CN103764823B - 包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言为由其产生的枯草杆菌蛋白酶变体。具体而言，本发明提供与参考丝氨酸蛋白酶相比具有一个或多个置换的丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言为枯草杆菌蛋白酶变体。另外，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体、更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体中的至少一者的清洁组合物。

Description

包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法
技术领域
本发明提供丝氨酸蛋白酶变体。具体而言，本发明提供与参考丝氨酸蛋白酶相比具有一个或多个置换的丝氨酸蛋白酶变体。此外，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体(更具体而言是枯草杆菌蛋白酶变体)中的至少一者的清洁组合物。
发明背景
尽管丝氨酸蛋白酶在工业酶领域中已久为人所知，但对于适于特定条件和用途的工程蛋白酶仍存在需要。
发明内容
在一些实施例中，本发明包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表1-19的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
在一些实施例中，本发明包括迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ IDNO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表1-19，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
在一些实施例中，本发明包括编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表1-19的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。在一些实施例中，本发明为用于产生上述变体任一者的表达载体、宿主细胞或方法。
在一些实施例中，本发明包括编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表1-19，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。在一些实施例中，本发明为用于产生上述变体任一者的表达载体、宿主细胞或方法。
在上文所列的每个实施例中，与具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的GG36蛋白酶相比，所述变体可具有改善的清洁性。
在一些实施例中，本发明包括上述变体或编码所述变体的核酸中的任一者，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4或-5。
在一些实施例中，本发明包括具有上文所列变体中的至少一者的组合物，其中所述组合物不是织物和家庭护理产品。在一些实施例中，本发明为使用上述组合物的清洁方法。
附图说明
图1提供了包括BPN’(SEQ ID NO：1)和GG36(SEQ ID NO：2)在内的成熟参考蛋白酶的比对。每种蛋白酶变体(更具体而言，本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体，包括每种冷水蛋白酶变体)的每个氨基酸位置均根据如图1中所显示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号，如通过将所述蛋白酶变体氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列进行比对所确定的。因而，除非本文另外指明，否则置换位置是以与BPN’的关系给出。
具体实施方式
本发明提供丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体。具体而言，本发明提供与参考丝氨酸蛋白酶相比具有一个或多个置换的丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体。另外，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)的组合物。在一些实施例中，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体(更具体而言是枯草杆菌蛋白酶变体)中的至少一者的清洁组合物。
定义
除非另外指明，否则本发明的实施涉及处于本领域技术范围内的常用于分子生物学、蛋白质工程改造、微生物学和重组DNA的常规技术。这类技术是本领域技术人员已知的并描述于本领域技术人员众所周知的许多文章和参考著作中。将本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，包括上文中和下文中的，都特此明确地以引用的方式并入本文。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。许多技术词典是本领域技术人员已知的。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施，但还是在本文中描述了一些合适的方法和材料。相应地，通过整体参考本说明书来更完整地描述接下来定义的术语。另外，如本文所用，除非上下文明确指明，否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数含义。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5′至3′取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些方面可根据本领域技术人员使用它们的背景而有所变化。
除非另外指明，否则本发明的实施可采用蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术以及蛋白质测序的常规技术，所有这些均在本领域技术人员的技能之内。
此外，本文提供的标题并是对本发明的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例都可以通过整体参考说明书而获取。因此，通过整体参考本说明书可更完全地限定下文定义的术语。尽管如此，为了便于理解本发明，将多个术语定义如下。
如本文所用，术语“蛋白酶”和“朊酶”是指具有分解其他蛋白质的能力的酶蛋白。蛋白酶具有进行“蛋白水解”的能力，其通过水解在形成该蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而开始蛋白质分解代谢。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性称为“蛋白水解活性”。存在许多众所周知的用于测量蛋白水解活性的方法(参见例如，Kalisz，“Microbial Proteinases(微生物蛋白酶)”，载于：Fiechter(编辑)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology(《生物化学工程/生物技术进展》)(1988))。例如，蛋白水解活性可通过可分析各蛋白酶水解商业底物的能力的比较测定法来确定。可用于蛋白酶或蛋白水解活性的分析的示例性底物包括但不限于：二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical902111)。利用这些底物的比色测定法为本领域所熟知的(参见例如WO99/34011和美国专利No.6,376,450，将这二者以引用的方式并入本文)。pNA测定法(参见例如DelMar等人，Anal.Biochem.(《分析生物化学》)99：316-320[1979])也可以用于测定在梯度洗脱期间收集的级分的活性酶浓度。该测定法测量当该酶水解可溶性的合成底物即琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时对硝基苯胺释放的速率。用分光光度计在410nm处测量从该水解反应产生黄色的速率，其与活性酶浓度成比例。此外，280纳米(nm)处的吸光度测量值可用于测定总蛋白质浓度。活性酶/总蛋白质比率给出了酶纯度。
如本文中所用，术语“枯草杆菌蛋白酶”是指如在MEROPS-肽酶数据库(MEROPS-ThePeptidase Data base)中所述的S8丝氨酸蛋白酶家族的任何成员(参见Rawlings等人，MEROPS：the peptidase database(MEROPS：肽酶数据库)，Nucl Acids Res(《核酸研究》)，34Database issue(数据库期)，D270-272[2006])。如其中所述，肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物(Rawlings和Barrett，Biochem J.(《(生物化学杂志》)，290：205-218，[1993])。S8家族也称为枯草杆菌酶(subtilase)家族，是丝氨酸肽酶的第二大家族。现在已经测定了S8家族若干成员的三级结构。典型的S8蛋白质结构由三个层组成，其中一个七股β片层夹在两层螺旋之间。枯草杆菌蛋白酶(S08.001)是异种集团(clan)SB(SB)的典型结构。尽管结构不同，但枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(S01.001)的活性位点可叠合，这表明该相似性是趋同进化而不是趋异进化的结果。
本文所用的术语“蛋白酶变体”、“变体蛋白酶”、“变体丝氨酸蛋白酶”、“丝氨酸蛋白酶变体”、“枯草杆菌蛋白酶变体”、“突变蛋白酶”用于指与参考蛋白酶(可以为野生型枯草杆菌蛋白酶)相似的蛋白酶(尤其是在其功能上)，但在其氨基酸序列中有使得它们在序列上与衍生该变体蛋白酶的野生型蛋白酶或任何起始参考蛋白酶(即“亲本”蛋白酶)不同的突变。在一些实施例中，本发明提供了“GG36变体”(或“GG36枯草杆菌蛋白酶变体”)，其中在SEQ ID NO：2所示的成熟GG36序列中存在突变。然而，并不旨在使参考蛋白酶局限于任何特定的氨基酸序列。此外，该术语旨在涵盖亲本蛋白酶的变体，其中所述亲本蛋白酶的序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
如本文所以，术语“冷水蛋白酶变体”意指亲本蛋白酶的蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列，其中所述蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)具有如下特性中的一者或多者：a)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法2性能指数；b)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法3性能指数；c)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法4性能指数；和/或d)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法6性能指数；和/或e)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约15、1.1至约10或甚至1.1至约7的测试方法7性能指数。在下文实例1中标题为“测试方法”的部分中明确描述了测试方法2、测试方法3、测试方法4、测试方法6和测试方法7。此外，该术语旨在涵盖亲本蛋白酶的变体，其中所述亲本蛋白酶的序列与SEQ ID N0：2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述亲本蛋白酶(即“参考”或“起始”蛋白酶)为可商购获得的蛋白酶，包括但不限于：以如下商标名销售的蛋白酶： (诺维信公司(Novozymes A/S)销售)； 和PURAFECTPURAFASTTM、PRIME、(由美国丹尼斯克杰能科分公司(Danisco US，Genencor Division)销售的蛋白酶；以及可得自汉高/凯米拉公司(Henkel/Kemira)的那些，即BLAP(US5,352,604的图29中所示的氨基酸序列，具有如下突变S99D+S101R+S103A+V104I+G159S，下文中称为BLAP)和BLAP X(具有S3T+V4I+V205I的BLAP)。
本文所用的术语“变体多肽”是指包含与亲本或参考多肽(包括但不限于野生型多肽)的氨基酸序列相差至少一个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。
如本文中所用，芽孢杆菌属(Bacillus)包括本领域技术人员已知的芽孢杆菌属内的所有种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经认识到，芽孢杆菌属还在继续进行分类学整理。因此，该属旨在包括已经重新分类的种，包括(但不限于)诸如现在命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”的嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物体。在存在氧气的情况下产生抗性内生孢子被视为芽孢杆菌属的定义性特征，但该特性还适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，指在链中共价键合的核苷酸单体的任何长度的聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)(包含脱氧核糖核苷酸的多核苷酸)和RNA(核糖核酸)(核糖核苷酸的聚合物)是具有独特生物学功能的多核苷酸或核酸的例子。多核苷酸或核酸包括(但不限于)：单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其他天然的、经化学修饰的、经生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。如下是多核苷酸的非限制性例子：基因、基因片段、染色体片段、表达序列标签(EST)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。在一些实施例中，多核苷酸包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶基(uracyl)、其他糖和连接基如氟代核糖和硫代酸酯(thioate)，以及核苷酸支链。在具体实施例中，核苷酸的序列夹杂有非核苷酸组分。
本文所用的术语“突变”是指在起始氨基酸或核酸序列中作出的变化。该术语旨在涵盖置换、***和缺失。
如本文所用，术语“载体”指用于将核酸或多核苷酸引入或转移进靶细胞或组织中的核酸构建体或多核苷酸构建体。载体通常用于将外来DNA引入另一细胞或组织中。载体通常包含作为转基因的DNA序列和充当该载体“骨架”的较大的多核苷酸序列。载体通常起到转移遗传信息(如***的转基因)至靶细胞或组织的作用，以便在该靶细胞或组织中分离、增殖或表达该***物。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(如病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体、盒(cassette)等等。载体通常包含复制起点、多克隆位点和选择性标记。将载体***靶细胞的过程通常称为转染。使用病毒载体进行的细胞转染通常称为转导。在一些实施例中，本发明包括载体，该载体包含编码变体蛋白酶(如前体或成熟变体蛋白酶)的DNA序列，该DNA序列与能够实现其在合适宿主中表达的合适前序列(如分泌序列、信号肽序列等)有效连接。
本文所用的术语“表达盒”、“表达质粒”或“表达载体”是指以重组方式或以合成方式产生的、用于所关注的核酸(如外来核酸或转基因)在靶细胞中表达的核酸构建体或载体。所关注的核酸通常表达所关注的蛋白质。表达载体或表达盒通常包含驱动或促进外来核酸的表达的启动子核苷酸序列。表达载体或表达盒还通常包含允许特定核酸在靶细胞中的转录的任何其他规定的核酸元件。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。某些表达载体具有使异源DNA片段***宿主细胞中以及使其在宿主细胞中表达的能力。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。适宜的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。用于从掺入表达载体中的核酸序列表达蛋白质的适当表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
DNA构建体是可被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。DNA构建体通常包含已被亚克隆进载体中的DNA***物，该DNA***物包含编码所关注的蛋白质的核苷酸序列。载体可含有用于在细菌中生长的细菌抗性基因和用于所关注的蛋白质在生物体中的表达的启动子。DNA可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其他合适的技术体外产生。在一些实施例中，DNA构建体包含所关注的核酸序列。在一些实施例中，该序列与另外的元件例如控制元件(如启动子等)有效连接。DNA构建体可还包含选择性标记并且可还包含侧接有同源盒(homology box)的输入序列(incoming sequence)。构建体可包含添加至末端的其他非同源序列(如填充序列(stuffer sequence)或旁侧序列(flank))。在一些实施例中，序列的末端是闭合的，使得DNA构建体形成闭环。用本领域熟知的技术掺入DNA构建体中的所关注的核酸序列可以是野生型的、突变型的或经修饰的核酸。在一些实施例中，DNA构建体包含一条或多条与宿主细胞染色体同源的核酸序列。在其他实施例中，DNA构建体包含一条或多条非同源核苷酸序列。一旦体外装配了DNA构建体，则可将其用于例如：1)将异源序列***宿主细胞的所需靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即用异源序列置换内源序列)；3)使靶基因缺失；和/或4)将复制型质粒引入宿主中。在本文中“DNA构建体”可与“表达盒”互换使用。
如本文所用，“质粒”指染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。质粒是双链的(ds)并且可以是环状的，通常用作克隆载体。
如本文在将核酸序列引入细胞的语境中所用，术语“引入”指任何适于将核酸序列转移进细胞中的方法。这类引入方法包括但不限于：原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导(参见例如Ferrari等人“Genetics”(“遗传学”)，载于Hardwood等人(编辑)Bacillus(《芽孢杆菌》)，普莱南出版公司(Plenum Publishing Corp.)，第57-72页[1989])。
转化是指因遗传物质(如DNA)的吸收、基因组掺入和表达所致的细胞的遗传变更。
如本文所用，当核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系中时，该核酸与另一核酸序列“有效连接”。例如，如果启动子影响核苷酸编码序列的转录，则该启动子或增强子与该编码序列有效连接。如果核糖体结合位点被设置成使得有利于编码序列的翻译，则该核糖***点可与该编码序列有效连接。通常，“有效连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在便利的限制位点处的连接来实现。如果这类位点不存在，则可根据常规操作使用合成的寡核苷酸接头或连接物。
如本文所用，术语“基因”是指多核苷酸(例如，DNA片段)，其编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域以及各个编码片段(外显子)之间的***序列(内含子)。
如本文所用，在用于指细胞时“重组的”通常指该细胞已通过引入异源核酸序列而进行了修饰或指该细胞衍自经过如此修饰的细胞。例如，重组细胞可包含这样的基因，其不以相同的形式存在于天然(非重组)形式的该细胞内，或者重组细胞可包含(存在于天然形式的细胞中的)天然基因，但该基因已经过修饰并被再次引入该细胞中。重组细胞可包含对该细胞而言是内源性的核酸，该核酸在未将其从该细胞移除的情况下进行了修饰；这种修饰包括通过基因置换、定点突变以及本领域一般技术人员已知的相关技术获得的那些修饰。重组DNA技术包括用于在体外产生重组DNA和将重组DNA转移进细胞的技术，重组DNA在细胞中可以表达或增殖，从而产生重组的多肽。多核苷酸或核酸的“重组”和“重组的”一般是指两条或更多条核酸或多核苷酸链或片段的组装或组合，以产生新的多核苷酸或核酸。重组多核苷酸或核酸有时称为嵌合体。当核酸或多肽为人工的或工程化改造的，或衍生自人工的或工程化改造的蛋白质或核酸时，该核酸或多肽是“重组的”。
如本文所用，术语核酸或基因“扩增”是指这样的一种过程，通过该过程特定DNA序列以不成比例的方式复制，使得被扩增的核酸或基因以高于基因组中最初存在的拷贝数的拷贝数存在。在一些实施例中，通过在药物(例如，可抑制的酶的抑制剂)的存在下培养而进行的细胞的选择，导致编码在所述药物的存在下生长所需的基因产物的内源性基因的扩增，或编码该核酸或基因产物的外源(即，输入)序列的扩增或二者皆有。
“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特定情形。与其形成对照的是非特异性模板复制(即，复制是模板依赖的，但不依赖于特异性模板)。模板特异性在这里区别于复制的保真性(即，正确的多核苷酸序列的合成)和(核糖或脱氧核糖)核苷酸特异性。模板特异性在很多情况下以“靶”特异性描述。靶序列是此种意义的“靶”，也就是可设法将它们从其他核酸挑选出来。已经设计出主要用于该挑选的扩增技术。
如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸(核苷酸残基的聚合物)，无论是天然产生的(如在纯化的限制性消化产物中)还是合成产生的，其能够在被置于与核酸链互补的引物延伸产物的合成在其中被诱发的条件下时(即，在核苷酸和诱发剂如DNA聚合酶的存在下并且在适合的温度和pH下)，作为合成起始的点起作用。为了使扩增效率最高，引物优选为单链的，但作为另一种选择其也可以是双链的。如果是双链，则首先对引物进行处理以分离其链，然后再用于制备延伸产物。在一些实施例中，引物为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源以及使用的方法。
如本文所用，术语“探针”指这样的寡核苷酸，无论是如在纯化的限制酶切消化物中的天然存在的还是以合成方式、重组方式或通过PCR扩增产生的，其通常能够与所关注的另一寡核苷酸杂交。探针可以是单链的或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴别和分离。设想到，本发明中所用的任何探针将用任何“报告分子”进行标记，从而其可在任何检测***中检测，所述检测***包括但不限于酶***(如ELISA，以及基于酶的组织化学测定法)、荧光***、放射性***和发光***。无意于将本发明局限于任何具体的检测***或标记。
如本文所用，当用于讨论聚合酶链反应时，术语“靶”是指用于聚合酶链反应的引物结合的核酸区域。因此，可设法将“靶”从其他核酸序列中挑选出来。核苷酸“片段”是在靶核酸序列内的核酸区域。
如本文所用，术语“聚合酶链反应”(PCR)是指美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.4,965,188的方法(特此将该专利以引用方式并入)，其包括在不进行克隆或纯化的情况下增加靶序列的某个片段在基因组DNA的混合物中的浓度的方法。扩增靶序列的这种方法是本领域众所周知的。
如本文所用，术语“扩增试剂”指扩增所需的除引物、核酸模板以及扩增酶以外的那些试剂(如脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲剂等)。通常，将扩增试剂连同其他反应组分放置于和装于反应容器(试管、微孔等)中。
如本文所用，术语“限制性内切酶”或“限制酶”指能够在称为限制位点的特定核苷酸序列处或附近切开双链或单链DNA的酶(如细菌酶)。包含限制位点的核苷酸序列为给定的限制性内切酶或限制酶所识别和切割并且常常是***DNA片段的位点。可将限制位点工程引入进表达载体或DNA构建体中。
“同源重组”是指两个DNA分子或成对染色体之间的DNA片段在相同或几乎相同的核苷酸序列位点处的交换。在一些实施例中，染色体整合是同源重组。
如果核酸或多核苷酸在天然状态下或通过本领域的技术人员已知的方法操纵时，可转录和/或翻译产生多肽或其片段，则称该核酸或多核苷酸“编码”多肽。也称此类核酸的反义链编码该序列。
如本领域已知的，DNA序列可被RNA聚合酶转录而产生RNA序列，但RNA序列可被逆转录酶逆转录而产生DNA序列。
“宿主菌株”或“宿主细胞”指适合于包含所关注的DNA序列的表达载体的宿主。所关注的DNA序列可在宿主菌株或宿主细胞中表达所关注的蛋白质。
“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的多聚序列。在本文中，术语“蛋白质”与“多肽”可互换使用。遵照国际纯化学及应用化学联合会-国际生物化学联合会的生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)所定义的氨基酸的单字母和三字母代码在整个本公开中使用。单字母X指二十种氨基酸中的任一种。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。突变按以下方式命名：亲本氨基酸的单字母代码，后跟三位数或两位数的位置编号，然后是变体氨基酸的单字母代码。例如，使位置87的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。多重突变通过在各突变之间***“-”表示。在位置87和90的突变表示为“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”或“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。对于缺失，使用单字母代码“Z”。对于相对于亲本序列的***，单字母代码“Z”位于该位置号码的左侧。对于缺失，单字母代码“Z”位于该位置号码的右侧。对于***，位置号码是在***的氨基酸的前面的位置号码，每个氨基酸加0.01。例如，在位置87和88之间***三个氨基酸即丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和酪氨酸(Y)显示为“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。因而，将上面所有的突变加上位置100处的缺失组合在一起为：“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。
“前序列”或“前肽序列”是指蛋白酶分泌所必要的处于信号肽序列和成熟蛋白酶序列之间的氨基酸序列。前序列或前肽序列的切除会得到成熟的活性蛋白酶。
术语“信号序列”或“信号肽”指可参与成熟或前体形式的蛋白质的分泌或直接转运的氨基酸残基序列。信号序列通常位于前体或成熟蛋白质序列的N端。信号序列可以是内源性的或外源性的。一种示例性的外源性信号序列包含来自枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前七个氨基酸残基和与之融合的来自迟缓芽孢杆菌(ATCC 21536)枯草杆菌蛋白酶的信号序列的其余部分。通常成熟蛋白质缺少信号序列。在转运蛋白质后通常由信号肽酶从该蛋白质切除信号序列。
术语“杂合信号序列”指与待表达的基因的信号序列融合的信号序列，其中该序列的一部分从表达宿主获得。在一些实施例中，利用合成序列。
术语蛋白质、多肽或肽的“成熟”形式指无信号肽序列和前肽序列的该蛋白质、多肽或肽功能形式。
术语蛋白质或肽的“前体”形式指具有与该蛋白质的氨基或羰基末端有效连接的前序列的该蛋白质成熟形式。前体还可具有与前序列的氨基末端有效连接的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多核苷酸(例如，从前体切除会留下蛋白质或肽的成熟形式的多核苷酸)。
关于氨基酸序列或核酸序列的术语“野生型”指所述氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。本文所用的术语“天然存在的”指自然界中存在的(即还未借助重组方法进行过操纵的)任何东西(如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。
本文所用的术语“非天然存在的”是指自然界中不存在的任何东西(如实验室中产生的重组核酸)。
如本文所用，对于氨基酸残基位置，“与相对应”或“对应于”或“对应”是指在蛋白质或肽的列举位置处的氨基酸残基，或与蛋白质或肽中列举的残基类似、同源或等同的氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”一般是指沿相关蛋白质或参考蛋白质的类似位置。
术语“衍生自”和“得自”不仅指通过所考虑的生物菌株产生或可产生的蛋白酶，还指从此类菌株分离的DNA序列编码的以及在包含此类DNA序列的宿主生物中产生的蛋白酶。另外，该术语指由合成的和/或cDNA起源的DNA序列编码的，并且具有所考虑的蛋白酶的鉴别特性的蛋白酶。例如，“衍生自芽孢杆菌属的蛋白酶”是指那些由芽孢杆菌天然产生的具有蛋白水解活性的酶，以及指与由芽孢杆菌来源产生的那些蛋白酶类似的丝氨酸蛋白酶，但这些丝氨酸蛋白酶是通过使用基因工程技术由转化有编码丝氨酸蛋白酶的核酸的非芽孢杆菌生物体产生的。
在两条核酸或多肽序列的语境中，术语“相同”是指当比对以达到最大匹配程度时两条序列中相同的残基，如使用如下序列比较或分析算法中的一种所测定的。
如本文所用，“同源基因”是指来自不同但通常相关的物种的一对基因，这对基因彼此对应并且彼此相同或非常类似。该术语涵盖了因物种形成(即新物种的发展)而分化的基因(如直向同源基因)，以及因基因复制而分化的基因(如平行同源基因)。
如本文所用，“同源性”是指序列相似性或同一性，其中同一性是优选的。同源性可用本领域已知的标准技术确定(参见例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.(《应用数学进展》)，2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，85：2444[1988]；软件程序，如威斯康辛遗传软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传计算小组公司(Genetics Computer Group)，威斯康辛州麦迪逊(Madison，WI))中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux等人，Nucl.Acid Res.(《核酸研究》)，12：387-395[1984])。可用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以画出树状图，该图示出用于产生该比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法(参见Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.(《分子进化杂志》)，35：351-360[1987])的简化方法。该方法与Higgins和Sharp描述的方法(参见Higgins和Sharp，CABIOS5：151-153[1989])类似。可用的PILEUP参数包括：默认空位权重＝3.00，默认空位长度权重＝0.10，以及加权的末端空位。可用的算法的另一个例子是BLAST算法，该算法由Altschul等人进行了描述(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，215：403-410[1990]；以及Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，90：5873-5787[1993])。尤其可用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见Altschul等人，Meth.Enzymol.(《酶学方法》)，266：460-480[1996])。WU-BLAST-2使用数种搜索参数，大部分参数设定为默认值。可调参数设定为如下值：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字串阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，由程序自身根据特定序列的组成和被用来搜索所关注的序列的特定数据库的组成来确定。然而，可以调整所述值来增加灵敏度。
参考序列和所关注的测试序列之间的序列同一性百分数可由本领域技术人员容易地测定。多核苷酸或多肽序列共有的同一性百分数通过分子之间序列信息的直接比较测定，所述比较通过序列比对并使用本领域已知的方法确定同一性来进行。适用于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，215：403-410[1990])。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中确定长度为W的短字串来确定高打分序列对(high scoring sequence pair，HSP)，该短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数T。这些最初的邻近命中字串充当起点来寻找含有它们的更长的HSP。使命中字串沿进行比较的两条序列的每一条朝两个方向扩展至累积比对分数不能增加为止。命中字串的延伸在如下情况会停止：累积比对分数从最大获得值下降达数量X；累积分数达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定该算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用如下默认值：字串长度(W)为11、BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，89：10915[1992])，比对数(B)为50，期望值(E)为10，M’5，N’-4，以及两条链的比较。
BLAST算法然后对两条序列之间的相似性进行统计分析(例如参见Karlin和Altschul，出处同上)。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sumprobability，P(N))，其指示两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率。例如，如果在测试核酸与丝氨酸蛋白酶核酸的比较中最小合计概率低于约0.1，更优选低于约0.01，最优选低于0.001，则该核酸可视为与本发明的丝氨酸蛋白酶核酸相似。在测试核酸编码丝氨酸蛋白酶多肽的情况中，如果比较得到低于约0.5，更优选低于约0.2的最小合计概率，则其视为与指定的丝氨酸蛋白酶核酸相似。
在两条或更多条核酸或多肽序列的语境中，“相同”或“同一性”百分数是指，当比较和比对以达到最大相似性时，两条或更多条序列是相同的或分别具有指定百分比的相同核酸残基或氨基酸残基，如使用序列比较算法或通过目测所确定的。主题氨基酸序列与参考(即查询)氨基酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性％”或“序列同一性％”或“氨基酸序列同一性％”意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上主题氨基酸序列与查询氨基酸序列相同(即以氨基酸比氨基酸计)达指定的百分数。因此，就两条氨基酸序列而言，80％氨基酸序列同一性或80％同一性意指两条最佳比对的氨基酸序列中80％氨基酸残基是相同的。
主题核酸序列与参考(即查询)核酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性％”或“序列同一性％”或“核苷酸序列同一性％”意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上主题核酸序列与查询序列相同(即以多核苷酸序列的核苷酸比核苷酸计)达指定的百分数。因此，就两条核酸序列而言，80％核苷酸序列同一性或80％同一性意指两条最佳比对的核酸序列中80％核苷酸残基是相同的。
在一些实施例中，主题序列与查询序列的“序列同一性百分数”或“序列同一性％”或“同一性％”可通过将两条序列进行最佳比对并在比较长度上比较两条最佳比对的序列来计算。确定在最佳比对中相同的残基出现在两条序列中的位置数目，从而提供匹配位置的数目，然后将匹配位置的数目除以比较长度(除非另外指明，否则其为查询序列的长度)的位置总数。所得的数目乘以100而得到主题序列与查询序列的序列同一性百分数。
“最佳比对”或“最佳比对的”指两条(或更多条)序列的给出最高同一性百分比分数的比对。例如，可通过将两条蛋白质序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同氨基酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。可通过将两条核酸序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同核苷酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。
在一些实施例中，当用限定的参数，例如限定的氨基酸置换矩阵、空位存在罚分(也称为空位开放罚分)和空位延伸罚分来比对两条多肽序列，以实现该对序列可能的最高相似性分数时，这两条多肽序列被认为是“最佳比对的”。在多肽序列比对算法(如BLASTP)中，BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，出处同上)通常用作默认的打分置换矩阵。施加空位存在罚分以在被比对的序列之一者中引入单个氨基酸空位，并为该空位中的每一个残基位置施加空位延伸罚分。所采用的示例性比对参数是：BLOSUM62打分矩阵，空位存在罚分＝11，空位延伸罚分＝1。比对分数由每条序列的该对比开始和结束的氨基酸位置(如比对窗口)，以及任选由一条或两条序列中一个空位或多个空位的***来限定，以实现可能的最高相似性分数。
两条或更多条序列之间的最佳比对可通过目测手动来确定，或通过使用计算机，例如但不限于如BLASTP程序(用于氨基酸序列)和BLASTN程序(用于核酸序列)(参见例如Altschul等人，Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)，25(17)：3389-3402(1997)；还可参见美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站)来确定。
如果所关注的多肽包含与参考多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的氨基酸序列，则可称所关注的多肽与参考多肽“实质上相同”。两条这类多肽之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的多肽序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两个多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如在某条多肽与第二多肽仅因保守氨基酸置换或一个或多个保守氨基酸置换而不同的情况中，这两条多肽是实质上相同的。
如果所关注的核酸包含与参考核酸的核苷酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的核苷酸序列，则可称所关注的核酸与参考核酸“实质上相同”。两条这类核酸之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的核酸序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条核酸序列实质上相同的一个指示是这两条核酸分子在严格条件(例如，在中等严格性至高严格性的范围内)下彼此杂交。
当核酸或多核苷酸从其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)部分地或完全地分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。相似地，当多肽、蛋白质或肽从其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)部分地或完全地分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔浓度计，在组合物中，分离的物质的丰度比其他物质更高。例如，分离的物质可以占所有存在的大分子物质的至少约50％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％(以摩尔浓度计)。优选地，所关注的物质纯化为基本上均质的(即通过常规检测方法在组合物中检测不到污染物)。纯度和均一性可以使用本领域熟知的多种技术测定，例如对蛋白质或核酸样品进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在染色后进行目测观察。如果需要，可采用高分辨率技术，如高效液相色谱法(HPLC)或类似的方法来纯化材料。
应用于核酸或多肽的术语“纯化的”一般表示核酸或多肽基本上不合其他组分，如通过本领域熟知的分析技术所测定的(如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经密度梯度离心的介质中形成离散的条带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一个条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽的纯度为至少约50％，通常纯度为至少约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更大(例如以摩尔浓度计的重量％)。在相关的意义上，本发明提供对组合物富集一种或多种本发明的分子，例如一种或多种本发明的多肽或多核苷酸的方法。在应用纯化或富集技术后某分子的浓度有实质性增加时，则对组合物富集了该分子。实质上纯的本发明的多肽或多核苷酸(如，分别为实质上纯的本发明变体蛋白酶或编码本发明变体蛋白酶的多核苷酸)通常将占特定组合物中的所有大分子物质重量(以摩尔浓度计)的至少约55％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98、约99％、约99.5％或更高。
在相关的意义上，本发明提供针对一种或多种本发明的分子，例如一种或多种本发明的多肽(如一种或多种本发明的变体蛋白酶)或一种或多种本发明的核酸(如编码一种或多种本发明变体蛋白酶的一种或多种核酸)对组合物进行富集的方法。在应用纯化或富集技术后某分子的浓度有实质性增加时，则对组合物富集了该分子。基本上纯的多肽或多核苷酸通常将占特定组合物中的所有大分子物质重量(以摩尔浓度计)的至少约55％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98、约99％、约99.5％或更高。
本文所用的术语“组合诱变”或“组合”是指产生参考核酸序列的核酸变体的文库的方法。在这些文库中，变体含有选自一组预定突变的一个或数个突变。这类方法还提供了引入随机突变的手段，这些随机突变不是该预定突变组的成员。一些此类方法包括在美国专利No.6,582,914中示出的那些方法，特此将该专利以引用的方式。一些此类组合诱变方法包括和/或涵盖在市售试剂盒(例如多定点诱变试剂盒(Stratagene公司)，PCR融合/延伸PCR)中体现的方法。
如本文所用，结合变体蛋白酶使用的“具有改善的特性’’是指相对于对应的参考蛋白酶(如野生型或天然存在的蛋白酶)，变体蛋白酶具有改善的或增强的洗涤或清洁性能，和/或改善的或增强的稳定性，任选保持了洗涤或清洁性能。变体蛋白酶的改善特性可以包括改善的洗涤或清洁性能和/或改善的稳定性。在一些实施例中，本发明提供表现出如下特性中的一者或多者的本发明变体蛋白酶：相对于参考蛋白酶(如，野生型蛋白酶，例如野生型枯草杆菌蛋白酶)的改善的手动洗涤性能、改善的手动或手工盛具洗涤性能、改善的自动盛具洗涤性能、改善的衣物洗涤性能和/或改善的稳定性。
如本文所用，术语“功能测定法”指提供蛋白质活性的指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对蛋白质以其惯常的本领发挥作用的能力对该蛋白质进行分析的测定***。例如，就酶而言，功能测定法涉及测定该酶催化反应的效力。
如本文所用，术语“靶性质”是指待变更的起始基因的性质。无意于将本发明局限于任何特定的靶性质。然而，在一些实施例中，靶性质是基因产物的稳定性(如，对变性、蛋白水解或其他降解因素的耐受性)，而在其他实施例中，生产宿主的生产水平发生改变。
如本文所用，在核酸的语境中，术语“性质”或其语法等同形式是指可选择或检测的核酸的任何特性或属性。这些性质包括但不限于影响与多肽的结合的性质、赋予包含特定核酸的细胞的性质、影响基因转录的性质(如，启动子强度、启动子识别、启动子调控、增强子功能)、影响RNA加工的性质(如，RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)、影响翻译的性质(如mRNA的水平、调控、与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)。例如，可以改变核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点以产生所需的特性或鉴别不期望的特性。
如本文所用，在多肽(包括蛋白质)的语境中，术语“性质”或其语法等同形式是指可选择或检测的多肽的任何特性或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、酶活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性分布、对蛋白降解的耐受性、KM、kcat、kcat/kM比率、蛋白质折叠、诱导免疫应答、与配体结合的能力、与受体结合的能力、被分泌的能力、在细胞表面上展示的能力、低聚化的能力、信号传导的能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导细胞凋亡的能力、被磷酸化或糖基化作用修饰的能力和/或治疗疾病的能力等。
如本文所用，术语“筛选”在本领域中具有其通常含义。在一个示例性筛选方法中，提供了突变体核酸或由其编码的变体多肽，并且分别评估或测定突变体核酸或变体多肽的性质。突变体核酸或变体多肽的测定性质可以分别与对应的前体(亲本)核酸的性质或与对应的亲本多肽的性质比较。
对技术人员而言将显而易见的是，获得具有改变的性质的核酸或蛋白质的筛选方法取决于原料性质，突变体核酸的产生旨在促进原料性质的变更。因此，技术人员将认识到，本发明不限于要筛选的任何具体性质，并且如下性质描述仅列出了示例性的例子。筛选任何特定性质的方法通常在本领域中有所描述。例如，可在突变之前和之后测量结合性、pH、特异性等，其中变化表明发生了变更。优选地，筛选以高通量方式进行，包括同时筛选多个样品，包括但不限于利用芯片、噬菌体展示和多底物和/或指示剂的测定法。
如本文所用，在一些实施例中，筛选方法包括一个或多个选择步骤，在这些步骤中将所关注的变体从一群变体中富集。这些实施例的例子包括对赋予宿主生物生长优势的变体的选择，以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中可根据变体的结合或催化性质从一群变体捕集该变体。在一些实施例中，将变体文库暴露于胁迫(如热、变性等)，随后对仍然完整的变体在筛选中进行鉴定或通过选择进行富集。该术语旨在涵盖任何合适的选择方式。实际上，无意于将本发明局限于任何特定的筛选方法。
