ES2529815T3

ES2529815T3 - Uso y producción de metaloproteasa neutra estable en el almacenamiento

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Publication number: ES2529815T3
Application number: ES11165353.1T
Authority: ES
Inventors: Andrew Shaw; Louise Wallace; David A. Estell; Sang-Kyu Lee; Eugene Steven Sadlowski; Hiroshi Oh; Ronald Hommes
Original assignee: Procter and Gamble Co; Danisco US Inc
Current assignee: Procter and Gamble Co; Danisco US Inc
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2026-10-12
Also published as: CN105200027B; EP2390321A1; TWI444478B; JP5507843B2; JP2017121234A; US20180066244A1; CN101341248B; WO2007044993A3; WO2007044993A2; US11091750B2; US20220033798A1; EP2390321B1; CA2624977A1; JP2009511072A; JP6677629B2; US20080293610A1; US20200056165A1; TW200730628A; JP2014064562A; CA2624977C

Abstract

Variante de metaloproteasa neutra aislada que presenta al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con la metaloproteasa neutra, comprendiendo la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:18 y presentando una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una mutación equivalente a una mutación de una metaloproteasa neutra que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18, donde dichas mutaciones se seleccionan entre T004C, T004E, T004H, T004I, T004K, T004L, T004M, T004N, T004P, T004R, T004S, T004V, T004W, T004Y, G012D, G012E, G012I, G012K, G012L, G012M, G012Q, G012T, G012V, G012W, K013C, K013D, K013E, K013F, K013G, K013H, K013I, K013L, K013M, K013N, K013Q, K013S, K013T, K013V, K013Y, T014F, T014G, T014H, T014I, T014K, T014L, T014M, T014P, T014Q, T014R, T014S, T014V, T014W, T014Y, S023A, S023D, S023F, S023I, S023K, S023L, S023M, S023N, S023P, S023Q, S023R, S023T, S023V, S023W, S023Y, G024A, G024D, G024F, G024G, G024H, G024I, G024K, G024L, G024M, G024N, G024P, G024R, G024S, G024T, G024V, G024W, G024Y, K033H, Q045C, Q045D, Q045E, Q045F, Q045H, Q045I, Q045K, Q045L, Q045M, Q045N, Q045P, Q045R, Q045T, Q045W, N046A, N046C, N046E, N046F, N046G, N046H, N046I, N046K, N046L, N046M, N046P, N046Q, N046R, N046S, N046T, N046V, N046W, N046Y, R047E, R047K, R047L, R047M, R47Q, R047S, R047T, Y049A, Y049C, Y049D, Y049E, Y049F, Y049H, Y049I, Y049K, Y049L, Y049N, Y049R, Y049T, Y049V, Y049W, N050D, N050F, N050G, N050H, N050I, N050K, N050L, N050M, N050P, N050Q, N050W, N050Y, T054C, T054D, T054E, T054F, T054G, T054H, T054I T054K, T054L, T054M, T054N, T054P, T054Q, T054R, T054S, T054V, T054W, T054Y, S058D, S058H, S058I, S058L, S058N, S058P, S058Q, T059A, T059C, T059E, T059G, T059H, T059I, T059K, T059L T059M, T059N, T059P, T059Q, T059R, T059S, T059V,T059W, T060D, T060F, T060I, T060K, T060L, T060N, T060Q, T060R, T060V, T060W, T060Y, T065C, T065E,T065F, T065H, T065I, T065K, T065L, T065M, T065P, T065Q, T065R, T065V, T065Y, S066C, S066D, S066E, S066F, S066H, S066I, S066K, S066L, S066N, S066P, S066Q, S066R, S066T, S066V, S066W, S066Y, Q087A, Q087D, Q087E, Q087H, Q087I, Q087K, Q087L, Q087M, Q087N, Q087R, Q087T, Q087V, Q087W, N090C, N090D, N090E, N090F, N090G, N090H, N090L, N090R, N090T, N096G, N096H, N096K, N096R, K097H, K097Q, K097W, K100A, K100D, K100E, K100F, K100H, K100N, K100P, K100Q, K100R, K100S, K100V, K100Y, R110A, R110C, R110E, R110H, R110K, R110L, R110M, R110N, R110S, R110Y, D119E, D119H, D119I, D119L, D119Q, D119R, D119S, D119T, D119V, D119W, G128C, G128F, G128H, G128K, G128L, G128M, G128N, G128Q, G128R, G128W, G128Y, S129A, S129C, S129D, S129F, S129G, S129H, S129I, S129K, S129L, S129M, S129Q, S129R, S129T, S129V, S129W, S129Y, F130I, F130K, F130L, F130M, F130Q, F130R, F130T, F130V, F130Y, S135P, G136I, G136L, G136P, G136V, G136W, G136Y, S137A, M138I, M138K, M138Q, M138V, D139A, D139C, D139E, D139G, D139H, D139I, D139K, D139L, D139M, D139P, D139R, D139S, D139V, D139W, D139Y, V140C, Q151I, E152A, E152C, E152D, E152F, E152G, E152H, E152L, E152M, E152N, E152R, E152S, E152W, N155D, N155K, N155Q, N155R, D178A, D178C, D178G, D178H, D178K, D178L, D178M, D178N, D178P, D178Q, D178R, D178S, D178T, D178V, D178W, D178Y, T179A, T179F, T179H, T179I, T179K, T179L, T179M, T179N, T179P, T179Q, T179R, T179S, T179V, T179W, T179Y, E186A, E186C, E186D, E186G, E186H, E186K, E186L, E186M, E186N, E186P, E186Q, E186R, E186S, E186T, E186V, E186W, E186Y, V190H, V190I, V190K, V190L, V190Q, V190R, S191F, S191G, S191H, S191I, S191K, S191L, S191N, S191Q, S191R, S191W, L198M, L198V, S199C, S199D, S199E, S199F, S199I, S 199K, S 199L, S 199N, S199Q, S 199R, S199V, Y204H, Y204T, G205F, G205H, G205L, G205M, G205R, G205S, G205Y, K211C, K211D, K211G, K211M, K211N, K211Q, K211R, K211S, K211T, K211V, K214A, K214C, K214E, K214I, K214L, K214M, K214N, K214Q, K214S, K214V, L216A, L216C, L216F, L216H, L216Q, L216R, L216S, L216Y, N218K, N218P, T219D, D220A,D220E, D220H, D220K, D220N, D220P, A221D, A221F, A221I, A221K, A221L, A221M, A221N, A221S, A221V, A221Y, G222C, G222H, G222N, G222R, Y224F, Y224H, Y224N, Y224R, T243C, T243G, T243H, T243I, T243K, T243L, T243Q, T243R, T243W, T243Y, K244A, K244C, K244D, K244E, K244F, K244G, K244L, K244M, K244N, K244Q, K244S, K244T, K244V, K244W, K244Y, V260A, V260D, V260E, V260G, V260H, V260I, V260K, V260L, V260M, V260P, V260Q, V260R V260S, V260T, V260W, V260Y, Y261C, Y261F, Y261I, Y261L, T263E, T263F, T263H, T263I, T263L, T263M, T263Q, T263V, T263W, T263Y, S265A, S265C, S265D, S265E, S265K, S265N, S265P, S265Q, S265R, S265T, S265V, S265W, K269E, K269F, K269G, K269H, K269I, K269L, K269M, K269N, K269P, K269Q, K269S, K269T, K269V, K269W, K269Y, A273C, A273D, A273H, A273I, A273K, A273L, A273N, A273Q, A273R, A273Y, R280A, R280C, R280D, R280E, R280F, R280G, R280H, R280K, R280L, R280M, R280S, R280T, R280V, R280W, R280Y, L282F, L282G, L282H, L282I, L282K, L282M, L282N, L282Q, L282R, L282V, L282Y, S285A, S285C, S285D, S285E, S285K, S285P, S285Q, S285R, S285W, Q286A, Q286D, Q286E, Q286K, Q286P, Q286R, A289C, A289D, A289E, A289K, A289L, A289R, A293C, A293R, N296C, N296D, N296E, N296K, N296R, N296V, A297C, A297K, A297N, A297Q, A297R y G299N; donde dicha identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 18 se determina por medio de un BLAST con parámetros predeterminados; donde dicha variante de metaloproteasa neutra presenta una termoestabilidad mejorada en comparación con la metaloproteasa neutra natural de B. amyloliquefaciens que presenta la secuencia de la SEQ ID NO: 18.

Description

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vidrio, madera, cerámica y metal; limpiadores de alfombras; limpiahornos; ambientadores para la ropa; suavizantes de telas; y pretratadores textiles y para la ropa, así como lavavajillas).

[0031] De hecho, el término «composición limpiadora» en el sentido en que se usa en la presente memoria

5 incluye, salvo que se indique de otro modo, agentes de lavado en forma granulada o en polvo multiusos o de alto rendimiento, sobre todo detergentes de limpieza; agentes de lavado multiusos en forma líquida, en gel o pasta, sobre todo los tipos denominados líquidos de alto rendimiento (HDL); detergentes líquidos para telas delicadas; agentes de lavavajillas a mano o agentes de lavavajillas de bajo rendimiento, sobre todo los del tipo muy espumoso; agentes de lavavajillas a máquina, que incluyen los diversos tipos en pastillas, granulados, líquidos y

10 agentes de aclarado para uso doméstico e institucional; agentes de limpieza y desinfección líquidos, lo que incluye los tipos de jabón de manos antibacterianos, pastillas de jabón, colutorios, productos de limpieza de dentaduras postizas, limpiadores jabonosos para automóviles o alfombras, productos de limpieza para el baño, champús para el cabello y productos para el aclarado capilar; geles de ducha y geles de baño y limpiadores de metales, así como auxiliares de limpieza como aditivos de blanqueo y los tipos «quitamanchas en barra» o de

15 pretratamiento.

