HU219851B - Proteáz tartalmú tisztítókészítmények - Google Patents

Proteáz tartalmú tisztítókészítmények Download PDF

Info

Publication number
HU219851B
HU219851B HU9600960A HU9600960A HU219851B HU 219851 B HU219851 B HU 219851B HU 9600960 A HU9600960 A HU 9600960A HU 9600960 A HU9600960 A HU 9600960A HU 219851 B HU219851 B HU 219851B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
subtilisin
amino acid
protease
cleaning composition
enzyme
Prior art date
Application number
HU9600960A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT75984A (en
HU9600960D0 (en
Inventor
André Baeck
Bobby Lee Barnett
Richard Ray Bott
Philip Frederick Brode
Chanchal Kumar Ghosh
Thomas Paul Graycar
Donn Nelton Rubingh
Lori Jean Wilson
Original Assignee
The Procter And Gamble Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Procter And Gamble Company filed Critical The Procter And Gamble Company
Publication of HU9600960D0 publication Critical patent/HU9600960D0/hu
Publication of HUT75984A publication Critical patent/HUT75984A/hu
Publication of HU219851B publication Critical patent/HU219851B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
    • A61K8/41—Amines
    • A61K8/416—Quaternary ammonium compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/19—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing inorganic ingredients
    • A61K8/22—Peroxides; Oxygen; Ozone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/19—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing inorganic ingredients
    • A61K8/23—Sulfur; Selenium; Tellurium; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/19—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing inorganic ingredients
    • A61K8/24—Phosphorous; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
    • A61K8/42—Amides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/46—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing sulfur
    • A61K8/463—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing sulfur containing sulfuric acid derivatives, e.g. sodium lauryl sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/46—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing sulfur
    • A61K8/466—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing sulfur containing sulfonic acid derivatives; Salts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4906—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A61Q11/02—Preparations for deodorising, bleaching or disinfecting dentures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/10—Washing or bathing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • G06Q40/00—Finance; Insurance; Tax strategies; Processing of corporate or income taxes
    • G06Q40/04—Trading; Exchange, e.g. stocks, commodities, derivatives or currency exchange
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/20—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of the composition as a whole
    • A61K2800/22—Gas releasing
    • A61K2800/222—Effervescent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/86—Products or compounds obtained by genetic engineering

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Business, Economics & Management (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Accounting & Taxation (AREA)
  • Finance (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Strategic Management (AREA)
  • Economics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Business, Economics & Management (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Marketing (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Technology Law (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Development Economics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát tisztítókészítmények képezik, melyek tartalmaznak:a) hatásos mennyiségű proteázenzimet, amely egy természetben elő nemforduló aminosavszekvenciával rendelkező karbonil-hidroláz-változat,amely egy szubtilizin prekurzor karbonil-hidrolázból származikhelyettesítve a prekurzor karbonil-hidrolázban a +76. helyzetűaminosavmaradékot és egy vagy több aminosavma- radékot a +27., +99.,+101., +103., +104., +105, +107., +109., +123., +126., +128., +135.,+156., +166., +195., +197., +204., +206., +210., +216., +217., +218.,+222., +260., +265. és/vagy +274. helyzetben, melyek ekvivalenshelyzetűek a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizinaminosavmaradékaival; és b) egy vagy több, a proteázenzimmelösszeegyeztethető tisztítókészítmény-anyagot. A találmány szerintitisztítókészítmények felölelik a karbonil-hidroláz-enzimet tartalmazómosószereket, mosogatószereket, személyi tisztálkodásra szolgálókészítményeket. A találmány továbbá tisztítóeljárásokra is vonatkozika fenti készítményekkel. ŕ