术语“经修饰的核酸序列”和“经修饰的基因”在本文中可互换使用，是指天然存在的(即野生型)核酸序列的包含缺失、***或中断的核酸序列。在一些实施例中，经修饰的核酸序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰为序列的缺失或中断的话)。在一些实施例中，截短的蛋白质保留生物活性。在备选的实施例中，经修饰的核酸序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，修饰包括核酸序列中的***)。在一些实施例中，核苷酸***核酸序列会导致截短的蛋白质(例如，当***导致形成终止密码子时)。因此，***可以导致截短的蛋白质或延长的蛋白质表达产物。
“突变体”核酸序列通常指这样的核酸序列，其在宿主细胞的野生型序列中存在的至少一个密码子中具有变更，使得该突变型核酸序列的表达产物是相对于野生型蛋白质而言具有变更的氨基酸序列的蛋白质。表达产物可具有变更的功能能力(例如增强的酶活性)。
如本文所用，短语“底物特异性的变更”是指酶的底物特异性的变化。在一些实施例中，底物特异性的变化定义为由于酶的突变或反应条件的改变而导致的特定底物的kcat和/或Km的变化。通过比较酶表现出的对不同底物的催化效率，来确定酶的底物特异性。这些测定尤其可用于评估突变酶的效率，因为通常期望产生的变体酶对所关注的底物表现出更大kcat/Km比率。然而，无意于将本发明局限于任何特定的底物组合物或底物特异性。
如本文所用，“表面性质”用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性之类的性质。
本文所用的术语“净电荷”定义为分子中存在的所有电荷的总和。可对亲本蛋白质分子作出“净电荷改变”，以提供具有与该亲本分子的净电荷不同的净电荷的变体(即该变体具有的净电荷与亲本分子的净电荷不相同)。例如，用带负电的氨基酸置换中性氨基酸或用中性氨基酸置换带正电的氨基酸，会导致相对于亲本分子而言净电荷为-1。用带负电的氨基酸置换带正电的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为-2。用带正电的氨基酸置换中性氨基酸或用中性氨基酸置换带负电的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为+1。用带正电的氨基酸置换带负电的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为+2。亲本蛋白质的净电荷还可通过缺失和/或***带电的氨基酸来变更。
术语“热稳定的”和“热稳定”和“热稳定性”是指蛋白酶在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他处理期间的主要条件下(同时暴露于改变的温度)，暴露于指定的温度达给定时间段后仍保持指定量的酶活性。“改变的温度”涵盖增加的或降低的温度。在一些实施例中，蛋白酶在暴露于改变的温度指定时间段(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)后保持至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定蛋白酶的语境中，术语“增强的稳定性”是指与其他蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间推移保留较高的蛋白水解活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定蛋白酶的语境中，术语“降低的稳定性”是指与其他蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间推移保留较低的蛋白水解活性。
术语“清洁活性”是指在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间的主要条件下，变体蛋白酶或参考蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，变体蛋白酶或参考蛋白酶的清洁性能可以使用用于清洁物品或表面上的一种或多种不同的酶敏感性污渍(例如来自食物、草、血、墨、奶、油和/或卵蛋白的污渍)的各种测定法来测定。变体或参考蛋白酶的清洁性能可通过使物品或表面上的污渍经受标准洗涤条件，并且使用各种色谱方法、分光光度方法或其他定量方法评估污渍被移除的程度来测定。示例性的清洁测定法和方法是本领域已知的，包括但不限于WO99/34011和美国专利6,605,458(这二个专利均以引用方式并入本文)中描述的那些方法以及下文提供的实例中包括的那些清洁测定法和方法。
术语变体蛋白酶或参考蛋白酶的“清洁有效量”是指在特定清洁组合物中实现所需水平的酶活性的蛋白酶的量。这种有效量可由本领域一般技术人员容易地确定并且基于多种因素，如所用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成，以及是需要液体组合物还是干燥(例如颗粒状、片状、条棒状)组合物等等。
术语“清洁辅助材料”是指清洁组合物中包含的除本发明变体蛋白酶之外的任何液体、固体或气体材料。在一些实施例中，本发明的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。每种清洁辅助材料通常根据清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、条棒、糊、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择。优选地，每种清洁辅助材料与组合物中所用的蛋白酶相容。
在清洁活性的语境中术语“增强的性能”是指酶对某些酶敏感性污渍如蛋、奶、草、墨、油和/或血的增加的或更高的清洁活性，这种活性是在标准的洗涤循环和/或多个洗涤循环后通过常用的评价法来测定的。
在清洁活性的语境中术语“减低的性能”是指酶对某些酶敏感性污渍如蛋、奶、草或血的降低的或较小的清洁活性，这种活性是在标准的洗涤循环后通过常用的评价法来测定的。
在本发明变体蛋白酶的清洁活性语境中，术语“相当的性能”是指至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％的比较或参考蛋白酶(如市售蛋白酶)的清洁活性，所述比较或参考蛋白酶包括但不限于OPTIMASETM蛋白酶(杰能科公司)、PURAFECTTM蛋白酶产品(杰能科公司)、SAVINASETM蛋白酶(诺维信公司)、BPN’-变体(参见例如美国专利No.Re34,606)、RELASETM、DURAZYMETM、EVERLASETM、KANNASETM蛋白酶(诺维信公司)、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM蛋白酶(杰能科公司；还可参见美国专利No.Re34,606和美国专利No.5,700,676、No.5,955,340、No.6,312,936以及No.6,482,628)和迟缓芽孢杆菌变体蛋白酶产品(例如WO92/21760、WO95/23221和/或WO97/07770中描述的那些)。可如下测定清洁性能：在涉及酶敏感性污渍(例如草、血、墨、油和/或奶)的各种清洁测定法中，将本发明变体蛋白酶与参考枯草杆菌蛋白酶进行比较，如在标准洗涤循环条件后通过常用的分光光度测定或分析法来测定。
本文所用的术语“消费品”意指织物和家庭护理产品。如本文所以，术语“织物和家庭护理产品”或“织物和家居护理产品”包括通常旨在以它们所销售的形式使用或消费的且用以处理织物、硬质表面和任何其他表面的产品；和用于无生命表面的护理和清洁的清洁***整体；以及织物调理剂产品和特定设计用于织物的护理和维护的其他产品；和空气护理产品，包括：空气护理(包括空气清新剂和香味递送***)；汽车护理产品、宠物护理产品、家畜护理产品、个人护理产品、珠宝护理产品；盛具洗涤产品、织物调理产品(包括软化和/或鲜化)、衣物洗涤产品、洗衣和漂洗添加剂和/或护理产品、预处理清洁组合物、硬质表面清洁和/或处理产品(包括地板和抽水马桶清洁剂、玻璃清洁剂和/或处理剂、瓷砖清洁剂和/或处理剂、陶瓷清洁剂和/或处理剂)以及用于消费者或公共场所使用的其他清洁产品。在一些实施例中，织物和家庭护理产品适用于伤口和/或皮肤。“织物和家庭护理产品”包括消费者和公共场所用产品。
本文所用的术语“非织物和家庭护理产品”是指这样的组合物，其被添加至其他组合物中以产生可以为织物和家庭护理产品的最终产品。
如本文所用，术语“公共场所用清洁组合物”是指适用于公共场所(包括但不限于学校、医院、工厂、商场、公司、建筑物、餐馆、办公楼和商厦、加工和/或制造车间、兽医院、工厂化农场、工厂化牧场等)的产品。
本文所用的术语“清洁和/或处理组合物”是指织物和家庭护理产品的这样的子集，除非另外指明，该子集包括适用于清洁和/或处理物品的组合物。这类产品包括(但不限于)用于处理织物、硬质表面及织物和家庭护理领域中的任何其他表面的产品，包括：空气护理产品(包括空气清新剂和香味递送***)；汽车护理产品、盛具洗涤产品；织物调理产品(包括软化和/或鲜化)；衣物洗涤产品、洗衣和漂洗添加剂和/或护理产品、硬质表面清洁和/或处理产品(包括地板和抽水马桶清洁剂)；颗粒或粉末形式的多功能型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊形式的多功能型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体型；液体精细织物洗涤剂；手动盛具洗涤剂或轻垢型盛具洗涤剂，尤其是高泡类型的那些；机洗用盛具洗涤剂，包括家居和公共场所使用的各种片剂型、颗粒型、液体型和漂洗助剂型：汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂(包括抽水马桶清洁剂)；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型、底物装载型产品(substrate-1aden)如加干燥剂的片材。
实际上，如本文所用，本发明的“清洁组合物”或“清洁制剂”是指可用于从待清洁的物体、物品或表面移除或除去化合物(如不需要的化合物)的任何本发明组合物，所述待清洁的物体、物品或表面包括但不限于，例如织物、织物物品、盛具物品、餐具物品、玻璃器具物品、接触镜、其他固体基材、毛发(洗发剂)(包括人或动物毛发)、皮肤(肥皂或/和霜剂)、牙齿(漱口水、牙膏)、物品或物体的表面(如硬质表面，例如桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板、非盘碟物品、非盛具物品等的硬质表面)、过滤器、膜(如过滤膜，包括但不限于超滤膜)等。该术语涵盖为所需清洁组合物的特定类型和产品的形式(如液体、凝胶、颗粒、喷雾或其他组合物)选择的任何材料和/或添加的化合物，只要该组合物与用于组合物的蛋白酶和其他酶相容即可。易于通过考虑待清洁的表面、物体、物品或织物以及针对在使用期间清洁条件所需的组合物形式来具体选择清洁组合物材料。
清洁组合物和清洁制剂包括适于对任何物体、物品和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。这种组合物和制剂包括但不限于例如：液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片状、凝胶、条棒状、颗粒和/或固体衣物清洁组合物或洗涤剂组合物以及精细织物洗涤剂组合物；硬质表面清洁组合物和制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、洗衣添加剂清洁组合物和衣物预洗剂清洁组合物；盛具洗涤组合物，包括手动或手工盛具洗涤组合物(如“手动”或“手工”盛具洗涤剂)和自动盛具洗涤用组合物(如“自动盛具洗涤用洗涤剂”)。
除非另外指明，否则如本文所用，清洁组合物或清洁制剂包括颗粒状或粉末形式的多功能型洗涤剂或重垢型洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片或糊形式的多功能型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢粉末洗涤剂(HDD)类型；液体精细织物洗涤剂；手动或手工盛具洗涤剂，包括高泡类型的那些；手动或手工盛具洗涤剂、自动盛具洗涤用洗涤剂或盛具或餐具洗涤剂，包括家居和公共场所使用的各种片、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁条棒、漱口水、假牙清洁剂、汽车清洗剂、地毯清洗剂、浴室清洁剂；人和其他动物的洗发剂和/或毛发清洗剂；沐浴凝胶和泡沫浴和金属洗涤剂；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒状组合物为“紧凑”形式；在一些实施例中，液体组合物为“浓缩”形式。
如本文所用，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于染污织物(如衣物、亚麻布和其他纺织材料)的浸洗和/或预处理的组合物在内。
如本文所用，“非织物清洁组合物”包括非纺织物(即非织物)表面清洁组合物，包括但不限于例如手动或人工或自动盛具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物和个人清洁组合物。
如本文所以，术语“织物和/或硬质表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的这样的子集，除非另外指明，该子集包括颗粒或粉末形式的多用途型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊形式的多功能型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体型；液体精细织物洗涤剂；手动盛具洗涤剂或轻垢型盛具洗涤剂，尤其是高泡类型的那些；机洗用盛具洗涤剂，包括家居和公共场所使用的各种片剂型、颗粒型、液体型和漂洗助剂型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂(包括抽水马桶清洁剂)；织物调理产品，包括可以液体、固体和/或干衣纸形式使用的软化产品和/或鲜化产品；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型、底物装载型产品如加干燥剂的片材。所有此类适用的产品可以是标准、浓缩或甚至高浓缩形式，甚至浓缩到使此类产品在某些方面为非水性的程度。
如本文所用，术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用于指旨在用于洗涤介质中用来清洁染污的或脏的物体(包括特定的织物和/或非织物物体或物品)的组合物。本发明的这类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，在一些实施例中，本发明的洗涤剂包含至少一种本发明的变体蛋白酶，此外还包含一种或多种表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在某些情况下，助洗剂盐为硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选硅酸盐(如偏硅酸钠)比磷酸盐(如三聚磷酸钠)多。一些本发明的组合物(例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物)不含有任何磷酸盐(如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。
如本文所用，术语“漂白”是指以足够的时长和/或在合适的pH和/或温度条件下处理材料(如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增亮(增白)和/或清洁。适用于漂白的化学品的例子包括但不限于例如ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
如本文所用，蛋白酶(如本发明的变体蛋白酶)的“洗涤性能”是指变体蛋白酶对洗涤的贡献，与未向组合物中添加该变体蛋白酶的洗涤剂相比其为洗涤剂提供额外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较。在一些测试***中，其他相关因素(如洗涤剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度)可以以使得某些细分市场中的家居应用(手动或手用盛具洗涤、自动盛具洗涤、盛具清洁、餐具清洁、织物清洁等)的典型条件得以模拟的方式进行控制。
术语“相关洗涤条件”在本文中用于指在手动盛具洗涤、自动盛具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中在家庭中实际上使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
术语“改善的洗涤性能”用于指在相关洗涤条件下在去污方面获得更好的最终结果，或以重量计，相对于相应的野生型或起始亲本蛋白酶，需要较少的变体蛋白酶来获得相同的最终结果。
如本文所用，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。无意于将本发明受限于任何特定表面、物品或待移除的污染物或微生物。
本文的清洁组合物的“紧凑”形式最好由密度反映，就组成来说，由无机填料盐的量反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐是大量存在，通常占总组合物的约17重量％至约35重量％。相比之下，在紧凑型组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过所述组合物的约10重量％，或更优选不超过约5重量％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属硫酸盐和氯化物。在一些实施例中，填料盐为硫酸钠。
在本文中，给定氨基酸序列中的氨基酸残基的位置通常利用SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的对应氨基酸残基的位置的编号方式进行编号。SEQ ID NO：1的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列因而充当参考序列。可利用本文所述的比对算法将给定氨基酸序列(例如本文描述的变体蛋白酶氨基酸序列)与BPN’序列(SEQ ID NO：1)比对，该给定氨基酸序列中与BPN’序列中的氨基酸残基比对(优选最佳比对)的氨基酸残基可通过参考该枯草杆菌蛋白酶BPN’序列中的对应氨基酸残基便利地进行编号。或者，如果枯草杆菌蛋白酶变体蛋白酶序列的氨基酸残基位置利用GG36氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中的氨基酸残基位置的实际编号方式进行编号，并且在比对时不参考BPN’序列中的对应氨基酸位置，则枯草杆菌蛋白酶变体蛋白酶可描述为SEQ IDNO：2所示的GG36蛋白酶的变体蛋白酶。
一般来讲，本文所用的命名以及下文描述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白质化学中的实验室方法中的许多方法是众所周知的，并常常为本领域一般技术人员所采用。重组核酸的产生和操纵的方法、核酸合成的方法、细胞培养方法以及转基因掺入(如转染、电穿孔)是本领域技术人员已知的并在许多标准文献中有描述。寡核苷酸合成和纯化步骤通常根据说明书来进行。技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法以及本文通篇中提供的各种一般文献来进行。本文的程序据信是本领域普通技术人员所熟知的，并为了阅读者的便利而提供。
本发明的多肽
本发明提供新型多肽，它们可统称为“本发明的多肽”。本发明的多肽包括分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的变体蛋白酶多肽，包括例如具有酶活性(如蛋白水解活性)的枯草杆菌蛋白酶变体多肽。在一些实施例中，本发明的多肽(例如枯草杆菌蛋白酶变体或具有SEQ ID NO：2的序列的GG36的变体)，与亲本如具有SEQ ID NO：2的序列的GG36蛋白酶相比，具有改善的清洁性能。在一些实施例中，本发明的多肽可用于清洁应用，并且可掺入可在清洁需要进行清洁的物品或表面(如物品的表面)的方法中使用的清洁组合物中。
在一些实施例中，本发明的变体蛋白酶包括“变体枯草杆菌蛋白酶”。在一些实施例中，本发明提供“芽孢杆菌变体蛋白酶”。在一些实施例中，本发明提供“芽孢杆菌变体枯草杆菌蛋白酶”。在一些实施例中，本发明提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，本发明提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。
在上述实施例任一者中，本发明包括分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的变体蛋白酶，该多肽包含的多肽序列与编码本文提供的变体蛋白酶的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％的序列同一性。
如上所述，本发明的变体蛋白酶多肽具有酶活性(如蛋白水解活性)并因而可用于清洁应用，包括但不限于用于清洁盘碟物品、餐具物品、织物和具有硬质表面的物品(如桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板等的硬质表面)的方法。包含一种或多种本发明的变体蛋白酶多肽的示例性清洁组合物在下文中进行描述。本发明的变体蛋白酶多肽的酶活性(如蛋白酶活性)可使用本领域普通技术人员熟知的程序容易地测定。下文提供的实例描述了用于评价酶活性、清洁性能和/或洗涤性能的方法。本发明的变体蛋白酶在移除污渍(例如蛋白质性污渍)、清洁硬质表面或清洁衣物、盛具或餐具物品方面的性能可用本领域所熟知的程序和/或通过使用实例部分中示出的程序容易地测定。
可对本发明的多肽进行多种改变，如一个或多个氨基酸的***、缺失和/或置换(保守的或非保守的置换)，包括其中这类改变不会实质上改变该多肽的酶活性的情况。类似地，也可对本发明的核酸进行多种改变，如在一个或多个密码子中对一个或多个核酸进行一个或多个置换使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，从而导致沉默变异(如，核苷酸序列中的突变可导致氨基酸序列中的沉默突变，例如当所编码的氨基酸未因该核酸突变而变更时)或非沉默变异；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种缺失；序列中一个或多个核酸(密码子)的一种或多种添加或***；和/或序列中一个或多个核酸(密码子)的切除或序列中一个或多个核酸(密码子)的一种或多种截短。与初始核酸序列编码的变体蛋白酶相比，核酸序列中的许多此类改变可能不会实质上改变所得的编码的变体蛋白酶的酶活性。还可对本发明的核酸进行修饰以包括一个或多个使得能在表达***(如细菌表达***)中进行最优表达的密码子，同时如果需要，所述一个或多个密码子仍编码相同氨基酸。
在一些实施例中，本发明提供这样一类多肽，其包括具有所需酶活性(如蛋白酶活性或清洁性能活性)的变体蛋白酶多肽，所述变体蛋白酶多肽包含具有本文所述的氨基酸置换的序列并且还包含一个或多个另外的氨基酸置换，例如保守和非保守置换，其中多肽表现出、维持或大致维持所需的酶活性(如蛋白酶活性或枯草杆菌蛋白酶活性，如该变体蛋白酶的清洁活性或性能所反映的)。根据本发明的氨基酸置换可包括但不限于一个或多个非保守置换和/或一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸残基置换通常涉及将一功能类别的氨基酸残基中的成员替换为属于同一功能类别的残基(在计算功能同源性百分数时相同氨基酸残基被视为在功能上是同源的或保守的)。保守氨基酸置换通常涉及用功能相似的氨基酸置换氨基酸序列中的氨基酸。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸是功能相似的，因而可充当彼此的保守氨基酸置换。天冬氨酸和谷氨酸可充当彼此的保守置换。天冬酰胺和谷氨酰胺可充当彼此的保守置换。精氨酸、赖氨酸和组氨酸可充当彼此的保守置换。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸可充当彼此的保守置换。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可充当彼此的保守置换。
可以设想其他的保守氨基酸置换组。例如，可通过相似的功能或化学结构或组成对氨基酸进行分组(如酸性、碱性、脂族、芳族、含硫)。例如，脂族组可包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。含有可视为彼此保守置换的氨基酸的其他组包括：芳族组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫组：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性组：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性组：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带电荷的残基的组：半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)和脯氨酸(P)；亲水性不带电荷的残基的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组是本领域技术人员所熟知的并在各种标准教科书中有描述。本文的多肽序列的列表，结合上文的置换组，提供了所有经保守置换的多肽序列的明确列表。
在上文描述的氨基酸残基类别中存在更保守的置换，其也可以是合适的或者其作为另一种选择可以是合适的。用于更保守的置换的保守组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。因此，例如在一些实施例中，本发明提供具有蛋白水解活性的分离或重组的变体蛋白酶多肽(如变体枯草杆菌蛋白酶)，所述变体蛋白酶多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％序列同一性的氨基酸序列。本发明的变体蛋白酶中一个氨基酸保守置换另一个氨基酸预计不会显著改变该变体蛋白酶的酶活性或清洁性能活性。所得的蛋白酶的酶活性或清洁性能活性可容易地用标准测定法和本文所述的测定法进行测定。
本发明的多肽序列(例如本发明的变体蛋白酶)的保守置换变异包括用同一保守置换组的保守选择的氨基酸来置换该多肽序列的少部分的，有时低于约25％、约20％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％或约6％的氨基酸，或该多肽序列的低于约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的氨基酸。
如本文其他地方更详细描述的以及本文提供的实例中描述的，本发明的多肽可具有可与已知蛋白酶(包括已知枯草杆菌蛋白酶)相当的清洁能力。示例性的已知枯草杆菌蛋白酶包括但不限于例如迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36、解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’、解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L和克劳氏芽孢杆菌PB92。成熟迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白的氨基酸序列为：
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVS SIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO：2)
成熟解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白的氨基酸序列为：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO：1)
本发明提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V104I、T022R+V104I+A232V、T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V、T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R、T022R+S103A+V104I+Q245R、T022R+S103A+A232V+Q245R、T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V、T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R、T022A+N076D+A232V+Q245R、T022A+N076D+V104I+A232V、T022A+N076D+S103A+Q245R、T022A+N076D+S103A+A232V、T022A+N076D+S103A+V104I、T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V104I、T022A+N076D+A232V、T022A+N076D+Q245R、G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G211Q、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G211Q、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V104I、T022W+S101A+T213A、T022R+S101G+Q245R、T022W+S101A+G211Q、G020R+S024R+Q245R、T022R+S101G+V104I+Q245R、T022R+S101G+A232V、T022R+S101G+S103A、T022R+S101G+S103A+V104I、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A、G020R+S024R+T213AS101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V104I、S101N+S103A+A232V、S101N+S103A+V104I+A232V、G020R+S103A+A232V、G020R+V104I+A232V、G020R+S103A+V104I+A232V、G020R+S103A+V104I、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F或N018R+N076D+G211Q(列表1)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于位置T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R(列表2)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V、T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+A232V+Q245R或T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R(列表3)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R、T022R+S103A+V104I+Q245R、T022R+S103A+A232V+Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R、T022A+N076D+A232V+Q245R、T022A+N076D+V104I+A232V、T022A+N076D+S103A+Q245R、T022A+N076D+S103A+A232V、T022A+N076D+S103A+V104I、T022R+S101G+V104I+Q245R、T022R+S101G+S103A+V104I、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A、S101N+S103A+V104I+A232V或G020R+S103A+V104I+A232V(列表4)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V104I、T022R+V104I+A232V、T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V、T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V104I、T022A+N076D+A232V、T022A+N076D+Q245R、G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G211Q、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G211Q、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V104I、T022W+S101A+T213A、T022R+S101G+Q245R、T022W+S101A+G211Q、G020R+S024R+Q245R、T022R+S101G+A232V、T022R+S101G+S103A、G020R+S024R+T213A、S101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V104I、S101N+S103A+A232V、G020R+S103A+A232V、G020R+V104I+A232V、G020R+S103A+V104I、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F或N018R+N076D+G211Q(列表5)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID N0：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：S101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V104I、S101N+S103A+A232V或S101N+S103A+V104I+A232V(列表6)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于位置S101N+S103A+V104I+A232V(列表7)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：S101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V104I或S101N+S103A+A232V(列表8)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：S103A+V104I+S188D、S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+Q245R、V104I+S188D+Q245R、S103A+V104I+S188D+Q245R、T022A+S103A+S188D、T022A+V104I+S188D、T022A+S103A+V104I+S188D、G159D+S188D+Q245R、S103A+S188D+A232V、S103A+G159D+S188D、V104I+S188D+A232V、V104I+G159D+S188D、S103A+V104I+S188D+A232V、S103A+V104I+G159D+S188D、S103A+S188D+N248D、V104I+S188D+N248D、S103A+V104I+S188D+N248D、G159D+S188D+N248D、S188D+A232V+Q245R、S103A+S188D+A232V+Q245R、V104I+S188D+A232V+Q245R、S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S188D+Q245R、T022A+S103A+S188D+Q245R、T022A+V104I+S188D+Q245R、S103A+S188D+E271F、V104I+S188D+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R、S103A+V104I+S188D+E271F、T022A+S188D+N248D、T022A+S103A+S188D+N248D、T022A+V104I+S188D+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+V104I+S188D+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S188D+A232V、T022A+S103A+S188D+A232V、T022A+V104I+S188D+A232V、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V、S188D+A232V+N248D、S188D+Q245R+E271F、T022A+S188D+E271F、T022A+S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+A232V+N248D、S103A+S188D+Q245R+E271F、S188D+N248D+E271F、V104I+S188D+A232V+N248D、V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+E271F、T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+E271F、T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F、S103A+V104I+S188D+A232V+N248D、V104I+S188D+N248D+E271F、S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+S188D+N248D+E271F、S103A+S188D+A232V+E271F、V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R、T022A+S188D+Q245R+E271F、T022A+S188D+N248D+E271F、S103A+V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R、S188D+A232V+Q245R+N248D、S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S188D+A232V+N248D、T022A+S103A+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R、S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S103A+S188D+A232V+N248D、T022A+V104I+S188D+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+Q245R+E271F、S188D+A232V+Q245R+E271F、S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R、V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+V104I+S188D+A232V+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+N248D+E271F、T022A+S188D+Q245R+N248D+E271F、S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F、S103A+S188D+A232V+N248D+E271F、S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+N248D、S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+S103A+S188D+A232V+E271F、V104I+S188D+A232V+N248D+E271F、V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D、S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F、S103A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F、S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D、S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F、G159D+S188D+Q245R+N248D、T022A+G159D+S188D、T022A+S103A+G159D+S188D、T022A+V104I+G159D+S188D、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D、S103A+G159D+S188D+Q245R、V104I+G159D+S188D+Q245R、S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R、S103A+G159D+S188D+N248D、V104I+G159D+S188D+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+N248D、G159D+S188D+A232V、S103A+G159D+S188D+A232V、V104I+G159D+S188D+A232V、S103A+V104I+G159D+S188D+A232V、T022A+G159D+S188D+Q245R、G159D+S188D+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R、S103A+G159D+S188D+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R、V104I+G159D+S188D+E271F、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R、S103A+V104I+G159D+S188D+E271F、T022A+G159D+S188D+N248D、T022A+S103A+G159D+S188D+N248D、T022A+V104I+G159D+S188D+N248D、S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+N248D、V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D、T022A+G159D+S188D+A232V、T022A+S103A+G159D+S188D+A232V、T022A+V104I+G159D+S188D+A232V、G159D+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+A232V、S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R、G159D+S188D+Q245R+E271F、V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R、G159D+S188D+A232V+N248D、T022A+G159D+S188D+E271F、S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F、G159D+S188D+N248D+E271F、S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R、S103A+G159D+S188D+A232V+N248D、T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+G159D+S188D+E271F、V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+E271F、V104I+G159D+S188D+A232V+N248D、S103A+G159D+S188D+N248D+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F、V104I+G159D+S188D+N248D+E271F、G159D+S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+E271F、S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D、T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F、S103A+G159D+S188D+A232V+E271F、V104I+G159D+S188D+A232V+E271F、T022A+G159D+S188D+N248D+E271F、T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R、T022A+G159D+S188D+Q245R+E271F、S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F、G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+N248D+E271F、T022A+G159D+S188D+A232V+N248D、G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R、S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F、G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F、G159D+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+N248D、V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F、S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+G159D+S188D+A232V+E271F、T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F、S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D、V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D、S103A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+E271F、V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F、V104I+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F、G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、T022A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D、S101G+S103A+S188D、S101G+V104I+S188D、S101G+S103A+V104I+S188D(列表9)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID N0：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+N248D+E271F、S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+N248D、S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F、S103A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F、S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D、S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+A232V、S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+E271F、S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D、T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F、S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+N248D+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R、S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+N248D、V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F、S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F、S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D、V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D、S103A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+E271F、V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F、V104I+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F、G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、T022A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F或T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D(列表10)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R、T022A+S103A+V104I+S188D+N248D、S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V、T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D、T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F、S103A+V104I+S188D+A232V+N248D、T022A+S103A+V104I+S188D+E271F、S103A+V104I+S188D+N248D+E271F、S103A+V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R、S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S103A+S188D+A232V+N248D、T022A+V104I+S188D+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+Q245R+E271F、V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+V104I+S188D+A232V+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S188D+Q245R+N248D+E271F、S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F、S103A+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S103A+S188D+A232V+E271F、V104I+S188D+A232V+N248D+E271F、V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D、S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R+E271F、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D、S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R、S103A+V104I+G159D+S188D+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+A232V、T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R、T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R、S103A+V104I+G159D+S188D+E271F、T022A+S103A+G159D+S188D+N248D、T022A+V104I+G159D+S188D+N248D、S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D、V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+G159D+S188D+A232V、T022A+V104I+G159D+S188D+A232V、S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R、V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R、S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F、S103A+G159D+S188D+A232V+N248D、T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+G159D+S188D+E271F、V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F、T022A+V104I+G159D+S188D+E271F、V104I+G159D+S188D+A232V+N248D、S103A+G159D+S188D+N248D+E271F、V104I+G159D+S188D+N248D+E271F、S103A+G159D+S188D+A232V+E271F、V104I+G159D+S188D+A232V+E271F、T022A+G159D+S188D+N248D+E271F、T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R、T022A+G159D+S188D+Q245R+E271F、G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+G159D+S188D+A232V+N248D、G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D、G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F、G159D+S188D+A232V+N248D+E271F或T022A+G159D+S188D+A232V+E271F(列表11)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：S103A+V104I+S188D+Q245R、T022A+S103A+V104I+S188D、S103A+V104I+S188D+A232V、S103A+V104I+G159D+S188D、S103A+V104I+S188D+N248D、S103A+S188D+A232V+Q245R、V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+S188D+Q245R、T022A+V104I+S188D+Q245R、S103A+V104I+S188D+E271F、T022A+S103A+S188D+N248D、T022A+V104I+S188D+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+S188D+A232V、T022A+V104I+S188D+A232V、T022A+S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+A232V+N248D、S103A+S188D+Q245R+E271F、V104I+S188D+A232V+N248D、V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+E271F、S103A+S188D+N248D+E271F、T022A+V104I+S188D+E271F、V104I+S188D+N248D+E271F、S103A+S188D+A232V+E271F、V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R、T022A+S188D+Q245R+E271F、T022A+S188D+N248D+E271F、S188D+A232V+Q245R+N248D、S188D+Q245R+N248D+E271F、T022A+S188D+A232V+N248D、S188D+A232V+Q245R+E271F、S188D+A232V+N248D+E271F、T022A+S188D+A232V+E271F、G159D+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+G159D+S188D、T022A+V104I+G159D+S188D、S103A+G159D+S188D+Q245R、V104I+G159D+S188D+Q245R、S103A+G159D+S188D+N248D、V104I+G159D+S188D+N248D、S103A+G159D+S188D+A232V、V104I+G159D+S188D+A232V、T022A+G159D+S188D+Q245R、S103A+G159D+S188D+E271F、V104I+G159D+S188D+E271F、T022A+G159D+S188D+N248D、T022A+G159D+S188D+A232V、G159D+S188D+A232V+Q245R、G159D+S188D+Q245R+E271F、G159D+S188D+A232V+N248D、T022A+G159D+S188D+E271F、G159D+S188D+N248D+E271F、G159D+S188D+A232V+E271F或S101G+S103A+V104I+S188D(列表12)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：S103A+V104I+S188D、S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+Q245R、V104I+S188D+Q245R、T022A+S103A+S188D、T022A+V104I+S188D、G159D+S188D+Q245R、S103A+S188D+A232V、S103A+G159D+S188D、V104I+S188D+A232V、V104I+G159D+S188D、S103A+S188D+N248D、V104I+S188D+N248D、G159D+S188D+N248D、S188D+A232V+Q245R、T022A+S188D+Q245R、S103A+S188D+E271F、V104I+S188D+E271F、T022A+S188D+N248D、T022A+S188D+A232V、S188D+A232V+N248D、S188D+Q245R+E271F、T022A+S188D+E271F、S188D+N248D+E271F、S188D+A232V+E271F、T022A+G159D+S188D、G159D+S188D+A232V、G159D+S188D+E271F、S101G+S103A+S188D或S101G+V104I+S188D(列表13)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID N0：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D、S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020R-N062E-S078G-G118S-S188D-N248D-H249R、S024R-N062E-G118R-A158E-S188D、T022A-S024R-T033S-G118R-S166D-S188D、S024R-N062E-S078G-G118S-S188D-Q245R-N248D、G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D、G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E、G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D、G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D、S024R-N116L-A158E-S166D、G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D-H249R、G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D、S024R-G118R-S166D、T022A-S024R-T033S-G118R-A158E-S166D-A273V、G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R、T022A-G118R-A158E-S166D、G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D、T022A-S024R-G118R-S166D-S188D、N062E-S078G-G118S-G159D、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248E-E271H、G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-Q245R-N248D、S024R-T033S-N116L-A158E-S166D、S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-Q245R、G020R-N062E-S078D-G118S-Q245R、T022A-S024R-N062E-N116L-A158E、G020R-N062E-S078G-G118D-P129E、S024R-T033S-N062E-N116L-G118R-S188D、G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R、S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D、G020R-N062E-S078G-G118D-S188D-H249R、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248D-E271T、S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248H-E271T、G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-H249R、G020R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R、S024R-N062E-N116L-G118R、T022A-S024R-N116L-G118R-A158E-S188D、S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-Q245R、S024R-N062E-G118R-A158E、G020R-N062E-S078G-G118S-G159D-S188D、G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R、S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R、A098Q-S099T-G102A-S103G、T022A-G118R-S166D-S188D、S024R-S078D-G118S-G159D-S188D-H249R、T022A-S024R-N116L-G118R-S166D-S188D、T022A-N062E-G118R-A158E、G020R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R、S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248E-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248E-E271F、G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-N248D-H249R、S024R-N116L-G118R-S128I-S166D-S188D、G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-H249R、G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D-N248D、G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D、S024R-N062E-S078D-G118S-S188D-H249R、T033S-N062E-G118R、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245T-N248E-E271H、T033S-G118R-A158E-S166D、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248H、G020R-S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R、T022A-S024R-N062E、G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-G159D-S188D-R247L、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248E-E271T、G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245R-N248H、P014S-G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245R-N248E-E271L、G020R-S078D-G118D-G159D-S188D-H249R、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248D-E271T、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232T-Q245T-N248E-E271L、S024R-N062E-S078D-G118S-S188D-Q245R、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232L-Q245R-N248E-E271H、G020R-S078D-G118S-P129E-G159D-H249R、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232S-Q245R-N248H-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245R-N248H-E271H、S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-T213A-A232V、S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-G211Q-T213A-A232V、S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D、G020R-S024R-S078G-G118S-S188D-Q245R、G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R、S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-H249R、G020R-S078G-G118S-G159D-S188D-H249R、G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-S188D-N248D、S078D-G118S-G159D-Q245R、G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-N248D-H249R、S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-Q245R-N248D、G020R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D、S024R-N062E-S078G-G118S-G159D-Q245R、G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-Q245R、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-P210L-A232T-Q245T-N248D-E271T、G0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ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D、S024R-N116L-A158E-S188D、G020K-S024F-S078N-G118R-T213A、T022A-S024R-T033S-N116L-G118R-S128I、G020R-S078D-G118D-S188D-Q245R、S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-T213A-A232V、S024R-N062E-S078G-G118D-G159D-S188D、T022A-N062E-N116L-G118R-A158E-S166D、G020K-T022L-S078N-S166D-L217E、G020R-S078D-G118D-G159D、T022A-S024R-T033S-N116L、G020R-S078D-G118D-P129E-G159D、G020R-S078D-G118D-G159D-H249R、S024R-N062E-S078G-G118S、S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R-H249R、A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V、G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R、S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209V-G211Q-A232V、S024F-S166D-L217E、T022A-S024R-S166D、S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-N248D、A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V、A016S-T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-A232V、S078D-G118S-G159D-N248D-H249R、S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D、T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-S188D、S103A-S128N、T022L-S078N-G118R-S166D-T213A、S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-T213A-A232V、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V、S024R-S078D-G118S-S128N-P129E、S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232T-Q245T-N248D、S024R-T033S-N116L-A158E、S130E-N269K、S024R-T033S-N116L-S128I-A158E、A016V-G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-Q245R-N248D、S099G-S101A-G102A-S103G-V104I、A016S-T022A-S101A-V104L-S128N-L148I、G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-S188D、S259W、S259H、T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、N018D-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-T213A-A232V、G020K-S024F-S078N-S166D-T213A、N076D-S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-0245R、S078D-G118D-P129E-G159D-H249R、S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-N248D、S024R-N062E-S101A-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R、E271R、G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F、G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-Q245R-H249R、Q012R-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V、G020R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D、G020R-N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R、T022A-S101G-S103A-V104I-G118R-S128L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020R-S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V、G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R、G020R-S078G-G118S-G159D-H249R、G020K-T022L-S024F-G118R-S128D-S166D、T022A-S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D、A016S-S103G-V104L、A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V、G020R-S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-S188D-N248D、G020K-T022L-S078N-G118R-S166D、G020K-T213A-L217E、S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R、S078N-S166D-T213A-L217E、S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-H249R、T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V、G020K-T022L-G118R-L217E、T022A-V104L-L111V、T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-S188D-N248D、G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-N248D、T022L-S078N-L217E、G020R-S024R-S078G-G118S-S188D、S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V、T022A-N116L-G118R-A158E-S166D、G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R、T022A-V104I-S128N、S024R-S078G-G118D-Q245R、N062E-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-H249R、T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V、S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R、T022A-T033S-G118R-A158E-S188D、T022A-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024R-S166D-S188D、A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V、T022A-T033S-S128I-A158E、S024R-T033S-N116L-S188D、N062E-N076D-S101A-S103A-V104I-P210I-A232V-Q245R、T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V、S130D、G020K-T022L-S024F-S078N-G118R-S166D-L217E、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232S-Q245V-N248E、S024R-T033S-N116L-S166D-S188D、S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R、T022A-S024R-T033S-A158E-S166D-S188D、G020K-T022L-S024F-S166D-T213A-L217E、T022A-N062E-N116L-G118R-S188D、G020R-S078G-G118D-Q245R-N248D-H249R、T022A-N116L-G118R-S128I、T022L-S078N-S166D、T022L-G118R-S128D、G097P-S099A、T022L-S024F-G118R-S128D、S242K、N062E-S078D-G118S-G159D、A016S-S103G-S128N-L148I、G097P-A098Q-S101A、T022A-S103A-V104L-S128N-L148I、T022A-S101G-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-T213A-A232V-Q245R-N248D-E271F、S099G-S101G-G102A、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-Q245T-N248D、G100S-S101G-V104I、S078D-G118S-G159D-Q245R-N248D、A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-T213A-A232V、T022A-S024R-T033S-N116L-A158E、T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V、T022A-S024R-N116L-S128I-S166D、S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V、S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V、G020R-S078G-G118D-G159D-S188D-N248D、G020R-S078D-G118D-S1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01N-Q109N-N116L-N218D、S024G-S101N-Q109G-S128A-S188D-M222S、S024G-G097A-S101Q-Q109N-S188D-L217Q、S024G-S078N-G097S-S101Q-Q109N-S128A-S188D、S101N-Q109G-M222S、S024G-1072V-G097S-S101N-S128A-L217Q、S101G-S128A、N043R-S078N-G102A-A215G、G020K-S101D-S128L-L217E-S240R、S078N-S101D-S128Q-L217E-S240R、G020K-N116L-S128L-M222S、G020K-N062E-S078N-N116L-T213A-M222S、G020K-N062E-S078N-N116L-S128Q、G020K-N062E-T213A、或G020K-N062E-S078N-N116L-N123G-M222S(列表15)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020K-T022L-S078N-G118R-S128D-T213A、S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-H249R、T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T033S-G118R-S128I-A158E、T022A-S103A-L111V-L148I、T022A-N076D-A085T-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020K-T022L-S078N-S128D-T213A-L217E、T022A-T033S-P129E-S166D、T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020K-S078N-S166D-T213A、T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248D、A158E-S166D-S188D、L021S-T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F、T022A-T033S-N062E-N116L-S188D、T022A-S024G-S049N-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、G097P-A098Q-S099A-S103G-V104I、G020K-S024F-G118R-S128D-S166D、T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024R-T033S-G118R-S166D、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F、N062E-S078D-G118S-P129E-N248D-H249R、T022A-S024G-V026I-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、G097P-A098Q-S099A-S101A、S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R、T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q236R-Q245R-N248D、T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-E271F-A272V、T022A-N076D-N077D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F、S099G-S101A-G102A-S103A、T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-Q245R、S056C、S024R-T033S-N062E-N116L、T022A-S024G-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209A-T213A-A232V、A098Q-S099A-G100S-S101G-V104I、T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V、T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-L090I-S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020R-N062E-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R、A016S-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-T213A-A232V、G020R-S078G-G118D-N248D-H249R、T022A-N062Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S024R-N062E-N116L-A158E-S166D-S188D、T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F、T022A-N062Q-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-1107V-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024R-N116L-G118R、T022A-S024R-T033S-N062E-N116L-G118R-S128I-A158E-S188D、T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S024G-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S024R-T033S-N062E-N116L-S128I-S188D、T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S240V、N062E-G118R、T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-Q245T-N248E、S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-N248D、A016S-S103A-V104I、A088P、T022A-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、G097P-A098F-V104L、T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F、T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020K-T022L-S128D、T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F、G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-S188D-N248D-H249R、S024F-S078N-G118R-L217E、T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-G159D-S18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IDN0：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N204S-G211Q、T022W-S024R-S101A-P210I-T213A、G020R-S101A-G211Q、G020R-S024R-S101A-P210I-G211Q-T213A、G020R-S101A-P210I-T213A、T022W-S024R-N043R-S101A-P210I、G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q、T022R-S101T-S103N-V104L-A232M-Q245R、G020R-T022A-S024R-R045T-S101A-T213A、T022R-S101G-S103N-V104I-A232M-Q245R、G020R-T022W-S024R-S101A-N116L-G211Q-T213A、G020R-T022W-N043R-S101A-N116L-G211Q、G020R-T022W-N043R-R045T-S101A、T022W-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A、G020R-S024R-R045T-S101A-Q109R-P210I-G211Q-T213A、S024R-N043K-S101A-N204D-P210I、G020R-S024R-R045T-S101A-P210I、S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A、G020R-S024R-R045T-S101A-T213A、T022R-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245R、G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N204S-P210I-G211Q、T022W-N043R-S101A-P210I-G211Q、G020R-S024R-N043K-R045T-S101A-N116L-P210I、T022A-S101G-S103A-V104I-1107V-L217Q-A232V-Q245R、S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A、T022R-S101A-S103G-V104I-A232M-Q245R、T022R-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R、S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R、S024R-N043R-S101A-P210I-T213A、T022K-S101N-S103A-V104I-A232T-Q245R、G020R-N043R-S101A-P210I-G211Q、T022R-S101T-S103A-V104I-A232M-Q245R、S024R-V026A-N043R-S101A-P210I-G211Q、T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、T022K-S101T-S103G-V104I-A232L-Q245R、G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q、G020R-S024R-S078G-G118D-Q245R、T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-P129S-A232V-Q245R、T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、G020R-T022W-N043R-S101A-G211Q-T213A、N018K-G020R-S024R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A、G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A、T022R-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R、G020R-S024R-S101A-T213A、T022R-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245R、G020R-T022W-S024R-S101A-G211Q-T213A、T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、S024R-S078G-G118D-P129E-Q245R-H249R、T022R-S101T-S103A-V104L-A232L-Q245R、G020R-S024R-S101A-G211Q-T213A、T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、G020R-T022W-N043R-V051A-S101A-P210I-G211Q、S024R-S078G-G118D-Q245R、N043R-S101A-P210I、T022Y-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245R、G020R-T022W-N043R-S101A-T213A、G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R、T022Y-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245R、G020R-T022W-S024R-F050L-S101A-G211Q-T213A、N018S-T022W-S024R-N043R-