[0032] En el sentido en que se usa en la presente memoria, los términos «composición detergente» y «formulación de detergente» se utilizan en referencia a mezclas que están pensadas para ser usadas en un medio de lavado para la limpieza de objetos sucios. En algunas formas de realización preferentes, el término se 20 utiliza en referencia al lavado de telas y/o prendas (por ejemplo, «detergentes para ropa»). En formas de realización alternativas, el término designa otros detergentes, como los utilizados para limpiar vajilla, cubertería, etc. (por ejemplo, «detergentes lavavajillas»). No se pretende que la presente invención esté limitada a ninguna formulación o composición detergente en concreto. De hecho, se pretende que, además de metaloproteasa neutra, el término abarque detergentes que contienen tensioactivos, transferasa(s), enzimas hidrolíticas,

25 óxidorreductasas, adyuvantes, agentes de blanqueo, activadores del blanqueo, agentes de azulado y tintes fluorescentes, inhibidores de la aglomeración, agentes secuestrantes, activadores enzimáticos, antioxidantes y solubilizantes.

[0033] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «Enzima del solicitante» designa las 30 metaloproteasas neutras de la presente invención.

[0034] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «rendimiento potenciado» en un detergente se define como el aumento de la limpieza de manchas sensibles al blanqueo (por ejemplo, de hierba, té, vino, sangre, suciedad, etc.), tal y como se determina por medio de una evaluación habitual tras un ciclo de lavado

35 estándar. En formas de realización concretas, la metaloproteasa neutra de la presente invención proporciona un rendimiento potenciado en la eliminación de manchas y suciedad de color. En otras formas de realización, la enzima de la presente invención proporciona un rendimiento potenciado a la hora de eliminar y/o descolorar manchas.

40 [0035] En el sentido en que se usa en la presente memoria, el término «composición limpiadora de superficies duras» designa composiciones detergentes para limpiar superficies duras como suelos, paredes, azulejos, mobiliario de baño y la cocina, y similares. Dichas composiciones se proporcionan en cualquier forma, lo que incluye, sin carácter limitativo, sólidos, líquidos, emulsiones, etc.

45 [0036] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «composición de lavavajillas» designa todas las formas de las composiciones para lavar vajilla, lo que incluye, sin carácter limitativo, formas granuladas y líquidas.

[0037] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «composición limpiadora de telas» designa todas

50 las formas de composiciones detergentes para limpiar telas, lo que incluye, sin carácter limitativo, formas granuladas, líquidas y en pastilla.

[0038] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «producto textil» designa telas tejidas, así como fibras y filamentos cortados adecuados para su conversión o uso como hilos, tejidos, géneros de punto y telas no

55 tejidas. El término abarca hilos hechos de fibras naturales, así como sintéticas (por ejemplo, fabricadas).

[0039] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «materiales textiles» es un término general para fibras, intermedios de hilo, hilos, telas y productos elaborados de tela (por ejemplo, prendas y otros artículos).

60 [0040] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «tela» abarca cualquier material textil. Por consiguiente, se pretende que el término abarque prendas así como telas, hilos, fibras, materiales no tejidos, materiales naturales, materiales sintéticos y cualquier otro material textil.

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preferentemente sitios únicos en el gen de la proteína, para facilitar el reemplazo del segmento génico. No obstante, puede que se utilice cualquier sitio de restricción conveniente que no sea excesivamente redundante en el gen de metaloproteasa neutra, siempre que los fragmentos génicos generados por la digestión de restricción puedan ensamblarse de nuevo en la secuencia apropiada. Si los sitios de restricción no están 5 presentes en localizaciones a una distancia conveniente del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), se generan dichos sitios por medio de la sustitución de nucleótidos en el gen de tal modo que ni el marco de lectura ni los aminoácidos codificados cambien en la construcción final. La mutación del gen para cambiar su secuencia para conformar la secuencia deseada se consigue mediante una extensión con el cebador M13 de acuerdo con procedimientos conocidos en general. La tarea de localizar las regiones flanqueantes adecuadas y de evaluar los

10 cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitio de restricción convenientes se convierte en rutinaria por medio de la redundancia del código genético, un mapa de enzimas de restricción del gen y el gran número de enzimas de restricción diferentes. Cabe observar que si está disponible un sitio de restricción flanqueante conveniente, el método anterior tiene que usarse únicamente con respecto a la región flanqueante que no contiene un sitio.

15 [0073] Una vez que se clona el ADN de origen natural y/o ADN sintético, se digieren los sitios de restricción que flanquean las posiciones que van a mutarse con las enzimas de restricción asociadas y se liga en el gen una pluralidad de casetes de oligonucleótidos complementarios de los extremos. La mutagénesis se simplifica mediante este método porque todos los oligonucleótidos pueden sintetizarse para que tengan los mismos sitios

20 de restricción, y no son necesarios enlazadores sintéticos para crear los sitios de restricción.

[0074] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «correspondiente a» designa un residuo en la posición enumerada en una proteína o péptido, o un residuo que es análogo, homólogo o equivalente a un residuo enumerado en una proteína o péptido.

25 [0075] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «región correspondiente» designa en general una posición análoga en proteínas relacionadas o en una proteína original.

[0076] Los términos «molécula de ácido nucleico que codifica», «secuencia de ácido nucleico que codifica»,

30 «secuencia de ADN que codifica» y «ADN que codifica» designan el orden o secuencia de desoxirribonucleótidos en una hebra de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos en la cadena polipeptídica (proteína). Por tanto, la secuencia de ADN codifica la secuencia de aminoácidos.

35 [0077] En el sentido en que se usa en la presente memoria, el término «secuencia análoga» designa una secuencia en una proteína que proporciona una función, estructura terciaria y/o residuos conservados similares a la proteína de interés (es decir, normalmente la proteína de interés original). Por ejemplo, en regiones epitópicas que contienen una estructura de hélice alfa o lámina beta, los aminoácidos de reemplazo en la secuencia análoga mantienen preferentemente la misma estructura específica. El término también designa las secuencias

40 de nucleótidos, así como las secuencias de aminoácidos. En algunas formas de realización, se desarrollan secuencias análogas de modo que los aminoácidos de reemplazo dan lugar a una variante enzimática que muestra una función similar o mejorada. En algunas formas de realización preferentes, la estructura terciaria y/o residuos conservados de los aminoácidos de la proteína de interés están localizados en o cerca del segmento o fragmento de interés. Por tanto, cuando el segmento o fragmento de interés contiene, por ejemplo, una

45 estructura de hélice alfa o lámina beta, los aminoácidos de reemplazo mantienen preferentemente dicha estructura específica.

[0078] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «proteína homóloga» designa una proteína (por ejemplo, metaloproteasa neutra) que tiene una acción y/o estructura similares a una proteína de interés (por 50 ejemplo, una metaloproteasa neutra de otra fuente). No se pretende necesariamente que los homólogos estén relacionados evolutivamente. Por tanto, se pretende que el término abarque la misma enzima o enzimas o similar

o similares (es decir, en términos de estructura y función) obtenidas de distintas especies. En algunas formas de realización preferentes, es deseable identificar un homólogo que tenga una estructura cuaternaria, terciaria y/o primaria similar a la proteína de interés, ya que el reemplazo del segmento o fragmento en la proteína de interés

55 por un segmento análogo del homólogo reducirá la inestabilidad del cambio.

[0079] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «genes homólogos» designa al menos un par de genes de distintas especies, siendo correspondientes dichos genes entre sí y siendo idénticos o muy similares entre sí. El término abarca genes que están separados por especiación (es decir, el desarrollo de nuevas

60 especies) (por ejemplo, genes ortólogos), así como genes que se han separado por duplicación genética (por ejemplo, genes parálogos). Estos genes codifican «proteínas homólogas».

[0080] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «ortólogo» y «genes ortólogos» designan genes de distintas especies que han evolucionado a partir de un gen ancestral común (es decir, un gen homólogo) por 65 especiación. Normalmente, los ortólogos retienen la misma función en el transcurso de la evolución. La

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identificación de los ortólogos se utiliza en la predicción fiable de la función génica en genomas recién secuenciados.

[0081] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «parálogo» y «genes parálogos» designan genes

5 que están relacionados por duplicación en un genoma. Mientras que los ortólogos retienen la misma función a lo largo del transcurso de la evolución, los parálogos desarrollan nuevas funciones, aunque algunas funciones están a menudo relacionadas con la original. Ejemplos de genes parálogos incluyen, sin carácter limitativo, los genes que codifican tripsina, quimotripsina, elastasa y trombina, que son todas proteasas serínicas y aparecen conjuntamente en la misma especie.