Description

A találmány tárgyát különböző, új proteázenzimeket amelyek karbonil-hidroláz-változatok - tartalmazó tisztítókészítmények képezik.
Az enzimek alkotják a természetben előforduló fehérjék legnagyobb osztályát. Az enzimek minden osztálya különböző típusú kémiai reakciót katalizál (felgyorsítja a reakciót anélkül, hogy felhasználódna). Az enzimek proteázok néven ismert osztálya arról a képességéről ismert, hogy más fehérjéket hidrolizálni képes (a vegyületet két vagy több egyszerűbb vegyületre bontja a vízmolekula H- és -OH csoportjainak a hasítás mentén létrejött mindkét kémiai kötésre történő felvételével). Ezt a fehérjéket hidrolizáló képességet előnyként használjuk fel a természetben előforduló és biomémöki úton készített proteázoknak mosószerkészítményekbe adalékként történő beépítésével. A ruhákon sok folt fehérjétől eredő, és széles specifitású proteázok lényegesen javítani tudják ilyen foltok eltávolítását.
Sajnos, ezeknek a fehérjéknek a természetes bakteriális környezetben kifejtett hatékonysági szintje gyakran nem ültethető át a relatív természetellenes mosási környezetbe. Különösen olyan fehérjetulajdonságok, mint a hőstabilitás, pH-stabilitás, oxidatív stabilitás és szubsztrátspecifitás nem szükségszerűen az enzimnek a természetes környezetén kívüli felhasználására optimalizáltak.
A proteázenzim aminosavszekvenciája határozza meg a proteáz tulajdonságait. A proteáz aminosavszekvenciájának megváltozása különböző mértékig módosíthatja az enzim sajátságait - sőt inaktiválhatja az enzimet - az aminosavszekvenciában bekövetkezett változás helyétől, természetétől és/vagy terjedelmétől függően. Történt néhány próbálkozás a proteázok aminosavszekvenciájának módosítására tulajdonságaik javítására azzal a céllal, hogy növeljék a proteáz hatékonyságát tisztítási felhasználásnál. Ezek a megközelítések magukban foglalják az aminosavszekvencia módosítását a hőstabilitás fokozása és az oxidatív stabilitás megjavítása céljából meglehetősen eltérő körülmények között.
így például az EP-A 0 398 539 közrebocsátási iratban olyan szubtilizinanalógokat ismertetnek, melyek egy természetben előforduló Bacillus szubtilizinből származnak, és melyekben (1) egy vagy több aminosavat a kalciumkötő helyen negatív töltésű aminosawal helyettesítettek; (2) egy vagy több Asn-t és/vagy Gly-t bármely Asn-Gly szekvenciában kivágtak vagy eltérő aminosavval helyettesítettek; (3) egy vagy több metioninrészt helyettesítettek; és (4) egy vagy több aminosavmaradékot a katalitikus triád környékén helyettesítettek.
Az EP-A 0 405 901 közrebocsátási iratban enzimes detergens kompozíciókat ismertetnek, melyek mutált szubtilizin proteázvariánsokat tartalmaznak megnövelt mosóhatással, melyeket a szülőenzim több mint 100 specifikus pozíciójában végzett egyszeres vagy többszörös delécióval, szubsztitúcióval vagy inszercióval állítottak elő.
A WO 88/08033 PCT-beli közrebocsátási iratban olyan szubtilizinanalógokat ismertetnek, melyek egy természetben előforduló Bacillus szubtilizinből származnak, és (1) egy vagy több negatív töltésű aminosav van jelen a kalciumkötő helyen; és (2) egy vagy több Asn-t és/vagy Gly-t bármely Asn-Gly szekvenciában kivágtak vagy helyettesítettek egy eltérő aminosawal.
A WO 89/09830 PCT-beli közrebocsátási iratban megnövelt hőstabilitású mutált szubtilizinenzimeket írnak le, melyek egy természetben előforduló Bacillus szubtilizinből származnak specifikus aminosavhelyettesítéseket végezve egy vagy két megadott pozícióban.
Az irodalomban leírt változatos próbálkozások ellenére állandó igény mutatkozik különböző felületek tisztítására használható új, hatásos proteázváltozatokra. Ezért a találmány tárgyát olyan proteázenzimeket - karbonilhidroláz-változatokat - tartalmazó tisztítókészítmények képezik, amelyek javított proteolitikus aktivitásssal, szubsztrátspecifitással, stabilitással és/vagy fokozott teljesítménnyel rendelkeznek. A találmány szerinti proteázváltozatok a fent említett közrebocsátási iratokban leírt mutáns szubtilizinektől eltérnek, amennyiben (1) legalább két aminosavmódosítást tartalmaznak; (2) az aminosavmódosításnak kötelezően a 76. pozícióban és egy vagy több más pozícióban kell előfordulni, kiválasztva a
27., 99., 101., 103., 104., 105., 107., 109., 123., 126.,
128., 135., 156., 166., 195., 197., 204., 206., 210., 216.,
217., 218., 222., 260., 265. és/vagy 274. pozíciók közül; és (3) az aminosavmódosítások specifikusan szubsztitúciók és nem lehetnek sem deléciók sem inszerciók.
A találmány szerinti mutáns szubtilizinek kiváló tisztítóteljesítménnyel rendelkeznek.
A fentiek alapján a találmány tárgyát tisztítókészítmények képezik, amelyek tartalmaznak:
a) hatásos mennyiségű proteázenzimet, amely egy természetben elő nem forduló aminosavszekvenciával rendelkező karbonil-hidroláz-változat, amely egy természetben előforduló Bacillus szubtilizin prekurzor karbonil-hidrolázból származik helyettesítve a prekurzor karbonil-hidrolázban a +76. helyzetű aminosavmaradékot és egy vagy több aminosavmaradékot a +27., +99., +101., +103., +104., +105, +107., +109., + 123., +126., +128., +135., +156., +166., +195., + 197., +204., +206., +210., +216., +217., +218., +222., +260., +265. és/vagy +274. helyzetben, melyek ekvivalens helyzetűek a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin aminosavmaradékaival;
azzal a megkötéssel, hogy az enzimváltozatokban az együttes helyettesítések az alábbi helyettesítésektől eltérőek:
két aminosavhelyettesítés esetén: 76+109 vagy 76+218;
három aminosavhelyettesítés esetén: 76++ 109+218; négy aminosavhelyettesítés esetén: 76+109+217+222 vagy 76+217+218+222;
öt aminosavhelyettesítés esetén:
76+109+217+218+222;
és
b) a proteázenzimmel összeegyeztethető, egy vagy több tisztítókészítmény-anyagot.
A találmány tárgyát képezik továbbá tisztítandó dolgok tisztításra szolgáló módszerek a nevezett dolognak a proteázenzimmel - amely az itt leírtak szerint karbonil-hidroláz - való érintkeztetése révén. A találmány tehát felölel egy szövetek tisztítására szolgáló mód2
HU 219 851 Β szert, amely magában foglalja a nevezett szövetek érintkeztetését - előnyösen keveréssel - a nevezett proteázenzimet tartalmazó vizes folyadékkal. Az eljárás kivitelezhető 60 °C alatti hőmérsékleten, de természetesen meglehetősen hatásos mosodai hőmérsékleteken egészen forralásig. Szintén a találmány tárgyát képezi egy tisztítandó edények tisztítására szolgáló módszer az edényeknek az itt leírt proteázenzimmel való érintkeztetése révén.
Az ábrák rövid leírása
Az 1A-C. ábrák a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin DNS- és aminosavszekvenciáját és ennek a génnek (6. számú szekvenciavázlat) részleges restrikciós térképét mutatják.
A 2. ábra a Bacillus amyloliquefaciens (BPN)’ és Bacillus lentus (vad típus) szubtilizinek körében előforduló konzervatív aminosavmaradékokat mutatja.
A 3A. és 3B. ábrák négy szubtilizin aminosavszekvenciáját mutatják. A felső vonal a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin (időnként szubtilizin BPN’-ként említve) aminosavszekvenciáját (7. számú szekvenciavázlat) tünteti fel. A második vonal mutatja a Bacillus subtilis szubtilizin aminosavszekvenciáját (8. számú szekvenciavázlat). A harmadik vonal ábrázolja a Bacillus licheniformis szubtilizin aminosavszekvenciáját (9. számú szekvenciavázlat). A negyedik vonal a Bacillus lentus szubtilizin (szubtilizin 309-ként is említve a WO 89/06276 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben) aminosavszekvenciáját (10. számú szekvenciavázlat) mutatja. A * jel specifikus aminosavmaradék hiányát jelenti a szubtilizin BPN’-hez képest.
A 4. ábra a GGA274 plazmid szerkesztését mutatja.
Az 5. ábra a GGT274 szerkesztését mutatja, amely az ebben a bejelentésben alkalmazott bizonyos expreszsziós plazmidok köztiterméke.
A 6A., 6B. és 6C. ábrák a Bacillus lentus szubtilizin DNS- (11. számú szekvenciavázlat) és aminosavszekvenciáját mutatják. Az érett szubtilizinfehérjét az alaninnak megfelelő GCG (334-336.) kodonnal kezdődő kodonok kódolják.
A 7 A., 7B. és 7C. ábrák mutatják a találmány előnyben részesített megvalósítási formájának (N76D/S103A/ /V104I) DNS- (12. számú szekvenciavázlat) és aminosavszekvenciáját. Az ezen az ábrán levő DNS-t a leírt módszerekkel úgy módosítottuk, hogy a 76. helyzetben aszpartátot, a 103. helyzetben alanint és a 104. helyen izoleucint kódoljon. Az érett szubtilizinfehéije-változatot az alaninnak megfelelő GCG (334-336) kodonnal kezdődő kodonok kódolják.
A 8. ábra mutatja a pBCDAICAT vektor szerkesztését.
A 9. ábra mutatja a pUCCATFNA vektor szerkesztését.
A 10. ábra előnyben részesített mutáns enzim stabilitását mutatja a vad típushoz képest, folyékony detergens készítményben.
A találmány leírása Proteázenzimek:
A találmány tárgyát olyan, a természetben fel nem lelhető karbonil-hidroláz proteázenzim-változatok képezik, amelyek különböző proteolitikus aktivitással, stabilitással, szubsztrátspecifitással, pH-profillal és/vagy teljesítményjellemzőkkel rendelkeznek ahhoz a prekurzor karbonil-hidrolázhoz képest, amelyből a változat aminosavszekvenciája származik. A prekurzor karbonilhidroláz lehet természetben előforduló karbonil-hidroláz vagy rekombináns hidroláz. Különösen olyan karbonil-hidroláz-változatok rendelkeznek a természetben fel nem lelhető aminosavszekvenciával, amelyek a prekurzor karbonil-hidroláz aminosavmaradékai többségének eltérő aminosavakkal való helyettesítésével származnak. A prekurzor enzim aminosavmaradékainak többsége megfelel a +76. helyzetnek a következő egy vagy több maradékkal kombinálva: +99, +101, +103, + 104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, + 135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 es/vagy +274, ahol a számozott helyek megfelelnek a természetben előforduló, Bacillus amyloliquefacienshőX származó szubtilizinnek vagy más karbonil-hidrolázok vagy szubtilizinek, úgymint Bacillus lentus szubtilizin.
A karbonil-hidroláz-változatok, amelyek a találmány szerinti készítményekben használható proteázenzimek, egy vagy több módosítással kombinálva tartalmazzák a +76. helyzetű aminosavmaradék helyettesítését. A találmány számára hasznos proteázenzim-változatok előnyösen magukban foglalják aminosavmaradékok helyettesítését (szubsztitúcióját), a következő kombinációkban: 76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/ /101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/ /104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/ /104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/ /104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/ /104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/ /104/126/265 és/vagy 76/103/104/222. A találmány számára hasznos különböző enzimek legelőnyösebben a maradékok következő kombinációjában tartalmazzák aminosavmaradék helyettesítését: B. amyloliquefaciens szubtilizin 76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 és 76/101/104.
Ilyen karbonil-hidrolázokat vagy szubtilizinváltozatokat kódoló különböző DNS-szekvenciák olyan prekurzor DNS-szekvenciából származnak, amely a természetben előforduló vagy rekombináns prekurzor enzimet kódol. A különböző DNS-szekvenciák a prekurzor DNS-szekvencia olyan módosításával származnak, amely a prekurzor DNS-szekvencia által kódolt egy vagy több specifikus aminosavmaradék helyettesítését kódolja a következő helyzeteknek megfelelően: 76, 99, 101, 103, 104, 107, 123, 27, 105, 109, 126, 128, 135, 156, 166, 195, 197, 204, 206, 210, 216, 217, 218, 222, 260, 265 és/vagy 274 Bacillus amyloliquefaciensben vagy ezek bármilyen kombinációja. Jóllehet a módosításhoz azonosított aminosavmaradékok itt a B. amyloliquefaciensre alkalmazható számozás szerint vannak
HU 219 851 Β azonosítva (amely a maradékok helyzetének azonosítására szolgáló hagyományos módszerré vált minden szubtilizinben), a találmány számára használható, előnyben részesített prekurzor DNS-szekvencia a Bacillus lentus DNS-szekvenciája, ahogyan azt a 6. ábrán bemutatjuk (11. számú szekvenciavázlat).
Ezek a különböző DNS-szekvenciák a 76. aminosavmaradék behelyettesítését kódolják egy vagy több további módosítással kombinálva. A különböző DNS-szekvenciák aminosavmaradékok behelyettesítését előnyösen a következő kombinációkban kódolják: 76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/ /103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/ /107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/ /260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/ /105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/ /107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 és/vagy 76/103/104/222. A különböző DNS-szekvenciák legelőnyösebben a maradékok következő kombinációinak módosítását kódolják: 76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/ /104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 és 76/101/104. Ezek a rekombináns DNS-szekvenciák olyan karbonil-hidroláz-változatokat kódolnak, amelyek új aminosavszekvenciával, és általában legalább egy olyan sajátsággal rendelkeznek, amely lényegesen különbözik a prekurzor karbonil-hidroláz DNS-szekvencia által kódolt azonos tulajdonságtól. Az ilyen sajátságok közé tartozik a proteolitikus aktivitás, szubsztrátspecifitás, stabilitás, megváltozott pH-profil és/vagy fokozott teljesítményjellemzők.
Az itt felhasználható proteázenzimek felölelik a 19 természetben előforduló L-aminosav bármelyikének behelyettesítését a megjelölt aminosavmaradék-helyzetekbe. Ilyen helyettesítéseket bármelyik prekurzor szubtilizinben (prokarióta, eukarióta, emlős stb.) végezhetünk. E bejelentés egésze során a különböző aminosavakra a szokásos egy- és hárombetűs kódokkal hivatkozunk. Ilyen kódokat azonosít könyvében Dalé, J. W. [Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd. App. B (1989)].
Az elvégzendő helyettesítés az azonosított aminosavmaradék-helyek mindegyikénél előnyösen magában foglalja, de nem korlátozódik a: helyettesítésekre a 76. helyzetben, beleértve D, Η, E, G, F, K, P és N; helyettesítésekre a 99. helyzetben, beleértve D, T, N, Q, G és S; helyettesítésekre a 101. helyzetben, beleértve G, D, K, L, A, E, S és R; helyettesítésekre a 103. helyzetben, beleértve Q, T, D, Ε, Y, K, G, R, S és A; helyettesítésekre a 104. helyzetben, beleértve mind a 19 természetben előforduló aminosavat; helyettesítésekre a 107. helyzetben, beleértve V, L, Μ, Y, G, E, F, T, S, A, N és I; helyettesítésekre a 123. helyzetben, beleértve Ν, T, I, G, A, C és S; helyettesítésekre a 27. helyzetben, beleértve K, N, C, V és T; helyettesítésekre a 105. helyzetben, beleértve A, D, G, R és N; helyettesítésekre a 107. helyzetben, beleértve A, L, V, Y, G, F, T, S és A; helyettesítésekre a 109. helyzetben, beleértve S, K, R, A, N és D; helyettesítésekre a 126. helyzetben, beleértve A, F, I, V és G; helyettesítésekre a 128. helyzetben, beleértve G, L és A; helyettesítésekre a 135. helyzetben, beleértve A, F, I, S és V; helyettesítésekre a 156. helyzetben, beleértve D, E, A, G, Q és K; helyettesítésekre a 166. helyzetben, beleértve mind a 19 természetben előforduló aminosavat; helyettesítésekre a 195. helyzetben, beleértve E; helyettesítésekre a 197. helyzetben, beleértve E; helyettesítésekre a 204. helyzetben, beleértve A, G, C, S és D; helyettesítésekre a 206. helyzetben, beleértve L, Y, N, D és E; helyettesítésekre a 210. helyzetben, beleértve L, I, S, C és F; helyettesítésekre a 216. helyzetben, beleértve V, Ε, T és K; helyettesítésekre a 217. helyzetben, beleértve mind a 19 természetben előforduló aminosavat; helyettesítésekre a 218. helyzetben, beleértve S, A, G, T és V; helyettesítésekre a 222. helyzetben, beleértve mind a 19 természetben előforduló aminosavat; helyettesítésekre a 260. helyzetben, beleértve P, N, G, A, S, C, K és D; helyettesítésekre a 265. helyzetben, beleértve N, G, A, S, C, K, Y és H; és helyettesítésekre a 274. helyzetben, beleértve A és S aminosavakat. Minden ilyen helyzetbe a különösen előnyben részesített behelyettesítendő aminosava(ka)t jelezzük az 1. táblázatban. Bár az 1. táblázatban specifikus aminosavakat mutatunk, megjegyezzük, hogy bármelyik aminosav behelyettesíthető az azonosított maradékok helyébe.
1. táblázat
Aminosav- maradék A helyettesítésre/beszúrásra előnyben részesített aminosav
+ 76. D,H
+ 99. D, T, N, G
+ 101. R, G, D, K, L, A, E
+ 103. A, Q, T, D, Ε, Y, K, G, R
+ 104. I, Y, S, L, A, T, G, F, M, W, D, V, N
+ 107. V, L, Y, G, F, T, S, A, N
+ 123. S, T,I
+ 27. K
+ 105. A,D
+ 109. S, K,R
+ 126. A, I, V, F
+ 128. G,L
+ 135. I, A,S
+ 156. E,D,Q
+ 166. D, G, Ε, K, N, A, F, I, V, L
+ 195. E
+ 197. E
+204. A, G,C
+206. L
+210. I, s, C
+216. V
HU 219 851 Β
1. táblázat (folytatás)
Aminosav- maradék A helycttcsítcsre/beszúrásra előnyben részesített aminosav
+217. Η, I, Y, C, A, G, F, S, N, E, K
+218. S
+222. A, Q, S, C, I, K.
+260. P, A, S, N, G
+265. N, A, G, S
+274. A, S
Ezek a proteázenzimek, amelyek in vitro mutációkat tartalmaznak a B. lentus szubtilizinben a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin +76. helyének megfelelő aminosavmaradéknál, a prekurzor szubtilizinekhez képest megváltozott stabilitású (például módosított autoproteolitikus stabilitású) szubtilizinváltozatokat eredményeznek (lásd a 4., 5. és 6. táblázatokat).
A Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin +99, + 101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, + 126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 és/vagy +274 helyzeteinek megfelelő maradékoknál egyenként, vagy egymással kombinálva és a +76 mutációkkal bármilyen kombinációban történő in vitro mutáció szintén olyan szubtilizinváltozatokat eredményez, amelyek megváltozott proteolitikus aktivitást, megváltozott hőstabilitást, megváltozott pH-profilt, megváltozott szubsztrátspecifitást és/vagy megváltozott teljesítménytulajdonságokat mutatnak.
A karbonil-hidrolázok olyan proteázenzimek, amelyek hidrolizálják az O=C-X kötéseket tartalmazó vegyületeket, ahol az X oxigén vagy nitrogén. Magukban foglalnak természetben előforduló és rekombináns karbonil-hidrolázokat. A természetben előforduló karbonil-hidrolázok főként olyan hidrolázokat ölelnek föl, mint például peptidhidrolázokat, úgymint szubtilizineket vagy metalloproteázokat. A peptidhidrolázok közé tartozik az α-amino-acil-peptidhidroláz, peptidil-aminosav-hidroláz, acil-amino-hidroláz, szerin-karboxi-peptidáz, metallo-karboxi-peptidáz, tiolproteináz, karboxilproteináz és metalloproteináz. Szerin, metallo-, tiol- és savproteázok ugyanúgy beletartoznak, mint az endo- és exoproteázok.
„Rekombináns karbonil-hidroláz” olyan karbonilhidrolázra utal, amelyben a természetben előforduló karbonil-hidrolázt kódoló DNS-szekvenciát módosítottuk olyan mutáns DNS-szekvencia előállítása céljából, amely a karbonil-hidroláz aminosavszekvenciájában egy vagy több aminosav helyettesítését, beszúrását vagy kivágását kódolja. Megfelelő módosítási módszereket itt teszünk közzé és a 4,760,025 (RE 34,606 számon újra érvénybe helyezett), 5,204,015 és 5,185,258 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, amelyeket beépítettünk ide referenciaként.
A szubtilizinek baktérium- vagy gomba-karbonilhidrolázok, amelyek általában fehéqék vagy peptidek peptidkötéseit bontva hatnak. „Szubtilizin” ahogyan itt használjuk, természetben előforduló szubtilizint vagy rekombináns szubtilizint jelent. A természetben előforduló szubtilizinek sorozata különböző mikrobafajok által termelt és gyakran kiválasztott szubtilizinként ismert. E sorozatok tagjainak aminosavszekvenciái nem teljesen homológok. E sorozatok szubtilizinjei azonban ugyanazt vagy hasonló típusú proteolitikus aktivitást mutatnak. A szerinproteázok ezen osztálya egy katalitikus triádot definiáló közös aminosavszekvenciával rendelkezik, amely megkülönbözteti őket a kimotripszinnel rokon szerinproteázok osztályától. A szubtilizinek és kimotripszinnel rokon szerinproteázok egyaránt rendelkeznek aszparaginsavat, hisztidint és szerint tartalmazó katalitikus trióddal. A szubtilizinnel rokon proteázokban ezen aminosavak relatív sorrendje - az aminovégtől a karboxilvég felé olvasva - aszparaginsav hisztidin - szerin. A kimotripszinnel rokon proteázokban azonban a relatív sorrend hisztidin - aszparaginsav - szerin. Tehát az itt leírt szubtilizin olyan szerinproteázt jelent, amely a szubtilizinrokon proteázok katalitikus triádjával rendelkezik. A példák tartalmazzák, de nem korlátozódnak a 3. ábrán azonosított szubtilizinekre.
„Rekombináns szubtilizin” olyan szubtilizinre utal, amelyben a szubtilizint kódoló DNS-szekvenciát módosítottuk olyan variáns (vagy mutáns) DNS-szekvencia előállítása céljából, amely a természetben előforduló szubtilizin aminosavszekvenciájában egy vagy több aminosav helyettesítését, kivágását vagy beszúrását kódolja. Ilyen módosítások elvégzésére szolgáló megfelelő módszereket, és amelyeket kombinálhatunk az itt közöltekkel, a 4,760,025 (RE 34,606 számon újra érvénybe helyezett), 5,204,015 és 5,185,258 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások tartalmaznak.
„Nem humán karbonil-hidrolázokat” és azokat kódoló DNS-eket kaphatunk több prokarióta és eukarióta szervezetből. A megfelelő példák prokarióta szervezetekre magukban foglalnak Gram-negatív szervezeteket, úgymint E. colit vagy Pseudomonas speciest és Grampozitív baktériumokat, úgymint Micrococcus vagy Bacillus speciest. Példák eukarióta szervezetekre, amelyekből karbonil-hidrolázok és azok génjei kinyerhetők, felölelnek az élesztőt, úgymint Saccharomyces cerevisiaet, gombát, úgymint Aspergillus speciest és nem humán emlősforrásokat, úgymint például szarvasmarhafajt, amelyből a kimozin karbonil-hidrolázt kódoló gént nyerhetjük ki. Ahogyan a szubtilizineknél, karbonil-hidrolázok sorozatát kaphatjuk különböző olyan rokon fajokból, amelyek e sorozat tagjai között nem teljesen homológ aminosavszekvenciákkal rendelkeznek, mindamellett azonban ugyanazt vagy hasonló típusú biológiai aktivitást mutatnak. Tehát a nem humán karbonil-hidrolázok - ahogyan itt használjuk funkcionális definíciójuk szerint olyan karbonil-hidrolázokat jelentenek, amelyek közvetlenül vagy közvetetten kapcsolatban vannak prokarióta- vagy eukariótaforrásokkal.
Egy „karbonil-hidroláz-változat” olyan aminosavszekvenciával rendelkezik, amely egy „prekurzor karbonil-hidroláz” aminosavszekvenciájából származik.
HU 219 851 Β
A prekurzor karbonil-hidrolázok (úgymint szubtilizin) magukban foglalnak természetben előforduló karbonilhidrolázokat (szubtilizin) és rekombináns karbonilhidrolázokat (szubtilizin). A karbonil-hidroláz-változat aminosavszekvenciája a prekurzor hidroláz aminosavszekvenciájából „származik” a prekurzor aminosavszekvencia egy vagy több aminosavjának helyettesítésével. Ilyen módosítás a prekurzor karbonil-hidroláz (szubtilizin) aminosavszekvenciáját kódoló „prekurzor DNS-szekvenciá”-ban inkább célszerű, mint magának a prekurzor karbonil-hidroláz-enzimnek (szubtilizin) a manipulációja. A prekurzor DNS-szekvencia ilyen manipulációjára megfelelő módszerek felölelik az itt közzétett módszereket ugyanúgy, mint a szakmában ismeretes módszereket (lásd például az EP 0 328299 számú európai szabadalmi leírást, WO 89/06279 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentést és a korábban már hivatkozott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat és bejelentéseket).
A +76. helyzetnek megfelelő specifikus aminosavmaradékot egy vagy több helyzettel kombinálva a következők közül: +99, +101, +103, +104, +107, + 123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, + 166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 és/vagy +274 azonosítottuk Bacillus amyloliquefaciens szubtilizinben mutáció céljára. A módosított maradékokat előnyösen a következő kombinációk közül választottuk ki: 76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/ /104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/ /104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/ /104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/ /104/126/265 és/vagy 76/103/104/222; és a legelőnyösebbek: 76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 és 76/101/104. Ezek az aminosavhelyzet-számok az 1. ábrán bemutatott, érett Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin szekvenciájának jelöléseire vonatkoznak. A találmány számára hasznos proteázenzimek azonban nem korlátozódnak ennek az egy szubtilizinnek a mutációjára, hanem kiterjednek olyan prekurzor karbonil-hidro1 azokra, amelyek a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizinben azonosított maradékokkal „ekvivalens” helyzetű aminosavmaradékokat tartalmaznak. Előnyösen a Bacillus lentus szubtilizinje a prekurzor szubtilizin, és a helyettesítéseket azoknál az ekvivalens aminosavmaradékoknál végezzük a Bacillus len tusban, amelyek megfelelnek a fent felsoroltaknak.
A prekurzor karbonil-hidroláz aminosavmaradéka akkor ekvivalens a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin maradékával, ha vagy homológ (azaz pozíciójában megfelel akár az elsődleges, akár a harmadlagos szerkezetnek), vagy analóg a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin specifikus maradékával vagy ennek a maradéknak egy részével (azaz kémiai egyesülésre, reakcióra vagy kölcsönhatásra ugyanazzal vagy hasonló funkciós képességgel rendelkezik).
Az elsődleges szerkezet homológiájának megállapítása céljából közvetlenül összehasonlítjuk a prekurzor karbonil-hidroláz aminosavszekvenciáját a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin elsődleges szekvenciájával és különösen a szubtilizinekben állandónak ismert maradékok csoportjával, amelyeknek a szekvenciája ismert. A 2. ábra mutatja a Bacillus amyloliquefaciens és a Bacillus lentus szubtilizin közötti konzervatív maradékokat. A konzervatív maradékok sorba állítása után, megengedve szükséges beszúrásokat és kivágásokat a sorrend fenntartása érdekében (azaz elkerülve a konzervatív maradékoknak korlátlan kivágások és beszúrások általi eltüntetését), definiáljuk a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin elsődleges szerkezetének egyes aminosavjaival ekvivalens maradékokat. A konzervatív maradékok sorrendjének előnyösen az ilyen maradékok 100%-át kellene megőrizniük. Azonban a konzervatív maradékok 75%-nál nagyobb vagy olyan kicsi, mint 50%-os sorrendje szintén megfelelő ekvivalens maradékok definiálására. Az Asp32/His64/Ser221 katalitikus triád megőrzését fenn kell tartani.
Például a 3. ábrán a Bacillus amyloliquefaciensbő\, Bacillus subtilisből, Bacillus licheniformisból (carlsbergensis) és Bacillus lentusból származó szubtilizin aminosavszekvenciáját állítottuk sorba, hogy megállapítsuk a maximális homológiát az aminosavszekvenciák között. Ezeknek a szekvenciáknak az összehasonlítása azt mutatja, hogy számos konzervatív maradék van, amelyet minden szekvencia tartalmaz. Ezeket a konzervatív maradékokat (mint a BPN’ és B. lentus között) azonosítjuk a 2. ábrán.
Ezek a konzervatív maradékok tehát felhasználhatók a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin megfelelő ekvivalens aminosavmaradékainak definiálására más karbonil-hidrolázokban, úgymint Bacillus lentus szubtilizinben (PCT WO 89/06279 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, közzététel 1989. július 13-án), az itt előnyben részesített szubtilizin prekurzor enzimben, vagy a PB92-ként (EP 0328299 számú európai szabadalmi leírás) említett szubtilizinben, amely nagymértékben homológ az előnyben részesített Bacillus lentus szubtilizinnel. Ezek közül bizonyos szubtilizinek aminosavszekvenciáit a 3A. és 3B. ábrákon sorba állítottuk a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin szekvenciájával a konzervatív maradékok maximális homológiájának megállapítására. Ahogyan látható, a Bacillus lentus szekvenciájában számos kivágás van a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizinnel öszszehasonlítva. így például a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizinben Vall65-tel ekvivalens aminosav a többi, B. lentus és B. licheniformis szubtilizinben izoleucin.
így például a +76. helyzetű aminosav aszparagin (N) mind a B. amyloliquefaciens, mind a B. lentus szubtilizinben. A találmány számára hasznos, előnyben részesített szubtilizinváltozatban azonban a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin +76. helyzetével ekvivalens aminosavat aszparaginsavval (D) helyettesítettük. A 2.
HU 219 851 Β táblázatban szemléltetés céljából közreadjuk minden, összevetését minden ilyen helyzetnél az előnyben részehelyettesítés céljából itt azonosított aminosavmaradék sített helyettesítésekkel.
2. táblázat
+76 +99 + 101 + 103 + 104 + 107 + 123
B. amyloliquefaciens (vad típus) N D s Q Y I N
B. lentus (vad típus) N S s s V I N
A legelőnyösebb helyettesítés D D R A I/Y V S
Ekvivalens maradékok definiálhatók a prekurzor karbonil-hidroláz harmadlagos szerkezetének szintjében levő homológia meghatározásával is, amelynek harmadlagos szerkezetét röntgensugárzásos kristallográfiával tárták fel. Ekvivalens maradékoknak tekintjük azokat, amelyeknél a sorba állítás után a prekurzor karbonilhidroláz és a B. amyloliquefaciens szubtilizin kérdéses aminosavmaradéka főláncának atomjaiból kettőnek vagy többnek az atomkoordinátái (N az N-en, CA a CAn, C a C-én, O az O-n) 0,13 nm-en belül, előnyösen 0,1 nm-en belül vannak. A sorba állítást elérjük, miután a legjobb modellt úgy irányítjuk és helyezzük el, hogy a kérdéses karbonil-hidroláz nem hidrogén fehéijeatomjainak koordinátái maximális fedésben legyenek a B. amyloliquefaciens szubtilizinnel. A legjobb modell az a krisztallográfiás modell, amely az elérhető legmagasabb felbontásnál a kísérleti diffrakciós adatokból a legalacsonyabb R-faktort adja.
Rfaktor=
Yh[Fo(b}]-[Fc<M üh[Fo(by\
A B. amyloliquefaciens szubtilizinspecifikus maradékával funkcionálisan analóg ekvivalens maradékok definíció szerint a prekurzor karbonil-hidroláz azon aminosavai, amelyek úgy vehetnek fel konformációt, hogy vagy változnak, módosulnak, vagy hozzájárulnak a fehérjeszerkezethez, szubsztrátkötéshez vagy katalízishez a B. amyloliquefaciens szubtilizinspecifikus maradékánál definiált és annak tulajdonított módon. Továbbá ezek a prekurzor karbonil-hidroláznak azon maradékai (amelyeknek a harmadlagos szerkezetét röntgenkristallográfiával kaptuk), amelyek oly mértékben foglalnak el egy analóg helyzetet, hogy bár az adott maradék főláncának atomjai nem elégíthetik ki az ekvivalencia kritériumait a homológ helyzet elfoglalása alapján, a maradék oldallánc atomjaiból legalább kettőnek az atomkoordinátái 0,13 nm-en belül fekszenek a B. amyloliquefaciens szubtilizin megfelelő oldalláncának atomjaival. A B. amyloliquefaciens szubtilizin háromdimenziós szerkezetének koordinátáit az EP-A 0251446 számú szabadalmi iratban tesszük közzé (megfelel a 08/212,291 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésnek, amelyet itt referenciaként beépítettünk) és ez felhasználható, ahogyan azt fent vázoltuk, ekvivalens maradékok meghatározására a harmadlagos szerkezet szintjén.