S101A-G211Q、T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R、T022R-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245R、T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、S101A-P210I-G211Q-T213A、G020R-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A、T022R-S101A-S103N-V104I-A232M-Q245S、G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-G211Q、G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I、G020R-S024R-S078D-G118S-Q245R、G020R-T022W-S024R-N043R-S101A-P210I-G211Q-T213A、G020R-S024R-N043R-R045T-V051A-S101A-P210I-G211Q、T022A-S101G-S103A-V104I-P129S-L217Q-A232V-Q245R、G020R-S078G-G118D-Q245R-N248D-H249R、T022K-S101A-S103N-V104L-A232T-Q245R、T022A-N076D-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、S024R-N043R-R045T-S101A-P210I、T022A-S024G-G061R-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-0245R、T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、T022Q-S101T-S103A-V104L-A232V-Q245R、G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-G211Q、P014R、T022R-S101A-S103N-V104L-A232M-Q245R、T022K-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245R、G020R-S024R-S078D-G118D-Q245R、T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、G020R-S024R-S101A-P210I-T213A、T022K-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245R、T022Y-S101T-S103A-V104I-A232L-Q245R、T022A-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A、G020R-R045T-S101A-P210I-T213A、G020R-S078D-G118S-Q245R-H249R、G020R-T022W-R045T-V051A-S101A、T022R-S101T-S103A-V104I-A232V-Q245R、N043R-S101A、G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A、T022R-S101G-S103G-V104I-A232L-Q245R、G020R-S101A-P210I、T022K-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245R、G020R-T022W-N043R-V051A-S101A、G020R-T022W-N043R-S101A、G020R-T022W-S024R-N043R-S101A-P210I、G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A、G020R-N043R-R045T-S101A-T213A、T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022Y-S101N-S103N-V104L-A232T-Q245R、G020R-S101A-N116L-P210I-G211Q、T022R-S101A-S103N-V104L-A232L-Q245R、G020R-S024R-N043R-S101A、T022R-S101G-S103A-V104L-A232T-Q245R、G020R-S024R-S101A-G211Q、T022A-S101Q-S103A-V104I-P129S-A232V-Q245R、T022A-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022A-S024G-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、T022K-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245R、G020R-T022W-S024R-R045T-S101A、T022Y-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、S024R-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I-G211Q-T213A、T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、G020R-N043R-S101A-P210I、T022A-S024G-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022R-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245R、P055R、T022A-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245R、G020R-T022W-S024R-N043R-N076D-S101A-P210I-T213A、G020R-T022W-S101A-P210I-T213A、T022Q-S101G-S103A-V104L-A232L-Q245R、T022W-S024R-N043R-R045T-S101A、T022A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022K-S101N-S103A-V104I-A232L-Q245R、T022R-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245R、G0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NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：T022Y-S101N-S103A-V104I-A232T-Q245R、G020R-R045T-S101A-P210I-G211Q-L267F、T022Y-S101N-S103N-V104L-A232M-Q245R、T022A-P052T-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022A-S101G-S103N-V104L-A232T-Q245R、T022Y-S101A-S103N-V104L-A232V-Q245R、T022A-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245R、T022Y-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245R、T022Y-S101G-S103A-V104I-A232T-Q245R、T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022A-S101N-S103N-V104L-A232M-Q245R、T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129S-A232V-Q245R、T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、S024R-S078D-G118S-G159D-Q245R-H249R、T022K-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R、T022R-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245S、T022Q-S101N-S103N-V104I-A232M-Q245R、S024R-S078G-G118D-Q245R-H249R、T022R-S101N-S103N-V104L-A232V-Q245R、T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R、G020R-S024R-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D、T022Y-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022Q-S101N-S103A-V104L-A232L-Q245R、T022Q-S101N-S103N-V104I-A232L-Q245R、T022A-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、T022R-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245S、G020R-S078D-G118D-G159D-Q245R-H249R、T022R-S101N-S103A-V104L-A232M-Q245R、T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R、T022R-S101G-S103N-V104L-A232T-Q245S、G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A、T022Q-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245R、G020R-S024R-N043R-S101A-N204D-T213A、T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R、G020R-S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R-N248D-H249R、S024R-N043R-S101A-P210I、T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A270V、G020R-S024R-S078D-G118S-H249R、S024R-S078G-G118S、T022R-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245S、S024R-N043K-R045T-S101A、T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R-T274A、T022A-S024G-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022Q-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245W、S024R-S078G-G118S-P129E-Q245R-H249R、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、V026W、T022R-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245W、G020R-S024R-S078D-G118S-N248D、G020R-R045T-S101A-N204S-P210I、G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-N248D-H249R、T022Y-S101A-S103N-V104I-A232V-Q245R、T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、S024R-S101A-P210I-G211Q、T022R-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245S、T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R、T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022A-S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R、G020R-S078G-G118S-H249R、S078G-G118S-Q245R-H249R、T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022Y-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245R、T022K-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245R、T022A-S024G-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R、T022Q-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-Q245R-N248D、T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022Q-S101G-S103A-V104L-A232T-Q245R、T022Q-S101T-S103A-V104I-A232T-Q245R、T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022A-S101G-S103A-V104L-A232V-0245R、T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、S024R-N043R-S101A-G211Q-T213A、T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R、S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D、G020R-T022W-S024R-N043R-S101A-N204S-P210I-G211Q、T022A-S024G-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R、T022A-S101G-S103A-V104I-P129S-A232V-Q245R、T022R-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245S、T022A-S024G-I072V-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、T022K-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245W、G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N116L-P210I、T022R-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245W、T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022Y-S101T-S103N-V104L-A232V-Q245R、G020R-S024R-N062E-S078G-G118S-N248D、T022Q-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-S024G-N076D-S078N-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022A-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022A-S024G-N076D-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022R-S101N-S103A-V104I-A232L-Q245S、T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-L217Q-A232V-Q245R、T022R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245W、T022A-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022A-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-P129S-A232V-Q245R、T022A-S101T-S103A-V104I-A232L-Q245R、T022A-A085T-G097S-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022A-S101T-S103N-V104L-S105G-A232M-Q245R、T022A-S101A-S103A-V104I-A232M-Q245S、T022Q-S101A-S103A-V104I-A232M-Q245R、T022Q-S101G-S103A-V104L-A232M-Q245R、T022A-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R、T022A-N076D-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-H120Q-S128A-A232V-Q245R、T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R、G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-Q245R、T022K-S101G-S103G-V104I-A232V-Q245R、S078G-G118S-S188D-Q245R-H249R、T022W-N043R-S101A-G211Q-T213A、T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R、T022Y-S1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ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置：G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-H249R、G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R、T022A-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245S、T022A-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245R、T022Q-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245W、T022W-N043R-S101A-T213A、T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022K-S101N-S103N-V104L-A232T-Q245R、T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、G020R-S024R-N062E-S078G-G118D、G020R-S078G-G118D、T022Y-S101T-S103G-V104L-A232T-Q245R、R010H-T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A272V、T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-A270V-A272V、T022A-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R、G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-Q245R、T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R-A272V、T022K-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245W、T022Q-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245S、T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-Q245R、W113Y、T022A-S101A-S103N-V104I-A232M-Q245S、T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-H249R、T022A-S101N-S103G-V104I-A232T-Q245R、T022K-S101G-S103G-V104I-A232L-Q245R、T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022Q-S1Q1T-S103N-V104I-A232V-Q245S、TQ22A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V、T022A-S101N-S103G-V104L-A232T-Q245R、T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238Y-Q245R、T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022A-N076D-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R、S259W、A016S-T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-A232V、T022W-S101A-P210I-G211Q-T213A、T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、V028T-A215V、S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R、T022Q-S101T-S103A-V104I-A232V-Q245W、T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-Q245R、T022A-S024G-T071A-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、H120P、G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-Q245R、T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022Q-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245W、T022Q-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R、T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I-G211Q、T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、G020R-S078G-G118S-G159D-S188D-H249R、A013S、A232N、T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、I035T、V051M、N123A、G020R-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D、T022Y-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245W、T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-A270V、G020R-S078D-G118S、T022R-S101N-S103N-V104L-A232M-Q245W、T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、T022A-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R、T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-A232V-0245R、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-A232V-Q245R、S024R-R045T-S101A-P210I-G211Q、T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R、T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R、G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-H249R、G020R-S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R、P014W、G020R-S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R-N248D、T022R-S101G-S103N-V104I-A232M-Q245W、T022R-A098V-S101G-S103N-V104L-A232T-Q245R、T022A-S101T-S103A-V104I-A232V-Q245W、G020R-T022W-R045T-S101A-T213A、N043R-R045T-S101A、T022K-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、T022K-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245S、S056V、G020R-T022W-R045T-S101A-G211Q、G020R-S024R-S078D-G118D-Q245R-N248D、G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-V244L-Q245R-N248D、T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R、T022A-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、G020R-T022W-R045T-S101A-N116L-P210I、T022Q-S101N-S103N-V104I-A232M-Q245S、T022Y-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245W、A114V、S141C、T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、S056H、S078D-G118D-Q245R、S024R-N043R-R045T-S101A-T213A、T022Y-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245S、T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、N269W、S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D-H249R、T022W-S024R-R045T-S101A、T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V、T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R、T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V、A122F、S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-H249R、T022K-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245S、S009G-T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-L217Q-A232V-Q245R、A098Q、T022A-S101N-S103A-V104L-A232L-Q245R、T022A-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245W、T022A-S024G-N076D-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R、S024R-S078G-G118D-G159D-H249R、T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-S024G-N076D-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R、T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-A232V-Q245R、T022R-S101N-S103A-V104I-A232M-W241R-Q245W、R045T-S101A-P210I-G211Q、G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-Q245V-N248E、T022Q-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245W、T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-Q245R、T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A223S-A232V-Q245R、T022K-S101T-S103A-V104I-A232T-Q245W、N043R-S101A-G211Q、T022A-S101G-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R、T022A-G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R、G020R-S078G-G118S-P129E-H249R、S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R、N043R-R0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M-Q245S、T022W-S024R-R045T-S101A-N116L-P210I-G211Q、T022W-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A、T038A、S078D-G118S-G159D-Q245R、T022K-S101T-S103A-V104L-A232V-Q245W、T022A-S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R、T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-L217Q-A232V-Q245R、G025S、G025T、A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-M119V-Y209V-G211Q-A232V、T022A-N076D-V084A-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、V011L、T022Y-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245S、T022R-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245S、S240V、G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-S188D-H249R、T022W-S024R-R045T-S101A-G211Q-T213A、T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R、V004Y、V051A、G195W-N269E、S024R-S078G-G118D-N248D-H249R、T022A-S099G-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245S、T022Q-S101T-S103G-V104I-A232L-Q245W、T022Q-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245W、T022A-S101T-S103G-V104I-A232V-Q245W、T022K-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245R、T022Q-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245S、T022R-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R、T022R-S101G-S103A-V104I-M222S-A232V-Q245R-E271H、G020R-S024R-S101N-Q109G-N116L-M222S、R010A-G020R-S024R-S101A-N116L或G020R-N043R-M222S(列表19)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供上述分离的枯草杆菌蛋白酶变体中的任一者，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID N0：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表1，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表2，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表3，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表4，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表5，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表6，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表7，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表8，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表9，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表10，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表11，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表12，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表13，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表14，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表15，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表16，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表17，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表18，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表19，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少85％氨基酸同一性。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少90％氨基酸同一性。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少95％氨基酸同一性。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少98％氨基酸同一性。
本发明还提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID N0：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少99％氨基酸同一性。
本发明还提供上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体中的任一者，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4或-5。在一些实施例中，该总净电荷通过一个或多个选自如下的置换获得：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E、R275H/S、A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236I/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K和/或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，并且其中所述蛋白酶变体(更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体)的氨基酸位置是根据SEQ ID N0：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供分离的蛋白酶变体，更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)具有至少一个、或甚至两个或更多个选自如下的带电突变：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E和/或R275H/S，相对于SEQ ID NO：1的酶优选具有0、-1、-2、-3、-4或-5、优选0、-1、-2或-3、最优选-1或-2的电荷。所述蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)也可以包括本专利申请中所列变体中的任一者。
本发明还提供分离的蛋白酶变体，更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)具有一个或两个或者更多个选自如下的带电突变：A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K和/或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，相对于SEQ ID NO：1的酶优选具有0、+1、+2、+3、+4或+5、优选+1、+2或+3、最优选+2的电荷。所述蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)也可以包括本专利申请中所列变体中的任一者。
在一些实施例中，可将上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体中的任一者掺入适于添加至水中以制备具有低离子强度或低洗涤剂浓度的洗涤液体的洗涤剂组合物中。因此，在本发明的优选方面，这些变体将形成洗涤剂组合物的一部分，该洗涤剂组合物为了手动洗涤或机器洗涤过程而加入水中(通常是洗涤机器内的水中)以形成洗涤液体，其电导率为约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm。用于低离子强度或低洗涤剂浓度的优选变体选自上文的列表9、14、15或16、优选上文的列表14或15、最优选上文的列表15任一者中的变体。
不希望受理论的束缚，但认为这些旨在达到所需的净电荷的突变通过确保该分子对于低离子强度条件或具有低洗涤剂浓度的洗涤液体的最佳电荷来提供增强的总体蛋白酶性能-仅通过某些突变(其中这些突变是优选的)的仔细组合即可获得此类优选的蛋白酶。
在一些实施例中，可将上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体中的任一者掺入适于添加至水中以制备具有高离子强度或高洗涤剂浓度的洗涤液体的洗涤剂组合物中。因此，在本发明的优选方面，这些变体将形成洗涤剂组合物的一部分，该洗涤剂组合物为了手动洗涤或机器洗涤过程而加入水中(通常是洗涤机器内的水中)以形成洗涤液体，其电导率为约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。用于高离子强度或高洗涤剂浓度的优选变体选自上文的列表1或17、18或19、优选上文的列表17或18、最优选上文的列表17任一者中的变体。
不希望受理论的束缚，但认为这些旨在达到所需的净电荷的突变通过确保该分子对于高离子强度条件或具有高洗涤剂浓度的洗涤液体的最佳电荷来提供增强的总体蛋白酶性能-仅通过某些突变(其中这些突变是优选的)的仔细组合即可获得此类优选的蛋白酶。
优选地，这些蛋白酶形成这样的洗涤剂组合物的一部分，该洗涤剂组合物在手动或机器洗涤过程加入水中(通常是洗涤机器内的水中)以形成洗涤液体，其电导率为大于约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。
不希望受理论的束缚，但认为这些旨在达到所需的净电荷的突变在高离子强度或高洗涤剂浓度条件下提供增强的总体蛋白酶性能-仅通过某些突变(其中这些突变是优选的)的仔细组合即可获得此类优选的蛋白酶。
本发明还提供具有如下特征中的一者或多者的上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体中的任一者：a)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法2性能指数；b)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法3性能指数；c)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法4性能指数；和/或d)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法6性能指数；和/或e)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约15、1.1至约10或甚至1.1至约7的测试方法7性能指数。在下文实例1中标题为“测试方法”的部分中明确描述了测试方法2、测试方法3、测试方法4、测试方法6和测试方法7。
本发明的核酸
本发明提供分离的、非天然存在的或重组的核酸(在本文中也称为“多核苷酸”)，其可统称为“本发明的核酸”或“本发明的多核苷酸”，其编码本发明的多肽。本发明的核酸(包括下文描述的全部核酸在内)可用于本发明多肽的重组生产(如表达)，通常是通过表达包含编码所关注的多肽或其片段的序列的质粒表达载体来进行。如上面所论述，多肽包括变体蛋白酶多肽，包括具有酶活性(如蛋白水解活性)的变体枯草杆菌蛋白酶多肽，其可用于清洁应用和清洁组合物，以供清洁需要进行清洁的物品或表面(如物品的表面)。
在一些实施例中，本发明提供分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码在以上题为“本发明的多肽”的章节中以及本文其他地方描述的任何本发明多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本发明还提供分离、重组、实质上纯的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码本发明上述和本文其他地方所述的任何多肽中两种或更多种的组合的核苷酸序列。