10 [0082] En el sentido en que se usa en la presente memoria, las proteínas «naturales» y «nativas» son aquellas que se encuentran en la naturaleza. Los términos «secuencia natural» y «gen natural» se usan indistintamente en la presente memoria para designar una secuencia que es nativa o de origen natural en una célula hospedadora. En algunas formas de realización, la secuencia natural designa una secuencia de interés que es el

15 punto de partida de un proyecto de ingeniería de proteínas. Los genes que codifican la proteína de origen natural puede que se obtengan de acuerdo con los métodos generales conocidos por los expertos en la materia. En general, los métodos comprenden la síntesis de sondas marcadas que presentan secuencias que codifican presuntamente regiones de la proteína de interés, la preparación de genotecas genómicas a partir de organismos que expresan la proteína y el cribado de las genotecas en busca del gen de interés mediante hibridación con las

20 sondas. A continuación, se cartografían y secuencian los clones de hibridación positiva.

[0083] El término «molécula de ADN recombinante», en el sentido en que se usa en la presente memoria, designa una molécula de ADN que está comprendida de segmentos de ADN unidos conjuntamente mediante técnicas de biología molecular.

25 [0084] El término «oligonucleótido recombinante» designa un oligonucleótido creado por medio de manipulaciones de biología molecular que incluyen, sin carácter limitativo, el ligamiento de dos o más secuencias de oligonucleótidos generadas por digestión con enzimas de restricción de una secuencia de polinucleótidos, la síntesis de oligonucleótidos (por ejemplo, la síntesis de cebadores u oligonucleótidos) y similares.

30 [0085] El grado de identidad entre secuencias de aminoácidos se determina por medio del algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]; y Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). Un programa BLAST que resulta especialmente útil es el programa WU-BLAST-2 (véase Altschul et al., Meth. Enzymol." 266:460-480 [1996]). Los parámetros «W», «T» y «X» determinan la

35 sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa de manera predeterminada una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]), alineamientos (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M'5, N'-4, y una comparación de ambas hebras.

40 [0086] En el sentido en que se usa en la presente memoria, «identidad porcentual (%) de secuencia de ácido nucleico» se define como el porcentaje de residuos nucleotídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos nucleotídicos de la secuencia.

[0087] En el sentido en que se usa en la presente memoria, el término «hibridación» designa el proceso

45 mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria mediante apareamiento de bases, como se conoce en la técnica.

[0088] En el sentido en que se usa en la presente memoria, la frase «condiciones de hibridación» designa las condiciones en que se realizan las reacciones de hibridación. Estas condiciones se clasifican normalmente por el

50 grado de «rigor» de las condiciones en que se mide la hibridación. El grado de rigor puede estar basado, por ejemplo, en la temperatura de fusión (Tm) del complejo o sonda de unión a ácido nucleico. Por ejemplo, el «rigor máximo» aparece normalmente a aproximadamente Tm-5 °C (5 °C por debajo de la Tm de la sonda); el «rigor alto» a aproximadamente 5-10 C° por debajo de la Tm; el «rigor intermedio» a aproximadamente 10-20 °C por debajo de la Tm de la sonda; y el «rigor bajo» a aproximadamente 20-25 °C por debajo de la Tm. De manera

55 alternativa, o adicionalmente, las condiciones de hibridación pueden estar basadas en las condiciones de sal o fuerza iónica de la hibridación y/o uno o varios lavados de rigor. Por ejemplo, 6xSSC = rigor muy bajo; 3xSSC = rigor bajo a medio; 1xSSC = rigor medio; y 0.5xSSC= rigor alto. Funcionalmente, las condiciones de rigor máximo puede que se usen para identificar secuencias de ácido nucleico que presentan una identidad estricta o casi estricta con la sonda de hibridación, mientras que las condiciones de rigor alto se usan para identificar

60 secuencias de ácido nucleico que presentan aproximadamente un 80 % o más de identidad de secuencia con la sonda.

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los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se vuelven las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están «amplificados por PCR».

[0111] En el sentido en que se usa en la presente memoria, el término «reactivos de amplificación» designa

5 aquellos reactivos (trifosfatos de desoxirribonucleótido, tampón, etc.) necesarios para la amplificación salvo los cebadores, el molde de ácido nucleico y la enzima de amplificación. Normalmente, los reactivos de amplificación junto con los demás componentes de reacción están dispuestos y contenidos en un recipiente de reacción (tubo de ensayo, micropocillo, etc.).

10 [0112] Con la PCR, es posible amplificar una sola copia de una secuencia diana específica en ADN genómico a un nivel detectable mediante varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una sonda marcada; incorporación de cebadores biotinilados seguida de detección con conjugado de avidina-enzima; incorporación de trifosfatos de desoxinucleótidos marcados con 32P, tales como dCTP o dATP, al segmento amplificado). Además del ADN genómico, puede amplificarse cualquier secuencia de oligonucleótidos o polinucleótidos con el

15 conjunto apropiado de moléculas cebadoras. En concreto, los segmentos amplificados creados por el proceso mismo de PCR son, a su vez, moldes eficaces para posteriores amplificaciones por PCR.

[0113] En el sentido en que se usa en la presente memoria, los términos «producto de PCR», «fragmento de PCR» y «producto de amplificación» designan la mezcla de compuestos resultante después de completar dos o

20 más ciclos de las etapas de PCR de desnaturalización, apareamiento y extensión. Estos términos abarcan el caso en que ha habido amplificación de uno o más segmentos de una o más secuencias diana.

[0114] En el sentido en que se usa en la presente memoria, los términos «endonucleasas de restricción» y «enzimas de restricción» designan enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta ADN bicatenario en o

25 cerca de una secuencia de nucleótidos específica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCIÓN

[0115] La presente invención proporciona una enzima de metaloproteasa neutra que presenta una actividad o

30 estabilidad mejorada. En algunas formas de realización, la metaloproteasa neutra se utiliza en aplicaciones que incluyen, sin carácter limitativo, limpieza, blanqueo y desinfección.

[0116] Asimismo, tal y como se describe con más detalle en los Ejemplos más adelante, la presente invención proporciona muchas ventajas para la limpieza de una amplia variedad de objetos, entre los que se incluyen, sin

35 carácter limitativo, ropa, telas, productos sanitarios, etc. Además, la presente invención proporciona composiciones que son eficaces en la limpieza, blanqueo y desinfección, en un intervalo de temperaturas y pH de lavado.

[0117] En general, las proteasas hidrolizan ligamientos amidas de proteínas mediante la adición de una molécula

40 de agua al enlace o enlaces peptídicos. El corte sucede en el grupo carbonilo del enlace peptídico. En especies bacterianas como Bacillus, existen dos clases principales de proteasas extracelulares, concretamente proteasas alcalinas o serínicas y metaloproteasas neutras.

[0118] Las metaloendopeptidasas neutras (es decir, metaloproteasas neutras) (EC 3.4.24.4) pertenecen a una

45 clase de proteasas que necesita de manera imprescindible iones de cinc para su actividad catalítica. Estas enzimas están óptimamente activas a un pH neutro y se encuentran en el intervalo de tamaño de 30 a 40 kDa. Las metaloproteasas neutras se unen a entre dos y cuatro iones de calcio que contribuyen a la estabilidad estructural de la proteína. El ión metálico unido en el centro activo de las metaloproteasas es una característica fundamental que permite la activación de una molécula de agua. La molécula de agua actúa entonces como el

50 nucleófilo y corta el grupo carbonilo del enlace peptídico.

[0119] La familia de metaloproteasas neutras de unión a cinc incluye la enzima bacteriana termolisina, y proteasas similares a la termolisina («TLP»), así como carboxipeptidasa A (una enzima digestiva) y las metaloproteasas de matriz que catalizan las reacciones en la remodelación y degradación tisulares. De estas

55 proteasas, la única bien caracterizada en cuanto a estabilidad y función es la termolisina y sus variantes (TLP). De hecho, gran parte de las investigaciones se han centrado en la modificación por ingeniería genética de las proteasas neutras de Bacillus subtilis para aumentar la estabilidad térmica de la enzima (véase, por ejemplo, Vriend et al., In, Tweel et al. (eds), Stability and Stabilization of enzymes, Elsevier, págs. 93-99 [1993]).

60 [0120] La mayor parte de los esfuerzos se han centrado en aumentar la estabilidad de la proteasa al alterar los determinantes estructurales que se identifican en el uso de modelización molecular que se sugiere que evita los procesos de despliegue locales que darían lugar a la autolisis de la proteína y provocarían la desnaturalización de la proteasa neutra a altas temperaturas (véase, por ejemplo, van den Burg et al., en Hopsu-Havu et al., (eds),

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5 [0209] La secuencia del propéptido de B. amyloliquefaciens y la secuencia madura de codificación de nprE y el terminador de transcripción se proporcionan en la siguiente secuencia. En esta secuencia, la parte de nprE de los cebadores 2 y 3 está subrayada (GCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTG; SEQ ID NO:7), mientras que la parte de npr-r del cebador 4 (GGCTTCACCATGATCATATATGTCAAGCTTGGGGGG; SEQ ID NO:8) se

10 muestra con doble subrayado.

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[0210] La secuencia de aminoácidos del NprE de longitud completa (secuencia pre, pro y madura) se proporciona a continuación:

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[0211] En algunas formas de realización alternativas, la siguiente secuencia de NprE se utiliza en la presente invención.