A helyettesítéshez azonosított maradékok némelyike konzervatív maradék, míg a többi nem. A nem konzervatív maradékok esetében egy vagy több aminosav cseréje olyan helyettesítésekre korlátozódik, amelyek a természetben fel nem lelhető aminosavszekvenciájú változatot eredményeznek. A konzervatív maradékok ese15 tében az ilyen cseréknek nem kellene természetben előforduló szekvenciát eredményezniük. A találmány számára hasznos karbonil-hidroláz-változatok felölelik a karbonil-hidroláz-változatok érett formáit ugyanúgy, mint az ilyen hidrolázváltozatok elő- és elő-elóformáit.
A elő-előformák az előnyben részesített szerkezetek, mivel ezek megkönnyítik a karbonil-hidroláz-változatok kifejezését, kiválasztódását és érését.
Az „előszekvencia” olyan aminosavak szekvenciájára utal a karbonil-hidroláz érett formájának N-terminá25 lis részéhez kapcsolva, amelynek az eltávolítása a karbonil-hidroláz „érett” formájának megjelenését eredményezi. Sok proteolitikus enzim található a természetben, mint transzlációs előenzimtermék és poszttranszlációs lépés hiányában ebben a formában fejeződik ki.
Előnyben részesített előszekvencia a karbonil-hidrolázváltozatok, különösen szubtilizinváltozatok előállítására a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin feltételezett előszekvenciája, bár más szubtilizin előszekvenciák is használhatók. A példákban a Bacillus lentus (ATCC
21536) szubtilizin vélt elószekvenciáját használjuk.
A „szignálszekvencia” vagy „előszekvencia” egy karbonil-hidroláz N-terminális részéhez vagy egy előhidroláz N-terminális részéhez kapcsolt bármilyen aminosavszekvenciára vonatkozik; amely részt vehet a hidro40 láz érett vagy előformáinak kiválasztódásában. A szignálszekvenciának ez a funkcionális meghatározása, magában kívánja foglalni mindazokat a szubtilizingén vagy más kiválasztható karbonil-hidrolázok génjeinek N-terminális véget kódoló része által kódolt aminosavszekven45 ciákat, amelyek részt vesznek a szubtilizin- vagy más karbonil-hidroláz-változatok kiválasztásának megvalósításában természetes körülmények között. A találmány számára hasznos proteázenzimek felhasználják az ilyen szekvenciákat a karbonil-hidroláz-változatok kiválasztá50 sának végrehajtására, ahogyan azt itt leírtuk. A példákban használt előnyben részesített szignálszekvencia a Bacillus subtilis szubtilizinból származó szignálszekvencia első hét aminosavmaradékát a Bacillus lentusból (ATCC 21536) származó szubtilizin szignálszekvenciájának fennmaradó részével egyesítve tartalmazza.
A karbonil-hidroláz-változat elő-előformája az érett hidroláz formából, melynek aminovégéhez működőképesen előszekvencia kapcsolódik, és az előszekvencia aminovégéhez működőképesen hozzákapcsolt „elő”- vagy „szignáf’-szekvenciából áll.
HU 219 851 Β
Az „expressziós vektor” olyan DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-szerkezetre utal, amely működőképesen kapcsolódik egy megfelelő, a nevezett DNS kifejeződését alkalmas gazdaszervezetben végrehajtani képes kontrollszekvenciához. Ilyen kontrollszekvenciák közé tartozik a transzkripció végrehajtására a promoter, az ilyen transzkripció ellenőrzésére egy adott operátorszekvencia, megfelelő mRNS riboszóma-kötőhelyeket kódoló szekvencia és a transzkripció és a transzláció végét ellenőrző szekvenciák. A vektor lehet plazmid, fágrészecske vagy egyszerűen egy potenciális genomiális inzert. Amint transzformáltuk egy alkalmas gazdaszervezetbe, a vektor replikálódhat és működhet a gazdaszervezet genomjától függetlenül, vagy néhány esetben integrálódhat magába a genomba. A jelen feltételek között a „plazmid” és „vektor” kifejezéseket időnként egymással felcserélhetően használjuk, mivel a vektor leggyakrabban alkalmazott formája jelenleg a plazmid. Azonban az expressziós vektoroknak olyan egyéb formái is idetartoznak, amelyek egyenértékű fünkciókat szolgálnak, és amelyek ismertek vagy ismertté válnak a szakmában.
A találmányban használt „gazdasejtek” általában prokarióta vagy eukarióta gazdaszervezetek, amelyeket előnyösen átalakítottunk, a 4,760,025 számú (RE 34,606 számon újra érvénybe helyezett) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt módszerek szerint enzimesen aktív endoproteázok kiválasztására képtelenné tettünk. Előnyben részesített gazdasejt szubtilizin kifejezésére a Bacillus BG2036 törzs, amely enzimesen aktív neutrális proteáz és alkalikus proteáz (szubtilizin) hiányos. A BG2036 törzs előállítását részleteiben az 5,264,366 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás tartalmazza. Szubtilizin kifejezésére alkalmas egyéb gazdasejtek közé tartozik a Bacillus subtilis 1168 (szintén a 4,760,025 (RE 34,606 számon újra érvénybe helyezett) és 5,264,366 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, amelyeket itt referenciaként beépítettünk) ugyanúgy, mint bármilyen alkalmas Bacillus törzs, úgymint B. licheniformis, B. lentus stb.
A gazdasejteket transzformáljuk vagy megfertőzzük rekombináns DNS-technikák felhasználásával összeállított vektorokkal. Az ilyen transzformált gazdasejtek vagy a karbonil-hidroláz-változatokat kódoló vektorok replikációjára vagy a kívánt karbonil-hidroláz-változat kifejezésére képesek. Olyan vektorok esetében, amelyek a karbonil-hidroláz-változat elő- vagy elő-előformáját kódolják, az ilyen változatok amikor kifejeződnek, tipikusan a gazdasejt táptalajába választódnak ki a gazdasejtből.
„Működőképesen hozzákapcsolva”, amikor leírjuk a két DNS-régió közötti kapcsolatot, egyszerűen azt jelenti, hogy azok funkcionálisan kapcsolatban állnak egymással. Például egy előszekvencia működőképesen kapcsolódik egy peptidhez, ha szignálszekvenciaként működik, részt vesz a fehérje érett formájának kiválasztódásában legvalószínűbb, hogy magában foglalja a szignálszekvencia lehasítását. Egy promoter működőképesen kapcsolódik egy kódolószekvenciához, ha kontrollt gyakorol a szekvencia transzkripciójára; egy riboszóma-kötőhely működőképesen kapcsolódik egy kódolószekvenciához, ha úgy helyezkedik el, hogy lehetővé teszi a transzlációt,
A természetben előforduló prekurzor karbonilhidrolázt kódoló géneket megkaphatjuk a szakmában ismert általános módszerek szerint. A módszerek általában magukban foglalják olyan jelzett próbák szintézisét, amelyek vélhetően a kérdéses hidroláz régióit kódoló szekvenciákkal rendelkeznek, genomiális könyvtár elkészítését a hidrolázt kifejező szervezetekből, és a könyvtárak screenelését a kérdéses génre a próbákkal történő hibridizációval. A pozitívan hibridizáló kiónokat azután térképezzük és szekvenáljuk. A példákban felhasznált B. lentus gént az 5,185,258 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás - amelynek közzétételét itt beépítettük - 1. példájában leírtak szerint klónozzuk. A példákban felhasznált BPN’ gént a 4,760,025 számú (RE 34,606 számon újra érvénybe helyezett) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás - amelynek közzétételét itt beépítettük - 1. példájában leírtak szerint klónozzuk.
A klónozott karbonil-hidrolázt azután felhasználjuk egy gazdasejt transzformálására a hidroláz kifejezése céljából. A hidrolázgént ezután ligáljuk egy nagy példányszámú plazmidba. Ez a plazmid replikálódik a gazdaszervezetben olyan értelemben, hogy az tartalmazza a plazmidreplikációhoz szükséges jól ismert elemeket: promotert működőképesen hozzákapcsolva a kérdéses génhez (amelyet betölthet a gén saját homológ promotere, ha azt a gazdaszervezet felismeri, azaz átírja), transzkripciós terminációs és poliadenilációs régiót (bizonyos eukarióta gazdasejtekben a gazdaszervezet által a hidrolázgénből átírt mRNS stabilitásához szükséges), amely exogén vagy betöltheti a hidrolázgén endogén terminátor régiója, és kívánság szerint egy szelekciós gén, úgymint antibiotikumrezisztencia gén, amely képessé teszi a plazmiddal fertőzött gazdasejteket folyamatos fenntartó tenyésztésre antibiotikumot tartalmazó táptalajokon. Nagy példányszámú plazmidok tartalmaznak egy replikációs forrást a gazdaszervezet mellett is, lehetővé téve ezáltal plazmidok nagy számban történő keletkezését a citoplazmában kromoszomális korlátozás nélkül. A hidrolázgén többszörös példányainak gazdaszervezet genomjába történő beépítése azonban az oltalmi körbe tartozik. Ezt elősegítik prokarióta és eukarióta szervezetek, amelyek különösen fogékonyak homológ rekombinációra.
Az itteni példákban használt gének, egy természetes B. lentus gén és egy természetes B. amyloliquefaciens gén. Egy másik lehetőség szerint előállíthatunk természetben előforduló vagy mutáns prekurzor karbonil-hidrolázt (szubtilizint) kódoló szintetikus gént. Egy ilyen megközelítésben a prekurzor hidroláz (szubtilizin) DNS- és/vagy aminosavszekvenciáját határozzuk meg. Azután többszörös, egymást átfedő szintetikus egyszálú DNS-fragmentumokat szintetizálunk, amelyek hibridizációval és ligációval a prekurzor hidrolázt kódoló szintetikus DNS-t eredményeznek. Szintetikus gén összeállítására tesz közzé példát az 5,204,015 számú ameri 8
HU 219 851 Β kai egyesült államokbeli szabadalmi leírás - amelynek közzétételét itt beépítettük referenciaként - 3. példája.
Amint megtörtént a természetben előforduló vagy szintetikus prekurzor karbonil-hidroláz-gén klónozása, a természetben előforduló prekurzor karbonil-hidroláz szintézisén túlmenően számos módosítást végzünk a gén hasznosságának fokozására. Az ilyen módosítások magukban foglalják rekombináns karbonil-hidrolázok előállítását a 4,760,025 számú (RE 34,606 számon újra érvénybe helyezett) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és EPO 0251446 számú szabadalmi iratban közöltek szerint, és itt leírt karbonil-hidrolázváltozatok előállítását.
A következő kazettamutagenezis módszer alkalmazható a találmány számára hasznos karbonil-hidroláz-változatok összeállításának és azonosításának megkönnyítésére, jóllehet más módszerek, beleértve a helyre irányított mutagenezist is alkalmazhatunk. Először a hidrolázt kódoló, természetben előforduló gént nyerjük ki és teljes egészében vagy részben szekvenáljuk. Azután a szekvenciát végigvizsgálva olyan pontot keresünk, amelynél kívánatos egy vagy több aminosav mutációja (kivágása, beszúrása vagy helyettesítése) a kódolt enzimben. Az ezt a pontot szegélyező szekvenciákat restrikciós helyek jelenlétére vizsgáljuk, hogy a génnek egy rövid szakaszát olyan oligonukleotid-poollal cseréljük ki, amelyek azután kifejeződve különböző mutánsokat kódolnak. Az ilyen restrikciós helyek előnyösen egyedülállóak a hidrolázgénen belül, hogy megkönnyítsék a génszegmens kicserélését. Azonban bármilyen alkalmas restrikciós hely felhasználható - amely nem fordul elő túlzott gyakorisággal a hidrolázgénben - restrikciós emésztéssel keletkezett génfragmentumok előállítására, amelyek újra összeállíthatók megfelelő szekvenciává. Ha a kiválasztott ponttól megfelelő távolságra (10-15 nukleotid) nincsenek restrikciós helyek, ilyen helyeket nukleotidoknak a génbe történő behelyettesítésével hozunk létre oly módon, hogy a végső összeállításnál sem a leolvasási keret, sem a kódolt aminosavak nem változnak meg. A gén mutációját abból a célból, hogy szekvenciáját hasonlóvá tegyük a kívánt szekvenciához, M13 primer kiterjesztéssel végezzük általánosan ismert módszerek szerint. Az elvégzendő feladat, alkalmas szegélyezőrégiók helyének felderítésére és két megfelelő restrikciós hely eléréséhez szükséges változtatások megállapítására, rutinszerűen történik a genetikai kód bőséges mennyiségével, a gén restrikciósenzim-térképével és a nagyszámú különböző restrikciós enzimmel. Megjegyezzük, hogy ha rendelkezésre áll megfelelő szegélyező restrikciós hely, a fenti módszert csak avval a szegélyezőrégióval kapcsolatban kell alkalmazni, amely nem tartalmaz ilyen helyet.
Amint a természetben előforduló DNS-t vagy szintetikus DNS-t klónoztuk, a mutációra kiszemelt helyzeteket szegélyező restrikciós helyeket emésztjük a rokon restrikciós enzimekkel és a végcsoportokkal komplementer oligonukleotid-kazetták többségét ligáljuk a génbe. A mutagenezis egyszerűsödik ezzel a módszerrel, mivel mindegyik oligonukleotid szintetizálható oly módon, hogy ugyanazokkal a restrikciós helyekkel rendelkezzen, és nem szükségesek szintetikus linkerek a restrikciós helyek létrehozásához.
Ahogyan itt használjuk, a proteolitikus aktivitást úgy definiáljuk, mint a peptidkötések hidrolízisének arányát milligramm aktív enzimre vonatkoztatva. Sok jól ismert eljárás létezik a proteolitikus aktivitás mérésére [Kalisz
K. M., Microbial Proteinases, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed. (1988)]. A módosított proteolitikus aktivitáson túl vagy más lehetőségként, a találmány különböző enzimjei rendelkezhetnek más módosított sajátságokkal, úgymint Km, K,.at, «(a/K™ arány és/vagy módosított szubsztrátspecifitás és/vagy módosított pH-aktivitás-profil. Ezek az enzimek alakíthatók az egyes szubsztrátokhoz, amelyek előreláthatóan jelen lesznek, például hidrolitikus folyamatokban, úgymint mosodai használatnál.
Célirányosan biztosítható egy megváltozott proteolitikus aktivitású karbonil-hidroláz-változat a prekurzor karbonil-hidrolázzal összehasonlítva, mióta az ilyen aktivitás megnövelése (nagyságrenddel nagyobbra) lehetővé teszi az enzim célszubsztráton való sokkal hatásosabb működésének felhasználását. Szintén fontosak különböző, a prekurzorhoz képest megváltozott hőstabilitással és/vagy megváltozott szubsztrátspecifitással bíró enzimek. A mutációnak alávetendő karbonil-hidroláz előnyösen szubtilizin. Specifikus aminosavakat mutatunk be a példákban - amelyek felhasználhatók arra, hogy szubtilizin típusú karbonil-hidrolázokban ilyen eredményeket kapjunk - a következő helyekkel ekvivalens maradékoknál: +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, + 105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, + 197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 és/vagy +274 vagy ezek bármilyen kombinációjában Bacillus amyloliquefaciens szubtilizinben. Néhány esetben kívánatos lehet gyengébb proteolitikus aktivitás. Néhány esetben viszont fordítva, kívánatos lehet a különböző enzimek proteolitikus aktivitásának növelése a prekurzorral szemben. Továbbá kívánatos lehet a változat stabilitásának - vagy alkalikus vagy hőstabilitásának - növelése vagy csökkentése (megváltoztatása). Növekedés vagy csökkenés a K^-, ICn-, ^,/Κη, értékekben ezeknek a kinetikai paramétereknek a meghatározásához használt szubsztrátra specifikus.
Szintén meghatároztuk, hogy a +76. helyzettel ekvivalens maradékok - kombinációban számos más módosítással - a szubtilizinben fontosak az enzim stabilitásának és/vagy proteolitikus aktivitásának átfogó szabályozásában. így tehát, ahogyan azt a példákban közzétesszük, az előnyben részesített proteázenzimekben az aszparagin (N) a Bacillus lentus szubtilizinben a +76. helyzettel ekvivalens pozícióban helyettesíthető aszparaginsavval (D) kombinációban egy vagy több következő aminosavmaradék módosításával: +99, +101, +103, + 104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, + 135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 és/vagy +274 az eredményül kapott mutáns enzim fokozott stabilitásának és/vagy fokozott aktivitásának létrehozására.
A találmányban felhasználható leginkább előnyben részesített proteázenzimeket a példákban mutatjuk be.
HU 219 851 Β
Ezek felölelik a helyettesített maradékok következő specifikus kombinációit: N76D/S99D; N76D/V104I; N76D/S99D/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/ /V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V és N76D/S101R/ /S103A/V104I. Ezeket a helyettesítéseket előnyösen a B. lentus (rekombináns vagy természetes típusú) szubtilizinben végezzük, bár a helyettesítések elvégezhetők bármilyen Bacillus szubtilizinben.
Az ezzel és más különböző szubtilizinekkel kapott eredményekre alapozva nyilvánvaló, hogy a karbonilhidrolázokban (előnyösen szubtilizinben) a következő Bacillus amyloliquefaciens helyzetekkel ekvivalens maradékok: +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, + 195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 és/vagy +274 fontosak ezeknek az enzimeknek a proteolitikus aktivitására, teljesítményére és/vagy stabilitására és az ilyen enzimváltozatok tisztító- vagy mosási teljesítményére nézve.
A következőket a találmány készítményeiben használható proteázenzimek előállítására szolgáló példákon keresztül mutatjuk be.
Példa proteáz készítésére
A GG36 gén B. subtilisben való kifejezésére szolgáló szerkezet
A klónozást és a B. len tusból származó szubtilizingénnek a kifejezéshez történő szerkesztését lényegében ugyanúgy végezzük el, ahogy azt az 5,185,258 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírják. A GGA274 plazmidot (a 4. ábra mutatja be) továbbmódosítjuk a következő módon, ahogyan azt az 5. ábrán mutatjuk. A PstI helyet, amelyet a szerkezettel vittünk be a GGA274 plazmid szerkezetébe, eltávolítjuk - az alábbiakban leírt - oligonukleotid-irányította mutagenezissel, a következő szekvenciával rendelkező oligonukleotiddal:
5’ GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3’ (1. számú szekvenciavázlat). Az aláhúzott „A” maradék megszünteti a PstI restrikciósenzim-felismerő szekvenciát és a megfelelő aminosavmaradékot alaninról treoninra változtatja a 274. helyzetben. A 274. helyzetű treonin a vad típusú maradék, eredetileg a klónozott B. lentus szubtilizingén-szekvenciákban fordul elő. A szubtilizint kódoló DNS-szegmenst kivágjuk a GGA274 plazmidból vagy annak származékaiból (GGT274, az 5. ábrán) EcoRIgyel és BamHI-gyel történő emésztéssel. A DNS-fragmentumot visszaszubklónozzuk Ml3 bakteriofág-alapú vektorokba, úgymint MP 19-be, mutagenezishez. Mutagenezis után az EcoRI és Hindlll emésztést, amelyet klónozás követ, a mutációt szenvedett szubtilizingénnek egy GGA274-hez hasonló expressziós plazmidba történő visszavitele céljából végezzük a mutáns szubtilizinfehérjék kifejezésére és kinyerésére.
Oligonukleotid-irányított mutagenezis
Oligonukleotid-irányított mutagenezist végzünk Zoller és munkatársai leírása alapján [Zoller M. et al., Methods Enzymol. 100, 468-500 (1983)]. Példaként az 5’ GCTGCTCTAGACAATTCG 3’ (2. számú szekvenciavázlat) szintetikus oligonukleotidot használjuk a 76. helyzetű aminosavmaradék aszparaginról (N) aszparaginsavra (D) - N76D - történő kicseréléséhez. Az aláhúzott „G” és „C” maradékok jelzik a változásokat a vad típushoz képest. A CA megtartja az izoleucint a 75. helyzetben és megváltoztatja az aminosavszekvenciát egy Xbal restrikciósenzim-felismerő hely (TCTAGA) bevitelével, miközben a változtatás a GAC-nál az aszparagint a 76. helyzetben aszparaginsavra változtatja.
A 99., 101., 103. és 104. helyzetekben különböző oligonukleotidokat használhatunk mutagenezishez a kívánt mutációk kombinációjától függően. Az 5’ GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAG CTCGATT 3’ szekvenciájú (3. számú szekvenciavázlat) nukleotidot használjuk például a következő egyidejű változtatások elvégzésére: S99D; S101R; S103A és V104I egy szubtilizinmolekulában. Ehhez hasonlóan, az 5’ TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGAT TG 3’ szekvenciájú (4. számú szekvenciavázlat) és az 5’ CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG 3’ szekvenciájú (5. számú szekvenciavázlat) oligonukleotidokat használjuk fel az I107V és N123S létrehozására külön-külön. Az aláhúzott maradékok jelzik megint a változtatásokat a vad típusú szekvenciákból, amelyek vagy az aminosavszekvenciákban vagy a restrikciósenzim-felismerő szekvenciákban bekövetkező kívánt változásokat eredményezik.
A szubtilizinváltozatok proteolitikus aktivitása
Az előbbi oligonukleotid-irányította mutagenezist követően a 3. táblázatban felsorolt változatok készültek. Ezen szubtilizinváltozatok mindegyikének proteolitikus aktivitását mutatja a 3. táblázat. A K<.at, Km, Kca/Km kinetikai paramétereket a szukcinil-L-Ala-L-Ala-L-ProL-Phe-p-nitro-anilid szintetikus peptidszubsztrát hidrolízisére mértük meg, a Bonneau és munkatársai által leírt módszer [Bonneau P. et al., J. Am. Chem. Soc. 113 (3), 1030 (1991)] szerint. Röviden, a szubtilizinváltozat törzsoldatának kis részletét a szubsztrátot 0,1 M TrisHCl-pufferben (pH 8,6) feloldva tartalmazó 1 cm3-es küvettába tesszük, és 25 °C-on termosztáljuk. A reakció előrehaladtát spektrofotometriásán követjük a p-nitroanilin reakciótennék abszorbanciájának nyomon követésével 410 nm-en. Kinetikai paramétereket kapunk nemlineáris regressziós algoritmus alkalmazásával, minden egyes reakció sebességének és termékkoncentrációjának a Michaelis-Menten-egyenletbe illesztésével.
3. táblázat
A Bacillus lentus szubtilizinben és változataiban mért kinetikai paraméterek
Protcázenzim-változatok IW*-1) K„,(M)
- B. lentus szubtilizin 170 0,000 78 2,18xl05
- N76D 219 0,000 8 2,74x105
HU 219 851 Β
3. táblázat (folytatás)
Protcázcnzim-változatok KCa,(s-') Κπ,(Μ) KeaAmÜ-'M1)
1. N76D/S99D 88 0,000 61 1,44x105
2. N76D/S101R 371 0,001 3 2,85x105
3. N76D/S103A 400 0,001 4 2,86x105
4. N76D/V104I 459 0,001 1 4,17x105
5. N76D/I107V 219 0,001 1 1,99x105
6. N76D/N123S 115 0,001 8 6,40 x1ο4
7. N76D/S99D/S101R 146 0,000 38 3,84x105
8. N76D/S99D/S103A 157 0,001 2 1,31x105
9. N76D/S99D/V104I 247 0,000 97 2,55x105
10. N76D/S101R/S103A 405 0,000 69 5,90x105
11. N76D/S101R/V104I 540 0,000 49 Ι,ΙΟχΙΟ6
12. N76D/S103A/V104I 832 0,001 6 5,20x105
13. N76D/V104I/I107V 497 0,000 45 Ι,ΙΟχΙΟ6
14. N76D/V104Y/I107V 330 0,000 17 1,90 x1ο6
15. N76D/V104I/N123S 251 0,002 6 9,65x10*
16. N76D/I107V/N123S 147 0,003 5 4,20x10*
17. N76D/S99D/S101R/S103A 242 0,000 74 3,27x105
18. N76D/S99D/S101R/V104I 403 0,000 72 5,60x105
19. N76D/S99D/S103A/V104I 420 0,001 6 2,62x105
20. N76D/S101R/S103A/V104I 731 0,000 65 1,12x1ο6
21. N76D/S103A/V104I/N123S 321 0,002 6 1,23x105
22. N76D/V104I/I107V/N123S 231 0,003 7,70x10*
23. N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 624 0,000 98 6,37x105
24. N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 194 0,004 3 4,51x10*
25. N76D/S99D/S101R/S103A/V104I//N123S 311 0,002 3 1,35x105
A 3. táblázatban felsorolt eredmények azt jelzik, hogy minden vizsgált szubtilizinváltozat megőrzi proteolitikus aktivitását. Továbbá az adatok részletes analízise elénk tátja, hogy a proteolitikus aktivitás szignifikánsan változott a Bacillus lentus szubtilizinhez képest, a Bacillus amyloliquefaciensben 76, 99, 101, 103, 104,107 és 123 helyzetekkel ekvivalens aminosavmaradékoknál történt helyettesítések különböző kombinációival.
A szubtilizinváltozatok hőstabilitása
A Bacillus lentus szubtilizin és - az oligonukleotidirányította mutagenezis eljárásával az előbbiek szerint előállított találmány szerinti változatok hőstabilitásának összevetésénél megfigyelteket a 4. táblázatban mutatjuk be. Tisztított enzimből 15 pg/ml 0,1 M glicin 0,01% Tween-80 pH 10,0 oldatban, 50 mM CaCl2-dal vagy anélkül kis részletekben kis csövekbe és inkubálva 10 °C-on 5 percig, 10 °C-ról 60 °C-ra 1 percen belül, és 60 °C-on 20 percig. A csöveket ezután 10 percre jégre tesszük. A csövek kis részleteiből enzimaktivitást határozunk meg 1,2 mM szukcinil-L-Ala-L-Ala-L-Pro-LPhe-p-nitro-anilid szintetikus peptidszubsztrátot 0,1 M Tris-HCl-pufferben (pH 8,6) feloldva tartalmazó 1 cm3es küvettákhoz adva, és 25 °C-on termosztálva. A kezdeti lineáris reakciósebességet spektrofotometriásán követjük a p-nitro-anilin reakciótermék abszorbanciájának nyomon követésével 410 nm-en az idő függvényében. A hőkezelést megelőzően kapott adatokat százalékos aktivitásként mutatjuk be. A 4. táblázatban felsorolt eredmények azt mutatják, hogy a változatok nagy többsége a Bacillus lentus szubtilizinnel összehasonlítható hőstabilitást mutat (26-ból 24) a vizsgálati körülmények között, 50 mM CaCl2 hozzáadásával. 50 mM CaCl2 hozzáadása nélküli vizsgálati körülmények között a változatok nagy többsége (26-ból 19) szignifikánsan stabilabb, mint a Bacillus lentus szubtilizin. Továbbá az N76D/S99D; N76D/V104I; N76D/S99D/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/ /V104Y/I107V és N76D/S101R/S103A/V104I változatok szignifikánsan stabilabbak, mint az egyszeresen helyettesített N76D változat, 50 mM CaCl2 hozzáadása nélküli vizsgálati körülmények között.
HU 219 851 Β
4. táblázat
A Bacillus lentus szubtilizinben és változataiban mért kinetikai paraméterek (pH 10, 60 °C, +/-50 mM CaCl2 hozzáadásával)
Enzim Maradék %-os kezdeti aktivitás
-CaCl2 +CaCl2
B. lentus szubtilizin 2 96
N76D 34 97
N76D/S99D 49 98
N76D/S101R 0 82
N76D/S103A 26 92
N76D/V104I 58 98
N76D/I107V 32 96
N76D/N123S 0 97
N76D/S99D/S101R 30 100
N76D/S99D/S103A 36 100
N76D/S99D/V104I 48 97
N76D/S101R/S103A 26 100
N76D/S101R/V104I 38 100
N76D/S103A/V104I 58 100
N76D/V104I/I107V 60 97
N76D/V104Y/I107V 48 74
N76D/V104I/N123S 0 98
N76D/I107V/N123S 16 100
N76D/S99D/S101R/S103A 38 100
N76D/S99D/S101R/V104I 33 100
N76D/S99D/S103A/V104I 38 98
N76D/S101R/S103A/V104I 40 99
N76D/S103A/V104I/N123S 1 98
N76D/V104I/I107V/N123S 3 99
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 36 99
N76D/S99D/S103 A/V104I/N123 S 2 95
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 0 100
Oligonukleotid-irányított mutagenezis fágmidból 45 létrehozott egyszálú DNS-templáttal A) B. len tus változatok összeállítása
A mutagenezis menete lényegében ugyanaz, mint ahogyan fent leírtuk az Oligonukleotid-irányított mutagenezis című fejezetben. Az egyszálú DNS-templátot 50 fágmidmódszerrel hozzuk létre. A fágmidvektor összeállítására az egyszálú DNS-templát létrehozásához, mi először a pBCDAICAT vektort állítjuk össze. A vektor megszerkesztésének folyamatábráját a 8. ábrán mutatjuk be. Először a pC194 plazmidból származó, a CAT gént meghatározó Clal-től Clal-ig terjedő fragmentumot [Horinouchi S. és Weisblum B., J. Bacteriol. 150, 8-15 (1982)] klónozzuk a pUC19 (New England BioLabs, Beverly, MA) polilinker régiójának AccI helyére a pUCCHL plazmid elkészítéséhez, és a GG36DAI kó- 60 doló DNS 5’-végéből való EcoRI-Dral 0,6 kb fragmentumot klónozzuk a pBC2SK plazmid (Stratagene, Inc., San Diego, CA) EcoRI és EcoRV helyeire a pBC2SK-5 plazmid elkészítéséhez. A pBC2SK-5 plazmid egyedüli EcoRI helyét EcoRI emésztéssel távolítjuk el, amelyet T4 DNS-polimerázzal katalizált feltöltés követ és religáció a pBC2SK-5R plazmid létrehozására, amely nem tartalmazza az EcoRI helyet. A pBC2SK-5R-be klónozott EcoRI-Dral fragmentumot Pstl-HindlII fragmentumként izoláljuk, és klónozzuk a pUCCHL (a pUC19 polilinkerének egy részébe) Pstl-HindlII helyére, hogy létrehozzuk a pUCCHL5R plazmidot. A GG36DAI gén kódolószekvenciáját EcoRI-BamHI fragmentumként kivágjuk és klónozzuk a pUCCHL5R plazmid EcoRI-BamHI helyére a pUCCAT elkészítése céljából. A pUCCAT hatalmas EcoRI-HindlII fragmentumát ez12
HU 219 851 Β után a pBS2KS+ EcoRI és Hindin helyei közé klónozzuk, hogy létrehozzuk a pBCDAICAT plazmidot.
Egyszálú DNS létrehozása céljából pBCDAICAT plazmidot tartalmazó E. colit fertőzünk R408 fággal (Stratagene-től beszerezve) Russel és munkatársai leírása [Russel M., Kidd S. és Kelley M. R., Gene 45, 333-338 (1986)] szerint. Amint az egyszálú DNS-templát rendelkezésre áll, standard mutagenezis módszereket hajtunk végre, ahogyan azt fent az Oligonukleotidirányított mutagenezis című fejezetben leírtuk. Bizonyos mutánsok szerkezetét részletezzük az alábbiakban szemléltetés céljából.
A B. lentus (GG36)N76D/S103A/V104I/L217H előállításához egy GG36 N76D/S103A/V104I összeállítást kódoló EcoRI-BamHI DNS-ífagmentumot használunk fel a pUCCAT megszerkesztéséhez (lásd a 8. ábrát), hogy létrehozzuk a pBCDAICAT plazmidot. Miután az egyszálú DNS-templátot elkészítettük a fenti leírás szerint, a következő szekvenciával rendelkező mutagenezis prímért használjuk az L217H előállításához:
* *** **x Clal
5’ TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT 3’ (13. számú szekvenciavázlat). Ahogy az előzőekben, az aláhúzott maradékok jelzik az elvégzett nukleotidváltoztatásokat és az x Clal azt jelzi, hogy a meglévő Clal hely eltűnt a mutagenezis után. A mutagenezis menete ugyanaz, ahogyan azt fent az Oligonukleotid-irányította mutagenezis című fejezetben leírtuk. A mutagenezis után a plazmid-DNS-t először a Clal hely eltűnésére screeneljük, és a Clal helyet nem tartalmazó kiónokat DNS-szekvenciaanalízisnek vetjük alá, hogy megvizsgáljuk, melyik DNS-szekvencia változtatta H-ra az L-t a 217. aminosavmaradéknál.
Β) BPN’-változatok összeállítása és kifejezésük B. subtilisben
A B. amyloliquefaciens (BPN’)N76D/Q103A/ /Y104I/Y217L összeállítását hasonló módon végezzük, két egymást követő lépés kivételével. Először N76D-t visszük be BPN’Y217L-be BPN’N76D/Y217L előállítására, és egy második mutagenezis során a BPN’N76D/ /Y217L-1 alakítjuk át BPN’N76D/Q103A/Y104I/ /Y217L-lé. Az egyszálú DNS-templát létrehozására az első mutagenezishez, BPN’Y217L szubtilizint kódoló EcoRI-BamHI fragmentumot (az Y217L plazmidból származik) [Wells J. et al., PNAS 84, 5167 (1987)] használunk fel a pUCCATFNA összeállítására (lásd a 9. ábrát). A BPN’Y217L-t tartalmazó pUCCATFNA plazmidot a pBCFNACAT plazmid (9. ábra) megszerkesztésére használjuk fel. Egyszálú DNS-t hozunk létre, ahogyan azt fent leírtuk. BPN’N76D/Y217L előállítására a következő szekvenciával rendelkező oligonukleotid prímért használjuk az N76D változtatás elvégzéséhez:
* *** **xbai
5’ C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3’ (14. számú szekvenciavázlat). Az egyszálú DNS-t azután a BPN’N76D/Y217L-t tartalmazó pBCFNACAT plazmidból (a pBCFNACAT plazmid az N76D mutagenezis után) készítjük el és egy másik, a következő szekvenciával rendelkező oligonukleotiddal végzünk mutagenezist:
* *** **xPvuII
5’ GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT 3’ (15. számú szekvenciavázlat), hogy BPN’N76D/Q103A/Y104I/Y217L-t kapjunk. A klónozásba beletartozó minden lépést, az egyszálú DNS elkészítését, a mutagenezist és a mutánsok screenelését a fentiekben leírtak szerint végezzük. A BPN’ génnek és változatainak kifejezését a plazmid DNS-nek (különböző BPN’ génváltozatokat tartalmazó pBCFNACATnak) közvetlenül a Bacillus subtilis egy proteázhiányos törzsébe történő beépítésével érjük el, a 4,760,025 (RE 34,606) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint.
Számos változatot készítünk e proteáz-előállítási példák tanítása szerint. Kinetikai és stabilitási adatokat határozunk meg az ilyen változatokra. A kinetikai adatokat az előbbiekben leírt módszerek felhasználásával határozzuk meg, és az 5. táblázatban adjuk közre. A stabilitási adatokat a következőkben részletezettek szerint kapjuk. Az eredményeket a 6. táblázatban mutatjuk be.
