KR20140056237A - 알파-아밀라제 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모 알파-아밀라제의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물, 벡터 및 숙주 세포; 그리고 이 변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

알파-아밀라제 변이체{ALPHA-AMYLASE VARIANTS}

서열 목록에 대한 참고 사항

본 출원은 컴퓨터로 판독 가능한 형태로 서열 목록을 포함하며, 상기 서열 목록은 본원에 참조로 포함되어 있다.

본 발명의 분야

본 발명은 알파-아밀라제 변이체, 이 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 제조하는 방법 및 상기 변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

알파-아밀라제(알파-1,4-글루칸-4-글루카노하이드롤라제, E.C.3.2.1.1)는, 전분과 기타 다른 선형 및 분지형의 1,4-글루코시드 올리고당체 및 다당체의 가수 분해를 촉진하는 효소 군을 구성한다.

몇 가지 알려진 응용, 예를 들어 고농도 프럭토스 시럽 제조시, 또는 전분으로부터의 에탄올 생산의 부분으로서, 예를 들어 세제, 베이킹, 양조, 전분 액화 및 당화에 있어서 알파-아밀라제의 산업적 사용은 오랜 역사가 있다. 이러한 알파-아밀라제의 용도 및 기타 다른 용도가 알려져 있으며, 미생물로부터 유래되는 알파-아밀라제, 특히 박테리아 알파-아밀라제를 이용한다.

가장 많이 사용되는 박테리아 알파-아밀라제는 비.리케니포르미스(B.licheniformis)로부터 유래되는 알파-아밀라제(터마밀(Termamyl)이라고도 알려짐)로서, 이것의 특성은 널리 규명되어 있으며, 이 효소에 대한 결정 구조도 결정되었다. 알칼리성 아밀라제, 예를 들어 AA560은 세제에 사용되는 것으로 알려진 알파-아밀라제의 특정 군을 형성한다. 이러한 공지된 박테리아 아밀라제 다수는 변형되어, 특정 응용에 있어서 자체의 기능성을 개선하였다.

알파-아밀라제의 열안정성을 증가시키는 방법에 대해서는 널리 연구되어 있다. Suzuki et al.(1989)는 비.아밀로리크패이션스(B. amyloliquefaciens) 알파-아밀라제의 특정 영역이 비.리케니포르미스 알파-아밀라제의 상응하는 영역으로 교체된 키메라 알파-아밀라제를 개시한다. 키메라 알파-아밀라제는 열안정성에 관여하는 영역들을 동정하기 위한 목적으로 구성되었다. 이와 같은 영역들은 비.아밀로리크패이션스 알파-아밀라제의 177번 내지 186번 아미노산 잔기들과 255번 내지 270번 아미노산 잔기들을 포함하는 것으로 확인되었다. Igarashi et al.(1998)는 AmyS-형 아밀라제의 열안정성이 루프(F178 내지 A184)로부터 2개의 아미노산 잔기들, 즉 R179-G180(AmyS 번호 매김)의 결실에 의해 증가될 수 있음을 나타낸다. 그러나, Shiau et al.(2003)는, 상기와 동일한 루프에 결실이 있는 AmyS 효소는 모 효소보다 고온에서의 옥수수 전분 가수 분해에 대한 비활성이 더 낮음을 나타내었는데, 이는 AmyS 아밀라제의 중요 이점들 중 하나를 부인하는 것이다.

환경적 이유로, 세척, 식기 세척 및/또는 세정 과정에 있어서 온도를 낮추는 것이 점점 중요하게 되었다. 그러나, 아밀라제를 비롯한 대부분의 효소들은 최적 온도가 저온 세척에 통상적으로 사용되는 온도를 초과한다. 알파-아밀라제는 세제 조성물에 사용되는 중요 효소로서, 이 효소의 사용은 세탁 또는 식기 세척 동안 전분 얼룩의 제거에 대하여 점점 더 중요하게 되었다. 그러므로, 온도가 낮을 때에도 세척 성능, 얼룩 제거 효능 및/또는 활성을 보유하는 알파-아밀라제 변이체를 찾아내는 것이 중요하다. 그러나, 현재 세제 효소 조성물의 효능에도 불구하고, 완전히 제거하는 것이 어려운 얼룩들이 많이 있다. 이러한 문제점들은 낮은(예를 들어, 냉수) 세척 온도 및 더 짧은 세척 주기의 사용 증가에 의해 더 심각해졌다. 그러므로, 저온에서도 기능을 발휘할 수 있음과 동시에 기타 다른 원하는 특성들, 예를 들어 비활성(아밀로스 분해 활성), 안정성 및/또는 세척 성능을 보존 또는 강화할 수 있는 아밀로스 분해 효소를 가지는 것이 바람직하다.

그러므로, 저온, 예를 들어 5℃ 내지 35℃에서의 세척, 식기 세척 및/또는 세정 과정에서 사용될 수 있는 알파-아밀라제 변이체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 저온 세척 성능이, 모 알파-아밀라제에 비하여 또는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 서열들 중 임의의 것의 알파-아밀라제에 비하여 저온에서의 세척 성능이 개선된 알파-아밀라제 변이체를 제공하는 것이 본 발명의 추가 목적이다.

본 발명은, 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드의 위치 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477에 상응하는 위치 2개 이상(수 개)에 변형을 포함하는 모 알파-아밀라제의 분리된 변이체에 관한 것으로서, 여기서 각각의 변형은 독립적으로 치환, 결실 또는 삽입이고, 상기 변이체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 서열들 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 80% 이상이되 100% 미만이며, 상기 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가진다.

본 발명은 또한 변이체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드; 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물, 벡터 및 숙주 세포; 그리고 상기 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이와 같은 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은, 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드의 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치에 상응하는 위치 2개 이상(수 개)에 변형을 포함하는 모 알파-아밀라제의 분리된 변이체에 관한 것으로서, 여기서 각각의 변형은 독립적으로 치환, 결실 또는 삽입이고, 상기 변이체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 서열들 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 80% 이상이되 100% 미만이며, 상기 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가진다.

정의

알파-아밀라제 활성: "알파-아밀라제 활성"이라는 용어는, 전분과 기타 다른 선형 및 분지형 1,4-글루코시드 올리고당체 및 다당체의 가수 분해를 촉매하는 효소 군을 이루는 알파-1,4-글루칸-4-글루카노하이드롤라제(E.C.3.2.1.1)의 활성을 의미한다.

변이체 : "변이체"란 용어는, 1개 이상의(수 개의) 위치에 변형, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는, 알파-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 치환이란, 하나의 위치를 점유하고 있는 아미노산을 이 아미노산과 상이한 아미노산으로 교체하는 것을 의미하고; 결실이란, 하나의 위치를 점유하고 있는 아미노산을 제거하는 것을 의미하며; 삽입이란, 하나의 위치를 점유하고 있는 아미노산에 인접한 위치에 1개 내지 3개의 아미노산을 부가하는 것을 의미한다.

돌연 변이체 : "돌연 변이체"란 용어는, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

야생형 효소: "야생형" 알파-아밀라제란 용어는, 천연에 존재하는 미생물, 예를 들어 천연에서 발견되는 박테리아, 효모 또는 사상 진균에 의해 발현되는 알파-아밀라제를 의미한다.

모 효소 또는 모 알파-아밀라제: "모 효소" 또는 "모 알파-아밀라제"란 용어는, 본 발명의 효소 변이체를 제조하기 위해 변형이 가하여진 알파-아밀라제를 의미한다. 모 효소는 천연 생성된(야생형) 폴리펩티드 또는 이의 변이체일 수 있다.

분리된 변이체 : "분리된 변이체"용어는, 사람의 손으로 변형된 변이체를 의미한다. 하나의 양태에서, 변이체의 순도는 1% 이상, 예를 들어 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상 그리고 90% 이상이다(SDS-PAGE로 측정).

실질적으로 순수한 변이체 : "실질적으로 순수한 변이체"란 용어는, 변이체와 원래부터 또는 재조합에 의해 결합된 기타 다른 폴리펩티드 물질을 10중량% 이하, 8중량% 이하, 6중량% 이하, 5중량% 이하, 4중량% 이하, 3중량% 이하, 2중량% 이하, 1중량% 이하 및 0.5중량% 이하 포함하는 제조물을 의미한다. 바람직하게, 변이체의 순도는 상기 제조물 중에 존재하는 총 폴리펩티드 물질의 중량을 기준으로 92% 이상, 예를 들어 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 그리고 100% 이상이다. 본 발명의 변이체는 실질적으로 순수한 형태인 것이 바람직하다. 이는, 예를 들어 널리 공지된 재조합 방법 또는 통상적인 정제 방법에 의해 변이체를 제조함으로써 얻어질 수 있다.

성숙 폴리펩티드: "성숙 폴리펩티드"란 용어는, 번역 및 임의의 번역후 변형, 예를 들어 N-말단 가공, C-말단 가공, 당화 및 인산화 등을 거친 최종 형태의 폴리펩티드를 의미한다.

성숙 폴리펩티드 암호화 서열: "성숙 폴리펩티드 암호화 서열"이란 용어는, 알파-아밀라제 활성을 가지는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

서열 동일성: 2개의 아미노산 서열들 또는 2개의 뉴클레오티드 서열들 간 관련성은 매개 변수인 "서열 동일성"에 의해 기술된다.

본 발명의 목적을 위하여, 2개의 아미노산 서열들 간 서열 동일성 정도는 니들먼-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)(EMBOSS 팩키지(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.16:276-277)의 니들 프로그램(바람직하게는 3.0.0 버전 또는 이 이후의 버전)으로 수행)을 이용하여 측정된다. 이용된 임의의 매개 변수들로서는 갭 개방 페널티(gap open penalty)(10), 갭 연장 페널티(gap extension penalty)(0.5) 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스가 있다. 니들 아웃풋("최장 동일성(longest identity)"이라 명명)(-노브리프 옵션(-nobrief option)을 사용하여 얻어짐)은 동일성 백분율로서 사용되고, 다음과 같이 산정된다:

(동일한 잔기들 × 100) / (정렬의 길이 - 정렬 중 갭의 총수)

본 발명의 목적을 위하여, 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열들 간 서열 동일성 정도는 니들먼-운치 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, 상동)(EMBOSS 팩키지(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 상동)의 니들먼 프로그램(바람직하게는 3.0.0 버전 또는 이 이후의 버전)으로 수행)을 사용하여 측정된다. 이용된 임의의 매개 변수들로서는 갭 개방 페널티(10), 갭 연장 페널티(0.5) 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스가 있다. 니들 아웃풋("최장 동일성"이라 명명)(-노브리프 옵션을 사용하여 얻어짐)은 동일성 백분율로서 사용되고, 다음과 같이 산정된다:

(동일한 데옥시리보뉴클레오티드 × 100) / (정렬의 길이 - 정렬 중 갭의 총수)

단편: "단편"이란 용어는, 성숙 폴리펩티드의 아미노 말단 및/또는 카복실 말단으로부터 1개 이상의(수 개의) 아미노산이 결실된 폴리펩티드를 의미하며; 여기서, 상기 단편은 알파-아밀라제 활성을 가진다.

부분 서열: "부분 서열"이란 용어는, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단으로부터 1개 이상의(수 개의) 뉴클레오티드들이 결실된 폴리뉴클레오티드를 의미하며; 여기서, 상기 부분 서열은 알파-아밀라제 활성을 가지는 단편을 암호화한다.

대립 유전자 변이체 : "대립 유전자 변이체"란 용어는, 동일한 염색체 위치를 점유하는 유전자의 대안형 2개 이상 중 임의의 것을 의미한다. 대립 유전자 변이는 돌연 변이를 통해 천연 발생하며, 모집단 내에 다형성을 형성한다. 유전자 돌연 변이는 침묵 돌연 변이(암호화된 폴리펩티드에 변화가 없는 돌연 변이)일 수 있거나, 또는 아미노산 서열들이 변형된 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체는 유전자의 대립 유전자 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드이다.

분리된 폴리뉴클레오티드: "분리된 폴리뉴클레오티드"란 용어는, 용어는, 사람의 손으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 하나의 양태에서, 분리된 폴리뉴클레오티드의 순도는 1% 이상, 예를 들어 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상, 90% 이상 그리고 95% 이상이다(아가로스 전기 영동에 의해 측정). 폴리뉴클레오티드는 게놈 폴리뉴클레오티드, cDNA 또는 RNA이거나, 반합성 또는 합성되어 유래된 폴리뉴클레오티드들, 또는 이것들의 임의의 조합체일 수 있다.

실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드: "실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드"란 용어는, 기타 다른 외부 뉴클레오티드 또는 원치않는 뉴클레오티드를 포함하지 않으며, 유전자 조작된 폴리펩티드 생산 시스템 내에서 사용되기 적당한 형태를 가지는 폴리뉴클레오티드 제조물을 의미한다. 그러므로, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 원래부터 또는 재조합에 의해 결합된 기타 다른 폴리뉴클레오티드를 10중량% 이하, 8중량% 이하, 6중량% 이하, 5중량% 이하, 4중량% 이하, 3중량% 이하, 2중량% 이하, 1중량% 이하, 그리고 0.5중량% 이하 포함한다. 그러나, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 천연 생성된 5'-비번역 영역 및 3'-비번역 영역, 예를 들어 프로모터 및 종결 인자를 포함할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드의 순도는 90중량% 이상, 예를 들어 92중량% 이상, 94중량% 이상, 95중량% 이상, 96중량% 이상, 97중량% 이상, 98중량% 이상, 99중량% 이상, 그리고 99.5중량% 이상인 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드들은 실질적으로 순수한 형태를 가지는 것이 바람직하다.

암호화 서열: "암호화 서열"이란 용어는, 제제의 폴리펩티드 생성물을 이루는 아미노산 서열을 직접 특정하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 개방 해독틀)(일반적으로 ATG 개시 코돈 또는 대안적 개시 코돈, 예를 들어 GTG 및 TTG로 시작되어, 종결 코돈, 예를 들어 TAA, TAG 및 TGA로 끝남)에 의해 결정된다. 암호화 서열은 DNA, cDNA, 합성 또는 재조합 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

cDNA : "cDNA"란 용어는, 성숙한 것, 즉 스플라이싱(splicing)된 mRNA 분자(진핵 생물 세포로부터 얻어진 것)로부터 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. cDNA는 이와 상응하는 게놈 DNA 내에 존재할 수 있는 인트론 서열들을 포함하지 않는다. 초기의 1차 RNA 전사체는, 성숙한 것, 즉 스플라이싱된 mRNA로서 발현되기 전, 스플라이싱을 비롯한 일련의 단계들을 통하여 가공된 mRNA의 전구체이다.

핵산 구조물: "핵산 구조물"이란 용어는, 단일 사슬 또는 이중 사슬 형태의 핵산 분자로서, 천연 생성 유전자로부터 분리된 것, 또는 천연에서는 볼 수 없거나 합성에 의한 방식으로 제조된 핵산들의 분절들을 포함하도록 변형된 것을 의미한다. 핵산 구조물이란 용어는, 핵산 구조물이 본 발명의 암호화 서열의 발현에 필요한 제어 서열들을 포함할 때 용어 "발현 카세트"와 동일한 의미를 갖는다.

제어 서열: "제어 서열"이란 용어는, 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 모든 구성 요소들을 의미한다. 각각의 제어 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 원래 존재하는 것일 수 있거나 이 폴리뉴클레오티드에 외래인 것일 수 있거나, 또는 각각이 원래 존재하는 것일 수 있거나 서로에 대해 외래인 것일 수 있다. 이와 같은 제어 서열로서는 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 전사 종결 인자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 최소한 제어 서열들은 프로모터와, 전사 및 번역 종결 신호를 포함한다. 제어 서열에는, 이 제어 서열들과 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 암호화 영역의 결찰을 촉진하는 특이적 제한 위치들을 도입하기 위한 링커들이 제공될 수 있다.