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15 [0212] Las secuencias de cebador usadas en estos experimentos de PCR se proporcionan a continuación:

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EJEMPLO 7

Producción de proteasa NprE en B. subtilis por medio del vector de expresión de nprE pUBnprE

5 [0242] En este Ejemplo, se describen los experimentos realizados para producir proteasa NprE en B. subtilis, en concreto los métodos usados en la transformación de plásmido pUBnprE en B. subtilis. La transformación se llevó a cabo del modo conocido en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 02/14490). La secuencia de ADN (secuencia de ADN de nprE líder, nprE pro y nprE madura de B.amyloliquefaciens) que se proporciona a continuación codifica la proteína precursora de NprE:

10

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[0243] En la secuencia anterior, la negrita señala el ADN que codifica la proteasa NprE madura, la fuente

15 estándar señala la secuencia líder (nprE líder) y el subrayado señala las secuencias pro (nprE pro). La secuencia de aminoácidos (secuencia de ADN de NprE líder, NprE pro y NprE madura) (SEQ ID NO:13) que se proporciona a continuación codifica la proteína precursora de NprE. En esta secuencia, el subrayado señala la secuencia pro y la negrita señala la proteasa NprE madura. La SEQ ID NO:17 proporciona la secuencia de NprE pro separada

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de la secuencia de NprE madura y la SEQ ID NO:18 proporciona la secuencia de NprE madura. Esta secuencia se utilizó de base para la elaboración de las genotecas de variantes descritas en la presente memoria.

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[0244] El vector de expresión de pUBnprE se construyó al amplificar el gen de nprE del ADN cromosómico de B. amyloliquefaciens por PCR por medio de dos cebadores específicos:

10 Oligo AB 1740: CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCG (SEQ ID NO:19)

Oligo AB 1741: GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC (SEQ ID NO:20)

[0245] La PCR se llevó a cabo en un termociclador con ADN polimerasa Phusion High Fidelity (Finnzymes). La mezcla de PCR contenía 10 µl de 5x tampón (Finnzymes Phusion), 1 µl de 10mM de dNTP, 1.5 µl de DMSO, 1 µl de cada cebador, 1 µl de ADN polimerasa Phusion de Finnzymes, 1 µl de solución de ADN cromosómico

15 50ng/µl, 34.5 µl de agua MilliQ. Se utilizó el siguiente protocolo:

Protocolo de PCR:

[0246]

1) 30s98°C;

20 2) 10s98°C; 3) 20s55°C; 4) 1min72°C; 5) 25 ciclos de los pasos 2 a 4; y 6) 5min72°C.

25 [0247] Ello dio lugar a un fragmento de ADN de 1.9 kb que se digirió por medio de las enzimas de restricción del ADN BglII y BclI. El vector de Bacillus pUB 110 de copia múltiple (véase, por ejemplo, Gryczan, J. Bacteriol.,

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Cebadores de mutagénesis directos específicos de nprE

nprE12F: CAGGTACGACTCTTAAANNSAAAACGGTCTCATTAAATAT (SEQ ID NO:24)

nprE13F: GTACGACTCTTAAAGGANNSACGGTCTCATTAAATATTTC (SEQ ID NO:25)

nprE14F: CGACTCTTAAAGGAAAANNSGTCTCATTAAATATTTC (SEQ ID NO:26)

nprE23F: CATTAAATATTTCTTCTGAANNSGGCAAATATGTGCTGCG (SEQ ID NO:27)

nprE24F: TAAATATTTCTTCTGAAAGCNNSAAATATGTGCTGCGCGATC (SEQ ID NO:28)

nprE33F: GTGCTGCGCGATCTTTCTNNSCCTACCGGAACACAAATTAT (SEQ ID NO:29)

nprE45F: AAATTATTACGTACGATCTGNNSAACCGCGAGTATAACCTG (SEQ ID NO:30)

nprE46F: TTATTACGTACGATCTGCAANNSCGCGAGTATAACCTGCC (SEQ ID NO:31)

nprE47F: CGTACGATCTGCAAAACNNSGAGTATAACCTGCCGGG (SEQ ID NO:32)

nprE49F: GATCTGCAAAACCGCGAGNNSAACCTGCCGGGCACACTC (SEQ ID NO:33)

nprE50F: CTGCAAAACCGCGAGTATNNSCTGCCGGGCACACTCGTATC (SEQ ID NO:34)

nprE54F: GAGTATAACCTGCCGGGCNNSCTCGTATCCAGCACCAC (SEQ ID NO:35)

nprE58F: CGGGCACACTCGTATCCNNSACCACAAACCAGTTTAC (SEQ ID NO:36)

nprE59F: GCACACTCGTATCCAGCNNSACAAACCAGTTTACAAC (SEQ ID NO:37)

nprE60F: CACTCGTATCCAGCACCNNSAACCAGTTTACAACTTC (SEQ ID NO:38)

nprE65F: CCACAAACCAGTTTACANNSTCTTCTCAGCGCGCTGC (SEQ ID NO:39)

nprE66F: CAAACCAGTTTACAACTNNSTCTCAGCGCGCTGCCGTTG (SEQ ID NO:40)

nprE87F: GTGTATGATTATTTCTATNNSAAGTTTAATCGCAACAG (SEQ ID NO:41)

nprE90F: ATTATTTCTATCAGAAGTTTNNSCGCAACAGCTACGACAATAA (SEQ ID NO:42)

Nombre cebador: Secuencia de cebador y SEQ ID NO:

nprE96F: TTAATCGCAACAGCTACGACNNSAAAGGCGGCAAGATCGTATC (SEQ ID NO:43)

nprE97F: GCAACAGCTACGACAATNNSGGCGGCAAGATCGTATC (SEQ ID NO:44)

nprE100F: CTACGACAATAAAGGCGGCNNSATCGTATCCTCCGTTCATTA (SEQ ID NO:45)

nprE186F: GAGGACTGGGATATCGGTNNSGATATTACGGTCAGCCAG (SEQ ID NO:46)

nprE196F: GTCAGCCAGCCGGCTCTCNNSAGCTTATCCAATCCGAC (SEQ ID NO:47)

nprE211F: GACAGCCTGATAATTTCNNSAATTACAAAAACCTTCC (SEQ ID NO:48)

nprE214F: GATAATTTCAAAAATTACNNSAACCTTCCGAACACTGATG (SEQ ID NO:49)

nprE228F: GCGACTACGGCGGCGTGNNSACAAACAGCGGAATCCC (SEQ ID NO:50)

nprE280F: CTTTGATTCAATCTGCGNNSGACCTTTACGGCTCTCAAG (SEQ ID NO:51)

Cebadores de mutagénesis inversos específicos de nprE

nprE4R: TTAAGAGTCGTACCTGTTCCSNNTGTGGCGGCATGCTCCAC (SEQ ID NO:52)

nprE12R: ATATTTAATGAGACCGTTTTSNNTTTAAGAGTCGTACCTG (SEQ ID NO:53)

nprE13R: GAAATATTTAATGAGACCGTSNNTCCTTTAAGAGTCGTAC (SEQ ID NO:54)

nprE14R: GAAATATTTAATGAGACSNNTTTTCCTTTAAGAGTCG (SEQ ID NO:55)

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Cebadores de mutagénesis inversos específicos de nprE

nprE23R: CGCAGCACATATTTGCCSNNTTCAGAAGAAATATTTAATG (SEQ ID NO:56)

nprE24R: GATCGCGCAGCACATATTTSNNGCTTTCAGAAGAAATATTTA (SEQ ID NO:57)

nprE33R: ATAATTTGTGTTCCGGTAGGSNNAGAAAGATCGCGCAGCAC (SEQ ID NO:58)

nprE45R: CAGGTTATACTCGCGGTTSNNCAGATCGTACGTAATAATTT (SEQ ID NO:59)

nprE46R: GGCAGGTTATACTCGCGSNNTTGCAGATCGTACGTAATAA (SEQ ID NO:60)

nprE47R: CCCGGCAGGTTATACTCSNNGTTTTGCAGATCGTACG (SEQ ID NO:61)

nprE49R: GAGTGTGCCCGGCAGGTTSNNCTCGCGGTTTTGCAGATC (SEQ ID NO:62)

nprE50R: GATACGAGTGTGCCCGGCAGSNNATACTCGCGGTTTTGCAG (SEQ ID NO:63)