Eljárás a hőstabilitás meghatározására
A tisztított enzimet puffercserére visszük 0,1 M glicint, pH 10,0 és 0,01% Tween-80-at tartalmazó pufferrel. Az enzimet a nevezett pufferrel ekvilibrált Sephadex G-25 oszlopra visszük fel, majd ugyanennek a puffemek az alkalmazásával eluáljuk az enzimet az oszlopról.
0,1 M glicint és 0,01% Tween-80-at (pH 10,0) tartalmazó, 60 °C-on termosztált csőbe visszük a puffercserélt enzimet oly módon, hogy 15 pg/ml végső enzimkoncentrációt kapjunk.
A 60 °C-os termosztálásból különböző időpontokban kis részleteket kiveszünk és azonnal meghatározzuk az enzimaktivitást, a mintát 1,2 mM szukcinil-LAla-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitro-anilid szintetikus peptidszubsztrátot 0,1 M Tris-HCl-pufferben (pH 8,6) feloldva tartalmazó 1 cm3-es küvettához adva, és 25 °C-on termosztálva. A kezdeti lineáris reakciósebességet spektrofotometriásán követjük a p-nitro-anilin reakciótermék abszorbanciájának nyomon követésével 410 nm-en az idő függvényében.
A felezési időt - azt az időtartamot, amely az enzim 50%-ának inaktiválásához szükséges - a 60 °C-os inkubáció időfüggvényében mért reakciósebesség elsőrendű görbéjéből határozzuk meg.
Az adatokat a 6. táblázatban mutatjuk be a Bacillus lentus szubtilizinhez (GG36) képest a felezési idő %-ában, azonos körülmények között meghatározva.
HU 219 851 Β
5. táblázat
Enzim Kca.(s-') Kca/KnU-'M-')
B. lentus szubtilizin 170 0,78 2,20E+05
N76D/S103G/V104I* 380 1,4 2,70E+05
N76D/S103A/V104F 730 0,33 2.20E+06
N76D/S103A/V104N 790 2,8 2.80E+05
N76D/S103A/V104S 170 0,83 2,00E+05
N76D/S103A/V104T 370 1,9 2,00E+05
N76D/S103A/V104W 880 0,31 2,80E+06
N76D/S103A/V104Y 690 0,5 l,40E+06
K27R/N76D/V104Y/N123S 500 1,2 4,20E+05
N76D/SI0IG/S103A/VI04I* 620 1,3 4,80E+05
N76D/S103A/V104I/S105A* 550 1,3 4,20E+05
N76D/S103A/V104I/S105D* 440 1,7 2.60E+05
N76D/S103A/V104T/I107A* 120 5,7 2,10E+04
N76D/S103A/V104T/I107L* 310 3,2 9,70E+04
N76D/S103A/V104I/L126A 90 2,2 4,10E+04
N76D/S103 A/V104I/L126F 180 1,9 9,50E+04
N76D/S103 A/V 104I/L1261 100 2,4 4,20E+04
N76D/S103 A/V 104I/L126V 64 3,2 2,00E+04
N76D/S103A/V104I/S128G* 560 1,7 3,30E+05
N76D/S103A/V104I/S128L* 430 3,8 Ι,ΙΟΕ+05
N76D/S103A/V104I/L135A 140 0,76 l,80E+05
N76D/S103A/V104I/L135F 390 0,69 5,70E+05
N76D/S103A/V104I/L135I 110 0,73 l,50E+05
N76D/S103A/V104I/L135V 140 0,86 1.60E+05
N76D/S103A/V104VS156E* 170 2,6 6.50E+04
N76D/S103A/V104I/S166D* 160 3,5 4,60E+04
N76D/S103 A/V 104I/D197E 510 1,4 3,60E+05
N76D/S103A/V104I/N204A* 530 1,1 4,80E+05
N76D/S103A/V104I/N204G* 580 1,4 4,10E+05
N76D/S103A/V104I/N204C* 370 1,3 2.90E+05
N76D/S103 A/V 104I/P2101 * 500 1,2 4,20E+05
N76D/S103A/V104I/L217H* 80 0,63 1,3OE+O5
N76D/S103 A/V 104I/M222A 70 3,1 2,30E+04
N76D/S103A/V1041/M222S 80 3,1 2,60E+04
N76D/S103A/V104I/T260P 660 1,5 4,40E+05
N76D/S103A/V104I/S265N 590 1,3 4,50E+05
K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 220 1,4 1.60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123 S/D197E 430 1,1 3,9OE+O5
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 400 1,1 3.60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L 440 1,2 3,70E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 440 1,2 3.7OE+O5
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S 760 0,98 7,80E+05
K27R/N76D/V104Y/N123 S/T260P 410 1,2 3,40E+05
K27R/N76D/V104Y/N123 S/T274A 390 1 3,90E+05
HU 219 851 Β
5. táblázat (folytatás)
Enzim Kc.,(s-') Km(mM)
N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 170 2,1 8,10E+04
N76D/S103A/V104I/S156E/S166D* 40 6,3 6,40E+03
K27R/N76D/V104Y/N123 S/G195E/G197E 410 0,98 4.20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 540 0,66 8,20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 770 0,79 9,80E+05
K27R/N76D/V104Y/N123 S/N204C/N218S 610 0,99 6,20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 580 0,78 7,40E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 660 1 6,60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A 590 0,89 6.60E+05
K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274A 520 1 5.20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S 460 0,65 7,10E+05
B. amyloliquefaciens szubtilizin (BPN’) 50 0,14 3,60E+05
BPN’-N76D/Y217L* 380 0,46 8,30E+05
* Ezek a mutánsok a fágmidból létrehozott egyszálú DNS-templáttal történő oligonukleotid-irányította mutagenezissel készülnek, az összes többi az előbbiekben leírt oligonukleotid-irányította mutagenezissel.
6. táblázat
Enzim Hőstabilitás (a natív enzim felezési idejének %-ában)
B. lentus szubtilizin 100
N76D 590
N76D/S99D 840
N76D/S103A 390
N76D/V104I 660
N76D/I107V 710
N76D/N123S 70
N76D/S99D/S101R 610
N76D/S99D/S103A 590
N76D/S99D/V104I 910
N76D/S101R/S103A 930
N76D/S101R/V104I 500
N76D/S103A/V104I 460
N76D/S103G/V104I* 370
N76D/S103A/V104F 480
N76D/S103A/V104N 230
N76D/S103A/V104S 230
N76D/S103A/V104T 370
N76D/S103A/V104W 280
N76D/S103A/V104Y 400
N76D/V104I/1107V 940
N76D/V104Y/I107V 820
N76D/V104I/N123S 80
N76D/I107V/N123S 150
Enzim Hőstabilitás (a natív enzim felezési idejének %-ában)
K27R/N76D/V104Y/N123S 100
N76D/S99D/S101R/S103 A 570
N76D/S99D/S101R/V104I 1000
N76D/S99D/S103A/V104I 680
N76D/S101 G/S 103 A/V1041* 390
N76D/S101R/S103A/V104I 470
N76D/S103A/V104I/S105A* 360
N76D/S103A/V104I/S105D* 370
N76D/S103A/V104T/I107A* 270
N76D/S103 A/V104T/1107L* 230
N76D/S103A/V104I/N123S 110
N76D/V104I/I107V/N123S 220
N76D/S103A/V104I/L126A 270
N76D/S103A/V104I/L126F 950
N76D/S103A/V104I/L126I 410
N76D/S103A/V104I/L126V 320
N76D/S103A/V104I/S128G* 640
N76D/S103A/V104I/S128L* 760
N76D/S103A/V104I/L135A 230
N76D/S103A/V104I/L135F 200
N76D/S103 A/V 104I/L1351 510
N76D/S103 A/Vl 04I/L135 V 500
N76D/S103 A/Vl 04I/S156E* 120
N76D/S103 A/Vl 04I/S166D* 590
N76D/S103A/V104I/D197E 460
HU 219 851 Β
6. táblázat (folytatás)
Enzim Hőstabilitás (a natív enzim felezési idejének %-ában)
N76D/S103A/V104I/N204A* 230
N76D/S103A/V104I/N204G* 240
N76D/S103A/V104I/N204C* 500
N76D/S103A/V104I/P210I* 1370
N76D/S103 A/Vl 04I/L217H* 60
N76D/S103A/V104I/M222A 520
N76D/S103A/V104I/M222S 490
N76D/S103 A/Vl 04I/T260P 490
N76D/S103A/V104I/S265N 360
K27R/N76D/V104Y/I107V/ /N123S 210
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /D197E 120
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /N204C 110
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /Q206L 380
K27R/N76D/V104 Y/N123S/ /S216V 140
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /N218S 270
K27R/N76D/V104Y/N123 S/ /T260P 40
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /T274A 60
N76D/S99D/S101R/S103A/ /V104I 590
N76D/S99D/S103A/V104I/ /N123S 110
N76D/S103 A/V104I/L126F/ /S265N 810
N76D/S103A/V104I/S156E/ /S166D* 220
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /G195E/G197E 90
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /G195E/N218S 250
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /D197E/N218S 270
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /N204C/N218S 460
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /Q206L/N218S 1400
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /N218S/T260P 310
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /N218S/T274A 180
N76D/S99D/S101R/S103 A/ /V104I/N123S 90
Enzim Hőstabilitás (a natív enzim felezési idejének %-ában)
K27R/N76D/V104Y/Q109S/ /N123S/N218S/T274A 230
K27R/N76D/V104Y/N123S/ /G195E/D197E/N218S 240
B. amyloliquefaciens szubtilizin (BPN’) 100
BPN’-N76D/Y217L* 420
* Ezek a mutánsok a fágmidból létrehozott egyszálú DNS-templáttal történő oligonukleotid-irányította mutagenezissel készülnek, az összes többi az előbbiekben leírt oligonukleotid-irányította mutagenezissel.
Tisztítókészítmények anyagai
A találmány szerinti tisztítókészítmények az előbbiekben leírt proteázenzimeken kívül egy vagy több, a proteázenzimmel összeegyeztethető tisztítószert is tartalmaznak. A „tisztítókészítmények anyagai” kifejezés ahogyan itt használjuk, bármilyen - a kívánt tisztítókészítmény típusa számára kiválasztott - folyékony, szilárd vagy gáznemű anyagot jelent, és a termék formája (például folyadék; granulátum; spray-készítmény) attól függ, hogy melyek azok az anyagok, amelyek a készítményben használt proteázenzimmel is összeegyeztethetők. A tisztítókészítmények anyagainak specifikus kiválasztása gyorsan megy a tisztítandó dolog vagy szövet felszínének és a készítménynek a használat közbeni tisztítási körülményekhez megkívánt formája (például detergens használata a mosás során) figyelembevételével. Az „összeegyeztethető” kifejezés ahogyan itt használjuk, a tisztitókészítmények olyan anyagait jelenti, amelyek a proteázenzim proteolitikus aktivitását nem csökkentik olyan mértékben, hogy a proteáz ne legyen a kívánt mértékben hatásos normál felhasználásoknál. Specifikus tisztítókészítmény-anyagokat részleteiben szemléltetünk az alábbiakban.
Egy vagy több fent leírt proteázenzim hatásos mennyiségét tartalmazzák fehérje eredetű folt eltávolítását igénylő, különböző felületek tisztítására használható készítmények. Az ilyen tisztítókészítmények tartalmaznak detergens készítményeket kemény felületek tisztítására, alaki korlátozás nélkül (például folyékony és granulált); detergens készítményeket szövetek tisztítására, alaki korlátozás nélkül (például granulált, folyékony és darabos formában); edénymosogató készítményeket (alaki korlátozás nélkül); szájápolási készítményeket, alaki korlátozás nélkül (például fogpor, fogpaszta és szájöblítő formulák); és fogsortisztító készítményeket, alaki korlátozás nélkül (például folyadék, tabletta). Ahogyan itt használjuk, a „proteázenzim hatékony mennyisége” az előbbiekben leírt proteázenzim olyan mennyiségére utal, amely a specifikus tisztítókészítményben a szükséges enzimaktivitás eléréséhez elengedhetetlen. Az ilyen hatásos mennyiségeket gyorsan megállapítja aki a szakterületen jártas, és ez sok összetevőn alapul, úgymint az egyes felhasznált enzimváltozaton, a tisztítási alkalmazáson, a tisztítókészítmény specifikus készít16
HU 219 851 Β menyén és vagy egy folyékony vagy száraz (például granulált, darabos) készítményen és hasonlókon.
A találmány szerinti tisztítókészítmények előnyösen 0,0001-10% egy vagy több proteázenzimet, előnyösebben 0,001-1%-ot, még előnyösebben 0,001-0,1%-ot tartalmaznak. Néhány példát különböző tisztítókészítményekre, amelyekben proteázenzimeket alkalmazhatunk, további részletekben kifejtünk az alábbiakban. Minden itt használt rész, százalék és arány tömegre vonatkozik, ha más kikötés nincs.
A „nem szövettisztító készítmények” kemény felületet tisztító készítményeket, edénymosogató készítményeket, szájápolási készítményeket, fogsortisztító készítményeket és személyi tisztítókészítményeket foglalnak magukban.
A) Tisztítókészítmények szilárd felületekhez, edényekhez és szövetekhez
A proteázenzimek felhasználhatók bármilyen detergens készítményben, amelyben erős szappanhabzás és/vagy jó oldhatatlanszubsztrát-eltávolítás szükséges. Tehát a proteázenzimek használhatók különböző hagyományos alkotórészekkel teljes mértékben formázott szilárd felületi tisztítókat, edénymosogató készítményeket, szövetmosó készítményeket és hasonlókat szolgáltatva. Az ilyen készítmények lehetnek folyadék, granulátum, darabos és hasonló formában. Az ilyen készítmények készülhetnek modem „koncentrált” detergensekként, amelyek 30-60% felületaktív anyagot tartalmaznak.
Az itt leírt tisztítókészítmények adott esetben és előnyösen tartalmazhatnak különböző anionos, nemionos, ikerionos stb. felületaktív anyagokat. Az ilyen felületaktív anyagok jellemzően jelen vannak körülbelül 0,l%tól körülbelül 60%-os szintig, előnyösen 1-35% a készítményekben.
Az itt használható felületaktív anyagok példáit nem korlátozva beletartoznak a hagyományos Cn-C18-alkil-benzolszulfonátok és primer vagy véletlenszerű alkil-szulfátok, a C10-C18 szekunder 2,3-alkil-szulfátok a következő képletek szerint:
CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3 és
CH3(CH2)y(CHOSO3)-M+)CH2CH3, ahol x és (y+1) legalább 7, legalább 9 egész számok, és M egy vízoldható kation, főleg nátrium, a C10-Cl8-alkil-alkoxi-szulfátok (különösen az EO 1-7 etoxi-szulfátok), a C10-Ci8-alkilalkoxi-karboxilátok (különösen az EO 1-7 etoxi-karboxilátok), a C10-CI8-alkil-poliglikozidok és ezek megfelelő szulfátéit poliglikozidjai, Cj2-C18-alfa-szulfonált zsírsav-észterek, C12-C18-alkil- és alkil-fenol-alkoxilátok (különösen etoxilátok és kevert etoxi/propoxi), C12-C18 betainok és szulfobetainok („szultainok”), C10-C18amin-oxidok, C8-C24-szarkozinátok (különösen oleoszarkozinátok) és hasonlók. Itt az alkil-alkoxi-szulfátokat (AES) és az alkil-alkoxi-karboxilátokat (AEC) részesítjük előnyben. (Az ilyen felületaktív anyagoknak a felhasználását az előbbiekben említett amin-oxidokkal és/vagy bétáin vagy szultain felületaktív anyagokkal kombináltan szintén előnyben részesítjük, a készítő kívánságaitól függően.) Egyéb hagyományos használható felületaktív anyagokat sorolunk fel a standard szövegben. Különösen hasznos felületaktív anyagok közé tartoznak a C10-C18-N-metil-glükamidok, amelyeket Connor és munkatársai tettek közzé 1993. március 16-án az 5,194,639 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyet referenciaként itt beépítettünk.
Különösen hasznos a nemionos felületaktív anyagok osztálya, amelyek etilén-oxidnak egy hidrofób résszel való kondenzátornál, olyan felületaktív anyagot szolgáltatnak, amelynek átlagos hidrofil-lipofil egyensúlya (hydrophilic-lipophilic balance=HLB) 5-17-ig terjed, előnyösen 6-14, előnyösebben 7-12. A hidrofób (lipofil) rész lehet alifás vagy aromás természetű és a poli(oxi-etilén)-csoport hossza - amely valamilyen különleges hidrofób csoporttal kondenzált - könnyen beállítható ahhoz, hogy a hidrofil és hidrofób elemek között a kívánt fokú egyensúllyal rendelkező vízoldható vegyületet kapjunk. Különösen előnyben részesítjük az alkoholmolekulánként 3-8 mól etilén-oxidot tartalmazó C9—C15 elsőrendű alkohol-etoxilátokat (vagy kevert etoxi/propoxi vegyületeket), különösen az alkoholmolekulánként 6-8 mól etilén-oxidot tartalmazó C14-C15 elsőrendű alkoholokat, az alkoholmolekulánként 3-5 mól etilén-oxidot tartalmazó C12-C15 elsőrendű alkoholokat és ezek keverékeit.
Detergens tisztítókészítményekben használható egyéb alkotórészek széles választékát tartalmazhatják az itteni készítmények, beleértve más aktív alkotórészeket, hordozókat, hidrotropokat, gyártási segédanyagokat, festékeket vagy pigmenteket, oldószereket a folyékony kiszerelésekhez stb. Ha további szappanhabzás-növelésre van szükség, szappanhab-erősítőket, úgymint C10-C16alkilamidokat vihetünk be a készítményekbe, jellemzően körülbelül 1%-tól 10%-os szintig. A CI0-C14-monoetanol- és dietanolamidok képviselik az ilyen szappanhab-erősítők egy jellegzetes osztályát. Az ilyen szappanhab-erősítők alkalmazása magas szappanhabzású, járulék felületaktív anyagokkal, úgymint a fent említett amin-oxidokkal, betainokkal és szultainokkal, szintén kedvező. Ha szükséges, oldható magnéziumsókat, úgymint MgCl2-ot, MgSO4-ot és hasonlókat adhatunk, jellemzően körülbelül 0,1%-tól körülbelül 2%-os szintig további szappanhabzás biztosítására.
Az itteni folyékony detergens készítmények tartalmazhatnak vizet vagy más oldószereket és hordozókat. Használhatók kis molekulatömegű első- vagy másodrendű alkoholok, melyeket metanollal, etanollal, propanollal és izopropanollal példázunk. Egyértékű alkoholokat előnyben részesítünk felületaktív anyagok oldására, de olyan poliolokat, amelyek 2-6 szénatomot és 2-6 hidroxilcsoportot tartalmaznak (például 1,3-propándiol, etilénglikol, glicerin és 1,2-propándiol) szintén felhasználhatunk. A készítmények tartalmazhatnak 5-90%-ban, jellegzetesen 10-50%-ban ilyen hordozókat.
Az itteni detergens készítményeket előnyösen úgy formázzuk, hogy vizes tisztítási műveleteknél történő felhasználás során a mosóvíz pH-ja 6,8-11,0 közé esik. Az elkészült termékek tehát jellegzetesen ebben a tartományban formázottak. A pH ellenőrzésének technikái az ajánlott felhasználási szinteknél magukban foglalják pufferek, lúgok, savak stb. felhasználását és a szakember számára jól ismertek.
HU 219 851 Β
A találmány szerinti kemény felületeket tisztító készítmények és szövettisztító készítmények előállításakor a készítő megkívánhatja különböző mosószerépítők alkalmazását körülbelül 5%-tól körülbelül 50%-ig. A jellemző mosószerépítők felölelik az 1-10 pm zeolitokat, polikarboxilátokat, úgymint citrátot és oxidiszukcinátokat, rétegelt szilikátokat, foszfátokat és hasonlókat. Egyéb szokásos mosószerépítőket a standard formuláknál sorolunk fel.
Ehhez hasonlóan a készítő megkívánhatja különböző további enzimek alkalmazását, úgymint cellulázokat, lipázokat, amilázokat, peroxidázokat és proteázokat az ilyen készítményekben, jellemzően 0,001-1% mennyiségben. Különböző védő- és szövetkímélő enzimek jól ismertek a mosodai detergens szakmában.
Különböző fehérítővegyületek, úgymint perkarbonátok, perborátok és hasonlók felhasználhatók ilyen készítményekben, jellegzetesen 1-15% mennyiségben. Ha kívánatos, az ilyen készítmények tartalmazhatnak fehérítőaktivátorokat is, úgymint tetraacetil-etilén-diamint, nonanoiloxi-benzolszulfonátot és hasonlókat, amelyek szintén ismertek a szakmában. Az alkalmazási mennyiségek körülbelül 1%-tól körülbelül 10%-ig terjednek.
Különböző piszokeltávolító ágensek, különösen az anionos oligoészter-típusból, különböző kelátképző ágensek, különösen az amino-foszfonátok és etiléndiamin-diszukcinátok, különböző agyagos földet eltávolító ágensek, különösen etoxilált tetraetilén-pentamin, különböző diszpergálóágensek, különösen poliakrilátok és poliaszpartátok, különböző színélénkítők, különösen anionos színélénkítők, különböző festékterjedést gátló ágensek, úgymint poli(vinil-pirrolidon), különböző habzásgátlók, különösen szilikonok és másodrendű alkoholok, különböző szövetlágyítók, különösen smektit agyag és agyagflokkuláló polimerek [például poli(oxi-etilén)] és hasonlók mind felhasználhatók ilyen készítményekben 1%-tól 35%-ig terjedő mennyiségben. Standard formulák és közzétett szabadalmi leírások az ilyen hagyományos anyagok többszörösének részletes leírását tartalmazzák.
Enzimstabilizátorok szintén felhasználhatók a találmány szerinti tisztítókészítményekben. Az ilyen enzimstabilizátorok magukban foglalják a propilénglikolt (előnyösen 1-10%-ban), nátrium-formiátot (előnyösen 0,1-1%-ban), és kalcium-formiátot (előnyösen 0,1-1%-ban).
1. Kemény felületeket tisztító készítmények
Ahogyan itt használjuk, a „kemény felületeket tisztító készítmények” elnevezés kemény felületek, úgymint
1-6. példák
Kemény felületeket tisztító folyékony készítmények padlók, falak, fürdőszobacsempe és hasonlók tisztítására szolgáló folyékony és granulált detergens készítményekre utal. A találmány szerinti, kemény felületeket tisztító készítmények tartalmazzák egy vagy több proteázenzim hatásos mennyiségét, előnyösen 0,0001%-tól 10%-ig terjedő mennyiségben, előnyösebben 0,001-5%-ban, még előnyösebben 0,001 -1 %-ban a készítmény tömegszázalékában. Egy vagy több proteázenzim tartalmazásán felül az ilyen kemény felületeket tisztító készítmények jellegzetesen tartalmaznak felületaktív anyagot és vízoldható zárványképzőt. Bizonyos specializált termékekben, úgymint spray ablaktisztítókban azonban néha nem használunk felületaktív anyagot, mivel ezek film/csík maradványt hagyhatnak az üveg felületén.
A felületaktív komponens, ha jelen van, a készítménynek olyan kicsi, mint 0,1%-os részét foglalhatja el, de a készítmények jellemzően 0,25-10%, előnyösebben 1-5% felületaktív anyagot tartalmaznak.
A készítmények jellemzően 0,5-50% detergenst tartalmaznak, előnyösen 1-10%-ot. A pH-nak előnyösen a 8-12-ig terjedő tartományban kell lennie. Hagyományos pH-állító ágensek, úgymint nátrium-hidroxid, nátrium-karbonát vagy sósav használható, ha pH-állítás szükséges.
Oldószereket tartalmazhatnak a készítmények. A használható oldószerek közé tartoznak, bár körét nem korlátozzák, a glikol-éterek, úgymint dietilénglikol-monohexil-éter, dietilénglikol-monobutil-éter, etilénglikol-monobutil-éter, etilénglikol-monohexil-éter, propilénglikol-monobutil-éter, dipropilénglikol-monobutil-éter és diolok, úgymint 2,2,4-trimetil-l,3-pentándiol és 2-etil1,3-hexándiol. Amennyiben használjuk, az ilyen oldószerek jellemzően 0,5-15%-ban, előnyösen 3-11%-ban vannak jelen.
Ezenkívül erősen illékony oldószerek, úgymint izopropanol vagy etanol felhasználhatók a találmány szerinti készítményekben, elősegítendő a készítmény gyorsabb elpárolgását a felületekről, ha a felületet nem öblítjük le a készítmény „teljes erősségű” alkalmazása után. Ha alkalmazzuk, az illékony oldószerek jellemzően 2%-tól 12%-ig terjedő mennyiségben vannak jelen a készítményekben.
A találmánynak a kemény felületeket tisztító készítményre vonatkozó megvalósítási formáját szemléltetjük a következő, korlátozást nem jelentő példákkal. (A következő példákban a sorszámmal jelzett proteáz hivatkozás a találmány számára hasznos olyan készítményváltozatra vonatkozik, amely az előzőekben, 3. táblázatban megadott számmal rendelkezik.)
Összetevők Példa száma
1. 2. 3. 4. 5. 6.
12. proteáz 0,05 0,20 0,02 0,03 0,10 0,03
4. proteáz - - - - 0,20 0,02
EDTA** - - 2,90 2,90 - -
Na-citrát - - - - 2,90 2,90
HU 219 851 Β
Táblázat (folytatás)
Összetevők Példa száma
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Na-C12-alkil-benzolszulfonát 1,95 - 1,95 - 1,95 -
Na-C 12-alkil-szulfát - 2,20 - 2,20 2,20
Na-C12-etoxi***-szulfát - 2,20 - 2,20 - 2,20
C! 2-dimetil-amin-oxid - 0,50 - 0,50 - 0,50
Na-kumolszulfonát 1,30 - 1,30 - 1,30 -
Hexil-karbitol*** 6,30 6,30 6,30 6,30 6,30 6,30
Víz**** 100%-ra kiegészítve
** Na^-etilén-diamin-diacctát.
* * * Dietilénglikol-monohexil-éter.
**** Minden készítmény pH-ja 7-re állítva.
Az 1-4. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban 20 leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak.
Az 5. és 6. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt és 4. proteázt lényegében hasonló eredményeket ad.
7-12. példák
Kemény felületek tisztítására és háztartási penész eltávolítására szolgáló spray-készítmények
Összetevők Példa száma
7. 8. 9. 10. 11. 12.
12. proteáz 0,20 0,05 0,10 0,30 0,20 0,30
4. proteáz - - - - 0,30 0,10
Na-oktil-szulfát 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
Na-dodecil-szulfát 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
Na-hidroxid 0,80 0,80 0,80 0,80 0,80 0,80
Na-szilikát 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04
Parfüm 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35
Víz 100%-ra kiegészítve
A termék pH-ja körülbelül 7.
A 7-10. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak.
A 11. és 12. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt és 4. proteázt lényegében hasonló eredményeket ad.
2. Edénymosogató készítmények
A találmány egy másik kiviteli alakjában edénymosogató készítmények egy vagy több proteázenzimet tartalmaznak. Ahogyan itt használjuk, az „edénymosogató készítmény” edények tisztítására szolgáló készítmé45 nyék minden formájára utal, beleértve - de korlátozást nem jelentve - granulált és folyékony formákat. A találmánynak az edénymosogató készítmény kiviteli alakját szemléltetik a következő példák.
13-18. példák
Edénymosogató készítmény
Összetevők Példa száma
13. 14. 15. 16. 17. 18.
12. proteáz 0,05 0,50 0,02 0,40 0,10 0,03
4. proteáz - - - - 0,40 0,02
C12 - C14-N-metil-glükamid 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90
HU 219 851 Β
Táblázat (folytatás)
Összetevők Példa száma
13. 14. 15. 16. 17. 18.
C12-etoxi( 1 )-szulfát 12,00 12,00 12,00 12,00 12,00 12,00
2-metil-undekánsav 4,50 4,50 - 4,50 4,50 -
C,2-etoxi(2)-karboxilát 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50
C 12-alkohol-etoxilát(4) 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00
C,2-amin-oxid 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00
Na-kumolszulfonát 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
Etanol 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
Mg+ + (mint MgCl2) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Ca++ (mintCaCl2) 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40
Víz 100%-ra kiegészítve
A termék pH-ja körülbelül 7.
A 13-16. példákban a 3. táblázatban felsorolt
1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak.
A 17. és 18. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt és 4. proteázt lényegében hasonló eredmé25 nyékét ad.
19. példa
Granulált automata edénymosogató készítmény
Összetevők A B C
Citromsav 15,0 - -
Citrát 4,0 29,0 15,0
Akrilát/metakrilát kopolimer 6,0 - 6,0
Akrilsav/maleinsav kopolimer - 3,7 -
Szárazon adott karbonát 9,0 - 20,0
Alkálifém-szilikát 8,5 17,0 9,0
Paraffin - 0,5 -
Benzotriazol - 0,3 -
Termamyl 60T 1,5 1,5 1,0
12. proteáz (4,6% Prill) 1,6 1,6 1,6
Perkarbonát (AvO) 1,5 - -
Perborát-monohidrát - 0,3 1,5
Perborát-tetrahidrát - 0,9 -
T etraacetilén-diamin 3,8 4,4 -
Dietilén-triamin-pentametilén-foszfonsav (Mg-só) 0,13 0,13 0,13
Alkil-etoxi-szulfát (3 χ etoxilált) 3,0 - -
Alkil-etoxi-propoxi nemionos felületaktív anyag - 1,5 -
Habzásgátló 2,0 - -
Olin SLF18 nemionos felületaktív anyag - - 2,0
Szulfát 100%-ra kiegészítve
HU 219 851 Β
A 19A)-C) példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak. Szintén a 19A)-C) példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt lényegében hasonló eredményeket ad.
3. Szövettisztító készítmények
A találmány egy másik kiviteli alakjában szövettisztító készítmények egy vagy több proteázenzimet tartalmaznak. Ahogyan itt használjuk, a „szövettisztító készítmény” szövetek tisztítására szolgáló detergens készítmények minden formájára utal, beleértve - de korlátozást nem jelentve - granulált, folyékony és darabos formákat.
a) Granulált szövettisztító készítmények A találmány szerinti granulált szövettisztító készítmények egy vagy több proteázenzim hatásos mennyiségét tartalmazzák, előnyösen körülbelül 0,001 - 10%-ban, előnyösebben körülbelül 0,005-5%-ban, még előnyösebben körülbelül 0,01-1%-ban a készítmény aktív proteázenzimjének tömegszázalékában. Egy vagy több proteázenzimen kívül a granulált szövettisztító készítmények jellemzően tartalmaznak legalább egy felületaktív anyagot, egy vagy több mosószerépítőt és néhány esetben fehérítőágenst.
A találmánynak a granulált szövettisztító készítmény kiviteli alakját a következő példákkal szemléltetjük.
20-23. példák
Granulált szövettisztítókészítmények -| 5
Összetevők Példa száma
20. 21. 22. 23.
12. proteáz (4% Prill) 0,10 0,20 0,03 0,05
4. proteáz (4% Prill) - - 0,02 0,05
C13 lineáris alkil-benzolszulfonát 22,00 22,00 22,00 22,00
Foszfát (Na-tri-polifoszfátok) 23,00 23,00 23,00 23,00
Na-karbonát 23,00 23,00 23,00 23,00
Na-szilikát 14,00 14,00 14,00 14,00
Zeolit 8,20 8,20 8,20 8,20
Kelátképző (dietilén-triamin-pentaecetsav) 0,40 0,40 0,40 0,40
Na-szulfát 5,50 5,50 5,50 5,50
Víz 100%-ra kiegészítve
A 20-21. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak.
A 22. és 23. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt és 4. proteázt lényegében hasonló eredményeket ad.
24-27. példák
Granulált szövettisztító készítmények
Összetevők Példa száma
24. 25. 26. 27.
12. proteáz (4% Prill) 0,10 0,20 0,03 0,05
4. proteáz (4% Prill) - - 0,02 0,05
C12 lineáris alkil-benzolszulfonát 12,00 12,00 12,00 12,00
Zeolit A (1-10 pm) 26,00 26,00 26,00 26,00
2-Butil-oktánsav 4,00 4,00 4,00 4,00
C12-C14 szekunder 2,3-alkil-szulfát Na-sója 5,00 5,00 5,00 5,00
Na-citrát 5,00 5,00 5,00 5,00
Optikai élénkítő 0,10 0,10 0,10 0,10
Na-szulfát 17,00 17,00 17,00 17,00
Töltőanyagok, víz, egyéb alkotórészek 100%-ra kiegészítve
HU 219 851 Β
A 24. és 25. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak. 5
A 26. és 27. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt és 4. proteázt lényegében hasonló eredményeket ad.
28. és 29. példák
Granulált szövettisztító készítmények
Összetevők Példa száma
28. 29.
Lineáris alkil-benzolszulfonát 11,4 10,70
Faggyú-alkil-szulfát 1,80 2,40
Ci4-C15-alkil-szulfát 3,00 3,10
C14-C15-alkohol, 7 xetoxilált 4,00 4,00
Faggyú-alkohol, 11 xetoxilált 1,80 1,80
Diszpergálószer 0,07 0,1
Szilikon (folyékony) 0,80 0,80
Trinátrium-citrát 14,00 15,00
Citromsav 3,00 2,50
Zeolit 32,50 32,10
Maleinsav/akrilsav kopolimer 5,00 5,00
Dietilén-triamin-pentametilén-foszfonsav 1,00 0,20
12. proteáz (4% Prill) 0,30 0,30
Lipáz 0,36 0,40
Amiláz 0,30 0,30
Na-szilikát 2,00 2,50
Na-szulfát 3,50 5,20
Poli(vinil-pirrolidon) 0,30 0,50
Perborát 0,5 1
Fenolszulfonát 0,1 0,2
Peroxidáz 0,1 0,1
Kisebb alkotórészek 100%-ra kiegészítve
30. és 31. példák
Granulált szövettisztító készítmények
Összetevők Példa száma
30. 31.
Lineáris C12-alkil-benzolszulfonát Na-sója 6,5 8,0
Na-szulfát 15,0 18,0
Zeolit A 26,0 22,0
Na-nitrilo-triacetát 5,0 5,0
Poli(vinil-pirrolidon) 0,5 0,7
Tetraacetil-etilén-diamin 3,0 3,0
Bórsav 4,0 -
Perborát 0,5 1
Fenolszulfonát 0,1 0,2
12. proteáz (4% Prill) 0,4 0,4
Töltőanyagok (például szilikátok; karbonátok; parfümök; víz) 100-ra kiegészítve
HU 219 851 Β
32. példa
Kompakt granulált szövettisztító készítmény
Összetevők Tömegszázalék
Alkil-szulfát 8,0
Alkil-etoxi-szulfát 2,0
3 χ és 7 χ etoxilált C25- és C45-alkoholok keveréke 6,0
Poli(hidroxi-zsírsavamid) 2,5
Zeolit 17,0
Rétegelt szilikát/citrát 16,0
Karbonát 7,0
Maleinsav/akrilsav kopolimer 5,0
Piszkot kiengedő polimer 0,4
Karboxi-metil-cellulóz 0,4
Poli(4-vinil-piridin)-N-oxid 0,1
Vinil-imidazol/vinil-pirrolidon kopolimer 0,1
PEG 2000 0,2
12. proteáz (4% Prill) 0,5
Lipáz 0,2
Celluláz 0,2
Tetraacetil-etilén-diamin 6,0
Perkarbonát 22,0
Etilén-diamin-diszukcinát 0,3
Habzásgátló 3,5
Dinátrium-4,4’-bisz[(2-morfolino-4-anilino-sz-triazin-6-il)-amino]-sztilbén-2,2’- diszulfonát 0,25
4,4’-bisz(2-szulfosztiril)-bifenil-dinátriumsó 0,05
Víz, parfüm és kisebb alkotórészek 100%-ra kiegészítve
33. példa
Granulált szövettisztító készítmény
Összetevők Tömegszázalék
Lineáris alkil-benzolszulfonát 7,6
C16 ~ C18-alki 1-szulfát 1,3
7 χ etoxilált C14-C15-alkohol 4,0
Kókusz-alkil-dimetil-hidroxi-etil-ammónium-klorid 1,4
Diszpergálószer 0,07
Szilikon (folyékony) 0,8
Trinátrium-citrát 5,0
Zeolit 4A 15,0
Maleinsav/akrilsav kopolimer 4,0
HU 219 851 Β
Táblázat (folytatás)
Összetevők Tömegszázalék
Dietilén-triamin-pentametilén-foszfonsav 0,4
Perborát 15,0
Tetraacetil-etilén-diamin 5,0
Smektitagyag 10,0
Poli(oxi-etilén) (M, 300 000) 0,3
12. proteáz (4% Prill) 0,4
Lipáz 0,2
Amiláz 0,3
Celluláz 0,2
Na-szilikát 3,0
Na-karbonát 10,0
Karboxi-metil-cellulóz 0,2
Színélénkítők 0,2
Víz, parfüm és kisebb alkotórészek 100%-ra kiegészítve
34. példa
Granulált szövettisztító készítmény
Összetevők Tömcgszázalck
Lineáris alkil-benzolszulfonát 6,92
F aggyú-alkil-szulfát 2,05
7xetoxilált C14-C)5-alkohol 4,4