작동 가능하도록 결합된 : "작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 제어 서열이 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열을 기준으로 적당한 위치에 존재하여 암호화 서열의 발현을 유도하도록 배치된 경우를 의미한다.

발현: "발현"이란 용어는, 변이체 제조와 관련된 임의의 단계, 예를 들어 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비(이에 한정되는 것은 아님)를 포함한다.

발현 벡터: "발현 벡터"란 용어는, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 부가의 뉴클레오티드와 작동 가능하도록 결합되어 있는, 선형 또는 환형 DNA 분자를 의미한다.

숙주 세포: "숙주 세포"란 용어는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물 또는 발현 벡터에 의한 형질 전환, 형질 감염 및 형질 도입 등에 감수성인 임의의 유형의 세포를 의미한다. "숙주 세포"란 용어에는, 복제시 일어나는 돌연 변이로 인해 부모 세포와 동일하지 않게 된, 부모 세포의 임의의 자손도 포함된다.

전분 제거 공정: "전분 제거 공정"이란 표현은, 예를 들어 전분이 직물로부터 제거되는 세척 공정, 예를 들어 직물 세척(예를 들어, 세탁)에 있어서 전분이 제거(또는 전환)되는 임의의 종류의 공정과 관련있다. 전분 제거 공정은 또한 경질 표면의 세정, 예를 들어 식기 세척일 수 있거나, 또는 일반적인 세정 공정, 예를 들어 산업상 세정 공정 또는 영업상 세정 공정일 수 있다. 상기 표현에는 일반적으로, 기타 다른 전분 제거 공정이나 전분 전환, 에탄올 생산, 전분 액화, 직물의 풀기 제거, 종이 및 펄프 생산, 맥주 주조 및 세제 사용 공정을 포함하기도 한다.

개선된 특성: "개선된 특성"이란 용어는, 모 효소에 비하여 개량된 변이체와 연관된 특징을 의미한다. 이와 같이 개선된 특성으로서는 열활성, 열안정성, pH 활성, pH 안정성, 기질/보조 인자 특이성, 개선된 표면 특성, 생성물 특이성, 전처리된 바이오매스 존재시 안정성 또는 가용성 증가, 보관 조건 하에서의 개선된 안정성 및 화학 안정성을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

세척 성능: 본 발명의 내용 중 "세척 성능"이란 용어는, 예를 들어 세탁이나 경질 표면 세정, 예를 들어 식기 세척시 세정될 물체상에 존재하는 전분 또는 전분 함유 얼룩을 제거하는 효소의 능력을 일컫는데 사용된다. 세척 성능은, 소위 세기 값(intensity value)(int)(AMSA에 관한 설명 또는 비이커 세척 성능 테스트(이하 방법 섹션 참조)에서 정의됨)을 산정함으로써 정량될 수 있다.

개선된 세척 성능: 본원에서 "개선된 세척 성능"이란 용어는, 아밀라제 변이체 세척 성능이, 모 아밀라제의 세척 성능, 또는 변이체의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지되 특정 위치들 중 1개 이상의 위치에 결실이 발생하지 않은 알파-아밀라제의 세척 성능, 또는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 가지는 알파-아밀라제의 활성과 비교하였을 때 변화된(예를 들어, 얼룩 제거능의 강화), 변이체 효소의 성능으로서 정의된다. 일반적으로 "개선된 세척 성능"이란 용어는, 예를 들어 경질 표면의 세정능(식기 세척)을 포함할 뿐만 아니라, 섬유에 대한 세척 성능(예를 들어, 세탁), 그리고 산업상 및 영업상 세정능도 포함한다.

저온: "저온"이란, 5℃ 내지 35℃, 바람직하게는 5℃ 내지 30℃, 더 바람직하게는 5℃ 내지 25℃, 더 바람직하게는 5℃ 내지 20℃, 가장 바람직하게는 5℃ 내지 15℃, 특히 5℃ 내지 10℃의 온도를 말한다. 바람직한 구체예에서, "저온"이란, 10℃ 내지 35℃, 바람직하게는 10℃ 내지 30℃, 더 바람직하게는 10℃ 내지 25℃, 가장 바람직하게는 10℃ 내지 20℃, 특히 10℃ 내지 15℃의 온도를 말한다.

변이체 지정에 대한 관례

본 발명의 목적을 위해서, 서열 번호 1에 개시된 성숙 폴리펩티드는 또 다른 알파-아밀라제 내 상응하는 아미노산 잔기를 확인하는데 사용된다. 또 다른 알파-아밀라제의 아미노산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6에 개시된 성숙 폴리펩티드와 함께 정렬되며, 이와 같은 정렬을 바탕으로 하였을 때 서열 번호 2에 개시된 성숙 폴리펩티드 내 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치 번호는 니들먼-운치 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)(EMBOSS 팩키지(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.16:276-277)의 니들먼 프로그램(바람직하게는 3.0.0 버전 또는 이 이후의 버전)으로 수행)을 통하여 결정된다.

또 다른 알파-아밀라제 내 상응하는 아미노산 잔기의 동정 결과는, "클러스탈W(ClustalW)"를 이용하여 다수의 폴리펩티드 서열들을 정렬함으로써 확증될 수 있다(Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948).

기타 다른 효소가 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 6의 성숙한 폴리펩티드로부터 유래되어, 통상의 서열 기반 비교가 서열간 관계를 확인하는데 실패하였을 때(Lindahl 및 Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), 기타 다른 짝 서열 비교 알고리즘(pairwise sequence comparison algorithm)이 사용될 수 있다. 검색 데이터베이스에 대한 폴리펩티드 군의 확률적 표현(프로필)을 이용하는 검색 프로그램이 사용될 경우, 서열 기반 검색법의 정확도(sensitivity)는 더욱 커질 수 있다. 예를 들어 PSI-BLAST 프로그램은 반복적인 데이터베이스 검색 절차를 통하여 프로필들이 생성되고, 멀리 떨어져 존재하는 상동체의 특성까지도 간파될 수 있다(Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). 만일 폴리펩티드 군이나 상위군이 단백질 구조 데이터베이스의 대표예 1개 이상을 가지면 감도는 더욱더 커질 수 있다. 프로그램, 예를 들어 GenTHREADER(Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin 및 Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881)는 다양한 소스로부터 얻어진 정보를 중립 네트워크(미지의 서열에 대한 구조적 접힘 양상 예측)에 대한 인풋으로서 이용한다. 이와 유사하게, 문헌[Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919]의 방법은 미지의 구조를 가지는 서열을 SCOP 데이터베이스에 존재하는 상위군 모델과 함께 정렬하는데 사용될 수 있다. 이러한 정렬들은 결국 폴리펩티드에 대한 상동성 모델들을 생성하는데 사용될 수 있으며, 이러한 모델들은 상기와 같은 목적으로 개발된 다양한 도구들을 통해 자체의 정확도에 대해 평가될 수 있다.

공지된 구조를 가지는 단백질에 있어서, 몇 개의 도구와 원천은 구조상 정렬을 검색 및 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 단백질의 SCOP 상위군은 구조적으로 정렬되었으며, 이와 같은 정렬들은 입수 가능할뿐만 아니라 다운로드도 가능하다. 2개 이상의 단백질 구조는 다양한 알고리즘, 예를 들어 거리 정렬 매트릭스(distance alignment matrix)(Holm 및 Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) 또는 조합 연장 알고리즘(combinatorial extension algorithm)(Shindyalov 및 Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747)을 이용하여 정렬될 수 있으며, 이러한 알고리즘은 또한 생성 가능한 구조 상동체를 찾아내기 위하여, 관심있는 구조를 가지는 미지의 구조에 관한 데이터베이스에 대해 부가적으로 실행될 수 있다(예를 들어, Holm 및 Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

본 발명의 알파-아밀라제 변이체를 기술함에 있어서, 이하에 기술된 명명법은 인용의 편의를 위해 적용되는 것이다. 승인된 IUPAC 1문자 또는 3문자 아미노산 축약어가 사용된다.

치환: 아미노산 치환에 있어서는 다음과 같은 명명법이 사용된다: 원 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 그러므로 226번 위치에서 일어난 트레오닌의 알라닌으로의 치환은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"라고 명명된다. 다수의 돌연 변이들은 더하기 표시("+")로 분리되는데, 예를 들어 "Gly205Arg + Ser411Phe" 또는 "G205R + S411F"는 205번 위치의 글리신(G)이 아르기닌(R)으로 치환되었고, 411번 위치의 세린(S)이 페닐알라닌(F)으로 치환되었음을 나타낸다.

결실: 아미노산 결실에 있어서는 다음과 같은 명명법이 사용된다: 원 아미노산, 위치^*. 그러므로 195번 위치에서 일어난 글리신 결실은 "Gly195^*" 또는 "G195^*"라고 명명된다. 다수의 결실들은 더하기 표시("+")로 분리되는데, 예를 들어 "Gly195^* + Ser411^*" 또는 "G195^* + S411^*"로 표시된다.

삽입: 아미노산 삽입에 있어서는 다음과 같은 명명법이 사용된다: 원 아미노산, 위치, 원 아미노산, 삽입된 아미노산. 그러므로, 195번 위치의 글리신 다음에 리신이 삽입된 경우는 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"라고 명명된다. 다수의 아미노산들이 삽입된 경우는 다음과 같이 명명된다: 원 아미노산, 위치, 원 아미노산, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2 등. 예를 들어 195번 위치의 글리신 다음에 리신과 알라닌이 삽입된 경우는 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"라고 명명된다.

이와 같은 경우, 삽입된 아미노산 잔기(들)는 삽입된 아미노산 잔기(들)의 앞에 있는 아미노산 잔기의 위치 번호에 소문자를 부가함으로써 번호가 매겨진다. 상기와 같은 예의 경우, 서열은 다음과 같을 것이다:

다중 변형: 다중 변형을 포함하는 변이체는 더하기 표시("+")로 분리되는데, 예를 들어 "Arg170Tyr + Gly195Glu" 또는 "A170Y + G195E"는 170번 위치의 아르기닌이 티로신으로 치환되었고, 195번 위치의 글리신이 글루탐산으로 치환되었음을 나타낸다.

상이한 치환: 특정 위치에 상이한 치환들이 도입될 수 있는 경우, 상이한 치환들은 콤마(,)로 분리되는데, 예를 들어 "Arg170Tyr,Glu"는 170번 위치에서 아르기닌이 티로신이나 글루탐산으로 치환되었음을 나타내는 것이다. 그러므로, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala"는 다음과 같은 변이체들을 지정한다:

"Tyr167Gly + Arg170Gly", "Tyr167Gly + Arg170Ala", "Tyr167Ala + Arg170Gly" 및 "Tyr167Ala + Arg170Ala".

모 알파-아밀라제

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드(SP722)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수 있다.

하나의 양태에서, 모 효소와 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.

다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.

모 효소는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.

또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.

서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 이것들의 단편은, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라서 상이한 속이나 종의 균주로부터 모 효소를 암호화하는 DNA를 동정 및 클로닝하기 위한 핵산 프로브를 디자인하는데 사용될 수 있다. 특히 이러한 프로브는 관심 있는 속이나 종의 게놈 DNA 또는 cDNA와의 혼성화(표준적인 서던 블롯팅 방법에 따름)에 사용되어, 상기 게놈 DNA 또는 cDNA 내 상기 프로브와 상응하는 유전자를 동정 및 분리할 수 있다. 이와 같은 프로브의 길이는 전체 서열의 길이보다 훨씬 짧을 수 있지만, 14개 뉴클레오티드 이상, 예를 들어 25개 뉴클레오티드 이상, 35개 뉴클레오티드 이상 또는 70개 뉴클레오티드 이상은 되어야 한다. 상기 핵산 프로브의 길이는 100개 뉴클레오티드 이상, 예를 들어 200개 뉴클레오티드 이상, 300개 뉴클레오티드 이상, 400개 뉴클레오티드 이상, 500개 뉴클레오티드 이상, 600개 뉴클레오티드 이상, 700개 뉴클레오티드 이상, 800개 뉴클레오티드 이상 또는 900개 뉴클레오티드 이상인 것이 바람직하다. DNA 프로브와 RNA 프로브 둘 다 사용될 수 있다. 상기 프로브는 통상적으로 이와 상응하는 유전자를 검출하기 위해 (예를 들어, ³²P, ³H, ³⁵S, 바이오틴 또는 아비딘으로) 표지화된다. 이러한 프로브는 본 발명에 포함된다.

기타 다른 유기체로부터 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리는 상기 기술된 프로브와 혼성화되고 모 효소를 암호화하는 DNA에 대해 스크리닝될 수 있다. 이와 같이 기타 다른 유기체로부터 유래하는 게놈 DNA 또는 기타 다른 DNA는 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동이나 기타 다른 분리 기법에 의해 분리될 수 있다. 라이브러리로부터 유래하는 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀룰로스 또는 기타 다른 적당한 담체 재료(서던 블럿팅에 사용되는 재료) 상에 옮겨져 고정될 수 있다.

본 발명에 있어서, 혼성화란, 어떤 폴리뉴클레오티드가, 낮은 엄중도 조건으로부터 매우 높은 엄중도 조건에 이르는 조건 하에서 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분 서열에 상응하는, 표지화된 뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 것을 의미한다. 프로브가 혼성화되는 분자들은, 예를 들어 X선 필름 또는 당업계에 알려진 기타 다른 임의의 검출 수단을 통해 검출될 수 있다.

하나의 양태에서, 핵산 프로브는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편이다.

길이가 긴 프로브(길이 100개 뉴클레오티드 이상인 프로브)의 경우, 매우 낮은 엄중도 조건으로부터 매우 높은 엄중도 조건에 이르는 조건이란, 적당히는 12시간 내지 24시간 동안의 표준 서던 블럿팅 방법에 따라서, 5×SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성 연어 정자 DNA 200㎍/㎖, 25% 포름아미드(매우 낮은 엄중도 및 낮은 엄중도), 35% 포름아미드(중간 엄중도 및 중간-높은 엄중도), 또는 50% 포름아미드(높은 엄중도 및 매우 높은 엄중도)의 존재 하에서의 예비 혼성화 조건 및 혼성화 조건으로서 정의된다. 담체 재료는 최종적으로 3회 세척되는데, 이 경우, 다음과 같은 온도에서 15분 동안 2×SSC 및 0.2% SDS가 사용된다: 45℃(매우 낮은 엄중도), 50℃(낮은 엄중도), 55℃(중간 엄중도), 60℃(중간-높은 엄중도), 65℃(높은 엄중도) 또는 70℃(매우 높은 엄중도).

길이가 짧은 프로브(길이 약 15개 뉴클레오티드에서 약 70개 뉴클레오티드인 프로브)의 경우, 엄중도 조건이란, 적당히는 12시간 내지 24시간 동안의 표준 서던 블럿팅 방법에 따라서, 0.9M NaCl, 0.09M Tris-HCl pH 7.6, 6mM EDTA, 0.5% NP-40, 1×덴하르트 용액(Denhardt's solution), 1mM 피로인산나트륨, 1mM 1가 염기 인산니트륨, 0.1mM ATP 및 0.2㎎/㎖ 효모 RNA 중, 그리고 문헌[Bolton 및 McCarthy, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390]에 따른 산정법을 이용하여 산정된 T_m보다 약 5℃ 내지 약 10℃ 낮은 온도에서 이루어지는 예비 혼성화 조건 및 혼성화 조건으로서 정의된다. 담체 재료는 최종적으로 6×SSC 및 0.1% SDS 중에서 1회 세척되고(15분), 6×SSC를 사용하여 2회 세척된다(산정된 T_m보다 5℃ 내지 10℃ 낮은 온도에서 각각 15분씩).

모 효소는 임의의 속에 속하는 미생물로부터 얻어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 소정의 공급원과 연관하여 사용된 "~로부터 얻어지는"이란 용어는, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 효소가 특정 공급원 또는 세포(특정 공급원으로부터 유래하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 세포)에 의해 생산됨을 의미할 것이다. 하나의 양태에서 모 효소는 세포 외에 분비된다.

모 효소는 박테리아 알파-아밀라제일 수 있다. 예를 들어 모 효소는 그람 양성 박테리아 폴리펩티드, 예를 들어 바실러스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로코커스(Enterococcus), 지오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 알파-아밀라제이거나, 그람 음성 박테리아 폴리펩티드, 예를 들어 캄필로박터(Campylobacter), 이.콜라이(E. coli), 플라보박테리움(Flavobacterium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 리오박터(llyobacter), 네이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella) 또는 우레아플라스마(Ureaplasma) 알파-아밀라제일 수 있다.

하나의 양태에서, 모 효소는 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리크패이션스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퍼무스(Bacillus firmus), 바실러스 로투스(Bacillus lautus), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 알파-아밀라제이다.

다른 양태에서, 모 효소는 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis) 또는 스트렙토코커스 에퀴 아종 주에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus) 알파-아밀라제이다.

다른 양태에서, 모 효소는 스트렙토마이세스 아크로모제네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 또는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 알파-아밀라제이다.

모 효소는 진균 알파-아밀라제일 수 있다. 예를 들어 모 효소는 효모 알파-아밀라제, 예를 들어 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 알파-아밀라제일 수 있다. 예를 들어 모 효소는 사상 진균 알파-아밀라제, 예를 들어 아크레모니움(Acremonium), 아가리쿠스(Agaricus), 알터나리아(Alternaria), 아스퍼질러스(Aspergillus), 오레오바시디움(Aureobasidium), 보트리오스파에리아(Botryospaeria), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 카에토미디움(Chaetomidium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 클라비셉스(Claviceps), 코클리오볼루스(Cochliobolus), 코프리놉시스(Coprinopsis), 콥토터메스(Coptotermes), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토코커스(Cryptococcus), 디플로디아(Diplodia), 엑시디아(Exidia), 필리바시디움(Filibasidium), 푸사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 홀로마스티고토이데스(Holomastigotoides), 휴미콜라(Humicola), 어펙스(Irpex), 렌티뉼라(Lentinula), 렙토스파에리아(Leptospaeria), 마그나포르테(Magnaporthe), 멜라노카르푸스(Melanocarpus), 메리필러스(Meripilus), 뮤코(Mucor), 미셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 파네로카에테(Phanerochaete), 피로마이세스(Piromyces), 포이트라시아(Poitrasia), 슈도플렉타니아(Pseudoplectania), 슈도트리코님파(Pseudotrichonympha), 리조뮤코(Rhizomucor), 쉬조필럼(Schizophyllum), 사이탈리디움(Scytalidium), 탈라로마이세스(Talaromyces), 서모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트리코더마(Trichoderma), 트리코파에아(Trichophaea), 버티실리움(Verticillium), 볼바리엘라(Volvariella) 또는 자일라리아(Xylaria) 알파-아밀라제일 수 있다.

다른 양태에서, 모 효소는 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis) 또는 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis) 알파-아밀라제이다.

다른 양태에서, 모 효소는 아크레모니움 셀룰로리티쿠스(Acremonium cellulolyticus), 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오라이재(Aspergillus oryzae), 크리소스포리움 이놉스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필럼(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 머다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 파니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스랜디큠(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피큠(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나튬(Chrysosporium zonatum), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 큘모럼(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아럼(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미넘(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포럼(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네건디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티큘라텀(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 샘부시넘(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로세움(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나텀(Fusarium venenatum), 휴미콜라 그리세아(Humicola grisea), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 어프렉스 락테우스(Irpex lacteus), 뮤코 미에헤이(Mucor miehei), 마이셀리오프토라 서모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 퍼니큘로섬(Penicillium funiculosum), 페니실리움 퍼퓨로제넘(Penicillium purpurogenum), 파네로카에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 티엘라비아 아크로마티카(Thielavia achromatica), 티엘라비아 알보마이세스(Thielavia albomyces), 티엘라비아 알보필로사(Thielavia albopilosa), 티엘라비아 오스트랄레인시스(Thielavia australeinsis), 티엘라비아 피메티(Thielavia fimeti), 티엘라비아 마이크로스포라(Thielavia microspora), 티엘라비아 오비스포라(Thielavia ovispora), 티엘라비아 페루비아나(Thielavia peruviana), 티엘라비아 세토사(Thielavia setosa), 티엘라비아 스페데도니움(Thielavia spededonium), 티엘라비아 서브서모필라(Thielavia subthermophila), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트리코더마 하지아넘(Trichoderma harzianum), 트리코더마 코닌지(Trichoderma koningii), 트리코더마 론지브라키아텀(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 또는 트리코더마 비리드(Trichoderma viride) 알파-아밀라제이다.

다른 양태에서, 모 효소는 바실러스 종의 알파-아밀라제, 예를 들어 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 6의 알파-아밀라제이다.

상기 언급된 종들에 있어서, 본 발명은 완전한 상태 및 불완전한 상태의 종 둘 다 포함하며, 기타 다른 분류학상 균등 균주, 예를 들어 무성 세대 균주(종의 알려진 이름이 무엇이든 상관 없음)도 포함한다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 적당한 균등 균주의 고유성(identity)을 쉽게 알 것이다.

이러한 종들의 균주는 다수의 배양 수집소, 예를 들어 미국 모식균 배양 수집소(ATCC), 독일 생물 자원 센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM), 사균배지 중앙 보관소(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS) 및 농업 리서치 서비스 특허 배양 수집소, 북부 지역 리서치 센터(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center)(NRRL)를 통하여 공중이 용이하게 입수할 수 있다.

모 효소는 기타 다른 공급원, 예를 들어 자연(예를 들어, 토양, 비료 및 물 등)으로부터 분리된 미생물 또는 상기 업급된 프로브를 사용하여 천연 재료(예를 들어, 토양, 비료 및 물 등)로부터 직접 얻어진 DNA 샘플로부터도 동정되어 얻어질 수 있다. 천연 서식지로부터 직접 미생물 및 DNA를 분리하는 기법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이후, 모 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또 다른 미생물의 cDNA 라이브러리나 게놈 DNA 라이브러리, 또는 혼합된 DNA 샘플을 유사하게 스크리닝함으로써 유래될 수 있다. 일단 모 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로브(들)로 검출되면, 이 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 알려진 기법을 이용하여 분리 또는 클로닝될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989, 상동] 참조).

모 효소는 하나의 폴리펩티드 일부가 또 다른 폴리펩티드 일부의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된 하이브리드 폴리펩티드일 수 있다.

모 효소는 또한 하나의 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된, 융합 폴리펩티드 또는 절단 가능한 융합 폴리펩티드일 수 있다. 융합 폴리펩티드는, 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 또 다른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합함으로써 제조된다. 융합 폴리펩티드를 제조하는 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열들을 결찰하여 이 서열들을 해독 틀 내에 존재하도록 만들고, 융합된 폴리펩티드의 발현을 동일한 프로모터(들) 및 종결 인자의 제어 하에 두는 것을 포함한다. 융합 단백질은 또한 번역후 융합이 진행되는 인테인 기법(intein technology)을 사용하여 구성될 수도 있다(Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

융합 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드들 간 절단 위치를 추가로 포함할 수도 있다. 융합 단백질이 분비될 때, 상기 위치는 절단되고, 이때 2개의 폴리펩티드가 방출된다. 절단 위치의 예로서는 문헌[Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576]; [Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251]; [Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493]; [Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503]; [Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381]; [Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512]; [Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987]; [Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248]; 및 [Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48]에 개시된 위치들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

변이체의 제조

본 발명은 또한 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드의 140번, 181번, 189번, 134번, 195번, 206번, 243번, 260번, 262번, 284번, 304번, 347번, 439번, 469번, 476번 및 477번 위치에 상응하는, 모 알파-아밀라제의 위치 2개 이상(수 개)에 변형을 도입하는 단계(여기서, 번호 매김은 서열 번호 1에 따른 것이고, 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가짐); 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 알파-아밀라제 활성을 가지는 변이체를 얻는 방법에 관한 것이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드의 W140, R181, W189, D134, N195, V206, Y243, E260, F262, W284, G304, W347, W439, W469, G476 및 G477에 상응하는, 모 알파-아밀라제의 위치 2개 이상(수 개)에 변형을 도입하는 단계(여기서, 번호 매김은 서열 번호 1에 따른 것이고, 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가짐); 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 알파-아밀라제 활성을 가지는 변이체를 얻는 방법에 관한 것이다.

하나의 구체예에서, 도입된 변형은 치환이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드의 G304RKEQ, W140YF, W189EGT, D134E, E260ADCQLMFPSWVGHIKNRTY, F262GP, W284DHFYR, W347HFY, W439RG, G476EQRK, G477EQKMR에 상응하는 치환을, 모 알파-아밀라제의 위치 2개 이상(수 개)에 도입하는 단계(여기서, 번호 매김은 서열 번호 1에 따른 것이고, 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가짐); 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 알파-아밀라제 활성을 가지는 변이체를 얻는 방법에 관한 것이다.

바람직한 구체예에서, 도입된 치환은 G304R, W140YF, W189EGT, D134E, E260GHIKNRTY, W284DFR, W439RG, G476EK, G477EKMR 중 2개 이상이다. 더 바람직한 구체예에서, 도입된 치환은 G304R, W140YF, E260GHIKNPRTY 및 G476EQRK이다. 훨씬 더 바람직한 구체예에서, 알파-아밀라제 활성을 가지는 변이체를 얻는 방법은 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12 중 임의의 서열 내 G304R, W140Y, E260G 및 G476K 치환을 모 알파-아밀라제에 도입하는 단계(여기서, 번호 매김은 서열 번호 1에 따른 것이고, 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가짐); 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함한다. 변이체는 당업계에 공지된 임의의 돌연 변이 유발법, 예를 들어 위치 배향 돌연 변이 유발법, 합성 유전자 구성법, 반합성 유전자 구성법, 무작위 돌연 변이 유발법 및 셔플링(shuffling) 등을 사용하여 제조될 수 있다.

위치 배향 돌연 변이 유발법은 모 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내 특정된 위치 1개 이상에서 1개 이상(수 개)의 돌연 변이를 발생시키는 기법이다.

위치 배향 돌연 변이 유발법은 원하는 돌연 변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 시험관 내에서 진행될 수 있다. 위치 배향 돌연 변이 유발법은 또한, 모 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 내 임의의 위치를 해당 제한 효소로 절단한 후, 상기 폴리뉴클레오티드 내에 돌연 변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 결찰하는 것을 포함하는 카세트 돌연 변이 유발법에 의해 시험관 내에서 수행될 수도 있다. 일반적으로 플라스미드와 올리고뉴클레오티드를 절단하는 제한 효소는 동일한데, 이 제한 효소는 접착 말단(sticky end)을 만드는 방식으로 플라스미드를 절단할 수 있고, 삽입물과 상기 접착 말단을 상호 결찰시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[Scherer 및 Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955]; 및 [Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966]을 참조한다.

위치 배향 돌연 변이 유발법은 또한 당업계에 알려진 방법에 의해 생체 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어 미국 특허출원공개 제2004/0171154호; 문헌[Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776]; [Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290]; 및 [Calissano 및 Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16]을 참조한다.

임의의 위치 배향 돌연 변이 유발법이 본 발명에 사용될 수 있다. 변이체를 제조하는데 사용될 수 있는 키트가 다수 시판되고 있다.

합성 유전자 구성법은 관심 있는 폴리펩티드를 암호화하는, 디자인된 폴리뉴클레오티드 분자를 시험관 내 합성하는 것을 포함한다. 유전자 합성은 다수의 기법, 예를 들어 문헌[Tian et al.,2004, Nature 432:1050-1054]에 기술된 다중체 마이크로칩 기반 기법 및 이와 유사한 기법(광 프로그래밍 가능 미세 유체 칩(photo-programable microfluidic chip) 상에서 올리고뉴클레오티드를 합성 및 조립하는 기법)을 이용하여 수행될 수 있다.

단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은, 공지된 돌연 변이 유발법, 재조합법 및/또는 셔플링(shuffling)을 수행한 후, 관련된 스크리닝법, 예를 들어 문헌[Reidhaar-Olson 및 Sauer, 1988, Science 241: 53-57]; [Bowie 및 Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156]; WO 제95/17413호; 또는 WO 제95/22625호에 개시된 방법에 의해 이루어질 수 있을뿐만 아니라 테스트될 수 있다. 사용될 수 있는 기타 다른 방법으로서는 오류-유발 PCR, 파지 전시법(예를 들어, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; 미국 특허 제5,223,409호; WO 제92/06204호) 그리고 영역 배향 돌연 변이 유발법(Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127)을 포함한다.

돌연 변이 유발법/셔플링 방법은 클로닝 및 돌연 변이 유발된 폴리펩티드로서 숙주 세포에 의해 발현된 것의 활성을 확인하기 위한 고처리량 자동화 스크리닝 방법과 함께 수행될 수 있다(Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). 활성 폴리펩티드를 암호화하는 돌연 변이 유발 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수될 수 있으며, 업계의 표준 방법을 사용하여 신속하게 서열 결정될 수 있다. 이와 같은 방법들은 폴리펩티드 내 각각의 아미노산 잔기들의 중요성을 신속하게 확인할 수 있게 해준다.

반합성 유전자 구성법은, 합성 유전자 구성법 및/또는 위치 배향 돌연 변이 유발법 및/또는 무작위 돌연 변이 유발법 및/또는 셔플링의 양태들을 조합하여 수행된다. 반합성 구성법은 통상적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 단편들을 이용하는 방법을 PCR 기법과 함께 수행함으로써 진행된다. 그러므로 유전자의 특정 영역들이 새로이 합성될 수 있으며, 기타 다른 영역들은 위치 특이적 돌연 변이 유발 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있고, 또 다른 영역들은 이 영역들을 대상으로 하는 오류 유발 PCR 증폭법 또는 비 오류 유발 PCR 증폭법으로 증폭될 수 있다. 이후, 폴리뉴클레오티드 부분 서열은 셔플링될 수 있다.

변이체

본 발명은 또한 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드의 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치에 상응하는 위치 2개 이상(수 개)에 변형을 포함하는 모 알파-아밀라제의 변이체도 제공하는데, 여기서 각각의 변형은 독립적으로 치환, 삽입 또는 결실(바람직하게는 치환)이고, 상기 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가진다. 이에 의하여, 모 알파-아밀라제에 비하여, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 알파-아밀라제에 비하여 저온에서의 세척 성능이 개선된 변이체가 제공된다.

하나의 구체예에서, 변이체는 서열 동일성이 모 알파-아밀라제의 아미노산 서열에 대하여 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이되, 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드의 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치에 상응하는 위치 2개 이상(수 개)에 변형을 포함하는 알파-아밀라제의 분리된 변이체에 관한 것으로서, 여기서 각각의 변형은 독립적으로 치환, 결실 또는 삽입이고, 상기 변이체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 서열들 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 80% 이상이되 100% 미만이며, 상기 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가진다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

다른 구체예에서, 변이체는 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이되 100% 미만이다.

하나의 양태에서, 본 발명의 변이체 내 변형의 수는 변형이 2개 내지 20개, 예를 들어 2개 내지 10개 및 2개 내지 5개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개이다.

하나의 양태에서, 변이체는 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치에 상응하는 위치 2개 이상(수 개)에 변형을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체는 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치 중 임의의 위치에 상응하는 위치 2개에 변형을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체는 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치 중 임의의 위치에 상응하는 위치 3개에 변형을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체는 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치 중 임의의 위치에 상응하는 위치 4개에 변형을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체는 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치 중 임의의 위치에 상응하는 위치 5개에 변형을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체는 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치 중 임의의 위치에 상응하는 위치 6개에 변형을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체는 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치에 상응하는 각각의 위치에 변형을 포함한다. 상기 위치들은 서열 번호 1의 위치들에 상응한다. 변형은 치환인 것이 바람직하다.

하나의 구체예에서, 변이체는 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치 2개, 3개 또는 4개에 치환을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 변이체는 G304, W140, E260 및 G476으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치 2개, 3개 또는 4개에 치환을 포함한다.

본 발명의 하나의 양태에서, 변이체는 G304RKEQ, W140YF, W189EGT, D134E, E260ADCQLMFPSWVGHIKNRTY, F262GP, W284DHFYR, W347HFY, W439RG, G476EQRK 및 G477EQKMR로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 2개 이상(수 개) 포함한다.

본 발명에 따른 변이체는 2개, 3개 또는 4개의 위치에 G304R, W140YF, E260GHIKNPRTY 및 G476EQRK로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 상기 2개, 3개 또는 4개의 위치에서의 치환은 G304R, W140Y, E260G 및 G476K로 이루어진 군으로부터 선택된다.

하나의 구체예에서, 변이체는 T51IL, S52Q, N54K, G109A, E194D, N195F, V206Y, Y243F, G109A, G273DV, G337N, K72R, R181H, S303G 및 Y100I로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 1개 이상을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 1개 이상의 추가 치환은 N195F, V206Y, Y243F로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 변이체는 이러한 치환들 중 2개 또는 3개를 포함한다. 이에 의하여, 모 알파-아밀라제에 비하여 또는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 알파-아밀라제에 비하여 저온에서의 세척 성능이 개선될 뿐만 아니라 Ca^{2 +} 결핍에 대한 안정성이 개선된 변이체가 제공된다.

본 발명의 다른 양태에서, 변이체는, D134E, E260G, E260H, E260I, E260K, E260N, E260R, E260T, G109A, G273D, G273V, G337N, G476E, G477E, G477M, G477R, K72R, R181H, S303G, W140F, W140Y, W189E, W189G, W189T, W284D 및 Y100I로 이루어진 군으로부터 선택되는, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드의 치환을 2개 이상(수 개) 포함한다.

변이체는 기타 다른 위치 1개 이상(수 개)에 변형을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 G182*+D183* 또는 D183*+G184* 위치에 상응하는 위치에 변형을 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1의 폴리펩티드의 위치들에 상응하는 위치들에, 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 포함하는 변이체에 관한 것이다:

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,

G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

D134E+G476E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,

W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,

W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R

G109A+ W140Y+ E194D+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G

G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E

T51I+ Y100I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G

T51I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R

T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G304R+ G476K

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284R+ G477K

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284F+ G477R, 및

N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D.

다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1의 폴리펩티드의 위치들에 상응하는 위치들이, 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환으로 이루어진 변이체에 관한 것이다:

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,

G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

D134E+G476E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,

W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,

W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R

G109A+ W140Y+ E194D+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G

G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E

T51I+ Y100I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G

T51I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R

T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G304R+ G476K

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284R+ G477K

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284F+ G477R, 및

N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1의 폴리펩티드의 위치들에 상응하는 위치들에, 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형들을 포함하는 변이체에 관한 것이다:

D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,

D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,

D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,

D183*+ G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

D183*+ G184*+ D134E+G476E,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,

D183*+ G184*+ W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,

D183*+ G184*+ W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

D183*+ G184*+ Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,

D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R

D183*+ G184*+ G109A+ W140Y+ E194D+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G

D183*+ G184*+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E

D183*+ G184*+ T51I+ Y100I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G

D183*+ G184*+ T51I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R

D183*+ G184*+ T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E

D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G304R+ G476K

D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284R+ G477K

D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284F+ G477R, 및

D183*+ G184*+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D.

다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1의 폴리펩티드의 위치들에 상응하는 위치들이, 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형들로 이루어진 변이체에 관한 것이다:

D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,

D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,

D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,

D183*+ G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

D183*+ G184*+ D134E+G476E,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,

D183*+ G184*+ W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,

D183*+ G184*+ W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

D183*+ G184*+ Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,

D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R

D183*+ G184*+ G109A+ W140Y+ E194D+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G

D183*+ G184*+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E

D183*+ G184*+ T51I+ Y100I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G

D183*+ G184*+ T51I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R

D183*+ G184*+ T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E

D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G304R+ G476K

D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284R+ G477K

D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284F+ G477R, 및

D183*+ G184*+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D.

모 효소 내 필수 아미노산은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 위치 배향 돌연 변이 유발법 또는 알라닌-스캐닝 돌연 변이 유발법에 따라서 동정될 수 있다(Cunningham 및 Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). 상기 알라닌-스캐닝 돌연 변이 유발 기법에 있어서, 하나의 알라닌 돌연 변이는 분자 내 매 잔기마다 도입되고, 생성된 돌연 변이 분자는 알파-아밀라제 활성에 대해 테스트되며, 그 결과, 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기가 동정된다. 또한, 문헌[Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 : 4699-4708]을 참조한다. 알파-아밀라제 또는 기타 다른 생물학적 상호 작용의 활성 위치는 또한 추정 접촉 위치 아미노산을 돌연 변이시킴과 아울러, 기법, 예를 들어 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화 기법에 의해 구조를 물리적으로 분석함으로써 확인될 수도 있다. 예를 들어 문헌[de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312]; [Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904]; [Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64]을 참조한다. 필수 아미노산의 고유성은 또한 모 효소와 관련된 폴리펩티드를 사용하여 고유성을 분석함으로써 추정될 수 있다.

폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한 본 발명의 변이체들 중 임의의 것을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

핵산 구조물

본 발명은 또한 제어 서열과 양립 가능한 조건 하에 적당한 숙주 세포 내에서 암호화 서열의 발현을 유도하는 제어 서열 1개 이상(수 개)에 작동 가능하도록 결합되어 있는, 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물에 관한 것이다.

폴리뉴클레오티드는 변이체를 발현시키는 다양한 방법으로 조작될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 벡터에 삽입되기 전에 이 폴리뉴클레오티드를 조작하는 것은 발현 벡터에 따라서 바람직하거나 필요한 것일 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 변형하는 기법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

제어 서열은 폴리뉴클레오티드를 발현시킴에 있어서 숙주 세포에 의해 인지되는 프로모터 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 변이체의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 포함한다. 돌연 변이 프로모터, 절단형 프로모터 및 하이브리드 프로모터를 비롯한 프로모터는 숙주 세포 내에서 전사 활성을 보이는 임의의 핵산 서열일 수 있으며, 이 숙주 세포에 동질성이거나 이질성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다.

박테리아 숙주 세포 내에서 본 발명의 핵산 구조물의 전사를 유도하는데 적당한 프로모터의 예로서는, 바실러스 아밀로리크패이션스 알파-아밀라제 유전자(amyQ), 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자(amyL), 바실러스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자(penP), 바실러스 스테아로서모필러스 말토게닉 아밀라제 유전자(amyM), 바실러스 서브틸리스 레반수크라제 유전자(sacB), 바실러스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 이.콜라이 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리칼라 아가라제 유전자(dagA) 및 원핵 생물 베타-락타마제 유전자로부터 얻어지는 프로모터(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731)와, tac 프로모터(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21 -25)가 있다. 추가의 프로모터는 문헌["Useful proteins from recombinant bacteria", Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94]; 및 [Sambrook et al., 1989, 상동]에 기술되어 있다.

본 발명의 핵산 구조물의 전사를 사상 진균 숙주 세포 내에서 유도하는데 적당한 프로모터의 예로서는, 아스퍼질러스 니듈란스 아세타미다제, 아스퍼질러스 나이저 중성 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 나이저 산 안정 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 아와모리 글루코아밀라제(glaA), 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 오라이재 알칼리 프로테아제, 아스퍼질러스 오라이재 트리오스 인산염 이소머라제, 푸사리움 옥시스포럼 트립신 유사 프로테아제(WO 제96/00787호), 푸사리움 베네나텀 아밀로글루코시다제(WO 제00/56900호), 푸사리움 베네나텀 다리아(Daria)(WO 제00/56900호), 푸사리움 베네나텀 퀸(Quinn)(WO 제00/56900호), 리조뮤코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파제, 리조뮤코 미에헤이 아스파르트산 프로티나제, 트리코더마 리세이 베타-글루코시다제, 트리코더마 리세이 셀로비오하이드롤라제 I, 트리코더마 리세이 셀로비오하이드롤라제 II, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 I, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 II, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 III, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 IV, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 V, 트리코더마 리세이 자일라나제 I, 트리코더마 리세이 자일라나제 II, 트리코더마 리세이 베타-자일로시다제의 유전자로부터 얻어지는 프로모터와, NA2-tpi 프로모터(아스퍼질리(Aspergilli)에서 중성 알파-아밀라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 변형 프로모터(비번역 리더가 아스퍼질리 내에서 트리오스 인산염 이소머라제를 암호화하는 유전자 유래 비번역 리더로 치환된 것)로서; 이에 관한 비제한적 예로서는 아스퍼질러스 나이저 내에서 중성 알파-아밀라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 변형 프로모터(비번역 리더가 아스퍼질러스 니듈란스 또는 아스퍼질러스 오라이재 내에서 트리오스 인산염 이소머라제를 암호화하는 유전자 유래 비번역 리더로 치환된 것)를 포함함); 및 이것들의 돌연 변이 프로모터, 절단형 프로모터 및 하이브리드 프로모터가 있다.

효모 숙주에 있어서 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 갈락토키나제(GAL1), 사카로마이세스 세레비지아에 알코올 탈수소 효소/글리세랄데히드-3-인산염 탈수소 효소(ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비지아에 트리오스 인산염 이소머라제(TPI), 사카로마이세스 세레비지아에 메탈로티오네인(CUP1) 및 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제의 유전자로부터 얻어진다. 기타 효모 숙주 세포에 유용한 프로모터는 문헌[Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488]에 기술되어 있다.

제어 서열은 또한 숙주 세포에 의해 인지되어 전사를 종결시키는, 적당한 전사 종결 인자 서열일 수도 있다. 상기 종결 인자 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 숙주 세포 내에서 작동하는 임의의 종결 인자가 사용될 수 있다.

사상 진균 숙주 세포에 바람직한 종결 인자는, 아스퍼질러스 니듈란스 안트라닐레이트 합성 효소, 아스퍼질러스 나이저 알파-글루코시다제, 아스퍼질러스 나이저 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제 및 푸사리움 옥시스포럼 트립신 유사 프로테아제의 유전자로부터 얻어진다.

효모 숙주 세포의 바람직한 종결 인자는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀라제, 사카로마이세스 세레비지아에 시토크롬 C(CYC1) 및 사카로마이세스 세레비지아에 글리세랄데히드-3-인산염 탈수소 효소의 유전자로부터 얻어진다. 기타 효모 숙주 세포에 유용한 종결 인자는 문헌[Romanos et al., 1992, 상동]에 기술되어 있다.

제어 서열은 또한 적당한 리더 서열 즉, mRNA의 비번역 영역(숙주 세포에 의한 번역에 중요한 영역)일 수도 있다. 리더 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 숙주 세포 내에서 작동하는 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다.

사상 진균 숙주 세포에 바람직한 리더는 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제 및 아스퍼질러스 니듈란스 트리오스 인산염 이소머라제의 유전자로부터 얻어진다.

효소 숙주 세포에 적당한 리더는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지아에 알코올 탈수소 효소/글리세르알데히드-3-인산염 탈수소 효소(ADH2/GAP)의 유전자로부터 얻어진다.

제어 서열은 또한 폴리아데닐화 서열 즉, 변이체 암호화 서열의 3'-말단에 작동 가능하도록 결합되어 있으며, 이 서열이 전사될 때 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기들을 부가하는 신호로서 숙주 세포에 의해 인지되는 서열일 수도 있다. 숙주 세포 내에서 작동하는 임의의 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있다.

사상 진균 숙주 세포에 바람직한 폴리아데닐화 서열은 아스퍼질러스 니듈란스 안트라닐레이트 합성 효소, 아스퍼질러스 나이저 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 나이저 알파-글루코시다제, 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제 및 푸사리움 옥시스포럼 트립신 유사 프로테아제의 유전자로부터 얻어진다.

효모 숙주 세포에 유용한 폴리아데닐화 서열은 문헌[Guo 및 Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990]에 기술되어 있다.

제어 서열은 또한 변이체의 N-말단에 결합되어 있는 신호 펩티드를 암호화하고, 변이체를 세포의 분비 경로로 유도하는 신호 펩티드 암호화 영역일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열의 5'-말단은 본래 번역 해독 틀 내에서 변이체를 암호화하는 암호화 영역 분절과 결합된 신호 펩티드 암호화 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 암호화 서열의 5'-말단은 암호화 서열에 외래인 신호 펩티드 암호화 영역을 포함할 수 있다. 외래 신호 펩티드 암호화 영역은, 암호화 서열이 본래 신호 펩티드 암호화 영역을 포함하지 않는 경우에 필요할 수 있다. 대안적으로, 외래 신호 펩티드 암호화 영역은 간단히 천연 신호 펩티드 암호화 영역을 치환하여, 변이체의 분비를 증가시킬 수 있다. 그러나, 빌현된 변이체를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하는 임의의 신호 펩티드 암호화 영역이 사용될 수 있다.

박테리아 숙주 세포용으로서 유용한 신호 펩티드 암호화 서열로서는, 바실러스 NCIB 11837 말토게닉 아밀라제, 바실러스 리케니포르미스 서브틸리신, 바실러스 리케니포르미스 베타-락타마제 및 바실러스 스테아로서모필러스 알파-아밀라제의 유전자, 바실러스 스테아로서모필러스 중성 프로테아제의 유전자(nprT, nprS, nprM) 및 바실러스 서브틸리스 유전자 prsA로부터 얻어지는 신호 펩티드 암호화 서열이 있다. 추가의 신호 펩티드는 문헌[Simonen 및 Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137]에 기술되어 있다.

사상 진균 숙주 세포용으로서 유용한 신호 펩티드 암호화 서열로서는, 아스퍼질러스 나이저 중성 아밀라제, 아스퍼질러스 나이저 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제, 휴미콜라 인솔렌스 셀룰라제, 휴미콜라 인솔렌스 엔도글루카나제 V, 휴미콜라 라누기노사 리파제 및 리조뮤코 미에헤이 아스파르트산 프로티나제 유전자로부터 얻어지는 신호 펩티드 암호화 서열이 있다.

효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지아에 인버타제 유전자로부터 얻어진다. 기타 유용한 신호 펩티드 암호화 서열은 문헌[Romanos et al., 1992, 상동]에 기술되어 있다.

제어 서열은 또한 변이체의 N-말단에 위치하는 프로펩티드를 암호화하는 프로펩티드 암호화 영역일 수도 있다. 생성된 폴리펩티드는 전구 효소 또는 프로폴리펩티드(또는 몇몇 경우, 자이모겐)로서 알려져 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성이며, 프로폴리펩티드로부터 유래하는 프로펩티드의 촉매 작용 또는 자가 촉매 작용에 의한 분해에 의해 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 암호화 영역은 바실러스 서브틸리스 알칼리 프로테아제(aprE), 바실러스 서브틸리스 중성 프로테아제(nprT), 마이셀리오프토라 서모필라 라카제(WO 제95/33836호), 리조뮤코 미에헤이 아스파르트산 프로티나제 및 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자의 유전자로부터 얻어질 수 있다.

신호 펩티드 영역과 프로펩티드 영역 둘 다가 변이체의 N-말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 변이체의 N-말단 옆에 위치하고, 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 N-말단 옆에 위치한다.

숙주 세포가 생장함에 따라서 상기 변이체의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열을 부가하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예로서는, 화학 자극이나 물리 자극(예를 들어, 조절 화합물의 존재)에 반응하여 유전자를 발현시키거나 발현시키지 않는 것들이 있다. 원핵 생물 시스템 내 조절 시스템으로서는 lac, tac 및 trp 작동 인자 시스템을 포함한다. 효모에 있어서는 ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상 진균에 있어서는 아스퍼질러스 나이저 글루코아밀라제 프로모터, 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 알파-아밀라제 프로모터 및 아스퍼질러스 오라이재 글루코아밀라제 프로모터가 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예로서는 유전자를 증폭시킬 수 있는 것들이 있다. 진핵 생물 시스템에 있어서, 이와 같은 조절 서열로서는 디하이드로폴레이트 환원 효소 유전자(메토트렉세이트가 존재할 때 증폭됨)와, 메탈로티오네인 유전자(중금속이 존재할 때 증폭됨)를 포함한다. 이와 같은 경우에 있어서, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동 가능하도록 결합될 것이다.

발현 벡터

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 그리고 전사 및 번역 종결 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 다양한 뉴클레오티드 및 제어 서열은 함께 연결되어, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 편의상 삽입된 제한 위치에 삽입하거나 이 제한 위치에서 치환시키는 제한 위치 1개 이상(수 개)을 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터를 이룰 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드 또는 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물을 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터를 제조함에 있어서, 암호화 서열은 벡터 내에 위치하고, 이 암호화 서열은 적당한 발현용 제어 서열과 작동 가능하도록 결합된다.

재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 방법이 수행될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 통상적으로 벡터와, 이 벡터가 도입될 숙주 세포의 혼화성에 좌우될 것이다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 환형 플라스미드일 수 있다.

벡터는 독자적으로 복제 가능한 벡터, 즉 염색체 외 실체(자체의 복제가 염색체의 복제와는 독립적으로 이루어지는 것으로서, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체 또는 인공 염색체를 예로 들 수 있음)로서 존재하는 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제를 보장하는 임의의 요소를 포함할 수 있다. 대안적으로 벡터는, 숙주 세포에 도입되었을 때 숙주의 게놈에 통합되어, 이 벡터가 통합된 염색체(들)가 복제될 때 함께 복제되는 것일 수 있다. 뿐만 아니라, 숙주 세포의 게놈에 도입될 완전 DNA 또는 트랜스포손을 모두 포함하는 1개의 벡터나 플라스미드, 또는 2개 이상의 벡터나 플라스미드가 사용될 수 있다.

벡터는 형질 전환, 형질 감염 또는 형질 도입 등이 일어난 세포가 용이하게 선별될 수 있도록 만드는 선별 마커를 1개 이상(수 개) 포함하는 것이 바람직하다. 선별 마커는 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성 및 영양 요구주에 대한 원영양성등을 제공하는 유전자 생산물이다.

박테리아 선별 마커의 예로서는, 바실러스 리케니포르미스 또는 바실러스 서브틸리스 유래 dal 유전자, 또는 항생제 내성, 예를 들어 암피실린 내성, 클로람페니콜 내성, 카나마이신 내성 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커가 있다. 효모 숙주 세포에 적당한 마커로서는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 및 URA3가 있다. 사상 진균 숙주 세포에 사용되는 선별 마커로서는 amdS(아세타미다제), argB(오르니틴 카바모일 전이 효소), bar(포스피노트리신 아세틸기 전이 효소), hph(하이그로마이신 인산 전이 효소), niaD(니트레이트 환원 효소), pyrG(오로티딘-5'-인산염 탈탄산효소), sC(황산염 아데닐 전이 효소), 및 trpC(안트라닐레이트 합성 효소), 그리고 이와 같은 것들의 균등물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아스퍼질러스 세포에 사용되기 적당한 마커로서는 아스퍼질러스 니듈란스 또는 아스퍼질러스 오라이재의 amdS 및 pyrG 유전자와, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 bar 유전자가 있다.

벡터는, 게놈과는 독립적으로 세포 내에서 벡터를 자발적으로 복제시킬 수 있거나 숙주 세포의 게놈에 벡터를 통합시킬 수 있는 요소(들)를 포함하는 것이 바람직하다.

숙주 세포 게놈으로의 통합에 있어서 벡터는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 상동성 또는 비상동성 재조합에 의한 게놈으로의 통합에 사용되는 벡터의 기타 다른 임의의 요소에 의존적일 수 있다. 대안적으로, 벡터는 상동성 재조합에 의해 염색체(들) 내 정확한 위치(들)에 존재하는 숙주 세포 게놈으로의 통합을 유도하는 부가 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 통합될 요소들이 정확한 위치에 통합될 가능성을 높이기 위해서, 상기 요소들은 충분한 수의 핵산(상응하는 표적 서열과의 동일성이 높아서, 상동성 재조합의 성공 확률이 높은 핵산), 예를 들어 100개 내지 10,000개 염기쌍, 400개 내지 10,000개 염기쌍, 그리고 800개 내지 10,000개 염기쌍을 포함하여야 한다. 통합될 요소들은 숙주 세포 게놈 내 표적 서열과 상동성인 임의의 서열일 수 있다. 뿐만 아니라, 통합될 요소들은 비암호화 뉴클레오티드 서열 또는 암호화 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 다른 한편, 벡터는 비상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다.

자가 복제를 위해, 벡터는 추가로 복제원(벡터가 미지의 숙주 세포 내에서 자발적으로 복제할 수 있도록 해주는 것)을 포함할 수 있다. 복제원은 자가 복제를 매개하는 것으로서 세포 내에서 작동되는 임의의 플라스미드 복제 인자(plasmid replicator)일 수 있다. "복제원" 또는 "플라스미도 복제 인자"란 용어는, 플라스미드 또는 벡터가 생체 내에서 복제될 수 있도록 해주는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

박테리아 복제원의 예로서는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177 및 pACYC184(이.콜라이 내에서 복제 가능), 그리고 pUB110, pE194, pTA1060 및 pAMβ1(바실러스 내에서 복제 가능)의 복제원이 있다.

효모 숙주 세포 내에서 사용되는 복제원의 예로서는 2 마이크론 복제원, ARS1, ARS4, ARS1과 CEN3의 조합, 그리고 ARS4와 CEN6의 조합이 있다.

사상 진균 세포용으로서 유용한 복제원의 예로서는 AMA1 및 ANS1이 있다(Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et ai, 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 제00/24883호). AMA1 유전자의 분리와, 이 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 구성은 WO 제00/24883호에 개시된 방법에 따라서 이루어질 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 복사체 1개 이상이 숙주 세포에 삽입될 수 있는데, 그 결과 변이체의 생산이 촉진될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 복사체 수의 증가는, 서열의 부가 복사체 1개 이상을 숙주 세포 게놈에 통합시키거나 또는 증폭 가능한 선별 마커 유전자를 폴리뉴클레오티드와 함께 포함시킴으로써(세포가 선별 마커 유전자 복사체를 다수 개 포함하는 경우) 얻어질 수 있으며, 이로써 폴리뉴클레오티드 부가 복사체들은 적당한 선별 제제의 존재 하에 세포들을 배양함으로써 선별될 수 있다.

상기된 요소들을 결찰하여 본 발명의 재조합 발현 벡터를 구성함으로써 실질적으로 순수한 변이체를 얻는데 사용되는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989, 상동] 참조).

숙주 세포

본 발명은 또한 1개 이상(수 개)의 제어 서열(본 발명의 변이체 생산을 유도하는 서열)에 작동 가능하도록 결합되어 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조물 또는 벡터는 숙주 세포에 도입되고, 그 결과 구조물 또는 벡터는 염색체 통합 인자(chromosomal integrant) 또는 전술된 바와 같은 자가 복제 염색체외 벡터로서 유지된다. "숙주 세포"란 용어는 복제시 발생한 돌연 변이로 인하여 부모 세포와 동일하지 않게 된, 부모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 변이체와 이의 공급원을 암호화하는 유전자에 따라서 광범위하게 이루어질 것이다.

숙주 세포는 변이체를 재조합적으로 생산하는데 유용한 임의의 세포, 예를 들어 원핵 생물 세포 또는 진핵 생물 세포일 수 있다.

원핵 생물 숙주 세포는 임의의 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 그람 양성 박테리아로서는 바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스, 지오바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 오세아노바실러스, 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 스트렙토마이세스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그람 음성 박테리아로서는 캄필로박터, 이.콜라이, 플라보박테리움, 푸소박테리움, 헬리코박터, 리오박터, 네이세리아, 슈도모나스, 살모넬라 및 우레아플라스마를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

박테리아 숙주 세포는 바실러스 알칼로필러스, 바실러스 아밀로리크패이션스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 클라우시, 바실러스 코아귤란스, 바실러스 퍼무스, 바실러스 로투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 퓨밀러스, 바실러스 스테아로서모필러스, 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 투린지엔시스 세포를 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 임의의 바실러스 세포일 수 있다.

박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토코커스 에퀴시밀리스, 스트렙토코커스 피오제네스, 스트렙토코커스 우베리스 및 스트렙토코커스 에퀴 아종 주에피데미쿠스 세포를 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 임의의 스트렙토코커스 세포일 수도 있다.

박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토마이세스 아크로모제네스, 스트렙토마이세스 아버미틸리스, 스트렙토마이세스 코엘리칼라, 스트렙토마이세스 그리세우스 또는 스트렙토마이세스 리비단스 세포를 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 스트렙토마이세스 세포일 수 있다.

DNA를 바실러스 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 원형질체 형질 전환(예를 들어, 문헌[Chang 및 Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115] 참조), 수용성 세포 사용법(예를 들어, 문한[Young 및 Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829], 또는 [Dubnau 및 Davidoff-Abelson, 1971 , J. Mol. Biol. 56: 209-221] 참조), 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Shigekawa 및 Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751] 참조) 또는 접합(예를 들어, 문헌[Koehler 및 Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA를 이.콜라이 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 원형질체 형질 전환(예를 들어, 문헌[Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580] 참조) 또는 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA를 스트렙토마이세스 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 원형질체 형질 전환 및 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405] 참조), 접합(예를 들어 문헌[Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585] 참조) 또는 형질 도입(예를 들어, 문헌[Burke et al., 2001 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA를 슈도모나스 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391 -397] 참조) 또는 접합(예를 들어, 문헌[Pinedo 및 Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA를 스트렙토코커스 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 본연의 수용능(natural competence)을 이용하는 방법(예를 들어, 문헌[Perry 및 Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297] 참조), 원형질체 형질 전환(예를 들어, 문헌[Catt 및 Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070] 참조), 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804] 참조) 또는 접합(예를 들어, 문헌[Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 당업계에 알려진 임의의 방법으로서 DNA를 숙주 세포에 도입하는 방법이 사용될 수 있다.

숙주 세포는 또한 진핵 생물, 예를 들어 포유 동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포일 수도 있다.

숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본원에 사용된 "진균"에는, 아스코마이코타(Ascomycota), 바시디오마이코타(Basidiomycota), 키트리디오마이코타(Chytridiomycota) 및 자이고마이코타(Zygomycota) 문, 그리고 우마이코타(Oomycota) 및 모든 불완전 진균(mitosporic fungi)(문헌[Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 정의된 바와 같음)이 포함된다.

진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본원에 사용된 "효모"에는 자낭 포자 형성 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자 포자 효모 및 불완전 진균에 속하는 효모(블라스토마이세테스(Blastomycetes))를 포함한다. 효모의 분류법은 앞으로 바뀔수 있으므로, 본 발명에 의하면 효모는 문헌["Biology and Activities of Yeast", Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980]에 기술된 바와 같이 정의되어야 할 것이다.

효모 숙주 세포는 칸디다, 한세뉼라(Hansenula), 클루이베로마이세스, 피치아, 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스 또는 야로위아 세포, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 칼스버겐시스, 사카로마이세스 세레비지아에, 사카로마이세스 디아스타티쿠스, 사카로마이세스 도우글라시, 사카로마이세스 클루이베리, 사카로마이세스 노르벤시스, 사카로마이세스 오비포르미스 또는 야로위아 리폴리티카 세포일 수 있다.

진균 숙주 세포는 사상 진균 세포일 수 있다. "사상 진균"으로서는 아문 유마이코타 및 우마이코타에 속하는 모든 사상 진균(문헌[Hawksworth et al., 1995, 상동]에 정의된 바와 같음)을 포함한다. 사상 진균은 일반적으로 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 기타 다른 복합 다당체로 구성된 균사벽에 의해 특징지어진다. 영양 생장은 균사가 연장됨에 따른 것이고, 탄소 이화 작용은 절대 호기적이다. 이와는 대조적으로, 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에에 의한 영양 생장은 단일 세포 엽상체의 출아에 의해 이루어지고, 탄소 이화 작용은 발효일 수 있다.

사상 진균 숙주 세포는 아크레모니움, 아스퍼질러스, 오레오바시디움, 비저칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스, 크리소스포리움, 코프리누스(Coprinus), 코리올러스(Coriolus), 크립토코커스, 필리바시디움, 푸사리움, 휴미콜라, 마그나포르테, 뮤코, 미셀리오프토라, 네오칼리마스틱스, 뉴로스포라, 파에실로마이세스, 페니실리움, 파네로카에테, 플레비아(Phlebia), 피로마이세스, 플루로투스(Pleurotus), 쉬조필럼, 탈라로마이세스, 서모아스쿠스, 티엘라비아, 톨리포클라디움, 트라메테스(Trametes) 또는 트리코더마 세포일 수 있다.

예를 들어 사상 진균 숙주 세포는 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 포에티두스, 아스퍼질러스 퓨미가투스, 아스퍼질러스 자포니쿠스, 아스퍼질러스 니듈란스, 아스퍼질러스 나이저, 아스퍼질러스 오라이재, 비저칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에아(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 파노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 서브버미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이놉스, 크리소스포리움 케라티노필럼, 크리소스포리움 루크노웬스, 크리소스포리움 머다리움, 크리소스포리움 파니콜라, 크리소스포리움 퀸스랜디큠, 크리소스포리움 트로피큠, 크리소스포리움 조나튬, 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올러스 허수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스, 푸사리움 세레알리스, 푸사리움 크룩웰렌스, 푸사리움 큘모럼, 푸사리움 그라미네아럼, 푸사리움 그라미넘, 푸사리움 헤테로스포럼, 푸사리움 네건디, 푸사리움 옥시스포럼, 푸사리움 레티큘라텀, 푸사리움 로세움, 푸사리움 샘부시넘, 푸사리움 사르코크로움, 푸사리움 스포로트리키오이데스, 푸사리움 설푸레움, 푸사리움 토룰로세움, 푸사리움 트리코테시오이데스, 푸사리움 베네나텀, 휴미콜라 인솔렌스, 휴미콜라 라누기노사, 뮤코 미에헤이, 마이셀리오프토라 서모필라, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 퍼퓨로제넘, 파네로카에테 크리소스포리움, 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플루로터스 에린지이(Pleurotus eryngii), 티엘라비아 테레스트리스, 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 버시칼라(Trametes versicolor), 트리코더마 하지아넘, 트리코더마 코닌지, 트리코더마 론지브라키아텀, 트리코더마 리세이 또는 트리코더마 비리드 세포일 수 있다.

진균 세포는 원형질체를 형성하는 단계, 원형질체를 형질 전환시키는 단계 및 그 자체로서 알려져 있는 방식으로 세포벽을 재생시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 형질 전환될 수 있다. 아스퍼질러스 및 트리코더마 숙주 세포를 형질 전환하는데 적당한 방법들은 EP 제238023호 및 문헌[Yelton et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474]에 기술되어 있다. 푸사리움 종을 형질 전환하는데 적당한 방법들은 문헌[Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156], 및 WO 제96/00787호에 기술되어 있다. 효모는 문헌[Becker 및 Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York]; [Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163]; 및 [Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920]에 기술된 방법을 통하여 형질 전환될 수 있다.

제조 방법

본 발명은 또한 (a) 변이체 발현에 적당한 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 변이체 제조 방법에 관한 것이다.

숙주 세포는 당업계에 공지된 방법을 통하여 변이체를 제조하는데 적당한 영양 배지 중에서 배양된다. 예를 들어 세포는 진탕 플라스크 배양, 또는 실험실이나 산업용 발효조 내 폴리펩티드가 발현 및/또는 분리될 수 있는 조건 하에 적당한 배지 중에서 수행되는 소규모 또는 대규모 발효(연속, 회분식, 유가 또는 고상 발효 포함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 탄소와 질소 공급원, 그리고 무기염을 포함하는 적당한 영양 배지 중에서 이루어진다. 적당한 배지는 상업상 공급처로부터 구입되거나, 또는 (예를 들어, 미국 모식균 배양 수집소 카탈로그에) 공개된 조성물로부터 제조될 수 있다. 만일 변이체가 영양 배지에 분비되면, 변이체는 이 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 만일 변이체가 영양 배지에 분비되지 않는다면, 변이체는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.

변이체는 당업계에 공지된 방법으로서 변이체에 특이적인 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 이와 같은 검출 방법은 특이 항체를 사용하는 것, 효소 산물을 생성하는 것, 또는 효소 기질이 없어지는 것을 살피는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어 효소 분석법은 변이체의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.

변이체는 당업계에 공지된 방법에 의해 회수될 수 있다. 예를 들어 변이체는 수집, 원심 분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 통상의 방법을 통하여 영양 배지로부터 회수될 수 있다.

변이체는 실질적으로 순수한 변이체를 얻기 위한 방법으로서, 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 크기별 배제 크로마토그래피), 전기 영동법(예를 들어, 예비적 등전점 전기 영동법), 용해도 차이를 이용하는 방법(예를 들어, 황산암모늄 침전법), SDS-PAGE 또는 추출(예를 들어, 문헌[Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조](이에 한정되는 것은 아님)을 통하여 정제될 수 있다.

대안적인 양태에서, 변이체는 회수되지 않고, 이 변이체를 발현하는 본 발명의 숙주 세포가 변이체 공급원으로 사용된다.

조성물

본 발명은 또한 본 발명의 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명의 조성물에는 이와 같은 변이체가 증가되어 존재한다. "증가되어 존재하는"이란 용어는, 조성물의 알파-아밀라제 활성이 증가되었음(증가 팩터 = 1.1)을 의미한다.

본 발명의 조성물은 주요 효소 성분으로서 변이체를 포함할 수 있다(예를 들어, 1 성분 조성물). 대안적으로, 본 발명의 조성물은 다수의 효소 활성(예를 들어, 아미노펩티다제, 아밀라제, 탄수화물 가수 분해 효소, 카복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 큐티나제, 사이클로덱스트린 글리코실 전이 효소, 데옥시리보뉴클레아제, 에스터라제, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 할로퍼옥시다제, 인버타제, 라카제, 리파제, 만노시다제, 옥시다제, 펙틴 분해 효소, 펩티도글루타미나제, 퍼옥시다제, 피타제, 폴리페놀옥시다제, 단백 분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나제 또는 자일라나제 활성)을 가질 수 있다. 추가 효소(들)는, 예를 들어 아스퍼질러스 속에 속하는 미생물, 예를 들어 아스퍼질러스 아큘레아투스, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 포에티두스, 아스퍼질러스 퓨미가투스, 아스퍼질러스 자포니쿠스, 아스퍼질러스 니듈란스, 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 오라이재; 푸사리움 속에 속하는 미생물, 예를 들어 푸사리움 박트리디오이데스, 푸사리움 세레알리스, 푸사리움 크룩웰렌스, 푸사리움 큘모럼, 푸사리움 그라미네아럼, 푸사리움 그라미넘, 푸사리움 헤테로스포럼, 푸사리움 네건디, 푸사리움 옥시스포럼, 푸사리움 레티큘라텀, 푸사리움 로세움, 푸사리움 샘부시넘, 푸사리움 사르코크로움, 푸사리움 설푸레움, 푸사리움 토룰로세움, 푸사리움 트리코테시오이데스 또는 푸사리움 베네나텀; 휴미콜라 속에 속하는 미생물, 예를 들어 휴미콜라 인솔렌스 또는 휴미콜라 라누기노사; 또는 트리코더마 속에 속하는 미생물, 예를 들어 트리코더마 하지아넘, 트리코더마 코닌지, 트리코더마 론지브라키아텀, 트리코더마 리세이 또는 트리코더마 비리드에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있으며, 액체나 무수 조성물의 형태를 가질 수 있다. 예를 들어 본 발명의 조성물은 과립이나 미소 과립의 형태를 가질 수 있다. 변이체는 당업계에 공지된 방법들에 따라서 안정화될 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 알파-아밀라제 변이체는 통상적으로 세정 조성물, 예를 들어 세제 조성물, 예를 들어 세탁 세제 조성물 또는 식기 세척 세제 조성물의 성분일 수 있다. 액체 세탁 세제 조성물이 특히 바람직하다.

이와 같은 세정 조성물은 세정/세제 부가물, 바람직하게는 성분들의 혼합물을 포함한다. 통상적으로, 세정 부가물은 조성물 중에 세정 부가물이 0.001중량% 내지 99.9중량%, 더욱 통상적으로는 0.01중량% 내지 80중량%의 양으로 존재할 것이다.

또 다른 바람직한 양태에서, 조성물은 비이온성, 예를 들어 반극성 및/또는 음이온성 및/또는 양이온성 및/또는 양쪽이온성 및/또는 양성 및/또는 반극성 비이온성일 수 있는 계면 활성제 1개 이상 및/또는 이것들의 혼합물을 포함한다. 계면 활성제는 통상적으로 조성물의 0.1중량% 내지 60중량%, 또는 0.5중량% 내지 50중량%, 또는 1중량% 내지 40중량%의 수준으로 존재한다.

용도

본 발명은 또한 알파-아밀라제 변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 알파-아밀라제 변이체는 저온에서의 세제 조성물, 세탁물 세척, 식기 세척 및/또는 세정 과정에 유용하다.

실시예

알파-아밀라제 활성 측정용 pNP - G7 분석법

알파-아밀라제 활성은 G7-pNP 기질을 사용하는 방법을 통해 측정될 수 있다. 4,6-에틸리덴(G₇)-p-니트로페닐(G₁)-α,D-말토헵타오시드의 축약어인 G7-pNP는, 엔도-아밀라제, 예를 들어 알파-아밀라제에 의해 절단될 수 있는 차단형 올리고당이다. 절단 후, 키트에 포함된 알파-글루코시다제는 가수 분해된 기질을 분해하여, 황색을 띄는 유리 PNP 분자를 방출시키는데, 이러한 특성을 이용하면 가시 분광 분석법(λ=405㎚(400㎚ 내지 420㎚))으로 상기 효소의 활성이 측정될 수 있다. G7-pNP 기질과 알파-글루코시다제를 포함하는 키트는 로쉐(Roche)/히타치(Hitachi)에 의해 제조된다(cat.No.11876473).

시약:

본 키트에 포함된 G7-pNP 기질은 22mM 4,6-에틸리덴-G7-pNP 기질 및 52.4mM HEPES(2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]-에탄설폰산), pH 7.0)을 함유한다.

알파-글루코시다제 시약은 52.4mM HEPES, 87mM NaCl, 12.6mM MgCl₂, 0.075mM CaCl₂, ≥ 4 kU/L 알파-글루코시다제를 함유한다.

기질 작용 용액은, 알파-글루코시다제 시약 1㎖를 G7-pNP 기질 0.2㎖와 혼합하여 제조된다. 이 기질 작용 용액은 사용 직전에 제조된다.

희석 완충액: 50mM MOPS, 0.05%(w/v) 트리톤 X100(폴리에틸렌글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르(C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n(n = 9~10))), 1mM CaCl₂, pH 8.0.

방법:

분석될 아밀라제 샘플은 희석 완충액으로 희석되고, 희석된 샘플의 pH를 7로 만들었다. 분석은, 희석된 효소 샘플 20㎕를 96웰 미세 역가 평판에 옮긴 후, 여기에 기질 작용 용액 80㎕를 첨가함으로써 수행되었다. 이 용액이 혼합되고 나면, 실온에서 1분 동안 예비 항온 처리되고, 흡광도(OD 405㎚)는 총 5분에 걸쳐 20초마다 측정된다.

시간 의존성 흡광도 곡선의 기울기(분당 흡광도)는 소정의 조건 하에서 미지의 알파-아밀라제의 비활성(효소 1㎎당 활성)에 정비례한다. 아밀라제 샘플은 곡선의 기울기가 0.4 흡광도 단위/분 이하의 수준이 되도록 희석되어야 한다.

세탁에 대한 자동화 기계적 스트레스 분석( AMSA )

세탁 세척에서 세척 성능을 평가하기 위해 자동화 기계적 스트레스 분석(AMSA)을 사용하여 실험을 실시하였다. AMSA를 이용하여 소용량 효소-세제 용액의 세척 성능이 다수 회 평가될 수 있다. AMSA 플레이트는 테스트 용액을 위한 구멍 다수 개와, 세탁 샘플, 즉 세척될 직물 견본을 꽉 쥐어짜는 뚜껑(상기 구멍 전부의 입구에 끼워 맞춰짐)을 가진다. 세척 동안, 플레이트, 테스트 용액, 직물 및 뚜껑은 격렬하게 진탕되어, 테스트 용액은 직물과 접촉하게 되고, 기계적 스트레스는 규칙적이고 주기적인 진동의 형태로 가하여진다. 이에 관한 추가 설명에 관하여는 WO 제02/42740호, 특히 23페이지 내지 24 페이지 ?pecial method embodiments 단락을 참조한다.

세척 성능에 관한 일반적인 설명

물(10?H), 세제(예를 들어, 이하 기술된 바와 같은 유럽 액체 세제) 5.1g/L와, 본 발명의 효소(예를 들어, 테스트 용액 1리터당 효소 단백질 0㎎, 0.8㎎ 및/또는 1.2㎎의 농도로 존재)를 포함하는 테스트 용액을 제조하였다. 전분 얼룩이 묻은 섬유(예를 들어, CS-28(센터 포 테스트매테리얼즈 비브이(Center For Testmaterials BV), 네덜란드 플라르딩겐 3133 KT, 사서함 120))를 가하고, 이를 20℃에서 20분 동안 세척하였다. 상기 섬유를 흐르는 수돗물에 충분히 헹군 후 암실에서 건조한 다음, 세척 성능의 척도로서, 얼룩진 섬유의 광도 또는 반사도 값(reflectance value)을 측정하였다. 테스트 용액 1리터당 효소 단백질을 0㎎ 포함한 테스트는 델타 소광 값(delta remission value)을 얻기 위한 블랭크(blank)로서 사용하였다. 예를 들어 섬유와 함께 세척 용액을 진탕, 회전 또는 교반하는 형태로 바람직하게 세척 단계 동안 기계적 작용이 가하여진다.

이하에 명시된 실험 조건 하에서 AMSA 세척 성능 실험을 수행하였다:

표 1: AMSA 실험 조건

아밀라제 희석 완충액: 보관 동안 아밀라제를 안정화시키기 위한 소량의 칼슘(0.1mM), 및 효소 단백질이 용기와 피펫에 흡착될 위험을 감소시키기 위한 0.01% 트리톤(Triton) X-100을 포함하는 초순수(밀리Q(MilliQ) 수) 중에 아밀라제를 희석하였다.

물의 경도는, 테스트 시스템에 CaCl₂, MgCl₂ 및 NaHC0₃(Ca^{2 +}:Mg^{2 +}:HC0₃ ^- = 3:1:4.5)를 첨가함으로써 10?H로 맞추었다. 직물을 흐르는 수돗물로 헹군 후 건조하였다.

세척 성능은 세척된 직물 색의 휘도로 측정된다. 휘도는 또한 백색광을 비추었을 때 샘플로부터 반사되는 빛의 세기로서 표현될 수도 있다. 샘플에 얼룩이 졌을 때, 반사광의 세기는 깨끗한 샘플의 반사광의 세기보다 작다. 그러므로, 반사광의 세기는 세척 성능을 측정하는데 사용될 수 있다.

색 측정은 전문가용 평판 스캐너(코닥 iQ스마트(Kodak iQsmart), 코닥(Kodak)사, 덴마크 DK-2605 브뢴드비, 미트타거 29 소재) (세척된 직물의 이미지를 포착하는데 사용됨)를 이용하여 이루어졌다.

스캐닝된 이미지들로부터 빛의 세기에 대한 값을 추출하기 위해서, 이 이미지로부터 구한 24-비트 픽셀 값들을 레드, 그린 및 블루에 대한 값(RGB)들로 변환하였다. 세기 값(Int)은 RGB 값들을 벡터값으로서 함께 더한 다음, 구하여진 벡터의 길이를 취함으로써 산정된다:

직물:

직물 샘플 CS-28(쌀 전분 얼룩이 진 면)은 센터 포 테스트매테리얼즈 비브이(네덜란드 플라르딩겐 3133 KT, 사서함 120)로부터 입수하였다. 상이한 변이체의 AMSA 세탁 테스트 결과는 표 3에 나타내어져 있다. 결과에서 지수는 100이다. 모 알파-아밀라제의 성능 결과에는 값 100을 부여하였으며, 변이체의 결과를 이 값과 비교하였다.

AMSA 세척 성능

본 변이체와 이와 상응하는 모 알파-아밀라제의 세척 성능을 "방법" 섹션에 기술된 바와 같이 AMSA-테스트 방법으로 테스트하였다. 그 결과는 (변이체 성능 - 블랭크 성능)/(모 효소 성능 - 블랭크 성능) × 100으로 제시되었는데, 여기서 상기 블랭크는 알파-아밀라제가 존재하지 않는다는 것을 제외하고 동일한 조건에서의 세척에 의해 구하여진 성능이다. 마지막으로, 2가지 농도 0.8Mg/L 및 1.2Mg/L에서 상대적 성능의 평균을 산정하였다. 결과는 표 3에 제시되어 있다.

터그오미터 ( TOM ) 세척 분석

터그오미터(Tergo-To-Meter; TOM)는 중간 규모의 전형적인 세척 시스템으로서, 12개의 상이한 세척 조건들을 동시에 테스트하는데 적용될 수 있다. 기본적으로 TOM은 대형 온도 제어 수조로서 12개 이하의 개방 금속 비이커들이 물에 침지되어 있다. 각각의 비이커는 하나의 소형 탑 로더(top loader) 스타일의 세탁기를 구성하는데, 실험 동안 이 비이커들 각각에는 특정 세제/효소 시스템 용액이 담길 것인데, 얼룩 진 섬유와 얼룩지지 않은 섬유에 대한 세척 성능이 여기에서 테스트된다. 기계적 스트레스는 회전 교반 암(각각의 비이커 내에 담긴 액체를 교반함)으로 가하여진다. TOM 비이커는 뚜껑을 가지지 않으므로, TOM 실험 동안 샘플들을 꺼내어, 세척 동안 작동 중 정보를 분석할 수 있다.

전형적인 TOM 세척 시스템은 주로 US 또는 LA/AP 세척 조건에서 중간 규모의 세제 및 효소 테스트에 사용된다. TOM 실험에 있어서, 인자, 예를 들어 밸러스트(ballast) 대 오염물의 비율과, 섬유 대 세척액의 비율은 가변적일 수 있다. 그러므로, TOM은 소규모 실험, 예를 들어 AMSA와 소형 세척 실험, 그리고 더 많은 시간이 소요되는 탑 로더 세탁기에서 실제 규모의 실험 간의 관련성을 제공한다.

장비: 12개의 강철 비이커와, 비이커(담을 수 있는 세척 용액의 용량 = 500㎖ 또는 1200㎖) 1개당 회전 암 1개를 가지는 수조. 온도는 5℃ 내지 80℃의 범위이다. 수조는 탈이온수로 채워져야 한다. 회전 속도는 70rpm/분 내지 120rpm/분으로 설정될 수 있다.

TOM 세척 성능

물에 CaCl₂, MgCl₂ 및 NAHCO₃를 첨가하여 물의 경도를 이하에 기술된 세기로 조정하였다. 이하에 기술된 바와 같이, 원하는 양만큼의 세제를 포함하고, 원하는 온도 및 물의 경도를 가지는 세척 용액을 버킷에서 제조하였다. 10분 동안 자석으로 교반을 하여 세제를 용해하였다. (제조한 지 30분 내지 60분 이내의 세척 용액을 사용하였다).

터그오미터의 수조 내 온도와 회전 속도(rpm)는 이하에 제시된 바에 따라서 설정하였다. 온도가 설정 조건(허용 오차는 +/- 0.5℃임)에 따라서 맞추어졌을 때, 세척 용액을 이하에 기술된 양에 따라서 TOM 비이커에 첨가하였다.

비이커 내에서 120rpm으로 교반을 실시하였다. 2개의 쌀 전분 얼룩이 진 견본(CS-28)과 오염물 밸러스트를 각각의 비이커에 넣고 나서, 이하에 기술된 시간에 따라서 세척을 수행하였다. 상기 견본들을 차가운 수돗물로 5분 동안 헹구었다. 견본들을 밤새 암실에 놓아두어 건조시켰다.

직물: 직물 샘플 CS-28(쌀 전분 얼룩이 진 면)은 센터 포 테스트매테리얼즈 비브이(네덜란드 플라르딩겐 3133 KT, 사서함 120)로부터 입수하였다.

오염물 밸러스트 : 쌀 전분으로 오염된 밸러스트(면/폴리에스테르 상)(EMPA 162)는 센터 포 테스트매테리얼즈 비브이(네덜란드 플라르딩겐 3133 KT, 사서함 120)로부터 입수하였다. 비스트로(Bistro) 그레이비(063KC), 프리즈(Frij) 쵸콜렛 밀크쉐이크, 하인즈(Heinz) 스파게티(113KC), 허쉬즈(Herseys) 더블 쵸콜렛은 워윅 이퀘스트 리미티드(Warwick Equest Ltd.)(영국 DH8 6BN, 카운티 더럼, 콘세트, 콘세트 비즈니스 파크, 유닛 55 소재)로부터 입수하였다.

상이한 변이체의 TOM 세척 테스트 결과는 표 3에 나타내어져 있다. 결과에서 지수는 100이다. 모 알파-아밀라제(서열 번호 7)의 성능 결과에는 값 100을 부여하였으며, 변이체의 결과를 이 값과 비교하였다.

표 2: 실험 조건

세제와 테스트 물질은 다음과 같았다:

세척 성능은 델타 소광 값으로 표현되는, 세척된 직물 색상의 휘도로 측정되었다. 소광 측정은, 맥베쓰 7000 칼라 아이(Macbeth 7000 Color Eye) 분광 분석계를 사용하여 수행되었다. 건조된 각각의 견본들을 측정하였다. 백그라운드로 인한 간섭의 위험이 있기 때문에, 소광 값의 측정 동안 4겹 섬유의 위에 견본들을 놓았다. 소광 값은 460㎚에서 측정하였다. UV 필터는 포함하지 않았다. 견본들에 대한 소광 값의 평균치를 산정하였다.

실시예 1

유럽( EU )( 실시예 1A) 및 북아메리카( US )( 실시예 1B) 액체 세제 중 알파-아밀라제의 세척 성능

테스트된 변이체 및 이와 상응하는 모 알파-아밀라제(서열 번호 7)의 세척 성능을 상기 기술된 바와 같이 테스트하였다. 그 결과는 (변이체 성능 - 블랭크 성능)/(모 효소 성능 - 블랭크 성능) × 100으로 제시되었는데, 여기서 상기 블랭크는 알파-아밀라제가 존재하지 않는다는 것을 제외하고 동일한 조건에서의 세척에 의해 구하여진 성능이다.

실시예 1A: 유럽 중세 액체 세탁 세제 조성물

실시예 1B: 북아메리카 중세 액체 세탁 세제 조성물

표 3: 세척 성능

세척 성능 테스트 결과는, 변이체의 성능이 테스트된 온도에서 각각의 모 분자(서열 번호 7)에 비하여 개선되었음을 명확하게 입증한다.

실시예 2

액체 세제 중 아밀라제 변이체의 실제 규모 세탁기 성능 평가.

I. 세제 테스트 조성물의 제조

본 실험에서는 액체 세제인 실시예 1A를 주성분으로 하여 테스트 조성물 4개를 제조하였다. 세제 베이스는 실시예 1A로부터 제조하였으며, 효소는 포함하지 않고, pH는 최종적으로 8.2로 하였다.

다음과 같은 4개의 세제 제형을 제조하였다.

표 4

II . 섬유 테스트

아밀라제 감수성 얼룩 3개: CS-28 쌀 전분, PCS-28 쌀 전분 및 CS-29 타피오카 전분을 묻힌 견본, 5㎝×5㎝(센터 포 테스트 매테리얼즈(네덜란드 소재) 공급)을, 20㎝×20㎝의 흰색 메리야스 견본(워윅 이퀘스트(영국 더럼 소재) 공급)에 부착하였다. 아밀라제 감수성 얼룩 2개: BBQ 소스 및 프리즈 쵸콜렛 밀크쉐이크를 묻힌 견본(지름 2.5㎝)을, 20㎝×20㎝의 흰색 메리야스 견본(워윅 이퀘스트(영국 더럼 소재) 공급)에 부착하였다. 각각의 테스트 제형에 대해 8개의 동일 견본들(상이한 기계 4대에 동일 견본 2개씩 사용)을 사용하였다.

표 5

III . 테스트 세척 절차

본 방법은 서유럽 핫포인트(Hotpoint) 세탁기, 모델 아쿠아리우스(Aquarius) WF541의 사용을 수반한다. 상기 기술된 테스트 제형은 상기 기술된 바와 같이 여러 가지 오염물이 묻은 밸러스트와 깨끗한 밸러스트를 로딩하여 아밀라제 감수성 얼룩들을 세척하는데 사용되었다.

테스트 제형 6g/L, 물 13L(클라크 경도 = 10°), 그리고 테스트 섬유와 밸러스트를 포함하는 세탁기로 15℃에서 급속 면 세탁 사이클(지속 시간 = 1시간 15분)로 세척하였다. 세척 후, 테스트 섬유들을 나열하여 실내에서 건조하였다.

이러한 세척 과정을 반복하여 세척 사이클을 3회 더 진행시켰다.

그 다음, 얼룩 제거 지수(SRI)(미세척 L*a*b* 값 대 세척 L*a*b* 값을 비교하여 측정)를 측정하여, 세제 조성물의 얼룩 제거 성능을 정량하였다.

(실시예 C 또는 실시예 D의 성능 - 비교예 A의 성능)/(비교예 B의 성능 - 비교예 A의 성능)×100을 산정하여 성능 지수를 측정하였다.

IV . 샘플 비교

표 6: 얼룩 5가지에 대한 평균 SRI (각각의 얼룩이 묻은 동일 견본 8개 사용)

표 7: CS -29 타피오카 전분에 대한 성능 지수(동일 견본 8개 사용)

실시예 A의 조성물(효소 불포함)로 세척된 샘플들과 실시예 B의 조성물(나탈라제 포함), 실시예 C의 조성물 및 실시예 D의 조성물(각각 변이체 1 및 변이체 2 포함)로 세척된 샘플들을 비교함으로써, 얼룩 제거 성능은 아밀라제 효소의 첨가에 의하여 개선된다는 것이 명백하게 되었다. 실시예 A를 참고 기준(효소 불포함)으로 삼았을 때, 실시예 B의 조성물(나탈라제 포함)로 세척된 샘플들과 실시예 C의 조성물 및 실시예 D의 조성물(각각 변이체 1 및 변이체 2 포함)로 세척된 샘플들을 비교함으로써, 본 발명의 변이체 1과 변이체 2 둘 다 나탈라제?보다 현저하게 더 높은 수준의 얼룩 제거 수준을 달성할 수 있다는 것이 명백하게 되었다.

실시예 3

액체 세제 중 아밀라제 변이체의 실제 규모 세탁기 성능 평가.

I. 세제 테스트 조성물의 제조

본 실험에서는 액체 세제인 실시예 1B를 주성분으로 하여 테스트 조성물 4개를 제조하였다. 세제 베이스는 실시예 1B로부터 제조하였으며, 효소는 포함하지 않고, pH는 최종적으로 8.2로 하였다.

다음과 같은 4개의 제형을 제조하였다.

표 8

II . 섬유 테스트

아밀라제 감수성 얼룩 3개: PCS-28 쌀 전분, PS-28 쌀 전분 및 CS-26 옥수수 전분을 묻힌 견본, 5㎝×5㎝(센터 포 테스트 매테리얼즈(네덜란드 소재) 공급)을, 20㎝×20㎝의 흰색 메리야스 견본(워윅 이퀘스트(영국 더럼 소재) 공급)에 부착하였다. 아밀라제 감수성 얼룩 2개: BBQ 소스 및 쵸콜렛 푸딩 이유식을 묻힌 견본(지름 2.5㎝)을, 20㎝×20㎝의 흰색 메리야스 견본(워윅 이퀘스트(영국 더럼 소재) 공급)에 부착하였다. 각각의 테스트 제형에 대해 8개의 동일 견본들(상이한 기계 4대에 동일 견본 2개씩 사용)을 사용하였다.

표 9

III . 테스트 세척 절차

본 방법은 북아메리카 켄모어(Kenmore) 세탁기 모델 600 시리즈의 사용을 수반한다. 상기 기술된 테스트 제형은 상기 기술된 바와 같이 여러 가지 오염물이 묻은 밸러스트와 깨끗한 밸러스트를 로딩하여 아밀라제 감수성 얼룩들을 세척하는데 사용되었다.

테스트 제형 0.78g/L, 물 64L(클라크 경도 = 6°), 그리고 테스트 섬유와 밸러스트를 포함하는 세탁기로 15℃에서 12분 간 수퍼워시(superwash)(헹굼 1회)로 세척하였다. 세척 후, 테스트 섬유들을 나열하여 실내에서 건조하였다.

이러한 세척 과정을 반복하여 세척 사이클을 3회 더 진행시켰다.

그 다음, 얼룩 제거 지수(미세척 L*a*b* 값 대 세척 L*a*b* 값을 비교하여 측정)를 측정하여, 세제 조성물의 얼룩 제거 성능을 정량하였다.

(실시예 C 또는 실시예 D의 성능 - 비교예 A의 성능)/(비교예 B의 성능 - 비교예 A의 성능)×100을 산정하여 성능 지수를 측정하였다.

IV . 샘플 비교

표 10: 얼룩 5가지에 대한 평균 SRI (각각의 얼룩이 묻은 동일 견본 8개 사용)

표 11: CS -26 옥수수 전분에 대한 성능 지수(동일 견본 8개 사용)

실시예 A의 조성물(효소 불포함)로 세척된 샘플들과 실시예 B의 조성물(나탈라제 포함), 실시예 C의 조성물 및 실시예 D의 조성물(각각 변이체 3 및 변이체 4 포함)로 세척된 샘플들을 비교함으로써, 얼룩 제거 성능은 아밀라제 효소의 첨가에 의하여 개선된다는 것이 명백하게 되었다. 실시예 A를 참고 기준(효소 불포함)으로 삼았을 때, 실시예 B의 조성물(나탈라제 포함)로 세척된 샘플들과 실시예 C의 조성물 및 실시예 D의 조성물(각각 변이체 3 및 변이체 4 포함)로 세척된 샘플들을 비교함으로써, 본 발명의 변이체 3과 변이체 4 둘 다 나탈라제?보다 현저하게 더 높은 수준의 얼룩 제거 수준을 달성할 수 있다는 것이 명백하게 되었다.

실시예 4

액체 세제 중 아밀라제 변이체의 실제 규모 세탁기 성능 평가.

I. 세제 테스트 조성물의 제조

본 실험에서는 하기 액체 세제인 제형 4A를 주성분으로 하여 테스트 조성물 4개를 제조하였다. 세제 베이스는 제형 4A로부터 제조하였으며, 효소는 포함하지 않고, pH는 최종적으로 8.2로 하였다.

표 12: 제형 4A: 중세 액체 세탁 세제 조성물

다음과 같은 세제 제형 7개를 제조하였다.

표 13

II . 섬유 테스트

아밀라제 감수성 얼룩 3개: PCS-28 쌀 전분, CS-128 노화 쌀 전분 및 CS-26 옥수수 전분을 묻힌 견본, 5㎝×5㎝(센터 포 테스트 매테리얼즈(네덜란드 소재) 공급)을, 20㎝×20㎝의 흰색 메리야스 견본(워윅 이퀘스트(영국 더럼 소재) 공급)에 부착하였다. 아밀라제 감수성 얼룩 2개: 칠리 콘 카르네 및 하인즈 스파게티를 묻힌 견본(지름 2.5㎝)을, 20㎝×20㎝의 흰색 메리야스 견본(워윅 이퀘스트(영국 더럼 소재) 공급)에 부착하였다. 각각의 테스트 제형에 대해 8개의 동일 견본들(상이한 기계 4대에 동일 견본 2개씩 사용)을 사용하였다.

표 14

III . 테스트 세척 절차

본 방법은 서유럽 핫포인트 세탁기, 모델 아쿠아리우스 WF541의 사용을 수반한다. 상기 기술된 테스트 제형은 상기 기술된 바와 같이 여러 가지 오염물이 묻은 밸러스트와 깨끗한 밸러스트를 로딩하여 아밀라제 감수성 얼룩들을 세척하는데 사용되었다.

테스트 제형 6g/L, 물 13L(클라크 경도 = 10°), 그리고 테스트 섬유와 밸러스트를 포함하는 세탁기로 15℃에서 급속 면 세탁 사이클(지속 시간 = 1시간 15분)로 세척하였다. 세척 후, 테스트 섬유들을 나열하여 실내에서 건조하였다.

이러한 세척 과정을 반복하여 세척 사이클을 3회 더 진행시켰다.

그 다음, 얼룩 제거 지수(SRI)(미세척 L*a*b* 값 대 세척 L*a*b* 값을 비교하여 측정)를 측정하여, 세제 조성물의 얼룩 제거 성능을 정량하였다.

(실시예 C, 실시예 D, 실시예 E, 실시예 F 또는 실시예 G의 성능 - 비교예 A의 성능)/(비교예 B의 성능 - 비교예 A의 성능)×100을 산정하여 성능 지수를 측정하였다.

IV . 샘플 비교

표 15: 얼룩 5가지에 대한 평균 SRI (각각의 얼룩이 묻은 동일 견본 8개 사용)

표 16: 칠리 콘 카르네에 대한 성능 지수(동일 견본 8개 사용)

실시예 A의 조성물(효소 불포함)로 세척된 샘플들과 실시예 B의 조성물(나탈라제 포함), 실시예 C, 실시예 D, 실시예 E, 실시예 F 및 실시예 G의 조성물(각각 변이체 5, 변이체 6, 변이체 7, 변이체 8 및 변이체 9 포함)로 세척된 샘플들을 비교함으로써, 얼룩 제거 성능은 아밀라제 효소의 첨가에 의하여 개선된다는 것이 명백하게 되었다.

실시예 A를 참고 기준(효소 불포함)으로 삼았을 때, 실시예 B의 조성물(나탈라제 포함)로 세척된 샘플들과 실시예 C, 실시예 D, 실시예 E, 실시예 F 및 실시예 G의 조성물(각각 변이체 5, 변이체 6, 변이체 7, 변이체 8 및 변이체 9 포함)로 세척된 샘플들을 비교함으로써, 본 발명의 변이체 5, 변이체 6, 변이체 7, 변이체 8 및 변이체 9는 나탈라제?보다 현저하게 더 높은 수준의 얼룩 제거 수준을 달성할 수 있다는 것이 명백하게 되었다.

실시예 5

액체 세제 중 아밀라제 변이체의 실제 규모 세탁기 성능 평가.

I. 세제 테스트 조성물의 제조

본 실험에서는 액체 세제인 제형 5A를 주성분으로 하여 테스트 조성물 4개를 제조하였다. 세제 베이스는 제형 5A로부터 제조하였으며, 효소는 포함하지 않고, pH는 최종적으로 8.2로 하였다.

표 17: 제형 5A: 중세 액체 세탁 세제 조성물

표 18

다음과 같은 제형 6개를 제조하였다.

*: 활성 효소 단백질로서 첨가됨.

¹나탈라제?는, 노보자임스 A/S(덴마크 박스바에르트 소재)에 의해 '나탈라제 200L'로서 공급됨.

²변이체 7은, 2개의 결실들(D183* + G184*)이 일어났으며, 치환, T51I, S52Q, N54K, G109A, W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G 및 G476E를 포함하는, 야생형 아밀라제 바실러스 sp722 서열 번호 1인 본 발명의 아밀라제 변이체임. 또한, SP722 + D183* + G184* + T51I + S52Q + N54K + G109A + W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260G + G476E라고 칭하여지기도 함.

³변이체 8은, 2개의 결실들(D183* + G184*)이 일어났으며, 치환 W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G, G304R 및 G476K를 포함하는, 야생형 아밀라제 바실러스 sp722 서열 번호 1인 본 발명의 아밀라제 변이체임. 또한, SP722 + D183* + G184* + W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260G + G304R + G476K라고 칭하여지기도 함.

⁴변이체 9는, 2개의 결실들(D183* + G184*)이 일어났으며, 치환 W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G, W284R 및 G477K를 포함하는, 야생형 아밀라제 바실러스 sp722 서열 번호 1인 본 발명의 아밀라제 변이체임. 또한, SP722 + D183* + G184* + W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260G + W284R + G477K라고 칭하여지기도 함.

⁵변이체 10은, 2개의 결실들(D183* + G184*)이 일어났으며, 치환 W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G, W284F 및 G477R을 포함하는, 야생형 아밀라제 바실러스 sp722 서열 번호 1인 본 발명의 아밀라제 변이체임. 또한, SP722 + D183* + G184* + W140Y + N195F + V206Y + Y243F + E260G + W284F + G477R라고 칭하여지기도 함.

II . 섬유 테스트

아밀라제 감수성 얼룩 3개: PCS-28 쌀 전분, PS-28 쌀 전분 및 CS-29 타피오카 전분을 묻힌 견본, 5㎝×5㎝(센터 포 테스트 매테리얼즈(네덜란드 소재) 공급)을, 20㎝×20㎝의 흰색 메리야스 견본(워윅 이퀘스트(영국 더럼 소재) 공급)에 부착하였다. 아밀라제 감수성 얼룩 1개: 하인즈 스파게티를 묻힌 견본(지름 2.5㎝)을, 20㎝×20㎝의 흰색 메리야스 견본(워윅 이퀘스트(영국 더럼 소재) 공급)에 부착하였다. 아밀라제 감수성 얼룩 1개: 그레이비를 묻힌 견본(지름 2.5㎝)을, 25㎝×24㎝의 흰색 메리야스 견본(워윅 이퀘스트(영국 더럼 소재) 공급)에 부착하였다. 각각의 테스트 제형에 대해 8개의 동일 견본들(상이한 기계 4대에 동일 견본 2개씩 사용)을 사용하였다.

표 19

III . 테스트 세척 절차

본 방법은 북아메리카 켄모어 세탁기 모델 600 시리즈의 사용을 수반한다. 상기 기술된 테스트 제형은 상기 기술된 바와 같이 여러 가지 오염물이 묻은 밸러스트와 깨끗한 밸러스트를 로딩하여 아밀라제 감수성 얼룩들을 세척하는데 사용되었다.

테스트 제형 0.78g/L, 물 64L(클라크 경도 = 6°), 그리고 테스트 섬유와 밸러스트를 포함하는 세탁기로 15℃에서 12분 간 수퍼워시(superwash)(헹굼 1회)로 세척하였다. 세척 후, 테스트 섬유들을 나열하여 실내에서 건조하였다. 이러한 세척 과정을 반복하여 세척 사이클을 3회 더 진행시켰다.

그 다음, 얼룩 제거 지수(미세척 L*a*b* 값 대 세척 L*a*b* 값을 비교하여 측정)를 측정하여, 세제 조성물의 얼룩 제거 성능을 정량하였다.

(실시예 C, 실시예 D, 실시예 E 또는 실시예 F의 성능 - 비교예 A의 성능)/(비교예 B의 성능 - 비교예 A의 성능)×100을 산정하여 성능 지수를 측정하였다.

IV . 샘플 비교

표 20: 얼룩 5가지에 대한 평균 SRI (각각의 얼룩이 묻은 동일 견본 8개 사용)

표 21: 하인즈 스파게티에 대한 성능 지수(동일 견본 8개 사용)

실시예 A의 조성물(효소 불포함)로 세척된 샘플들과 실시예 B의 조성물(나탈라제 포함), 실시예 C, 실시예 D, 실시예 E 및 실시예 F의 조성물(각각 변이체 7, 변이체 8, 변이체 9 및 변이체 10 포함)로 세척된 샘플들을 비교함으로써, 얼룩 제거 성능은 아밀라제 효소의 첨가에 의하여 개선된다는 것이 명백하게 되었다.

실시예 A를 참고 기준(효소 불포함)으로 삼았을 때, 실시예 B의 조성물(나탈라제 포함)로 세척된 샘플들과 실시예 C, 실시예 D, 실시예 E 및 실시예 F의 조성물(각각 변이체 7, 변이체 8, 변이체 9 및 변이체 10 포함)로 세척된 샘플들을 비교함으로써, 본 발명의 변이체 7, 변이체 8, 변이체 9 및 변이체 10은 나탈라제?보다 현저하게 더 높은 수준의 얼룩 제거 수준을 달성할 수 있다는 것이 명백하게 되었다.

본원에 기술 및 청구된 발명은 본원에 개시된 특정 양태에 의해 그 범주가 제한되지는 않는데, 그 이유는 이러한 양태들은 본 발명의 몇몇 양태들을 예시하고자 하는 것이기 때문이다. 임의의 균등한 양태들은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 실제로, 본원에 나타내고 기술된 변형예들에 더하여 본 발명의 다양한 변형예들은 앞서 기술된 사항들로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이와 같은 변형예들도 또한 첨부된 특허청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 모순이 있는 경우, 용어의 정의를 포함하여 본원에 개시된 내용이 우선할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Novozymes A/S <120> Alpha-amylase variants <130> 12183-WO-PCT <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys 305 310 315 320 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400 Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Lys Arg 485 <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Ala Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Asn Lys 485 <210> 3 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 3 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Asn Lys 485 <210> 4 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 4 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Gly Thr Glu Ile Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Asn His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Ile His Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr 245 250 255 Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys 305 310 315 320 His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gln Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Val Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Phe Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400 Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Val Trp Val Lys Gln 485 <210> 5 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 5 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr 245 250 255 Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys 305 310 315 320 His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400 Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser 465 470 475 480 Val Trp Val Lys Gln 485 <210> 6 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 6 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Trp Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Ile 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Arg Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Asp Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Met Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Asn Asn 485 <210> 7 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant of SEQ ID NO:1 <400> 7 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ser Glu 180 185 190 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala Thr Gly 245 250 255 Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 260 265 270 Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Asn 290 295 300 Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro 305 310 315 320 Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu 325 330 335 Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp 465 470 475 480 Val Lys Arg <210> 8 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant of SEQ ID NO:2 <400> 8 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly 245 250 255 Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn 290 295 300 Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg His Pro 305 310 315 320 Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu 325 330 335 Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys Gln Asn 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala 420 425 430 Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp 465 470 475 480 Val Asn Lys <210> 9 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant of SEQ ID NO:3 <400> 9 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly 245 250 255 Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn 290 295 300 Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg His Pro 305 310 315 320 Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu 325 330 335 Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala 420 425 430 Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp 465 470 475 480 Val Asn Lys <210> 10 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant of SEQ ID NO:4 <400> 10 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Gly Thr Glu Ile Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Asn His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Ile His Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr Gly 245 250 255 Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Tyr 290 295 300 Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys His Pro 305 310 315 320 Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu 325 330 335 Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gln Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Val Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Phe Ala Tyr Gly Thr Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp 465 470 475 480 Val Lys Gln <210> 11 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant of SEQ ID NO:5 <400> 11 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ile Glu 180 185 190 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr Gly 245 250 255 Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Ala Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Tyr 290 295 300 Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys His Pro 305 310 315 320 Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu 325 330 335 Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser Val Trp 465 470 475 480 Val Lys Gln <210> 12 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant of SEQ ID NO:6 <400> 12 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Trp Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr Gly 245 250 255 Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Ile Gly Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Arg Ser Gly Gly Asn 290 295 300 Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg His Pro 305 310 315 320 Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu 325 330 335 Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Thr Leu Thr Arg Asp Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys Gln Asn 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His His Asn Met Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp 465 470 475 480 Val Asn Asn

Claims (22)

1. 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드의 위치 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477에 상응하는 위치 2개 이상(수 개)에 변형을 포함하는, 모 알파-아밀라제의 분리된 변이체로서, 각각의 변형은 독립적으로 치환, 결실 또는 삽입이고, 상기 변이체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 서열들 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 80% 이상 또는 87% 이상이되 100% 미만이며, 상기 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가지는 모 알파-아밀라제의 분리된 변이체.
2. 제1항에 있어서, 변형은 치환인 변이체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치 3개에 치환을 포함하는 변이체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치 4개에 치환을 포함하는 변이체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, G304, W140, E260 및 G476으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치 2개, 3개 또는 4개에 치환을 포함하는 변이체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, G304R, W140YF, W189EGT, D134E, E260GHIKNRTY, W284DFR, W439RG, G476EK 및 G477EKMR로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 2개 이상(수 개) 포함하는 변이체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, G304R, W140YF, E260GHIKNRTY 및 G476EK로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 2개, 3개 또는 4개의 위치에 포함하는 변이체.
8. 제7항에 있어서, 2개, 3개 또는 4개의 위치에서의 치환은 G304R, W140Y, E260G 및 G476K로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, N195F, V206Y, Y243F, G109A, G273DV, G337N, K72R, R181H, S303G 및 Y100I로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 1개 이상 추가로 포함하는 변이체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형의 수는 변형이 2개 내지 20개, 예를 들어 2개 내지 10개 및 2개 내지 5개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개인 변이체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 서열들 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이되 100% 미만인 변이체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 1의 폴리펩티드의 위치들에 상응하는 위치들에 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환들을 포함하는 변이체:
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
    G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
    D134E+G476E,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
    W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
    W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
    Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
    W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R
    G109A+ W140Y+ E194D+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G
    G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E
    T51I+ Y100I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G
    T51I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R
    T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E
    W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G304R+ G476K
    W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284R+ G477K
    W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284F+ G477R 및
    N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 1의 폴리펩티드의 위치들에 상응하는 위치들에, 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환들로 이루어진 변이체:
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
    G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
    D134E+G476E,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
    W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
    W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
    Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
    W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R
    G109A+ W140Y+ E194D+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G
    G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E
    T51I+ Y100I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G
    T51I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R
    T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E
    W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G304R+ G476K
    W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284R+ G477K
    W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284F+ G477R 및
    N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 1의 G182*+D183* 또는 D183*+G184 위치에 상응하는 위치에 결실들을 추가로 포함하는 변이체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 1의 폴리펩티드의 위치들에 상응하는 위치들에, 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형들을 포함하는 변이체:
    D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
    D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
    D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
    D183*+ G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
    D183*+ G184*+ D134E+G476E,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
    D183*+ G184*+ W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
    D183*+ G184*+ W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
    D183*+ G184*+ Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
    D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R
    D183*+ G184*+ G109A+ W140Y+ E194D+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G
    D183*+ G184*+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E
    D183*+ G184*+ T51I+ Y100I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G
    D183*+ G184*+ T51I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R
    D183*+ G184*+ T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E
    D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G304R+ G476K
    D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284R+ G477K
    D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284F+ G477R 및
    D183*+ G184*+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 1의 폴리펩티드의 위치들에 상응하는 위치들에, 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형들로 이루어진 변이체:
    D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
    D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
    D183*+ G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
    D183*+ G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
    D183*+ G184*+ D134E+G476E,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
    D183*+ G184*+ W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
    D183*+ G184*+ W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
    D183*+ G184*+ Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
    D183*+ G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
    D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R
    D183*+ G184*+ G109A+ W140Y+ E194D+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G
    D183*+ G184*+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E
    D183*+ G184*+ T51I+ Y100I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G
    D183*+ G184*+ T51I+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R
    D183*+ G184*+ T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E
    D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G304R+ G476K
    D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284R+ G477K
    D183*+ G184*+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284F+ G477R 및
    D183*+ G184*+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 의한 변이체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
18. 제17항에 의한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물.
19. 제17항에 의한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
20. 제17항에 의한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
21. 변이체를 발현시키기에 적당한 조건 하에서 제20항에 의한 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 모 알파-아밀라제의 변이체를 제조하는 방법.
22. 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드의 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 및 G477 위치에 상응하는 모 알파-아밀라제의 위치 2개 이상(수 개)에 변형을 도입하는 단계(여기서, 각각의 변형은 독립적으로 치환, 결실 또는 삽입이고, 변이체는 알파-아밀라제 활성을 가짐); 및 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 모 알파-아밀라제의 변이체를 얻는 방법.