Nombre cebador: Secuencia de cebador y SEQ ID NO:

nprE54R: GTGGTGCTGGATACGAGSNNGCCCGGCAGGTTATACTC (SEQ ID NO:64)

nprE58R: GTAAACTGGTTTGTGGTSNNGGATACGAGTGTGCCCG (SEQ ID NO:65)

nprE59R: GTTGTAAACTGGTTTGTSNNGCTGGATACGAGTGTGC (SEQ ID NO:66)

nprE60R: GAAGTTGTAAACTGGTTSNNGGTGCTGGATACGAGTG (SEQ ID NO:67)

nprE65R: GCAGCGCGCTGAGAAGASNNTGTAAACTGGTTTGTGG (SEQ ID NO:68)

nprE66R: CAACGGCAGCGCGCTGAGASNNAGTTGTAAACTGGTTTG (SEQ ID NO:69)

nprE87R: CTGTTGCGATTAAACTTSNNATAGAAATAATCATACAC (SEQ ID NO:70)

nprE90R: TTATTGTCGTAGCTGTTGCGSNNAAACTTCTGATAGAAATAAT (SEQ ID NO:71)

nprE96R: GATACGATCTTGCCGCCTTTSNNGTCGTAGCTGTTGCGATTAA (SEQ ID NO:72)

nprE97R: GATACGATCTTGCCGCCSNNATTGTCGTAGCTGTTGC (SEQ ID NO:73)

nprE100R: TAATGAACGGAGGATACGATSNNGCCGCCTTTATTGTCGTAG (SEQ ID NO:74)

nprE186R: CTGGCTGACCGTAATATCSNNACCGATATCCCAGTCCTC (SEQ ID NO:75)

nprE196R: GTCGGATTGGATAAGCTSNNGAGAGCCGGCTGGCTGAC (SEQ ID NO:76)

nprE211R: GGAAGGTTTTTGTAATTSNNGAAATTATCAGGCTGTC (SEQ ID NO:77)

nprE214R: CATCAGTGTTCGGAAGGTTSNNGTAATTTTTGAAATTATC (SEQ ID NO:78)

nprE228R: GGGATTCCGCTGTTTGTSNNCACGCCGCCGTAGTCGC (SEQ ID NO:79)

nprE280R: CTTGAGAGCCGTAAAGGTCSNNCGCAGATTGAATCAAAG (SEQ ID NO:80)

[0254] La construcción de cada genoteca de evaluación del sitio comenzó con dos amplificaciones primarias por PCR por medio del cebador directo pUB-BglII-FW y un cebador de mutagénesis inverso específico de nprE. Para la segunda PCR, se usó el cebador inverso pUB-BglII -RV y un cebador de mutagénesis directo específico de

5 nprE (las posiciones de codón de nprE madura son iguales para los cebadores de mutagénesis directos e inversos).

[0255] La introducción de las mutaciones en la secuencia de nprE madura se llevó a cabo mediante ADN polimerasa Phusion High-Fidelity (Finnzymes; n. º cat. F-530L). Todas las PCR se llevaron a cabo de acuerdo 10 con el protocolo de Finnzymes que se facilitó con la polimerasa. Las condiciones de PCR para las PCR primarias fueron:

Para la PCR primaria 1:

15 [0256] Cebador directo pUB-BglII-FW y un cebador de mutagénesis inverso específico de NPRE, ambos 1 µL (10 µM);

Para la PCR primaria 2:

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sencillas en medios MOPS con neomicina y 1.25 g/L de extracto de levadura para fines de análisis de secuencia (BaseClear) y de cribado. Cada genoteca incluía un máximo de 19 variantes de nprE específicas de sitio.

[0264] Las variantes se produjeron al cultivar los transformantes de B. subtilis de SEL en MTP de 96 pocillos a 5 37 °C durante 68 horas en medio MBD con 20 mg/L de neomicina y 1.25 g/L de extracto de levadura (véase, supra).

EJEMPLO 9

10 Generación de genotecas combinatorias de nprE (RCL)

[0265] En este Ejemplo, se describen los métodos usados para generar genotecas combinatorias de nprE. Para esta enzima, se escogió una propiedad como la propiedad que necesitaba cambiarse en mayor grado. Esta propiedad se define en la presente memoria como la «propiedad primaria». El resto de propiedades fueron 15 «propiedades secundarias» a efectos del diseño de la genoteca combinatoria. La estrategia básica para mejorar una proteína en la presente memoria fue la de combinar mutaciones que mejoran la propiedad primaria y asimismo mantener o mejorar las propiedades secundarias. Los datos de evaluación del sitio se utilizaron para identificar dichas mutaciones, lo que mejoró la propiedad primaria al tiempo que mantuvo o mejoró las propiedades secundarias. Las mutaciones que se iban a combinar se identificaron por medio de su índice de

20 rendimiento (PI o Pi) y valores de ΔΔGapp asociados.

[0266] El «cambio de energía libre aparente» (ΔΔGapp) en el sentido en que se usa en la presente memoria se define como:

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donde Pvariante es el valor de rendimiento de la variante y Pprogenitora es el valor de rendimiento de la enzima progenitora en las mismas condiciones. La relación Pvariante/Pprogenitora se define como el índice de rendimiento (Pi) de la propiedad. Se esperaba que los valores de ΔΔGapp se comportaran de un modo similar a los valores de

30 ΔΔG reales para las distribuciones de datos y efecto acumulativo. No obstante, dado que ΔΔG representa la cantidad máxima de trabajo que la variante puede efectuar en comparación con la enzima progenitora, la magnitud ΔΔGapp por lo general subestima el ΔΔG y puede que conduzca a resultados que parecen sinérgicos en el sentido de que las propiedades de dos posiciones acumulativas puede que sean mayores que el valor previsto al añadir juntos sus valores de ΔΔGapp.

35 [0267] Por ejemplo, cuando la estabilidad de TIDE® es la propiedad primaria y la actividad de BMI es la propiedad secundaria, puede que se escojan para la combinación las mutaciones que presentan valores de ΔΔGapp <0 (Pi>1) y valores de ΔΔGapp de BMI <0.06 (Pi >0.9). De hecho, en estos experimentos se exploraron dichas relaciones.

40 [0268] Para producir las variantes utilizadas en estos experimentos, GeneArt (Geneart) produjo fragmentos de genoteca de nprE sintética, que contenían múltiples mutaciones en múltiples posiciones de ADN de nprE madura. Estos fragmentos de genoteca de nprE de 1.5 kB se digirieron con las enzimas de restricción de ADN PvuIy AvaI, se purificaron y ligaron en el fragmento de vector pUB de 5 kB (también digerido con enzimas de

45 restricción de ADN PvuIy AvaI) mediante una reacción de ligasas por medio de ADN ligasa de T4 (Invitrogen®

n. º cat. 15224-017).

[0269] Para transformar directamente la mezcla de reacción de ligamiento en células Bacillus, el ADN de genoteca (la mezcla de fragmento de genoteca de nprE ligada en el fragmento de vector pUB) se amplificó por

50 medio del kit TempliPhi (Amersham cat. n. º 25-6400). A estos efectos, se mezcló 1µL de la mezcla de reacción de ligamiento con 5µL de tampón de muestra del kit TempliPhi y se calentó durante 3 minutos a 95 °C para desnaturalizar el ADN. La reacción se colocó sobre hielo para enfriarse durante 2 minutos y a continuación se centrifugó brevemente. Después, se añadieron 5µL de tampón de reacción y 0.2 µL de polimerasa de phi29 del kit TempliPhi y las reacciones se incubaron a 30 °C en un termociclador de MJ Research durante 4 horas. La

55 enzima de phi29 se inactivó mediante calor en las reacciones por medio de la incubación a 65 °C durante 10 min en el termociclador.

[0270] Para la transformación de las genotecas en Bacillus, se mezcló 0.1 µL de producto de reacción de amplificación de TempliPhi con 500 µL de células de B. subtilis competentes (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE,

60 degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK) seguido de una agitación enérgica a 37 °C durante 1 hora. A continuación, se colocaron 100 y 500 µL en placas HI-agar que contenían 20 mg/L de neomicina y leche

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desnatada al 0.5 %. En general, la transformación a B. subtilis se llevó a cabo del modo descrito en el documento WO 02/14490. Se contempla que las genotecas combinatorias de nprE de B. subtilis construidas mediante este método contengan aminoácidos naturales en una o varias de las posiciones localizadas para la mutagénesis.

5 [0271] A continuación, las variantes obtenidas en dichas genotecas se sometieron a prueba para comprobar su estabilidad en TIDE® y su rendimiento en pruebas de rendimiento de lavado de BMI del modo descrito en la presente memoria. La Tabla 9 proporciona índices de rendimiento de las variantes sometidas a prueba en el ensayo de BMI. En esta Tabla, «Pos.» indica la posición en la secuencia de aminoácidos de NprE que se cambió, y «AA» indica la sustitución de aminoácidos realizada para cada variante.