3 χ etoxilált C12C15-alkil-etoxi-szulfát 0,16
Zeolit 20,2
Citrát 5,5
Karbonát 15,4
Szilikát 3,0
Maleinsav/akrilsav kopolimer 4,0
Karboxi-metil-celluláz 0,31
Piszkot kiengedő polimer 0,30
12. proteáz (4% Prill) 0,2
Lipáz 0,36
Celluláz 0,13
Perborát-tetrahidrát 11,64
Perborát-monohidrát 8,7
Tetraacetil-etilén-diamin 5,0
Dietilén-triamin-pentametilén-foszfonsav 0,38
Magnézium-szulfát 0,40
Színélénkítő 0,19
Parfüm, szilikon, habzásgátlók 0,85
Kisebb alkotórészek 100%-ra kiegészítve
HU 219 851 Β
A 28-34. példák mindegyikében a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak. 5 A 28-34. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt lényegében szintén hasonló eredményeket ad.
b) Folyékony szövettisztító készítmények
A találmány szerinti folyékony szövettisztítókészítmények egy vagy több proteázenzim hatásos mennyiségét tartalmazzák, előnyösen körülbelül 0,0001-10%ban, előnyösebben körülbelül 0,001-1%-ban, még előnyösebben körülbelül 0,001-0,1%-ban a készítmény aktív proteázenzimjének tömegszázalékában. Az ilyen folyékony szövettisztító készítmények ezenkívül jellemzően tartalmaznak még anionos felületaktív anyagot, zsírsavat, vízoldható detergens mosószerépítőt és vizet.
A találmánynak a folyékony szövettisztító készít10 mény kiviteli alakját a következő példákkal szemléltetjük.
35-39. példák
Folyékony szövettisztító készítmények
Összetevők Példa száma
35. 36. 37. 38. 39.
12. proteáz 0,05 0,03 0,30 0,03 0,10
4. proteáz - - - 0,01 0,20
Na-C 12 -C14-alkil-szulfát 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00
2-Butil-oktánsav 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00
Na-citrát 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
C10-alkohol-etoxilát (3) 13,00 13,00 13,00 13,00 13,00
Monoetanol-amin 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50
Víz/propilénglikol/etanol (100:1:1) 100%-ra kiegészítve
A 35-37. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve 35 lényegében hasonló eredményeket adnak.
A 38. és 39. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt és 4. proteázt lényegében hasonló eredményeket ad.
40-41. példák
Folyékony szövettisztító készítmények
Összetevők Példa száma
40. 41.
C12- 14-alkenil-borostyánkősav 3,0 8,0
Citromsav-monohidrát 10,0 15,0
Na-C12-C15-alkil-szulfát 8,0 8,0
2 χ etoxilált Ci2-C,5-alkohol, Na-szulfát - 3,0
7xetoxilált Cl2-C15-alkohol - 8,0
5 χ etoxilált C12-C15-alkohol 8,0 -
Dietilén-triamin-pentametilén-foszfonsav 0,2 -
Oleinsav 1,8 -
Etanol 4,0 4,0
Propándiol 2,0 2,0
12. proteáz 0,2 0,2
Poli(vinil-pirrolidon) 1,0 2,0
Habzásgátló 0,15 0,15
HU 219 851 Β
Táblázat (folytatás)
Összetevők Példa száma
40. 41.
NaOH pH 7,5-re
Perborát 0,5 1
Fenolszulfonát 0,1 0,2
Peroxidáz 0,4 0,1
Víz és kisebb alkotórészek 100%-ra kiegészítve
A 40. és 41. példák mindegyikében a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - 15 beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak.
A 40. és 41. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bár- 20 milyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt lényegében szintén hasonló eredményeket ad.
c) Darabos szövettisztítö készítmények A találmány szerinti - piszkos szövetek kézi mosására alkalmas - darabos szövettisztító készítmények egy vagy több proteázenzim hatásos mennyiségét tartalmazzák, előnyösen körülbelül 0,001-10%-ban, előnyösebben körülbelül 0,01-1%-ban a készítmény tömegszázalékában.
A találmánynak a darabos szövettisztító készítmény kiviteli alakját a következő példákkal szemléltetjük.
42-45. példák
Darabos szövettisztító készítmények 25
Összetevők Példa száma
42. 43. 44. 45.
12. proteáz 0,3 - 0,1 0,02
4. proteáz - - 0,4 0,03
Na-C, 2 - C j 6-alkil-szulfát 20,0 20,0 20,0 20,0
C12 - C14-N-metil-glükamid 5,0 5,0 5,0 5,0
Na-Cn-C13 alkil-benzolszulfonát 10,0 10,0 10,0 10,0
Na-karbonát 25,0 25,0 25,0 25,0
Na-pirofoszfát 7,0 7,0 7,0 7,0
Na-tri-polifoszfát 7,0 7,0 7,0 7,0
Zeolit A (1-10 pm) 5,0 5,0 5,0 5,0
Karboxi-metil-cellulóz 0,2 0,2 0,2 0,20
Poliakrilát (M, 1400) 0,2 0,2 0,2 0,20
Kókuszdió-monoetanolamid 5,0 5,0 5,0 5,0
Színélénkítő, parfüm 0,2 0,2 0,2 0,20
Ca-szulfát 1,0 1,0 1,0 1,0
Mg-szulfát 1,0 1,0 1,0 1,0
Víz 4,0 4,0 4,0 4,0
Töltőanyag* 100%-ra kiegészítve
* Olyan hagyományos anyagokból választható, mint Ca-karbonát, talkum, agyag, szilikátok és hasonlók.
A 42. és 43. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve 55 a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak.
A 44. és 45. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek 60 bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt és 4. proteázt lényegében hasonló eredményeket ad.
B) További tisztítókészitmények
A fentiekben tárgyalt kemény felületeket tisztító, edénymosogató és szövettisztító készítményeken kívül, egy vagy több proteázenzim bevihető más tisztítókészít26
HU 219 851 Β mények olyan változataiba, ahol oldhatatlan szubsztrát hidrolízise kívánatos. Az ilyen további tisztítókészítmények felölelnek - bár körét nem korlátozzák - szájápolási készítményeket, fogsortisztító készítményeket és kontaktlencse-tisztító készítményeket.
1. Szájápolási készítmények
A találmány egy másik kiviteli alakjában fehéijefoltoknak fogakról és fogsorokról történő eltávolítására alkalmas készítmények, egy vagy több proteázenzim gyógyászatilag elfogadható mennyiségét tartalmazzák. Ahogyan itt használjuk a „szájápolási készítmények” kifejezés fogtisztító szerekre, fogpasztákra, fogtisztító gélekre, fogporokra, szájvizekre, szájpermetekre, szájgélekre, rágógumikra, pasztillákra, illatszeres zacskókra, tablettákra, biogélekre, védőpasztákra, fogápolási oldatokra és hasonlókra utal. A találmány szerinti szájápolási készítmények előnyösen 0,0001-20%-ban, előnyösebben 0,001-10%-ban, még előnyösebben 0,01-5%ban tartalmaznak egy vagy több proteázenzimet a készítmény tömegszázalékában kifejezve, és gyógyászatilag elfogadható hordozót. Ahogyan itt használjuk a „gyögyászatilag elfogadható” azt jelenti, hogy azok a drogok, orvosságok vagy inért alkotórészek, amelyeket a kifejezéssel leírunk, alkalmasak emberi és állati szövetekkel érintkező felhasználásra túlzott toxicitás, öszszeférhetetlenség, instabilitás, irritáció, allergiás válasz és hasonlók kiváltása nélkül, ésszerű előny/kockázat arányhoz igazodva.
Jellemzően, a szájápolási készítmények szájtisztító komponenseinek gyögyászatilag elfogadható szájtisztító hordozókomponensei általában 50-99,99%-ot, előnyösen 65-99,99%-ot, még előnyösebben 65-99%-ot tesznek ki a készítmény tömegszázalékában.
A gyögyászatilag elfogadható hordozókomponensek és választható komponensek, amelyet a találmány szerinti szájápolási készítmények tartalmazhatnak, jól ismertek a szakmában járatosak számára. A szájápolási készítményekben használható készítménytípusok széles választékát, hordozókomponenseket és választható komponenseket tesznek közzé Seibel az 1992. március 17-én megadott 5,096,700 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, Sampathkumar az 1991. július 2-án megadott 5,028,414 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, Benedict, Bush és Sunberg az 1991. július 2-án megadott 5,028,415 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, melyeknek mindegyikét itt referenciaként tekintjük.
A találmánynak a szájápolási készítményre vonatkozó kiviteli alakját a következő példákkal szemléltetjük.
46-49. példák Fogtisztító szer készítmény
Összetevők Példa száma
46. 47. 48. 49.
12. proteáz 2,000 3,500 1,500 2,000
Szorbit (70%-os vizes oldat) 35,000 35,000 35,000 35,000
PEG-6* 1,000 1,000 1,000 1,000
Fogdörzsölő szilikagél** 20,000 20,000 20,000 20,000
Na-fluorid 0,243 0,243 0,243 0,243
Titán-dioxid 0,500 0,500 0,500 0,500
Na-szacharinát 0,286 0,286 0,286 0,286
Na-alkil-szulfát (27,9% vizes oldat) 4,000 4,000 4,000 4,000
Illatanyag 1,040 1,040 1,040 1,040
(Karboxi-vinil) polimer*** 0,300 0,300 0,300 0,300
Carrageen**** 0,800 0,800 0,800 0,800
Víz 100%-ra kiegészítve
* PEG-6=polictilcnglikol, M, 600.
** Precipitált SiO2 Zeodcnt 119-kcnt azonosította J. M. Huber.
*** Carbopol (B. F. Goodrich Chemical Company által ajánlott). **** lota Carrageenan (Hercules Chemical Company által ajánlott).
A 46-49. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak. A 46-49.
példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt lényegében szintén hasonló eredményeket ad.
HU 219 851 Β
50-53. példák Szájöblítő készítmény
Összetevők Példa száma
50. 51. 52. 53.
12. proteáz 3,00 7,50 1,00 5,00
SDA 40 alkohol 8,00 8,00 8,00 8,00
Illatanyag 0,08 0,08 0,08 0,08
Emulgeálószer 0,08 0,08 0,08 0,08
Na-fluorid 0,05 0,05 0,05 0,05
Glicerin 10,00 10,00 10,00 10,00
Édesítő 0,02 0,02 0,02 0,02
Benzoesav 0,05 0,05 0,05 0,05
Na-hidroxid 0,20 0,20 0,20 0,20
Festék 0,04 0,04 0,04 0,04
Víz 100%-ra kiegészítve
Az 50-53. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak. Az 50-53. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt lényegében szintén hasonló eredményeket ad.
54-57. példák Pasztillakészítmény
Összetevők Példa száma
54. 55. 56. 57.
12. proteáz 0,01 0,03 0,10 0,02
Szorbit 17,50 17,50 17,50 17,50
Mannit 17,50 17,50 17,50 17,50
Keményítő 13,60 13,60 13,60 13,60
Édesítő 1,20 1,20 1,20 1,20
Illatanyag 11,70 11,70 11,70 11,70
Színanyag 0,10 0,10 0,10 0,10
Keményítőszörp 100%-ra kiegészítve
Az 54-57. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak. Az 54-57. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt lényegében szintén hasonló eredményeket ad.
58-61. példák Rágógumi-készítmények
Összetevők Példa száma
58. 59. 60. 61.
12. proteáz 0,03 0,02 0,10 0,05
Kristályos szorbit 38,44 38,40 38,40 38,40
Paloja-T gumialap* 20,00 20,00 20,00 20,00
Szorbit (70%-os vizes oldat) 22,00 22,00 22,00 22,00
Mannit 10,00 10,00 10,00 10,00
Glicerin 7,56 7,56 7,56 7,56
Illatanyag 1,00 1,00 1,00 1,00
* L. A. Dreyfus Company által szállítva.
Az 58-61. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak. Az 58-61. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt lényegében szintén hasonló eredményeket ad.
2. Fogsortisztító készítmények
A találmány egy másik kiviteli alakjában a szájüregen kívüli fogsorok tisztítására szolgáló, fogsortisztítókészítmények egy vagy több proteázenzimet tartalmaznak. Az ilyen fogsortisztító készítmények egy vagy több proteázenzim hatásos mennyiségét, előnyösen 0,0001-50%-ot, előnyösebben 0,001-35%-ot, még előnyösebben 0,01-20%-ot a készítmény tömegszázalékában, és fogsortisztító hordozót tartalmaznak. Különböző fogsortisztítókészítmény-formák, úgymint habzó tabletták és hasonlók jól ismertek a szakmában (lásd például a Young-féle 5,055,305 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, amelyet beépítettünk ide referenciaként), és általában alkalmasak egy vagy több proteázenzim bevitelére fehéijefoltoknak a fogsorokról történő eltávolítása céljából.
A találmánynak a fogsortisztító készítményre vonatkozó kiviteli alakját a következő példákkal szemléltetjük.
62-65. példák
Kétrétegű habzó fogsortisztító tabletta
Összetevők Példa száma
62. 63. 64. 65.
Savas réteg
12. proteáz 1,0 1,5 0,01 0,05
Borkősav 24,0 24,0 24,00 24,00
HU 219 851 Β
Táblázat (folytatás)
Összetevők Példa száma
62. 63. 64. 65.
Na-karbonát 4,0 4,0 4,0 4,0
Szulfaminsav 10,0 10,0 10,0 10,0
PEG 20 000 4,0 4,0 4,0 4,0
Na-dikarbonát 24,5 24,5 24,5 24,5
Kálium- perszulfát 15,0 15,0 15,0 15,0
Na-pirofoszfát 7,0 7,0 7,0 7,0
Pirogén szilika 2,0 2,0 2,0 2,0
Tetraacetilén- diamin 7,0 7,0 7,0 7,0
Ricinoleil- szulfoszukcinát 0,5 0,5 0,5 0,5
Illatanyag 1,0 1,0 1,0 1,0
Alkalikus réteg
Na-perborát- monohidrát 32,0 32,0 32,0 32,0
Na-dikarbonát 19,0 19,0 19,0 19,0
EDTA 3,0 3,0 3,0 3,0
Na-tri- polifoszfát 12,0 12,0 12,0 12,0
PEG 20 000 2,0 2,0 2,0 2,0
Kálium- perszulfát 26,0 26,0 26,0 26,0
Na-karbonát 2,0 2,0 2,0 2,0
Pirogén szilika 2,0 2,0 2,0 2,0
Festék/illat- anyag 2,0 2,0 2,0 2,0
A 62-65. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a további, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak. A 62-65. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt lényegében szintén hasonló eredményeket ad.
3. Személyi tisztitókészítmények
A találmány egy másik kiviteli alakjában a bőr tisztítására szolgáló személyi tisztítókészítmények (folyadék vagy darabos formában) egy vagy több proteázenzimet tartalmaznak. Az ilyen készítmények jellemzően 0,001-5%, előnyösen 0,005-2%, és legelőnyösebben 0,01-0,8% proteázenzimet tartalmaznak a készítmény tömegszázalékában. Előnyben részesített személyi tisztítókészítményeket - amelyekbe beletartozhatnak az itt leírtak szerinti proteázenzimek - ismerünk meg a 08/121,623 és 08/121,624 sorozatszámú, 1993. szeptember 14-én benyújtott (mindkettő Visscher és munkatársaitól) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekből, amelyekben közzétetteket itt teljes egészében beépítettük referenciaként.
66. példa
Szappant tartalmazó folyékony személyi tisztítókészítmények
Összetevők Tömegszázalék
Szappan (K vagy Na) 15,00
30% laurát
30% mirisztát
25% palmitát
15% sztearát
Zsírsavak (fenti arányokban) 4,50
Na-lauril-szarkozinát 6,00
Na-laurát-3-szulfát 0,66
Kókusz-amido-propil-betain 1,33
Glicerin 15,00
Propilénglikol 9,00
Polikvatemium 10 0,80
Etilénglikol-disztearát (EDTA) 1,50
Propil-parabén 0,10
Metil-parabén 0,20
12. proteáz 0,10
KOH vagy NaOH ha szükséges pH-t állítani
Kalcium-szulfát 3
Ecetsav 3
Víz 100%-ra kiegészítve
67. példa
Darabos személyi tisztítókészítmény
Összetevők Tömegszázalék
Na-kokoil-izetionát 47,20
Na-cetaril-szulfát 9,14
Paraffin 9,05
Na-szappan (in situ) 3,67
Na-izetionát 5,51
Na-klorid 0,45
Titán-dioxid 0,4
EDTA-trinátrium sója 0,1
Trinátrium-etidronát 0,1
Parfüm 1,20
Na-szulfát 0,87
12. proteáz 0,10
Víz/kisebb alkotórészek 100%-ra kiegészítve
A 66-67. példákban a 3. táblázatban felsorolt 1-11. és 13-25. proteázok, többek között - beleértve a továb29
HU 219 851 Β bi, a találmány számára hasznos, az 5. és 6. táblázatban leírt proteázokat - a 12. proteázt helyettesítve lényegében hasonló eredményeket adnak. A 66-67. példákban a 3., 5. és 6. táblázatban felsorolt, a találmány számára hasznos proteázenzimek bármilyen kombinációja, többek között, helyettesítve a 12. proteázt lényegében szintén hasonló eredményeket ad.
68. példa
Mosásiteljesítmény-teszt
A találmány szerinti készítményekben használható változatok mosási teljesítményét EMPA 116 szövetmintákból (Testfabrics, Inc., Middlesex, NJ 07030) történő folteltávolítás (vér/tej/feketeszén pamuton) mérésével értékeljük.
Hat darab 3x4-1/2 inch méretűre vágott, átszűrt szélű EMPA 116 szövetmintát teszünk egy Model 7243S Terg-O-Tometer mindegyik edényébe, amelyek 1000 ml 15 gpg keménységű vizet (Ca2+:Mg2+=3:l tömegarányban), 7 g detergenst és megfelelő enzimet tartalmaznak. A detergens alap WFK1 detergens (a Testgewebe GmbH-tól, Adlerstrasse 42, Pf. 130762, D-47759 Krefeld, Germany):
Komponens A végső formula %-ában
Zeolit A 25
Na-szulfát 25
Szódahamu 10
Lineáris alkil-benzolszulfonát 8,8
Etoxilált alkohol (7-8 EO) 4,5
Na-szappan 3
Na-szilikát (SiO2:Na2O=3,3:1) 3
Ehhez a detergensbázishoz a következőket adjuk:
Komponens A végső formula %-ában
N a-perborát-monohidrát 13
Kopolimer (Sokalan CP5) 4
TAED (Mykon ATC Green) 3
Enzim 0,5
Színélénkítő (Tinopal AMS-GX) 0,2
Nátrium-perborát-monohidrátot a Degussa Corporationtől (Ridgefield-Park, NJ 07660), Sokalan CP5-öt a BASF Corporationtől (Parsippany, NJ 07054), Mykon ATC Greent (TAED=tetraacetil-etilén-diamin) a Warwick International Limitedtől (Mostyn, Holywell, Clwyd CH8 9HE, England), Tinopal AMS-GX-et a Ciba-Geigy Corporationtől (Greensboro, NC 27419) szereztünk be.
Hat EMPA 116 mintát mosunk enzimmel kiegészített mosószerben 30 percig 60 °C-on és mindjárt utána kétszer 5 percig öblítjük, mindkét esetben 1000 ml vízben. Enzimet adunk 0,05-tól 1 ppm végső koncentrációig a standard görbe felvételéhez és 0,25 ppm-et rutinanalízisekhez. A mintadarabokat megszárítjuk és préseljük, és a mintadarabokról történő visszaverődést méijük a Minolta Chroma Meter, CR-200 modelljének (Minolta Corp, Ramsey, NJ 07446) Láb scale változatán az L érték alkalmazásával. A teljesítményt a B. lentus (GG36) proteázteljesítményének százalékában adjuk meg, és oly módon számítjuk ki, hogy a B. lentus (GG36) proteáz mennyiségét elosztjuk a proteázváltozatnak azon mennyiségével, amely ugyanolyan folteltávolítási teljesítmény eléréséhez szükséges, és szorozzuk 100-zal. Az adatokat a 7. táblázatban mutatjuk be.
7. táblázat
Enzim Mosási teljesítmény
B. lentus szubtilizin 100
N76D 310
N76D/S103A 230
N76D/V104I 130
N76D/V107V 160
N76D/S99D/S101R 370
N76D/S99D/S103A 290
N76D/S101R/S103A 130
N76D/S101R/V104I 300
N76D/S103A/V104I 320
N76D/S103G/V104I 160
N76D/S103A/V104F 210
N76D/S103A/V104N 110
N76D/S103A/V104T 170
N76D/V104I/I107V 210
N76D/S99D/S101R/S103A 220
N76D/S99D/S101R/V104I 140
N76D/S101G/S103 A/V1041 170
N76D/S101R/S103A/V104I 150
N76D/S103A/V104I/S105A 170
N76D/S103 A/Vl 04T/I107A 120
N76D/S103A/V104T/I107L 110
N76D/S103A/V104I/L126F 110
N76D/S103 A/V 104I/S128G 280
N76D/S103A/V104I/L135I 160
N76D/S103A/V104I/L135V 160
N76D/S103A/V104I/D197E 170
N76D/S103 A/V104I/N204A 160
N76D/S103A/V104I/N204G 150
N76D/S103A/V104I/P210I 470
N76D/S103A/V104I/M222A 100
N76D/S103A/V104I/T260P 280
N76D/S103A/V104I/S265N 190
HU 219 851 Β
69. példa
Proteázstabilitás folyékony detergens formulában Összehasonlítást teszünk a Bacillus lentus szubtilizin és N76D/S103A/V104I enzimváltozatának proteázstabilitása inaktiválódásának irányában folyékony detergens formulában, az itt leírt eljárás szerint. A vizsgálatra bocsátott detergens készítmény egy üveg kereskedelemben beszerzett Tide Ultra folyékony mosószer, amelyet a Procter & Gamble Company gyárt az Egyesült Államokban.
A detergens készítmény hőkezelése szükséges az in situ 10 proteázok inaktiválására. Ezt a detergensnek 96 °C-on történő 4,5 órás inkubálásával végezzük. A B. lentus szubtilizin és az N76D/S103A/V104I változat koncentrált preparátumait - 20 g/1 enzim - adjuk a hőkezelt Tide Ultrához szobahőmérsékleten 0,3 g/1 végső en- 15 zimkoncentráció elérésére a detergens készítményben.
A hőkezelt detergenst a hozzáadott proteázzal azután 50 °C-on termosztált vízfürdőben inkubáljuk. 0, 24, 46, és 112 órás időközökben kis részleteket veszünk ki az inkubált csövekből és az enzimaktivitás meghatározására 20 a szubsztrátot 0,1 M Tris-HCl-pufferben (pH 8,6) feloldva tartalmazó 1 cm3-es küvettába tesszük, és 25 °C-on termosztáljuk. A reakció előrehaladtát spektrofotometriásán követjük a p-nitro-anilin reakciótermék abszorbanciájának nyomon követésével 410 nm-en az idő függvényében. Ahogyan azt a 10. ábra mutatja, az N76D/S103A/ /V104I változatnál szignifikánsan nagyobb stabilitást figyeltünk meg az inaktiválódással szemben, mint a natív B. lentus enzimnél. A két enzim inaktiválódásának becsült felezési ideje a Tide Ultra mosószerben az előírt 5 tesztkörülmények között 45 óra a B. lentus szubtilizinre és 125 óra az N76D/S103A/V104I változatra. SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE
Az 1. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 19 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) Az 1. számú szekvencia leírása:
GAAGCTGCAA CTCGTTAAA 1 9
A 2. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 18 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS 25 (xi) A 2. számú szekvencia leírása:
GCTGCTCTAG ACAATTCG 18
A 3. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 39 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) A 3. számú szekvencia leírása:
GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT 39
A 4. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) A 4. számú szekvencia leírása:
TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG 33
Az 5. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 22bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) Az 5. számú szekvencia leírása:
CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG 22
A 6. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 1497 bázispár
HU 219 851 Β (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) A 6. számú szekvencia leírása:
GGTCTACTAA AATATTATTC CATACTATAC AATTAATACA CAGAATAATC TGTCTATTGG TTATTCTGCA AATGAAAAAA AGGAGAGGAT AAAGAGTGAG AGGCAAAAAA GTATGGATCA GTTTGCTGTT TGCTTTAGCG TTAATCTTTA CGATGGCGTT CGGCAGCACA TCCTCTGCCC AGGCGGCAGG GAAATCAAAC GGGGAAAAGA AATATATTGT CGGGTTTAAA CAGACAATGA GCACGATGAG CGCCGCTAAG AAGAAAGATG TCATTTCTGA AAAAGGCGGG AAAGTGCAAA AGCAATTCAA ATATGTAGAC GCAGCTTCAG TCACATTAAA CGAAAAAGCT GTAAAAGAAT TGAAAAAAGA CCCGAGCGTC GCTTACGTTG AAGAAGATCA CGTAGCACAT GCGTACGCGC AGTCCGTGCC TTACGGCGTA TCACAAATTA AAGCCCCTGC TCTGCACTCT CAAGGCTACA CTGGATCAAA TGTTAAAGTA GCGGTTATCG ACAGCGGTAT CGATTCTTCT CATCCTGATT TAAAGGTAGC AAGCGGAGCC AGCATGGTTC CTTCTGAAAC AAATCCTTTC CAAGACAACA ACTCTCACGG AACTCACGTT GCCGGCACAG TTGCGGCTCT TAATAACTCA ATCGGTGTAT TAGGCGTTGC GCCAAGCGCA TCACTTTACG CTGTAAAAGT TCTCGGTGCT GACGGTTCCG GCCAATACAG CTGGATCATT AACGGAATCG AGTGGGCGAT CGCAAACAAT ATGGACGTTA TTAACATGAG CCTCGGCGGA CCTTCTGGTT CTGCTGCTTT AAAAGCGGCA GTTGATAAAG CCGTTGCATC CGGCGTCGTA GTCGTTGCGG CAGCCGGTAA CGAAGGCACT TCCGGCAGCT CAAGCACAGT GGGCTACCCT GGTAAATACC CTTCTGTCAT TGCAGTAGGC GCTGTTGACA GCAGCAACCA AAGAGCATCT TTCTCAAGCG TAGGACCTGA GCTTGATGTC ATGGCACCTG GCGTATCTAT CCAAAGCACG CTTCCTGGAA ACAAATACGG GGCGTACAAC GGTACGTCAA TGGCATCTCC GCACGTTGCC GGAGCGGCTG CTTTGATTCT TTCTAAGCAC CCGAACTGGA CAAACACTCA AGTCCGCAGC AGTTTAGAAA ACACCACTAC AAAACTTGGT GATTCTTTGT ACTATGGAAA AGGGCTGATC AACGTACAAG CGGCAGCTCA GTAAAACATA AAAAACCGGC CTTGGCCCCG CCGGTTTTTT ATTATTTTTC TTCCTCCGCA TGTTCAATCC GCTCCATAAT CGACGGATGG CTCCCTCTGA AAATTTTAAC GAGAAACGGC GGGTTGACCC GGCTCAGTCC CGTAACGGCC AACTCCTGAA ACGTCTCAAT CGCCGCTTCC CGGTTTCCGG TCAGCTCAAT GCCATAACGG TCGGCGGCGT TTTCCTGATA CCGGGAGACG GCATTCGTAA TCGGATC
A 7. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 275 aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A 7. számú szekvencia leírása:
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1497
Al a Gin Se r Val Pr 0 Tyr Gly Va 1 Ser Gin Ile Ly s Al a Pro Al a Le u
1 5 10 15
Hi s Ser Gl n Gly Ty r Thr Gly Ser Asn Va 1 Ly s Va 1 Alá Va 1 Ile As P
20 25 30
Se r Gly 11 e Asp Se r Ser Hi s Pro Asp Leu Ly s Va 1 Al a Gly Gly Al a
35 40 45
Se r Me t Va 1 Pro Se r Glu Thr Asn Pro Phe Gin As p Asn Asn Ser Hi s
50 55 60
Gl y Thr Hi s Val Al a Gly Thr Val Al a Al a Leu Asn Asn Ser Ile Gl y
65 70 75 80
Va 1 Leu Gl y Val Al a Pro Ser Al a Ser Leu Tyr Al a Val Ly s Val Le u
85 90 95
Gl y Al a As P Gly Se r Gly Gin Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gl y Ile Gl u
100 105 110
Tr P Al a 11 e Al a As n Asn Me t As p Val Ile As n Me t Ser Leu Gly Gl y
11 5 120 125
Pr 0 Ser Gl y Ser Al a Al a Leu Ly s Alá Al a Va 1 As p Ly s Al a Val Al a
130 135 140
Se r Gly Va 1 Val Va 1 Va 1 Al a Al a Al a Gly As n Glu Gly Thr Ser Gl y
14 5 150 155 16 0
HU 219 851 Β
Ser Ser Ser Thr Va 1 165 Gly Tyr Pro Gly Ly s 170 Tyr Pro Ser Va 1 Ile 175 Al a
Val Gly Al a Va 1 As p Ser Ser As n Gin Arg Al a Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu As p Val Me t Al a Pro Gly Va 1 Ser Ile Gin Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Ly s Tyr Gly Al a Tyr Asn Gly Thr Ser Me t Al a Ser
210 215 220
Pro Hi s Val Al a Gly Al a Al a Al a Leu Ile Leu Ser Ly s Hi s Pro As n
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gin Va 1 Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Ly s Gly Leu Ile Asn Va 1 Gin Al a
260 265 270
Al a Al a Gin
275
A 8. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 275 aminosav
(B) Típusa: aminosav
(C) Szálasság: egyszálú
(D) Topológia: lineáris
(ii) Molekulatípus: fehérje
(xi) A 8. számú szekvencia leírása:
Al a Gin Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gin Ile Lys Al a Pro Al a Leu
1 5 10 15
Hi s Ser Gin Gly Tyr Thr Gly Ser As n Val Ly s Va 1 Al a Va 1 I le As p
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser Hi s Pro As p Le u Asn Va 1 Arg Gly Gly Al a
35 40 45
Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr As n Pro Tyr Gin Asp Gly Ser Ser Hi s
50 55 60
Gly Thr His Val Al a Gly Thr Ile Al a Al a Leu As n As n Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ser Pro Ser Al a Ser Leu Tyr Al a Val Ly s Val Leu
85 90 95
Asp Ser Thr Gly Se r Gly Gin Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Al a Ile Ser Asn Asn Me t Asp Val Ile Asn Me t Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Thr Gly Ser Thr Al a Leu Ly s Thr Val Va 1 Asp Ly s Al a Va 1 Ser
130 135 140
Ser Gl y Ile Val Va 1 Al a Al a Al a Al a Gly As n Glu Gly Ser Ser Gly
145 150 155 160
Ser Thr Ser Thr Va 1 Gly Tyr Pro Al a Ly s Tyr Pro Ser Thr Ile Al a
165 170 175
Val Gl y Alá Val Asn Ser Ser As n Gin Arg Al a Ser Phe Ser Ser Al a
180 185 190
Gly Ser Glu Leu As p Val Me t Al a Pro Gly Va 1 Ser Ile Gin Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Al a Tyr Asn Gly Thr Ser Me t Al a Thr
210 215 220
Pro Hi s Val Alá Gly Al a Al a Al a Leu Ile Leu Ser Ly s Hi s Pro Thr
225 230 235 240
Trp Thr Asn Alá Gl n Va 1 Arg As p Arg Leu Glu Ser Thr Al a Thr Tyr
245 250 255
Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Ly s Gly Leu Ile Asn Va 1 Gin Al a
260 265 270
HU 219 851 Β
Alá Alá Gin 275
A 9. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 274 aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A 9. számú szekvencia leírása:
Al a 1 Gin Thr Val Pro 5 Tyr Gly Ile Pro Leu 10 Ile Lys Al a Asp Lys 15 Va 1
Gin Alá Gin Gly Phe Ly s Gly Al a Asn Va 1 Ly s Val Al a Va 1 Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Gin Al a Ser Hi s Pro As p Leu As n Val Va 1 Gly Gly Al a
35 40 45
Ser Phe Val Al a Gl y Glu Al a Tyr Asn Thr Asp Gly As n Gly H i s Gly
50 55 60
Thr Hi s Val Al a Gly Thr Val Al a Al a Leu As p Asn Thr Thr Gly Va 1
65 70 75 80
Le u Gly Val Al a Pro Ser Va 1 Ser Leu Tyr Al a Val Ly s Va 1 Leu Asn
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Va 1 Ser Gly Ile Glu Trp
100 105 110
Al a Thr Thr Asn Gly Me t Asp Va 1 Ile Asn Me t Ser Leu Gly Gly Al a
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Al a Me t Ly s Gin Al a Va 1 As p Asn Al a Tyr Al a Arg
130 135 140
Gly Va 1 Val Va 1 Val Al a Al a Al a Gly Asn Ser Gly Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Thr As n Thr Ile Gly Tyr Pro Al a Ly s Tyr As p Ser Val Ile Al a Val
165 170 175
Gly Al a Val Asp Ser Asn Ser As n Arg Alá Ser Phe Ser Ser Val Gly
180 185 190
Al a Glu Leu Glu Val Me t Al a Pro Gly Al a Gly Val Tyr Ser Thr Tyr
195 200 205
Pro Thr Asn Thr Tyr Al a Thr Leu Asn Gly Thr Ser Me t Al a Ser Pro
210 215 220
Hi s Va 1 Al a Gly Al a Al a Al a Leu Ile Leu Ser Lys Hi s Pro Asn Leu
225 230 235 240
Ser Al a Ser Gin Va 1 Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Al a Thr Tyr Leu
245 250 255
Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Ly s Gly Leu Ile Asn Va 1 Glu Al a Al a
260 265 270
Al a Gin
A 10. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 269 aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A 10. számú szekvencia leírása:
Al a 1 Gin Ser Val Pro 5 Trp Gly Ile Ser Arg 10 Va 1 Gin Al a Pro Al a 15 Al a
Hi s As n Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Va 1 Ly s Va 1 Al a Va 1 Leu Asp
20 25 30
HU 219 851 Β
Thr Gly I le Ser Thr Hi s Pro As P Le u Asn I 1 e Arg Gly Gly Al a Ser
35 40 45
Phe Va 1 Pro Gly Glu Pro Ser Th r Gl n As p Gl y Asn Gly Hi s Gl y Thr
50 55 60
Hi s Va 1 Al a Gly Thr I le Al a Al a Le u Asn As n Ser I le Gly Va 1 Leu
65 70 75 80
Gly Va 1 Al a Pro Ser Al a Glu Le u Ty r Al a Va 1 Ly s Val Leu Gl y Al a
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Va 1 Ser Se r 11 e Al a Gl n Gly Leu Glu Tr P Al a
100 10 5 110
Gly Asn Asn Gly Me t Hi s Val Al a As n Leu Se r Le u Gly Ser Pr 0 Ser
115 12 0 125
Pro Ser Al a Thr Leu Glu Gin Al a Va 1 As n Se r Al a Thr Ser Ar g Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Al a Al a Ser Gl y As n Ser Gl y Al a Gly Ser I 1 e Ser
145 150 15 5 160
Tyr Pro Al a Arg Tyr Alá As n Al a Me t Al a Va 1 Gly Al a Thr As P Gin
165 170 17 5
Asn As n Asn Arg Al a Ser Phe Se r Gl n Tyr Gl y Al a Gly Leu As P I le
180 18 5 190
Val Al a Pro Gly Va 1 Asn Va 1 Gl n Se r Thr Ty r Pro Gly Ser Th r Tyr
195 20 0 205
Al a Ser Leu Asn Gly Thr Ser Me t Al a Thr Pr 0 Hi s Val Al a Gl y Al a
210 215 220
Al a Al a Leu Val Ly s Gin Lys As n Pr 0 Ser Tr P Ser Asn Va 1 Gl n I le
225 230 23 5 240
Arg As n Hi s Leu Ly s Asn Thr Al a Th r Ser Le u Gly Ser Thr As n Leu
245 250 25 5
Tyr Gly Ser Gly Le u Va 1 As n Al a Gl u Al a Al a Thr Arg
260 26 5
A 11. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 1140 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) All. számú szekvencia leírása:
ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG ATTGCTGCTT TAAACAATTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGTTCGGTCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
HU 219 851 Β
A 12. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 1140 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) A 12. számú szekvencia leírása:
ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60
AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT 120
GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT 180
CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT 240
TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT 300
TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC 360
CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT 420
GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT 480
GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG 540
ATTGCTGCTT TAGACAACTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC 600
GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGCGCCATCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG 660
GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA 720
AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG 780
GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG 840
GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG 900
CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC 960
AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA 1020
CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG 1080
AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC 1140
A 13. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 30 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) A 13. számú szekvencia leírása:
TATGCCAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT 30
A 14. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői :
(A) Hossza: 31 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) A 14. számú szekvencia leírása:
CACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T 31
A 15. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: genomiális DNS (xi) A 15. számú szekvencia leírása:
GCTGACGGTT CCGGCGCTAT TAGTTGGATC ATT 33