还提供分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的核酸，其包含编码具有蛋白水解活性的变体蛋白酶的多核苷酸序列，所述变体蛋白酶(如变体枯草杆菌蛋白酶)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相差不超过50、不超过40、不超过30、不超过35、不超过25、不超过20、不超过19、不超过18、不超过17、不超过16、不超过15、不超过14、不超过13、不超过12、不超过11、不超过10、不超过9、不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2或不超过1个氨基酸残基的氨基酸序列，其中该变体枯草杆菌蛋白酶的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号，如通过该变体蛋白酶氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对所确定的。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表1的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表2的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表3的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表4的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表5的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表6的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表7的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表8的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表9的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表10的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表11的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表12的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表13的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表14的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表15的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表16的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表17的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表18的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表19的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码上述分离的枯草杆菌蛋白酶变体中的任一者的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表1，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表2，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表3，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表4，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表5，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表6，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表7，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表8，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表9，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表10，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表11，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表12，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表13，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表14，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表15，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表16，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表17，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表18，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ IDNO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自19，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少85％氨基酸同一性。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少90％氨基酸同一性。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少95％氨基酸同一性。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID N0：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少98％氨基酸同一性。
本发明提供编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列出的，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少99％氨基酸同一性。
本发明还提供编码上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体中的任一者的核酸，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4或-5。在一些实施例中，该总净电荷通过一个或多个选自如下的置换获得：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E、R275H/S、A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，并且其中所述蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID N0：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供编码分离的蛋白酶变体(更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体)的核酸，其中所述蛋白酶变体具有至少一个、或甚至两个或更多个选自如下的带电突变：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E和/或R275H/S，相对于SEQ ID NO：1的酶优选具有0、-1、-2、-3、-4或-5、优选0、-1、-2或-3、最优选-1或-2的电荷。所述蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)也可以包括本专利申请中所列变体中的任一者。
本发明还提供分离的蛋白酶变体，更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体具有一个或两个或者更多个选自如下的带电突变：A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K和/或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V和/或N269R，相对于SEQ ID NO：1的酶优选具有0、+1、+2、+3、+4或+5、优选+1、+2或+3、最优选+2的电荷。所述蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)也可以包括本专利申请中所列变体中的任一者。
如本文所指出的，合适的冷水蛋白酶变体或枯草杆菌蛋白酶变体是亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶的序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少97％、至少99％或100％同一性，所述蛋白酶变体具有如下特性中的一者或多者：
a)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法2性能指数；b)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法3性能指数；c)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法4性能指数；和/或d)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法6性能指数；和/或e)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约15、1.1至约10或甚至1.1至约7的测试方法7性能指数。在下文实例1中标题为“测试方法”的部分中明确描述了测试方法2、测试方法3、测试方法4、测试方法6和测试方法7。本文提及的所有突变均利用如图1所示的BPN’编号方案。在一些实施例中，本文提及的变体是指具有利用BPN’编号方案与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，上述高离子强度冷水蛋白酶变体(更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体)构成洗涤剂组合物的一部分，将该洗涤剂组合物稀释于水中，通常是洗衣机内的水中，以形成衣物洗涤剂洗涤液体，其电导率为约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。
冷水蛋白酶变体(更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体)的电荷是相对于具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶野生型来表示的。赋予单个负电荷的氨基酸为D和E，赋予单个正电荷的那些氨基酸为R、H和K。任何相对于SEQ ID NO：2可改变电荷的氨基酸变化均可用于计算冷水蛋白酶变体的电荷。例如，从野生型中性位置引入负电荷突变将给冷水蛋白酶变体添加净电荷-1，而从野生型正电荷氨基酸残基(R、H或K)引入负电荷突变(D或E)将添加净电荷-2。将冷水蛋白酶变体的相对于具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶野生型而言不同的所有氨基酸残基的电荷变化进行加和，可得到冷水蛋白酶变体的电荷变化。不希望受理论束缚，但认为：对于待用于低电导率衣物洗涤剂溶液中的冷水蛋白酶，优选的电荷范围为-5、-4、-3、-2、-1、0，尤其为是-2、-1；对于待用于高电导率衣物洗涤剂溶液中的冷水蛋白酶，优选的电荷范围为+5、+4、+3、+2、+1、0，尤其是+2、+1。通过正确选择电荷，可获得水平得到出乎意料的改善的冷水清洁性能。“低电导率衣物洗涤剂溶液”定义为具有约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm的电导率。“高电导率衣物洗涤剂溶液”定义为具有约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm或甚至约4mS/cm至约10mS/cm的电导率。上述例子旨在是非限制性的。一旦将各突变进行组合以优化冷水性能时，还可以通过在另外的位置的突变来平衡酶电荷。
在一些实施例中，本发明提供分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的变体蛋白酶(如变体枯草杆菌蛋白酶)，所述变体蛋白酶包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列相差不超过50、不超过45、不超过40、不超过35、不超过30、不超过25、不超过20、不超过19、不超过18、不超过17、不超过16、不超过15、不超过14、不超过13、不超过12、不超过11、不超过10、不超过9或不超过8个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号，如通过该变体蛋白酶氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对所确定的。
本发明的核酸可通过使用任何合适的合成、操纵和/或分离技术或这些技术的组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可用标准的核酸合成技术，如本领域技术人员所熟知的固相合成技术来制备。在这类技术中，通常合成多达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(如通过酶连接方法或化学连接方法，或者聚合酶介导的重组方法连接)以形成基本上任何所需的连续核酸序列。还可通过本领域已知的任何合适方法促进(或者完成)本发明核酸的合成，包括但不限于利用经典亚磷酰胺方法(参见例如Beaucage等人，TetrahedronLetters(《四面体通讯》)22：1859-69[1981])；或Matthes等人描述的方法(参见Matthes等人，EMBO J.(《欧洲分子生物学组织杂志》)3：801-805[1984]描述的方法(其为自动合成方法中通常采用的)进行化学合成。本发明的核酸也可以通过使用自动DNA合成仪来制备。定制的核酸可从多个商业来源订购(如米德兰认证试公司(Midland Certified ReagentCompany)、大美国基因公司(Great American Gene Company)、操纵子技术公司(OperonTechnologies Inc.)和DNA2.0公司)。其他合成核酸的技术和相关原理是本领域已知的(参见例如Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.(《生物化学年评》)53：323[1984]；以及Itakura等人，Science(《科学》)198：1056[1984])。
如上文所指出的，可用于修饰核酸的重组DNA技术是本领域所熟知的。例如，诸如限制性内切酶消化、连接、逆转录和cDNA产生以及聚合酶链反应(如PCR)之类的技术是已知的并且易于由本领域技术人员采用。本发明的核苷酸还可以通过使用一种或多种可与编码本发明变体蛋白酶多肽的多核苷酸杂交或对其进行PCR扩增的寡核苷酸探针来筛选cDNA文库(如使用本领域通常使用的诱变技术(包括本文所述的那些)产生的cDNA文库)而获得。筛选和分离cDNA克隆的程序和PCR扩增程序是本领域技术人员所熟知的，并在本领域技术人员已知的标准参考文献中描述。本发明的一些核酸可通过利用例如已知的诱变程序(如定点诱变、位点饱和诱变以及体外重组)来改变天然存在的多核苷酸骨架(如编码酶或亲本蛋白酶的多核苷酸骨架)来获得。
制备本发明的经修饰的变体蛋白酶的方法
多种适用于产生编码本发明变体蛋白酶的本发明经修饰的多核苷酸的方法是本领域已知的，包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、***诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及各种其他重组方法。制备经修饰的多核苷酸和蛋白质(如变体蛋白酶)的方法包括DNA改组方法；基于基因的非同源重组的方法，例如ITCHY(参见Ostermeier等人，Bioorg.Med.Chem.(《生物有机化学和药物化学》)7：2139-44[1999])、SCRACHY(参见Lutz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(《美国国家科学院院刊》)98：11248-53[2001])、SHIPREC(参见Sieber等人，Nat.Biotechno1.(《自然生物技术》)19：456-60[2001])和NRR(参见Bittker等人，Nat.Biotechno1.(《自然生物技术》)20：1024-9[2001]；Bittker等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)101：7011-6[2004])；以及依赖于使用寡核苷酸来***随机和定向突变、缺失和/或***的方法(参见Ness等人，Nat.Biotechno1.(《自然生物技术》)20：1251-5[2002]；Coco等人，Nat.Biotechno1.(《自然生物技术》)20：1246-50[2002]；Zha等人，Chembiochem.(《化学生物化学》)4：34-9[2003]；Glaser等人，J.Immuno1.(《免疫性杂志》)149：3903-13[1992])。
用于产生本发明的变体蛋白酶的载体、细胞和方法
本发明提供包含至少一种本文所述的本发明多核苷酸(如编码本文所述的本发明变体蛋白酶的多核苷酸)的分离的或重组的载体；包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的分离的或重组的表达载体或表达盒；包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的分离的、实质上纯的或重组的DNA构建体；包含至少一种本发明的多核苷酸的分离的或重组的细胞；包含含有至少一种本发明的多核苷酸的细胞的细胞培养物；包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的细胞培养物；和包含一种或多种此类载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或它们的任何组合或混合物的组合物。
在一些实施例中，本发明提供包含至少一种本发明的载体(如表达载体或DNA构建体)的重组细胞，所述载体包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸。一些这类重组细胞转化有或转染有所述至少一种载体。这类细胞通常称为宿主细胞。一些此类细胞包括细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供包含至少一种本发明的变体蛋白酶的重组细胞(如重组宿主细胞)。
在一些实施例中，本发明提供包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施例中，载体是表达载体或表达盒，其中编码本发明变体蛋白酶的本发明多核苷酸序列有效连接至一个或多个为进行有效基因表达所需的核酸区段(例如与编码本发明变体蛋白酶的本发明多核苷酸有效连接的启动子)。载体可包含转录终止子和/或选择基因，如抗生素抗性基因，该抗性基因使得能通过在含有抗微生物剂的培养基中培养而对质粒感染的宿主细胞进行连续的培养维持。
表达载体可衍生自质粒或病毒DNA，或在备选实施例中，含有这二者的元件。示例性的载体包括但不限于pXX、pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting[编辑]，第3章，Molecular Biological Methods for Bacillus(《芽孢杆菌的分子生物学方法》)，约翰威立父子公司(John Wiley & Sons)[1990]；适于枯草芽孢杆菌的复制型质粒包括第92页列出的那些；还可参见Perego，Integrational Vectors for Genetic Manipulationsin Bacillus subtilis(用于枯草芽孢杆菌中的遗传操纵的整合载体)，载于：Sonenshein等人[编辑]Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria：Biochemistry， Physiology and Molecular Genetics(《枯草芽孢杆菌及其他***：生物化学、生理学和分子遗传学》)，华盛顿特区美国微生物学会(American S ociety forMicrobiology，Washington，D.C.)[1993]，第615-624页)。
为了在细胞中表达和产生所关注的蛋白质(如变体蛋白酶)，将至少一个包含至少一个拷贝(优选包含多个拷贝)的编码经修饰的蛋白酶的多核苷酸的表达载体在适于表达该蛋白酶的条件下转化进细胞中。在本发明的一些实施例中，将编码变体蛋白酶的多核苷酸序列(以及载体中包含的其他序列)整合进宿主细胞的基因组中，而在其他实施例中，将包含编码变体蛋白酶的多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合进宿主细胞基因组中的输入核苷酸序列二者。本文所述的载体可用于产生本发明的变体蛋白酶。在一些实施例中，编码变体蛋白酶的多核苷酸构建体存在于整合型载体上，该整合型载体使得编码变体蛋白酶的多核苷酸能整合以及任选扩增进细菌染色体中。整合位点的例子是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本发明变体蛋白酶的多核苷酸的转录通过对所选择的前体蛋白酶而言是野生型启动子的启动子来实现。在一些其他实施例中，启动子对于前体蛋白酶而言是异源的，但在宿主细胞中有功能。具体而言，适用于细菌宿主细胞中的启动子的例子包括但不限于例如amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌(B.pumilis)木聚糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动予以及噬菌体λPR或PL启动子，和大肠杆菌lac、trp或tac启动子。
本发明的变体蛋白酶可在任何合适的革兰氏阳性微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。例如，在一些实施例中，变体蛋白酶在真菌和/或细菌来源的宿主细胞中产生。在一些实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌、链霉(Streptomyces sp.)、埃希杆菌(Escherichia sp.)或曲霉(Aspergillus sp.)。在一些实施例中，变体蛋白酶由芽孢杆菌宿主细胞产生。可用于产生本发明变体蛋白酶的芽孢杆菌宿主细胞的例子包括但不限于地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞用于产生变体蛋白酶。美国专利5,264,366和4,760,025(RE34,606)描述了多种可用于产生本发明变体蛋白酶的芽孢杆菌宿主菌株，但可以使用其他合适的菌株。
可用于产生本发明变体蛋白酶的多种工业细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌菌株，以及天然存在的菌株的变体和/或重组菌株。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码所关注的多肽的多核苷酸已引入该宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，尤其是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC39,087)、ATCC21332、ATCC6051、MI113、DE100(ATCC39,094)、GX4931、PBT110和PEP211菌株(参见例如Hoch等人，Genetics(《遗传学》)73：215-228[1973]；还可参见美国专利No.4,450,235和No.4,302,544以及EP0134048，将它们每一者以引用的方式全文并入)。枯草芽孢杆菌用作表达宿主细胞是本领域众所周知的(参见例如Palva等人，Gene(《基因》)19：81-87[1982]；Fahnestock和Fischer，J.Bacterio1.(《细菌学杂志》)，165：796-804[1986]；以及Wang等人，Gene(《基因》)69：39-47[1988])。
在一些实施例中，芽孢杆菌宿主细胞是在如下基因中的至少一者中包括突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。优选地，突变是在degU基因中，并且更优选突变是在degU(Hy)32中(参见例如Msadek，J.Bacterio1.(《细菌学杂志》)172：824-834[1990]；以及Olmos等人，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)253：562-567[1997])。一种合适的宿主菌株是携带degU32(Hy)突变的枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，芽孢杆菌宿主包含在以下基因中的突变或缺失：scoC4(参见例如Caldwell等人，J.Bacterio1.(《细菌学杂志》)183：7329-7340[2001])；spoIIE(参见例如Arigoni等人，Mol.Microbio1.(《分子微生物学》)31：1407-1415[1999])；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如Perego等人，Mol.Microbio1.(《分子微生物学》)5：173-185[1991])。实际上，可设想opp操纵子中的导致与oppA基因中的突变相同的表型的任何突变将可用于本发明的变更的芽孢杆菌菌株的一些实施例。在一些实施例中，这些突变单独地出现，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可用于产生本发明的变体蛋白酶的变更的芽孢杆菌宿主细胞菌株是已在上述基因中的一者或多者中包含突变的芽孢杆菌宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的突变和/或缺失的芽孢杆菌宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如美国专利申请公开No.2005/0202535，该专利以引用方式并入本文)。
使用任何合适的本领域已知的方法用至少一条编码至少一种本发明变体蛋白酶的核酸转化宿主细胞。无论是将核酸整合进载体中还是在不存在质粒DNA的情况下使用核酸，通常将其引入微生物中，在一些实施例中，优选引入大肠杆菌细胞或感受态芽孢杆菌细胞中。利用质粒DNA构建体或载体并将此类质粒DNA构建体或载体转化进芽孢杆菌细胞或大肠杆菌细胞中来将核酸(如DNA)引入此类细胞中的方法是所熟知的。在一些实施例中，随后从大肠杆菌细胞分离该质粒并转化进芽孢杆菌细胞中。然而，使用诸如大肠杆菌之类的中间微生物不是必需的，在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌宿主中。
本领域的技术人员十分知道适于将本发明的核酸或多核苷酸引入芽孢杆菌细胞中的方法(参见例如Ferrari等人，“Genetics”(遗传学)载于：Harwood等人[编辑]Bacillus(《芽孢杆菌》)，普莱南出版公司[1989]，第57-72页；Saunders等人，J.Bacterio1.(《细菌学杂志》)157：718-726[1984]；Hoch等人，J.Bacterio1.(《细菌学杂志》)93：1925-1937[1967]；Mann等人，Current Microbio1.(《当代微生物学》)13：131-135[1986]；Holubova，Folia Microbio1.(《微生物学报》)30：97[1985]；Chang等人，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)168：11-115[1979]；Vorobjeva等人，FEMS Microbio1.Lett.(《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》)7：261-263[1980]；Smith等人，Appl.Env.Microbio1.(《应用与环境微生物学》)51：634[1986]；Fisher等人，Arch.Microbio1.(《微生物学档案》)139：213-217[1981]；以及McDonald，J.Gen.Microbio1.(《普通微生物学杂志》)130：203[1984])。实际上，诸如转化(包括原生质体转化和中板集合(congression)、转导和原生质体融合)之类的方法是众所周知的并且适用于本发明。使用转化方法将包含编码本发明变体蛋白酶的核酸的DNA构建体或载体引入宿主细胞中。本领域已知的转化芽孢杆菌细胞的方法包括诸如质粒标志补救(marker rescue)转化之类的方法，质粒标志补救转化涉及携带部分同源的内生质粒(resident plasmid)的感受态细胞摄入供体质粒(Contente等人，Plasmid(《质粒》)，2：555-571[1979]；Haima等人，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)，223：185-191[1990]；Weinrauch等人，J.Bacterio1.(《细菌学杂志》)，154：1077-1087[1983]；以及Weinrauch等人，J.Bacterio1.(《细菌学杂志》)169：1205-1211[1987])。在该方法中，输入的供体质粒与内生的“辅助”质粒的同源区在模拟染色体转化的过程中发生重组。
除了通常使用的方法，在一些实施例中，直接用包含编码本发明变体蛋白酶的核酸的DNA构建体或载体转化宿主细胞(即在引入宿主细胞之前，不使用中间细胞来扩增该DNA构建体或载体，或未对该DNA构建体或载体以别的方式处理)。将本发明的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的那些在不***质粒或载体的情况下将核酸序列(如DNA序列)引入宿主细胞中的物理和化学方法。这类方法包括但不限于氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法、脂质体法等等。在另外的实施例中，将DNA构建体或载体与质粒共同转化，而不***进质粒中。在另一个实施例中，通过本领域已知的方法从已改变的芽孢杆菌菌株缺失掉选择标记(参见Stahl等人，J.Bacterio1.(《细菌学杂志》)158：411-418[1984]；以及Palmeros等人，Gene(《基因》)247：255-264[2000])。
在一些实施例中，将本发明的转化的细胞在常规营养培养基中培养。合适的具体培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且在科学文献中很好地进行了描述。在一些实施例中，本发明提供包含至少一种本发明的变体蛋白酶或至少一种本发明的核酸的培养物(如细胞培养物)。还提供的是包含至少一种本发明的核酸、载体或DNA构建体的组合物。
在一些实施例中，将用编码至少一种本发明变体蛋白酶的至少一条多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本发明蛋白酶表达的条件下在合适的营养培养基中培养，此后从该培养物回收所得的蛋白酶。用于培养细胞的培养基包含任何适于培养宿主细胞的常规培养基，如含有适当的补充成分的基本培养基和复合培养基。合适的培养基可从商业供应商获得或可根据公布的配方(参见，例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)的目录)制备。在一些实施例中，通过常规的程序从培养基回收由细胞产生的蛋白酶，包括但不限于例如，通过离心或过滤从培养基分离出宿主细胞、借助于盐(如硫酸铵)沉淀出上清液或滤液的蛋白质组分、进行色谱纯化(如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等)。任何适于回收或纯化变体蛋白酶的方法均可用于本发明。
在一些实施例中，由重组宿主细胞产生的变体蛋白酶分泌进培养基中。编码利于纯化的结构域的核酸序列可用来利于可溶性蛋白质的纯化。包含编码变体蛋白酶的多核苷酸序列的载体或DNA构建体还可包含编码利于纯化的结构域的核酸序列，以利于纯化变体蛋白酶(参见例如Kroll等人，DNA Cell Biol.(《DNA细胞生物学》)12：441-53[1993])。此类利于纯化的结构域包括但不限于，例如金属螯合肽，如使得可以在固定化金属上进行纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath，Protein Expr.Purif.(《蛋白质表达和纯化》)3：263-281[1992])、使得可以在固定化免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域、以及FLAGS延伸/亲和纯化***中利用的结构域(如可得自华盛顿州西雅图英姆纳克斯公司(Immunex Corp.，Seattle，WA)的蛋白A结构域)。在纯化结构域与异源蛋白质之间包括可切割的接头序列如XA因子或肠激酶(如可得自加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen，San Diego，CA)的序列)也可用于利于纯化。
用于检测和测量酶(如本发明的变体蛋白酶)的酶活性的测定法是所熟知的。各种用于检测和测量蛋白酶(例如本发明的变体蛋白酶)的活性的测定法也是本领域一般技术人员已知的。具体而言，可用于测量蛋白酶活性的测定法有基于酸可溶性肽从酪蛋白或血红蛋白的释放，以280nm处的吸光度进行测量或使用本领域的技术人员熟知的福林法进行比色测量。其他示例性的测定法涉及显色底物的增溶(参见例如Ward，“Proteinases”(蛋白酶)，载于：Fogarty(编辑)，Microbial Enzymes and Biotechnology(《《微生物酶和生物技术》》)，伦敦应用科学出版社(Applied Science，London)，[1983]，第251-317页)。其他示例性测定法包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定法(suc-AAPF-pNA)和2，4，6-三硝基苯磺酸钠盐测定法(TNBS测定法)。本领域人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如Wells等人，Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)11：7911-7925[1983]；Christianson等人，Anal.Biochem.(《分析生物化学》)223：119-129[1994]；以及Hsia等人，Anal Biochem.(《分析生物化学》)242：221-227[1999])。
有多种方法可用于测定成熟蛋白酶(例如本发明的成熟变体蛋白酶)在宿主细胞中的产生水平。这类方法包括但不限于例如利用对该蛋白酶有特异性的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)和荧光激活细胞分选法(FACS)。这些和其他测定法是本领域所熟知的(参见例如Maddox等人，J.Exp.Med.(《实验医学杂志》)158：1211[1983])。
在一些其他实施例中，本发明提供用于制备或产生本发明的成熟变体蛋白酶的方法。成熟变体蛋白酶不包含信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞，例如芽孢杆菌细胞(如枯草芽孢杆菌细胞)中制备或产生本发明的变体蛋白酶。在一些实施例中，本发明提供产生本发明的变体蛋白酶的方法，该方法包括在有利于产生该变体蛋白酶的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸。一些这类方法还包括从培养物回收变体蛋白酶。
在一些实施例中本发明提供产生本发明的变体蛋白酶的方法，所述方法包括：(a)将包含编码本发明变体蛋白酶的核酸的重组表达载体引入一群细胞(例如细菌细胞，如枯草芽孢杆菌细胞)中；以及(b)在有利于产生由该表达载体编码的变体蛋白酶的条件下在培养基中培养该细胞。一些这类方法还包括：(c)从细胞或从培养基分离变体蛋白酶。
织物和家庭护理产品
在一些实施例中，本发明的蛋白酶变体(更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体)可用于包含辅助材料和蛋白酶变体的组合物，其中该组合物为织物和家庭护理产品。
在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物包含至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表1-19的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
本发明还提供上述分离的枯草杆菌蛋白酶变体中的任一者，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物包含至少一种迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中所述GG36蛋白酶为具有蛋白水解活性的成熟形式以及具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表1-19，并且其中该蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID N0：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物包含上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体中的任一者，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4或-5。在一些实施例中，该总净电荷通过一个或多个选自如下的置换获得：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E、R275H/S、A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，并且其中所述蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID N0：1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物的枯草杆菌蛋白酶变体衍生自市售的亲本枯草杆菌蛋白酶(例如 LIQUINASESAVINASE或(由诺维信公司销售)； 和PURAFECTPURAFASTTM、PRIME或(由杰能科国际公司销售)以及可得自汉高/凯米拉公司的那些，即BLAP(US5,352,604的图29中示出的序列，具有如下突变S99D+S101R+S103A+V104I+G159S，下文中称为BLAP)和BLAP X(具有S3T+V4I+V205I的BLAP)。
在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物包含至少一种蛋白酶变体，该蛋白酶变体的亲本具有蛋白水解活性，其中该变体蛋白酶包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列相差不超过50、不超过40、不超过35、不超过30、不超过25、不超过20、不超过19、不超过18、不超过17、不超过16、不超过15、不超过14、不超过13、不超过12、不超过11、不超过10、不超过9或不超过8个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨基酸位置是根据SEQ ID NO：1所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号，如通过该变体蛋白酶氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对所确定的。
清洁和/或处理组合物
在一些实施例中，包含清洁和/或处理组合物的消费品如织物和家庭护理产品包含至少一种蛋白酶变体(尤其是枯草杆菌蛋白酶变体)和至少一种辅助材料。在一些实施例中，掺入这些辅助材料，例如以帮助或增强清洁性能以便处理待清洁的基底，或改变清洁组合物的美观性，如利用香料、着色剂、染料等情形就是如此。应当理解，这些助剂是本发明的变体蛋白酶的补充。这些另外的组分的精确性质以及其掺入的水平将取决于组合物的物理形式和打算使用组合物的清洁操作的性质。清洁和/或处理辅助材料可选自来自列表的一者或多者，该列表包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定***、螯合剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物软化剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂、包含香料的囊粒、调色剂、表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、额外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢移除/抗再沉淀剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、弹性增进剂、织物软化剂、水溶助长剂、溶剂以及它们的混合物(参见例如美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，所有专利都以引用的方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施例在下文中举例说明。在清洁和/或处理辅助材料与清洁组合物中的本发明变体蛋白酶不相容的实施例中，则使用保持清洁辅助材料与该蛋白酶分离(即，相互不接触)直至两种组分适宜进行组合的合适方法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如明胶胶囊法(gelcap)、包封法、片剂法、物理分离法等)。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)还包含至少一种另外的选自如下的非免疫等价性蛋白酶：枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)；胰蛋白酶样蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶；金属蛋白酶；以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)还包含至少一种另外的选自如下的非免疫等价性蛋白酶：源自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)的枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)；源自纤维单胞菌(Cellulomonas)的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶；源自解淀粉芽孢杆菌的金属蛋白酶；以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)还包含至少一种另外的选自如下的酶：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、纤维二糖脱氢酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣聚糖酶、葡聚糖酶、***糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)还包含至少一种另外的选自如下的酶：第一洗涤脂肪酶；α-淀粉酶；细菌清洁纤维素酶；以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)还包含如下中的至少一者：包含香料的囊粒，其包含香料微胶囊；调色剂，其包含选自具有550nm至650nm的峰值吸收波长的碱性染料、酸性染料、疏水性染料、直接染料和聚合物染料及染料缀合物以及它们的混合物的材料；去污表面活性剂，其包含选自阴离子型去污表面活性剂、非离子型去污表面活性剂、阳离子型去污表面活性剂、两性离子型去污表面活性剂和两性型去污表面活性剂以及它们的混合物的材料；助洗剂，其包含选自沸石、磷酸盐以及它们的混合物的材料；硅酸盐，其包含选自硅酸钠、硅酸钾以及它们的混合物的材料；增白剂，其包含选自冷水溶性增白剂以及它们的混合物的材料；羧酸系聚合物，其包含选自马来酸系/丙烯酸系无规共聚物或聚丙烯酸系均聚物以及它们的混合物的材料；去污聚合物，其包含选自对苯二甲酸酯共聚物以及它们的混合物的材料；纤维素聚合物，其包含选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素以及它们的混合物的材料；漂白催化剂，其包含选自亚胺阳离子、亚胺聚离子的材料；亚胺两性离子；改性胺；改性氧化胺；N-磺酰亚胺；N-膦酰亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮以及它们的混合物；漂白活化剂，其包含选自十二烷酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3，5，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)以及它们的混合物的材料；过氧化氢的来源，其包含选自无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸的钠盐(通常为一水合物或四水合物)、过碳酸的钠盐、过硫酸的钠盐、过磷酸的钠盐、过硅酸的钠盐以及它们的任何混合物的材料；螯合剂，其包含选自DTPA(二亚乙基三胺五醋酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、1,2--二羟基苯-3，5-二磺酸二钠盐水合物、所述螯合剂的衍生物的材料；以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)包含选自如下的织物调色剂：染料；染料-粘土缀合物，其包含至少一种阳离子-碱性染料和绿土；以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)包含选自小分子染料和聚合物染料以及它们的混合物的至少一种织物调色剂，任选具有绿土。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)以单隔室或多隔室单位剂量提供。在一些实施例中，该组合物是多隔室单位剂量，其中该蛋白酶变体处于与任何过氧化氢源和/或螯合剂和/或另外的酶不同的隔室中。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)包含如下成分中的一者或多者(以总组合物重量计)：约0.0005重量％至约0.1重量％、约0.001重量％至约0.05重量％或甚至约0.002重量至约0.03重量％的所述蛋白酶变体；以及如下物质中的一者或多者：约0.00003重量％至约0.1重量％的织物调色剂；约0.001重量％至约5重量％的香料囊粒；约0.001重量％至约1重量％的冷水溶性增白剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的漂白催化剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的第一洗涤脂肪酶；约0.00003重量％至约0.1重量％的细菌清洁纤维素酶；和/或约0.05重量％至约20重量％的Guerbet非离子型表面活性剂。
在一些实施例中，清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)为液体衣物洗涤剂、盛具洗涤剂。
意图是，清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)以任何合适的形式(包括液体或固体)提供。清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)可以为单位剂量小袋的形式，尤其是在为液体形式时，并且通常，清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)至少部分地，或甚至完全地被水溶性小袋封闭。另外，在包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)的一些实施例中，清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)可具有上文详细描述的参数和/或特性的任何组合。除非另作说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组分或组合物的活性物水平，并且市售来源中可能存在的杂质(例如残余溶剂或副产物)排除在外。酶组分重量是以总活性蛋白质计。除非另作说明，否则所有百分比和比率都以重量计算。除非另作说明，否则所有百分比和比率都是以总组合物计算。在示例性的洗涤剂组合物中，酶水平是以纯酶占总组合物的重量比表示，并且除非另作规定，否则洗涤剂成分是以占总组合物的重量比表示。
有利地，本发明的清洁组合物用于例如洗衣应用、硬质表面清洁、盛具洗涤应用，以及美容应用，如假牙、牙齿、毛发和皮肤。此外，由于在较低温度溶液中效用提高的独特优势，本发明的酶理想地适合于衣物洗涤应用。此外，本发明的酶可用于颗粒状和液体组合物。
本发明的变体蛋白酶还可用于清洁添加剂产品。在一些实施例中，可使用低温溶液清洁应用。在一些实施例中，本发明提供清洁添加剂产品，其包含至少一种本发明的酶，当需要额外漂白效用时，该清洁添加剂产品理想地适于包括在洗涤过程中。此类情形包括(但不限于)低温溶液清洁应用。在一些实施例中，添加剂产品为其最简单的形式，即一种或多种蛋白酶。在一些实施例中，添加剂被包装成用于添加至清洁过程的剂型。在一些实施例中，添加剂被包装成用于添加至采用过氧源并且增加的漂白效用是所需的清洁过程中的剂型。任何合适的单一剂量单位形式都可用于本发明，包括但不限于：丸剂、片剂、明胶胶囊，或其他单一剂量单位例如预先计量的粉末或液体。在一些实施例中，包括填料或载体材料以增加所述组合物的体积。合适的填料或载体材料包括(但不限于)多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石、粘土等。适于液体组合物的填料或载体材料包括(但不限于)水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。这些醇的例子包括(但不限于)甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物含有约5％至约90％的这类材料。酸性填料可用于降低pH。或者，在一些实施例中，清洁添加剂包含辅助成分，下文将予以更完整地描述。
本发明清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本文所提供蛋白酶变体(更具体而言本文所提供的枯草杆菌蛋白酶变体)中的至少一者，其单独使用或与其他蛋白酶和/或另外的酶组合。所要求的酶水平通过添加一种或多种本发明的蛋白酶变体(更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体)来实现。通常，本发明清洁组合物包含至少约0.0001重量％、约0.0001至约10重量％、约0.001至约1重量％或甚至约0.01至约0.1重量％的至少一种本发明变体蛋白酶。
通常配制本文的清洁组合物而使得，在水性清洁操作中的使用期间，洗涤水的pH为约5.0至约11.5或甚至约7.5至约10.5。液体产品制剂通常配制成净pH为约3.0至约9.0或甚至约3至约5。颗粒状洗衣用产品通常配制成pH为约9至约11。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且这些技术是本领域技术人员众所周知的。
合适的“低pH清洁组合物”的净pH通常为约3至约5，并且通常不含在这种pH环境中水解的表面活性剂。这类表面活性剂包括包含至少一个氧化乙烯部分或甚至约1至约16摩尔的氧化乙烯的烷基硫酸钠表面活性剂。这类清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，用以使此类清洁组合物的净pH为约3至约5。这些组合物通常包含至少一种酸稳定性酶。在一些实施例中，所述组合物为液体，而在其它实施例中，其为固体。这类液体组合物的pH通常是以净pH度量。这类固体组合物的pH是以所述组合物的10％固形物溶液度量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，除非另作说明，否则所有pH测量值都是在20℃下取得。
在一些实施例中，当颗粒组合物或液体中采用变体蛋白酶时，期望变体蛋白酶为封装颗粒的形式，以在存储过程中保护变体蛋白酶免受该颗粒组合物的其他组分的影响。此外，封装还是控制变体蛋白酶在清洁过程期间的利用度的方式。在一些实施例中，封装可增强变体蛋白酶和/或其他酶的性能。就这一点而言，本发明的变体蛋白酶使用本领域已知的任何合适的封装材料封装。在一些实施例中，封装材料通常包封本发明变体蛋白酶的催化剂的至少一部分。通常，封装材料具有水溶性和/或水分散性。在一些实施例中，封装材料的玻璃化转变温度(Tg)为0℃或更高。玻璃化转变温度在WO97/11151中进行了更详细的描述。封装材料通常选自如下：碳水化合物、天然的或合成的树胶、甲壳质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡以及它们的组合。当封装材料是碳水化合物时，其通常选自单糖、寡糖、多糖以及它们的组合。在一些典型的实施例中，封装材料是淀粉(参见例如EP0922499；US4,977,252；US5,354,559和US5,935,826)。在一些实施例中，封装材料是由诸如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及它们的混合物之类的塑料制成的微球体；可使用的市售微球体包括(但不限于)由(瑞典的斯托克韦斯文肯(Stockviksverken，Sweden))以及PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、和(宾夕法尼亚州翠谷的PQ公司(PQ，Corp.，Valley Forge，PA))提供的微球体。
如本文所述，本发明的变体蛋白酶尤其可用于清洁行业，包括但不限于衣物和盛具洗涤剂。这些应用使酶处于各种环境压力下。本发明的变体蛋白酶由于其在各种条件下的稳定性，提供了优于多种当前使用的酶的优点。
实际上，洗涤中所涉及的蛋白酶暴露于多种洗涤条件，包括变化的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，不同地理区域中使用的洗涤剂制剂在洗涤水中存在不同浓度的其相关组分。例如，欧洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有约4500-5000ppm的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂通常在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。在北美，尤其是在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。
低洗涤剂浓度***包括在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。日本的洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度***，因为其在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。
中等洗涤剂浓度包括在洗涤水中存在介于约800ppm至约2000ppm之间的洗涤剂组分的洗涤剂。北美的洗涤剂一般被认为是中等洗涤剂浓度***，因为其在洗涤水中具有大约975ppm的洗涤剂组分。巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。
高洗涤剂浓度***包括在洗涤水中存在超过约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲的洗涤剂一般被认为是高洗涤剂浓度***，因为其在洗涤水中具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲的洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，而且拉丁美洲中使用的洗涤剂的范围可在中等洗涤剂浓度至高洗涤剂浓度之间，因为其在洗涤水中具有1500ppm至6000ppm的洗涤剂组分。如上所述，巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其它高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂地理区域(不限于其它拉丁美洲国家)也可具有在洗涤水中存在最高达约6000ppm的洗涤剂组分的高洗涤剂浓度***。
按照前述内容，很明显在全世界范围内，典型洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度在低于约800ppm洗涤剂组合物(“低洗涤剂浓度地理区域”，例如在日本约667ppm)至介于约800ppm至约2000ppm之间(“中等洗涤剂浓度地理区域”，例如在美国约975ppm，在巴西约1500ppm)再到高于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地理区域”，例如在欧洲约4500ppm至约5000ppm，以及在高泡磷酸盐助洗剂地理区域中约6000ppm)间变动。
典型的洗涤溶液的浓度凭经验确定。例如，在美国，典型洗涤机器容纳约64.4L体积的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液内获得约975ppm的洗涤剂浓度，须将约62.79g洗涤剂组合物添加至64.4L洗涤溶液中。该量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯计量加入洗涤水中的典型量。
再举个例子，不同地理区域使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水温度通常低于欧洲所用的洗涤水温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常介于约10℃至约30℃之间(例如为约20℃)，而欧洲的洗涤水温度通常介于约30℃至约60℃之间(例如为约40℃)。然而，为了节省能源，许多消费者转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，通常将冷水用于洗衣以及餐具洗涤应用。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”利用适用于在约10℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或约15℃至约25℃，以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合和在10℃至40℃内的所有范围的温度下进行洗涤的“冷水洗涤剂”。
再举个例子，不同地理区域通常具有不同的水硬度。水硬度经常按每加仑混合的Ca2+/Mg2+的格令数(grain)来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。在美国，大多数水都较硬，但硬度有波动。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm(ppm换算成每美制加仑格令数是ppm数除以17.1等于每加仑格令数)的硬度矿物质。
水 每加仑格令数 份每一百万份
软 低于1.0 低于17
略硬 1.0达3.5 17达60
中等硬 3.5达7.0 60达120
硬 7.0达10.5 120达180
极硬 高于10.5 高于180
欧洲的水硬度通常是每加仑的混合的Ca2+/Mg2+高于约10.5(例如约10.5至约20.0)格令(例如每加仑的混合的Ca2+/Mg2+为约15格令)。北美的水硬度通常高于日本的水硬度，但小于欧洲的水硬度。例如，北美的水硬度可介于约3至约10格令、约3至约8格令之间或为约6格令。日本的水硬度通常小于北美的水硬度，通常小于约4，例如每加仑混合的Ca2+/Mg2+为约3格令。
因此，在一些实施例中，本发明提供的变体蛋白酶在至少一组洗涤条件(如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)下显示出惊人的洗涤性能。在一些实施例中，本发明的变体蛋白酶与其他枯草杆菌蛋白酶的洗涤性能相当。在一些实施例中，与目前市售的枯草杆菌蛋白酶相比本发明的变体蛋白酶表现出增强的洗涤性能。因此，在本发明的一些实施例中，本文提供的变体蛋白酶表现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的在各种条件下的清洁能力和/或增强的螯合剂稳定性。此外，本发明的变体蛋白酶可用于不包含洗涤剂的清洁组合物，该变体蛋白酶同样是单独使用或与助洗剂和稳定剂组合。
在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，清洁组合物包含水平为约0.00001％至约10％的至少一种本发明变体蛋白酶，以及以组合物的重量计，余量(例如约99.999％至约90.0％)包含清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的至少一种变体蛋白酶，清洁组合物的余量(如约99.9999重量％至约90.0重量％、约99.999重量％至约98重量％、约99.995重量％至约99.5重量％)包含清洁辅助材料。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种另外的洗涤酶，该酶可提供清洁性能和/或织物护理和/或盘碟洗涤益处。合适的酶的例子包括但不限于：半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、***糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的任何组合或混合物。在一些实施例中，使用包含常规应用性酶的酶组合(即“混合物(cocktail)”)，如使用蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶联合淀粉酶。
除本文提供的蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)，任何其他合适的蛋白酶也均可用于本发明的组合物。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些。在一些实施例中，使用微生物蛋白酶。在一些实施例中，包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子包括枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属的那些(如枯草杆菌蛋白酶、迟缓芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。另外的例子包括美国专利No.RE34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628中描述的那些突变型蛋白酶，所有这些专利以引用方式并入本文。另外的蛋白酶的例子包括但不限于胰蛋白酶(如猪或牛来源的胰蛋白酶)和WO89/06270中描述的镰刀菌(Fusarium)蛋白酶。在一些实施例中，可用于本发明的市售蛋白酶包括但不限于例如MAXACALTM、MAXAPEMTM、 OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM和PURAFASTTM(杰能科公司)； DURAZYMTM、 (诺维信公司)；BLAPTM和BLAPTM变体(德国杜塞尔多夫的汉高股份两合公司(Henkel Kommanditgesellschan auf Aktien，Duesseldorf，Germany))和KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶；日本东京花王株式会社(Kao Corp.，Tokyo，Japan))。在W095/23221、WO92/21760、美国专利公开No.2008/0090747和美国专利No.5,801,039、No.5,340,735、No.5,500,364、No.5,855,625、US RE34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628以及多个其他专利中描述了多种蛋白酶。在一些其他实施例中，金属蛋白酶可用于本发明，包括但不限于WO07/044993中描述的中性金属蛋白酶。
此外，任何合适的脂肪酶均可用于本发明。合适的脂肪酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。本发明涵盖经过化学方式或遗传修饰的突变体。可用的脂肪酶的例子包括柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP258068和EP305216)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP238023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶，如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极假丝酵母脂肪酶A或B；例如参见EP331376)、假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(例如参见EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(例如参见EP214761)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(例如参见GB1，372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学报)，1131：253-260[1993])；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶[参见例如JP64/744992]；和短小芽孢杆菌脂肪酶[参见例如WO91/16422])。
此外，多种克隆的脂肪酶可用于本发明一些实施例中，包括但不限于：沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，Gene(《基因》)103：61-67[1991])、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，J.Biochem.(《生物化学杂志》)，106：383-388[1989])以及各种根霉(Rhizopus)脂肪酶，例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等人，Gene(《基因》)109：117-113[1991])、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.(《分析生物化学》)56：716-719[1992])和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
其他类型的脂肪分解酶(例如角质酶)也可用于本发明的一些实施例，包括但不限于源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO88/09367)和衍生自豌豆根腐镰刀菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见WO90/09446)。
其它合适的脂肪酶包括市售脂肪酶，如M1LIPASETM、LUMA FASTTM和LIPOMAXTM(杰能科公司)；和ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE PTM“Amano”(日本的天野制药株式会社(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，Japan))。
在本发明一些实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％的另外的脂肪酶，以组合物重量计余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％脂肪酶的脂肪酶。
在本发明的一些实施例中，任何合适的淀粉酶都可用于本发明。在一些实施例中，也可使用适用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如α和/或β淀粉酶)。合适的淀粉酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。可用于本发明的淀粉酶包括但不限于从地衣芽孢杆菌获得的α-淀粉酶(参见例如GB1,296,839)。可用于本发明的市售淀粉酶包括但不限于： STAINZYME和BANTM(诺维信公司)以及POWERASETM、和P(杰能科公司)。
在本发明一些实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外淀粉酶的淀粉酶，以组合物重量计余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％淀粉酶的淀粉酶。
在一些其他实施例中，任何合适的纤维素酶都都可用于本发明的清洁组合物。合适的纤维素酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。合适的纤维素酶包括(但不限于)特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶(例如参见美国专利No.4,435,307)。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理有益效果的纤维素酶(例如参见EP0495257)。可用于本发明中的市售纤维素酶包括(但不限于)：(诺维信公司)和KAC-500(B)TM(花王株式会社)。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分缺失(例如参见美国专利No.5,874,276)。在一些实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外纤维素酶的纤维素酶，并且以组合物重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％纤维素酶的纤维素酶。
任何适用于洗涤剂组合物中的甘露聚糖酶也可用于本发明。合适的甘露聚糖酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。各种可用于本发明的甘露聚糖酶是已知的(参见例如美国专利No.6,566,114、美国专利No.6,602,842和美国专利No.6,440,991，所有这些专利均以引用方式并入本文)。在一些实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外甘露聚糖酶的甘露聚糖酶，并且以组合物重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％甘露聚糖酶的甘露聚糖酶。
在一些实施例中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)联合用于本发明组合物中。在一些可供选择的实施例中，氧化酶与氧气联合使用。这两种类型的酶优选连同增强剂一起用于“溶液漂白”(即，当织物一起在洗涤液中洗涤时防止纺织物染料由染色的织物转移到另一织物)(例如参见WO94/12621和WO95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包括(但不限于)植物、细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，以本发明清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶。
在一些实施例中，可使用另外的酶，包括(但不限于)过水解酶(例如参见WO05/056782)。此外，在一些实施例中，本文涵盖上述酶的混合物，尤其是一种或多种另外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，可设想这些酶的各种混合物都可用于本发明。还设想到，变体蛋白酶与一种或多种另外的酶的不同水平都可独立地在最高达约10％的范围内，该清洁组合物的余量为清洁辅助材料。易于通过考虑待清洁表面、物品或织物以及针对在使用(例如通过使用洗涤剂)期间清洁条件所需的组合物形式来具体选择清洁辅助材料。
在一些实施例中，在可用于清洁多种需要去除蛋白质污渍的表面的组合物中包含有效量的一种或多种本文提供的变体蛋白酶。这些清洁组合物包括用于诸如清洁硬质表面、织物和盛具之类的应用的清洁组合物。实际上，在一些实施例中，本发明提供织物清洁组合物，而在其他实施例中，本发明提供非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提供适于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理(包括洁牙剂、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物)、皮肤和毛发清洁组合物。意在使本发明涵盖任何形式(即，液体、颗粒状、条状、半固体、凝胶、乳液、片剂、胶囊等)的洗涤剂组合物。
举例来说，在下文更详细地描述了几种在其中可使用本发明变体蛋白酶的清洁组合物。在本发明的清洁组合物被配制成适合在洗衣机洗涤方法中使用的组合物的一些实施例中，本发明组合物优选包含至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种清洁辅助材料，所述清洁辅助材料优选选自有机聚合化合物、漂白剂、另外的酶、抑泡剂、分散剂、石灰皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂。在一些实施例中，洗衣组合物还含有软化剂(即作为另外的清洁辅助材料)。本发明组合物还可使用固体或液体形式的洗涤添加剂产品。所述添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可在洗涤过程的任何阶段添加。在一些实施例中，在20℃下测量时，本文中衣物洗涤剂组合物的密度在约400至约1200g/L的范围内，而在其它实施例中，其在约500至约950g/L组合物的范围内。
在配制为在人工盛具洗涤方法中使用的组合物的实施例中，本发明组合物优选含有至少一种表面活性剂，以及优选至少一种另外的选自如下的清洁辅助材料：有机聚合化合物、泡沫增强剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和另外的酶。
在一些实施例中，各种清洁组合物(例如美国专利No.6,605,458中提供的那些组合物)可与本发明的变体蛋白酶一起使用。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是紧凑型颗粒织物清洁组合物，而在其他实施例中，所述组合物是可用于清洗有色织物的颗粒织物清洁组合物，在另外的实施例中，所述组合物是通过洗涤能力进行软化的颗粒织物清洁组合物，在其他实施例中，所述组合物是重垢型液体织物清洁组合物。在一些实施例中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是织物清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中所述的那些组合物。此外，本发明的变体蛋白酶可用于在欧洲或日本洗涤条件下特别具有实用性的颗粒衣物洗涤组合物中(参见例如美国专利No.6,610,642)。
在一些备选的实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的变体蛋白酶的硬质表面清洁组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642、No.6,376,450和No.6,376,450中所述的组合物。
在另外其他实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的变体蛋白酶的盛具洗涤组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中所述的那些组合物。在一些其他实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的变体蛋白酶的盛具洗涤组合物。在一些其他实施例中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物包含口腔护理组合物，例如美国专利No.6,376,450和No.6,376,450中所述的那些组合物。上述美国专利No.6,376,450、No.6,605,458、No.6,605,458和No.6,610,642中所包含的化合物和清洁辅助材料的配制和描述可用于本文提供的变体蛋白酶。
本发明清洁组合物被配制成任何合适的形式并且由配制者选择的任何方法制备，其非限制性例子描述于美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中，所有这些专利均以引用方式并入本文。当低pH清洁组合物是所需的时，通过添加诸如单乙醇胺或酸性材料(如HCl)之类的材料来调整此类组合物的pH。
本文所公开的清洁组合物可用于清洁位置(situs)(例如表面、物品、盛具或织物)。通常，使所述位置的至少一部分与纯的形式的本发明清洁组合物或在洗涤液中稀释的本发明清洁组合物的实施例接触，随后任选洗涤和/或漂洗所述位置。出于本发明的目的，“洗涤”包括(但不限于)擦洗和机械搅动。在一些实施例中，清洁组合物在溶液中通常以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述位置包括织物时，水与织物的质量比通常为约1：1至约30：1。
下面给出关于合适的清洁和/或处理辅助剂的更多细节。
织物调色剂。
尽管除了噻吩偶氮染料以外还掺入另外的调整织物色光的染料(fabric shadingdye)并不是优选的，但组合物可包含一种或多种另外的织物调色剂。合适的织物调色剂包括染料、染料-粘土缀合物和颜料。合适的染料包括相较于沉积于诸如聚酯和/或尼龙之类的合成纺织物上更多地会沉积于棉纺织物上的那些染料。另外合适的染料包括相较于棉更多地会沉积于诸如聚酯和/或尼龙之类的合成纤维上的那些染料。合适的染料包括小分子染料和聚合染料。合适的小分子染料包括选自属于如下颜色索引(C.I.)分类的染料的小分子染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或它们的混合物。小分子染料的例子包括选自：颜色索引(英国布拉德福德市染色工作者学会(Society of Dyers and Colourists，Bradford，UK))号直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159、选自颜色索引(英国布拉德福德市染色工作者学会)号酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71的小分子染料。直接紫小分子染料可能是优选的。选自酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113以及它们的混合物的染料可能是优选的。
合适的聚合染料包括：选自如下的聚合染料：含有共价键合的发色团的聚合物(染料-聚合物缀合物)和具有共聚进聚合物主链中的发色团的聚合物以及它们的混合物；以及选自如下的聚合染料：以(美国南卡罗来纳州斯帕坦堡市美利肯公司(Milliken，Spartanburg，South Carolina，USA))名称出售的织物直接着色剂(fabric-substantive colorant)、由至少一种活性染料和一种聚合物形成的染料-聚合物缀合物，其中所述聚合物选自包含选自羟基部分、伯胺部分、仲胺部分、硫醇部分以及它们的混合形式的部分的聚合物。在又一个方面中，合适的聚合染料包括选自如下的聚合染料：(美国南卡罗来纳州斯帕坦堡市美利肯公司)紫CT；与活性蓝、活性紫或活性红染料缀合的羧甲基纤维素(CMC)，如与C.I.活性蓝19缀合的CMC，由爱尔兰威克洛市美加姆公司(Megazyme，Wicklow，Ireland)以产品名称AZO-CM-CELLULOSE、产品代码S-ACMC出售；烷氧基化三苯基-甲烷聚合物着色剂、烷氧基化噻吩聚合物着色剂；以及它们的混合物。优选的另外的调色染料包括见于WO08/87497A1中的增白剂。这些增白剂可由如下结构(I)表征：
其中R1和R2可独立地选自：
a)[(CH2CR′HO)x(CH2CR″HO)yH]，其中R’选自H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH以及它们的混合形式；其中R”选自H、CH2O(CH2CH2O)zH以及它们的混合形式；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
b)R1＝烷基、芳基或芳基烷基并且R2＝[(CH2CR′HO)x(CH2CR″HO)yH]其中R’选自H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH以及它们的混合形式；其中R”选自H、CH2O(CH2CH2O)zH以及它们的混合形式；其中x+y≤10；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
c)R1＝[CH2CH(OR3)CH2OR4]并且R2＝[CH2CH(O R3)CH2O R4]其中R3选自H、(CH2CH2O)zH以及它们的混合形式；并且其中z＝0至10；
其中R4选自(C1-C16)烷基、芳基以及它们的混合形式；并且
d)其中R1和R2可独立地选自：随后加成1至10个氧化烯单元的氧化苯乙烯、缩水甘油基甲基醚、异丁基缩水甘油基醚、异丙基缩水甘油基醚、叔丁基缩水甘油基醚、2-乙基己基缩水甘油基醚以及缩水甘油基十六烷基醚的氨基加成产物。
可掺入本发明组合物中的优选的另外的织物调色剂可由如下结构(II)表征：
其中R’选自H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH以及它们的混合形式；其中R”选自H、CH2O(CH2CH2O)zH以及它们的混合形式；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5。
另一优选的另外的调色染料可由如下结构(III)表征：
这种染料通常为平均每分子具有3-10个EO基团、优选5个EO基团的化合物的混合物。
更另外的调整色光的染料是USPN200834511A1(联合利华公司(Unilever))中所描述的那些染料。优选的试剂是“溶剂紫13”。
合适的染料粘土缀合物包括选自包含如下项的组的染料粘土缀合物：至少一种阳离子/碱性染料和绿土，以及它们的混合物。在另一方面，合适的染料粘土缀合物包括选自由一种阳离子/碱性染料和一种粘土组成的组的染料粘土缀合物，所述阳离子/碱性染料选自：C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性棕1至23、CI碱性黑1至11，所述粘土选自：蒙脱土粘土、锂蒙脱石粘土、皂石粘土以及它们的混合物。在又一个方面中，合适的染料粘土缀合物包括选自如下的染料粘土缀合物：蒙脱土碱性蓝B7C.I.42595缀合物、蒙脱土碱性蓝B9C.I.52015缀合物、蒙脱土碱性紫V3C.I.42555缀合物、蒙脱土碱性绿G1C.I.42040缀合物、蒙脱土碱性红R1C.I.45160缀合物、蒙脱土C.I.碱性黑2缀合物、锂蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595缀合物、锂蒙脱石碱性蓝B9C.I.52015缀合物、锂蒙脱石碱性紫V3C.I.42555缀合物、锂蒙脱石碱性绿G1C.I.42040缀合物、锂蒙脱石碱性红R1C.I.45160缀合物、锂蒙脱石C.I.碱性黑2缀合物、皂石碱性蓝B7C.I.42595缀合物、皂石碱性蓝B9C.I.52015缀合物、皂石碱性紫V3C.I.42555缀合物、皂石碱性绿G1C.I.42040缀合物、皂石碱性红R1C.I.45160缀合物、皂石C.I.碱性黑2缀合物，以及它们的混合物。
合适的颜料包括选自如下的颜料：黄烷士酮、阴丹酮、含有1至4个氯原子的氯化阴丹酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4，9，10-四羧酸二酰亚胺，其中所述酰亚胺基团可未被取代或被C1-C3烷基或者苯基或杂环基取代，并且其中苯基和杂环基可另外带有不会赋予水中溶解性的取代基；蒽嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二嗪颜料、每分子可含有最多2个氯原子的铜酞菁、多氯铜酞菁或每分子含有最多14个溴原子的多溴氯铜酞菁，以及它们的混合物。尤其优选的是颜料蓝15至20，尤其是颜料蓝15和/或16。其他合适的颜料包括选自群青蓝(C.I.颜料蓝29)、群青紫(C.I.颜料紫15)以及它们的混合物的那些颜料。合适的调色剂在US7,208,459B2中有更详细的描述。
囊粒。组合物可包含囊粒。在一个方面中，囊粒包括芯、具有内表面和外表面的外壳，所述外壳囊封所述芯。芯可包含任何洗涤护理助剂，但通常芯可包含选自如下的材料：香料；增白剂；染料；驱昆虫剂；有机硅；蜡；风味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂，在一个方面中为石蜡；酶；抗细菌剂；漂白剂；感知物(sensate)；以及它们的混合物；并且所述外壳可包含选自如下的材料：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，任选含有其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一个方面中，所述氨基塑料可包含聚脲、聚氨基甲酸酯和/或聚脲-氨基甲酸酯，在一个方面中所述聚脲可包含聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一个方面中，所述多糖可包含海藻酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物；水不溶性无机物；有机硅；以及它们的混合物。优选的囊粒包含香料。优选的囊粒包括可包含三聚氰胺甲醛和/或交联三聚氰胺甲醛的外壳。优选的囊粒包括芯材料和外壳，已公开至少部分地环绕所述芯材料的所述外壳。至少75％、85％或甚至90％的所述囊粒的断裂强度可为0.2MPa至10MPa，并且以全部的初始囊封的有益剂计，有益剂渗漏率为0％至20％，或甚至不到10％或5％。优选的是这样的囊粒：其中至少75％、85％或甚至90％的所述囊粒可具有(i)1微米至80微米、5微米至60微米、10微米至50微米，或甚至15微米至40微米的粒度，和/或(ii)至少75％、85％或甚至90％的所述囊粒可具有30nm至250nm、80nm至180nm、或甚至100nm至160nm的粒子壁厚度。在将囊粒添加至所述组合物中之前、期间或之后，可将甲醛清除剂与囊粒一起使用，例如用于胶囊浆料中和/或添加至组合物中。合适的胶囊可通过遵循USPA2008/0305982A1和/或USPA2009/0247449A1的教导来制备。或者，合适的胶囊可购自美国威斯康星州阿普尔顿市阿普莱顿纸业公司(Appleton Papers Inc.，Appleton，Wisconsin USA)。
在一个优选的方面中，优选除囊粒以外，组合物还可包含沉积助剂。优选的沉积助剂选自阳离子和非离子聚合物。合适的聚合物包括阳离子淀粉、阳离子羟乙基纤维素、聚乙烯基甲醛、刺槐豆胶、甘露聚糖、木葡聚糖、罗望子胶、聚对苯二甲酸乙二醇酯以及含有甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，任选具有一个或多个选自包含丙烯酸和丙烯酰胺的组的单体的聚合物。
香料。优选的本发明组合物包含香料。通常，该组合物包含具有一种或多种选自在WO08/87497中所描述的组的香料原料的香料。然而，可使用可用于洗涤护理组合物中的任何香料。将香料掺入本发明组合物中的优选方法是通过囊封香料粒子来实现，该粒子包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或改性聚乙烯醇。在一个方面中，囊粒包含(a)包含一种或多种水溶性羟基化合物，优选淀粉的至少部分水溶性固体基质；以及(b)由固体基质囊封的香料油。在另一方面中，香料可与多胺，优选聚乙烯亚胺预先络合，以形成席夫碱。
聚合物。组合物可包含一种或多种聚合物。例子有任选经改性的羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡淀-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(例如聚丙烯酸酯)、顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
组合物可包含一种或多种两亲性清洁聚合物，例如具有如下通式结构的化合物：双((C2HsO)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-双((C2H5O)(C2H4O)n)，其中n＝20至30，并且x＝3至8，或者它们的硫酸化或磺化变体。在一个方面中，该聚合物被硫酸化或磺化以提供两性离子污物悬浮聚合物。
组合物优选包含两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物，这些聚合物具有平衡的亲水性质和疏水性质，以便它们从织物和表面移除油脂粒子。优选的两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物包含芯结构和多个连接至该芯结构的烷氧基化物基团。这些聚合物可包含烷氧基化聚亚烷基亚胺，优选具有内部的聚氧化乙烯嵌段和外部的聚氧化丙烯嵌段。通常，这些聚合物可以0.005至10重量％、通常0.5至8重量％的量掺入本发明组合物中。
烷氧基化聚羧酸酯，例如由聚丙烯酸酯制备的那些，在本文中可用于提供额外的油脂移除性能。这类材料描述于WO91/08281和PCT90/01815中。从化学上来讲，这些材料包含每7-8个丙烯酸酯单元具有一个乙氧基侧链的聚丙烯酸酯。这些侧链具有式-(CH2CH2O)m(CH2)nCH3，其中m为2-3并且n为6-12。这些侧链通过酯键连接至聚丙烯酸酯“主链”以提供“梳状”聚合物型结构。分子量可变化，但通常在约2000至约50,000的范围内。这类烷氧基化聚羧酸酯可占本文组合物的约0.05重量％至约10重量％。
助表面活性剂与其他辅助成分的混合物特别适于与两亲性接枝共聚物一起使用。优选的两亲性接枝共聚物包含(i)聚乙二醇主链；以及(ii)至少一个选自聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇以及它们的混合形式的侧挂部分。优选的两亲性接枝共聚物是由巴斯夫公司(BASF)供应的Sokalan HP22。合适的聚合物包括无规接枝共聚物，优选具有聚氧化乙烯主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链的聚乙酸乙烯酯接枝聚氧化乙烯共聚物。聚氧化乙烯主链的分子量优选为约6000并且聚氧化乙烯与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60并且每50个氧化乙烯单元不超过1个接枝点。通常，这些共聚物以0.005至10重量％，更通常为0.05至8重量％的量掺入本发明组合物中。组合物优选包含一种或多种羧酸酯聚合物，例如顺丁烯二酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一个方面中，羧酸酯聚合物是聚丙烯酸酯均聚物，其分子量为4,000Da至9,000Da，或为6,000Da至9,000Da。通常，这些聚合物以0.005至10重量％，或0.05至8重量％的量掺入本发明组合物中。
组合物优选包含一种或多种去污聚合物。例子包括具有如由下式(IV)、(V)或(VI)之一定义的结构的去污聚合物：
(IV)-[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d
(V)-[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e
(VI)-[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f
其中：
a、b和c是1至200；
d、e和f是1至50；
Ar是1，4-取代的亚苯基；
sAr是在5位上被SO3Me取代的1，3-取代的亚苯基；
Me是Li、K、Mg/2、Ca/2、Al/3、铵、单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵，其中这些烷基是C1-C18烷基或C2-C10羟烷基，或它们的混合形式；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H或C1-C18正构或异构烷基；并且
R7是直链或支链C1-C18烷基，或直链或支链C2-C30烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或C8-C30芳基，或C6-C30芳烷基。
合适的去污聚合物是聚酯去污聚合物，例如由罗地亚公司(Rhodia)供应的Repel-o-tex聚合物，包括Repel-o-tex SF、Repel-o-tex SF-2和Repel-o-tex SRP6。其他合适的去污聚合物包括由科莱恩公司(Clariant)供应的Texcare聚合物，包括Texcare SRA100、Texcare SRA300、Texcare SRN100、Texcare SRN170、Texcare SRN240、Texcare SRN300和Texcare SRN325。其他合适的去污聚合物是由萨索尔公司(Saso1)供应的Marloquest聚合物，例如Marloquest SL。
组合物优选包含一种或多种纤维素聚合物，包括选自如下的那些纤维素聚合物：烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素。优选的纤维素聚合物选自包含如下的组：羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物。在一个方面中，羧甲基纤维素具有0.5至0.9的羧甲基取代度以及100,000Da至300,000Da的分子量。
酶.组合物优选包含一种或多种酶。优选的酶可提供清洁性能和/或织物护理有益效果。合适的酶的例子包括(但不限于)半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、***糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或它们的混合物。典型的组合是酶混合液，其可包含例如蛋白酶和脂肪酶连同淀粉酶。当存在于组合物中时，以组合物的重量计，上述另外的酶可以约0.00001％至约2％、约0.0001％至约1％、或甚至约0.001％至约0.5％的酶蛋白质水平存在。
蛋白酶.组合物优选包含一种或多种蛋白酶。合适的蛋白酶包括金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，包括中性或碱性微生物丝氨酸蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些。在一个方面中，这样合适的蛋白酶可源于微生物。这些合适的蛋白酶包括上述合适的蛋白酶的化学或遗传修饰突变体。在一个方面中，合适的蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶和/或胰蛋白酶型蛋白酶。合适的中性或碱性蛋白酶的例子包括：
(a)枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)，包括源于如下的那些蛋白酶：芽孢杆菌属，例如描述于US 6,312,936 B1、US 5,679,630、US4,760,025、US 7,262,042和WO 09/021867中的迟缓芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌。
(b)胰蛋白酶型或胰凝乳蛋白酶型蛋白酶，例如胰蛋白酶(例如源于猪或牛)，包括描述于WO 89/06270中的镰刀菌蛋白酶以及描述于WO 05/052161和WO 05/052146中的源于纤维单胞菌的胰凝乳蛋白酶。
(c)金属蛋白酶，包括描述于WO 07/044993A2中的源于解淀粉芽孢杆菌的那些蛋白酶。
优选的蛋白酶包括源于吉氏芽孢杆菌或迟缓芽胞杆菌的那些蛋白酶。
合适的市售蛋白酶酶类包括：由诺维信公司(丹麦)以如下商标名出售的那些酶： LiquanaseSavinase 和由杰能科国际公司以如下商标名出售的那些酶： PurafectPurafect 和Purafect由苏威酶业公司(Solvay Enzymes)以商标名和出售的那些酶；可获自汉高/凯米拉公司的那些酶，即BLAP(US5,352,604的图29中所示的序列，具有如下突变：S99D+S101 R+S103A+V104I+G159S，下文中称为BLAP)、BLAP R(具有S3T+V4I+V199M+V205I+L217D的BLAP)、BLAP X(具有S3T+V4I+V205I的BLAP)以及BLAP F49(具有S3T+V4I+A194P+V199M+V205I+L217D的BLAP)-均来自汉高/凯米拉公司；以及来自花王株式会社的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶，具有突变A230V+S256G+S259N)。
淀粉酶。优选地，组合物可包含淀粉酶。合适的α-淀粉酶包括源于细菌或真菌的那些淀粉酶。包括化学或遗传修饰突变体(变体)。优选的碱性α-淀粉酶源于芽孢杆菌属菌株，例如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌属物种，例如芽孢杆菌属物种NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513、DSM9375(USP7,153,818)、DSM12368、DSMZ no.12649、KSM AP1378(WO97/00324)、KSM K36或KSM K38(EP1,022,334)。优选的淀粉酶包括：
(a)描述于WO94/02597、WO94/18314、WO96/23874和WO97/43424中的变体，尤其为相对于在WO96/23874中以SEQ ID No.2列出的酶在如下位置中的一者或多者具有置换的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
(b)描述于USP5,856,164以及WO99/23211、WO96/23873、WO00/60060和WO06/002643中的变体，尤其为相对于在WO06/002643中以SEQ ID No.12列出的AA560酶在如下位置具有一个或多个置换的变体：
26、30、33、82、37、106、118、128、133、149、150、160、178、182、186、193、203、214、231、256、257、258、269、270、272、283、295、296、298、299、303、304、305、311、314、315、318、319、339、345、361、378、383、419、421、437、441、444、445、446、447、450、461、471、482、484，优选还含有D183*和G184*的缺失。
(c)展现与WO06/002643中的SEQ ID No.4，即来自芽孢杆菌SP722的野生型酶具有至少90％同一性的变体，尤其是在183和184位置上具有缺失的变体以及描述于WO00/60060中的变体，该文献以引用的方式并入本文。
(d)展现与来自芽孢杆菌属物种707的野生型酶(US6,093，562中的SEQ ID NO：7)具有至少95％同一性的变体，尤其为包含如下突变中的一者或多者的那些变体：M202、M208、S255、R172和/或M261。优选地，所述淀粉酶包括如下中的一者或多者：M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、M202W、S255N和/或R172Q。尤其优选的是包含M202L或M202T突变的那些。
(e)描述于WO09/149130中的变体，优选为展现与WO09/149130中的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，即来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的野生型酶或其截短型式具有至少90％同一性的那些变体。
合适的市售α-淀粉酶包括 (丹麦巴格斯瓦德诺维信公司(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark))、AT9000(奥地利维也纳威利大街27bA-1200百因美生物技术贸易有限公司(Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse27bA-1200Wien Austria))、OPTISIZEHT 和PURASTAR(加利福尼亚帕洛阿尔托市杰能科国际公司(Genencor International Inc.，Palo Alto，Califomia))和(花王株式会社，日本东京中央区103-82101-丁目14-10日本桥茅场町(14-10Nihonbashi Kayabacho，1-chome，Chuo-ku Tokyo103-8210，Japan))。在一个方面中，合适的淀粉酶包括和STAINZYME以及它们的混合物。
脂肪酶。优选地，本发明包含一种或多种脂肪酶，包括“第一循环脂肪酶(firstcycle1ipase)”，例如描述于美国专利6,939,702B1和US PA2009/0217464中的那些。优选的脂肪酶是第一洗涤脂肪酶。在本发明的一个实施例中，组合物包含第一洗涤脂肪酶。第一洗涤脂肪酶包括是具有如下特征的氨基酸序列的多肽的脂肪酶：(a)与源于柔毛腐质霉菌株DSM4109的野生型脂肪酶具有至少90％的同一性；(b)相较于所述野生型脂肪酶，在三维结构表面处在E1或Q249的15A以内包含由带正电的氨基酸对电中性或带负电的氨基酸的置换；以及(c)在C末端包含肽添加；及/或(d)在N末端包含肽添加，及/或(e)满足如下限制条件：i)在所述野生型脂肪酶的位置E210包含负氨基酸；ii)在对应于所述野生型脂肪酶的位置90-101的区域中包含带负电的氨基酸；及iii)在对应于N94或所述野生型脂肪酶的位置处包含中性或负性氨基酸及/或在对应于所述野生型脂肪酶的位置90-101的区域中具有负性或中性净电荷。优选的是来自疏棉状嗜热丝孢菌的野生型脂肪酶包含T231R和N233R突变中的一者或多者的变体。野生型序列是Swissprot登录号Swiss-Prot O59952(源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)(柔毛腐质霉))的269个氨基酸(氨基酸23-291)。优选的脂肪酶将会包括以商标名和和出售的那些。
内切葡聚糖酶。其他优选的酶包括展现内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的微生物源性内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)，包括对芽孢杆菌属成员来说是内源性的、具有与US7,141,40382中的氨基酸序列SEQ ID NO：2有至少90％、94％、97％和甚至99％同一性的序列的细菌多肽，以及它们的混合物。合适的内切葡聚糖酶以商标名和(丹麦巴格斯瓦德诺维信公司)出售。
果胶酸裂解酶。其他优选的酶包括以商标名 出售的果胶酸裂解酶以及以商标名(均来自丹麦巴格斯瓦德诺维信公司)和(加利福尼亚帕洛阿尔托市杰能科国际公司)出售的甘露聚糖酶。
漂白剂。组合物可优选包含一种或多种漂白剂。不同于漂白催化剂的适合漂白剂包括光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸以及它们的混合物。一般来讲，当使用漂白剂时，以主题组合物重量计，本发明组合物可包含约0.1％至约50％，或甚至约0.1％至约25％的漂白剂或漂白剂混合物。合适的漂白剂的例子包括：
(1)光漂白剂，例如磺化酞菁锌、磺化酞菁铝、呫吨染料以及它们的混合物；
(2)预形成的过酸：合适的预形成的过酸包括(但不限于)选自如下的化合物：预形成的过氧酸或其盐，通常为过羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚胺酸及盐、过一硫酸及盐(例如)以及它们的混合物。合适的例子包括过氧羧酸或其盐，或过氧磺酸或其盐。适用于本文的典型过氧羧酸盐具有对应于如下化学式的化学结构：
其中：R14选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基；R14基团可为直链或支链的、取代或未取代的；当过酸疏水的时，具有6至14个碳原子，或8至12个碳原子，并且当过酸为亲水的时，具有少于6个碳原子或甚至少于4个碳原子，并且Y是可实现电荷中性的任何适合的抗衡离子，优选地，Y选自氢、钠或钾。优选地，R14是直链或支链、取代或未取代的C6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、它们的任何盐，或它们的任何组合。尤其优选的过氧酸是苯二甲酰亚氨基-过氧-烷酸，尤其是ε-苯二甲酰亚氨基过氧己酸(PAP)。优选地，过氧酸或其盐具有在30℃至60℃范围内的熔点。
预形成的过氧酸或其盐也可以是过氧磺酸或其盐，通常具有对应于如下化学式的化学结构：
其中：R15选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基；R15基团可为直链或支链的、取代或未取代的；并且Z是可实现电荷中性的任何适合的抗衡离子，优选地，Z选自氢、钠或钾。优选地，R15是直链或支链、取代或未取代的C4-14、优选C6-14烷基。优选的，这样的漂白剂组分可以0.01至50％、最优选0.1％至20％的量存在于本发明组合物中。
(3)过氧化氢源，例如无机过水合物盐，包括过硼酸碱金属盐(通常为一水合物或四水合物)、过碳酸碱金属盐、过硫酸碱金属盐、过磷酸碱金属盐、过硅酸碱金属盐，例如钠盐，以及它们的混合物。在本发明的一个方面中，无机过水合物盐选自过硼酸钠盐、过碳酸钠盐以及它们的混合物。当采用时，无机过水合物盐通常的存在量为整个清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)的0.05至40重量％，或1至30重量％，并且通常以可涂布的结晶固体掺入这类清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)中。合适的涂料包括无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或它们的混合物，或者有机材料，例如水溶性或可分散性聚合物、蜡类、油类或脂肪皂类；以及
(4)具有R-(C＝O)-L的漂白活化剂，其中R是烷基，任选为支化的，当漂白活化剂为疏水的时，具有6至14个碳原子，或8至12个碳原子，并且当漂白活化剂是亲水的时，具有少于6个碳原子或甚至少于4个碳原子；并且L是离去基团。合适的离去基团的例子是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸根。合适的漂白活化剂包括十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3，5，5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)和壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)。合适的漂白活化剂也公开于WO98/17767中。虽然可采用任何合适的漂白活化剂，但在本发明的一个方面中，本发明组合物可包含NOBS、TAED或它们的混合物。
(5)漂白催化剂。本发明组合物也可包括一种或多种漂白催化剂，其能够从过氧酸和/或其盐接受氧原子，并且将该氧原子转移给可氧化的底物。合适的漂白催化剂包括(但不限于)：亚胺阳离子和聚离子；亚胺两性离子；改性胺；改性氧化胺；N-磺酰亚胺；N-膦酰亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮和α氨基酮；以及它们的混合物。合适的α氨基酮例如是如WO2012/000846A1、WO2008/015443A1和WO2008/014965A1中所描述的。合适的混合物如描述于USPA2007/0173430A1中。
不希望受理论束缚，本发明者相信，以上述这种方式控制亲电性和疏水性，能够将漂白剂成分实质上仅递送到更疏水并且含有富电子污物的织物区域上，这些富电子污物包括可见发色团，它们易被高度亲电的氧化剂漂白。
在一个方面中，漂白催化剂具有对应于如下通式的结构：
其中R13选自2-乙基己基、2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基；
(6)组合物可优选包含催化金属络合物。一类优选的含金属的漂白催化剂是具如下特征的催化剂体系，该体系包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子，如铜阳离子、铁阳离子、钛阳离子、钌阳离子、钨阳离子、钼阳离子或锰阳离子；具有极低的或者没有漂白催化活性的辅助金属阳离子，如锌阳离子或铝阳离子；以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有确定的稳定性常数的螯合剂(sequestrate)，尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐。这类催化剂被公开于U.S.4,430,243中。
如果需要，则本文组合物可借助锰化合物来催化。这类化合物和用量是本领域熟知的，并且包括例如公开于U.S.5,576,282中的锰基催化剂。
可用于本文的钴漂白催化剂是已知的，并且例如描述于U.S.5,597,936、U.S.5,595,967中。这类钴催化剂易于通过已知程序，例如如在U.S.5,597,936和U.S.5,595,967中所教导程序来制备。
本文的组合物还可适当地包括诸如bispidones(WO05/042532A1)和/或大多环刚性配体(简写为“MRL”)之类的配体的过渡金属络合物。实际上，但绝非限制，可调节本文的组合物和方法，以在含水洗涤介质中提供大约至少1pphm的活性MRL物质，并且在洗涤液体中将通常提供约0.005ppm至约25ppm、约0.05ppm至约10ppm或甚至约0.1ppm至约5ppm的MRL。
本发明的过渡金属漂白催化剂中的适合过渡金属包括例如锰、铁和铬。合适的MRL包括5，12-二乙基-1,5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。
合适的过渡金属MRL易于通过已知程序，例如如在WO00/32601和U.S.6,225,464中所教导的程序来制备。
当存在时，以清洁和/或处理组合物(例如织物和家庭护理产品)计，过氧化氢源/过酸和/或漂白活化剂一般以约0.1至约60重量％，约0.5至约40重量％或甚至约0.6至约10重量％的量存在于组合物中。可将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体联合使用。
通常，过氧化氢源与漂白活化剂将被掺在一起。可对过氧化氢源与过酸或漂白活化剂的量进行选择，使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比为1∶1至35：1，或甚至2：1至10：1。
表面活性剂。组合物优选包含表面活性剂或表面活性剂体系。表面活性剂可选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性(amphoteric、ampholytic)表面活性剂、两亲性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及它们的混合物。优选的组合物包含表面活性剂/表面活性剂体系的混合物。优选的表面活性剂体系包括一种或多种阴离子表面活性剂，最优选与助表面活性剂组合，最优选为非离子表面活性剂和/或两性表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。优选的表面活性剂体系包含阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂二者，优选地，重量比为90：1至1：90。在某些情况下，阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂的重量比为至少1：1是优选的。然而，低于10：1的比率可能是优选的。当存在时，以本发明组合物的重量计，总体表面活性剂水平优选为0.1％至60％、1％至50％或甚至5％至40％。
组合物优选包含阴离子去污表面活性剂，优选硫酸盐和/或磺酸盐表面活性剂。优选的例子包括烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐和烷基烷氧基化硫酸盐。优选的磺酸盐是C10-13烷基苯磺酸盐。合适的烷基苯磺酸盐(LAS)可通过磺化市售直链烷基苯(LAB)而获得；合适的LAB包括低级2-苯基LAB，例如由萨索尔公司以商标名供应的那些产品或由帕蒂里莎公司(Petresa)以商标名供应的那些产品，其他合适的LAB包括高级2-苯基LAB，例如由萨索尔公司以商标名供应的那些产品。合适的阴离子去污表面活性剂是烷基苯磺酸盐，它是通过DETAL催化工艺获得，但其他合成途径，例如HF也可能是适合的。在一个方面中，使用LAS的镁盐。
优选的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，通常为C8-18烷基硫酸盐，或主要为C12烷基硫酸盐。另一优选的烷基硫酸盐是烷基烷氧基化硫酸盐，优选为C8-18烷基烷氧基化硫酸盐。优选地，烷氧基化基团是乙氧基化基团。通常，烷基烷氧基化硫酸盐具有0.5至30或20、或0.5至10的平均烷氧基化程度。尤其优选的是具有0.5至10、0.5至7、0.5至5、或甚至0.5至3的平均乙氧基化程度的C8-18烷基乙氧基化硫酸盐。
烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的，取代或未取代的。当表面活性剂是支链型时，优选地，该表面活性剂将包含中链分支的硫酸盐或磺酸盐表面活性剂。优选地，分支基团包含C1-4烷基，通常为甲基和/或乙基。
组合物优选包含非离子去污表面活性剂。合适的非离子表面活性剂选自：C8-C18烷基乙氧基化物，例如来自壳牌公司(Shell)的非离子表面活性剂；C6-C12烷基酚烷氧基化物，其中烷氧基化物单元可为乙烯氧基单元、丙烯氧基单元或它们的混合形式；C12-C18醇和C6-C12烷基酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，例如来自巴斯夫公司的；C14-C22中链分支的醇类；C14-C22中链分支的烷基烷氧基化物，通常具有1至30的平均烷氧基化程度；烷基多糖，在一个方面中为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端聚(氧基烷基化)醇表面活性剂；以及它们的混合物。
合适的非离子去污表面活性剂包括烷基多葡糖苷和/或烷基烷氧基化醇。
在一个方面中，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一个方面中，为C8-18烷基烷氧基化醇，例如C8-18烷基乙氧基化醇，该烷基烷氧基化醇可具有1至80，优选1至50，更优选1至30、1至20、或1至10的平均烷氧基化程度。在一个方面中，烷基烷氧基化醇可为C8-18烷基乙氧基化醇，其具有1至10、1至7、更多1至5、或者3至7、或者甚至低于3或2的平均乙氧基化程度。
烷基烷氧基化醇可为直链或支链的，且取代或未取代的。
合适的非离子表面活性剂包括来自巴斯夫公司的具有商标名的那些产品。
合适的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季化合物、烷基三锍化合物以及它们的混合物。
合适的阳离子去污表面活性剂是具有如下通式的季铵化合物：
(R)(R1)(R2)(R3)N+X-
其中R是直链或支链、取代或未取代的C6-18烷基或烯基部分，R1和R2独立地选自甲基或乙基部分，R3是羟基、羟甲基或羟乙基部分，X是提供电荷中性的阴离子，合适的阴离子包括：卤离子，例如氯离子；硫酸根；和磺酸根。合适的阳离子去污表面活性剂为单-C6-18烷基单羟乙基二甲基季铵氯化物。高度合适的阳离子去污表面活性剂为单-C8-10烷基单羟乙基二甲基季铵氯化物、单-C10-12烷基单羟乙基二甲基季铵氯化物和单-C10烷基单羟乙基二甲基季铵氯化物。
合适的两性/两性离子表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱。
胺中和的阴离子表面活性剂-本发明的阴离子表面活性剂和辅助阴离子助表面活性剂可以酸形式存在，并且可将所述酸形式中和，以形成可理想地用于本发明清洗剂组合物中的表面活性剂盐。典型的用于中和的试剂包括金属抗衡离子碱，例如氢氧化物，如NaOH或KOH。另外优选的用于中和本发明的阴离子表面活性剂和辅助阴离子表面活性剂或助表面活性剂的酸形式的药剂包括氨、胺或烷醇胺。烷醇胺是优选的。合适的非限制性例子包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺和本领域已知的其他直链或直链烷醇胺；例如，高度优选的烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺或1-氨基-3-丙醇。胺中和可进行至完全或部分程度，例如部分阴离子表面活性剂混合体可用钠或钾中和并且部分阴离子表面活性剂混合体可用胺或烷醇胺中和。
助洗剂。组合物优选包含一种或多种助洗剂或助洗剂体系。当使用助洗剂时，本发明组合物将通常包含至少1％，2％至60％的助洗剂。组合物可优选包含低水平的磷酸盐和/或沸石，例如1至10或5重量％。组合物可能甚至实质上不含强助洗剂；实质上不含强助洗剂意指“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。
螯合剂。组合物优选包含螯合剂和/或晶体生长抑制剂。合适的分子包括铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。合适的分子包括氨基羧酸酯、氨基磷酸酯、琥珀酸酯、它们的盐以及它们的混合物。适合用于本文的螯合剂的非限制性例子包括乙二胺四乙酸盐、N-(羟乙基)乙二胺三乙酸盐、次氮基三乙酸盐、乙二胺四丙酸盐、三亚乙基四胺六乙酸盐、二亚乙基三胺-五乙酸盐、乙醇二甘氨酸、乙二胺四(亚甲基膦酸盐)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、乙二胺二琥珀酸盐(EDDS)、羟基乙烷二亚甲基膦酸(HEDP)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、它们的盐以及它们的混合物。可用于本发明中的螯合剂的其他非限制性例子见于美国专利No.7445644、No.7585376和No.2009/0176684A1中。其他适合用于本文的螯合剂是商业DEQUEST系列，以及来自孟山都公司(Monsanto)、杜邦公司(DuPont)和纳尔科公司(Nalco，Inc)的螯合剂。
染料转移抑制剂(DTI)。组合物可包含一种或多种染料转移抑制剂。在本发明的一个实施例中，本发明者已惊奇地发现，除了指定染料以外还包含聚合染料转移抑制剂的组合物可提供改善的性能。这是令人惊讶的，因为这些聚合物可防止染料沉积。合适的染料转移抑制剂包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。合适的例子包括来自亚什兰公司亚跨龙部门(Ashland Aqualon)的PVP-K15、PVP-K30、ChromaBond S-400、ChromaBond S-403E和Chromabond S-100，以及来自巴斯夫公司的Sokalan HP165、Sokalan HP50、Sokalan HP53、Sokalan HP59、HP56K、HP66。其他合适的DTI如描述于WO2012/004134中。当存在于本发明组合物中时，以组合物重量计，染料转移抑制剂可以约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％、或甚至约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂。组合物优选包含一种或多种荧光增白剂。可用于本发明中的商业光学增白剂可分类为如下小组，包括(但不限于)：二苯乙烯、吡唑啉、香豆素、羧酸的衍生物、次甲基花青(methinecyanine)、二苯并噻吩-5，5-二氧化物、唑类、5元环杂环和6元环杂环以及其他各种试剂。尤其优选的增白剂选自：2-(4-苯乙烯基-3-磺基苯基)-2H-萘并[1，2-d]***钠、4，4′-双{[(4-苯胺基-6-(N-甲基-N-2-羟乙基)氨基-1，3，5-三嗪-2-基)]氨基}二苯乙烯-2-2-二磺酸二钠、4，4′-双{[(4-苯胺基-6-(N-吗啉基)-1，3，5-三嗪-2-基)]氨基}二苯乙烯-2-2′--二磺酸二钠以及4,4′-双(2-磺基苯乙烯基)联苯二钠。这样的增白剂的其他例子公开于“The Production and Application of Fluorescent BrighteningAgents(《荧光增白剂的制造和应用》)”，M.Zahradnik，由纽约的约翰威立父子出版社(JohnWiley & Sons，New York(1982))出版。可用于本发明组合物中的光学增白剂的特定非限制性例子为在美国专利No.4,790,856和美国专利No.3,646,015中确定的那些例子。
优选的增白剂具有如下结构：
合适的荧光增白剂含量包括从约0.01、从约0.05、从约0.1或甚至从约0.2重量％的下限含量至0.5或甚至0.75重量％的上限含量。
在一个方面中，增白剂可被加载于粘土上以形成粒子。
优选的增白剂完全或主要(通常为至少50重量％、至少75重量％、至少90重量％、至少99重量％)呈α-晶形。高度优选的增白剂包含C.I.荧光增白剂260，优选具有如下结构：
这可以是特别有用的，因为它能完全地溶解于例如低于30℃或25℃或甚至20℃的冷水中。
优选地，增白剂以微粉化微粒形式掺入组合物中，所述形式最优选具有3至30微米、3微米至20微米、或3至10微米的重均原生粒度。
组合物可包含β-晶形的C.I.荧光增白剂260的，并且(i)α-晶形的C.I.荧光增白剂260与(ii)β-晶形的C.I.荧光增白剂260的重量比可为至少0.1，或至少0.6。
BE680847涉及制备α-晶形的C.I.荧光增白剂260的方法。
硅酸盐。组合物可优选还含有硅酸盐，例如硅酸钠或硅酸钾。组合物可包含0重量％至低于10重量％的硅酸盐，至9重量％、或至8重量％、或至7重量％、或至6重量％、或至5重量％、或至4重量％、或至3重量％、或甚至至2重量％的硅酸盐，并且优选从0重量％以上起、或从0.5重量％，或甚至从1重量％起的硅酸盐。合适的硅酸盐是硅酸钠。
分散剂。组合物可优选还含有分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚酸或共聚酸或它们的盐，其中多元羧酸包含至少两个彼此相隔不超过两个碳原子的羧基。
酶稳定剂。组合物可优选包含酶稳定剂。可使用任何传统的酶稳定剂，例如通过在最终的织物和家庭护理产品中存在水溶性钙和/或镁离子源并且这些产品将这样的离子提供给酶来实现。在包含蛋白酶的含水组合物的情况下，可添加可逆蛋白酶抑制剂，例如包括硼酸盐的硼化合物，或优选4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸和它们的衍生物，或诸如甲酸钙、甲酸钠和1，2-丙二醇之类的化合物，以进一步提高稳定性。
溶剂体系。本发明组合物中的溶剂体系可为只含有水或有机溶剂不加上水或优选加上水的混合物的溶剂体系。优选的有机溶剂包括1，2-丙二醇、乙醇、丙三醇、二丙二醇、甲基丙二醇以及它们的混合物。也可以使用其他低级醇，如诸如单乙醇胺和三乙醇胺之类的C1-C4烷醇胺。溶剂体系可以不存在，例如在本发明的无水固体实施例中，但更通常以在约0.1％至约98％，优选至少约1％至约50％，更通常约5％至约25％的范围内的水平存在。
在本发明的一些实施例中，组合物是以结构化液体形式。这样的结构化液体可为内部结构化型，其中结构是由主要成分(例如表面活性剂材料)形成，和/或通过使用例如可用作增稠剂的辅助性成分(例如聚合物、粘土和/或硅酸盐材料)来提供三维基质结构而为外部结构化型。组合物可包含结构剂，优选为0.01重量％至5重量％、0.1重量％至2.0重量％的结构剂。合适的结构剂的例子在US2006/0205631A1、US2005/0203213A1、US7294611、US6855680中给出。结构剂通常选自：甘油二酯和甘油三酯、乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤维纤维素、疏水改性碱溶胀性乳液(如Polygel W30(3V希格玛公司(3VSigma))、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、氢化蓖麻油、氢化蓖麻油衍生物(例如其未被乙氧基化的衍生物)以及它们的混合物，尤其是选自以下的那些：氢化蓖麻油、氢化蓖麻油衍生物、微纤维纤维素、羟基官能结晶材料、长链脂肪醇、12-羟基硬脂酸、粘土以及它们的混合物。优选的结构剂描述于美国专利No.6,855,680中，该专利详细地定义了合适的羟基官能结晶材料。优选的是氢化蓖麻油。可用的结构剂的非限制性例子包括。这样的结构剂具有线状结构化***，其具有一系列纵横比。其他合适的结构剂和其制备方法描述于WO2010/034736中。
本发明组合物可包含高熔点脂肪化合物。可用于本文的高熔点脂肪化合物具有25℃或更高的熔点，并且选自：脂肪醇、脂肪酸、脂肪醇衍生物、脂肪酸衍生物以及它们的混合物。无意于将具有低熔点的这些化合物包括在该章节中。这些高熔点化合物的非限制性例子见于International Cosmetic Ingredient Dictionary，Fifth Edition，1993(国际化妆品成分字典1993年第5版)和CTFA Cosmetic Ingredient Handbook，Second Edition，1992(CTFA化妆品成分手册1992年第2版)中。当存在时，以组合物重量计，高熔点脂肪化合物优选以0.1％至40％，优选1％至30％，更优选1.5％至16％，鉴于提供改进的调理益处(例如在施用到湿发期间提供光滑感以及在干发上提供柔软性和湿润感)，1.5％至8％的水平包括于组合物中。
阳离子聚合物。本发明组合物可含有阳离子聚合物。组合物中的阳离子聚合物浓度通常在0.05％至3％范围内，在另一实施例中，在0.075％至2.0％范围内，并且在又一实施例中，在0.1％至1.0％范围内。合适的阳离子聚合物在组合物的预期用途的pH值下，将具有至少0.5meq/gm，在另一实施例中，至少0.9meq/gm，在另一实施例中，至少1.2meq/gm，在又一实施例中，至少1.5meq/gm，但在一个实施例中，又小于7meq/gm，并且在另一实施例中，小于5meq/gm的阳离子电荷密度，该组合物的pH值将一般在pH3至pH9范围内，在一个实施例中，介于pH4与pH8之间。在本文中，聚合物的“阳离子电荷密度”是指聚合物上的正电荷数目与聚合物分子量的比率。这样合适的阳离子聚合物的平均分子量将一般在10,000至1千万之间，在一个实施例中，在50,000至5百万之间，并且在另一实施例中，在100,000至3百万之间。
适用于本发明组合物中的阳离子聚合物含有诸如季铵之类的含阳离子氮的部分或阳离子质子化氨基部分。任何阴离子抗衡离子可与阳离子聚合物联合使用，只要这些聚合物在组合物中，或在组合物的凝聚层相中保持可溶于水中即可，并且只要这些抗衡离子在物理和化学上与组合物的基本组分相容或者不会不当地损害产品性能、稳定性或美观性即可。这样的抗衡离子的非限制性例子包括卤离子(例如氯离子、氟离子、溴离子、碘离子)、硫酸根和甲基硫酸根。
这样的聚合物的非限制性例子描述于：CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary，3rd edition(CTFA化妆品成分字典第3版)，由Estrin、Crosley和Haynes编辑(华盛顿的化妆品、梳洗品和芳香剂协会有限公司(The Cosmetic，Toiletry，and FragranceAssociation，Inc.，Washington，D.C.(1982))。
其他适用于该组合物中的阳离子聚合物包括多糖聚合物、阳离子瓜尔胶衍生物、含四价氮的纤维素醚、合成聚合物、醚化纤维素、瓜尔胶和淀粉的共聚物。当使用时，本文的阳离子聚合物可溶于组合物中或者可溶于组合物中的复合凝聚层相中，该复合凝聚层相是由本文上述的阳离子聚合物与阴离子表面活性剂、两性表面活性剂和/或两性离子表面活性剂组分形成。阳离子聚合物的复合凝聚层也能与组合物中的其他带电物质形成。
合适的阳离子聚合物描述于美国专利No.3,962,418、No.3,958,581和美国公布No.2007/0207109A1中。
非离子聚合物。本发明组合物可包括非离子聚合物作为调理剂。具有超过1000的分子量的聚亚烷基二醇可用于本文中。可用的是具有如下通式的那些聚合物：
其中R95选自：H、甲基以及它们的混合形式。组合物中可包括调理剂，并且尤其是有机硅。可用于本发明组合物中的调理剂通常包含水不溶性、水可分散性、非挥发性、可形成乳化液体粒子的液体。适用于组合物中的调理剂是一般表征为有机硅(例如有机硅油、阳离子有机硅、有机硅胶、高折射性有机硅和有机硅树脂)、有机调理油(例如烃油、聚烯烃和脂肪酯)或它们的组合的那些调理剂，或在本文含水表面活性剂基质中形成液体分散粒子的那些调理剂。这样的调理剂应当在物理和化学上与组合物的基本组分相容，并且应当不会不当地损害产品稳定性、美观性或性能。
组合物中的调理剂浓度应足以提供所需的调理有益效果。这样的浓度可随调理剂、所需调理性能、调理剂粒子平均尺寸、其他组分的类型和浓度以及其他类似因素而变化。
有机硅调理剂的浓度通常在约0.01％至约10％的范围内。合适的有机硅调理剂和任选的有机硅的助悬剂的非限制性例子描述于：美国再颁发专利No.34,584、美国专利No.5,104,646；No.5,106,609；No.4,152,416；No.2,826,551；No.3,964,500；No.4,364,837；No.6,607,717；No.6,482,969；No.5,807,956；No.5,981,681；No.6,207,782；No.7,465,439；No.7,041,767；No.7,217,777；美国专利申请No.2007/0286837A1；No.2005/0048549A1；No.2007/0041929A1；英国专利No.849,433；德国专利No.DE10036533，将所述文献以引用的方式并入本文中；Chemistry and Technology of Silicones(《有机硅的化学和技术》)，纽约：学术出版社(1968)；General E1ectric Silicone Rubber Product DataSheets(通用电气有机硅橡胶产品数据表)SE30、SE33、SE54和SE76；Silicon Compounds(《硅化合物》)，彼特拉克***有限公司(Petrarch Systems，Inc.)(1984)；以及Encyclopedia of Polymer Science and Engineering(《聚合物科学和工程百科全书》)，第15卷，第2版，第204-308页，约翰威立父子国际出版公司(1989)。
有机调理油。本发明组合物还可包含约0.05％至约3％的至少一种有机调理油作为调理剂，该调理油可单独使用，或与其他调理剂，如有机硅(本文所述)组合使用。合适的调理油包括烃油、聚烯烃和脂肪酯。由宝洁公司(Procter ＆ Gamble Company)在美国专利No.5,674,478和No.5,750,122中所描述的调理剂也适用于本文组合物中。在美国专利No.4,529,586、No.4,507,280、No.4,663,158、No.4,197,865、No.4,217,914、No.4,381,919和No.4,422,853中所描述的那些调理剂也适用于本文中。
卫生剂。本发明组合物还可包含用于在卫生和/或恶臭方面带来有益效果的组分，例如如下中的一者或多者：蓖麻醇酸锌、百里酚、季铵盐(如)、聚乙烯亚胺(如来自巴斯夫公司的)及其锌络合物、银和银化合物(尤其是被设计成能缓慢释放Ag+的那些)或纳米银分散体。
益生素(Probiotic)。组合物可包含益生素，例如在WO2009/043709中所描述的那些。
泡沫促进剂。如果需要高度起泡，则组合物可优选包含泡沫促进剂。合适的例子是C10-C16烷醇酰胺或C10-C14烷基硫酸盐，其优选以1％-10％含量掺入。C10-C14单乙醇和二乙醇酰胺是典型类型的这类泡沫促进剂。这类泡沫促进剂与上述高起泡性辅助表面活性剂，如氧化胺、甜菜碱和磺基甜菜碱一起使用也是有利的。如果需要，则可加入诸如MgC12、MgSO4、CaC12、CaSO4等之类的水溶性镁盐和/或钙盐，其含量通常为0.1％-2％，以产生额外的泡沫并且增强油脂移除性能。
泡沫抑制剂。可将用于减少或抑制泡沫形成的化合物掺入本发明组合物中。泡沫抑制在如在美国专利No.4,489,455和4,489,574中所描述的所谓“高浓度清洁过程”中，和在前装式洗涤机中可具有特别重要性。很多种类的材料可用作泡沫抑制剂，并且泡沫抑制剂对本领域技术人员来说是熟知的。参见例如Kirk Othmer Encyclopedia of ChemicalTechnology(《柯克-奥斯莫化工技术百科全书》)，第三版，第7卷，第430-447页(约翰威立父子国际出版公司，1979)。泡沫抑制剂的例子包括单羧基脂肪酸和其可溶性盐、高分子量烃类(如石蜡)、脂肪酸酯(例如脂肪酸甘油三酯)、一价醇的脂肪酸酯、脂族C18-C40酮(例如硬脂硬脂酮)、N-烷基化氨基三嗪、优选具有低于约100℃的熔点的含蜡烃、有机硅泡沫抑制剂以及仲醇。泡沫抑制剂描述于：美国专利No.2,954,347；No.4,265,779；No.4,265,779；No.3,455,839；No.3,933,672；No.4,652,392；No.4,978,471；No.4,983,316；No.5,288,431；No.4,639,489；No.4,749,740；和No.4,798,679；No.4,075,118；欧洲专利申请No.89307851.9；EP150,872；以及DOS2,124,526。
对于要在自动洗衣机中使用的任何清洗剂组合物而言，泡沫不应形成到它们溢出洗涤机的程度。泡沫抑制剂在使用时，优选以“泡沫抑制量”存在。“泡沫抑制量”是指组合物的配制者可选择这种泡沫控制剂的量，该量将充分地控制泡沫以得到用于自动洗衣机的低起泡性洗衣用清洗剂。本文组合物将通常包含0％至10％的泡沫抑制剂。当用作泡沫抑制剂时，单羧基脂肪酸及其盐将通常以最多达清洗剂组合物的5重量％的量存在。优选使用0.5％至3％的脂肪单羧酸盐泡沫抑制剂。有机硅泡沫抑制剂通常以最多达清洗剂组合物的2.0重量％的量利用，不过也可使用更高的量。磷酸单硬脂基酯泡沫抑制剂一般以在组合物的0.1重量％至2重量％的范围内的量利用。烃类泡沫抑制剂通常以在0.01％至5.0％范围内的量利用，不过也可使用更高的量。醇类泡沫抑制剂通常以成品组合物的0.2重量％-3重量％的量使用。
珠光剂。可将WO2011/163457中所描述的珠光剂掺入本发明组合物中。
香料。组合物优选包含香料，优选在0.001至3重量％范围内，最优选0.1至1重量％。香料的许多合适的例子提供于如下中：CTFA(Cosmetic，Toiletry and FragranceAssociation)1992 Intemational Buyers Guide(CTFA(化妆品、梳洗品和芳香剂协会)1992国际采购商指南)，由CFTA出版社(CFTA Publications)出版；以及OPD 1993Chemicals Buyers Directory Annual Edition(OPD 1993化学品采购商目录，第80期年刊)，由施内尔出版公司(Schnell Publishing Co)出版。在本发明组合物中常存在多种香料组分，例如四种、五种、六种、七种或更多种。在香料混合物中优选15至25重量％是头香(top notes)。头香是由Poucher定义(Journal of the Society of Cosmetic Chemists(《化妆品化学家协会杂志》)6(2)：80[1995])。优选的头香包括玫瑰醚、柑橘油、乙酸芳樟酯、熏衣草、芳樟醇、二氢月桂烯醇和顺式-3-己醇。
清洁组合物的制备和使用方法
本发明还提供制备如上所述的组合物的方法，包括获得上述变体中的至少一者并将其与辅助材料或辅助材料混合物混合。
将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式如固体、粉末、液体、片剂或凝胶，并且变体与助剂的混合可通过配制者选择的任何合适方法进行(参见例如美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392、No.5,486,303、No.4,515,705、No.4,537,706、No.4,515,707、No.4,550,862、No.4,561,998、No.4,597,898、No.4,968,451、No.5,565,145、No.5,929,022、No.6,294,514和No.6,376,445)。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物以单位剂型提供，包括片剂、胶囊剂、扁囊剂、袋剂和多隔室袋剂。在一些实施例中，对单位剂量形式进行设计以提供多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内的成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式是本领域已知的(关于适用于单位剂量和控制释放形式的材料，参见例如EP2100949、WO02/102955、美国专利No.4,765,916和No.4,972,017，以及WO04/111178)。在一些实施例中，单位剂型以包有水溶性膜或水溶性小袋的片剂提供。各种用于单位剂量的形式在EP2100947中提供，并且是本领域已知的。在优选的多隔室小袋中，所述蛋白酶变体处于与另外的蛋白酶、第一洗涤脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、漂白组分、pH调节剂、织物调色染料、荧光增白剂和非离子表面活性剂以及它们的混合物中的一者或多者分开的隔室中。
使用方法
本发明还提供处理表面(尤其是织物)的方法，包括使表面与包含上文所列变体中的至少一者及辅助材料的水性液体接触。通常，通过将本发明的组合物添加至水将蛋白酶变体和辅助材料添加至水以形成洗涤液体。有待在本发明方法中处理的表面可以是用于清洁的任何织物或家庭护理表面，例如盛具、衣物、硬质表面、接触镜片等。在一些实施例中，使所述表面的至少一部分与纯形式的或在洗涤液中稀释的本发明清洁组合物的至少一个实施例接触，然后任选洗涤和/或漂洗所述表面。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于例如浸泡、擦洗和机械洗涤。在一些实施例中，本发明的清洁组合物在溶液中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。在其中洗涤溶剂为水的一些实施例中，水温通常在约5℃至约90℃的范围内。
本发明提供用于清洁或洗涤需要清洁的物品或表面(如硬质表面)的方法，包括(但不限于)清洁或洗涤盛具物品、餐具物品、织物物品、衣物物品、个人护理物品等的方法，以及清洁或洗涤硬质或软质表面(如物品的硬质表面)的方法。
在一些实施例中，本发明提供清洁需要清洁的物品、物体或表面的方法，该方法包括使物品或表面(或希望进行清洁的物品或表面的一部分)与至少一种本发明的变体枯草杆菌蛋白酶或本发明的组合物接触足以清洁所述物品、物体或表面至所需程度的时间，和/或在适于和/或有效清洁所述物品、物体或表面至所需程度的条件下进行接触。一些这类方法还包括用水漂洗物品、物体或表面。对于一些这类方法，清洁组合物是盛具洗涤剂组合物，而待清洁的物品或物体是盛具物品或餐具物品。如本文所用，“盛具物品”是通常用于供给食物或食用食物的物品。盛具物品可以是但不限于例如盘子、碟子、杯子、碗等等。如本文所用，“餐具”是更广泛的术语，其包括(但不限于)例如器皿、刀具、餐刀、餐叉、匙、筷子、玻璃器具、罐壶、调味汁碟、饮用容器、盛菜物品等。预期“餐具物品”包括这些或相似的用于供应食物或食用食物的物品中的任何一种。对于一些这类方法，清洁组合物是自动盛具洗涤剂组合物或手动盛具洗涤剂组合物，而待清洁的物品或物体是盛具或餐具物品。对于一些这类方法，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物(例如粉末衣物洗涤剂组合物或液体衣物洗涤剂组合物)，而待清洁的物品是织物物品。在一些其他实施例中，清洁组合物是衣物预处理组合物。清洁组合物可包含硬质表面清洁剂。
在一些实施例中，本发明提供用于清洁或洗涤任选需要分别清洁或洗涤的织物物品的方法。在一些实施例中，所述方法包括提供包含变体蛋白酶的组合物(包括但不限于织物或衣物清洁组合物)和需要清洁的织物物品或衣物物品，并使该织物物品或衣物物品(希望进行清洁的物品的一部分)与该组合物在足以或有效清洁或洗涤该织物或衣物物品至所需程度的条件下接触。
在一些实施例中，本发明提供清洁或洗涤任选需要清洁的物品或表面(如硬质表面)的方法，该方法包括提供待清洁或洗涤的物品或表面，使该物品或表面(希望进行清洁或洗涤的物品或表面的一部分)与至少一种本发明的枯草杆菌蛋白酶变体或包含至少一种这类枯草杆菌蛋白酶变体的本发明组合物接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的时间，和/或在足以或有效清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的条件下接触。这类组合物包括但不限于例如本发明的清洁组合物或洗涤剂组合物(如手动盛具洗涤剂组合物、手动盛具洗涤清洁组合物、衣物洗涤剂组合物或织物洗涤剂组合物或者衣物或织物清洁组合物、液体衣物洗涤剂、液体衣物清洁组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、粉末衣物清洁组合物、自动盛具洗涤剂组合物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、衣物清洁添加剂和衣物预洗剂组合物等)。在一些实施例中，将该方法重复一次或多次，尤其是如果需要额外的清洁或洗涤的话。例如，在某些情况下，该方法任选还包括让物品或表面与至少一种变体蛋白酶或组合物保持接触足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的一段时间。在一些实施例中，这些方法还包括用水和/或另一种液体漂洗物品或表面。在一些实施例中，这些方法还包括再次用至少一种本发明的变体蛋白酶或本发明的组合物接触物品或表面，并且让该物品或表面与至少一种变体蛋白酶或组合物保持接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的一段时间。在一些实施例中，清洁组合物是盛具洗涤剂组合物，而待清洁的物品是盛具或餐具物品。在本发明方法的一些实施例中，清洁组合物是自动盛具洗涤剂组合物或手动盛具洗涤剂组合物，而待清洁的物品是盛具或餐具物品。在所述方法的一些实施例中，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物，而待清洁的物品是织物物品。
本发明还提供在自动洗碗机中清洁餐具或盛具物品的方法，该方法包括提供自动盛具洗涤机器，在机器中放入足以清洁餐具或盛具物品的一定量的包含至少一种本发明枯草杆菌蛋白酶变体或本发明组合物的自动盛具洗涤组合物(例如，通过将该组合物置于机器中的合适的或提供的洗涤剂隔室或分配器中)，将盛具或餐具物品放入该机器中，运行该机器以清洁该餐具或盛具物品(例如按照生产商的说明书)。在一些实施例中，所述方法包括本文所述的任何自动盛具洗涤组合物，其包含(但不限于)至少一种本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体。待使用的自动盛具洗涤组合物的量可根据生产商的说明书或建议容易地确定，并可采用任何形式的包含至少一种本发明变体蛋白酶的自动盛具洗涤组合物(例如液体、粉末、固体、凝胶、片剂等)，包括本文所述的任何组合物在内。
本发明还提供清洁任选需要清洁的表面、物品或物体的方法，该方法包括使物品或表面(或希望进行清洁的物品或表面的一部分)与纯形式的或在洗涤液中稀释的至少一种本发明变体枯草杆菌蛋白酶或本发明清洁组合物接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的条件下进行接触。然后如果需要，可对表面、物品或物体(任选)进行洗涤和/或漂洗。出于本发明的目的，“洗涤”包括(但不限于)例如擦洗和机械搅动。在一些实施例中，清洁组合物在溶液(如水溶液)中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当表面、物品或物体包括织物时，水与织物的质量比通常为约1：1至约30：1。
本发明还提供在洗涤机中清洁衣物或织物物品的方法，该方法包括提供洗涤机，将足以清洁衣物或织物物品的一定量的包含至少一种本发明变体枯草杆菌蛋白酶的衣物洗涤剂组合物置于该机器中(例如通过将该组合物置于机器中的合适的或提供的洗涤剂隔室中或分配器中)，将衣物或织物物品置于该机器中，运行该机器以清洁衣物或织物物品(例如，按照生产商的说明书)。本发明的方法包括本文所述的任何衣物洗涤剂组合物，其包含(但不限于)本文提供的任何变体枯草杆菌蛋白酶中的至少一种。要使用的衣物洗涤剂组合物的量可根据生产商的说明书或建议容易地确定，可采用任何形式的包含至少一种本发明变体蛋白酶的衣物洗涤剂组合物(例如固体、粉末、液体、片、凝胶等)，包括本文所述的任何组合物在内。
实验
在以下实例中更详细地描述本发明，所述实例不是旨在以任何方式限制受权利要求书保护的本发明的范围。
在以下实验公开内容中，将应用以下缩写：PI(性能指数)，ppm(份每一百万份)；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)；μM(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；Pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；℃(摄氏度)；QS(足量)；ND(未进行)；rpm(每分钟转数)；GH(德国硬度度数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(拷贝DNA或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；mgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量/体积比)；v/v(体积比)；w/w(重量比)；g(重力)；OD(光密度)；ppm(份每一百万份)；杜伯科氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲溶液(DPBS)；SOC(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl)；极品肉汤(Terrific Broth，TB；12g/l细菌用胰蛋白胨、24g/l甘油、2.31g/l KH2PO4和12.54g/l K2HPO4)；OD280(280nm处的光密度)；OD600(600nm处的光密度)；A405(405nm处的吸光度)；Vmax(酶催化反应的最大初速度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2])；PBST(PBS+0.25％-20)；PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链反应)；RT-PCR(逆转录PCR)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])；HBS(HEPES缓冲盐水)；Tris-HCl(三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸盐)；Tricine(N-[三-(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)；CHES(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)；TAPS(3-{[三-(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸)；CAPS(3-(环己基氨基)-丙磺酸；DMSO(二甲基亚砜)；DTT(1，4-二硫代-DL-苏糖醇)；SA(芥子酸(s，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)；TCA(三氯乙酸)；Glut和GSH(还原型谷胱甘肽)；GSSG(氧化型谷胱甘肽)；TCEP(三[2-羧乙基]膦)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；℃i(微居里)；HPLC(高压液相色谱)；RP-HPLC(反相高压液相色谱)；TLC(薄层色谱)；MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离--飞行时间)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰基)；Et(乙基)，Me(甲基)；Taq(水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)N，N，N′，N′-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla(β-内酰胺酶或氨苄青霉素抗性基因)；MJ Research(MJ Research公司，内华达州雷诺(Reno，NV))；Baseclear(Baseclear BV公司，荷兰莱顿(Leiden，TheNetherlands))；PerSeptive(PerSeptive Biosystems公司，迈阿密费雷明汉(Framingham，MA))；ThermoFinnigan(ThermoFinnigan公司，加利福尼亚州圣荷西(San Jose，CA))；Argo(Argo BioAnalytica公司，新泽西州莫里斯普莱恩斯(Morris Plains，NJ))；Seitz EKS(SeitzSchenk Filtersystems GmbH有限责任公司，德国巴特克罗伊茨纳赫(BadKreuznach，Germany))；Pall(Pall Corp.公司，纽约州东希尔斯(East Hills，NY)和德国巴特克罗伊茨纳赫(Bad Kreuznach，Germany))；Spectrum(Spectrum Laboratories公司，加利福尼亚州多明格斯农场(Dominguez Rancho，CA))；Molecular Structure(MolecularStructure Corp.公司，得克萨斯州伍德兰兹(Woodlands，TX))；Accelrys(阿赛乐德网络公司Accelrys，Inc.，加利福尼亚州圣地牙哥(San Diego，CA))；Chemical Computing(Chemical Computing Corp.公司，加拿大蒙特利尔(Montreal，Canada))；New Brunswick(New Brunswick Scientific，Co.公司，新泽西爱迪生(Edison，NJ))；CFT(材料测试中心(Center for Test Materials)，荷兰费拉尔丁恩(Vlaardingen，The Netherlands))；P＆G和Procter & Gamble(宝洁公司(Procter & Gamble，Inc.)，俄亥俄州辛辛那提(Cincinnati，OH))；GE Healthcare(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，英国查尔芬特.圣贾尔斯(Chalfont St.Giles，United Kingdom))；DNA2.0(DNA2.0公司，加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park，CA))；OXOID(Oxoid公司，英国汉普郡贝辛斯托克(Basingstoke，Hampshire，UK))；Megazyme(Megazyme International Ireland Ltd.有限公司，爱尔兰维克罗郡布雷市布雷商业园(Bray Business Park，Bray，Co.，Wicklow，Ireland))；Finnzymes(Finnzymes Oy公司，芬兰埃斯波(Espoo，Finland))；Kelco(CP Kelco公司，特拉华州威尔明顿(Wilmington，DE))；Coming(康宁生命科学(Corning Life Sciences)，纽约州科宁(Corning，NY))；(NEN(NEN LifeScience Products公司，麻萨诸塞州波士顿(Boston，MA))；Pharma AS(Pharma AS公司，挪威奥斯陆(Oslo，Norway))；Dynal(Dynal公司，挪威奥斯陆)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis公司，得克萨斯州刘易斯维尔(Lewisville，TX))；ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，马里兰州罗克维尔(Rockville，MD))；Gibco/BRL(Gibco/BRL公司，纽约州格兰德岛(rand Island，NY))；Sigma(西格玛化工有限公司(Sigma Chemical Co.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))；Pharmacia(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech)，新泽西州皮斯卡特维(Piscataway，NJ))；NCBI(美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnolo gy Information))；Applied Biosystems(应用生物***公司(AppliedBiosystems)，加利福尼亚州福斯特城(Foster City，CA))；BD Biosciences和/或Clontech(BD Biosciences CLONTECH Laboratories，加利福尼亚州帕罗奥图(Palo Alto，CA))；Operon Technologies(Operon Technologies，Inc.公司，加利福尼亚州阿拉米达(Alameda，CA))；MWG Biotech(MWG Biotech公司，北卡罗来纳州海波因特(High Point，NC))；Oligos Etc(Oligos Etc.Inc公司，俄勒冈州威尔逊维尔(Wilsonville，OR))；Bachem(Bachem Bioscience，Inc.公司，宾夕法尼亚州普鲁士王(King of Prussia，PA))；Difco(Difco Laboratories公司，密歇根州底特律(Detroit，MI))；Mediatech(Mediatech公司，弗吉尼亚州赫恩登(Hemdon，VA))；Santa Cruz(Santa Cruz Biotechnology，Inc.公司，加利福尼亚州圣塔克鲁兹(Santa Cruz，CA))；Oxoid(Oxoid Inc.公司，纽约州奥格登斯堡(Ogdensburg，NY))；Worthington(Worthington Biochemical Corp.公司，新泽西州弗里霍尔德(Freehold，NJ))；GIBCO BRL或Gibco BRL(Life Technologies，Inc.公司，马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，MD))；Millipore(密理博公司(Millipore)，麻萨诸塞州比尔里卡(Billerica，MA))；Bio-Rad(伯乐公司(Bio-Rad)，加利福尼亚州赫尔克里士(Hercules，CA))；Invitrogen(英杰公司(Invitrogen Corp.)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA))；NEB(New England Biolabs公司，麻萨诸塞州贝弗利(Beverly，MA))；Sigma(西格玛化工有限公司(Sigma Chemical Co.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))；Pierce(Pierce生物技术公司(Pierce Biotechnology)，伊利诺伊州罗克福德(Rockford，IL))；Takara(宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)，日本大津市(Otsu，Japan))；Roche(罗氏公司(Hoffmann-La Roche)，瑞士巴塞尔(Basel，Switzerland))；EM Science(EM Science公司，新泽西州吉布斯敦Gibbstown，NJ))；Qiagen(凯杰公司(Qiagen，Inc.)，加利福尼亚瓦伦西亚(Valencia，CA))；Biodesign(Biodesign Intl.公司，缅因州索科(Saco，Maine))；Aptagen(Aptagen，Inc.公司，弗吉尼亚州赫恩登(Hemdon，VA))；Sorvall(Sorvall牌，来自KendrO Laboratory Products公司，北卡罗来纳州阿什维尔(Asheville，NC))；MolecularDevices(Molecular Devices，Corp.公司，加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale，CA))；R＆DSystems(R&D Systems公司，明尼苏达州明尼阿波利斯(Minneapolis，MN))；SiegfriedHandel(Siegfried Handel AG公司，瑞士祖芬根(Zofingen，Switzerland))；Stratagene(Stratagene Cloning Systems公司，加利福尼亚州拉荷雅(La Jolla，CA))；Marsh(MarshBiosciences公司，纽约州罗彻斯特(Rochester，NY))；Geneart(Geneart GmbH)有限公司(，德国雷根斯堡(Regensburg，Germany))；Bio-Tek(Bio-Tek Instruments公司，佛蒙特州威努斯基(Winooski，VT))；(Biacore(Biacore，Inc.公司，新泽西州皮斯卡特维(Piscataway，NJ))；PeproTech(PeproTech公司，新泽西州罗基希尔(Rocky Hill，NJ))；SynPep(SynPep公司，加利福尼亚州都柏林(Dublin，CA))；New Objective(New Objective牌；ScientificInstmment Services，Inc.公司，新泽西州灵戈斯(Ringoes，NJ))；Waters(沃特斯公司(Waters，Inc.)，麻萨诸塞州米尔福德(Milford，MA))；Matrix Science(Matrix Science公司，麻萨诸塞州波士顿(Boston，MA))；Dionex(戴安公司(Dionex，Corp.)，加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale，CA))；Monsanto(孟山都公司(Monsanto Co.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))；Wintershall(Wintershall AG公司，德国卡塞尔(Kassel，Germany))；BASF(巴斯夫公司(BASF Co.)，新泽西州弗洛勒姆帕克(Florham Park，NJ))；Huntsman(亨斯迈石化公司(Huntsman Petrochemical Corp.)，犹他州盐湖城(Salt Lake City，UT))；Shell Chemicals(壳牌化学品公司(Shell Chemicals，Inc.)，英国伦敦(London，UK))；Stepan(斯泰潘公司，伊利诺伊州诺斯菲尔德(Northfield，IL))；Clariant(科莱恩公司，德国苏尔茨巴赫(Sulzbach，Germany))；Industrial Zeolite(Industrial Zeolite Ltd.公司，英国艾塞克斯格雷斯(Grays，Essex，UK))；Jungbunzlauer(Jungbunzlauer公司，巴塞尔(Basel，Switzerland))；Solvay(Solvay公司，比利时布鲁塞尔(Brussels，Belgium))；3VSigma(3V西格玛公司公司，意大利贝尔加莫(Bergamo，Italy))；Innospec(因诺斯派克公司(Innospec)，英国埃尔斯米尔港(Ellesmere Port，UK))；Thermphos(天富公司(Thermphos)，荷兰弗利辛恩奥斯特(Vlissiggeh-Ost，The Netherlands))；CibaSpecialty(汽巴精化公司(Ciba Specialty Chemicals)，瑞士布鲁塞尔(Basel，Switzerland))；Dow Corning(道康宁公司，英国巴里(Barry，UK))；Enichem(EnichemIberica公司，西班牙巴萨罗那(Barcelona，Spain))；Fluka Chemie AG(Fluka Chemie AG公司，瑞士布克斯(Buchs，Switzerland))；Gist-Brocades(Gist-Brocades，NV公司，荷兰代夫特(Delft，The Netherlands))；Dow Corning(道康宁公司(Dow Corning Corp.)，密歇根州米德兰(Midland，MI))；Mettler-Toledo(Mettler-Toledo Inc，俄亥俄州哥伦布(Columbus，OH))；RB(Reckitt-Benckiser公司，英国斯劳(Slough，UK))；以及Microsoft(微软公司(Microsoft，Inc.)，华盛顿州雷德蒙德(Redmond，WA))。
如本文所用，在一些列表中，标出了前面的“0”，以提供每个位点的三位数名称(例如“001”与“1”相同，因此“A001C”与“A1C”相同)。在一些列表中，未包括前面的“0”。此外，如本文所用，“X”是指任何氨基酸。
在本文提供的示例性洗涤剂组合物中，酶水平是以总组合物重量计的纯酶表示，除非另外指明，否则洗涤剂成分是以总组合物的重量表示。其中的缩写的组分标识具有如下含义：
对于北美(NA)和西欧(WE)重垢型液体衣物(HDL)洗涤剂，通过将预称重的液体洗涤剂(于玻璃瓶中)置于95℃水浴中2小时对市售洗涤剂中存在的酶进行热灭活。热灭活NA和WE自动盛具洗涤(ADW)洗涤剂的温育时间是8小时。未加热的和加热过的洗涤剂二者均在溶解该洗涤剂5分钟内测定，以便精确地测定灭活百分比。通过AAPF测定法测试酶活性。
为了测试在热灭活洗涤剂中的酶活性，由热灭活的储备液制备洗涤剂的工作溶液。添加适当量的水硬度(例如6gpg或12gpg)和缓冲液至该洗涤剂溶液以匹配所需的条件。通过涡旋或倒转瓶子来混合溶液。如下表A提供了关于某些洗涤剂组合物的信息。在一些实验中，另外的和/或其他的市售洗涤剂可用于如下实例。
表A提供了根据本发明制备的适于洗涤织物的颗粒衣物洗涤剂组合物。
1无规接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚氧化乙烯共聚物，其具有聚氧化乙烯主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚氧化乙烯主链的分子量为约6000，聚氧化乙烯与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个氧化乙烯单元不超过1个接枝点。
2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。
3两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物是聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有24个乙氧基化基团，每个-NH具有16个丙氧基化基团
4如下结构的可逆蛋白酶抑制剂：
5乙氧基化的噻吩调色染料是如US7,208,459B2中描述的。
在表A中，所有酶水平均以酶原料的百分比表示，(本发明的)冷水蛋白酶除外，其以添加至产品的活性蛋白质的百分比表示。
表B提供了适用于顶开式自动洗衣机的颗粒衣物洗涤剂组合物(洗涤剂组合物7-9)和前开式洗衣机的颗粒衣物洗涤剂组合物(洗涤剂组合物10-11)。将测试的GG36蛋白酶变体和/或本发明的冷水蛋白酶分别添加至这些制剂。
在表B中，表面活性剂成分可获自任何合适的供应商，包括但不限于巴斯夫公司(例如)、壳牌化学品公司、斯泰潘公司、亨斯迈石化公司和科莱恩公司(例如)。沸石可获自诸如Industrial Zeolite之类的来源。柠檬酸和柠檬酸钠可获自诸如Jungbunzlauer之类的来源。过碳酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠和倍半碳酸钠可获自诸如Solvay之类的来源。丙烯酸系/马来酸系共聚物可获自诸如巴斯夫公司之类的来源。羧甲基纤维素和疏水改性的羧甲基纤维素可获自诸如CPKelco之类的来源。C.I.荧光增白剂260可获自3V西格玛公司(例如2M/G、2MG/LT Extra或Ecobright。S，S-乙二胺二琥珀酸四钠可获自诸如因诺斯派克公司之类的来源。对苯二甲酸酯共聚物可获自科莱恩公司(例如REPELOTEX SF2)。另外，1-羟乙烷-1，1-二膦酸可获自天富公司。基于哑嗪盐的漂白增强剂具有如下结构，其中R1＝2-丁基辛基，并根据US2006/0089284A1制备。
酶STAINZYME 和可从Novozymes获得。四磺酸基酞菁锌可从汽巴精化公司获得(例如BMC)。抑泡剂颗粒可从道康宁公司获得。在这些洗涤剂组合物中，无规接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚氧化乙烯共聚物，其具有聚氧化乙烯主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚氧化乙烯主链的分子量为约6000，聚氧化乙烯与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个氧化乙烯单元不超过1个接枝点。
表C-E提供了适用于洗涤机的另外的颗粒洗涤剂组合物(洗涤剂36a-n)。将测试的GG36蛋白酶变体或本发明的冷水蛋白酶分别添加至这些制剂。
表C、D、E中的洗涤剂组合物36a-n的注释：
表面活性剂成分可获自德国路德维希港的巴斯夫公司()；英国伦敦的壳牌化学品公司；美国伊利诺伊州诺斯菲尔的斯泰潘公司；美国犹他州盐湖城亨斯迈的亨斯迈石化公司；德国苏尔茨巴赫的科莱恩公司
沸石可得自英国埃塞克斯郡格雷斯工业沸石有限责任公司(Industrial Zeolite(UK)Ltd，Grays，Essex，UK)。
柠檬酸和柠檬酸钠可得自瑞士巴塞尔君布莱尔公司(Jungbunzlauer，Basel，Switzerland)。
过碳酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠和倍半碳酸钠可得自比利时布鲁塞尔市苏威公司(Solvay，Brussels，Belgium)。
丙烯酸系/马来酸系共聚物可得自德国路德维希港巴斯夫公司。
羧甲基纤维素和疏水改性的羧甲基纤维素可得自荷兰阿纳姆斯比凯可公司(CPKelco，Arnhem，The Netherlands)。
C.I.荧光增白剂260可以商品名2M/G、2MG/LT Extra或Ecobright得自意大利贝加莫省3V西格玛公司(3V Sigma，Bergamo，Italy)。
S，S-乙二胺二琥珀酸四钠可得自英国埃尔斯米尔港因诺斯派克公司。
对苯二甲酸酯共聚物可以商品名Repelotex SF2得自科莱恩公司。
1-羟基乙烷-1，1-二膦酸可得自荷兰弗利辛恩天富公司。
基于哑嗪盐的漂白增强剂具有如下结构，其中R1＝2-丁基辛基，并根据US2006/0089284A1制备。
酶Stainzyme和可得自丹麦鲍斯韦诺维信公司(Novozymes，Bagsvaerd，Denmark)。
四磺酸基酞菁锌可以商品名BMC得自瑞士巴塞尔的汽巴精化有限公司。
抑泡剂颗粒可得自英国巴里道康宁公司(Dow Corning，Barry，UK)。
无规接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚氧化乙烯共聚物，其具有聚氧化乙烯主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚氧化乙烯主链的分子量为约6000，聚氧化乙烯与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个氧化乙烯单元不超过1个接枝点。
实例1
测定法和测试方法
本实例描述了用于开发本发明的多种测试方法和测定法。任何偏离于所提供的方案的地方均在相关的实例中指出。
这些测定法用Biomek FX Robot(Beckman Coulter)或多通道通道移液器(例如Rainin PipetLite，Mettler-Toledo)和SpectraMAX MTP读板仪(340型；分子仪器公司(Molecular Devices))进行。
A.测试方法
测试方法1
下面提供了确定染料或颜料是否是用于本发明目的的织物调色剂的方案：
1)向两个tergotometer去污机罐中装入800ml英国泰恩河畔纽卡斯尔城市用水(Newcastle upon Tyne，UK，City Water)(约12格令/美加仑总硬度，由英国达勒姆郡PityMe城诺森伯兰水务公司供应(Northumbrian Water，Pity Me，Durham，Co.Durham，UK))。
2)将罐***tergotometer去污机中，在实验期间水温控制在30℃并且搅拌设定在40rpm。
3)向每个罐添加4.8g的IEC-B洗涤剂(B型IEC60456洗衣机参考基础洗涤剂(IEC60456Washing Machine Reference Base Detergent Type B)，由德国Brüggen-Bracht的wfk公司提供)。
4)两分钟后，向第一个罐添加2.0mg活性着色剂。
5)一分钟后，向每个罐添加切成5cm×5cm样本的50g扁平棉背心(由英国达勒姆郡康塞特(Consett，County Durham，UK)的Warwick Equest公司提供)。
6)10分钟后，将罐中水排出并重新装上水硬度为14.4英式克拉克(Clark)度硬度的冷水(16℃)，钙镁摩尔比为3：1。
7)2分钟漂洗后，移出织物。
8)使用相同的处理再重复步骤3-7三个循环。
9)收集织物并在室内挂干12小时。
10)用装配有D65光源和UVA减光滤光片的Hunter Miniscan光谱仪分析样本，以获得Hunter a(红绿轴)和Hunter b(黄蓝轴)值。
11)将每组的织物的Hunter a值和Hunter b值取平均值。如果用评估的着色剂处理过的织物在a轴或b轴上显示出大于0.2个单位的平均色调差异，则其被认为是用于本发明目的的织物调色剂。
测试方法2
对于测试方法2，用颗粒状洗涤剂组合物10(参见上面的表D)进行下面提供的BMI微样本测定法。将衣物洗涤剂溶解于硬度为12gpg且调节至温度为16℃的水中，添加目的蛋白酶变体酶。然后按照所述的BMI微样本测定法测定蛋白酶变体酶的性能。通过将蛋白酶变体酶的性能与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌GG36枯草杆菌蛋白酶的性能相比较来确定性能指数，在所有情况中，酶剂量范围为0.1-5ppm。性能指数为1.1或更大的蛋白酶变体酶被视为是冷水蛋白酶。
测试方法3
对于测试方法3，用颗粒衣物洗涤剂组合物7(参见上面的表D)进行下面提供的BMI微样本测定法。将衣物洗涤剂溶解于硬度为6gpg且调节至温度为16℃的水中，添加目的GG36蛋白酶变体酶。然后按照所述的BMI微样本测定法测定GG36蛋白酶变体酶的性能。通过将GG36蛋白酶变体酶的性能与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌GG36枯草杆菌蛋白酶的性能相比较来确定性能指数，在所有情况中，酶剂量范围为0.1-5ppm。性能指数为1.1或更大的GG36蛋白酶变体酶被视为是冷水蛋白酶。
测试方法4
对于测试方法4，用颗粒衣物洗涤剂组合物7(参见上面的表D)进行BMI微样本测定法。将衣物洗涤剂溶解于硬度为6gpg且调节至温度为16℃的水中，添加目的GG36蛋白酶变体酶。然后按照所述的BMI微样本测定法测定GG36蛋白酶变体酶的性能。通过将GG36蛋白酶变体酶的性能与参考酶GG36-A158E的性能相比较来确定性能指数，所述GG36-A158E参考酶由具有位置158处的丙氨酸置换为谷氨酸的单一置换(即A158E突变)的SEQ ID NO：2的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶氨基酸序列组成，在所有情况中酶剂量范围为0.1-5ppm。性能指数为1.0或更大的GG36蛋白酶变体酶被视为是冷水蛋白酶。
测试方法6
对于测试方法6，使用表1-2中的洗涤剂36a-36n中的一种进行BMI微样本测定法。将洗涤剂溶解于具有如表1-2中指定的硬度且调节至温度为16℃的水中。然后按照所描述的BMI微样本测定法测定变体酶的性能。通过将变体的性能与具有SEQ ID NO：2的酶的性能相比较来确定性能指数，在所有情况下酶剂量范围为0.1-5ppm。性能指数为1.1或更大的酶被视为是冷水蛋白酶。
测试方法7
对于测试方法7，使用表1中的洗涤剂中的一种进行BMI微样本测定法。将洗涤剂溶解于具有表1中所指定的硬度且调节至温度16℃或25℃的水中。然后按照所描述的BMI微样本测定法测定变体酶的性能。通过将变体的性能与具有SEQ ID NO：2的酶的性能相比较来确定性能指数，在所有情况下酶剂量范围为0.1-5ppm。性能指数为1.1或更大的酶被视为是冷水蛋白酶。
B.测定法
用于蛋白质含量测定的TCA测定法
在通潮湿空气的情况下，将枯草芽孢杆菌培养物在37℃下培养2-3天，同时以250-300rpm振摇。通过离心和/或过滤将细胞从包含酶的培养上清液中移除。使用TCA沉淀测定法测定蛋白酶/蛋白质/酶浓度。将培养上清液的等分试样(20-25ul)转移至装有100μL/孔的0.25N HC的96孔平底微量滴定板(MTP；Costar9017中等结合性透明聚苯乙烯板)。在混合5秒后，通过在405nm处的光散射/吸光度读数确定“基线”读数。将100微升/孔的30％(w/v)三氯乙酸(TCA)添加到含HCl的板中，并在室温下温育10分钟，以促进蛋白质沉淀。混合5秒后，测定该“测试”板在405nm处的光散射/吸光度。样品中浊度/光散射的增加与培养上清液中可沉淀蛋白质的总量相关。通过从“测试”读数(添加TCA后得到)减去“基线”读数(添加HCl后得到)进行计算，从而得到存在的总蛋白质的相对量度。针对已知浓度的GG36标准品确定将蛋白质沉淀与蛋白质浓度相关的转化因子。可将该转换因子用于所有变体，因为沉淀与浓度线性相关。如果需要，可通过用具有已知比活性的克隆的AAPF蛋白酶测定法(参见下文)校正TCA读数，来生成标准曲线。然而，TCA结果对于50至500份每一百万份(ppm)的蛋白质(其中1ppm对应于1mg/L)的蛋白质浓度而言是线性的，因而可相对于酶性能直接绘图以选择具有所需性能的变体。
AAPF蛋白酶测定法
为了测定丝氨酸蛋白酶变体(更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体)的蛋白酶活性，对N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的水解进行测量。使用的试剂溶液是：100mM Tris/HCl，pH8.6，含有0.005％-80(Tris稀释缓冲液)；100mM Tris缓冲液，pH8.6，含有1mM CaCl2和0.005％-80(Tris/Ca缓冲液)；和DMSO中的160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA储备溶液)(西格玛公司：S-7388)。为制备suc-AAPF-pNA工作溶液，将1ml suc-AAPF-pNA储备溶液添加至100ml Tris/Ca缓冲液并充分混合至少10秒。通过添加10μl的稀释蛋白酶溶液至96孔MTP的每个孔，随即添加190μL的1mg/mlsuc-AAPF-pNA工作溶液来进行该测定法。将溶液混合5秒，25℃下在MTP读板仪中在405nm处读取动力学模式的吸光度变化(5分钟内25个读数)。蛋白酶活性表示为AU(活性＝ΔOD.min-1ml-1)。
BMI微样本测定法(BMI测定法)
从测试材料中心公司(Center for Testmaterials BV)(荷兰弗拉尔丁恩(Vlaardingen，The Netherlands))获得96孔微量滴定板(MTP；Coming3641)中圆直径为5.5毫米的预漂洗和冲孔的血、奶和墨(BMI)玷污的微样品(EMPA116)。
通过如下制备表1中的洗涤剂：以适当水平的水硬度(3：1Ca：Mg.-CaCl2：MgCl2·6H2O)混合至少30分钟，如表1中所述，对于洗涤剂组合物104和105在Milli-Q水中进行混合，对于洗涤剂组合物101、102、103、106和107在2mM碳酸钠缓冲液pH10.3中混合。将洗涤剂离心并过滤以移除沉淀并在冰上冷冻30分钟，然后用于在16℃下进行的测定法。
使酶浓度相对于纯化的GG36的标准品调整(equalize)至20-50ppm范围内的所需固定浓度。将GG36使用AAPF作为底物的比活性用于将扣除基线的TCA值换算为酶浓度(ppm)。一旦测定了酶浓度(ppm)，使用以下简单的公式计算添加至固定体积的缓冲液(300-600μL)以达到所需储备酶浓度所需的每种变体的体积：
x＝(目标ppm)(vb)/(y-目标ppm)
其中x＝酶体积，y＝酶浓度，vb＝缓冲液体积
使用具有Versispan8通道臂的珀金埃尔默(Perkin-Elmer)Janus机械手的导电尖端，将可变体积的酶从源板(爱思进(Axygen)半深孔板，具有汇集的收获的用于TCA酶浓度测定法的变体)分配进填充有缓冲液的目标板中。通过用移液管上下吹吸来将样品混合三次。通过测量经调整的板的AAPF活性来验证酶稀释液的精确度，并将其与源板的AAPF活性相比较，来证实是否已制得恰当的稀释液。
调整后，将5-15μL酶溶液添加到填充有洗涤剂的BMI微样本板以达到约200μL的最终体积。在某些情况下，酶样品未经调整，相反全部从储备板同样地稀释以达到0.1至5ppm的工作范围。从剂量响应曲线确定每种测定法的最佳目标浓度，从而测量给定洗涤剂在该范围内的清洁活性。
用箔(伯乐公司)密封MTP，并且在设置为4°的冷藏室中或在25℃下，在工作台上的预设为16℃的iEMS温育器/振荡器(热电/雷勃公司(Thermo/Labsystems))中以1400rpm温育15-30分钟。温育后，将120μL上清液转移到新的MTP(Corning9017)中并使用SpectraMax读板仪在600nm下读数。通过从每个值扣除空白对照(不含酶)而得到真实的吸光度读数。
计算每种变体的性能指数(PI)。性能指数为在固定酶浓度下通过变体酶清洁制得的上清液的吸光度与通过GG36清洁制得的上清液的吸光度的比率。通过用变体吸光度除以给定板上的对照的吸光度计算PI值。如果在文库筛选中获得同一变体的多种形式，则将它们的PI值平均以得到单一的代表性值。大于1的性能指数(PI)(PI＞1)指示与标准品(例如GG36)相比优越的变体清洁能力，而等于1的PI(PI＝1)指示与标准品表现相同的变体，小于1的PI(PI＜1)指示比标准品表现差的变体。
*(3：1Ca：Mg)浓度如文中详述。
性能指数
该性能指数将相同蛋白质浓度下变体的性能(测量值)与标准酶的性能(理论值)相比较。另外，可用标准蛋白酶的性能剂量响应曲线的参数计算理论值。
实例2
GG36的变体和组合文库的构建
该实例描述了使用pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒在枯草芽孢杆菌中构建的GG36变体和文库的冷水清洁。该枯草芽孢杆菌表达质粒含有下面示出的GG36表达盒、地衣芽孢杆菌LAT启动子(Plat)和来自pUB110(McKenzie等人，Plasmid(《质粒》)，15：93-103，1986)的包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标记(bleo)在内的额外元件(美国专利No.6,566,112中的图4)。pHPLT-GG36质粒图谱在WO2011140364中提供。GG36表达盒序列在下文提供。
GG36的DNA序列(信号序列以小写字母示出，前肽以小写带下划线的文本示出，GG36成熟序列以大写字母示出)在下面提供：
gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgctttcagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaag tagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacg attcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgccgcttgagctcgatccagcgatttcttatattg aagaggatgcagaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAA(SEQ ID NO：3)
GG36的蛋白质序列(信号序列以小写字母示出，前肽以小写带下划线的文本示出，GG36成熟蛋白酶序列以大写字母示出)在下面提供：
vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellhefet ipvlsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSIQDGNGHGIHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQID NO：4)。
通过延伸PCR(WO2011140364)、QuickChange诱变(Stratagene)产生所述DNA文库和变体，或者在DNA2.0公司或GeneArt公司合成它们。将pHPLT-GG36质粒用于GG36变体基因的克隆或用于诱变反应。为了文库和变体在枯草芽孢杆菌的有效转化，根据生产商的说明书通过Illustra Templiphi试剂盒(GE Healthcare)使用滚环扩增对1微升连接文库产物或诱变反应产物进行扩增，以产生用于转化进枯草芽孢杆菌中的多聚体DNA。将该滚环扩增的产物稀释100倍并用于转化枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，amyE：：xylRPxylAcomK-phleo)。将转化混合物的等分试样涂布接种于含有1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB板上，并在37℃下温育过夜。随后，将具有晕圈的菌落接种进120μL含有10μg/mL新霉素的Luria肉汤培养基中用于质粒DNA提取(QIAprep Spin Miniprep试剂盒，Qiagen)。将提取的质粒进行测序以确认所需的突变的存在。如实例1(TCA测定法)中所述在枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，amyE：：xylRPxylAcomK-phleo)表达变体，并且进一步使用实例1中所述的BMI微样品清洁测定法进一步表征。在如下表中，洗涤剂组合物(“洗涤剂”)对应上面表1中所示的那些。另外，如所指出，氨基酸位置根据BPN’编号方式列出。

Claims (18)

1.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式，并且所述成熟形式中的氨基酸置换的组合是选自以下的氨基酸置换的组合：T022R+S101G+Q245R、T022R+S101G+V104I+Q245R,T022R+S101G+S103A+Q245R，或
T022R+S101G+A232V+Q245R,
T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R,
T022R-S101G-S103N-V104I-A232M-Q245R,
T022R-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R,
T022R-S101G-S103G-V104I-A232L-Q245R,
T022R-S101G-S103A-V104L-A232T-Q245R,
T022R-S101G-S103G-V104I-A232T-Q245R,
T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271H,
T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271H,
T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-T260M,
T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R,
T022R-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-N116L-A232V-Q245R,T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-P239G-Q245R,
T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-T260K-L267N,
T022R-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R,
T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-V121F-A232V-Q245R,
T022R-S078N-S101G-S103A-V104I-N116L-A232V-Q245R,
T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-P239G-Q245R-E271I,
T022R-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-Q109G-N116L-S128A-A232V-Q245R,
T022R-S024G-S078N-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R,T022R-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R,
T022R-S024G-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-N116L-L217Q-A232V-Q245R,
T022R-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R,
T022R-S024G-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-Q109N-N116L-L217Q-A232V-Q245R,
T022R-S024G-S101G-S103A-V104I-N116L-L217Q-A232V-Q245R,
T022R-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-Q109G-N116L-L217Q-A232V-Q245R,
T022R-G097A-S101G-S103A-V104I-Q109G-N116L-L217Q-A232V-Q245R,
T022R-S024G-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R,
T022R-S024G-G097A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R,
T022R-G097S-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R,
T022R-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R,
T022R-S101G-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R,
T022R-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R,T022R-S101G-S103A-A232V-Q245R,
T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271A,
T022R-S101G-V104I-A232V-Q245R,
T022R-S101G-S103A-V104I-Q245R,
T022R-S101G-S103A-V104I-A232L-Q245R,
T022R-S101G-S103N-A232L-Q245R,
T022R-S101G-S103N-V104L-A232L-Q245R,
R010A-T022R-S024F-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-L267N-E271H,T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271F，或
T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271H,
T022R-A098V-S101G-S103N-V104L-A232T-Q245R,T022R-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R,以及T022R-S101G-S103A-V104I-M222S-A232V-Q245R-E271H，其中枯草杆菌蛋白酶变体是由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置所对应的编号方式进行编号。
2.一种分离的核酸序列，其编码权利要求1提供的枯草杆菌蛋白酶变体。
3.一种表达载体，其包含根据权利要求2所述的核酸序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其中至少一种所述核酸序列与启动子有效连接。
5.一种宿主细胞，其包含根据权利要求3或4中所述的表达载体。
6.一种用于产生芽孢杆菌属(Bacillus)枯草杆菌蛋白酶的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，其包括：
a)用包含编码至少一种根据权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体的至少一种核酸序列的表达载体转化宿主细胞，以产生转化的宿主细胞；以及
b)在适于产生至少一种枯草杆菌蛋白酶变体的条件下培养所述转化的宿主细胞，以产生至少一种枯草杆菌蛋白酶变体。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括收获所产生的枯草杆菌蛋白酶变体。
8.根据权利要求6中所述的方法，其中所述宿主细胞为芽孢杆菌属物种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述芽孢杆菌属物种为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
10.一种包含至少一种根据权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体的组合物，其中所述组合物不是织物和家庭护理产品。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物为清洁组合物。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述清洁组合物为固体、液体、凝胶或糊剂组合物。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述清洁组合物为颗粒、粉末、条棒或片剂组合物。
14.根据权利要求10所述的组合物，还包含至少一种漂白剂。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中所述清洁组合物含有磷酸盐或不含磷酸盐。
16.根据权利要求10所述的组合物，还包含至少一种另外的酶。
17.一种清洁方法，包括使表面或物品与包含至少一种根据权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物接触。
18.一种清洁方法，包括使表面或物品与权利要求11-13或15中任一项所示的清洁组合物接触。
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