10

Tabla 9. Resultados (índices de rendimiento) de las variantes sometidas a prueba

Pos.: Variante AA TIDE (-) ΔΔG TIDE(-) TIDE(+) ΔΔG TIDE(+) Pi BMI ΔΔG BMI

4: T004L L 0.80 0.13 1.13 -0.07 1.01 0.00

23: S023Y Y 1.08 -0.05 1.13 -0.07 1.02 -0.01

23: S023W W 1.12 -0.07 1.13 -0.07 1.29 -0.15

23: S023N N 1.33 -0.17 1.10 -0.06 0.95 0.03

23: S023T T 0.88 0.07 1.06 -0.03 0.91 0.05

23: S023G G 1.29 -0.15 1.06 -0.03 0.92 0.05

23: S023R R 0.98 0.01 1.06 -0.03 1.46 -0.22

23: S023L L 0.90 0.06 1.03 -0.02 1.24 -0.13

23: S023M M 1.04 -0.02 1.03 -0.02 1.09 -0.05

23: S023V V 0.82 0.12 1.02 -0.01 0.93 0.04

23: S023K K 1.01 -0.01 1.02 -0.01 1.50 -0.24

24: G024Y Y 0.60 0.30 1.11 -0.06 1.10 -0.06

24: G024W W 0.36 0.60 1.10 -0.06 1.20 -0.11

24: G024M M 0.71 0.20 1.09 -0.05 1.12 -0.07

24: G024F F 0.50 0.41 1.08 -0.04 1.19 -0.10

24: G024L L 0.49 0.42 1.07 -0.04 1.22 -0.12

24: G024H H 0.80 0.13 1.05 -0.03 1.17 -0.09

24: G024K K 0.55 0.35 1.04 -0.02 1.55 -0.26

24: G024T T 0.57 0.33 1.03 -0.02 0.94 0.04

24: G024R R 0.56 0.34 1.02 -0.01 1.47 -0.23

46: N046Q Q 0.88 0.08 1.07 -0.04 1.22 -0.12

47: R047K K 1.12 -0.07 1.09 -0.05 1.15 -0.08

50: N050F F 1.07 -0.04 1.07 -0.04 1.38 -0.19

50: N050Y Y 1.00 0.00 1.04 -0.02 1.27 -0.14

50: N050W W 1.01 -0.01 1.04 -0.02 1.46 -0.22

50: N050P P 1.23 -0.12 1.03 -0.02 1.12 -0.07

54: T054H H 1.08 -0.04 1.11 -0.06 1.17 -0.09

54: T054K K 1.03 -0.02 1.11 -0.06 1.47 -0.23

54: T054L L 1.09 -0.05 1.08 -0.05 1.26 -0.14

54: T054N N 0.97 0.02 1.07 -0.04 1.25 -0.13

54: T054Y Y 1.14 -0.08 1.07 -0.04 1.08 -0.04

54: T054W W 1.02 -0.01 1.07 -0.04 1.22 -0.12

54: T054S S 0.99 0.01 1.05 -0.03 1.03 -0.02

54: T054I I 1.09 -0.05 1.04 -0.02 1.34 -0.17

54: T054R R 0.96 0.02 1.04 -0.02 1.46 -0.22

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06-02-2015

54: T054Q Q 1.09 -0.05 1.03 -0.02 1.23 -0.12

54: T054F F 0.98 0.01 1.03 -0.02 1.16 -0.09

54: T054V V 1.14 -0.08 1.01 -0.01 1.11 -0.06

59: T059R R 0.76 0.16 1.28 -0.14 1.56 -0.26

59: T059W W 0.56 0.34 1.26 -0.14 1.32 -0.16

59: T059K K 0.99 0.00 1.16 -0.09 1.60 -0.28

59: T059N N 0.98 0.01 1.15 -0.08 1.16 -0.09

59: T059G G 0.94 0.04 1.13 -0.07 1.11 -0.06

59: T059P P 1.18 -0.10 1.12 -0.07 1.19 -0.10

59: T059M M 1.04 -0.02 1.10 -0.06 1.10 -0.05

59: T059H H 0.98 0.01 1.07 -0.04 1.32 -0.16

59: T059S s 1.09 -0.05 1.04 -0.03 0.91 0.06

59: T059A A 1.05 -0.03 1.04 -0.02 0.96 0.03

59: T059Q Q 1.05 -0.03 1.04 -0.02 1.31 -0.16

59: T059I I 0.64 0.26 1.01 -0.01 1.43 -0.21

60: T060N N 0.79 0.14 1.03 -0.02 1.07 -0.04

66: S066Q Q 0.75 0.17 1.01 -0.01 1.12 -0.07

66: S066N N 1.08 -0.05 1.01 -0.01 1.00 0.00

110: R110K K 1.08 -0.04 1.04 -0.02 1.05 -0.03

119: D119H H 1.03 -0.02 1.15 -0.08 1.16 -0.09

129: S129I I 2.32 -0.49 1.68 -0.30 0.98 0.01

129: S129V V 2.34 -0.50 1.55 -0.26 1.01 0.00

129: S129Q Q 1.86 -0.37 1.44 -0.21 0.99 0.00

129: S129T T 1.59 -0.27 1.36 -0.18 1.04 -0.02

129: S129L L 1.70 -0.31 1.35 -0.18 1.01 -0.01

129: S129H H 1.60 -0.28 1.30 -0.15 1.17 -0.09

129: S129Y Y 1.28 -0.14 1.06 -0.04 1.25 -0.13

129: S129A A 1.13 -0.07 1.06 -0.03 1.12 -0.07

129: S129K K 1.18 -0.10 1.05 -0.03 1.33 -0.17

130: F130L L 1.29 -0.15 1.52 -0.25 0.91 0.05

130: F130I I 1.18 -0.10 1.14 -0.08 1.03 -0.02

130: F130V V 1.05 -0.03 1.06 -0.03 0.99 0.00

130: F130K K 0.99 0.00 1.04 -0.02 1.26 -0.14

138: M138L L 1.11 -0.06 1.43 -0.21 0.95 0.03

152: E152H H 1.53 -0.25 1.36 -0.18 1.15 -0.08

152: E152W w 1.32 -0.16 1.31 -0.16 1.06 -0.03

152: E152F F 1.32 -0.16 1.15 -0.08 1.09 -0.05

179: T179P P 1.33 -0.17 1.50 -0.24 1.04 -0.03

190: V190I I 1.37 -0.18 1.68 -0.30 1.16 -0.09

220: D220P P 2.24 -0.47 2.66 -0.57 1.05 -0.03

220: D220E E 2.23 -0.47 2.44 -0.52 1.05 -0.03

243: T243I I 1.13 -0.07 1.17 -0.09 1.06 -0.03

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Células de B. subtilis competentes ((ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylAcomK)

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A. Clonación de nprE de B. subtilis

5 [0280] Para construir el plásmido nprE de B. subtilis, se prepararon por separado el fragmento de promotor de aprE amplificado (a partir del vector pJHT) y el fragmento de gen nprE de B. subtilis con terminador (a partir de la cepa de B. subtilis I168). La Figura 15 proporciona un esquema que ilustra la amplificación de los fragmentos de ADN individuales.

10 [0281] Se utilizó la reacción por PCR de corte y empalme por extensión de solapamiento (SOE) para unir los dos fragmentos de ADN separados. En esta reacción, se combinaron los siguientes reactivos: 1 ul de fragmento de ADN de promotor de aprE, 1 ul de fragmento de gen nprE de B. subtilis + terminador, 1 ul de cebador EL-689 (25 uM), 1 ul de cebador EL-695 (25 uM), 5 ul de 10x tampón de ADN polimerasa PfuUltra II Fusion HS, 1 ul de dNTP (10 mM), lul de ADN polimerasa PfuUltra II Fusion HS y 39 ul de agua destilada en autoclave para

15 proporcionar un volumen de reacción total de 50 ul. Los ciclos de PCR fueron: 95 °C durante 2 minutos (solo primer ciclo), seguido de 28 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 54 °C durante 30 segundos y 72 °C durante

0:45 segundos.

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EJEMPLO 14

Estabilidad de variantes de nprE

[0311] En este Ejemplo se describen los experimentos realizados para determinar la estabilidad de variantes de nprE. En estos experimentos, se usaron los métodos descritos antes del Ejemplo 1 para determinar los índices

5 de rendimiento (véase «Ensayos de estabilidad de NprE en presencia de detergente», supra). Las siguientes tablas proporcionan los resultados de dichas variantes con índices de rendimiento mayores que uno (PI>1) sometidas a prueba con y sin DTPA.

[0312] La estabilidad se midió al determinar la actividad de AGLA antes y después de la incubación a elevada temperatura. La tabla contiene los valores de estabilidad relativa en comparación con la enzima natural en dichas

10 condiciones. Constituye el cociente de (actividad residual de la variante/actividad residual de la enzima natural). Un valor mayor que uno indica una estabilidad mayor en presencia de detergente. En las Tablas 14.1 y 14.2 se proporcionan los datos que muestran los datos de estabilidad relativa de variantes de sustitución simple de NprE en relación con la estabilidad de la estabilidad de NprE natural en dichas condiciones, con y sin DTPA.

[0313] En las Tablas 14.3 y 14.4 se proporcionan datos que muestran los datos de estabilidad relativa de

15 variantes de sustitución múltiple de NprE en relación con la estabilidad de la estabilidad de NprE natural en dichas condiciones, con y sin DTPA.

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[0314] Los datos de la siguiente tabla (Tabla 14.5) representan los datos de estabilidad relativa de variantes de NprE en relación con la estabilidad de la estabilidad de NprE natural en el ensayo de estabilidad del citrato. La estabilidad se midió al determinar la actividad de caseína por medio de la determinación de la actividad de AGLA antes y después de la incubación a elevada temperatura (véase «Ensayo de estabilidad del citrato», supra). La tabla contiene los valores de estabilidad relativa en comparación con la enzima natural en dichas condiciones. Se presenta como el cociente de (actividad residual de la variante/actividad residual de la enzima natural). Un valor mayor que uno indica una estabilidad mayor en presencia de detergente.

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Tabla 17. Resultados de DSC

Enzima sometida a prueba: Concentración térmica por DSC Concentración

220 ppm proteína: 440 ppm proteína 440 ppm proteína con 130 mM citrato

NprE natural: 67.6 +/-0.5 69.2 +/-0.5 Sin transición

Termolisina: 87.0000 52.1000

NprE de B.subtilis: 68.0000 55.0000

FNA: 64.9000 51.7000

T14R: 57.0000 51.7000

S23K: 67.8000 Ninguna

S23R: 67.8000 53.5000

G24R: 63.7000 50.7

Q45E: 70.6000 70.7000 53.0000

N46K: 63.8000 50.7

S58D: 63.3000 50.5000

T59P: 68.8000 49.1000

S58D,T60D: 59.0000 Sin transición

T60D: 66.2000 Sin transición

S66E: 70.3000 71.6000

S129I: 70.2000 70.7000 50.3000

S 129V: 69.9000 70.3000 Sin transición

F130L: 69.8000 48.5000

M138I: 69.2000 52.5000

M138L: 67.8000

V190I: 69.0000 69.4000 51.5

L198M: 68.2000 68.5000 53.3000

S199E: 70.3000 70.3000 49.1000

D220P: 69.3000 69.9000 49.4000

D220E: 69.4000 69.8000 50.5000

K211V: 69.8000

K214Q: 68.9000

A221S: 59.1000 52.5000

G222C: 69.5000 Sin transición

K244S: 67.6000

K269T: 69.5000 51.5

R280D: 67.4000 67.9000 49.2000

N296E: 60.5000 69.8000 49.5000

N50W, N296E: 62.4000 47.2000

GSC, N61C: 67.8000 48.4

Q45K, S199E: 67.7000 51.3000

F130L, D220P: 62.7000 70.3000 50.8000

Tabla 17. Resultados de DSC

Enzima sometida a prueba: Concentración térmica por DSC Concentración

220 ppm proteína: 440 ppm proteína 440 ppm proteína con 130 mM citrato

M138L, D220P: 63.2000 68.2000 50.8000

S129I, V190I: 70.3000 55.8000

S129V, V190I: 69.9000 55.3000

S129V, D220P: 70.6000 55.7000

S129I, D220P: 70.7000 53.5000

S129V, R280L: 69.5000 54.9000

V190I, D220P: 69.8000 52.8000

Q45K, S199E: 67.7000 51.3000

N50W, N296E: 62.4000 47.2000

G24K K269T D220E: 65.0000 51.5000

S129I, F130L, D220P: 68.9000 56.6000

nprE-T004S-S023N-G024M(+K269N): 64.6000 Ninguna

nprE-T004V-S023N: 71.2000 49.0000

nprE-5023 W-G024Y: 64.0000 Ninguna

nprE-T004V-S023 W-G024M: 65.5000 49.3000

nprE-T059KS66Q-S129I: 70.5000 49.3000

nprE-T059RS66N-S129I: 70.2000 54.0000

nprE-T059R-S129I: 69.4000 54.0000

nprE-T059KS66Q-S129V: 70.3000 56.0000

[0328] En la Figura 27 se muestra una figura representativa de los perfiles de despliegue térmico (barridos de DSC) para NprE natural y diversos mutantes de esta. Los perfiles de despliegue indican el punto medio natural y muestran mutantes seleccionados que presentan unos puntos de fusión térmica elevados en relación con la 5 NprE natural y los que presentan unos puntos de fusión disminuidos en relación con la NprE natural. Esta figura destaca claramente que la DSC distinguía entre variantes de NprE estables y menos estables, y resulta de utilidad como cribado secundario. Se observa una tendencia general entre los puntos de fusión térmica de las variantes y su estabilidad en detergente. Por ejemplo, las variantes S66E, S 199E, D220P/E, S129I/N son todas ganadoras en TIDE® y presentan un aumento aproximado de 1 °C en el punto de fusión térmica en relación con

10 la NprE natural. Este aumento de 1 °C en el punto de fusión térmica es pequeño pero significativo, ya que la estabilidad térmica normalmente necesita múltiples sustituciones de aminoácidos.

[0329] La Figura 28 muestra el despliegue térmico de variantes de NprE que presentan un perfil de despliegue térmico en presencia de 130 mM de citrato. El citrato es un componente de detergente que provoca rápidamente

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EJEMPLO 20

Estabilización de NprE con formiato cálcico en detergente compacto HDL TIDE®

5 [0339] En este Ejemplo se describen los experimentos realizados para desarrollar medios de estabilización de NprE en detergente compacto HDL TIDE@. En estos experimentos, se investigaron los medios para estabilizar NprE al aumentar el nivel de formiato cálcico a una concentración fija de citrato al tiempo que se disminuye el contenido de DTPA en una formulación experimental de TIDE® compacto («TIDE® 2x»). Se usó una metodología estadística de diseño de experimentos (DOE) para simplificar los experimentos así como los análisis

10 de datos. Se demostró que la presencia de DTPA en TIDE® afecta de manera negativa a la estabilidad de NprE, mientras que la adición de formiato cálcico ayuda a contrarrestar el efecto perjudicial en la formulación pura de TIDE® compacto.

[0340] Se usó como método DOE un modelo completo de superficie de respuesta con un diseño compuesto

15 central con duplicación de puntos centrales. Se realizaron previamente un total de 16 formulaciones únicas variando cuatro componentes, de acuerdo con las variaciones de composición enumeradas en la Tabla 19.1. LAS varió de 0 – 6 % (p/p) con DTPA (0 -0.25 %) y formiato cálcico (0 -0.2 %) a una concentración fija de ácido cítrico (1.9 %). El resto de componentes del detergente TIDE® se mantuvieron constantes. Las condiciones límite de concentración de componentes se determinaron en función de la estabilidad de fase de las diversas mezclas.

20 Las pruebas de estabilidad de proteínas se realizaron con 780 ppm de nprE en las mezclas de formulación puras (~100 %) y se incubaron a 32 °C. La inactivación se midió hasta 24 horas. Todos los ensayos se realizaron por medio del kit de ensayo de caseína marcada con rojo fluorescente (Invitrogen) con 0.5 ppm de concentración de proteínas. Las tasas de inactivación de NprE se midieron en tres experimentos independientes. Los datos de DOE se analizaron por medio de DOE Fusion Pro (S-Matrix).

25

Tabla 20.1. Composición de las 16 formulaciones de TIDE® usadas para los estudios de DOE

HLAS: Ácido cítrico DTPA Formiato de Ca

Form. 1: 3 1.9 0 0.1

Form. 2: 3 1.9 0.125 0.1

Form. 3: 3 1.9 0.25 0.1

Form. 4: 6 1.9 0.25 0.2

Form. 5: 0 1.9 0 0.2

Form. 6: 6 1.9 0 0.2

Form. 7: 0 1.9 0.25 0.2

Form. 8: 6 1:9 0.125 0.1

Form. 9: 6 1.9 0.25 0

Form. 10: 0 1.9 0.125 0.1

Form. 11: 6 1.9 0 0

Form. 12: 3 1.9 0.125 0

Form. 13: 0 1.9 0.25 0

Form. 14: 3 1.9 0.125 0.1

Form. 15: 0 1.9 0 0

Form. 16: 3 1.9 0.125 0.2

[0341] La Tabla 20.2 y la Figura 31 muestran los resultados de las medidas de estabilidad de NprE en diversas mezclas de formulaciones. Las tasas medias y la desviación típica fueron la tasa de inactivación de NprE (hora-1) media de tres medidas independientes. Cualitativamente, las formulaciones con un bajo contenido de DTPA con 30 una alta carga de calcio tienden a ser más estables en el TIDE® compacto puro. A modo de ejemplo, la Formulación 5, sin adición de DTPA y un alto nivel de formiato cálcico mostró la tasa de inactivación más baja de todas, lo que indicó una alta estabilidad de NprE. Por el contrario, la Formulación 9, con una alta concentración de DTPA y sin añadir formiato cálcico mostró la estabilidad más baja de todas. En la Tabla 20.2, la clasificación se basa en la estabilidad medida (es decir, las tasas medias). Las medidas provienen de tres experimentos de

35 estabilidad independientes.

Tabla 20.2. Tasas de inactivación de NprE en 16 mezclas de formulaciones

Clasif.: Med. 1 Med. 2 Med. 3 Tasa media (hora -1) Desviación típica

Form. 5: 1 0.031 0.053 0.067 0.050 0.019

Form. 1: 2 0.060 0.044 0.081 0.062 0.019

Form. 15: 3 0.050 0.079 0.060 0.063 0.015

Form. 6: 4 0.312 0.057 0.059 0.143 0.147

Form. 7: 5 0.364 0.254 0.128 0.249 0.118

Form. 11: 6 0.099 0.288 0.395 0.261 0.150

Form. 10: 7 0.337 0.238 0.226 0.267 0.061

Form. 16: 8 0.063 0.593 0.188 0.281 0.277

Form. 2: 9 0.392 0.372 0.296 0.354 0.051

Form. 14: 10 0.387 0.451 0.269 0.369 0.093

Form. 4: 11 0.665 0.333 0.336 0.445 0.191

Form. 8: 12 0.682 0.554 0.378 0.538 0.153

Form. 3: 13 0.864 0.440 0.389 0.566 0.261

Form. 13: 14 1.417 0.931 0.964 1.104 0.272

Form. 12: 15 1.005 1.620 1.029 1.218 0.349

Form. 9: 16 0.875 2.099 0.694 1.223 0.764

[0342] La Figura 33 muestra los efectos de inactivación de NprE por DTPA a diversos niveles de una concentración fija de formiato cálcico. El Gráfico A muestra la tasa de inactivación de NprE por DTPA sin adición de formiato cálcico. La correlación muestra que DTPA presenta un efecto perjudicial significativo. El Gráfico B

5 muestra algo de disminución del efecto de DTPA con 0.1 % de formiato cálcico. El Gráfico C muestra una disminución significativa del efecto de DTPA con 0.2 % de formiato cálcico.

[0343] La Figura 34 muestra un perfil de predicción generado por el software de análisis de DOE (Fusion Pro) de la composición de DTPA y formiato cálcico en función de un objetivo de respuesta (tasa de decrecimiento) 10 inferior a 0.5 h-1 (Gráfico A), 0.25 h-1 (Gráfico B) y 0.05 h-1 (Gráfico C). Las zonas sombreadas indican relaciones de composiciones de DTPA y formiato cálcico que se prevé que mostrarán estabilidad con una tasa de decrecimiento por debajo del objetivo establecido. Por ejemplo, 0.16 % de formiato cálcico en presencia de

0.04 % de DTPA proporcionará estabilidad a la NprE, con una tasa de decrecimiento inferior a 0.25 hora-1 , como

se muestra en el Gráfico B de la Figura 34. Por otro lado, 0.08 % de formiato cálcico no puede mantener la 15 estabilidad de la NprE, con una tasa de decrecimiento de al menos 0.25 hora-1 en presencia de 0.16 % de DTPA.

EJEMPLO 21

Identificación de los puntos de autolisis inducidos por citrato para metaloproteasa neutra NprE de B. 20 amyloliquefaciens

[0344] En este Ejemplo, se describen los métodos usados para evaluar la autolisis inducida por citrato de nprE natural y la variante recombinante de nprE (por ejemplo, variante de B. subtilis). En estos experimentos, se indujo la autolisis de la metaloproteasa neutra de B. amyloliquefaciens (natural y la variante recombinante expresada en 25 B. subtilis) por medio de citrato de sodio (Sigma). El proceso de autolisis se controló al llevar a cabo la reacción a 4 °C en 25 mM de tampón MES, pH 6.5. En estos experimentos, se optimizó la autolisis de 0.4 mg/ml de NprE al variar o bien: (a) el tiempo de incubación (10-100 minutos) en 10 mM de citrato; o (b) la concentración de citrato (10-100 de mM) pasados los 100 minutos. Se incubó un control de metaloproteasa neutra diluido solo en tampón (es decir, sin citrato) en condiciones similares. Se puso fin a las reacciones autolíticas al añadir un volumen igual

30 de 1N de HCl, las muestras se precipitaron por medio de TCA y el sedimento se lavó y secó mediante acetona. El sedimento resultante se volvió a suspender en 20 uL de tampón, pH 6.5 y tampón de muestra 4X LDS (NuPage, Invitrogen).

[0345] Los fragmentos autolíticos se separaron por medio de SDS-PAGE al 10 % (p/v) y se transfirieron por

35 electrotransferencia a una membrana de PVDF. Los 10 primeros residuos de aminoácidos se secuenciaron por degradación de Edman (Argo Bioanalytica). Se determinaron las secuencias de aminoácidos parciales de los fragmentos autolíticos por medio de digestión en gel con tripsina y se analizaron mediante EM-LCQ (Agilent). El

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[0351] La digestión con tripsina seguida de EM-LCQ de los mapas peptídicos para los fragmentos del 1 al 5 identificó de manera positiva varios péptidos de aminoácidos en los respectivos fragmentos. Estos se destacan en la Figura 35. La EM-LCQ ofreció un control positivo para la identificación de los fragmentos.

[0352] En función del extremo N-terminal y el análisis EM-LCQ de los fragmentos de corte, los sitios de corte

5 primarios se identificaron en las posiciones de aminoácidos D220, A221, G222, M138 y L198. Estos sitios se localizaron por medio de mutagénesis dirigida y se crearon genotecas de evaluación del sitio de D220, A221, G222, L198 y M138, D139. Se cribaron las proteínas mutantes en busca de un aumento de la estabilidad en detergente y de un rendimiento de lavado de BMI, como se indica en la presente memoria. En algunos casos, también se seleccionaron los aminoácidos a lo largo de dichos sitios para ingeniería de proteínas, con el objetivo

10 de garantizar que el sitio de corte se había localizado de hecho.

[0353] Los resultados de ingeniería de proteínas indicaron claramente que las sustituciones de aminoácidos de Pro o Glu en D220 generaron una molécula de NprE que es más estable en detergente. Además, se le confirió una estabilidad adicional a la molécula de NprE al sustituir G222 con Cys y M138 con o Ile o Leu. En general, estas sustituciones de aminoácidos específicas dotaron a la NprE de ventajas en relación a la estabilidad del 15 detergente sin comprometer el rendimiento de lavado de BMI. Por tanto, estos experimentos proporcionan importantes datos de cartografía para los sitios de autolisis inducida por citrato, lo que facilita la identificación de residuos de aminoácidos clave que alteran y afectan a la estabilidad global de NprE. El citrato (que es un adyuvante que se añade a las matrices de detergente) desestabiliza y realiza la autolisis de NprE, y se sugiere que lo hace al quelatar los átomos esenciales unidos a calcio. La aplicación de NprE en condiciones de

20 detergentes agresivos exige que se utilice una molécula de NprE más estable en dichas situaciones. En estos experimentos, las sustituciones de uno o varios de los sitios de autolisis de NprE ha dado lugar a una molécula de nprE más estable respecto al detergente para su uso en estos detergentes agresivos.

EJEMPLO 22

Composiciones detergentes líquidas para ropa

25 [0354] En este Ejemplo, se proporcionan diversas formulaciones para composiciones detergentes líquidas para ropa. Se preparan las siguientes composiciones detergentes líquidas para ropa de la presente invención:

Compuesto: Formulaciones

I: II III IV V

LAS: 24.0 32.0 6.0 3.0 6.0

HSAS NaC16-C17: - - - 5.0 -

AE1.8S C12-C15: - - 8.0 7.0 5.0

Propildimetilamina C8-C10: 2.0 2.0 2.0 2.0 1.0

Óxido de alquildimetilamina C12-C14: - - - - 2.0

AS C12-C15: - - 17.0 - 8.0

CFAA: - 5.0 4.0 4.0 3.0

Alcoholetoxilato graso C12-C14: 12.0 6.0 1.0 1.0 1.0

Ácido graso C12-C18: 3.0 - 4.0 2.0 3.0

Ácido cítrico (anhidro): 4.5 5.0 3.0 2.0 1.0

DETPMP: - - 1.0 1.0 0.5

Monoetanolamina: 5.0 5.0 5.0 5.0 2.0

Hidróxido sódico: - - 2.5 1.0 1.5

1 N de solución acuosa de HCl: #1 #1 - - -

Propanodiol: 12.7 14.5 13.1 10. 8.0

Etanol: 1.8 2.4 4.7 5.4 1.0

DTPA: 0.5 0.4 0.3 0.4 0.5

Pectina liasa: - - - 0.005 -

Amilasa: 0.001 0.002 - -

Celulasa: - - 0.0002 0.0001

Lipasa: 0.1 - 0.1 - 0.1

Compuesto: Formulaciones

I: II III IV V

nprE: 0.05 0.3 - 0.5 0.2

PMN: - - 0.08 - -

Proteasa A: - - - - 0.1

Aldosa oxidasa: - - 0.3 - 0.003

ZnCl2: 0.1 0.05 0.05 0.05 0.02

Formiato de Ca: 0.05 0.07 0.05 0.06 0.07

DETBCHD: - - 0.02 0.01 -

SRP1: 0.5 0.5 - 0.3 0.3

Ácido bórico: - - - - 2.4

Xilenosulfonato de sodio: - - 3.0 - -

Cumenosulfato de sodio: - - - 0.3 0.5

DC 3225C: 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

2-butiloctanol: 0.03 0.04 0.04 0.03 0.03

Blanqueador 1: 0.12 0.10 0.18 0.08 0.10

Resto hasta 100 % perfume/tinte y/o agua

#1: Añadir 1N de solución acuosa de HCl para ajustar el pH puro de la fórmula en el intervalo de 3 aproximadamente a 5 aproximadamente.

[0355] El pH de los Ejemplos anteriores 22(I)-(II) es de 5 aproximadamente a 7 aproximadamente, y de 22(III)-(V) es de aproximadamente 7.5 a 8.5 aproximadamente.

EJEMPLO 23 Composiciones detergentes líquidas de lavavajillas a mano [0356] En este Ejemplo, se proporcionan diversas formulaciones de detergente líquidas de lavavajillas a mano.

Las siguientes son composiciones detergentes líquidas de lavavajillas a mano de la presente invención:

Compuesto: Formulaciones

I: II III IV V VI

AE1.8S C12-C15: 30.0 28.0 25.0 - 15.0 10.0

LAS: - - - 5.0 15.0 12.0

Sulfonato de parafina: - - - 20.0 - -

Óxido de alquildimetilamina C10-C18: 5.0 3.0 7.0 - - -

Betaína: 3.0, - 1.0 3.0 1.0 -

Amida de ácido graso poli-OH C12: - - - 3.0 - 1.0

Amida de ácido graso poli-OH C14: - 1.5 - - - -

C11E9: 2.0 - 4.0 - - 20.0

DTPA: - - - - 0.2 -

Citrato de trisodio dihidratado: 0.25 - - 0.7 - -

Diamina: 1.0 5.0 7.0 1.0 5.0 7.0

MgCl2: 0.25 - - 1.0 - -

nprE: 0.02 0.01 - 0.01 - 0.05

PMN: - - 0.03 - 0.02 -

Proteasa A: - 0.01 - - - -

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Claims

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