Claims (37)

1. Tisztítókészítmény, amely tartalmaz:
a) hatásos mennyiségű proteázenzimet, amely egy természetben elő nem forduló aminosavszekvenciával rendelkező karbonil-hidroláz-változat, amely egy szubtilizin prekurzor karbonil-hidrolázból származik helyettesítve a prekurzor karbonil-hidrolázban a +76. helyzetű aminosavmaradékot és egy vagy több aminosavmaradékot a +27., +99., +101., +103., +104., +105, + 107., +109., +123., +126., +128., +135., +156., + 166., +195., +197., +204., +206., +210., +216., +217., +218., +222., +260., +265. és/vagy +274.
helyzetben, melyek ekvivalens helyzetűek a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin aminosavmaradékaival; azzal a megkötéssel, hogy az enzimváltozatokban az együttes helyettesítések az alábbi helyettesítésektől eltérőek:
két aminosavhelyettesítés esetén:
76+109 vagy 76+218;
három aminosavhelyettesítés esetén:
76+ + 109+218;
négy aminosavhelyettesítés esetén:
76+109+217+222 vagy 76+217+218+222;
öt aminosavhelyettesítés esetén:
76+109+217+218+222;
és
b) egy vagy több, a proteázenzimmel összeegyeztethető tisztítókészítmény-anyagot.
2. Az 1. igénypont szerinti tisztítókészítmény, ahol a b) tisztítókészítmény-anyagok felületaktív anyagok, oldószerek, pufferek, enzimek, piszokelengedő ágensek, agyagos talajt eltávolító ágensek, diszpergálószerek, színélénkítők, habzásgátlók, szövetlágyítók, habzást erősítők, enzimstabilizátorok, mosószerépítők, fehérítőszerek, festékek, parfümök vagy ezek keverékei.
3. Az 1. igénypont szerinti tisztítókészítmény, ahol a b) tisztítókészítmény-anyagok legalább 1 tömeg% felületaktív anyagot tartalmaznak a készítményre vonatkoztatva, a nevezett felületaktív anyag alkil-benzolszulfonát, elsőrendű alkil-szulfát, másodrendű alkil-szulfát, alkil-alkoxi-szulfát, alkil-alkoxi-karboxilát, alkil-poliglikozid és ezeknek megfelelő szulfátéit poliglikozid, alfa-szulfonált-zsírsav-észter, alkil- és alkil-fenol-alkoxilát, bétáin vagy szulfobetain, amin-oxid, N-metilglükamid, nemionos elsőrendű etoxilált alkohol, nemionos elsőrendű, kevert etoxi/propoxi alkohol vagy ezek keveréke.
4. A 3. igénypont szerinti tisztítókészítmény, amely tartalmaz továbbá legalább 5 tömeg% mosószerépítőt, amely zeolit, polikarboxilát, rétegelt szilikát, foszfát vagy ezek keveréke.
5. Az 1. igénypont szerinti tisztítókészítmény, amelyben a b) tisztítókészítmény-anyagok legalább egy fehérítőszert tartalmaznak.
6. Az 5. igénypont szerinti tisztítókészítmény, amelyben a fehérítőszer perkarbonát, perborát vagy ezek keveréke, és adott esetben tartalmaz legalább egy fehérítőaktivátort.
7. Az 1. igénypont szerinti tisztítókészítmény, amelyben a b) tisztítókészítmény-anyagok tartalmaznak legalább egy enzimet a cellulázok, lipázok, amilázok, proteázok, peroxidázok vagy ezek keveréke közül.
8. Az 1. igénypont szerinti tisztítókészítmény, amelyben a b) tisztítókészítmény-anyagok legalább egy szövetlágyítót tartalmaznak.
9. Az 1. igénypont szerinti tisztítókészítmény, amelyben az a) proteázenzim egy olyan szubtilizinváltozat, amely az alábbi helyettesítéskombinációkat tartalmazza: 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/ /104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104,
76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/103/ /104/123,76/103/104/126,76/103/104/135,76/103/104/ /197, 76/103/104/222, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/126/265, 27/76/104/123/274, 27/76/104/ /109/123/274, 27/76/104/123/218/274, 27/76/104/123, 27/76/104/107/123, 27/76/104/109/123, 27/76/104/109/ /123/218/274, 27/76/104/123/197, 27/76/104/123/204, 27/76/104/123/206, 27/76/104/123/216, 27/76/104/ /123/218, 27/76/104/123/260, 27/76/104/123/195/197, 27/76/104/123/195/218, 27/76/104/123/197/218, 27/76/ /104/123/204/218, 27/76/104/123/206/218, 27/76/104/ /123/218/260, 27/76/104/123/195/197/218, 76/103/104/ /217, 76/103/104/156, 76/103/104/166, 76/103/104/105, 76/101/103/104, 76/103/104/128, 76/103/104/210, 76/103/104/107, 76/103/104/204, 76/217, 76/103/104/ /156/166 vagy 76/103/104/128.
10. A 9. igénypont szerinti tisztítókészítmény, amelyben a szubtilizinváltozat az alábbi helyettesítéskombinációkat tartalmazza: 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/ /104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/ /104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/ /104/123, 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/128, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/197, 76/103/104/105, 76/103/104/135, 76/103/104/126, 76/103/104/107, 76/103/104/210, 76/103/104/126/ /265 és/vagy 76/103/104/222.
11. Szövettisztító készítmény, amely tartalmaz:
a) hatásos mennyiségű proteázenzimet, amely a természetben fel nem lelhető aminosavszekvenciával rendelkező karbonil-hidroláz-változat, amely egy szubtilizin prekurzor karbonil-hidrolázból származik, és amelyben a proteázenzim egy szubtilizinváltozat az N76D/S99D; N76D/S101R; N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/ /I107V; N76D/N123S; N76D/S99D/S101R; N76D/ /S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/ /S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/ /V104I/N123S; N76D/I107V/N123S; N76D/S99D/ /S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/ /S99D/S103A/V1041; N76D/S101R/S103A/VI041; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V1041/1107V/ /N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/
HU 219 851 Β /S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/ /S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/ /S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/ /V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/ /S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N és N76D/S103A/ /V104I/M222A és ezek keverékeiből kiválasztva; és
b) egy vagy több, a proteázenzimmel összeegyeztethető tisztítókészítmény-anyagot, beleértve legalább 5 tömeg% felületaktív anyagot és legalább 5 tömeg% mosószerépítőt a készítményre vonatkoztatva.
12. A 11. igénypont szerinti szövettisztító készítmény, amely továbbá tartalmaz tisztítókészítményanyagokat az oldószereket, puffereket, enzimeket, piszokelengedő ágenseket, agyagos talajt eltávolító ágenseket, diszpergálószereket, színélénkítőket, habzásgátlókat, szövetlágyítókat, habzást erősítőket, enzimstabilizátorokat, fehérítőszereket, festékeket, parfümöket és ezek keverékeit tartalmazó csoportból kivál asztva.
13. A 11. igénypont szerinti szövettisztító készítmény, amely tartalmaz továbbá legalább egy fehérítőszert.
14. A 11. igénypont szerinti szövettisztító készítmény, amely tartalmaz továbbá legalább egy enzimet a cellulázokat, lipázokat, amilázokat, proteázokat, peroxidázokat és ezek keverékeit tartalmazó csoportból kiválasztva.
15. A 11. igénypont szerinti szövettisztító készítmény folyadék, granulált vagy darabos formában.
16. A 11. igénypont szerinti szövettisztító készítmény, amelyben a proteázenzim egy szubtilizinváltozat az N76D/S99D, N76D/V104I, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V104I, N76D/V1041/1107V, N76D/ /V104Y/I107V, N76D/S101R/S103A/V104I, N76D/ /S99D/S101R/S103A/V104I, N76D/S101R/V104I és ezek keverékeiből kiválasztva.
17. A 11. igénypont szerinti szövettisztító készítmény, amelyben a proteázenzim egy Bacillus szubtilizinváltozat az N76D/V104I, N76D/S103A/V104I és ezek keverékeiből kiválasztva.
18. Szövettisztító készítmény, amely tartalmaz:
a) 0,0001-10 tömeg% proteázenzimet, amely a Bacillus lentus szubtilizinből származó N76D/S103A/V104I szubtilizinváltozat;
b) legalább 5 tömeg% felületaktív anyagot;
c) legalább 5 tömeg% mosószerépítőt; és
d) adott esetben egy vagy több, a proteázenzimmel összeegyeztethető tisztítókészítmény-anyagot, oldószereket, puffereket, enzimeket, piszokelengedő ágenseket, agyagos talajt eltávolító ágenseket, diszpergálószereket, színélénkítőket, habzásgátlókat, szövetlágyítókat, habzást erősítőket, enzimstabilizátorokat, fehérítőszereket, festékeket, parfümöket és ezek keverékeit tartalmazó csoportból kiválasztva.
19. A 18. igénypont szerinti szövettisztító készítmény, amelyben a b) felületaktív anyag alkil-benzolszulfonát, elsőrendű alkil-szulfát, másodrendű alkil-szulfát, alkil-alkoxi-szulfát, alkil-alkoxi-karboxilát, alkil-poliglikozid és ezeknek megfelelő szulfátéit poliglikozid, alfaszulfonált-zsírsav-észter, alkil- és alkil-fenol-alkoxilát, bétáin vagy szulfobetain, amin-oxid, N-metil-glükamid, nemionos elsőrendű etoxilált alkohol, nemionos elsőrendű, kevert etoxi/propoxi alkohol vagy ezek keveréke.
20. A 19. igénypont szerinti szövettisztító készítmény, amely egy vagy több d) tisztítókészítményanyagot tartalmaz fehérítőszereket, szövetlágyítókat és enzimeket tartalmazó csoportból kiválasztva.
21. A 18. igénypont szerinti szövettisztító készítmény legalább 30 tömeg% felületaktív anyagot tartalmazó, koncentrált granulált szövettisztító készítmény formájában.
22. Edénymosogató készítmény, amely tartalmaz:
a) 0,0001-10 tömeg% proteázenzimet, amely a természetben fel nem lelhető aminosavszekvenciával rendelkező karbonil-hidroláz-változat, amely egy szubtilizin prekurzor karbonil-hidrolázból származik, és amelyben a proteázenzim egy szubtilizinváltozat az N76D/S99D; N76D/S101R; N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/ /I107V; N76D/N123S; N76D/S99D/S101R; N76D/ /S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/ /S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/ /V104I/N123S; N76D/I107V/N123S; N76D/S99D/ /S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/ /S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/1107V/ /N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/ /S99D/S103A/V 104I/N123S; N76D/S99D/S101R/ /S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V 104I/T260P; N76D/S103A/Vl041/ /S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/ /V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/ /S103A/V1041/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N és N76D/S103A/ /V104I/M222A és ezek keverékeiből kiválasztva; és
b) 0,1-10 tömeg% felületaktív anyagot; és
c) adott esetben egy vagy több, a proteázenzimmel öszszeegyeztethető tisztítókészítmény-anyagot az oldószereket, puffereket, enzimeket, diszpergálószereket, habzásgátlókat, enzimstabilizátorokat, fehérítőszereket, festékeket, parfümöket és ezek keverékeit tartalmazó csoportból kiválasztva.
23. A 22. igénypont szerinti edénymosogató készítmény, amelyben a proteázenzim a Bacillus lentus szubtilizinből származó N76D/S103A/V104I szubtilizinváltozat.
24. Személyes tisztálkodásra szolgáló készítmény, amely tartalmaz:
a) 0,001-5 tömeg% proteázenzimet, amely egy természetben elő nem forduló aminosavszekvenciával rendelkező karbonil-hidroláz-változat, amely egy szubtilizin prekurzor karbonil-hidrolázból származik helyettesítve a prekurzor karbonil-hidrolázban a +76. helyzetű aminosavmaradékot és egy vagy több aminosavmaradékot a +27., +99., +101., +103., +104., +105., +107, + 109., +123, +126., +128., +135., +156., +166., + 195., +197., +204., +206., +210., +216., +217., +218., +222., +260., +265. és/vagy +274. helyzetben, melyek ekvivalens helyzetűek a Bacillus amyloliquefaciens szubtilizin aminosavmaradékaival;
HU 219 851 Β azzal a megkötéssel, hogy az enzimváltozatokban az együttes helyettesítések az alábbi helyettesítésektől eltérőek :
két aminosavhelyettesítés esetén:
76+109 vagy 76+218;
három aminosavhelyettesítés esetén:
76+ + 109+218;
négy aminosavhelyettesítés esetén:
76+109+217+222 vagy 76+217+218+222;
öt aminosavhelyettesítés esetén:
76+109+217+218+222; és
b) 0,01-95 tömeg% felületaktív rendszert; és
c) adott esetben 0,05-50 tömeg% enzimstabilizátort.
25. A 24. igénypont szerinti készítmény, amelyben a proteázenzim mennyisége 0,001-2 tömeg%.
26. A 25. igénypont szerinti készítmény, amelyben a proteázenzim mennyisége 0,01 -0,8 tömeg%.
27. A 24. igénypont szerinti készítmény, amelyben a b) felületaktív rendszer az anionos karboxilátokat, amin-oxidokat, alkil-glükozidokat, glükózamidokat, alkil-szulfátokat, alkil-éter-szulfátokat, acil-izetionátokat, alkil-szulfo-szukcinátokat, alkil-foszfát-észtereket, etoxilált foszfát-észtereket, alkil-gliceril-éterszulfonátokat vagy ezek keverékeit tartalmazó csoportból kiválasztott felületaktív anyagot tartalmaz.
28. A 24. igénypont szerinti készítmény, amelyben a felületaktív rendszer szappanokat, acil-glutamátokat, alkil-szarkozinátokat, lauramin-oxidokat, kókusz-aminoxidokat, kókusz-amido-propil-amin-oxidokat, decil-glükozidokat, lauril-szulfátokat, lauret-szulfátokat, C]2-C18 acil-izetionátokat vagy ezek keverékeit tartalmazó csoportból kiválasztott felületaktív anyagot tartalmaz.
29. A 28. igénypont szerinti készítmény, amelyben a felületaktív anyag szappan, legalább 2 tömeg% mennyiségben a készítményre vonatkoztatva.
30. A 29. igénypont szerinti készítmény, amelyben a szappan legalább 10 tömeg%-ot tesz ki.
31. A 30. igénypont szerinti készítmény, amelyben a szappan legalább 30 tömeg%-ot tesz ki.
32. A 28. igénypont szerinti készítmény, amelyben a szappan aránya a proteázenzimhez 2000:1 és 8:1 között van.
33. A 32. igénypont szerinti készítmény, amelyben a szappan aránya a proteázenzimhez 400:1 és 40:1 között van.
34. A 28. igénypont szerinti készítmény, amelyben a proteázenzim egy szubtilizinváltozat az N76D/S99D;
N76D/S101R; N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/ /I107V; N76D/N123S; N76D/S99D/S101R; N76D/ /S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/ /S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/ /V104I/N123S; N76D/I107V/N123S; N76D/S99D/ /S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/ /S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/Vl04I/N123S; N76D/V104I/1107V/ /N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/ /S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/ /S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V 104I/T260P; N76D/S103A/Vl 041/ /S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/ /V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/ /S103A/V 104I/L126F; N76D/S103A/V 104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N és N76D/S103A/ /V104I/M222A és ezek keverékeiből kiválasztva.
35. Eljárás szövet tisztítására, azzal jellemezve, hogy a tisztítandó szövetet proteázenzimmel - amely a Bacillus lentus szubtilizinből származó N76D/S103A/ /VI041 szubtilizinváltozat - érintkeztetjük.
36. Eljárás edények tisztítására, azzal jellemezve, hogy a tisztítandó edényt proteázenzimmel - amely a Bacillus lentus szubtilizinből származó N76D/S103A/ /VI041 szubtilizinváltozat - érintkeztetjük.
37. A 24. igénypont szerinti személyes tisztálkodásra szolgáló készítmény, amelyben a proteázenzim egy szubtilizinváltozat az N76D/S99D; N76D/S101R; N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/I107V; N76D/ /N123S; N76D/S99D/S101R; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/ /S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/ /I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/ /V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/ /V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/ /S99D/S101R/S103A/V 1041; N76D/S99D/S103A/ /V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/ /N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/ /V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/ /S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V 104I/L1351; N76D/S103A/V 1041/ /L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/ /V104I/L126F/S265N és N76D/S103A/V104I/M222A és ezek keverékeiből kiválasztva.
HU9600960A 1993-10-14 1994-10-13 Proteáz tartalmú tisztítókészítmények HU219851B (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13679793A 1993-10-14 1993-10-14
US23793894A 1994-05-02 1994-05-02
PCT/US1994/011776 WO1995010591A1 (en) 1993-10-14 1994-10-13 Protease-containing cleaning compositions

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9600960D0 HU9600960D0 (en) 1996-06-28
HUT75984A HUT75984A (en) 1997-05-28
HU219851B true HU219851B (hu) 2001-08-28

Family

ID=26834646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9600960A HU219851B (hu) 1993-10-14 1994-10-13 Proteáz tartalmú tisztítókészítmények

Country Status (14)

Country Link
US (2) US5679630A (hu)
EP (1) EP0723579B1 (hu)
JP (2) JP2888985B2 (hu)
CN (1) CN1082999C (hu)
AT (1) ATE361355T1 (hu)
AU (1) AU8079794A (hu)
BR (1) BR9407834A (hu)
CA (1) CA2173105C (hu)
CZ (1) CZ105396A3 (hu)
DE (1) DE69434962T2 (hu)
ES (1) ES2287931T3 (hu)
HU (1) HU219851B (hu)
TW (1) TW306931B (hu)
WO (1) WO1995010591A1 (hu)

Families Citing this family (490)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK39093D0 (da) * 1993-04-01 1993-04-01 Novo Nordisk As Enzym
US6436690B1 (en) * 1993-09-15 2002-08-20 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
US6440717B1 (en) * 1993-09-15 2002-08-27 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
HU219851B (hu) * 1993-10-14 2001-08-28 The Procter And Gamble Company Proteáz tartalmú tisztítókészítmények
MA23346A1 (fr) * 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
HU219852B (hu) * 1993-10-14 2001-08-28 The Procter And Gamble Company Proteáz enzimeket tartalmazó fehérítő készítmények
EP0741770A1 (en) * 1994-01-25 1996-11-13 The Procter & Gamble Company Low sudsing detergent compositions containing long chain amine oxide and branched alkyl carboxylates
US6599730B1 (en) * 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US5922082A (en) 1994-06-16 1999-07-13 Procter & Gamble Company Detergent composition containing wool compatible high alkaline proteases
US6066611A (en) * 1994-10-13 2000-05-23 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising protease enzymes
EP0791046B1 (en) * 1994-11-18 2000-04-05 THE PROCTER &amp; GAMBLE COMPANY Detergent compositions containing lipase and protease
US6455295B1 (en) * 1995-03-08 2002-09-24 The Procter & Gamble Company Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
IL117350A0 (en) * 1995-03-09 1996-07-23 Procter & Gamble Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6475765B1 (en) * 1995-03-09 2002-11-05 Procter & Gamble Company Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
DE19530816A1 (de) 1995-08-23 1997-02-27 Cognis Bio Umwelt Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten
US5858948A (en) * 1996-05-03 1999-01-12 Procter & Gamble Company Liquid laundry detergent compositions comprising cotton soil release polymers and protease enzymes
JP2974786B2 (ja) 1996-05-03 1999-11-10 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 改善された汚れ分散性を有するポリアミン重合体を含む洗剤組成物
CN1233274A (zh) * 1996-07-08 1999-10-27 普罗格特-甘布尔公司 含有混合表面活性剂的手洗洗衣洗涤剂组合物
US6313086B1 (en) * 1996-07-31 2001-11-06 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing and effervescent
EP0934378B1 (en) * 1996-10-18 2003-06-11 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising a mixture of cationic, anionic and nonionic surfactants
EP0839905A1 (en) * 1996-11-05 1998-05-06 The Procter & Gamble Company Foam detergent composition with enzymes
EP0960186A2 (en) * 1996-12-31 1999-12-01 The Procter & Gamble Company Laundry detergent compositions with polyamide-polyamines to provide appearance benefits to fabrics laundered therewith
EP0958342B1 (en) 1996-12-31 2003-07-09 The Procter & Gamble Company Thickened, highly aqueous liquid detergent compositions
US6194370B1 (en) 1996-12-31 2001-02-27 The Procter & Gamble Company Cost effective stain and soil removal aqueous heavy duty liquid laundry detergent compositions
CN1170916C (zh) * 1996-12-31 2004-10-13 普罗格特-甘布尔公司 含有固色剂的洗衣洗涤剂组合物
WO1998055634A1 (en) * 1997-06-04 1998-12-10 The Procter & Gamble Company Protease enzymes for tough cleaning and/or spot and film reduction and compositions incorporating same
WO1998055579A1 (en) * 1997-06-04 1998-12-10 The Procter & Gamble Company Mixed protease enzyme systems for cleaning protein based soils and compositions incorporating same
EP0913458B1 (en) * 1997-10-22 2004-06-16 The Procter & Gamble Company Liquid hard-surface cleaning compositions
AR015977A1 (es) * 1997-10-23 2001-05-30 Genencor Int Variantes de proteasa multiplemente substituida con carga neta alterada para su empleo en detergentes
ES2367505T3 (es) * 1997-10-23 2011-11-04 Danisco Us Inc. Variantes de proteasa con sustituciones múltiples con carga neta alterada para usar en detergentes.
BR9909130A (pt) * 1998-03-26 2000-12-19 Procter & Gamble Variantes de protease de serina tendo substituições de amino-ácido
EP2261359B1 (en) 1998-06-10 2014-08-20 Novozymes A/S Mannanases
US6420331B1 (en) 1998-06-10 2002-07-16 Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising a mannanase and a bleach system
US6376450B1 (en) * 1998-10-23 2002-04-23 Chanchal Kumar Ghosh Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants
US6831053B1 (en) * 1998-10-23 2004-12-14 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants
DE19942595C2 (de) * 1998-11-18 2002-01-31 Linders Werner Reinigungsmittel für Zahnprothesen
US20050124738A1 (en) * 1999-05-26 2005-06-09 The Procter & Gamble Company Compositions and methods for using zwitterionic polymeric suds enhancers
EP1194461B1 (en) 1999-05-26 2008-10-08 Rhodia Inc. Block polymers, compositions and methods of use for foams, laundry detergents, shower rinses and coagulants
US7241729B2 (en) * 1999-05-26 2007-07-10 Rhodia Inc. Compositions and methods for using polymeric suds enhancers
US7939601B1 (en) 1999-05-26 2011-05-10 Rhodia Inc. Polymers, compositions and methods of use for foams, laundry detergents, shower rinses, and coagulants
US6740713B1 (en) 1999-07-08 2004-05-25 Procter & Gamble Company Process for producing particles of amine reaction products
US6764986B1 (en) 1999-07-08 2004-07-20 Procter & Gamble Company Process for producing particles of amine reaction products
US6972276B1 (en) 1999-07-09 2005-12-06 Procter & Gamble Company Process for making amine compounds
EP1754774B1 (en) 1999-08-10 2012-09-19 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising hydrotropes
JP2003509307A (ja) 1999-09-22 2003-03-11 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 手持ち式液体容器
WO2001060157A2 (en) * 2000-02-18 2001-08-23 The Procter & Gamble Company Antibacterial agents and compositions
JP2003524660A (ja) * 2000-02-29 2003-08-19 クラリアント ソシエダッド アノニマ アニオン性およびカチオン性界面活性剤を含む化粧品組成物
US6777218B1 (en) * 2000-03-14 2004-08-17 Novozymes A/S Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains
AU2001249811B2 (en) 2000-04-03 2006-06-08 Maxygen, Inc. Subtilisin variants
US7319112B2 (en) * 2000-07-14 2008-01-15 The Procter & Gamble Co. Non-halogenated antibacterial agents and processes for making same
US7109016B2 (en) 2000-08-21 2006-09-19 Novozymes A/S Subtilase enzymes
AU2001279614B2 (en) * 2000-08-21 2006-08-17 Novozymes A/S Subtilase enzymes
US6541234B1 (en) * 2000-09-11 2003-04-01 University Of Maryland Biotechnology Institute Calcium free subtilisin mutants
GB2367065B (en) * 2000-09-20 2002-11-20 Reckitt Benckiser Inc Enzyme containing laundry booster compositions
US6541235B1 (en) * 2000-09-29 2003-04-01 University Of Maryland Biotechnology Institute Calcium free subtilisin mutants
DE10104479C1 (de) * 2001-01-31 2002-09-12 Gerhard Knapp Verwendung eines Mittels zur Inhibierung von Milbenkot
US20030040459A1 (en) * 2001-02-05 2003-02-27 Unilever Home & Pesonal Care Usa Cleaning compositions
EP1241112A3 (en) 2001-03-15 2003-02-26 The Procter & Gamble Company Flexible multiple compartment pouch
EP1373296B1 (en) * 2001-03-23 2011-10-05 Genencor International, Inc. Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
DE10121463A1 (de) * 2001-05-02 2003-02-27 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten
US7157416B2 (en) * 2001-07-20 2007-01-02 Genencor International, Inc. Stabilization of enzymes
GB0118932D0 (en) * 2001-08-02 2001-09-26 Unilever Plc Improvements relating to laundry compositions
WO2003014193A1 (en) * 2001-08-03 2003-02-20 The Procter & Gamble Company Polyaspartate derivatives for use in detergent compositions
US7153820B2 (en) 2001-08-13 2006-12-26 Ecolab Inc. Solid detergent composition and method for solidifying a detergent composition
US6544941B1 (en) * 2001-08-27 2003-04-08 Unilever Home & Personal Care Usa, Division Of Conopco, Inc. Dishwashing composition
DE10153792A1 (de) * 2001-10-31 2003-05-22 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten
MXPA04004478A (es) * 2001-11-13 2004-08-11 Procter & Gamble Composiciones que contienen enzimas estabilizadas con ciertos osmoprotectores y metodos para utilizarls en el cuidado personal.
EP2287321B1 (en) * 2002-01-16 2014-08-13 Danisco US Inc. Multiply-substituted protease variants
ATE450606T1 (de) * 2002-01-16 2009-12-15 Genencor Int Mehrfachsubstituierte proteasevarianten
WO2004019685A1 (de) 2002-08-28 2004-03-11 Carl-Heinz Kapitz Verwendung von proteasen zum abbau von allergenen
KR20050052666A (ko) * 2002-10-10 2005-06-03 다이버사 코포레이션 프로테아제, 이를 암호화하는 핵산, 및 이를 제조하고사용하는 방법
US7585824B2 (en) 2002-10-10 2009-09-08 International Flavors & Fragrances Inc. Encapsulated fragrance chemicals
BR0303954A (pt) 2002-10-10 2004-09-08 Int Flavors & Fragrances Inc Composição, fragrância, método para divisão de uma quantidade efetiva olfativa de fragrância em um produto sem enxague e produto sem enxague
US20040097385A1 (en) * 2002-11-18 2004-05-20 Unilever Home & Personal Products Usa, Division Of Conopco, Inc. Viscoelastic cleansing gel with surfactant solutions containing polysaccharides and their derivatives polysaccharide hydrocolloids
US20040229763A1 (en) * 2003-02-28 2004-11-18 The Procter & Gamble Company Cleaning kit and/or a dishwashing kit containing a foam-generating dispenser and a cleaning and/or dishwashing composition
US7402554B2 (en) * 2003-02-28 2008-07-22 The Procter & Gamble Company Foam-generating kit containing a foam-generating dispenser and a composition containing a high level of surfactant
US7651992B2 (en) * 2003-02-28 2010-01-26 The Procter & Gamble Company Foam-generating kit containing a foam-generating dispenser and a composition containing a high level of surfactant
CN102766545B (zh) * 2003-05-07 2014-08-06 诺维信公司 变体枯草杆菌蛋白酶（枯草杆菌酶）
US20050113282A1 (en) * 2003-11-20 2005-05-26 Parekh Prabodh P. Melamine-formaldehyde microcapsule slurries for fabric article freshening
US20050112152A1 (en) 2003-11-20 2005-05-26 Popplewell Lewis M. Encapsulated materials
US7105064B2 (en) 2003-11-20 2006-09-12 International Flavors & Fragrances Inc. Particulate fragrance deposition on surfaces and malodour elimination from surfaces
DE10360805A1 (de) 2003-12-23 2005-07-28 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neue Alkalische Protease
US20050226900A1 (en) * 2004-04-13 2005-10-13 Winton Brooks Clint D Skin and hair treatment composition and process for using same resulting in controllably-releasable fragrance and/or malodour counteractant evolution
US20050227907A1 (en) * 2004-04-13 2005-10-13 Kaiping Lee Stable fragrance microcapsule suspension and process for using same
DE102004019751A1 (de) 2004-04-23 2005-11-17 Henkel Kgaa Neue Alkalische Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Alkalischen Proteasen
ATE454440T1 (de) 2004-05-17 2010-01-15 Procter & Gamble Bleichmittel mit carbohydratoxidase
DE102004029475A1 (de) * 2004-06-18 2006-01-26 Henkel Kgaa Neues enzymatisches Bleichsystem
US7419943B2 (en) 2004-08-20 2008-09-02 International Flavors & Fragrances Inc. Methanoazuenofurans and methanoazulenone compounds and uses of these compounds as fragrance materials
US7594594B2 (en) * 2004-11-17 2009-09-29 International Flavors & Fragrances Inc. Multi-compartment storage and delivery containers and delivery system for microencapsulated fragrances
US7686892B2 (en) 2004-11-19 2010-03-30 The Procter & Gamble Company Whiteness perception compositions
US7871972B2 (en) 2005-01-12 2011-01-18 Amcol International Corporation Compositions containing benefit agents pre-emulsified using colloidal cationic particles
US7977288B2 (en) 2005-01-12 2011-07-12 Amcol International Corporation Compositions containing cationically surface-modified microparticulate carrier for benefit agents
US7569533B2 (en) 2005-01-12 2009-08-04 Amcol International Corporation Detersive compositions containing hydrophobic benefit agents pre-emulsified using sub-micrometer-sized insoluble cationic particles
EP1700904A1 (en) 2005-03-11 2006-09-13 Unilever N.V. Liquid detergent composition
EP1700907A1 (en) 2005-03-11 2006-09-13 Unilever N.V. Liquid bleaching composition
US20070207174A1 (en) * 2005-05-06 2007-09-06 Pluyter Johan G L Encapsulated fragrance materials and methods for making same
CA2620738C (en) * 2005-08-31 2010-10-12 Ezaki Glico Co., Ltd. Tablet for removing tongue coating
RU2426774C2 (ru) 2005-09-27 2011-08-20 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Чистящая и моющая композиция и способы её получения и применения
CN105200027B (zh) * 2005-10-12 2019-05-31 金克克国际有限公司 储存稳定的中性金属蛋白酶的用途和制备
US20070138673A1 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Kaiping Lee Process for Preparing a High Stability Microcapsule Product and Method for Using Same
US20070138674A1 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Theodore James Anastasiou Encapsulated active material with reduced formaldehyde potential
US7838481B2 (en) * 2006-04-07 2010-11-23 Beckman Coulter, Inc. Formaldehyde-free cleaner composition for cleaning blood analyzers and method of use
EP2013339B1 (en) 2006-04-20 2013-09-11 Novozymes A/S Savinase variants having an improved wash performance on egg stains
US7629158B2 (en) 2006-06-16 2009-12-08 The Procter & Gamble Company Cleaning and/or treatment compositions
BRPI0714329B1 (pt) * 2006-07-18 2017-09-12 Danisco Us Inc.,Genencor Division A dishwashing detergent composition comprising protease variants active over a wide temperature range and dishwashing process
US20080027505A1 (en) * 2006-07-26 2008-01-31 G&L Consulting, Llc System and method for treatment of headaches
ATE491433T1 (de) 2006-08-01 2011-01-15 Procter & Gamble Pflegemittel mit freisetzungspartikel
DE102007029643A1 (de) 2006-09-08 2009-01-15 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungsmittel
US7833960B2 (en) 2006-12-15 2010-11-16 International Flavors & Fragrances Inc. Encapsulated active material containing nanoscaled material
US8093200B2 (en) 2007-02-15 2012-01-10 Ecolab Usa Inc. Fast dissolving solid detergent
US7709436B2 (en) * 2007-05-09 2010-05-04 The Dial Corporation Low carbon footprint compositions for use in laundry applications
US7648953B2 (en) * 2008-05-08 2010-01-19 The Dial Corporation Eco-friendly laundry detergent compositions comprising natural essence
EP2164448A4 (en) 2007-05-14 2012-07-04 Amcol International Corp COMPOSITIONS COMPOSED OF PREVENTIVE AGENTS PRE-EMULSIFIED WITH COLLOIDAL CATIONIC PARTICLES
US20080311064A1 (en) * 2007-06-12 2008-12-18 Yabin Lei Higher Performance Capsule Particles
ES1065735Y (es) * 2007-06-19 2008-01-16 Sensient Fragances S A Pastilla de jabon con nucleo activo
US8894898B2 (en) 2007-10-18 2014-11-25 Ecolab Usa Inc. Pressed, waxy, solid cleaning compositions and methods of making them
US7998920B2 (en) * 2008-01-22 2011-08-16 Stepan Company Sulfonated estolide compositions containing magnesium sulfate and processes employing them
US7879790B2 (en) * 2008-01-22 2011-02-01 Stepan Company Mixed salts of sulfonated estolides and other derivatives of fatty acids, and methods of making them
US7666828B2 (en) 2008-01-22 2010-02-23 Stepan Company Sulfonated estolides and other derivatives of fatty acids, methods of making them, and compositions and processes employing them
PL2088187T3 (pl) * 2008-02-08 2013-01-31 Procter & Gamble Sposób otrzymywania rozpuszczalnej w wodzie saszetki
US8066818B2 (en) 2008-02-08 2011-11-29 The Procter & Gamble Company Water-soluble pouch
WO2009100306A1 (en) * 2008-02-08 2009-08-13 Method Products, Inc. Consumer product packets with enhanced performance
CA2725814A1 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Amcol International Corporation Compositions containing cationically surface-modified microparticulate carrier for benefit agents
US20090209447A1 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Michelle Meek Cleaning compositions
US20090233830A1 (en) 2008-03-14 2009-09-17 Penny Sue Dirr Automatic detergent dishwashing composition
EP2100947A1 (en) * 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP2100948A1 (en) * 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
US8097047B2 (en) * 2008-04-02 2012-01-17 The Procter & Gamble Company Fabric color rejuvenation composition
EP2268782A2 (en) 2008-04-11 2011-01-05 Amcol International Corporation Multilayer fragrance encapsulation
US8188022B2 (en) 2008-04-11 2012-05-29 Amcol International Corporation Multilayer fragrance encapsulation comprising kappa carrageenan
CN102046783A (zh) * 2008-06-06 2011-05-04 丹尼斯科美国公司 包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法
US8601526B2 (en) 2008-06-13 2013-12-03 United Video Properties, Inc. Systems and methods for displaying media content and media guidance information
EP2166092A1 (en) 2008-09-18 2010-03-24 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP2166073A1 (en) 2008-09-23 2010-03-24 The Procter & Gamble Company Cleaning composition
EP2166076A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-24 The Procter & Gamble Company Cleaning composition
EP2166075A1 (en) 2008-09-23 2010-03-24 The Procter and Gamble Company Cleaning composition
US7915215B2 (en) 2008-10-17 2011-03-29 Appleton Papers Inc. Fragrance-delivery composition comprising boron and persulfate ion-crosslinked polyvinyl alcohol microcapsules and method of use thereof
BRPI0920925A2 (pt) * 2008-11-11 2015-08-18 Danisco Us Inc Composições e métodos compreendendo uma variante de subtilisina
US20100267304A1 (en) * 2008-11-14 2010-10-21 Gregory Fowler Polyurethane foam pad and methods of making and using same
US20100125046A1 (en) * 2008-11-20 2010-05-20 Denome Frank William Cleaning products
US8058223B2 (en) * 2009-01-21 2011-11-15 Stepan Company Automatic or machine dishwashing compositions of sulfonated estolides and other derivatives of fatty acids and uses thereof
US7884064B2 (en) * 2009-01-21 2011-02-08 Stepan Company Light duty liquid detergent compositions of sulfonated estolides and other derivatives of fatty acids
BRPI0924129B1 (pt) 2009-01-21 2019-09-17 Stepan Company Composição agrícola de estolides sulfonados e outros derivados de ácidos graxos
US8124577B2 (en) * 2009-01-21 2012-02-28 Stepan Company Personal care compositions of sulfonated estolides and other derivatives of fatty acids and uses thereof
US8119588B2 (en) * 2009-01-21 2012-02-21 Stepan Company Hard surface cleaner compositions of sulfonated estolides and other derivatives of fatty acids and uses thereof
EP2216390B1 (en) 2009-02-02 2013-11-27 The Procter and Gamble Company Hand dishwashing method
EP2213713B1 (en) 2009-02-02 2014-03-12 The Procter and Gamble Company Liquid hand dishwashing detergent composition
ES2488117T3 (es) 2009-02-02 2014-08-26 The Procter & Gamble Company Composición detergente líquida para lavado de vajillas a mano
EP2216392B1 (en) 2009-02-02 2013-11-13 The Procter and Gamble Company Liquid hand dishwashing detergent composition
EP2216391A1 (en) 2009-02-02 2010-08-11 The Procter & Gamble Company Liquid hand dishwashing detergent composition
EP3023483A1 (en) 2009-02-02 2016-05-25 The Procter and Gamble Company Liquid hand diswashing detergent composition
EP2216393B1 (en) 2009-02-09 2024-04-24 The Procter & Gamble Company Detergent composition
US8293697B2 (en) 2009-03-18 2012-10-23 The Procter & Gamble Company Structured fluid detergent compositions comprising dibenzylidene sorbitol acetal derivatives
US8153574B2 (en) 2009-03-18 2012-04-10 The Procter & Gamble Company Structured fluid detergent compositions comprising dibenzylidene polyol acetal derivatives and detersive enzymes
EP2435547A1 (en) 2009-05-26 2012-04-04 The Procter & Gamble Company Aqueous liquid composition for pre-treating soiled dishware
WO2011005804A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 The Procter & Gamble Company Method of laundering fabric using a liquid laundry detergent composition
WO2011005623A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition comprising low level of bleach
US20110009307A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 Alan Thomas Brooker Laundry Detergent Composition Comprising Low Level of Sulphate
US20110005004A1 (en) * 2009-07-09 2011-01-13 The Procter & Gamble Company Method of laundering fabric using a compacted liquid laundry detergent composition
EP2451923A1 (en) * 2009-07-09 2012-05-16 The Procter & Gamble Company Method of laundering fabric using a liquid laundry detergent composition
EP2451922A1 (en) 2009-07-09 2012-05-16 The Procter & Gamble Company Method of laundering fabric using a compacted liquid laundry detergent composition
BR112012000520A2 (pt) 2009-07-09 2016-02-16 Procter & Gamble composição catalítica detergente para lavagem de roupa que compreende teores relativamente baixos de eletrólito solúvel em água
WO2011005905A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 The Procter & Gamble Company A mildly alkaline, low-built, solid fabric treatment detergent composition comprising phthalimido peroxy caproic acid
EP2451914A1 (en) 2009-07-09 2012-05-16 The Procter & Gamble Company A catalytic laundry detergent composition comprising relatively low levels of water-soluble electrolyte
EP2277860B1 (en) 2009-07-22 2015-08-19 Stepan Company Compositions comprising sulfonated estolides and alkyl ester sulfonates, methods of making them, and compositions and processes employing them
CN102574961B (zh) 2009-07-31 2015-09-23 阿克佐诺贝尔股份有限公司 混杂共聚物组合物
PL2292725T5 (pl) 2009-08-13 2022-11-07 The Procter And Gamble Company Sposób prania tkanin w niskiej temperaturze
DE102009029513A1 (de) * 2009-09-16 2011-03-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Proteasen
CN102120167B (zh) 2009-09-18 2014-10-29 国际香料和香精公司 胶囊封装的活性材料
EP2322593A1 (en) 2009-11-12 2011-05-18 The Procter & Gamble Company Liquid laundry detergent composition
EP2322595A1 (en) 2009-11-12 2011-05-18 The Procter & Gamble Company Solid laundry detergent composition
MX2012006616A (es) * 2009-12-09 2012-06-21 Procter & Gamble Productos para el cuidado de las telas y el hogar.
ES2422593T3 (es) 2009-12-10 2013-09-12 Procter & Gamble Método y uso de una composición para lavavajillas
ES2399311T5 (es) 2009-12-10 2020-06-19 Procter & Gamble Composición detergente
ES2548772T3 (es) 2009-12-10 2015-10-20 The Procter & Gamble Company Producto para lavavajillas y uso del mismo
ES2423580T5 (es) 2009-12-10 2021-06-17 Procter & Gamble Método y uso de una composición para lavado de vajillas
CN102869759B (zh) 2010-02-10 2015-07-15 诺维信公司 在螯合剂存在下具有高稳定性的变体和包含变体的组合物
EP2357220A1 (en) 2010-02-10 2011-08-17 The Procter & Gamble Company Cleaning composition comprising amylase variants with high stability in the presence of a chelating agent
ES2401126T3 (es) 2010-02-25 2013-04-17 The Procter & Gamble Company Composición detergente
EP2377914B1 (en) 2010-04-19 2016-11-09 The Procter & Gamble Company Mildly alkaline, low-built, solid fabric treatment detergent composition comprising perhydrolase
EP2365054A1 (en) 2010-03-01 2011-09-14 The Procter & Gamble Company Solid laundry detergent composition comprising secondary alcohol-based detersive surfactant
EP2365058A1 (en) 2010-03-01 2011-09-14 The Procter & Gamble Company Solid laundry detergent composition having an excellent anti-encrustation profile
EP2365059A1 (en) 2010-03-01 2011-09-14 The Procter & Gamble Company Solid laundry detergent composition comprising C.I. fluorescent brightener 260 in alpha-crystalline form
EP2380957A1 (en) 2010-04-19 2011-10-26 The Procter & Gamble Company Solid laundry detergent composition having a dynamic in-wash ph profile
EP2363456A1 (en) 2010-03-01 2011-09-07 The Procter & Gamble Company Solid laundry detergent composition comprising brightener in micronized particulate form
JP6018044B2 (ja) * 2010-04-15 2016-11-02 ダニスコ・ユーエス・インク プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法
US20120067373A1 (en) 2010-04-15 2012-03-22 Philip Frank Souter Automatic Dishwashing Detergent Composition
US20110257060A1 (en) 2010-04-19 2011-10-20 Robert Richard Dykstra Laundry detergent composition comprising bleach particles that are suspended within a continuous liquid phase
US20110257062A1 (en) 2010-04-19 2011-10-20 Robert Richard Dykstra Liquid laundry detergent composition comprising a source of peracid and having a ph profile that is controlled with respect to the pka of the source of peracid
US20110257069A1 (en) 2010-04-19 2011-10-20 Stephen Joseph Hodson Detergent composition
US8889612B2 (en) 2010-04-19 2014-11-18 The Procter & Gamble Company Method of laundering fabric using a compacted liquid laundry detergent composition
EP2380961B1 (en) 2010-04-23 2018-05-23 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP2383329A1 (en) 2010-04-23 2011-11-02 The Procter & Gamble Company Particle
ES2579217T3 (es) 2010-04-23 2016-08-08 The Procter & Gamble Company Partícula
EP2380478A1 (en) 2010-04-23 2011-10-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing product
ES2565192T3 (es) 2010-04-23 2016-04-01 The Procter & Gamble Company Método para perfumar
ES2533368T3 (es) 2010-04-23 2015-04-09 The Procter & Gamble Company Producto para lavavajillas
BR112012028466B1 (pt) 2010-05-06 2020-03-17 The Procter & Gamble Company Composição de produtos com variantes de protease e método para tratar e/ou limpar uma superfície
EP2395070A1 (en) 2010-06-10 2011-12-14 The Procter & Gamble Company Liquid laundry detergent composition comprising lipase of bacterial origin
EP2395071A1 (en) 2010-06-10 2011-12-14 The Procter & Gamble Company Solid detergent composition comprising lipase of bacterial origin
EP2585573A1 (en) 2010-06-23 2013-05-01 The Procter and Gamble Company Product for pre-treatment and laundering of stained fabric
US20130166040A1 (en) * 2010-06-24 2013-06-27 The Board Of Trustee Of The University Of Illinois Reagents and methods for preparing teeth for implantation
RU2541949C2 (ru) 2010-07-02 2015-02-20 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Филаменты, содержащие активный агент, нетканые полотна и способы их получения
RU2607747C1 (ru) 2010-07-02 2017-01-10 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Способ получения пленок из нетканых полотен
EP2588655B1 (en) 2010-07-02 2017-11-15 The Procter and Gamble Company Method for delivering an active agent
WO2012003351A2 (en) 2010-07-02 2012-01-05 The Procter & Gamble Company Web material and method for making same
WO2012003300A2 (en) 2010-07-02 2012-01-05 The Procter & Gamble Company Filaments comprising a non-perfume active agent nonwoven webs and methods for making same
ES2532537T3 (es) 2010-07-22 2015-03-27 Unilever N.V. Composiciones de detergentes que comprenden un biotensioactivo y lipasa
CN103025856B (zh) 2010-07-22 2017-04-12 荷兰联合利华有限公司 包含生物表面活性剂和酶的洗涤剂组合物
EP2412792A1 (en) 2010-07-29 2012-02-01 The Procter & Gamble Company Liquid detergent composition
US8685171B2 (en) 2010-07-29 2014-04-01 The Procter & Gamble Company Liquid detergent composition
WO2012057781A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 The Procter & Gamble Company Cleaning and/or treatment compositions comprising a fungal serine protease
WO2011026154A2 (en) 2010-10-29 2011-03-03 The Procter & Gamble Company Cleaning and/or treatment compositions
DE102010063457A1 (de) * 2010-12-17 2012-06-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Cellulase
MX2012003321A (es) 2011-03-18 2013-03-21 Int Flavors & Fragrances Inc Microcapsulas producidas a partir de precursores de sol-gel mezclados y metodos para producir las mismas.
WO2012151480A2 (en) 2011-05-05 2012-11-08 The Procter & Gamble Company Compositions and methods comprising serine protease variants
CA2834865C (en) 2011-05-05 2021-03-09 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising serine protease variants
US20120291818A1 (en) 2011-05-20 2012-11-22 Ecolab Usa Inc. Non-phosphate detergents and non-phosphoric acids in an alternating alkali/acid system for warewashing
WO2012160498A2 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Ecolab Usa Inc. Acid formulations for use in a system for warewashing
US20140371435A9 (en) 2011-06-03 2014-12-18 Eduardo Torres Laundry Care Compositions Containing Thiophene Azo Dyes
EP2537918A1 (en) 2011-06-20 2012-12-26 The Procter & Gamble Company Consumer products with lipase comprising coated particles
US20120324655A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Nalini Chawla Product for pre-treatment and laundering of stained fabric
US8828920B2 (en) 2011-06-23 2014-09-09 The Procter & Gamble Company Product for pre-treatment and laundering of stained fabric
WO2013002786A1 (en) 2011-06-29 2013-01-03 Solae Baked food compositions comprising soy whey proteins that have been isolated from processing streams
EP2540824A1 (en) 2011-06-30 2013-01-02 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising amylase variants reference to a sequence listing
KR20140056237A (ko) 2011-06-30 2014-05-09 노보자임스 에이/에스 알파-아밀라제 변이체
EP2551335A1 (en) 2011-07-25 2013-01-30 The Procter & Gamble Company Enzyme stabilized liquid detergent composition
US20130029895A1 (en) 2011-07-27 2013-01-31 Jean-Luc Phillippe Bettiol Multiphase liquid detergent composition
US8841246B2 (en) 2011-08-05 2014-09-23 Ecolab Usa Inc. Cleaning composition containing a polysaccharide hybrid polymer composition and methods of improving drainage
US8853144B2 (en) 2011-08-05 2014-10-07 Ecolab Usa Inc. Cleaning composition containing a polysaccharide graft polymer composition and methods of improving drainage
US8636918B2 (en) 2011-08-05 2014-01-28 Ecolab Usa Inc. Cleaning composition containing a polysaccharide hybrid polymer composition and methods of controlling hard water scale
US8679366B2 (en) 2011-08-05 2014-03-25 Ecolab Usa Inc. Cleaning composition containing a polysaccharide graft polymer composition and methods of controlling hard water scale
US10246668B2 (en) * 2011-08-24 2019-04-02 Illinois Tool Works, Inc. Proportioner-ready bioenzymatic concentrated cleaning product
PL2584028T3 (pl) 2011-10-19 2017-10-31 Procter & Gamble Cząstka
MX2014005089A (es) 2011-11-04 2014-08-08 Akzo Nobel Chemicals Int Bv Copolimeros de dendrita de injerto, y metodos para producir los mismos.
CN103945828A (zh) 2011-11-04 2014-07-23 阿克佐诺贝尔化学国际公司 混杂树枝状共聚物、其组合物及其制备方法
US20130123162A1 (en) * 2011-11-10 2013-05-16 The Procter & Gamble Company Consumer products
JP6014163B2 (ja) 2011-12-13 2016-10-25 エコラボ ユーエスエー インコーポレイティド 濃縮物品洗浄組成物及び方法
RU2605065C2 (ru) 2012-01-04 2016-12-20 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Волокнистые структуры, содержащие частицы.
DK2623586T3 (da) 2012-02-03 2017-11-13 Procter & Gamble Sammensætninger og fremgangsmåder til overfladebehandling med lipaser
CA2867714A1 (en) 2012-03-19 2013-09-26 The Procter & Gamble Company Laundry care compositions containing dyes
WO2013149858A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
EP2674475A1 (en) 2012-06-11 2013-12-18 The Procter & Gamble Company Detergent composition
MX2015000312A (es) 2012-07-12 2015-04-10 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad lipasa y polinucleotidos que los codifican.
JP2015530424A (ja) 2012-07-26 2015-10-15 ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー 酵素を有する低ｐＨ液体洗浄組成物
US8945314B2 (en) 2012-07-30 2015-02-03 Ecolab Usa Inc. Biodegradable stability binding agent for a solid detergent
DE102012215107A1 (de) 2012-08-24 2014-02-27 Basf Se Festes Geschirrspülmittel mit verbesserter Proteaseleistung
US9745543B2 (en) 2012-09-10 2017-08-29 Ecolab Usa Inc. Stable liquid manual dishwashing compositions containing enzymes
EP2712915A1 (en) 2012-10-01 2014-04-02 The Procter and Gamble Company Methods of treating a surface and compositions for use therein
WO2014055107A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Ecolab Usa Inc. Pre-soak technology for laundry and other hard surface cleaning
MX2015007802A (es) 2012-12-20 2015-09-04 Procter & Gamble Composiciones de detergente con blanqueador recubierto con silicato.
EP2964740B1 (en) 2013-03-05 2017-10-04 The Procter and Gamble Company Mixed sugar-based amide surfactant compositions
CN110105480A (zh) 2013-03-15 2019-08-09 路博润先进材料公司 衣康酸聚合物
US9631164B2 (en) 2013-03-21 2017-04-25 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
MX2015013672A (es) 2013-03-28 2016-02-16 Procter & Gamble Composiciones de limpieza que contiene una polieteramina, un polimero para el desprendimiento de la suciedad y una carboximetilcelulosa.
JP6188199B2 (ja) * 2013-05-20 2017-08-30 ライオン株式会社 食器洗い機用洗浄剤
JP6077177B2 (ja) 2013-05-28 2017-02-08 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー フォトクロミック染料を含む表面処理組成物
MX361658B (es) 2013-08-15 2018-12-13 Int Flavors & Fragrances Inc Capsulas de poliurea o poliuretano.
AU2013399895B2 (en) 2013-09-09 2016-10-13 Ecolab Usa Inc. Synergistic stain removal through novel chelator combination
BR112016005143B1 (pt) 2013-09-09 2021-10-19 Ecolab Usa Inc Composição detergente concentrada, solução aquosa e uso de uma composição detergente concentrada
CN105555935A (zh) 2013-09-18 2016-05-04 宝洁公司 包含羧化物染料的衣物洗涤护理组合物
CA2920901A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 The Procter & Gamble Company Laundry care compositions containing thiophene azo carboxylate dyes
US9834682B2 (en) 2013-09-18 2017-12-05 Milliken & Company Laundry care composition comprising carboxylate dye
WO2015042013A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Lubrizol Advanced Materials, Inc. Stable linear polymers
WO2015042086A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 The Procter & Gamble Company Laundry care composition comprising carboxylate dye
EP2857486A1 (en) 2013-10-07 2015-04-08 WeylChem Switzerland AG Multi-compartment pouch comprising cleaning compositions, washing process and use for washing and cleaning of textiles and dishes
EP2857485A1 (en) 2013-10-07 2015-04-08 WeylChem Switzerland AG Multi-compartment pouch comprising alkanolamine-free cleaning compositions, washing process and use for washing and cleaning of textiles and dishes
EP2857487A1 (en) 2013-10-07 2015-04-08 WeylChem Switzerland AG Multi-compartment pouch comprising cleaning compositions, washing process and use for washing and cleaning of textiles and dishes
US9610228B2 (en) 2013-10-11 2017-04-04 International Flavors & Fragrances Inc. Terpolymer-coated polymer encapsulated active material
ES2658226T3 (es) 2013-10-18 2018-03-08 International Flavors & Fragrances Inc. Formulación fluida y estable de cápsulas de sílice
MX2016004990A (es) 2013-10-24 2016-07-06 Ecolab Usa Inc Composiciones y metodos para eliminar suciedades de las superficies.
EP3068860B1 (en) 2013-11-11 2019-08-21 International Flavors & Fragrances Inc. Multi-capsule compositions
ES2759066T3 (es) 2013-12-19 2020-05-07 Nestle Sa Usos de composiciones y métodos para reducir los alérgenos de gato en el ambiente
EP3097172A1 (en) 2014-01-22 2016-11-30 The Procter & Gamble Company Method of treating textile fabrics
EP3097173B1 (en) 2014-01-22 2020-12-23 The Procter and Gamble Company Fabric treatment composition
EP3097175B1 (en) 2014-01-22 2018-10-17 The Procter and Gamble Company Fabric treatment composition
EP3097174A1 (en) 2014-01-22 2016-11-30 The Procter & Gamble Company Method of treating textile fabrics
CA2841024C (en) 2014-01-30 2017-03-07 The Procter & Gamble Company Unit dose article
WO2015130653A1 (en) 2014-02-25 2015-09-03 The Procter & Gamble Company A process for making renewable surfactant intermediates and surfactants from fats and oils and products thereof
EP3110778A1 (en) 2014-02-25 2017-01-04 The Procter & Gamble Company A process for making renewable surfactant intermediates and surfactants from fats and oils and products thereof
CN106232791B (zh) 2014-02-26 2019-12-10 宝洁公司 包含烷氧基化的聚亚烷基亚胺、有机改性的硅氧烷和基于硅氧烷的稀释剂的清洁组合物
TWI637053B (zh) 2014-03-14 2018-10-01 美商盧伯利索先進材料有限公司 聚合物、製備其聚合物溶液之方法及從溶液中鉗合金屬離子之方法
JP6275864B2 (ja) 2014-03-27 2018-02-07 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー ポリエーテルアミンを含有する洗浄組成物
EP3122850A1 (en) 2014-03-27 2017-02-01 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions containing a polyetheramine
EP2924107A1 (en) 2014-03-28 2015-09-30 The Procter and Gamble Company Water soluble unit dose article
EP2924105A1 (en) 2014-03-28 2015-09-30 The Procter and Gamble Company Water soluble unit dose article
EP3140384B1 (en) 2014-05-06 2024-02-14 Milliken & Company Laundry care compositions
US9365805B2 (en) 2014-05-15 2016-06-14 Ecolab Usa Inc. Bio-based pot and pan pre-soak
WO2015187757A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 The Procter & Gamble Company Detergent composition comprising polyalkyleneimine polymers
BR112016028904A8 (pt) 2014-06-09 2021-05-04 Stepan Co detergente de vestuário, líquido, pó, pasta, grânulo, tablete, sólido moldado, folha solúvel em água, sachê solúvel em água, cápsula, ou casulo solúvel em água e método
CN116240202A (zh) 2014-07-04 2023-06-09 诺维信公司 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸
EP3164486B1 (en) * 2014-07-04 2020-05-13 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
JP6879902B2 (ja) 2014-08-01 2021-06-02 エコラボ ユーエスエー インコーポレイティド 洗浄用布地を用いた手動表面洗浄方法、及び上記洗浄布地を洗う方法
RU2691100C9 (ru) 2014-09-10 2019-10-11 Басф Се Инкапсулированная очищающая композиция
US9617502B2 (en) 2014-09-15 2017-04-11 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing salts of polyetheramines and polymeric acid
BR112017005767A2 (pt) 2014-09-25 2017-12-12 Procter & Gamble composições de limpeza contendo uma polieteramina
US20160090552A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing a polyetheramine and an anionic soil release polymer
US9388368B2 (en) 2014-09-26 2016-07-12 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions containing a polyetheramine
EP3550017B1 (en) * 2014-10-27 2021-07-14 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3256563A1 (en) 2014-11-17 2017-12-20 The Procter and Gamble Company Benefit agent delivery compositions
WO2016111884A2 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Stepan Company Cold-water laundry detergents
WO2016160407A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Stepan Company Detergents based on alpha-sulfonated fatty ester surfactants
US10280386B2 (en) 2015-04-03 2019-05-07 Ecolab Usa Inc. Enhanced peroxygen stability in multi-dispense TAED-containing peroxygen solid
US9783766B2 (en) 2015-04-03 2017-10-10 Ecolab Usa Inc. Enhanced peroxygen stability using anionic surfactant in TAED-containing peroxygen solid
EP3285594B1 (en) 2015-04-24 2021-03-17 International Flavors & Fragrances Inc. Delivery systems and methods of preparing the same
DK3088505T3 (da) 2015-04-29 2020-08-03 Procter & Gamble Fremgangsmåde til behandling af et tekstilstof
ES2683568T3 (es) 2015-04-29 2018-09-26 The Procter & Gamble Company Método para tratar un tejido
EP3088504B1 (en) 2015-04-29 2021-07-21 The Procter & Gamble Company Method of treating a fabric
CN107667166B (zh) 2015-04-29 2021-01-15 宝洁公司 处理织物的方法
CN107820515A (zh) 2015-04-29 2018-03-20 宝洁公司 洗涤剂组合物
CN107532007B (zh) 2015-05-04 2020-06-30 美利肯公司 在洗衣护理组合物中作为上蓝剂的隐色三苯甲烷着色剂
WO2016196555A1 (en) 2015-06-02 2016-12-08 Stepan Company Cold-water cleaning method
CN107835851B (zh) 2015-06-02 2020-03-20 荷兰联合利华有限公司 洗衣洗涤剂组合物
US10226544B2 (en) 2015-06-05 2019-03-12 International Flavors & Fragrances Inc. Malodor counteracting compositions
WO2016198262A1 (en) 2015-06-11 2016-12-15 Unilever Plc Laundry detergent composition
WO2016206837A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Unilever Plc Laundry detergent composition
CN108291178B (zh) * 2015-10-28 2020-08-04 诺维信公司 包含淀粉酶变体和蛋白酶变体的洗涤剂组合物
US10183087B2 (en) * 2015-11-10 2019-01-22 American Sterilizer Company Cleaning and disinfecting composition
US10731111B2 (en) 2015-11-25 2020-08-04 Conopco, Inc. Liquid laundry detergent composition
WO2017100051A2 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Stepan Comapny Cold-water cleaning compositions and methods
US20170204223A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 International Flavors & Fragrances Inc. Polyalkoxy-polyimine adducts for use in delayed release of fragrance ingredients
EP3205392A1 (en) 2016-02-12 2017-08-16 Basf Se Microcapsules and process for preparation of microcapsules
EP3205393A1 (en) 2016-02-12 2017-08-16 Basf Se Process for preparation of microcapsules
EP3417039B1 (en) 2016-02-17 2019-07-10 Unilever PLC Whitening composition
BR112018016674B1 (pt) 2016-02-17 2022-06-07 Unilever Ip Holdings B.V. Composição de detergente para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido
CN108697591B (zh) 2016-02-18 2022-06-17 国际香料和香精公司 聚脲胶囊组合物
US20190085273A1 (en) 2016-03-09 2019-03-21 Basf Se Encapsulated laundry cleaning composition
BR112018068068B1 (pt) 2016-03-21 2023-04-18 Unilever Ip Holdings B.V. Composição aquosa líquida de detergente para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido
US10119100B2 (en) * 2016-04-07 2018-11-06 The Honest Company, Inc. Laundry detergent compositions
EP3440172B1 (en) 2016-04-08 2019-08-21 Unilever PLC Laundry detergent composition
WO2017182295A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Basf Se Liquid cleaning compositions
CN105820888A (zh) * 2016-04-21 2016-08-03 刘爱华 一种去污除菌的衣物洗涤剂
WO2017200737A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Stepan Company Polyetheramine compositions for laundry detergents
EP3275986B1 (en) 2016-07-26 2020-07-08 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3275988B1 (en) 2016-07-26 2020-07-08 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3275985A1 (en) 2016-07-26 2018-01-31 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3275987A1 (en) 2016-07-26 2018-01-31 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3275989A1 (en) 2016-07-26 2018-01-31 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
ES2950434T3 (es) 2016-09-16 2023-10-10 Int Flavors & Fragrances Inc Composiciones de microcápsula estabilizadas con agentes de control de la viscosidad
US20180085291A1 (en) 2016-09-28 2018-03-29 International Flavors & Fragrances Inc. Microcapsule compositions containing amino silicone
US10851329B2 (en) 2016-11-01 2020-12-01 Milliken & Company Leuco colorants as bluing agents in laundry care compositions
WO2018085310A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 The Procter & Gamble Company Leuco colorants as bluing agents in laundry care compositions
US20180119070A1 (en) 2016-11-01 2018-05-03 The Procter & Gamble Company Leuco colorants as bluing agents in laundry care compositions, packaging, kits and methods thereof
US20180119056A1 (en) 2016-11-03 2018-05-03 Milliken & Company Leuco Triphenylmethane Colorants As Bluing Agents in Laundry Care Compositions
US10577571B2 (en) 2016-11-08 2020-03-03 Ecolab Usa Inc. Non-aqueous cleaner for vegetable oil soils
WO2018093356A1 (en) * 2016-11-16 2018-05-24 Colgate-Palmolive Company Oral care composition
US10758462B2 (en) 2016-11-16 2020-09-01 Colgate-Palmolive Company Oral care composition
MX2019006422A (es) 2016-12-02 2019-08-01 Procter & Gamble Composiciones de limpieza que incluyen enzimas.
US10550443B2 (en) 2016-12-02 2020-02-04 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions including enzymes
CA3044415C (en) 2016-12-02 2022-06-07 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions including enzymes
BR112019011999B1 (pt) 2016-12-15 2022-11-08 Unilever Ip Holdings B.V Composição de detergente líquida aquosa para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido
EP3339423A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
GB2572720B (en) 2017-01-27 2022-06-22 Procter & Gamble Active agent-containing articles that exhibit consumer acceptable article in-use properties
US11697906B2 (en) 2017-01-27 2023-07-11 The Procter & Gamble Company Active agent-containing articles and product-shipping assemblies for containing the same
US11697904B2 (en) 2017-01-27 2023-07-11 The Procter & Gamble Company Active agent-containing articles that exhibit consumer acceptable article in-use properties
US11697905B2 (en) 2017-01-27 2023-07-11 The Procter & Gamble Company Active agent-containing articles that exhibit consumer acceptable article in-use properties
ES2965826T3 (es) 2017-02-01 2024-04-17 Procter & Gamble Composiciones limpiadoras que comprenden variantes de amilasa
US20180346648A1 (en) 2017-05-30 2018-12-06 International Flavors & Fragrances Inc. Branched polyethyleneimine microcapsules
BR112020000205B1 (pt) 2017-07-07 2023-10-31 Unilever Ip Holdings B.V. Composição de limpeza para a lavagem de tecidos e método doméstico de tratamento de um tecido
CN110869480B (zh) 2017-07-07 2021-08-13 联合利华知识产权控股有限公司 增白组合物
WO2019075148A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 The Procter & Gamble Company LEUCO-COLORANTS AS AZURING AGENTS IN LAUNDRY CARE COMPOSITIONS
US10717950B2 (en) 2017-10-12 2020-07-21 The Procter & Gamble Company Leuco colorants as bluing agents in laundry care composition
CA3074613A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 The Procter & Gamble Company Leuco colorants in combination with a second whitening agent as bluing agents in laundry care compositions
TWI715878B (zh) 2017-10-12 2021-01-11 美商美力肯及公司 隱色著色劑及組成物
US11053392B2 (en) 2017-11-01 2021-07-06 Milliken & Company Leuco compounds, colorant compounds, and compositions containing the same
EP3717616B1 (en) 2017-11-30 2021-10-13 Unilever IP Holdings B.V. Detergent composition comprising protease
EP3502246A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3502244A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3502245A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3502227A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
WO2019147533A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 The Procter & Gamble Company Water-soluble unit dose articles comprising enzyme
JP2021512986A (ja) 2018-02-28 2021-05-20 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーＴｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ 洗浄方法
US20190264139A1 (en) 2018-02-28 2019-08-29 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions
BR112020023083A2 (pt) 2018-05-17 2021-02-02 Unilever N.V. composição de limpeza fluida, composição detergente líquida para lavanderia e uso de uma combinação de tensoativos
US10870818B2 (en) 2018-06-15 2020-12-22 Ecolab Usa Inc. Enhanced peroxygen stability using fatty acid in bleach activating agent containing peroxygen solid
CN112204138A (zh) 2018-06-19 2021-01-08 宝洁公司 自动盘碟洗涤剂组合物
JP2021527413A (ja) 2018-06-19 2021-10-14 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーＴｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ 自動食器洗浄洗剤組成物
CN110713866B (zh) * 2018-07-13 2022-05-03 花王株式会社 衣料用液体洗涤剂组合物
US20200032178A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 The Procter & Gamble Company Water-soluble unit dose articles comprising water-soluble fibrous structures and particles
WO2020058024A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Unilever Plc Detergent composition
BR112021009837A2 (pt) 2018-11-20 2021-08-17 Unilever Ip Holdings B.V. composição detergente, método de tratamento de um substrato de tecido e uso de uma amida hidrolase de ácido graxo
WO2020104155A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 Unilever Plc Detergent composition
CN113015781B (zh) 2018-11-20 2022-09-13 联合利华知识产权控股有限公司 洗涤剂组合物
WO2020104158A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 Unilever Plc Detergent composition
CN113056548B (zh) 2018-11-20 2023-05-02 联合利华知识产权控股有限公司 洗涤剂组合物
EP3894527A1 (en) 2018-12-14 2021-10-20 The Procter & Gamble Company Foaming fibrous structures comprising particles and methods for making same
BR112021011903A2 (pt) 2018-12-18 2021-08-31 International Flavors & Fragrances Inc. Composição de microcápsula, produto de consumo, e, processo para preparar uma composição de microcápsula
MX2021011106A (es) 2019-03-14 2021-10-22 Procter & Gamble Metodo para tratar el algodon.
US11248194B2 (en) 2019-03-14 2022-02-15 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising enzymes
WO2020186028A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising enzymes
US20220195337A1 (en) 2019-05-16 2022-06-23 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Laundry composition
EP3741283A1 (en) 2019-05-22 2020-11-25 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing method
WO2020243738A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
WO2020264552A1 (en) 2019-06-24 2020-12-30 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising amylase variants
WO2020260040A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Unilever Plc Detergent composition
CN113906124A (zh) 2019-06-28 2022-01-07 联合利华知识产权控股有限公司 洗涤剂组合物
EP3990603B1 (en) 2019-06-28 2022-12-07 Unilever Global Ip Limited Detergent composition
WO2020260006A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Unilever Plc Detergent compositions
CN113993981A (zh) 2019-06-28 2022-01-28 联合利华知识产权控股有限公司 洗涤剂组合物
BR112021022423A2 (pt) 2019-06-28 2022-01-04 Unilever Ip Holdings B V Composição detergente e método doméstico de tratamento de tecidos
US11891588B2 (en) 2019-07-31 2024-02-06 Ecolab Usa Inc. Personal protective equipment free delimer compositions o
US11873465B2 (en) 2019-08-14 2024-01-16 Ecolab Usa Inc. Methods of cleaning and soil release of highly oil absorbing substrates employing optimized extended chain nonionic surfactants
US20220333038A1 (en) 2019-09-02 2022-10-20 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Detergent composition
BR112022004470A2 (pt) 2019-09-19 2022-05-31 Unilever Ip Holdings B V Composição detergente e método para lavagem não oxidativa de manchas de tecido
AR120142A1 (es) 2019-10-07 2022-02-02 Unilever Nv Composición detergente
US20210122998A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition comprising an amylase
US11492571B2 (en) 2019-10-24 2022-11-08 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition comprising a protease
US20210148044A1 (en) 2019-11-15 2021-05-20 The Procter & Gamble Company Graphic-Containing Soluble Articles and Methods for Making Same
EP3835396A1 (en) 2019-12-09 2021-06-16 The Procter & Gamble Company A detergent composition comprising a polymer
US20230407208A1 (en) 2020-01-29 2023-12-21 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Laundry detergent product
EP3862412A1 (en) 2020-02-04 2021-08-11 The Procter & Gamble Company Detergent composition
JP2023526020A (ja) 2020-06-05 2023-06-20 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 分岐界面活性剤を含有する洗剤組成物
CN115698246A (zh) 2020-06-08 2023-02-03 联合利华知识产权控股有限公司 提高蛋白酶活性的方法
CA3185062A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Gang Pu Foaming mixed alcohol/water compositions comprising a structured alkoxylated siloxane
CN116075583A (zh) 2020-07-06 2023-05-05 埃科莱布美国股份有限公司 包含烷基硅氧烷和水溶助剂/增溶剂的组合的发泡混合醇/水组合物
WO2022010906A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Ecolab Usa Inc. Peg-modified castor oil based compositions for microemulsifying and removing multiple oily soils
JP2023536081A (ja) 2020-08-04 2023-08-23 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 自動食器洗浄方法
CA3187735A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Nina Elizabeth GRAY Automatic dishwashing method and pack
WO2022031309A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing method
CN116096846A (zh) 2020-08-04 2023-05-09 宝洁公司 自动盘碟洗涤方法
WO2022043045A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Unilever Ip Holdings B.V. Detergent composition
US20230287302A1 (en) 2020-08-28 2023-09-14 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Detergent composition
WO2022043042A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Unilever Ip Holdings B.V. Detergent composition
EP4204526B1 (en) 2020-08-28 2024-04-24 Unilever IP Holdings B.V. Surfactant and detergent composition
EP4204396B1 (en) 2020-08-28 2024-05-29 Unilever IP Holdings B.V. Surfactant and detergent composition
EP4237498A1 (en) 2020-10-27 2023-09-06 Milliken & Company Compositions comprising leuco compounds and colorants
WO2022094588A1 (en) 2020-10-29 2022-05-05 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions containing alginate lyase enzymes
EP4001388A1 (en) 2020-11-17 2022-05-25 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing method with amphiphilic graft polymer in the rinse
US20220169952A1 (en) 2020-11-17 2022-06-02 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing composition comprising amphiphilic graft polymer
JP2023547853A (ja) 2020-11-17 2023-11-14 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー アルカリ性すすぎによる自動食器洗浄方法
EP4006131A1 (en) 2020-11-30 2022-06-01 The Procter & Gamble Company Method of laundering fabric
EP4256020A1 (en) 2020-12-07 2023-10-11 Unilever IP Holdings B.V. Detergent compositions
CN116529351A (zh) 2020-12-07 2023-08-01 联合利华知识产权控股有限公司 洗涤剂组合物
MX2023006625A (es) 2020-12-23 2023-07-04 Procter & Gamble Poliaminas alcoxiladas anfifilicas y sus usos.
CA3199985A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Lars Lehmann Hylling Christensen Cleaning compositions containing polypeptide variants
WO2022235720A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 The Procter & Gamble Company Methods for making cleaning compositions and detecting soils
EP4086330A1 (en) 2021-05-06 2022-11-09 The Procter & Gamble Company Surface treatment
EP4341371A1 (en) 2021-05-18 2024-03-27 Nouryon Chemicals International B.V. Polyester polyquats in cleaning applications
WO2022243533A1 (en) 2021-05-20 2022-11-24 Nouryon Chemicals International B.V. Manufactured polymers having altered oligosaccharide or polysaccharide functionality or narrowed oligosaccharide distribution, processes for preparing them, compositions containing them, and methods of using them
EP4108767A1 (en) 2021-06-22 2022-12-28 The Procter & Gamble Company Cleaning or treatment compositions containing nuclease enzymes
CN117940546A (zh) 2021-06-30 2024-04-26 诺力昂化学品国际有限公司 螯合物-两性表面活性剂液体浓缩物及其在清洁应用中的用途
EP4123007A1 (en) 2021-07-19 2023-01-25 The Procter & Gamble Company Fabric treatment using bacterial spores
EP4123006A1 (en) 2021-07-19 2023-01-25 The Procter & Gamble Company Composition comprising spores and pro-perfume materials
EP4124383A1 (en) 2021-07-27 2023-02-01 International Flavors & Fragrances Inc. Biodegradable microcapsules
CA3228918A1 (en) 2021-08-10 2023-02-16 Nippon Shokubai Co., Ltd. Polyalkylene-oxide-containing compound
CN117957300A (zh) 2021-09-20 2024-04-30 联合利华知识产权控股有限公司 洗涤剂组合物
EP4154974A1 (en) 2021-09-23 2023-03-29 International Flavors & Fragrances Inc. Biodegradable microcapsules
WO2023057367A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Unilever Ip Holdings B.V. Laundry composition
CN118119692A (zh) 2021-10-14 2024-05-31 宝洁公司 包含阳离子去垢性聚合物和脂肪酶的织物和家庭护理产品
EP4194537A1 (en) 2021-12-08 2023-06-14 The Procter & Gamble Company Laundry treatment cartridge
EP4194536A1 (en) 2021-12-08 2023-06-14 The Procter & Gamble Company Laundry treatment cartridge
CA3240641A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Michelle Jackson Automatic dishwashing composition comprising a protease
WO2023114792A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 The Procter & Gamble Company Home care composition comprising an amylase
US20230272310A1 (en) 2021-12-16 2023-08-31 The Procter & Gamble Company Home care composition
US20230365897A1 (en) 2021-12-16 2023-11-16 The Procter & Gamble Company Fabric and home care composition including a protease
EP4212239A1 (en) 2022-01-14 2023-07-19 International Flavors & Fragrances Inc. Biodegradable prepolymer microcapsules
EP4273209A1 (en) 2022-05-04 2023-11-08 The Procter & Gamble Company Machine-cleaning compositions containing enzymes
EP4273210A1 (en) 2022-05-04 2023-11-08 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing enzymes
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
EP4279571A1 (en) 2022-05-19 2023-11-22 The Procter & Gamble Company Laundry composition comprising spores
WO2023227421A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Unilever Ip Holdings B.V. Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer, and a fragrance
WO2023227335A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Unilever Ip Holdings B.V. Liquid composition comprising linear alkyl benzene sulphonate, methyl ester ethoxylate and alkoxylated zwitterionic polyamine polymer
WO2023227331A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Unilever Ip Holdings B.V. Composition comprising a specific methyl ester ethoxylate surfactant and a lipase
WO2023227356A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Unilever Ip Holdings B.V. Composition containing enzyme
WO2023227332A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Unilever Ip Holdings B.V. Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer and a protease
WO2023227375A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Unilever Ip Holdings B.V. Laundry liquid composition comprising a surfactant, an aminocarboxylate, an organic acid and a fragrance
WO2023233025A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Unilever Ip Holdings B.V. Liquid detergent product
WO2024020445A1 (en) 2022-07-20 2024-01-25 Ecolab Usa Inc. Novel nonionic extended surfactants, compositions and methods of use thereof
EP4321604A1 (en) 2022-08-08 2024-02-14 The Procter & Gamble Company A fabric and home care composition comprising surfactant and a polyester
WO2024056333A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Unilever Ip Holdings B.V. Washing machine and washing method
WO2024056278A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Unilever Ip Holdings B.V. Washing machine and washing method
WO2024056332A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Unilever Ip Holdings B.V. Washing machine and washing method
WO2024056334A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Unilever Ip Holdings B.V. Washing machine and washing method
EP4349947A1 (en) 2022-10-05 2024-04-10 Unilever IP Holdings B.V. Laundry liquid composition
EP4349944A1 (en) 2022-10-05 2024-04-10 Unilever IP Holdings B.V. Laundry liquid composition
EP4349943A1 (en) 2022-10-05 2024-04-10 Unilever IP Holdings B.V. Laundry liquid composition
EP4349946A1 (en) 2022-10-05 2024-04-10 Unilever IP Holdings B.V. Unit dose fabric treatment product
EP4349948A1 (en) 2022-10-05 2024-04-10 Unilever IP Holdings B.V. Laundry liquid composition
EP4349945A1 (en) 2022-10-05 2024-04-10 Unilever IP Holdings B.V. Laundry liquid composition
EP4349942A1 (en) 2022-10-05 2024-04-10 Unilever IP Holdings B.V. Laundry liquid composition
WO2024088706A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Unilever Ip Holdings B.V. Composition
EP4361239A1 (en) 2022-10-25 2024-05-01 Unilever IP Holdings B.V. Laundry liquid composition
WO2024088716A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Unilever Ip Holdings B.V. Composition
WO2024094800A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 The Procter & Gamble Company Fabric and home care composition
WO2024094802A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 The Procter & Gamble Company Fabric and home care composition
WO2024094803A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 The Procter & Gamble Company Fabric and home care composition
WO2024115106A1 (en) 2022-11-29 2024-06-06 Unilever Ip Holdings B.V. Composition
WO2024119298A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 The Procter & Gamble Company Fabric and home care composition comprising a polyalkylenecarbonate compound
EP4386074A1 (en) 2022-12-16 2024-06-19 The Procter & Gamble Company Fabric and home care composition
CN117701487B (zh) * 2024-02-05 2024-05-03 内蒙古昆明卷烟有限责任公司 一种高效表达淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌及其应用

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US34606A (en) * 1862-03-04 Improvement in machines for combing cotton
US4760025A (en) * 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
US5204015A (en) * 1984-05-29 1993-04-20 Genencor International, Inc. Subtilisin mutants
US5155033A (en) * 1989-01-06 1992-10-13 Genencor, Inc. Subtilisins modified at position 225 resulting in a shift in catalytic activity
US5182204A (en) * 1984-05-29 1993-01-26 Genencor International, Inc. Non-human carbonyl hydrolase mutants, vectors encoding same and hosts transformed with said vectors
US5185258A (en) * 1984-05-29 1993-02-09 Genencor International, Inc. Subtilisin mutants
US4634551A (en) * 1985-06-03 1987-01-06 Procter & Gamble Company Bleaching compounds and compositions comprising fatty peroxyacids salts thereof and precursors therefor having amide moieties in the fatty chain
US5013657A (en) * 1988-04-12 1991-05-07 Bryan Philip N Subtilisin mutations
US4990452A (en) * 1986-02-12 1991-02-05 Genex Corporation Combining mutations for stabilization of subtilisin
IE65767B1 (en) * 1986-04-30 1995-11-15 Genencor Int Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors
US4686063A (en) * 1986-09-12 1987-08-11 The Procter & Gamble Company Fatty peroxyacids or salts thereof having amide moieties in the fatty chain and low levels of exotherm control agents
US5260207A (en) * 1987-04-06 1993-11-09 Enzon Labs Inc. Engineering of electrostatic interactions at metal ion binding sites for the stabilization of proteins
DE3856593D1 (de) * 1987-04-06 2007-10-04 Novozymes As Regelung von elektrostatischen interaktionen an metallionen-Bindungsstellen zur Stabilisierung von Proteinen
US4914031A (en) * 1987-04-10 1990-04-03 Amgen, Inc. Subtilisin analogs
DK571587D0 (da) * 1987-11-02 1987-11-02 Novo Industri As Enzymatisk detergentsammensaetning
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
US4844821A (en) * 1988-02-10 1989-07-04 The Procter & Gamble Company Stable liquid laundry detergent/fabric conditioning composition
GB8803114D0 (en) * 1988-02-11 1988-03-09 Bp Chem Int Ltd Bleach activators in detergent compositions
US5324653A (en) * 1988-02-11 1994-06-28 Gist-Brocades N.V. Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins
PT89702B (pt) * 1988-02-11 1994-04-29 Gist Brocades Nv Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem
US5116741A (en) * 1988-04-12 1992-05-26 Genex Corporation Biosynthetic uses of thermostable proteases
GB8810954D0 (en) * 1988-05-09 1988-06-15 Unilever Plc Enzymatic detergent & bleaching composition
US5118623A (en) * 1988-05-27 1992-06-02 Solvay Enzymes, Inc. Bleach stable enzymes
JPH03505976A (ja) * 1989-05-17 1991-12-26 アムジエン・インコーポレーテツド 多重突然変異スブチリシン
EP0405901B1 (en) * 1989-06-26 2004-09-01 Unilever Plc Enzymatic detergent compositions
DK316989D0 (da) * 1989-06-26 1989-06-26 Novo Nordisk As Enzymer
EP0405902A1 (en) * 1989-06-26 1991-01-02 Unilever Plc Enymatic detergent compositions
JPH0372876A (ja) * 1989-08-11 1991-03-28 Mitsubishi Gas Chem Co Inc 新規アルカリ性プロテアーゼ
DK271490D0 (da) * 1990-11-14 1990-11-14 Novo Nordisk As Detergentkomposition
ATE159757T1 (de) * 1990-12-21 1997-11-15 Novo Nordisk As Enzym-mutanten mit einer geringen variation der molekularladung über einen ph-bereich
ES2090481T3 (es) * 1991-05-01 1996-10-16 Unilever Nv Composiciones detergentes que contienen enzimas estabilizadas.
JP3471797B2 (ja) * 1991-05-01 2003-12-02 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 安定化酵素及び洗剤
US5340735A (en) * 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
JP4028592B2 (ja) * 1992-07-17 2007-12-26 ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド 高アルカリ性セリンプロテアーゼ
BR9307300A (pt) * 1992-10-23 1999-06-01 Procter & Gamble Detergentes granulares com enzima protease e alvejante
DK39093D0 (da) * 1993-04-01 1993-04-01 Novo Nordisk As Enzym
US5505938A (en) * 1993-09-30 1996-04-09 Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. Straight chain saturated or unsaturated C8 -C18 alkyl aldonolactone esters and an enzymatic process for their preparation
HU219851B (hu) * 1993-10-14 2001-08-28 The Procter And Gamble Company Proteáz tartalmú tisztítókészítmények
MA23346A1 (fr) * 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
HU219852B (hu) * 1993-10-14 2001-08-28 The Procter And Gamble Company Proteáz enzimeket tartalmazó fehérítő készítmények
ATE195970T1 (de) * 1993-11-03 2000-09-15 Procter & Gamble Kalziumkarbonatabsetzungskontroll im maschinengeschirrspülen
WO1995012653A1 (en) * 1993-11-03 1995-05-11 The Procter & Gamble Company Control of calcium carbonate precipitation in automatic dishwashing
US5460747A (en) * 1994-08-31 1995-10-24 The Procter & Gamble Co. Multiple-substituted bleach activators
US5686015A (en) * 1994-08-31 1997-11-11 The Procter & Gamble Company Quaternary substituted bleach activators
US5578136A (en) * 1994-08-31 1996-11-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing compositions comprising quaternary substituted bleach activators
EP0791046B1 (en) * 1994-11-18 2000-04-05 THE PROCTER &amp; GAMBLE COMPANY Detergent compositions containing lipase and protease
EP2278001B1 (en) * 1996-11-04 2013-10-23 Novozymes A/S Protease variants and compositions
JP2001503269A (ja) * 1996-11-04 2001-03-13 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ ズブチラーゼ変異体及び、組成物

Also Published As

Publication number Publication date
CZ105396A3 (en) 1996-09-11
HUT75984A (en) 1997-05-28
US5679630A (en) 1997-10-21
CA2173105A1 (en) 1995-04-20
JPH11246895A (ja) 1999-09-14
BR9407834A (pt) 1997-05-13
EP0723579B1 (en) 2007-05-02
JP2888985B2 (ja) 1999-05-10
HU9600960D0 (en) 1996-06-28
TW306931B (hu) 1997-06-01
CA2173105C (en) 2003-05-27
CN1137289A (zh) 1996-12-04
ATE361355T1 (de) 2007-05-15
CN1082999C (zh) 2002-04-17
ES2287931T3 (es) 2007-12-16
DE69434962D1 (de) 2007-06-14
US6017871A (en) 2000-01-25
JPH09505841A (ja) 1997-06-10
WO1995010591A1 (en) 1995-04-20
DE69434962T2 (de) 2008-01-17
AU8079794A (en) 1995-05-04
JP3776244B2 (ja) 2006-05-17
EP0723579A1 (en) 1996-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU219851B (hu) Proteáz tartalmú tisztítókészítmények
JP2888986B2 (ja) プロテアーゼ酵素を含んでなる漂白組成物
US6436690B1 (en) BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
CA2189427C (en) Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6455295B1 (en) Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
KR100344976B1 (ko) 서브틸리신변종
ES2310014T5 (es) Composiciones de limpieza que contienen variantes de proteasas multiplemente substituidas.
EP0719339B1 (en) Subtilisin bpn&#39; variants with decreased adsorption and increased hydrolysis
US6451574B1 (en) Proteinase K variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6475765B1 (en) Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
WO1996028558A9 (en) Thermitase variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6440717B1 (en) BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis