CN109477112A - 蛋白酶变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、编码其的核酸以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改善的稳定性和/或污垢去除性的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。

Description

蛋白酶变体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请涉及并要求于2016年5月31日提交的美国临时专利申请序列号62/343,618的优先权权益，将该临时专利申请通过援引以其全文并入本文。
以电子方式提交的序列表的引用
作为ASCII文本文件(名称：NB40785WOPCT_ST25；大小：882KB；创建日期：2017年5月26日)以电子方式与申请一起提交的序列表的内容形成本申请的一部分，并且通过引用以其全文并入本文。
本文公开了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、编码其的核酸以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改善的稳定性和/或污垢去除性的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。
丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(EC编号3.4.21)。丝氨酸蛋白酶包含种类繁多的具有广泛特异性和生物学功能的酶，基于这些酶的结构，这些酶进一步被划分为胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(EC编号3.4.21.62)最初从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)获得。枯草杆菌蛋白酶及其同源物是MEROPS分类方案的S8肽酶家族的成员。家族S8的成员在其氨基酸序列中具有顺序为Asp、His和Ser的催化三联体。尽管已经开发了许多可用于清洁应用的变体蛋白酶，但是仍然需要改善的蛋白酶变体。
一个实施例提供一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其包含在对应于SEQ ID NO:2的位置处包含两个、三个或四个或更多个变体的氨基酸序列，其中所述位置选自：(i)1、3、9、10、15、22、24、26、27、28、29、30、31、35、37、40、43、45、48、52、68、71、76、77、78、86、87、95、96、98、99、100、101、102、103、105、108、111、114、115、117、119、123、125、126、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、158、160、161、165、184、187、193、202、203、204、210、211、216、217、234、238、239、242、243、250、255、258、259、260、264和274；(ii)1、3、9、10、15、22、24、26、28、29、30、31、35、37、40、45、48、52、68、71、76、77、78、86、87、95、96、98、99、100、101、102、105、108、111、114、115、117、119、123、125、126、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、158、160、161、165、184、187、193、202、203、204、210、211、216、217、234、238、239、242、243、250、255、258、259、260、264和274；(iii)1、3、9、10、24、26、29、30、31、35、37、40、45、48、52、68、71、77、78、86、87、95、96、98、99、100、101、102、105、108、111、115、117、119、123、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、158、160、161、165、184、187、193、202、203、204、210、211、216、217、234、238、239、242、243、250、258、259、260、264和274；(iv)3、9、10、35、68、77、78、86、87、99、101、115、123、127、128、165、184、187、202、203、210、217、242、250、258和264；或(v)3、68、77、78、123、127、128、165、184、202、210、217和258；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是人为突变或取代；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少85％但小于100％的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
又另一个实施例提供了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其包含在对应于SEQ IDNO:2的两个、三个或四个或更多个位置处包含两个、三个或四个或更多个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述取代选自：(i)1Q、3Q/V、9E、10M、15I、22Y、24N/Q、26Q、27R、28A、29S、30T、31I、35A、37T、40E、43A、45I/Q/R、48I/T/V、52R、68S、71A、76K、77D/E/H/N/Q/S、78I、86H/N/R、87S/T、95A/F/Q、96S、98H/R、99A/E/Q/S、100N、101A、102D/T、103I、105N、108H/K、111Q、114N、115F、117S、119Q、123I、125N、126Q、127E/F/Q/S/T/V、128P/R/S、129H/R、130S、136N/R、143Q/V、146A/S、147L、151G、155E/G/N、158D/N/Q、160C/D/K、161D/Q、165A/E/Q/S、184E/Q、187E/P、193D/Q、202V、203E/N/Q、204I、210E/H/I/P、211S、216Q、217S、234I/W、238Q/R、239K/S/T、242G/N、243I、250G、255R、258D/E/P、259E/P、260W、264H/Q/S和274A；(ii)1Q、3Q/V、9E、10M、15I、22Y、24N/Q、26Q、28A、29S、30T、31I、35A、37T、40E、45I/Q/R、48I/T/V、52R、68S、71A、76K、77D/E/H/N/S、78I、86H/N/R、87S/T、95A/F/Q、96S、98K/R、99A/E/Q/S、100N、101A、102D/T、105N、108H/K、111Q、114N、115F、117S、119Q、123I、125N、126Q、127E/F/Q/S/T/V、128P/R/S、129H/R、130S、136N、143Q/V、146A/S、147L、151G、155E/G/N、158D/N/Q、160D/K、161D/Q、165A/E/Q/S、184E/Q、187E/P、193D/Q、194E、202V、203E/N/Q、204I、210I/P、211S、216Q、217S、234I/W、238Q/R、239K/S/T、242G/N、243I、250G、255R、258D/P、259E/P、260W、264H/Q/S和274A；(iii)1Q、3V、9E、10M、24Q、26Q、29S、30T、31I、35A、37T、40E、45I/Q/R、48T/V、52R、68S、71A、77E/N、78I、86H/R、87S、95A/F、96S、98R、99A/E/Q/S、100N、101A、102D/T、105N、108H、111Q、115F、117S、119Q、123I、127E/Q/S/T/V、128P/R、129H/R、130S、136N、143Q/V、146A、147L、151G、155G/N、158D/N/Q、160D/K、161D/Q、165A/E/Q、184E/Q、187E/P、193Q、202V、203E/N/Q、204I、210I/P、211S、216Q、217S、234W、238Q、239S、242G/N、243I、250G、258D/P、259E/P、260W、264H/Q/S和274A；(iv)3V、9E、10M、35A、68S、77N、78I、86H、87S、99Q/S、101A、115F、123I、127S/T、128P/R、165E/Q、184Q、187E、202V、203E、210P、217S、242G、250G、258D/P和264H；或(v)3V、68S、77N、78I、123I、127S、128P、165Q、184Q、202V、210P、217S和258D/P；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是人为取代；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少85％但小于100％的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
在一个实施例中，该AprL-进化枝酶包含基序A、基序B或其组合。在其他实施例中，该AprL-进化枝酶包含基序A和基序B。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含基序A、基序B或其组合。在仍其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含基序A和基序B。在另一个实施例中，基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4。在仍另外的实施例中，基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14。
一些实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。另外的实施例涉及一种清洁方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或本文所述的一种或多种组合物接触。
图1A-1D提供了AprL、Blid02339和其他AprL-进化枝酶的CLUSTAL W序列比对。
图2提供了包括AprL、Blid02339、AprL-进化枝的其他成员的枯草杆菌蛋白酶和包括本文所述的变体的其他枯草杆菌蛋白酶的***发生树。
除非本文另有说明，否则本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可通过常用于分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序、重组DNA领域和工业酶使用和开发的常规技术制备和使用。未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非本文另有定义，否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文提供的任何定义将在说明书的上下文中作为整体进行解释。除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数“一个/一种”和“该/所述”包括复数。除非另有说明，否则核酸序列从左至右以5’至3’方向书写；并且氨基酸序列从左向右以氨基至羧基方向书写。本文使用的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在此全部明确写出一样。
如本文与数值结合使用的术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非该术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非该pH值另有具体定义。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸取代或变异的命名使用以下中的一种或多种：位置；位置：氨基酸取代或一种或多种变异；或一种或多种起始氨基酸：位置：一种或多种氨基酸取代。对“位置”(即5、8、17、22等)的提及涵盖了可能存在于此类位置处的任何起始氨基酸，以及来自该起始氨基酸的任何变异或可能存在于此类位置处的取代。对“位置：一种或多种氨基酸取代和/或一种或多种变异”(即1S/T/G、3G、17T等)的提及涵盖了可能存在于该位置处的任何起始氨基酸和可能与该起始氨基酸不同和/或可能取代该起始氨基酸的一种或多种氨基酸。经取代的氨基酸和起始氨基酸相同的情况下，氨基酸取代排除该起始氨基酸。对起始氨基酸或取代的氨基酸或氨基酸变异的提及可以进一步表示为由斜线(“/”)分开的若干种起始、经取代的或经变异的氨基酸。例如，D275S/K表示位置275被丝氨酸(S)或赖氨酸(K)取代，并且P/S197K表示位置197处的起始氨基酸脯氨酸(P)或丝氨酸(S)被赖氨酸(K)取代。
给定的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。即，将SEQ ID NO:2所示的AprL-进化枝酶的氨基酸序列用作参比序列。例如，使用如本文所述的比对算法将本文所述的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶或一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列进行比对，并且与SEQ ID NO:2中的氨基酸残基比对(优选地，最佳比对)的给定的氨基酸序列中的每个氨基酸残基通过参照对应的氨基酸残基的用数字表示的位置而方便地编号。当与查询序列比较时，例如像本文所述的序列比对算法将鉴定在主题序列中发生***或缺失的位置。
关于多肽氨基酸序列，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽氨基酸序列，不同在于它包括一种或多种人为氨基酸取代、***或缺失。相似的，关于多核苷酸核酸序列，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多核苷酸不同的多核苷酸核酸序列，不同在于它包括一种或多种人为核酸取代、***或缺失。野生型、亲本或参比多肽核酸序列或多核苷酸核酸序列的身份将从上下文中显而易见。
当在例如短语“相对于SEQ ID NO:2的两个、三个、或四个或更多个氨基酸变异”或“对应于SEQ ID NO:2的位置处的两个、三个或四个或更多个变异”中使用时，术语“一个或多个变异”涵盖与存在于SEQ ID NO:2中对应位置处的氨基酸不同的每个氨基酸。例如，将目的变体的序列与SEQ ID NO:2进行比对，并且将该变体中的每个位置与SEQ ID NO:2进行比较，以鉴定每个位置处与存在于SEQ ID NO:2中对应位置处的氨基酸不同的氨基酸，并且与SEQ ID NO:2中对应氨基酸不同的每个氨基酸都为变异。
术语“蛋白酶”(protease)和“朊酶”(proteinase)是指具有分解蛋白质和肽的能力的酶。蛋白酶具有通过肽键的水解进行“蛋白水解”的能力，所述肽键在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。存在用于测量蛋白水解活性的许多熟知的程序。例如，蛋白水解活性可以通过分析各自蛋白酶水解合适底物的能力的比较试验来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛公司(Sigma)C-9801)、牛胶原(西格玛公司C-9879)、牛弹性蛋白(西格玛公司E-1625)和牛角蛋白(ICN生物医学公司(ICNBiomedical)902111)。使用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如WO 99/34011和US 6,376,450)。pNA肽基测定(参见例如，Del Mar等人,Anal Biochem[分析生物化学],99:316-320,1979)还可用于确定活性酶浓度。该测定测量当酶水解可溶性合成底物例如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上在410nm测量来自水解反应的黄色的生成速率并且该速率与活性酶浓度成正比。另外，在280纳米(nm)处的吸光度测量可以用于确定纯化的蛋白质样品中的总蛋白质浓度。底物/蛋白质浓度的活性给出了酶比活性。
短语“一种或多种基本上不含硼的组合物”或“一种或多种基本上不含硼的洗涤剂”是指一种或多种分别含有痕量硼(例如，小于约1000ppm(1mg/kg或L(等于1ppm))、小于约100ppm、小于约50ppm、小于约10ppm、或小于约5ppm、或小于约1ppm)的组合物或洗涤剂，这些硼可能来自其他组合物或洗涤剂成分。
如本文使用的，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。应认识到，芽孢杆菌属不断进行分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多黏芽孢杆菌(B.polymyxa)(现在是“多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体。在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
如本文使用的，术语“突变”是指对参比氨基酸或核酸序列进行的人为改变。该术语旨在涵盖人为取代、***和缺失。
如本文使用的，术语“载体”是指用于将一个或多个核酸引入或转移到靶细胞或靶组织中的核酸构建体。典型地，载体用于将外源DNA引入细胞或组织中。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如病毒载体)、黏粒、表达载体、穿梭载体等。典型地，载体包括复制起点、多克隆位点和可选择标记。典型地，将载体***靶细胞的过程被称为转化。在一些实施例中，本发明包括：包含有效地连接到合适的前导序列(例如分泌、信号肽序列等)的编码丝氨酸蛋白酶多肽(例如，前体或成熟丝氨酸蛋白酶多肽)的DNA序列的载体，该载体能够在合适的宿主中实现DNA序列的表达，以及重组多肽链的折叠和易位。
如本文使用的，在将核酸序列引入细胞中的上下文中，术语“引入”是指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。此类引入方法包括但不限于：原生质体融合、转染、转化、电穿孔、轭合和转导。转化是指由摄取、任选的基因组掺入和遗传物质(例如DNA)的表达引起的细胞的遗传改变。
“表达盒”或“表达载体”是指重组或合成产生的用于在靶细胞中表达目的核酸的核酸构建体或载体(例如外源核酸或转基因)。典型地，目的核酸表达目的蛋白。典型地，表达载体或表达盒包含驱动或促进外源核酸表达的启动子核苷酸序列。典型地，表达载体或表达盒还包括其他的允许靶细胞中特定核酸转录的特定核酸元件。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。一些表达载体具有在宿主细胞或宿主细胞基因组中整合并表达异源DNA片段的能力。许多原核和真核表达载体是可商购的。从掺入表达载体的核酸序列中选择用于表达蛋白质的合适的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。
如本文使用的，当核酸与另一个核酸序列一起置于功能关系时，该核酸与另一个核酸序列“有效地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，启动子或增强子有效地连接到核苷酸编码序列。如果核糖体结合位点被定位以便促进编码序列的翻译，该核糖体结合位点可以有效地连接到编码序列。典型地，“有效地连接”的DNA序列是邻接的。然而，增强子不需要是邻接的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果此类位点不存在，则可以按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文使用的，术语“基因”是指编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域的多核苷酸(例如，DNA区段)。在一些情况下，基因包括个体编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
如本文使用的，当关于细胞使用时，“重组体”典型地表明细胞已经通过引入外源核酸序列而被修饰，或者细胞衍生自如此修饰的细胞。例如，重组细胞可以包含在天然(非重组)形式的细胞中不以相同形式存在的基因，或者重组细胞可以包含已经被修饰并且重新引入细胞中的天然基因(发现于细胞的天然形式中)。重组细胞可以包含细胞内源的核酸，该核酸已经被修饰而不从细胞中除去该核酸；此类修饰包括通过基因取代、位点特异性突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的那些。重组DNA技术包括用于在体外生产重组DNA并且将该重组DNA转移到其可以被表达或繁殖的细胞中从而生产重组多肽的技术。多核苷酸或核酸的“重组”(recombination和recombining)通常是指装配或组合两个或更多个核酸或多核苷酸链或片段以产生新的多核苷酸或核酸。
如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员已知的方法操纵时，核酸或多核苷酸可以被转录和/或翻译以生产多肽或其片段，那么称该核酸或多核苷酸“编码”该多肽。这样的核酸的反义链也被称为编码该序列。
术语“宿主菌株”和“宿主细胞”是指对于包含感兴趣的DNA序列的表达载体而言合适的宿主。
“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(JointCommission on Biochemical Nomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。
“前导序列”或“前导肽序列”是指在信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前导序列或前导肽序列的切割产生成熟的活性蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶通常表达为前酶。
术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。典型地，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。典型地，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。
术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前导肽序列的蛋白质、多肽或肽的功能形式。
术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到该蛋白质的氨基或羧基末端的前导序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到前导序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。
关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”表示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所使用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质或多核苷酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组多核苷酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
如本文使用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文使用的，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。
术语“衍生自”和“获自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，该术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。举例来说，“来源于芽孢杆菌属的蛋白酶”是指具有由芽孢杆菌属天然生产的蛋白水解活性的那些酶，以及丝氨酸蛋白酶，如由芽孢杆菌属来源生产但是通过使用遗传工程技术由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的其他宿主细胞生产的那些。
在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”是指在两个序列中的核酸或氨基酸在比对最大对应关系时相同，如使用以下描述的或本领域已知的序列比较或分析算法测量的。
“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。可以通过比对序列以直接比较序列信息来确定目标序列共有的氨基酸同一性百分比，例如通过使用例如BLAST、MUSCLE或CLUSTAL的程序。BLAST算法描述于例如Altschul等人，J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410(1990)以及Karlin等人，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]，90:5873-5787,1993)中。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。
如本文所使用的，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。同源性可以通过氨基酸序列比对例如，使用程序例如BLAST、MUSCLE或CLUSTAL来确定。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul等，“Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation ofprotein database search programs”[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序],Nucleic Acids Res[核酸研究],第1组；25(17):3389-402(1997))。BLAST程序使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]，25:3389-3402,1997以及Schaffer等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；打分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放(GapOpening)＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；打分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。使用该信息，可以将蛋白质序列分组和/或从中构建***发生树。可以在例如Vector NTI Advance套件等程序中输入氨基酸序列，并且可以使用邻接(Neighbor Joining(NJ))法创建引导树(Saitou和Nei,Mol Biol Evol[分子生物学与进化],4:406-425,1987)。可以使用针对序列距离的Kimura校正并且忽略具有空位的位置来计算树结构。程序例如AlignX可以在***发生树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值。
了解分子之间的同源性可以揭示分子的进化历史以及它们的功能信息；如果新测序的蛋白质与已经表征的蛋白质同源，则存在新蛋白质的生物化学功能的强烈指示。两个实体之间最基本的关系是同源性；如果两个分子来源于共同的祖先，则它们被称为是同源的。同源分子或同系物可以分为两类：旁系同源物和直系同源物。旁系同源物是存在于一个物种内的同系物。旁系同源物在它们的详细生物化学功能上往往不同。直系同源物是存在于不同物种内并且具有非常相似或完全相同功能的同系物。蛋白质超家族是可以推断出共同祖先的蛋白质的最大分组(进化枝)。通常这个共同祖先是基于序列比对和机械相似性。典型地，超家族含有若干个在该家族内显示序列相似性的蛋白质家族。基于MEROPS蛋白酶分类***，术语“蛋白质宗族”通常用于蛋白酶超家族。
CLUSTAL W算法是序列比对算法的另一个实例(参见Thompson等人，NucleicAcids Res[核酸研究]22:4673-4680,1994)。CLUSTAL W算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质权重矩阵＝BLOSUM系列；DNA权重矩阵＝IUB；延迟发散序列％＝40；空位分隔距离＝8；DNA转换权重＝0.50；列表亲水残基＝GPSNDQEKR；使用负性矩阵＝关；切换特殊残基罚分＝开；切换亲水罚分＝开；以及切换结束空位分隔罚分＝关。在CLUSTAL算法中，包括在任一末端发生的缺失。例如，500个氨基酸的多肽的任一末端(或多肽内)具有五个氨基酸缺失的变体相对于“参比”多肽具有99％(495/500个相同残基×100)的百分比序列同一性。这样的变体将被与该多肽具有“至少99％的序列同一性”的变体所涵盖。
当核酸或多核苷酸至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。类似地，当多肽、蛋白质或肽至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔计，在组合物中分离的种类比其他种类更丰富。例如，分离的种类可以包含存在的所有大分子种类的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％(以摩尔计)。优选地，将感兴趣的种类纯化至基本同质(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)。可以分别使用本领域熟知的许多技术例如核酸或蛋白质样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过染色后可视化来确定纯度和同质。如果需要，可以使用高分辨率技术例如高效液相色谱法(HPLC)或类似方法来纯化物质。
术语“纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于该分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定物质或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
如本文使用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定***。例如，在蛋白酶的情况下，功能测定涉及确定蛋白酶水解蛋白质底物的有效性。
术语“清洁活性”是指在本公开的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间主要的条件下由丝氨酸蛋白酶多肽或参比枯草杆菌蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶或参比枯草杆菌蛋白酶的清洁性能可以通过使用用于清洁在物品或表面上的一种或多种酶敏感性污渍(例如，由食物、草地、血液、墨汁、奶、油和/或卵蛋白引起的污渍)的各种测定来确定。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参比枯草杆菌蛋白酶的清洁性能可以通过使在物品或表面上的污渍经受一个或多个标准洗涤条件并且通过使用各种色谱、分光光度计或其他定量方法来评价污渍除去的程度来确定。示例性清洁测定和方法是本领域已知的，并且包括但不限于在WO 99/34011和US 6,605,458中描述的那些，以及包括在下面所提供的实例中的那些清洁测定和方法。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参比枯草杆菌蛋白酶的术语“清洁有效量”是指在特定清洁组合物中达到希望的酶活性水平的蛋白酶的量。此类有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定，并且基于许多因素，例如所使用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成、以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、片剂、棒状)组合物等。
术语“清洁辅助材料”是指除了本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体之外在清洁组合物中包含的任何液体、固体或气体物质。在一些实施例中，本公开的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。典型地，取决于清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、棒状、糊剂、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁辅助材料。优选地，每种清洁辅助材料与在组合物中使用的蛋白酶相容。
清洁组合物和清洁制剂包括适合于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体、物品和/或表面的任何组合物。此类组合物和制剂包括但不限于例如液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片剂、凝胶、棒状、颗粒和/或固体衣物清洁或洗涤剂组合物)和精细织物洗涤剂组合物；硬表面清洁组合物和制剂，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔顺剂；以及纺织品、衣物增效清洁或洗涤剂组合物，衣物添加剂清洁组合物和衣物预去污(pre-spotter)清洁组合物；餐具洗涤组合物，包括手洗或手动餐具洗涤组合物(例如“手洗”或“手动”餐具洗涤剂)和自动餐具洗涤组合物(例如“自动餐具洗涤剂”)。本发明还可使用单一剂量单位形式，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片(gelca)或其他单一剂量单位例如预先测量的粉末或液体。
除非另有说明，否则如本文使用的清洁组合物或清洁制剂包括颗粒或粉末形式的通用的或重垢洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片剂、糊剂或单位剂量形式的通用洗涤剂，特别是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢干洗(HDD)洗涤剂类型；液体精细织物洗涤剂；手洗或手动餐具洗涤剂，包括高起泡类型的那些；手洗或手动餐具洗涤剂、自动餐具洗涤剂、或餐具或桌面器具洗涤剂，包括用于家庭和机构使用的各种片剂、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁棒、漱口水、假牙清洁剂、洗车香波、地毯香波、浴室清洁剂；用于人类和其他动物的毛发香波和/或毛发染发剂；沐浴露和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒组合物是处于“致密”形式；在一些实施例中，液体组合物是处于“浓缩”形式。
如本文使用的，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，其包括衣物添加剂组合物和适合用于带有污渍的织物(例如衣服、亚麻制品和其他纺织材料)的浸泡和/或预处理的组合物。
如本文使用的，“非织物清洁组合物”包括非纺织品(即非织物)表面清洁组合物，包括但不限于例如手洗或手动或自动餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、接触透镜清洁组合物、伤口清创组合物和个人清洁组合物。
如本文使用的，关于旨在用于清洁污染或肮脏物体(包括特定织物和/或非织物物体或物品)的洗涤介质中使用的组合物，使用术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”。在一些实施例中，本公开的洗涤剂包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，另外还包含一种或多种表面活性剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在一些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选具有比磷酸盐(例如三聚磷酸钠)更多的硅酸盐(例如偏硅酸钠)。一些实施例涉及清洁组合物或洗涤剂组合物，不包含任何磷酸盐(例如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。
如本文使用的，术语“漂白”是指处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面持续足够长的时间和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增白(即变白)和/或清洁。适合于漂白的化学品的实例包括但不限于例如ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
如本文使用的，蛋白酶(例如，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、或其重组多肽或活性片段)的“洗涤性能”是指与不添加本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体至组合物的洗涤剂相比，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体对洗涤提供另外的清洁性能的贡献。在相关洗涤条件下比较洗涤性能。在一些测试***中，其他相关因素，例如洗涤剂组合物、泡沫浓度(sud concentration)、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度能按以下这样的方式进行控制：模仿在某些细分市场(例如手洗或手动餐具洗涤、自动餐具洗涤、餐具清洁、桌面器具清洁、织物清洁等)中对于家庭应用典型的一种或多种条件。
本文中使用的术语“相关洗涤条件”表示在手洗餐具洗涤、自动餐具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中实际用于家庭中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
如本文使用的，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及在物品表面上抑制或杀死微生物。
本文清洁组合物的“致密”形式最好通过密度来反映，并且就组合物而言通过无机填料盐的量来反映。无机填料盐是处于粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐以相当大的量存在，典型地为总组合物的约17％至约35％(以重量计)。相比之下，在致密的组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过组合物(以重量计)的约10％、或更优选地约5％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自硫酸盐和氯化物的碱盐和碱土金属盐。在一些实施例中，填料盐是硫酸钠。
本文公开了可用于清洁应用和清洁方法以及多种工业应用的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。本文公开了一种或多种分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于清洁应用中，并且可以并入可用于清洁对其有需要的物品或表面的方法中的清洁组合物中。
一个实施例提供了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含相对于SEQ IDNO:2在选自以下的位置处的两个、三个或四个或更多个变异：(i)1、3、9、10、15、17、19、22、24、25、26、27、28、30、35、37、38、43、45、48、68、71、74、76、77、78、86、87、91、95、96、98、99、100、102、103、108、111、114、115、120、123、125、126、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、160、165、183、184、187、193、202、203、210、217、234、238、239、240、242、247、250、251、255、258、259、260和274；(ii)1、3、9、15、22、24、28、30、35、37、45、48、68、71、74、76、77、78、86、87、95、96、98、99、100、108、114、115、120、123、125、126、127、128、129、130、143、146、147、151、155、165、183、184、187、193、202、203、210、217、234、238、239、240、242、247、250、255、258、259、260和274；(iii)1、3、15、35、68、71、77、86、87、95、99、115、123、127、128、147、155、165、184、202、210、217、234、239、242、250、258和274；或(iv)3、68、77、86、99、115、123、127、128、165、184、202、210、217和258；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是非天然存在的氨基酸；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有85％或更高的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。另一个实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其包含在对应于SEQ ID NO:2的位置处包含两个、三个或四个或更多个变体的氨基酸序列，其中所述位置选自：(i)1、3、9、10、15、22、24、26、27、28、29、30、31、35、37、40、43、45、48、52、68、71、76、77、78、86、87、95、96、98、99、100、101、102、103、105、108、111、114、115、117、119、123、125、126、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、158、160、161、165、184、187、193、202、203、204、210、211、216、217、234、238、239、242、243、250、255、258、259、260、264和274；(ii)1、3、9、10、15、22、24、26、28、29、30、31、35、37、40、45、48、52、68、71、76、77、78、86、87、95、96、98、99、100、101、102、105、108、111、114、115、117、119、123、125、126、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、158、160、161、165、184、187、193、202、203、204、210、211、216、217、234、238、239、242、243、250、255、258、259、260、264和274；(iii)1、3、9、10、24、26、29、30、31、35、37、40、45、48、52、68、71、77、78、86、87、95、96、98、99、100、101、102、105、108、111、115、117、119、123、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、158、160、161、165、184、187、193、202、203、204、210、211、216、217、234、238、239、242、243、250、258、259、260、264和274；(iv)3、9、10、35、68、77、78、86、87、99、101、115、123、127、128、165、184、187、202、203、210、217、242、250、258和264；或(v)3、68、77、78、123、127、128、165、184、202、210、217和258；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是人为突变或取代；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少85％但小于100％的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
仍另一个实施例提供了一种或多种枯草杆菌蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶包含相对于SEQ ID NO:2的两个、三个或四个或更多个变异，所述变异选自：(i)1Q、3Q/V、9E/T、10M、15I/V、17H、19E、22Y、24N、25D、26R、27R、28A、30T、35A、37T、38G、43A、45I/R、48I、68S、71A、74G、76K、77D/H/N/Q/S、78I、86H/N/R、87S/T、91G、95A/Q、96S、98H/K/R、99L/S、100N/R、102R、103I、108H/K、111Q、114N、115F、120A、123I、125N、126Q、127F/T、128P/S、129T、130S、136A/R、143V、146A/S、147L、151G、155A/E/G、160C/R、165A/E/Q/S、183A/G、184Q、187P、193D、202V、203E/N、210E/H/P、217S、234I/W、238R/T、239K/S/T、240N、242G、247W、250G、251E、255R、258E/H/P、259P、260W和274A/F；(ii)1Q、3Q/V、9E、15I、22Y、24N、28A、30T、35A、37T、45I、48I、68S、71A、74G、76K、77D/H/N/S、78I、86H/N/R、87S/T、95A/Q、96S、98K、99L/S、100N、108H/K、114N、115F、120A、123I、125N、126Q、127F/T、128P/S、129T、130S、143V、146A/S、147L、151G、155A/E/G、165A/E/Q/S、183G、184Q、187P、193D、202V、203E/N、210P、217S、234I/W、238R/T、239K/S/T、240N、242G、247W、250G、255R、258P、259P、260W和274A；(iii)1Q、3V、15I、35A、68S、71A、77N、86H、87S、95A、99S、115F、123I、127T、128P/S、147L、155G、165Q/S、184Q、202V、210P、217S、234W、239S、242G、250G、258P和274A；或(iv)3V、68S、77N、86H、99S、115F、123I、127T、128P、165Q、184Q、202V、210P、217S和258P；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是非天然存在的氨基酸；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有85％或更高的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
又另一个实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：(i)A/G1、T3、P9、L/Q10、K15、H/Q17、Q19、K22、A24、N25、V26、K27、G/V28、I/V30、I35、A/S/T37、S38、N/K43、V45、A48、A68、V71、L74、N76、S/T77、I/T78、N/S86、V87、A/I91、L95、N96、S98、G99、S100、S/T102、Y103、S108、E111、T114、A/Q/T115、V120、M123、L125、G126、G127、A/P/T128、S129、G/V130、Q136、A/S143、A/I/V146、V147、A/S151、S155、N/S/Y160、G165、G/K/N/S183、N/Q184、S187、A/P/S193、K194、A/S/V202、G/S203、S/T210、S211、N217、L234、P238、A/N/T239、A242、D/N/T247、S250、R/S251、N/Y255、D/S258、S259、F260和Q274；(ii)A/G1、T3、P9、K15、K22、A24、G/V28、I/V30、I35、A/S/T37、V45、A48、A68、V71、L74、N76、S/T77、I/T78、N/S86、V87、L95、N96、S98、G99、S100、S108、T114、A/Q/T115、V120、M123、L125、G126、G127、A/P/T128、S129、G/V130、A/S143、A/I/V146、V147、A/S151、S155、G165、K/S183、N184、S187、A/P/S193、K194、A/S/V202、G/S203、S/T210、S211、N217、L234、P238、A/N/T239、A242、D/N/T247、S250、N/Y255、D/S258、S259、F260和Q274；(iii)A/G1、T3、K15、I35、A68、V71、S/T77、N/S86、V87、L95、G99、A/Q/T115、M123、G127、A/P/T128、V147、S155、G165、N184、A/S/V202、S/T210、N217、L234、A/N/T239、A242、S250、D/S258和Q274；或(iv)T3、A68、S/T77、N/S86、G99、A/Q/T115、M123、G127、A/P/T128、G165、N184、A/S/V202、S/T210、N217和D/S258；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的氨基酸；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有85％或更高的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。仍又另一个实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：(i)A/G1、T3、P9、L10、K15、H/Q17、Q19、K22、A24、N25、V26、K27、G/V28、I/V30、I35、A/S/T37、S38、N/K43、V45、A48、A68、V71、L74、N76、T77、T78、N/S86、V87、A91、L95、N96、S98、G99、S100、S/T102、Y103、S108、E111、T114、Q/T115、V120、M123、L125、G126、G127、A/P128、S129、G/V130、Q136、A143、A/I/V146、V147、A/S151、S155、N/S160、G165、K/S183、N184、S187、A/S193、K194、A/V202、G/S203、S/T210、S211、N217、L234、P238、N/T239、A242、N/T247、S250、R/S251、N/Y255、D/S258、S259、F260和Q274；(ii)A/G1、T3、P9、K15、K22、A24、G/V28、I/V30、I35、A/S/T37、V45、A48、A68、V71、L74、N76、T77、T78、N/S86、V87、L95、N96、S98、G99、S100、S108、T114、Q/T115、V120、M123、L125、G126、G127、A/P128、S129、G/V130、A143、A/I/V146、V147、A/S151、S155、G165、K/S183、N184、S187、A/S193、K194、A/V202、G/S203、S/T210、S211、N217、L234、P238、N/T239、A242、N/T247、S250、N/Y255、D/S258、S259、F260和Q274；(iii)A/G1、T3、K15、I35、A68、V71、T77、N/S86、V87、L95、G99、Q/T115、M123、G127、A/P128、V147、S155、G165、N184、A/V202、S/T210、N217、L234、N/T239、A242、S250、D/S258和Q274；或(iv)T3、A68、T77、N/S86、G99、Q/T115、M123、G127、A/P128、G165、N184、A/V202、S/T210、N217和D/S258；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的氨基酸；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有85％或更高的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：(i)1Q、3Q/V、9E/T、10M、15I/V、17H、19E、22Y、24N、25D、26R、27R、28A、30T、35A、37T、38G、43A、45I/R、48I、68S、71A、74G、76K、77D/H/N/Q/S、78I、86H/N/R/S、87S/T、91G、95A/Q、96S、98H/K/R、99L/S、100N/R、102R、103I、108H/K、111Q、114N、115F、120A、123I、125N、126Q、127F/T、128P/S、129T、130S、136A/R、143V、146A/S、147L、151G、155A/E/G、160C/R、165A/E/Q/S、183A/G、184Q、187P、193D、194E、202V、203E/N、210E/H/P、211N、217S、234I/W、238R/T、239K/S/T、242G、247W、250G、251E、255R、258E/H/P、259P、260W和274A/F；(ii)1Q、3Q/V、9E、15I、22Y、24N、28A、30T、35A、37T、45I、48I、68S、71A、74G、76K、77D/H/N/S、78I、86H/N/R/S、87S/T、95A/Q、96S、98K、99L/S、100N、108H/K、114N、115F、120A、123I、125N、126Q、127F/T、128P/S、129T、130S、143V、146A/S、147L、151G、155A/E/G、165A/E/Q/S、183G、184Q、187P、193D、194E、202V、203E/N、210P、211N、217S、234I/W、238R/T、239K/S/T、242G、247W、250G、255R、258P、259P、260W和274A；(iii)1Q、3V、15I、35A、68S、71A、77N、86H、87S、95A、99S、115F、123I、127T、128P/S、147L、155G、165Q/S、184Q、202V、210P、217S、234W、239S、242G、250G、258P和274A；或(iv)3V、68S、77N、86H、99S、115F、123I、127T、128P、165Q、184Q、202V、210P、217S和258P；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的氨基酸；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有85％或更高的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
又另外的实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含在对应于SEQ ID NO:2的两个、三个或四个或更多个位置处包含两个、三个或四个或更多个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述取代选自：(i)1Q、3Q/V、9E、10M、15I、22Y、24N/Q、26Q、27R、28A、29S、30T、31I、35A、37T、40E、43A、45I/Q/R、48I/T/V、52R、68S、71A、76K、77D/E/H/N/Q/S、78I、86H/N/R、87S/T、95A/F/Q、96S、98H/R、99A/E/Q/S、100N、101A、102D/T、103I、105N、108H/K、111Q、114N、115F、117S、119Q、123I、125N、126Q、127E/F/Q/S/T/V、128P/R/S、129H/R、130S、136N/R、143Q/V、146A/S、147L、151G、155E/G/N、158D/N/Q、160C/D/K、161D/Q、165A/E/Q/S、184E/Q、187E/P、193D/Q、202V、203E/N/Q、204I、210E/H/I/P、211S、216Q、217S、234I/W、238Q/R、239K/S/T、242G/N、243I、250G、255R、258D/E/P、259E/P、260W、264H/Q/S和274A；(ii)1Q、3Q/V、9E、10M、15I、22Y、24N/Q、26Q、28A、29S、30T、31I、35A、37T、40E、45I/Q/R、48I/T/V、52R、68S、71A、76K、77D/E/H/N/S、78I、86H/N/R、87S/T、95A/F/Q、96S、98K/R、99A/E/Q/S、100N、101A、102D/T、105N、108H/K、111Q、114N、115F、117S、119Q、123I、125N、126Q、127E/F/Q/S/T/V、128P/R/S、129H/R、130S、136N、143Q/V、146A/S、147L、151G、155E/G/N、158D/N/Q、160D/K、161D/Q、165A/E/Q/S、184E/Q、187E/P、193D/Q、194E、202V、203E/N/Q、204I、210I/P、211S、216Q、217S、234I/W、238Q/R、239K/S/T、242G/N、243I、250G、255R、258D/P、259E/P、260W、264H/Q/S和274A；(iii)1Q、3V、9E、10M、24Q、26Q、29S、30T、31I、35A、37T、40E、45I/Q/R、48T/V、52R、68S、71A、77E/N、78I、86H/R、87S、95A/F、96S、98R、99A/E/Q/S、100N、101A、102D/T、105N、108H、111Q、115F、117S、119Q、123I、127E/Q/S/T/V、128P/R、129H/R、130S、136N、143Q/V、146A、147L、151G、155G/N、158D/N/Q、160D/K、161D/Q、165A/E/Q、184E/Q、187E/P、193Q、202V、203E/N/Q、204I、210I/P、211S、216Q、217S、234W、238Q、239S、242G/N、243I、250G、258D/P、259E/P、260W、264H/Q/S和274A；(iv)3V、9E、10M、35A、68S、77N、78I、86H、87S、99Q/S、101A、115F、123I、127S/T、128P/R、165E/Q、184Q、187E、202V、203E、210P、217S、242G、250G、258D/P和264H；或(v)3V、68S、77N、78I、123I、127S、128P、165Q、184Q、202V、210P、217S和258D/P；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是人为取代；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少85％但小于100％的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
仍另外的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：(i)A/G1Q、T3Q/V、P9E/T、L/Q10M、K15I/V、Q17H、Q19E、K22Y、A24N、N25D、V26R、K27R、G/V28A、I/V30T、I35A、A/S37T、S38G、N/K43A、V45I/R、A48I、A68S、V71A、L74G、N76K、S/T77D/H/N/Q/S、T78I、N/S86H/N/R/S、V87S/T、A/I91G、L95A/Q、N96S、S98H/K/R、G99L/S、S100N/R、S/T102R、Y103I、S108H/K、E111Q、T114N、A/Q/T115F、V120A、M123I、L125N、G126Q、G127F/T、A/P/T128P/S、S129T、G/V130S、Q136A/R、A/S143V、A/I/V146A/S、V147L、A/S151G、S155A/E/G、N/S/Y160C/R、G165A/E/Q/S、G/K/N/S183A/G、N184Q、S187P、A/P/S193D、K194E、A/S202V、G/S203E/N、S/T210E/H/P、S211N、N217S、L234I/W、P238R/T、A/N/T239K/S/T、A242G、D/N/T247W、S250G、R/S251E、N/Y255R、D/S258E/H/P、S259P、F260W和Q274A/F；(ii)A/G1Q、T3Q/V、P9E、K15I、K22Y、A24N、G/V28A、I/V30T、I35A、A/S37T、V45I、A48I、A68S、V71A、L74G、N76K、S/T77D/H/N/S、T78I、N/S86H/N/R/S、V87S/T、L95A/Q、N96S、S98K、G99L/S、S100N、S108H/K、T114N、A/Q/T115F、V120A、M123I、L125N、G126Q、G127F/T、A/P/T128P/S、S129T、G/V130S、A/S143V、A/I/V146A/S、V147L、A/S151G、S155A/E/G、G165A/E/Q/S、K/S183G、N184Q、S187P、A/P/S193D、K194E、A/S202V、G/S203E/N、S/T210P、S211N、N217S、L234I/W、P238R/T、A/N/T239K/S/T、A242G、D/N/T247W、S250G、N/Y255R、D/S258P、S259P、F260W和Q274A；(iii)A/G1Q、T3V、K15I、I35A、A68S、V71A、S/T77N、N/S86H、V87S、L95A、G99S、A/Q/T115F、M123I、G127T、A/P/T128P/S、V147L、S155G、G165Q/S、N184Q、A/S202V、S/T210P、N217S、L234W、A/N/T239S、A242G、S250G、D/S258P和Q274A；或(iv)T3V、A68S、S/T77N、N/S86H、G99S、A/Q/T115F、M123I、G127T、A/T128P、G165Q、N184Q、A/S202V、S/T210P、N217S和D/S258P；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的氨基酸；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有85％或更高的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。仍又进一步的实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：(i)A/G1Q、T3Q/V、P9E/T、L10M、K15I/V、Q17H、Q19E、K22Y、A24N、N25D、V26R、K27R、G/V28A、I/V30T、I35A、A/S37T、S38G、N/K43A、V45I/R、A48I、A68S、V71A、L74G、N76K、T77D/H/N/Q/S、T78I、N/S86H/N/R/S、V87S/T、A91G、L95A/Q、N96S、S98H/K/R、G99L/S、S100N/R、S/T102R、Y103I、S108H/K、E111Q、T114N、Q/T115F、V120A、M123I、L125N、G126Q、G127F/T、A/P128P/S、S129T、G/V130S、Q136A/R、A143V、A/I/V146A/S、V147L、A/S151G、S155A/E/G、N/S160C/R、G165A/E/Q/S、K/S183A/G、N184Q、S187P、A/S193D、K194E、A202V、G/S203E/N、S/T210E/H/P、S211N、N217S、L234I/W、P238R/T、N/T239K/S/T、A242G、N/T247W、S250G、R/S251E、N/Y255R、D/S258E/H/P、S259P、F260W和Q274A/F；(ii)A/G1Q、T3Q/V、P9E、K15I、K22Y、A24N、G/V28A、I/V30T、I35A、A/S37T、V45I、A48I、A68S、V71A、L74G、N76K、T77D/H/N/S、T78I、N/S86H/N/R/S、V87S/T、L95A/Q、N96S、S98K、G99L/S、S100N、S108H/K、T114N、Q/T115F、V120A、M123I、L125N、G126Q、G127F/T、A/P128P/S、S129T、G/V130S、A143V、A/I/V146A/S、V147L、A/S151G、S155A/E/G、G165A/E/Q/S、K/S183G、N184Q、S187P、A/S193D、K194E、A202V、G/S203E/N、S/T210P、S211N、N217S、L234I/W、P238R/T、N/T239K/S/T、A242G、N/T247W、S250G、N/Y255R、D/S258P、S259P、F260W和Q274A；(iii)A/G1Q、T3V、K15I、I35A、A68S、V71A、T77N、N/S86H、V87S、L95A、G99S、Q/T115F、M123I、G127T、A/P128P/S、V147L、S155G、G165Q/S、N184Q、A202V、S/T210P、N217S、L234W、N/T239S、A242G、S250G、D/S258P和Q274A；或(iv)T3V、A68S、T77N、N/S86H、G99S、Q/T115F、M123I、G127T、A128P、G165Q、N184Q、A202V、S/T210P、N217S和D/S258P；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是非天然存在的氨基酸；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有85％或更高的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
甚至另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：(i)A/G1Q、T3Q/V、P/S9E、L/Q10M、K15I、K22Y、A24N/Q、V26Q、K27R、G/V28A、A/G29S、I/V30T、I/L31I、I35A、A/S37T、P/S/T40E、N/K43A、S/V45I/Q/R、A48I/T/V、A/S52R、A68S、V71A、N76K、S/T77D/E/H/N/Q/S、T78I、N/S86H/N/R、V87S/T、L95A/F/Q、N96S、S98H/R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S/T102D/T、Y103I、A/G105N、S108H/K、E111Q、T114N、A/Q/S/T115F、G/N117S、D119Q、M123I、L125N、G126Q、G127E/F/Q/S/T/V、A/P/S128P/R/S、S129H/R、G/V130S、Q136N/R、A/S143Q/V、A/I/V146A/S、V147L、A/S151G、S155E/G/N、S158D/N/Q、N/S/Y160C/D/K、A/S/Q/T161D/Q、G165A/E/Q/S、N/Q184E/Q、S187E/P、A/P/S193D/Q、A/S202V、A/G/S203E/N/Q、V204I、S/T210E/H/I/P、N211S、L216Q、N217S、L234I/W、P238Q/R、A/N/T239K/S/T、A242G/N、S243I、S250G、N/Y255R、D/S258D/E/P、S259E/P、F260W、K/N/R264H/Q/S和Q274A；(ii)A1Q、T3Q/V、P9E、L10M、K15I、K22Y、A24N/Q、V26Q、K27R、V28A、A29S、V30T、L31I、I35A、A37T、P40E、N43A、V45I/Q/R、A48I/T/V、A52R、A68S、V71A、N76K、S77D/E/H/N/Q/S、T78I、S86H/N/R、V87S/T、L95A/F/Q、N96S、S98H/R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S102D/T、Y103I、G105N、S108H/K、E111Q、T114N、T115F、G117S、D119Q、M123I、L125N、G126Q、G127E/F/Q/S/T/V、A128P/R/S、S129H/R、G130S、Q136N/R、A143Q/V、V146A/S、V147L、A151G、S155E/G/N、S158D/N/Q、N160C/D/K、T161D/Q、G165A/E/Q/S、N184E/Q、S187E/P、A193D/Q、A202V、G203E/N/Q、V204I、T210E/H/I/P、N211S、L216Q、N217S、L234I/W、P238Q/R、N239K/S/T、A242G/N、S243I、S250G、Y255R、S258D/E/P、S259E/P、F260W、K264H/Q/S和Q274A；(iii)A/G1Q、T3Q/V、P/S9E、L/Q10M、K15I、K22Y、A24N/Q、V26Q、G/V28A、A/G29S、I/V30T、I/L31I、I35A、A/S37T、P/S/T40E、S/V45I/Q/R、A48I/T/V、A/S52R、A68S、V71A、N76K、S/T77D/E/H/N/S、T78I、N/S86H/N/R、V87S/T、L95A/F/Q、N96S、S98R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S/T102D/T、A/G105N、S108H/K、E111Q、T114N、A/Q/S/T115F、G/N117S、D119Q、M123I、L125N、G126Q、G127E/F/Q/S/T/V、A/P/S128P/R/S、S129H/R、G/V130S、Q136N、A/S143Q/V、A/I/V146A/S、V147L、A/S151G、S155E/G/N、S158D/N/Q、N/S/Y160D/K、A/S/Q/T161D/Q、G165A/E/Q/S、N/Q184E/Q、S187E/P、A/P/S193D/Q、A/S202V、A/G/S203E/N/Q、V204I、S/T210I/P、N211S、L216Q、N217S、L234I/W、P238Q/R、A/N/T239K/S/T、A242G/N、S243I、S250G、N/Y255R、D/S258D/P、S259E/P、F260W、K/N/R264H/Q/S和Q274A；(iv)A1Q、T3Q/V、P9E、L10M、K15I、K22Y、A24N/Q、V26Q、V28A、A29S、V30T、L31I、I35A、A37T、P40E、V45I/Q/R、A48I/T/V、A52R、A68S、V71A、N76K、T77D/E/H/N/S、T78I、S86H/N/R、V87S/T、L95A/F/Q、N96S、S98R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S102D/T、G105N、S108H/K、E111Q、T114N、T115F、G117S、D119Q、M123I、L125N、G126Q、G127E/F/Q/S/T/V、A128P/R/S、S129H/R、G130S、Q136N、A143Q/V、V146A/S、V147L、A151G、S155E/G/N、S158D/N/Q、N160D/K、T161D/Q、G165A/E/Q/S、N184E/Q、S187E/P、A193D/Q、A202V、G203E/N/Q、V204I、T210I/P、N211S、L216Q、N217S、L234I/W、P238Q/R、N239K/S/T、A242G/N、S243I、S250G、Y255R、S258D/P、S259E/P、F260W、K264H/Q/S和Q274A；(v)A/G1Q、T3V、P/S9E、L/Q10M、A24Q、V26Q、A/G29S、I/V30T、I/L31I、I35A、A/S37T、P/S/T40E、S/V45I/Q/R、A48T/V、A/S52R、A68S、V71A、S/T77E/N、T78I、N/S86H/R、V87S、L95A/F、N96S、S98R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S/T102D/T、A/G105N、S108H、E111Q、A/Q/S/T115F、G/N117S、D119Q、M123I、G127E/Q/S/T/V、A/P/S128P/R、S129H/R、G/V130S、Q136N、A/S143Q/V、A/I/V146A、V147L、A/S151G、S155G/N、S158D/N/Q、N/S/Y160D/K、A/S/Q/T161D/Q、G165A/E/Q、N184E/Q、S187E/P、A/P/S193Q、A/S202V、A/G/S203E/N/Q、V204I、S/T210I/P、N211S、L216Q、N217S、L234W、P238Q、A/N/T239S、A242G/N、S243I、S250G、D/S258D/P、S259E/P、F260W、K/N/R264H/Q/S和Q274A；(vi)A1Q、T3V、P9E、L10M、A24Q、V26Q、A29S、V30T、L31I、I35A、A37T、P40E、V45I/Q/R、A48T/V、A52R、A68S、V71A、T77E/N、T78I、S86H/R、V87S、L95A/F、N96S、S98R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S102D/T、G105N、S108H、E111Q、T115F、G117S、D119Q、M123I、G127E/Q/S/T/V、A128P/R、S129H/R、G130S、Q136N、A143Q/V、V146A、V147L、A151G、S155G/N、S158D/N/Q、N160D/K、T161D/Q、G165A/E/Q、N184E/Q、S187E/P、A193Q、A202V、G203E/N/Q、V204I、T210I/P、N211S、L216Q、N217S、L234W、P238Q、N239S、A242G/N、S243I、S250G、S258D/P、S259E/P、F260W、K264H/Q/S和Q274A；(vii)T3V、P/S9E、L/Q10M、I35A、A68S、S/T77N、T78I、N/S86H、V87S、G99Q/S、G101A、A/Q/S/T115F、M123I、G127S/T、A/P/S128P/R、G165E/Q、N184Q、S187E、A/S202V、A/G/S203E、S/T210P、N217S、A242G、S250G、D/S258D/P和K/N/R264H；(viii)T3V、P9E、L10M、I35A、A68S、T77N、T78I、S86H、V87S、G99Q/S、G101A、T115F、M123I、G127S/T、A128P/R、G165E/Q、N184Q、S187E、A202V、G203E、T210P、N217S、A242G、S250G、S258D/P和K264H；(ix)T3V、A68S、S/T77N、T78I、M123I、G127S、A/S128P、G165Q、N184Q、A/S202V、S/T210P、N217S和D/S258D/P；或(x)T3V、A68S、T77N、T78I、M123I、G127S、A128P、G165Q、N184Q、A202V、T210P、N217S和S258D/P；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是人为取代；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少85％但小于100％的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含一个或多个选自以下的氨基酸取代组：(i)T77N-G165Q、T77N-N217S、G165Q-N217S、A68S-T77N、N184Q-N217S、A68S-G165Q、G165Q-N184Q、T77N-A128P、T77N-N184Q、A68S-N217S、A128P-N217S、A128P-G165Q、A68S-A128P、A68S-N184Q、A128P-N184Q、T3V-N217S、A202V-N217S、T3V-T77N、T3V-N184Q、N184Q-A202V、G165Q-A202V、M123I-G165Q、T3V-G165Q、T3V-A128P、T3V-A68S、T77N-A202V、M123I-N217S、A68S-A202V、M123I-N184Q、A128P-A202V、T77N-M123I、T3V-A202V、N217S-S258P、A68S-M123I、N184Q-S258P、G165Q-S258P、M123I-A128P、T77N-S258P、T3V-M123I、A128P-S258P、A202V-S258P、A68S-S258P、T3V-S258P、M123I-A202V、M123I-S258P、A68S-G127S、G127S-A128P、T77N-G127S、G127S-A202V、G127S-N184Q、G127S-N217S、G127S-G165Q、T3V-G127S、G127S-S258P、M123I-G127S、T77N-T210P、G165Q-T210P、T210P-N217S、A128P-T210P、A68S-T210P、N184Q-T210P、T210P-S258P、A202V-T210P、M123I-T210P、T3V-T210P、G127S-T210P、G127T-N184Q、G127T-N217S、V87S-G165Q、M123I-Q136R、A68S-G127T、G127T-A128P、T77N-V87S、G127T-G165Q、T77N-G127T、T78I-A202V、A68S-S258D、G165Q-S258D、T77N-S258D、T77N-T78I、T78I-G165Q、N184Q-S258D、N217S-S258D、P9E-M123I、A128P-A242G、A202V-S258D、A68S-T78I、G165Q-A242G、T77N-A242G、T78I-A128P、T78I-G127S、P9E-G165Q、Q136R-G165Q、T78I-N184Q、V87S-A128P、V87S-N217S、A68S-V87S、G127T-A202V、I35A-T77N、T3V-T78I、T78I-N217S、A68S-A242G、A68S-G99S、G99S-A128P、G99S-G165Q、I35A-G165Q、L10M-A202V、T3V-G127T、T77N-G99S、T78I-S258P、V45R-M123I、V87S-M123I、M123I-N239S、P9E-N184Q、S155G-G165Q、T78I-M123I、V45R-Q136R、V87S-A202V、A128P-S258D、I35A-A202V、M123I-G127T、M123I-S258D、N184Q-N239S、P9E-N217S、Q136R-S258E、S86H-S258P、T3V-A242G、T3V-S258D、G99S-N184Q、G99S-N217S、I35A-V87S、N217S-A242G、P9E-Q136R、G127T-S258P、I35A-A128P、I35A-A68S、I35A-N217S、L10M-M123I、P9E-S258P、P9E-T210P、P9E-T77N、S86H-A202V、S86H-G165Q、S86H-N184Q、T77N-S155G、T77N-V147L、T78I-T210P、V87S-S155G、A202V-A242G、A242G-S258P、A68S-G165E、G127S-A242G、G165E-N184Q、G165E-N217S、M123I-S258E、N184Q-A242G、S86H-T115F、T3V-G99S、V147L-G165Q、A128R-G165Q、A128R-S258D、A68S-A128R、A68S-V147L、G127S-S258D、G165E-A202V、G165Q-S258E、G165S-T210P、G203E-T210P、G99S-G127S、G99S-M123I、G99S-T210P、L10M-A128P、L10M-A68S、L10M-N184Q、L10M-N217S、L10M-S258P、L10M-T77N、M123I-A242G、M123I-G165E、M123I-S187P、N239S-S258P、P9E-A128P、P9E-A202V、P9E-A68S、P9E-V45R、Q136R-N184Q、Q136R-N239S、S86H-N217S、T115F-S258P、T210P-A242G、T3V-G165E、T3V-L10M、T3V-P9E、T77N-A128R、T77N-G165E、T78I-A242G、V45R-G165Q、V87T-M123I、V87T-N184Q、V87T-N239S、V87T-Q136R、A68S-G101A、A68S-V71A、G101A-A128P、G101A-G165Q、G101A-S258P、G165A-N184Q、G165E-S258P、G99S-S258P、I35A-M123I、K15I-G165S、K15I-T210P、L10M-G127S、L10M-G165Q、Q136R-S187P、S187E-A202V、S187P-S258P、S250G-S258P、T115F-A202V、T115F-G165Q、T3V-G101A、T3V-I35A、T3V-V87S、T77N-G101A、T77N-G203E、T78I-S258D、V71A-G165Q、V71A-T77N、V87S-S258P、V87S-V147L、A128P-G165E、A128P-S155G、A128P-V147L、A128R-A202V、A128R-N184Q、A128R-N217S、A1Q-S86H、A68S-G99Q、A68S-S155G、G101A-A202V、G101A-G127S、G101A-N184Q、G101A-N217S、G165Q-G203E、G165Q-N239S、G165S-N239S、G99Q-A128P、G99Q-G165Q、G99Q-N184Q、G99Q-N217S、G99S-A242G、I35A-N184Q、I35A-T78I、I35A-V147L、L10M-T210P、L10M-T78I、M123I-G165S、N184Q-G203E、N184Q-S187P、N43A-M123I、P9E-G127S、P9E-S258E、Q136R-S258P、T115F-N217S、T3V-S86H、T77H-M123I、T77H-N184Q、T77H-N239S、T77H-Q136R、T77H-V87T、T77N-G99Q、T77N-S250G、T78I-G99S、T78I-V87S、V146S-G165S、V146S-N239S、V146S-T210P、V45R-S258E、V87S-A242G、V87S-N184Q、A128S-T210P、A143V-A202V、A143V-G165Q、A143V-S258P、A1Q-N184Q、A1Q-S258P、A68S-G203E、A68S-S187E、A68S-T114N、G101A-M123I、G101A-T210P、G165A-N217S、G165Q-S187P、G99Q-A202V、G99S-A202V、I35A-A242G、I35A-S258P、L10M-I35A、L10M-V87S、M123I-A128R、M123I-V146S、N184Q-S187E、N217S-L234W、N239S-S250G、N43A-Q136R、N43A-V45R、P9E-N239S、P9E-V87T、S155G-N217S、S187E-N217S、S86H-A143V、S86H-Q274A、S86H-S250G、T114N-A128P、T114N-G165Q、T114N-N184Q、T114N-N217S、T115F-A143V、T115F-N184Q、T210P-N239S、T210P-S250G、T3V-A128R、T3V-G99Q、T77H-G165Q、T77N-S187E、T77N-T114N、V147L-N217S、V45R-N184Q、V71A-N184Q、V71A-N217S、V71A-T210P、T77N-G165Q-N217S、A68S-T77N-G165Q、T77N-N184Q-N217S、A68S-T77N-N217S、T77N-A128P-G165Q、T77N-A128P-N217S、A68S-T77N-A128P、G165Q-N184Q-N217S、T77N-G165Q-N184Q、A68S-A128P-G165Q、A68S-G165Q-N217S、A128P-N184Q-N217S、A128P-G165Q-N217S、A68S-A128P-N217S、A68S-N184Q-N217S、A68S-T77N-N184Q、T77N-A128P-N184Q、A68S-G165Q-N184Q、A128P-G165Q-N184Q、A68S-A128P-N184Q、T3V-N184Q-N217S、T3V-T77N-N217S、N184Q-A202V-N217S、T3V-T77N-N184Q、T3V-A128P-N217S、T3V-T77N-A128P、G165Q-A202V-N217S、T3V-A128P-N184Q、T77N-A202V-N217S、T3V-G165Q-N217S、T3V-T77N-G165Q、T3V-A68S-N217S、T3V-A68S-T77N、A68S-A202V-N217S、T3V-G165Q-N184Q、A128P-A202V-N217S、G165Q-N184Q-A202V、T77N-G165Q-A202V、T77N-N184Q-A202V、T3V-A128P-G165Q、T3V-A68S-A128P、T3V-A68S-N184Q、A128P-N184Q-A202V、A68S-N184Q-A202V、A68S-T77N-A202V、T3V-A68S-G165Q、T77N-A128P-A202V、A128P-G165Q-A202V、A68S-A128P-A202V、A68S-G165Q-A202V、M123I-G165Q-N217S、M123I-N184Q-N217S、T77N-M123I-G165Q、T77N-M123I-N217S、T3V-A202V-N217S、M123I-G165Q-N184Q、T77N-M123I-N184Q、T3V-N184Q-A202V、A68S-M123I-N217S、T3V-T77N-A202V、T3V-A128P-A202V、T3V-G165Q-A202V、M123I-A128P-N217S、T3V-A68S-A202V、A68S-M123I-N184Q、A68S-T77N-M123I、M123I-A128P-N184Q、T3V-M123I-N217S、T77N-M123I-A128P、A68S-M123I-G165Q、M123I-A128P-G165Q、A68S-M123I-A128P、N184Q-N217S-S258P、T3V-M123I-N184Q、T3V-M123I-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3V-T78I-G127S、T77N-G127T-N184Q、T77N-G127T-N217S、T77N-T78I-S258P、T78I-A128P-A202V、T78I-A128P-N184Q、T78I-A128P-N217S、T78I-A202V-N217S、T78I-G127S-A202V、T78I-G127S-N184Q、T78I-G127S-N217S、T78I-G165Q-S258P、A68S-G127T-A202V、A68S-T77N-G127T、G127T-A128P-G165Q、N184Q-A202V-S258D、T3V-G127T-N184Q、T3V-G127T-N217S、T77N-G127T-A128P、T78I-M123I-A202V、A128P-G165Q-A242G、A128P-G165Q-S258D、A128P-N184Q-S258D、A128P-N217S-S258D、A68S-A128P-S258D、A68S-G127T-G165Q、A68S-T78I-S258P、G127T-A128P-A202V、T3V-A128P-A242G、T3V-A68S-G127T、T3V-A68S-S258D、T3V-G127T-A202V、T3V-G165Q-A242G、T3V-G165Q-S258D、T3V-T77N-A242G、T3V-T77N-S258D、T3V-T78I-N184Q、T3V-T78I-N217S、T3V-T78I-S258P、T77N-A128P-A242G、T77N-A128P-S258D、T77N-G127T-G165Q、T77N-G165Q-A242G、T78I-A128P-S258P、T78I-G127S-S258P、A68S-M123I-S258D、G127T-G165Q-A202V、M123I-G165Q-S258D、T3V-G127T-A128P、T3V-N217S-S258D、T3V-T78I-A202V、T77N-G127T-A202V、T77N-M123I-S258D、T77N-T78I-M123I、T78I-M123I-G165Q、T78I-M123I-N184Q、T78I-N184Q-S258P、A68S-T78I-M123I、A68S-T78I-T210P、G127T-N184Q-S258P、G127T-N217S-S258P、M123I-A202V-S258D、M123I-N217S-S258D、T3V-A202V-S258D、T3V-M123I-S258D、T3V-N184Q-S258D、T3V-T77N-G127T、T3V-T78I-T210P、T77N-T78I-T210P、T78I-A128P-T210P、T78I-A202V-S258P、T78I-G127S-T210P、T78I-G165Q-T210P、T78I-M123I-A128P、T78I-M123I-G127S、T78I-M123I-N217S和T78I-N217S-S258P；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是人为取代；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少85％但小于100％的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含一个或多个选自以下的氨基酸取代组：
M123I-Q136R；P9E-M123I；V45R-M123I；G127T-G165S-T210E；
M123I-G165S-N239S；M123I-Q136R-G165Q；M123I-Q136R-S258E；
M123I-V146S-T210E；P9E-V45R-M123I；Q136R-G165Q-S258E；
V45R-M123I-Q136R；G127T-V146S-G165S-N239S；
L10M-K27R-S98H-M123I；M123I-Q136R-G165Q-S258E；
M123I-V146S-G165S-T210P；M123I-V146S-T210P-S250G；
P9E-M123I-Q136R-G165Q；P9E-Q136R-G165Q-S258E；
P9E-V45R-M123I-Q136R；V45R-M123I-Q136R-G165Q；
V45R-M123I-Q136R-S258E；V45R-Q136R-G165Q-S258E；
K27R-N43A-S98H-M123I-T210H；P9E-M123I-Q136R-G165Q-S258E；
P9E-V45R-M123I-Q136R-G165Q；P9E-V45R-M123I-Q136R-S258E；
V45R-M123I-Q136R-G165Q-S258E；Y103I-G127T-V146S-G165S-N239S；
T77H-V87T-M123I-Q136R-N184Q-N239S；
V26R-V45R-S98R-E111Q-M123I-Q136R；
T77H-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-N239S；
T77S-V87S-M123I-Q136R-G165Q-S187P-S258P；
T77S-V87S-M123I-Q136R-N160C-S187P-S258P；
T77H-V87T-M123I-Q136R-N184Q-S187P-N239S-S258P；
T3Q-K22Y-A24N-V45I-A48I-T77N-N217S-L234I-Y255R；
P9E-T77Q-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-N217S-N239S-S258E；
N43A-V45R-T77H-V87T-M123I-Q136R-G165A-N184Q-S187P-N239S-S258P；
P9E-N43A-V45R-T77S-V87S-M123I-Q136R-G165Q-S187P-N217S-S258P；
P9E-N43A-V45R-T77H-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-S187P-N239S-S258P；
P9E-N43A-V45R-T77Q-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-N217S-N239S-S258E；
P9E-N43A-V45R-T77H-V87T-M123I-Q136R-G165A-N184Q-S187P-N217S-N239S-S258E；T77N-N217S-L234W；T77N-N217S、
T77N-G126Q-G165Q-T210P-N217S-L234W-S258P、
T77N-G127F-G165Q-A202V-T210P-N217S-L234W-S258P；
A1Q-T3V-V28A-I35A-A68S-T77N-S86H-T115F-N217S-N239S-S250G-S258P-Q274A；T77N-M123I-T210P-N239S-S250G-S258P；
V45I-A68S-T77N-M123I-L125N-G165Q-N217S-S258P；
A68S-V71A-T77N-L95A-G165Q-N184Q-T210P-S258P；
M123I-T210P-N217S-S258P；G127F-G165Q-N217S-S258P；
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T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-I35A-T77N-V87S-G127T-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-A242G-S258P；
T3V-T77N-M123I-G127Q-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-T77N-M123I-G127V-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-T77N-M123I-G127E-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127T-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
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T3V-A68S-T77N-M123I-G127T-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；L10M-I35A-T78I-V87S-M123I-A202V-S258D-F260W；
L10M-I35A-T78I-V87S-M123I-A202V-F260W-K264H；
L10M-I35A-T78I-V87S-A202V-S258D；
L10M-I35A-T78I-V87S-S187E-A202V；L10M-T78I-V87S-S187E-A202V；
L10M-I35A-T78I-S187E-A202V；
T3V-L10M-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-I35A-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-V87S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165E-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-L216Q-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-A242G-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P-F260W；
A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-L31I-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
A68S-T77N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；
A68S-T77N-T78I-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；
T3V-A68S-T77N-T78I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；A68S-T77N-T78I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；
A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；
T3V-A68S-T77N-T78I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；
A68S-T77N-T78I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；
T3V-A68S-T77N-S108H-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G99Q-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G99Q-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G127S-A128P-G165E-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-P9E-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-S187E-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-G203E-T210P-N217S-S258P；
T3V-L10M-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-P9E-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-S187E-A202V-N217S-S258P；
T3V-P9E-A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-S187E-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-G203E-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G101A-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-L10M-A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-P9E-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-S187E-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-A202V-G203E-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G101A-M123I-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-L10M-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-L10M-A68S-T77N-G101A-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-P9E-L10M-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-P9E-A68S-T77N-G99Q-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S243I-S258P；
T3V-A68S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-S258P；
T3V-A68S-T77E-M123I-G127T-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77E-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P-K264H；
T3V-A68S-T77N-S102T-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N211S-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N211S-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-S102T-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P-S259P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-T161Q-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-S158Q-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-V45Q-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A193Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-A143Q-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G117S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A48V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A48T-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A29S-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
T3V-A68S-T77N-G127S-A128P-G165Q-N184Q-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G99Q-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-V87S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-A242G-S258P；
T3V-V26Q-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165E-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-P9E-L10M-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165E-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-P9E-L10M-A68S-T77N-G101A-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-M123I-G127S-A128P-N160K-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-A242G-S258P；
T3V-A68S-T77N-V87S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-S258P；
T3V-P40E-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77E-M123I-G127T-A128P-G165E-N184Q-A202V-N217S-P238Q-S258P；
T3V-A68S-T77N-G99S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77E-M123I-G127T-G165E-N184Q-A202V-N217S-S258P；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G101A-S102T-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-G127S-A128P-G165Q-T210P-A242G-S258P-K264H；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-A242G-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127T-G165E-N184Q-A202V-N217S-P238Q-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-G127S-A128P-G165Q-T210P-A242G-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-A242G-S258D；I35A-M123I-G127T-T210P-S243I；
T3V-A68S-T77N-G99S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P-F260W；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-G101A-G127S-A128P-G165Q-T210P-A242G-S258P；A68S-T77N-G99Q-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S-S258D；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-G101A-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-A242G-S258P；和V45R-S98R；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是人为取代；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少85％但小于100％的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例提供了包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含一个或多个选自以下的氨基酸取代组：
M123I-Q136R；P9E-M123I；V45R-M123I；G127T-G165S-T210E；
M123I-G165S-N239S；M123I-Q136R-G165Q；M123I-Q136R-S258E；
M123I-V146S-T210E；P9E-V45R-M123I；Q136R-G165Q-S258E；
V45R-M123I-Q136R；G127T-V146S-G165S-N239S；
L10M-K27R-S98H-M123I；M123I-Q136R-G165Q-S258E；
M123I-V146S-G165S-T210P；M123I-V146S-T210P-S250G；
P9E-M123I-Q136R-G165Q；P9E-Q136R-G165Q-S258E；
P9E-V45R-M123I-Q136R；V45R-M123I-Q136R-G165Q；
V45R-M123I-Q136R-S258E；V45R-Q136R-G165Q-S258E；
K27R-N43A-S98H-M123I-T210H；P9E-M123I-Q136R-G165Q-S258E；
P9E-V45R-M123I-Q136R-G165Q；P9E-V45R-M123I-Q136R-S258E；
V45R-M123I-Q136R-G165Q-S258E；Y103I-G127T-V146S-G165S-N239S；
T77H-V87T-M123I-Q136R-N184Q-N239S；
V26R-V45R-S98R-E111Q-M123I-Q136R；
T77H-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-N239S；
T77S-V87S-M123I-Q136R-G165Q-S187P-S258P；
T77S-V87S-M123I-Q136R-N160C-S187P-S258P；
T77H-V87T-M123I-Q136R-N184Q-S187P-N239S-S258P；
T3Q-K22Y-A24N-V45I-A48I-T77N-N217S-L234I-Y255R；
P9E-T77Q-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-N217S-N239S-S258E；
N43A-V45R-T77H-V87T-M123I-Q136R-G165A-N184Q-S187P-N239S-S258P；
P9E-N43A-V45R-T77S-V87S-M123I-Q136R-G165Q-S187P-N217S-S258P；
P9E-N43A-V45R-T77H-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-S187P-N239S-S258P；
P9E-N43A-V45R-T77Q-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-N217S-N239S-S258E；
P9E-N43A-V45R-T77H-V87T-M123I-Q136R-G165A-N184Q-S187P-N217S-N239S-S258E；T77N-N217S-L234W；T77N-N217S、
T77N-G126Q-G165Q-T210P-N217S-L234W-S258P、
T77N-G127F-G165Q-A202V-T210P-N217S-L234W-S258P；
A1Q-T3V-V28A-I35A-A68S-T77N-S86H-T115F-N217S-N239S-S250G-S258P-Q274A；T77N-M123I-T210P-N239S-S250G-S258P；
V45I-A68S-T77N-M123I-L125N-G165Q-N217S-S258P；
A68S-V71A-T77N-L95A-G165Q-N184Q-T210P-S258P；
M123I-T210P-N217S-S258P；G127F-G165Q-N217S-S258P；
T77N-G165Q-N217S-S258P；T77S-G165A-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S；V71A-T77S-N184Q-S258P；
T77N-M123I-G165Q-N184Q-N217S；V71A-L95A-A128S-T210P；
V71A-M123I-A128S-T210P；V71A-M123I-A128S-G165E；
T77S-A128P-N184Q-N217S-F260W；T77H-A128S-G165Q-T210P；
T77D-S86R-S155E-G165A-N184Q；
A68S-V71A-T77N-A128S-G165Q-T210P-N217S；
V28A-I35A-A68S-T77N-A128S-G165Q-N184Q-G203N-T210P；
A128P-T210P；T210P-S258P；A128P-T210P-S259P；A128P-S187P-T210P；
A128P-S187P-T210P-S258P；P9E-T77S-V87T-T210P-N239K；
K15I-L95Q-M123I-G165S-T210P-N217S；
K15I-M123I-V146S-G165S-T210P-N239S；
K15I-N76K-M123I-V146S-G165S-T210P-N239S；
K15I-V146S-G165S-T210P-N239S；
P009E-V146S-N184Q-G203E-T210P-P238R-N239S；
M123I-G165S-N217S；K15I-L95Q-S108K-G165S-G203E-T210P-N217S；
K15I-L95Q-S108K-G165S-G203E-T210P；
P9E-K15I-G165S-A193D-G203E-T210P；T77N-M123I-G165Q-N217S；
T77H-G165Q；T77N-G165Q-N217S；A68S-V71A-T77N-G165Q-N217S；
T77N-V87S-M123I-S155G-G165Q-N217S；T77H-V87S-S155G-G165Q；
T77N-V87S-S155G-G165Q-N217S；T77N-M123I-G165Q；T77N-G165Q；
A68S-V71A-T77N-G165Q；T77N-V87S-M123I-S155G-G165Q；
I35A-A68S-T77N-V87S-V147L-G165Q；
A68S-T77N-V87S-V147L-S155E-G165Q；
T77N-V87S-M123I-V147L-S155G-G165Q；
A68S-T77N-M123I-G165Q-N184Q-N217S；
T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-V71A-T77N-S100N-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S-N239T；
T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-A128P-G165Q-N184Q-N217S；A68S-T77N-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-A128P-N184Q-N217S；A68S-T77N-A128P-G165Q-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q；M123I-G165Q-N184Q-N217S；
T77N-G165Q-N184Q-N217S；T77N-M123I-N184Q-N217S；
T77N-M123I-G165Q-N184Q；
T3V-A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-T77N-M123I-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-S108H-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-G99S-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-T114N-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-G99S-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-G99S-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-G99S-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-T114N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-T114N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-T114N-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-M123I-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-G99S-M123I-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-M123I-G127T-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
T3V-A68S-T77N-G99S-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-A68S-T77N-T114N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
S86H-T115F-A143V-G165Q-A202V-S258P；
S86H-L95A-N184Q-A202V-T210P-N217S-L234W-S250G-S258P；
V30T-I35A-T77N-G165Q-A202V-T210P-S250G-S258P；
A1Q-T3V-I35A-T77N-T78I-S86H-T115F-G165Q-N184Q-N217S-L234W-S258P；
A1Q-A37T-T77N-T78I-S86H-M123I-G165Q-N184Q-A202V-N239S-S250G-S258P-Q274A；P9E-T77N-N96S-G165Q-G203E-S250G；
P9E-T77N-N96S-G165E-G203E-T210P-S250G；
A1Q-T3V-S86H-G130S-S155G-G165Q-N184Q-A202V-G203N-T210P-Q274A；A1Q-T3V-S86H-G165Q-N184Q-N239S-S250G-S258P；
A1Q-T77N-S86H-V147L-A151G-N184Q-N217S-S258P；
S86H-T115F-S155G-G165Q-N184Q-A202V-Q274A；
A68S-S86H-T115F-N184Q-A202V-G203N-N239S-S250G-S258P-Q274A；
A68S-T77N-V87S-A128P-S155G-G165Q-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q；A68S-T77N-V87S-A128P-S155G-G165Q；
I35A-A68S-T77N-V87S-A128P-V147L-G165Q-N217S；
A68S-T77N-V87S-A128P-S155G-G165Q-N217S-A242G；
A68S-T77N-V87S-A128P-V147L-S155E-G165Q；
A68S-T77N-V87S-A128P-S155E-G165Q-N217S；
A68S-T77N-S86N-V87S-A128P-S155G-G165Q-N217S-A242G；
I35A-A68S-T77N-A128P-V147L-G165Q-N217S；
I35A-A68S-T77N-A128P-S155G-G165Q-A242G；
I35A-A68S-T77N-A128P-V147L-G165Q-A242G；
A68S-T77N-V87S-A128P-S155G-G165Q-A242G；
A068S-T077N-N086S-G165Q-K194E-S211N-N217S；
A068S-T077N-N086S-V087S-S155G-G165Q-K194E-S211N-N217S；
A068S-T077N-N086S-G165Q-K194E-S211N；
A068S-T077N-N086S-V087S-S155G-G165Q-K194E-S211N；
I035A-A068S-T077N-N086S-V087S-V147L-G165Q-K194E-S211N-N217S；
A068S-T077N-N086S-V087S-S155G-G165Q-K194E-S211N-N217S-A242G；A068S-T077N-N086S-V087S-V147L-S155E-G165Q-K194E-S211N；
A068S-T077N-N086S-V087S-S155E-G165Q-K194E-S211N-N217S；
A068S-T077N-V087S-S155G-G165Q-K194E-S211N-N217S-A242G；
I035A-A068S-T077N-N086S-V147L-G165Q-K194E-S211N-N217S；
I035A-A068S-T077N-N086S-S155G-G165Q-K194E-S211N-A242G；
0I35A-A068S-T077N-N086S-V147L-G165Q-K194E-S211N-A242G；和
A068S-T077N-N086S-V087S-S155G-G165Q-K194E-S211N-A242G；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是非天然存在的氨基酸；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有85％或更高的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:2的氨基酸序列相对应来编号。
又甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含选自如下的一个或多个氨基酸取代组：A68S-T77N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
A68S-T77N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S-S258P；
A68S-T77N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-G203Q-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-G203Q-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-G203Q-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-G203Q-N217S-S258P；
S86H-T115F-G127T-A143V-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-S86H-T115F-M123I-A143V-G165Q-A202V-N217S-S258P；
A68S-T77N-A128P-S129H-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-S129H-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
S86H-T115F-S129H-A143V-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-S86H-T115F-M123I-S129H-A143V-G165Q-A202V-N217S-S258P；
A68S-T77N-A128P-S155N-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-S155N-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
I35A-A68S-T77N-V87S-A128P-V147L-G165Q-A202V-N217S；
T3V-I35A-A68S-T77N-V87S-M123I-A128P-V147L-G165Q-A202V-N217S；A68S-T77N-A128P-Q136N-S155N-G165Q-N184Q-N217S-A242N；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-Q136N-S155N-G165Q-N184Q-N217S-A242N；A68S-V71A-T77N-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
T3V-A68S-V71A-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-S187P-A202V-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-S187P-A202V-N217S；
A68S-T77N-A128R-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128R-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D；
A68S-T77N-A128P-S129R-G165Q-N184Q-N217S-S258D；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-S129R-G165Q-N184Q-N217S-S258D；
A68S-T77N-A128R-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D-K264H；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128R-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258D-K264H；A68S-T77N-A128R-G165Q-N184Q-G203E-S258D；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128R-G165Q-N184Q-G203E-S258D；
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T3V-A52R-A68S-T77N-M123I-A128R-G165Q-N184E-A202V-N217S-S258D；
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T3V-A68S-T77E-M123I-G127T-A128P-G165E-N184Q-A202V-N217S-P238Q-S258P；
T3V-A68S-T77N-G99S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77E-M123I-G127T-G165E-N184Q-A202V-N217S-S258P；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-G101A-S102T-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-G127S-A128P-G165Q-T210P-A242G-S258P-K264H；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-A242G-S258P；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127T-G165E-N184Q-A202V-N217S-P238Q-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-G127S-A128P-G165Q-T210P-A242G-S258P；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-A242G-S258D；I35A-M123I-G127T-T210P-S243I；
T3V-A68S-T77N-G99S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P-F260W；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-G101A-G127S-A128P-G165Q-T210P-A242G-S258P；A68S-T77N-G99Q-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S-S258D；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-G101A-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-A242G-S258P；和V45R-S98R；条件是所述两个、三个或四个或更多个取代中的一个或多个是人为取代；其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少85％但小于100％的氨基酸序列同一性；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
在另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含选自以下的一个或多个取代：3T、4I、9R、15T、67A、75D、86S、97S、98A/D/G、100G/M/R、102A、103N/Y、105A、117R/V、119D/N、122S、127L、128Q、129A、159D、166A、169S、193P、194E、198M、216D、217D、221S、231V、234L、235H、244R、251K和273A，和/或选自以下的一个或多个***：***位置36的D、***位置96的E、和***位置98和99之间的D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
在一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来自如下亲本，该亲本与包含基序A、基序B或其组合的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来自如下亲本，该亲本与包含基序A、基序B或其组合的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在又仍另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来自如下亲本，该亲本与包含基序A和基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在甚至另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来自如下亲本，该亲本与包含基序A和基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。枯草杆菌蛋白酶的AprL-进化枝在2016年5月13日提交的国际专利申请号PCT/US16/32514中更充分地描述。在一些实施例中，该AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶选自图1中列出的酶中的一种。在另一个实施例中，该AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:2、9、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205的氨基酸序列。在仍另外的实施例中，该AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:2、9、189、198、202、203或205的氨基酸序列。在仍另外的实施例中，该AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列。
在一个实施例中，该AprL-进化枝酶包含基序A、基序B或其组合。在其他实施例中，该AprL-进化枝酶包含基序A和基序B。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含基序A、基序B或其组合。在仍其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含基序A和基序B。在另一个实施例中，基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4。在仍另外的实施例中，基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14。在仍其他实施例中，该AprL-进化枝酶包含Asp32和His63之间的基序1，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。在甚至仍又其他实施例中，该AprL-进化枝酶包含Lys236和Arg246之间的基序6或基序7，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。在又仍另外的实施例中，该AprL-进化枝酶包含(i)Asp32和His63之间的基序1，和(ii)Lys236和Arg246之间的基序6或基序7，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。在仍甚至其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含Asp32和His63之间的基序1，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。在又仍甚至另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含Lys236和Arg246之间的基序6或基序7，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含(i)Asp32和His63之间的基序1，和(ii)Lys236和Arg246之间的基序6或基序7，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
在一些实施例中，该AprL-进化枝酶包含YNT(SEQ ID NO:166)基序(“基序1”)。在其他实施例中，该AprL-进化枝酶包含Y56N57T58(SEQ ID NO:167)基序，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序2”)。在进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含FVX1GEX2X3YNT(SEQ ID NO:168)基序，其中X1是A或S，X2不存在或是任何氨基酸，并且X3是A或S(“基序3”)。在仍然进一步的实施例中，AprL-进化枝酶包含F50V51X152G53E54X355Y56N57T58(SEQ ID NO:169)基序，其中X1是A或S且X3是A或S；并且进一步地其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序4”)。在一些实施例中，该AprL-进化枝酶包含在残基52-60之间的环区域，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
在其他实施例中，该AprL-进化枝酶包含LSX4S(SEQ ID NO:170)基序，其中X4是A或G(“基序5”)。在仍其他实施例中，该AprL-进化枝酶包含LSAS(SEQ ID NO:171)基序(“基序6”)。在另一个实施例中，该AprL-进化枝酶包含LSGS(SEQ ID NO:172)基序(“基序7”)。在一些实施例中，该AprL-进化枝酶包含L240S241A242S243(SEQ ID NO:173)基序，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序8”)。在进一步的实施例中，该AprL-进化枝酶包含L240S241G242S243(SEQ ID NO:174)基序，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序9”)。在仍另外的实施例中，该AprL-进化枝酶包含KXXXLSX4SQX5R(SEQ ID NO:175)基序，其中X是任何氨基酸，X4是A或G，并且X5是I或V(“基序10”)。在仍然进一步的实施例中，该AprL-进化枝酶包含KXXXLSASQX5R(SEQID NO:176)基序，其中X是任何氨基酸并且X5是I或V(“基序11”)。在甚至仍然进一步的实施例中，该AprL-进化枝酶包含KXXXLSGSQX5R(SEQ ID NO:177)基序，其中X是任何氨基酸并且X5是I或V(“基序12”)。在仍另外的实施例中，该AprL-进化枝酶包含K236XXXLSASQX5R246(SEQ ID NO:178)基序，其中X是任何氨基酸并且X5是I或V；并且进一步地其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序13”)。在甚至仍然进一步的实施例中，该AprL-进化枝酶包含K236XXXLSGSQX5R246(SEQ ID NO:179)基序，其中X是任何氨基酸并且X5是I或V；并且进一步地其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序14”)。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含YNT(SEQ IDNO:166)基序(“基序1”)。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含Y56N57T58(SEQ ID NO:167)基序，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序2”)。在进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含FVX1GEX2X3YNT(SEQ ID NO:168)基序，其中X1是A或S，X2是不存在的或是任何氨基酸，并且X3是A或S(“基序3”)。在仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含F50V51X152G53E54X355Y56N57T58(SEQ ID NO:169)基序，其中X1是A或S并且X3是A或S；并且进一步地其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序4”)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含在残基52-60之间的环区域，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含LSX4S(SEQ IDNO:170)基序，其中X4是A或G(“基序5”)。在仍其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含LSAS(SEQ ID NO:171)基序(“基序6”)。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含LSGS(SEQ ID NO:172)基序(“基序7”)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含L240S241A242S243(SEQ ID NO:173)基序，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序8”)。在进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含L240S241G242S243(SEQ ID NO:174)基序，其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序9”)。在仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含KXXXLSX4SQX5R(SEQ ID NO:175)基序，其中X是任何氨基酸，X4是A或G，并且X5是I或V(“基序10”)。在仍然进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含KXXXLSASQX5R(SEQ ID NO:176)基序，其中X是任何氨基酸并且X5是I或V(“基序11”)。在甚至仍然进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含KXXXLSGSQX5R(SEQ ID NO:177)基序，其中X是任何氨基酸并且X5是I或V(“基序12”)。在仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含K236XXXLSASQX5R246(SEQ ID NO:178)基序，其中X是任何氨基酸并且X5是I或V；并且进一步地其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序13”)。在甚至仍然进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含K236XXXLSGSQX5R246(SEQ ID NO:179)基序，其中X是任何氨基酸并且X5是I或V；并且进一步地其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号(“基序14”)。
在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含相对于SEQID NO:2的本文所述的两个、三个或四个或更多个变异，条件是(i)所述相对于SEQ ID NO:2的变异不是***或缺失；(ii)当所述变体的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:2在位置37、187、193和258的一个或多个处包含变异时，该变异不是脯氨酸；(iii)当所述变体的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:2在位置26、38、234和250中的两个或多个处包含变异时，所述变异不是26R、38S、234R或250E/N；和/或(iv)当所述变体的氨基酸序列在位置128处包含变异时，相对于SEQ ID NO:2的所述变异不是在位置130或193处；其中该变体的氨基酸位置通过与SEQID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在本文所述的相对于SEQ ID NO:2的位置处包含两个、三个或四个或更多个变异，条件是(i)在相对于SEQID NO:2的位置处的所述变异不是***或缺失；(ii)当所述变体的氨基酸序列在选自位置37、187、193和258的一个或多个对应的SEQ ID NO:2位置处包含变异时，该变异不是脯氨酸；(iii)当所述变体的氨基酸序列在选自位置26、38、234和250的两个或更多个对应的SEQID NO:2位置处包含变异时，所述变异不是26R、38S、234R、或250E/N；(iv)当所述变体的氨基酸序列在位置128处包含变异时，在对应于SEQ ID NO:2的位置处的所述变异不是在位置130或193处；和/或(v)所述变体不是由WO 2016074925中的SEQ ID NO:5或JP 201300714中的SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列组成的。
在仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含本文所述的两个、三个或四个或更多个取代，条件是(i)当所述变体的氨基酸序列在位置37、187、193和258中的一个或多个处包含取代时，所述取代不是脯氨酸；(ii)当所述变体的氨基酸序列在位置26、38、234和250中的两个或更多个处包含取代时，所述取代不是26R、38S、234R或250E/N；和/或(iii)当所述变体的氨基酸序列在位置128处包含取代时，所述取代不是在位置130或193处；其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含本文所述的两个、三个或四个或更多个取代，条件是(i)当所述变体的氨基酸序列在位置37、187、193和258中的一个或多个处包含取代时，所述取代不是脯氨酸；(ii)当所述变体的氨基酸序列在位置26、38、234和250中的两个或更多个处包含取代时，所述取代不是26R、38S、234R或250E/N；(iii)当所述变体的氨基酸序列在位置128处包含取代时，所述取代不是在位置130或193处；和/或(iv)所述变体不是由WO 2016074925中的SEQ ID NO:5或JP 201300714中的SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列组成的。
在一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与图1中鉴定的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的氨基酸序列同一性。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与(i)图1中鉴别的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列，或(ii)SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的氨基酸序列同一性。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与图1中鉴别的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列具有至少89％但小于100％的氨基酸序列同一性。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列具有至少89％但小于100％的氨基酸序列同一性。在进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与图1中鉴别的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列具有至少90％但小于100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列具有至少90％但小于100％的氨基酸序列同一性。在仍其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与图1中鉴别的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的氨基酸序列同一性。在又仍其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的氨基酸序列同一性。在甚至仍又其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体是分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的枯草杆菌蛋白酶，该酶具有枯草杆菌蛋白酶活性或酪蛋白水解活性(例如，二甲基酪蛋白水解活性)。
在一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有酶活性(例如，蛋白酶活性)并且因此可用于清洁应用中，该清洁应用包括但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬表面)的方法。以下描述了包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的示例性清洁组合物。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的酶活性(例如，蛋白酶活性)可以容易地使用本领域普通技术人员熟知的程序来确定。下面提供的实例描述用于评价酶活性和清洁性能的方法。可以容易地使用本领域中熟知的程序和/或通过使用在实例中列出的程序来确定本发明的多肽酶在除去污渍(例如，蛋白质污渍例如血液/奶/墨汁、色素/奶/墨汁或蛋黄)、清洁硬表面或清洁衣物、餐具或一种或多种桌面器具物品方面的性能。
在一些实施例中，当与参比枯草杆菌蛋白酶相比时，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有一种或多种改善的性质，其中改善的性质选自改善的蛋白酶活性、改善的洗涤剂清洁性能、改善的洗涤剂热稳定性、和改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物。在其他实施例中，当与参比枯草杆菌蛋白酶相比时，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有一种或多种改善的性质，其中改善的性质选自改善的蛋白酶活性、改善的洗涤剂清洁性能、改善的洗涤剂热稳定性和改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物，其中参比枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:2、9或63的氨基酸序列。在仍其他实施例中，与参比枯草杆菌蛋白酶相比，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有一种或多种改善的性质，其中改善的性质选自改善的蛋白酶活性、改善的洗涤剂清洁性能、改善的洗涤剂热稳定性和改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物，其中参比枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列。在一个实施例中，与参比枯草杆菌蛋白酶相比，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在更长的洗涤期内更稳定。在另一个实施例中，与参比枯草杆菌蛋白酶相比，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在短的冷水洗涤周期或长的热水洗涤周期中更稳定。在仍还另外的实施例中，所述一种或多种改善的性质是(i)改善的蛋白酶活性，其中所述变体针对N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI>1；(ii)改善的洗涤剂清洁性能，其中所述变体具有BMI、POM、蛋和/或蛋黄清洁PI>1；(iii)改善的洗涤剂热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI>1；和/或(iv)改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中所述变体具有熟化衣物清洁PI>1；其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物。在又另外的实施例中，该一种或多种改善的性质是(i)改善的蛋白酶活性，其中所述变体针对N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI>1；(ii)改善的洗涤剂清洁性能，其中所述变体具有BMI、POM、蛋和/或蛋黄清洁PI>1；(iii)改善的洗涤剂热稳定性，其中在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或更高的应激温度下15-20分钟后，所述变体具有稳定性PI>1或剩余活性％≥5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多；和/或(iv)改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中所述变体具有(a)熟化衣物清洁PI>1，(b)在55℃下24小时后，剩余清洁活性>10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多，和/或(c)在37℃下3天或3周后剩余清洁活性>10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多；其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物。在甚至另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的蛋白酶活性，其中所述变体对N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI>1。在甚至仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂清洁性能，其中所述变体具有BMI、POM和/或蛋黄清洁PI>1，其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI>1，其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物。在仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂热稳定性，其中在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或更高的应激温度下15-20分钟后，所述变体具有稳定性PI>1或剩余活性％≥5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多，其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中所述变体具有(a)熟化衣物清洁PI>1，(b)在55℃下24小时后，剩余清洁活性>10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多，和/或(c)在37℃下3天或3周后剩余清洁活性>10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多，其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中所述变体具有熟化衣物清洁PI>1，其中该洗涤剂任选地是不含硼的组合物。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的蛋白酶活性，其中所述变体对N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI>1，并且所述PI根据实例1的蛋白酶活性测定进行测量。在另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂清洁性能，其中所述变体具有BMI、POM、蛋和/或蛋黄清洁PI>1并且所述PI是根据实例1的衣物(HDL和HDD)和ADW洗涤剂测定中的清洁性能测量的。在甚至另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI>1并且所述PI是根据实例1的稳定性测定的通用样品设置测量的。在又甚至另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂热稳定性，其中所述变体在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或更高的应激温度下15-20分钟之后具有剩余活性％≥5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多并且所述剩余活性根据实例1的稳定性测定的通用样品设置测量。在仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中所述变体具有熟化衣物清洁PI>1并且所述PI根据实例1中的熟化衣物清洁测定测量。在甚至仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中所述变体在55℃下24小时后具有剩余清洁活性>10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多，并且/或在37℃下3天或3周后具有剩余清洁活性>10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多；并且所述剩余清洁活性根据实例1的熟化衣物清洁测定测量。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在清洁组合物中表现出清洁性能。清洁组合物通常包括对酶的稳定性和性能有害的成分，这些成分使清洁组合物成为酶例如丝氨酸蛋白酶保留功能的恶劣环境。因此，将酶置于清洁组合物中并且期望发挥酶功能(例如丝氨酸蛋白酶活性，例如通过清洁性能表现的)是重要的。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物中表现出清洁性能。在一些实施例中，ADW洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁蛋黄污渍。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在衣物洗涤剂组合物中表现出清洁性能。在一些实施例中，在衣物洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁血液/奶/墨汁、蛋、蛋黄和\或POM污渍。在每种清洁组合物中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在具有或不具有漂白组分情况下表现出清洁性能。在甚至仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种ADW或衣物洗涤剂组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体在一种或多种辅助材料和/或一种或多种另外的酶的存在下是稳定的并且/或进一步地其中所述变体对自体溶解是稳定的。
可以使本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体经历多种改变，例如一个或多个氨基酸***、缺失和/或取代(保守或非保守的)，包括此类改变基本上不改变该变体的酶活性的情况。类似地，本发明的核酸也可以经历多种变化，例如在一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸的一个或多个取代，这样使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，导致沉默变异(例如，当编码的氨基酸不被核苷酸突变改变时)或非沉默变异、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或***、和/或序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个截短的切割。与由原始核酸序列编码的多肽酶相比，核酸序列中的许多这样的变化基本上可能不会改变所得的编码的多肽酶的酶活性。还可以对本文描述的核酸序列进行修饰以便包括一个或多个密码子，这个或这些密码子在表达***(例如，细菌表达***)中提供了最佳表达，同时，若希望，所述一个或多个密码子仍编码一个或多个相同的氨基酸。
本文描述的是一种或多种分离的、非天然存在的或重组的多核苷酸，其包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或其重组多肽或活性片段的核酸序列。本文所述的一种或多种核酸序列可用于本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的重组生产(例如表达)中，典型地通过表达包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或其片段的序列的质粒表达载体。一个实施例提供了编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述变体是具有蛋白水解活性的成熟形式。在一些实施例中，用同源前肽序列重组表达本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在其他实施例中，用异源前肽序列(例如，GG36前肽序列)重组表达本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。
本文所述的一种或多种核酸序列可以通过使用任何合适的合成、操作和/或分离技术或其组合来产生。例如，本文所述的一种或多种多核苷酸可以使用本领域技术人员熟知的标准核酸合成技术、例如固相合成技术来生产。在此类技术中，典型地合成高至50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(例如通过酶或化学连接方法)以基本上形成任何希望的连续核酸序列。还可以通过本领域已知的任何合适的方法来促进本文所述的一种或多种多核苷酸的合成，包括但不限于使用以下方法的化学合成：经典的亚磷酰胺方法(参见例如Beaucage等人，Tetrahedron Letters[四面体快报]22:1859-69(1981))，或Matthes等人描述的方法，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:801-805(1984)，如典型地在自动合成方法中所实践的。本文所述的一种或多种多核苷酸也可以通过使用自动DNA合成仪产生。可以从多种商业来源订购定制的核酸(例如，米德兰认证试剂公司(The Midland CertifiedReagent Company)、大美国基因公司(Great American Gene Company)、操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)和DNA 2.0)。用于合成核酸的其他技术和相关原理例如由Itakura等人,Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]53:323(1984)和Itakura等人,Science[科学]198:1056(1984)描述。
用于修饰核酸的重组DNA技术是本领域熟知的，例如像限制性内切酶消化、连接、逆转录和cDNA产生、以及聚合酶链式反应(例如PCR)。本文所述的一种或多种多核苷酸还可以通过使用一个或多个寡核苷酸探针来筛选cDNA文库而获得，所述一个或多个寡核苷酸探针可以与编码本文所述的一种或多种AprL进化枝变体或其重组多肽或活性片段的多核苷酸杂交或对其进行PCR扩增。用于筛选和分离cDNA克隆和PCR扩增程序的方法是本领域技术人员熟知的并且描述于本领域技术人员已知的标准参考文献中。本文所述的一种或多种多核苷酸可以通过例如已知的诱变程序(例如，定点诱变、位点饱和诱变和体外重组)改变天然存在的多核苷酸主链(例如，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参比枯草杆菌蛋白酶的多核苷酸主链)来获得。适合于产生编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经修饰的本文所述的多核苷酸的多种方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、***诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化、以及各种其他重组方法。
另一个实施例涉及一种或多种载体，其包含一种或多种本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体(例如，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸)；表达载体或表达盒，该表达载体或表达盒包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸序列；分离的、基本上纯的、或重组的DNA构建体，该构建体包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸序列；分离的或重组的细胞，该细胞包含本文所述的一种或多种多核苷酸序列；以及组合物，该组合物包含一种或多种这样的载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或其任何组合或混合物。
一些实施例涉及一种或多种重组细胞，该重组细胞包含本文所述的一种或多种载体(例如表达载体或DNA构建体)，该载体包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸序列。使用这样的至少一种载体转化或转染一些这样的重组细胞，尽管其他方法在本领域中是可获得且已知的。这样的细胞典型地称为宿主细胞。一些这样的细胞包含细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。其他实施例是涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种载体是表达载体或表达盒，其包含有效地连接到有效的基因表达所需的一种或多种另外的核酸区段上(例如，有效地连接到本文所述的一种或多种多核苷酸序列的启动子)的本文所述的一种或多种多核苷酸序列。载体可以包括转录终止子和/或选择基因，例如能够通过在含有抗微生物剂的培养基中生长来实现质粒感染的宿主细胞的连续培养维持的抗生素抗性基因。
表达载体可以衍生自质粒或病毒DNA，或在可替代实施例中，含有两者的元件。示例性载体包括但不限于pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting[编辑]，第3章，Molecular Biological Methods for Bacillus[针对芽孢杆菌的分子生物学方法]，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)(1990))；枯草芽孢杆菌的适合的复制质粒包括第92页列出的那些)。(还参见，Perego，Integrational Vectors for Genetic Manipulations inBacillus subtilis[在枯草芽孢杆菌中用于遗传操作的整合载体]，Sonenshein等人[编辑]；Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,Physiology and Molecular Genetics[枯草芽孢杆菌和其他***：生物化学、生理学和分子遗传学]，American Society for Microbiology[美国微生物学会]，华盛顿(1993)，第615-624页；和p2JM103BBI)。
为了在细胞中表达和生产目的蛋白(例如，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体)，包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的一种或多种拷贝(并且在一些情况下包含多个拷贝)的一种或多种表达载体在适合于变体表达的条件下被转化到细胞中。在一些实施例中，将编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列(以及包含在载体中的其他序列)整合到宿主细胞的基因组中；然而在其他实施例中，包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外元件。一些实施例提供了染色体外核酸元件以及整合到宿主细胞基因组中的输入性核苷酸序列。本文描述的载体可用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体存在于能够将编码变体的多核苷酸整合到宿主染色体中并且任选地在宿主染色体中扩增的整合载体上。整合位点的实例是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的转录通过如下启动子来实现，该启动子是亲本枯草杆菌蛋白酶的野生型启动子。在一些其他实施例中，启动子与本文所述的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶是异源的，但是在宿主细胞中发挥功能。用于细菌宿主细胞的示例性的启动子的实例包括但不限于amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子；嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA的启动子、和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子，以及噬菌体λPR或PL启动子以及大肠杆菌lac、trp或tac启动子。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在***中产生。在一些实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌属物种(Bacillusspp.)、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)、埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、木霉属物种(Trichoderma spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)和毕赤酵母属物种(Pichia spp.)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体由芽孢杆菌属宿主细胞产生。可用于本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的生产的芽孢杆菌属宿主细胞的实例包括但不限于：地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞被用于产生本文所述的变体。USPN 5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了可以用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的各种芽孢杆菌属宿主菌株，但是可以使用其他合适的菌株。
可以用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的几种细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌属菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸已经被引入宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，特别是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110、和PEP211菌株(参见例如Hoch等人，Genetics[遗传学]73:215-228(1973)；还参见US 4,450,235；US 4,302,544；以及EP 0134048)。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如，Palva等人，Gene[基因]19:81-87(1982)；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，165:796-804(1986)；和Wang等人，Gene[基因]69:39-47(1988))。
在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞是包含以下基因中的至少一个中的突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。在一些实施例中，突变是在degU基因中，并且在一些实施例中，突变为degU(Hy)32(参见例如，Msadek等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]172:824-834(1990)；以及Olmos等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]253:562-567(1997))。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主在scoC4(参见例如Caldwell等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]183:7329-7340(2001))；spoIIE(参见例如Arigoni等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]31:1407-1415(1999))；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如，Perego等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]5:173-185(1991))中包含突变或缺失。实际上，预期引起与oppA基因中的突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于本文所述的经改变的芽孢杆菌属菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独发生，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可以用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经改变的芽孢杆菌属宿主细胞菌株是已经包含上述基因中的一个或多个中的突变的芽孢杆菌属宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的一个或多个突变和/或缺失的芽孢杆菌属宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如，US2005/0202535)。
使用本领域已知的任何合适的方法用编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种核酸序列转化宿主细胞。利用质粒DNA构建体或载体将核酸(例如DNA)引入芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌细胞并且将这样的质粒DNA构建体或载体转化到这样的细胞中的方法是熟知的。在一些实施例中，质粒随后从大肠杆菌细胞中分离并且转化到芽孢杆菌属细胞中。然而，没有必要使用介入微生物例如大肠杆菌，并且在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌属宿主中。
将本文所述的一种或多种核酸序列引入芽孢杆菌属细胞的示例性方法描述于，例如，Ferrari等人，“Genetics[遗传学]”，在Hardwood等人(编辑)，Bacillus[芽孢杆菌属]，Plenum Publishing Corp.[普莱南出版公司](1989)，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，157:718-726(1984)；Hoch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，93:1925-1937(1967)；Mann等人，Current Microbiol.[现代微生物学]，13:131-135(1986)；Holubova，Folia Microbiol.[福里亚微生物学]，30:97(1985)；Chang等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]，168:11-115(1979)；Vorobjeva等人，FEMSMicrobiol.Lett.[FEMS微生物学快报]，7:261-263(1980)；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.[应用与环境微生物学]，51:634(1986)；Fisher等人，Arch.Microbiol.[微生物学档案]139:213-217(1981)；以及McDonald，J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志]130:203(1984))。实际上，包括原生质体转化和转染、转导和原生质体融合在内的转化方法是熟知的并且适合用于本文。本领域已知的用于转化芽孢杆菌属细胞的方法包括例如质粒标记拯救转化等方法，其涉及通过携带部分同源的驻留质粒的感受态细胞摄取供体质粒(参见，Contente等人，Plasmid[质粒]2:555-571(1979)；Haima等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]，223:185-191(1990)；Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，154:1077-1087(1983)；和Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，169:1205-1211(1987))。在该方法中，进入的供体质粒在模拟染色体转化的过程中与驻留的“辅助”质粒的同源区重组。
除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，用包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种核酸的DNA构建体或载体直接转化宿主细胞(即，在引入宿主细胞之前，中间细胞不用于扩增或以其他方式处理DNA构建体或载体)。将本文所述的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的将核酸序列(例如DNA序列)引入宿主细胞而不***宿主基因组中的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA和脂质体。在另外的实施例中，DNA构建体或载体与质粒一起共转化而不***质粒。在另外的实施例中，通过本领域已知的方法从经改变的芽孢杆菌属菌株中缺失选择标记(参见Stahl等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]158:411-418(1984)；以及Palmeros等人，Gene[基因]247:255-264(2000))。
在一些实施例中，将经转化的细胞在常规营养培养基中培养。合适的特定培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且于科学文献中详细描述。一些实施例提供了培养物(例如，细胞培养物)，其包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或核酸序列。
在一些实施例中，将用编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许该变体表达的条件下在合适的营养培养基中培养，其后从该培养物中回收所得的变体。在一些实施例中，通过常规程序从培养基中回收由细胞生产的变体，该常规程序包括但不限于例如通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、借助于盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质组分和层析法纯化(例如离子交换、凝胶过滤、亲和等)。
在一些实施例中，由重组宿主细胞产生的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体被分泌到培养基中。编码纯化促进结构域的核酸序列可以用于促进该变体的纯化。包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列的载体或DNA构建体可以进一步包含编码促进变体纯化的纯化促进结构域的核酸序列(参见例如，Kroll等人，DNA CellBiol.[DNA细胞生物学]12:441-53(1993))。此类纯化促进结构域包括但不限于例如金属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath，ProteinExpr.Purif.[蛋白质表达与纯化]3:263-281[1992])；允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域；以及在FLAGS延伸/亲和纯化***中使用的结构域。在纯化结构域和异源蛋白之间包含可切割的接头序列例如因子XA或肠激酶(例如，可获自加利福尼亚州圣迭戈市英杰公司(Invitrogen)的序列)还可用于促进纯化。
可以使用多种方法来确定宿主细胞中如本文所述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体的生产水平。此类方法包括但不限于例如利用对蛋白酶特异的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。这些和其他测定法是本领域熟知的(参见例如，Maddox等人，J.Exp.Med.[实验医学杂志]158:1211(1983))。
一些其他实施例提供了用于制备或产生本文所述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体的方法。成熟的枯草杆菌蛋白酶变体不包括信号肽或前导肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞(例如像芽孢杆菌属细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞))中制备或生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。其他实施例提供了生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，其中该方法包括在有利于生产该变体的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸序列。一些这样的方法进一步包括从培养物中回收变体。
另外的实施例提供了生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，其中该方法包括：(a)将包含编码该变体的核酸的重组表达载体引入细胞群体(例如细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞)中；并且(b)在有助于生产由表达载体编码的变体的条件下在培养基中培养细胞。一些这样的方法进一步包括：(c)从细胞或从培养基中分离变体。
除非另外指出，本文提供的所有组分或组合物水平参考该组分或组合物的活性水平给出，并且不包括可能存在于可商购的来源中的杂质，例如残留溶剂或副产品。酶组分重量是基于总的活性蛋白。除非另外指明，所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比率均基于总组合物计算。本文所述的组合物包括清洁组合物，例如洗涤剂组合物。在例示的洗涤剂组合物中，通过按总组合物的重量计的纯酶表示酶水平并且除非另外说明，按总组合物的重量计表示洗涤剂成分。
在一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于清洁应用中，例如像但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物、医疗器械和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬表面)。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于消毒应用，例如像但不限于消毒自动餐具洗涤机或洗衣机。
另一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，该组合物是清洁组合物。在其他实施例中，该组合物是洗涤剂组合物。在又其他实施例中，该组合物选自衣物洗涤剂组合物、自动餐具洗涤(ADW)组合物、手洗(手动)餐具洗涤剂组合物、硬表面清洁组合物、眼镜清洁组合物、医疗器械清洁组合物、消毒剂(例如恶臭或微生物)组合物、和个人护理清洁组合物。在仍其他实施例中，该组合物是衣物洗涤剂组合物、ADW组合物、或手洗(手动)餐具洗涤剂组合物。甚至仍另外的实施例涉及织物清洁组合物，而其他实施例涉及非织物清洁组合物。在一些实施例中，该清洁组合物不含硼。在其他实施例中，该清洁组合物不含磷酸盐。在仍其他实施例中，该组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种赋形剂、辅助材料、和/或另外的酶。
在仍又进一步的实施例中，本文所述的组合物包含磷酸盐、不含磷酸盐、包含硼、不含硼、或是其组合。在其他实施例中，该组合物是不含硼的组合物。在一些实施例中，不含硼的组合物是未添加硼酸盐稳定剂的组合物。在另一个实施例中，不含硼的组合物是含有少于5.5％硼的组合物。在仍进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于4.5％硼的组合物。在仍又另一个实施例中，不含硼的组合物是含有少于3.5％硼的组合物。在仍又进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于2.5％硼的组合物。在甚至进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于1.5％硼的组合物。在另一个实施例中，不含硼的组合物是含有少于1.0％硼的组合物。在仍进一步的实施例中，不含硼的组合物是含有少于0.5％硼的组合物。在仍进一步的实施例中，不含硼的组合物是基本上不含硼的组合物。
在另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物是处于选自凝胶、片剂、粉末、颗粒、固体、液体、单位剂量及其组合的形式。在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物是处于选自低水致密配方、低水HDL或UD、或高水配方或HDL的形式。在一些实施例中，本文所述的清洁组合物是处于单位剂量形式。在其他实施例中，该单位剂量形式选自丸剂、片剂、胶囊、囊形片、小药囊、小袋、多隔室小袋和预先测量的粉末或液体。在一些实施例中，单位剂量形式被设计成在多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内提供对成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式描述于例如EP 2100949；WO 02/102955；US 4,765,916；US 4,972,017；和WO 04/111178中。在一些实施例中，该单位剂量形式是包含在水溶性膜或小袋中的片剂或粉末。
示例性衣物洗涤剂组合物包括但不限于例如液体和粉末衣物洗涤剂组合物。示例性硬表面清洁组合物包括但不限于例如用于清洁非餐具物品、非桌面器具物品、桌子、桌面、家具物品、墙壁、地板和天花板的硬表面的组合物。示例性硬表面清洁组合物描述于，例如，USPN 6,610,642、6,376,450和6,376,450中。示例性个人护理组合物包括但不限于用于清洁假牙、牙齿、头发、接触透镜和皮肤的组合物。这样的口腔护理组合物的示例性组分包括在例如US 6,376,450中描述的那些。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在低温下清洁。在其他实施例中，本文所述的一种或多种组合物在低温下清洁。在其他实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含有效量的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，该变体对于清洁需要蛋白质污渍去除的表面有用或有效。
在一些实施例中，掺入辅助材料例如以便辅助或增强清洁性能(用于处理待清洁的基材)，或者以便改变清洁组合物的美观性(例如用香料、色素、染料等的情况)。一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种辅助材料和一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种辅助材料和一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物，其中所述辅助材料选自：漂白催化剂、另外的酶、酶稳定剂(包括，例如酶稳定***)、螯合剂(chelant)、光亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、着色剂、填充剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂、抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载体、加工助剂、色素、pH控制剂、表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelatingagent)、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成型过酸、聚合物分散剂、黏土污垢去除/抗再沉积剂、结构增弹剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助剂、色素及其组合。示例性辅助材料和使用水平的合适实例可以在USPN 5,576,282；6,306,812；6,326,348；6,610,642；6,605,458；5,705,464；5,710,115；5,698,504；5,695,679；5,686,014和5,646,101中找到。在一种或多种清洁辅助材料与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体不相容的实施例中，使用将辅助材料和一种或多种变体保持分离(即彼此不接触)的方法，直到两种组分的组合合适为止。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，囊形片、包封、片剂、物理分离等)。
一些实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的清洁添加剂产品。在一些实施例中，所述添加剂被包封于用于添加至清洁过程中的剂型中。在一些实施例中，添加剂被包封在用于添加至清洁过程中的剂型中，在该清洁过程中使用过氧化物来源并且增加的漂白效果是希望的。
用于颗粒组合物的示例性填料或载体包括但不限于例如硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐；滑石；和黏土。用于液体组合物的示例性填料或载体包括但不限于，例如水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二元醇(例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇)。在一些实施例中，组合物包含从约5％至约90％的此类填料或载体。在此类组合物中可包含酸性填料以降低清洁方法或应用中所得溶液的pH。
在一个实施例中，本文描述的一种或多种清洁组合物包含有效量的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，该变体是单独的或与一种或多种另外的酶组合的。通常，清洁组合物包含至少约0.0001至约20wt.％、从约0.0001至约10wt.％、从约0.0001至约1wt.％、从约0.001至约1wt.％、或从约0.01至约0.1wt.％的一种或多种蛋白酶。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物包含从约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01至约2mg、约0.01至约1mg、约0.05至约1mg、约0.5至约10mg、约0.5至约5mg、约0.5至约4mg、约0.5至约4mg、约0.5至约3mg、约0.5至约2mg、约0.5至约1mg、约0.1至约10mg、约0.1至约5mg、约0.1至约4mg、约0.1至约3mg、约0.1至约2mg、约0.1至约2mg、约0.1至约1mg、或约0.1至约0.5mg的一种或多种蛋白酶/克组合物。
典型地配制本文所述的清洁组合物使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有从约4.0至约11.5、或甚至从约5.0至约11.5、或甚至从约5.0至约8.0、或甚至从约7.5至约10.5的pH。液体产品制剂典型地被配制成具有从约3.0至约9.0或甚至从约3至约5的pH。颗粒洗衣产品典型地被配制成具有从约9至约11的pH。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有碱性pH，例如从约8.0至约12.0、或从约8.5至约11.0、或从约9.0至约11.0的pH。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有中性pH，例如从约5.0至约8.0、或从约5.5至约8.0、或从约6.0至约8.0、或从约6.0至约7.5的pH。在一些实施例中，当清洁组合物在20℃下以1:100(wt:wt)溶解于去离子水中时，可以测量中性pH条件，使用常规pH计进行测量。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。
在一些实施方案中，将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包封以在储存期间保护其免于组合物中的其他组分和/或在清洁期间控制变体的可用性。在一些实施例中，包封增强了变体和/或另外的酶的性能。在一些实施例中，该包封材料典型地包封本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体的至少一部分。典型地，包封材料是水溶性和/或水分散性的。在一些实施例中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。示例性包封材料包括但不限于：碳水化合物、天然或合成胶、甲壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。当包封材料是碳水化合物时，其典型地选自单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些实施例中，包封材料是淀粉(参见例如EP 0922499、US4,977,252、US 5,354,559、和US 5,935,826)。在一些实施例中，包封材料是由塑料(例如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球。示例性商业微球包括但不限于(阿克苏诺贝尔化学国际公司(Akzo NobelChemicals International,B.V.))；PM6545、PM6550、PM7220、PM7228和(Sphere One公司)；和 和(波特工业有限责任公司(Potters Industries LLC))。
存在各种洗涤条件，包括本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体所暴露的不同的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度、和洗涤时间的长短。低洗涤剂浓度***涉及含有少于约800ppm洗涤剂组分的洗涤水。中等洗涤剂浓缩***涉及含有约800ppm至约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤水。高洗涤剂浓度***涉及含有大于约2000ppm洗涤剂组分的洗涤水。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”使用适合于在从约10℃至约40℃、从约20℃至约30℃、或从约15℃至约25℃、以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合、或10℃至40℃的温度下洗涤的“冷水洗涤剂”。
不同的地理位置具有不同的水硬度。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。通常按照颗粒/加仑(gpg)混合的Ca2+/Mg2+来描述水硬度。在美国，大部分水都是硬水，但是硬度不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm(将ppm转化为颗粒/美国加仑是将ppm除以17.1)的硬度矿物。
水 颗粒/加仑 百万分率
软 小于1.0 小于17
略硬 1.0至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
非常硬 大于10.5 大于180
其他实施例涉及一种或多种清洁组合物，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.999％至约90.0％的一种或多种辅助材料。在另一个实施例中，该清洁组合物包含按组合物重量计从约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.9999％至约90.0％、约99.999％至约98％、约99.995％至约99.5％的一种或多种辅助材料。
在其他实施例中，本文所述的组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、***糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、DNA酶或核酸酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、另外的蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合和混合物。一些实施例涉及包含常规酶(如淀粉酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶)的酶的组合(即“混合物”)，所述酶的组合与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和/或一种或多种另外的蛋白酶结合。
在另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的蛋白酶。在一个实施例中，另外的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在另一个实施例中，另外的蛋白酶是微生物碱性蛋白酶或胰蛋白样蛋白酶。适合的另外的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。在一些实施例中，另外的蛋白酶是微生物蛋白酶。在其他实施例中，另外的蛋白酶是化学或遗传修饰的突变体。在另一个实施例中，另外的蛋白酶是微生物碱性蛋白酶或胰蛋白样蛋白酶。示例性碱性蛋白酶包括衍生自例如芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶迟缓、枯草杆菌蛋白酶解淀粉、枯草杆菌蛋白酶吉氏、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。示例性金属蛋白酶包括在枯草芽孢杆菌中表达的重组形式的中性金属蛋白酶nprE(参见例如WO 07/044993)和来自解淀粉芽孢杆菌的纯化的中性金属蛋白酶PMN。示例性的另外的蛋白酶包括但不限于以下公开发明中描述的那些：WO 92/21760、WO 95/23221、WO 2008010925、WO 09149200、WO 09149144、WO 09149145、WO10056640、WO 10056653、WO 20100566356、WO 2011072099、WO 201113022、WO 11140364、WO2012151534、WO 2015038792、WO 2015/089441、WO 2015089447、WO 2015143360、WO2016001449、WO 2016001450、WO 2016061438、WO 2016069544、WO 2016069548、WO2016069552、WO 2016069557、WO 2016069563、WO 2016069569、WO 2016087617、WO2016087619、WO 2016145428、WO 2016174234、WO 2016183509、WO 2016202835、WO2016205755、US 20080090747、US 5,801,039、US 5,340,735、US 5,500,364、US 5,855,625、RE 34,606、US 5,955,340、US 5,700,676US 6,312,936、US 6,482,628、US 8,530,219、美国临时申请号62/331282、62/351649、62/437171、62/437174和62/437509以及PCT申请号PCT/CN 2017/076749和PCT/US 2017/029307以及在如下公开专利中描述的金属蛋白酶：WO 1999014341、WO 1999033960、WO 1999014342、WO 1999034003、WO 2007044993、WO2009058303、WO 2009058661、WO 2014071410、WO 2014194032、WO 2014194034、WO2014194054和WO 2014194117。示例性的另外的蛋白酶还包括但不限于胰蛋白酶(例如猪或牛起源的)和在WO 89/06270中描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。示例性商业蛋白酶包括但不限于MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、 OXP、 PREFERENZTM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZTM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZTM蛋白酶(例如P1000)、和PURAFAST(美国丹尼斯科公司)； ULTRA、 16L、 ULTRA、 PRIMASE、DURAZYM、 PROGRESS 和(诺维信公司)；BLAPTM和BLAPTM变体(汉高公司(Henkel))；LAVERGYTMPRO104L(BASF)、和KAP(嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)枯草杆菌蛋白酶(花王公司)。
另一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种脂肪酶的组合物。在一些实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的脂肪酶。示例性脂肪酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性脂肪酶包括但不限于例如细菌或真菌来源的那些，例如像绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP258068和EP 305216)、疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶(参见例如WO 2014/059360和WO 2015/010009)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP238023)、假丝酵母属(Candida)脂肪酶例如南极洲假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极洲假丝酵母脂肪酶A或B)(参见例如EP 214761)、假单胞菌属脂肪酶例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如，EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如，EP 331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如，GB 1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等人,Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1131:253-260(1993))、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(参见例如，JP 64/744992)、和短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如，WO 91/16422))。示例性经克隆的脂肪酶包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，Gene[基因]103:61-67(1991))；白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，J.Biochem.[生物化学杂志],106:383-388(1989))；以及各种根霉属脂肪酶例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等人，Gene[基因]109:117-113(1991))；雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]56:716-719(1992))和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。其他脂解酶如角质酶也可用于本文所述的一种或多种组合物中，包括但不限于例如衍生自门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)和/或豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)(参见WO90/09446)。示例性商业脂肪酶包括但不限于M1LIPASE、LUMA FAST和LIPOMAX(杰能科公司)； 和ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE P(天野药业有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd))。
仍另外的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种淀粉酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的淀粉酶。适合用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)可以用于包含在此类组合物中。示例性淀粉酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性的蛋白酶包括但不限于细菌来源或真菌来源的那些，例如像在如下公开专利中描述的淀粉酶：GB 1,296,839、WO 91/00353、WO 94/02597、WO 94/183314、WO 95/10603、WO 95/26397、WO 95/35382、WO 96/05295、WO 96/23873、WO 96/23874、WO 96/30481、WO 97/10342、WO 97/41213、WO 97/43424、WO 98/13481、WO 98/26078、WO 99/02702、WO 99/09183、WO 99/19467、WO 99/23211、WO 99/29876、WO 99/42567、WO 99/43793、WO 99/43794、WO 99/46399、WO 00/29560、WO 00/60058、WO 00/60059、WO 00/60060、WO 01/14532、WO 01/34784、WO 01/64852、WO 01/66712、WO 01/88107、WO 01/96537、WO 02/092797、WO 02/10355、WO 02/31124、WO 2004055178、WO 2004113551、WO 2005001064、WO 2005003311、WO2005018336、WO 2005019443、WO 2005066338、WO 2006002643、WO 2006012899、WO2006012902、WO 2006031554、WO 2006063594、WO 2006066594、WO 2006066596、WO2006136161、WO 2008000825、WO 2008088493、WO 2008092919、WO 2008101894、WO2008112459、WO 2009061380、WO 2009061381、WO 2009100102、WO 2009140504、WO2009149419、WO 2010059413、WO 2010088447、WO 2010091221、WO 2010104675、WO2010115021、WO 2010115028、WO 2010117511、WO 2011076123、WO 2011076897、WO2011080352、WO 2011080353、WO 2011080354、WO 2011082425、WO 2011082429、WO2011087836、WO 2011098531、WO 2013063460、WO 2013184577、WO 2014099523、WO2014164777和WO 2015077126。示例性商业淀粉酶包括但不限于AMPLIFYBAN ULTRA、 PLUS、ULTRA和 (诺维信公司)；EFFECTENZTMS1000、PREFERENZTMS100、PREFERENZTMS110、EXCELLENZTMS 2000、和P(美国丹尼斯科公司)。
仍又另外的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种纤维素酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的纤维素酶。任何合适的纤维素酶可以用于本文所述的组合物中。示例性纤维素酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性纤维素酶包括但不限于细菌来源或真菌来源的那些纤维素酶，例如像在如下公开专利中所描述：WO 2005054475、WO 2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US 4,435,307；EP 0495257；和美国临时申请号62/296,678和62/435340。示例性商业纤维素酶包括但不限于， PREMIUM、和(诺维信公司)；100、200/220和2000(美国丹尼斯科公司)；以及KAC-500(B)(花王公司)。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分被缺失(参见例如US 5,874,276)。
甚至仍另外的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种甘露聚糖酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶。示例性甘露聚糖酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些甘露聚糖酶，例如像如WO2016007929、WO 2017/079756和WO 2017/079751；以及USPN 6566114、6602842和6440991中所描述的。示例性商业甘露聚糖酶包括但不限于(诺维信公司)和EFFECTENZTMM 1000、M 100、和PURABRITE(美国丹尼斯科公司)。
又甚至仍另外的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种过氧化物酶和/或氧化酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的过氧化物酶或氧化酶。过氧化物酶可以与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合使用，并且氧化酶可以与氧气组合使用。将单独的或与增效剂组合的过氧化物酶和氧化酶用于“溶液漂白”(即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)(参见例如WO 94/12621和WO 95/01426)。示例性过氧化物酶和/或氧化酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌来源的那些。
另一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种过水解酶的组合物，例如比如描述于WO 2005/056782、WO 2007/106293、WO 2008/063400、WO 2008/106214和WO 2008/106215中的过水解酶。
在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及在本文所述的一种或多种组合物中包含的一种或多种另外的酶可以各自独立地变动至约10％，其中该清洁组合物的余量为一种或多种辅助材料。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物可用作洗涤剂添加剂，其中所述添加剂为固体或液体形式。此类添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施例中，衣物洗涤剂组合物的密度范围为从约400g/升至约1200g/升，而在其他实施例中，其范围为在20℃下测量的500g/升至约950g/升的组合物。
一些实施例涉及衣物洗涤剂组合物，其包含一种或多种本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种选自如下的辅助材料：表面活性剂、酶稳定剂、助洗剂化合物、聚合化合物、漂白剂、另外的酶、泡沫抑制剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮剂、抗再沉积剂、腐蚀抑制剂及其组合。在一些实施例中，该洗衣组合物还含有柔顺剂。
另外的实施例涉及手动餐具洗涤组合物，其包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种选自如下的辅助材料：表面活性剂、有机聚合化合物、增泡剂、II族金属离子、溶剂、助水溶物和另外的酶。
其他实施例涉及本文描述的一种或多种组合物，其中所述组合物是用于有色织物洗涤或通过洗涤容量提供软化的致密颗粒状织物清洁组合物，或者是重垢液体(HDL)织物清洁组合物。示例性织物清洁组合物和/或制备方法描述于USPN 6,610,642和6,376,450中。其他示例性清洁组合物描述于例如USPN 6,605,458、6,294,514；5,929,022；5,879,584；5,691,297；5,565,145；5,574,005；5,569,645；5,565,422；5,516,448；5,489,392；和5,486,303；4,968,451；4,597,898；4,561,998；4,550,862；4,537,706；4,515,707；和4,515,705。
在一些实施例中，该清洁组合物包含酸化颗粒或氨基羧酸助洗剂。氨基羧酸助洗剂的实例包括氨基羧酸、其盐和衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂是氨基多羧酸助洗剂，例如甘氨酸-N,N-二乙酸或具有通式MOOC-CHR-N(CH2COOM)2(其中R是C1-12烷基并且M是碱金属)的衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂可以是甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、羧基甲基菊粉及其盐及其衍生物、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺基甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺基乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺基甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺基乙基)谷氨酸(SEGL)、IDS(亚氨基二乙酸)及其盐及其衍生物例如N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺基甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、以及碱金属盐及其衍生物。在一些实施例中，酸化颗粒的重量几何平均粒度为从约400μ至约1200μ，并且体积密度为至少550g/L。在一些实施例中，酸化颗粒包含至少约5％的助洗剂。
在一些实施例中，酸化颗粒可以包含任何酸，包括有机酸和无机酸。有机酸可以具有一个或两个羧基，并且在一些情况下可以具有高至15个碳，特别是高至10个碳，例如甲酸、乙酸、丙酸、癸酸、草酸、琥珀酸、己二酸、马来酸、富马酸、癸二酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和水合乙醛酸。在一些实施例中，该酸是柠檬酸。无机酸包括盐酸和硫酸。在一些情况下，酸化颗粒是包含高水平氨基羧酸助洗剂的高活性颗粒。也已经发现硫酸进一步有助于最终颗粒的稳定性。
另外的实施例涉及清洁组合物，其包含一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种表面活性剂和/或表面活性剂***，其中该表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其混合物。在一些实施例中，表面活性剂以从约0.1％至约60％的水平存在，而在可替代的实施例中，该水平为从约1％至约50％，而在又另外的实施例中，该水平为从约5％至约40％，以清洁组合物的重量计。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂***。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约1％、从约0.1％至约80％、从约3％至约60％、从约5％至约40％、从约10％至约50％的助洗剂。示例性助洗剂包括但不限于多磷酸盐的碱金属盐、铵盐和烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；多元羧酸盐化合物；醚羟基多羧酸盐；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸、和羧基甲基氧基琥珀酸的共聚物；聚乙酸的铵盐和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；多羧酸盐，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸；及其可溶性盐。在一些此类组合物中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，例如柠檬酸盐和多磷酸盐，例如三聚磷酸钠、三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和三聚磷酸钾。示例性助洗剂描述于，例如EP 2100949。在一些实施例中，助洗剂包括磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂包括磷酸盐和非磷酸盐助洗剂的混合物。示例性磷酸盐助洗剂包括但不限于单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚多磷酸盐，包括这些化合物的碱金属盐，包括钠盐。在一些实施例中，助洗剂可以是三聚磷酸钠(STPP)。另外，组合物可以包含碳酸盐和/或柠檬酸盐。其他适合的非磷酸盐助洗剂包括多元羧酸及其部分或完全中和盐、单体型多羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物。在一些实施例中，上述化合物的盐包括铵盐和/或碱金属盐，即锂盐、钠盐和钾盐，包括钠盐。适合的多元羧酸包括无环的、脂环族的、杂环的和芳香族的羧酸，其中在一些实施例中，它们可以包含至少两个羧基基团，这些羧基基团在每种情况下彼此分离，在某些情况下被不超过两个碳原子分离。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种螯合剂。在一个实施例中，该组合物包含以组合物重量计从约0.1％至约15％或约3％至约10％的螯合剂。示例性螯合剂包括但不限于例如铜、铁、锰及其混合物。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种沉积助剂。示例性沉积助剂包括但不限于例如聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸盐；去污聚合物，例如比如聚对苯二甲酸；黏土，例如比如高岭石、蒙脱石、硅镁土、伊利石、膨润土和多水高岭土；以及它们的混合物。
在其他实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种抗再沉积剂或非离子表面活性剂(其可以防止污垢的再沉积)(参见，例如，EP 2100949)。例如，在ADW组合物中，非离子表面活性剂可用于表面改性目的(特别是用于薄片)以避免成膜和沾上污渍并且改善光泽。这些非离子表面活性剂还可用于防止污垢的再沉积。在一些实施例中，非离子表面活性剂可以是乙氧基化非离子表面活性剂、环氧树脂封端的聚(烷氧基化)醇和氧化胺表面活性剂。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。示例性聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯咪唑及其混合物。在一个实施例中，该组合物包含以组合物重量计从约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种硅酸盐。示例性包括但不限于硅酸钠，例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐。在一些实施例中，硅酸盐以按该组合物的重量计从约1％至约20％或约5％至约15％的水平存在。
在一些仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种分散剂。示例性水溶性有机材料包括但不限于例如均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。
在一些另外的实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种酶稳定剂。在一些实施例中，酶稳定剂是钙和/或镁离子的水溶性来源。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属，例如钙盐。在一些实施例中，本文使用的酶通过存在于为这些酶提供以下这样的离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于一些实施例中。示例性寡糖和多糖(例如糊精)描述于例如WO 07/145964中。在一些实施例中，可逆蛋白酶抑制剂也可用于例如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、和苯基硼酸衍生物(例如在WO 96/41859中描述的那些))和/或肽醛(例如像在WO 2009/118375和WO2013004636中进一步描述的)中。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种漂白剂、漂白活化剂、和/或漂白催化剂。在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种无机和/或有机漂白化合物。示例性无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐，例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括为结晶固体但没有额外保护的无机过氧化氢合物盐，但是在一些其他实施例中，所述盐被包衣。漂白活化剂通常为有机过酸前体，其在60℃及以下的温度下在清洁过程中增强漂白作用。示例性漂白活化剂包括在过水解条件下给出具有从约1至约10个碳原子或从约2至约4个碳原子的脂肪族过氧羧酸的化合物、和/或任选地取代的过氧苯甲酸。示例性的漂白活化剂描述于例如EP 2100949中。示例性漂白催化剂包括但不限于锰三氮杂环壬烷和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的示例性漂白催化剂描述于例如US 4,246,612；US 5,227,084；US 4,810,410；WO 99/06521；和EP 2100949。
在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些实施例中，金属漂白催化剂包含一种催化体系，该催化体系包括：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的螯合物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参见例如US 4,430,243)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物用锰化合物来催化。此类化合物和使用水平描述于例如US 5,576,282中。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于并包含于本文所述的一种或多种组合物中。多种钴漂白催化剂描述于例如USPN5,597,936和5,595,967中。
在一些另外的实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含大多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为实际问题而并非通过限制，在一些实施例中，对本文所述的组合物和清洁方法进行调节以提供至少一亿分之一数量级的，在洗涤液中约0.005ppm至约25ppm、约0.05ppm至约10ppm、或约0.1ppm至约5ppm的活性MRL。示例性MRL包括但不限于交联桥接的特殊超刚性配体，例如像5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环(6.6.2)十六烷。示例性金属MRL描述于例如WO 2000/32601和US 6,225,464中。
在另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种金属护理剂。在一些实施例中，组合物包含按该组合物的重量计从约0.1％至约5％的金属护理剂。示例性金属护理剂包括例如铝、不锈钢和非铁金属(例如，银和铜)。其他示例性金属护理剂描述于例如EP2100949、WO 94/26860和WO 94/26859中。在一些组合物中，金属护理剂是锌盐。
在一些实施例中，清洁组合物是包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的高密度液体(HDL)组合物。HDL液体衣物洗涤剂可以包含清洁表面活性剂(10％-40％)，该清洁表面活性剂包含：阴离子清洁表面活性剂，其选自以下组：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐、和/或其混合物；以及任选地非离子表面活性剂，其选自以下组：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物，任选地其中阴离子清洁表面活性剂(亲水指数(HIc)为从6.0至9)与非离子清洁表面活性剂的重量比大于1:1。适合的清洁表面活性剂还包括阳离子清洁型表面活性剂(选自烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物和/或其混合物)；兼性离子和/或两性清洁表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂；及其混合物。
在另一个实施例中，该清洁组合物是液体或凝胶洗涤剂(其不是单位剂量的)，该液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，通常含有按重量计至少20％和高至95％的水，例如按重量计高至约70％的水，按重量计高至约65％的水，按重量计高至约55％的水，按重量计高至约45％的水，或按重量计高至约35％的水。在水性液体或凝胶中可包括其他类型的液体(包括但不限于烷醇、胺、二醇、醚和多元醇)。水性液体或凝胶洗涤剂可包含从0至30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
该组合物可以任选地包含由两亲烷氧基化油脂清洁聚合物组成的表面活性增强聚合物，该两亲烷氧基化油脂清洁聚合物选自以下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如烷氧基化聚亚烷基亚胺(在0.05wt％-10wt％范围内)和/或典型地包含含有选自下组的单体的亲水主链的无规接枝聚合物，该组由以下组成：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(例如甘油)及其混合物；以及一个或多个疏水侧链，该疏水侧链选自下组，该组由以下组成：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C2-C6单羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯及其混合物。
该组合物可以包含另外的聚合物，例如去污聚合物，该去污聚合物包含例如阴离子封端的聚酯，例如SRP1；处于无规或嵌段构型的、含有至少一种单体单元的聚合物，该单体单元选自糖类、二羧酸、多元醇及其组合；处于无规或嵌段构型的、基于对苯二甲酸乙二醇酯的聚合物及其共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6；Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325；Marloquest SL；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％，包括例如羧酸盐聚合物，例如包含至少一种选自以下的单体的聚合物：丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或具有在500至100,000Da范围的分子量的聚乙二醇)；纤维素聚合物(包括例如烷基纤维素；烷基烷氧基烷基纤维素；羧基烷基纤维素；烷基羧基烷基纤维素，其实施例包括羧基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧基甲基纤维素；及其混合物)；以及聚合羧酸酯(例如，像马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。
该组合物可以进一步包含饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0wt％至-10wt％)；处于无规或嵌段构型的沉积助剂(包括例如多糖、纤维素聚合物、聚二烯丙基二甲基卤化铵(DADMAC))、以及DADMAC与乙烯基吡咯烷酮的共聚物、丙烯酰胺、咪唑、卤化咪唑啉及其混合物；阳离子瓜耳胶；阳离子纤维素，例如阳离子羟基乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺；以及它们的混合物。
该组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)；二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)；羟基乙烷二膦酸(HEDP)；乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；二乙撑三胺五乙酸(DTPA)；丙二胺四乙酸(PDT A)；2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)；或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)；次氮基三乙酸(NTA)；4,5-二羟基间苯二磺酸；柠檬酸及其任何盐；N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)及其衍生物。
该组合物可以进一步包含基于硅酮或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；酶稳定剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt.％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt.％至-5wt.％)(选自下组，该组由以下组成：甘油二酸酯、甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物)。
在一些实施例中，清洁组合物是包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的高密度粉末(HDD)组合物。该HDD粉末衣物洗涤剂可以包括清洁表面活性剂，其包括阴离子清洁表面活性剂(选自直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)；非离子清洁表面活性剂(选自直链或支链或无规链、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧基化物和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)；阳离子清洁表面活性剂(选自烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物，烷基三元锍化合物及其混合物)；兼性离子和/或两性清洁表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物；助洗剂(无磷酸盐助洗剂，例如沸石助洗剂，其实例包括在0至小于10wt.％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)；磷酸盐助洗剂，例如在0至小于10wt.％范围内的三聚磷酸钠；在小于15wt.％范围内的柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸或其盐；硅酸盐(在0至小于10wt.％范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠)或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(在0至小于10wt.％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂(光漂白剂，例如磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物)；疏水或亲水漂白活化剂(例如，十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、和壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐(nitrile quats)、及其混合物)；过氧化氢；过氧化氢源(无机过氧化氢合物盐，例如过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；预成型的亲水和/或疏水性过酸(选自过羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚胺酸和盐、过氧单硫酸和盐及其混合物)；和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白增效剂，例如亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子、改性胺、改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮及其混合物)、含金属的漂白催化剂(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(例如锌或铝)和螯合剂(例如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)、及其水溶性盐))。
组合物可以进一步包含另外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、酶稳定剂、调色剂、另外的聚合物(包括织物完整性和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物柔顺剂、增亮剂(例如C.I.荧光增亮剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化多胺、织物沉积助剂和/或环糊精。
在一些实施例中，清洁组合物是包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的ADW洗涤剂组合物。所述ADW洗涤剂组合物可以包含两种或更多种选自以下的非离子表面活性剂：乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇和胺氧化物表面活性剂，它们按重量计以0-10％的量存在；在5％-60％(以重量计)范围内的助洗剂，该助洗剂包括：磷酸盐助洗剂(单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚磷酸盐)，三聚磷酸钠-STPP或无磷酸盐助洗剂(基于氨基酸的化合物，例如MGDA(甲基-甘氨酸-二乙酸)及其盐和衍生物、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)及其盐和衍生物、IDS(亚氨基二琥珀酸)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物及其混合物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、和B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐)，多元羧酸及其部分或完全中和盐的均聚物和共聚物，单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐，它们在0.5％-50％(以重量计)的范围内；磺化/羧化聚合物(为产品提供尺寸稳定性)，其在约0.1％至约50％(以重量计)的范围内；在约0.1％至约10％(以重量计)的范围内的干燥助剂(选自聚酯，特别是任选地与有助于缩聚作用的具有3至6个官能团(特别是酸、醇或酯官能团)的另外的单体一起的阴离子聚酯，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其反应性环状碳酸酯和脲的前体化合物)；在约1％至约20％(以重量计)的范围内的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；无机漂白剂(例如，过氧水合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸、和二过氧十六烷二酸)；漂白活化剂-有机过酸前体，其在约0.1％至约10％(以重量计)的范围内；漂白催化剂(选自锰三氮杂环壬烷及相关络合物、Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物、以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；在约0.1％-5％(以重量计)的范围内的金属护理剂(选自苯并三氮唑、金属盐和络合物、和硅酸盐)；每克ADW洗涤剂组合物的在约0.01mg至5.0mg范围内的活性酶的酶(酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、***糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其混合物)；以及酶稳定剂组分(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。
更多实施例涉及使用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域中熟知的(参见例如，US 6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的本文所述变体接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。
可以在纺织品的编织期间或之后、在脱浆阶段期间或一个或多个另外的织物加工步骤中应用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在纺织品的编织期间，使线暴露于相当大的机械应变。在机械织机上编织之前，常常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可在编织期间或之后应用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以除去上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可以在进一步处理织物之前使用该变体来除去浆涂层以确保均一和耐洗的结果。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为清洁剂添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。淀粉酶还可以用于在靛蓝染色的牛仔织物和服装上产生石磨的外观的组合物和方法中使用。对于服装生产而言，织物可被裁剪和缝制成服装或衣服，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整加工通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使衣服经受淀粉水解酶的作用以为织物提供柔软性，并且使棉更易于进行随后的酶促精整加工步骤。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于下列方法中：精整牛仔衣服(例如“生物磨砂方法”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整方法。
在进一步的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于工业清洁和机构清洁应用，例如像用于工业或机构餐具洗涤***、机器或工艺中；用于工业或机构场内(on premises)衣物洗涤***、机器或工艺中；和用于工业或机构衣物洗涤***、机器或工艺中。
本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于从动物中去除蛋白质(例如羽毛、皮肤、毛发和兽皮)及用于其随后的降解或处置。在一些情况下，与在滚烫的水或去毛工艺中的传统浸泡相比，将动物尸体浸泡在包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的溶液中可以起到保护皮肤免受损伤的作用。在一个实施例中，羽毛可以在适合于消化或引发羽毛退化的条件下用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进行喷雾。在一些实施例中，该变体可以与氧化剂组合使用。
在一些实施例中，可以通过本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来辅助与未加工的羽毛相关的油或脂肪的去除。在一些实施例中，将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在用于清洁羽毛的组合物中使用，并且用来对纤维进行消毒和部分脱水。在又其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于从羽毛中回收蛋白质。在一些其他实施例中，在具有或没有约0.5％(v/v)的表面活性剂的情况下，将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与95％乙醇或其他极性有机溶剂组合应用于洗涤溶液中。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以单独使用或与合适的羽毛加工和蛋白水解方法(例如在PCT/EP 2013/065362、PCT/EP 2013/065363和PCT/EP2013/065364中公开的那些)组合使用。在一些实施例中，回收的蛋白质随后可以用于动物或鱼类饲料中。
在仍另外的实施例中，一种或多种动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。其他实施例涉及制备这样的动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，该方法包括将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分进行混合。
术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在具体实施例中，该动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于：猪(pig和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、小鸡、肉仔鸡、蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类，例如虾和对虾。在另外的实施例中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
在本发明上下文中，术语“宠物食品”旨在被理解为意指用于以下的食物：家庭动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，例如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。
术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“喂养料”可互换地使用，并且包含选自下组的一种或多种饲料原料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉米或高粱；b)来自谷类的副产品，例如玉米谷蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(Distillers Dried Grain Solubles)(DDGS)(特别是基于玉米的干酒糟谷物可溶物(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；以及e)矿物质和维生素。
本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于纸浆(例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆)的酶辅助漂白。一般来说，将纸浆与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在适合于漂白纸浆的条件下一起孵育。
在一些实施例中，纸浆是不含氯的纸浆，该纸浆经氧、臭氧、过氧化氢或过氧酸进行漂白。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体用于展示出低木质素含量的纸浆的酶辅助漂白，该纸浆是通过经改良的制浆方法或连续制浆方法生产的。在一些其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体单独地应用或优选地与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合应用。
在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于组织的酶辅助清创。这涉及去除死亡或受损的组织，例如从伤口去除以帮助愈合。
在甚至另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于组织培养。具体地，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以用于(例如在收获细胞过程中)悬浮或再悬浮附着于细胞培养壁的细胞。在另一实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以用于切割培养细胞与培养皿之间的蛋白质结合，从而允许细胞悬浮于溶液中。
在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用作食品添加剂、消化助剂和/或食品加工助剂。
在仍又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步通过从动物兽皮中除去毛发、浸泡、脱脂或软化(这是涉及皮革制造期间非结构蛋白质降解的过程)来用于皮革加工。
实例1
测定
在随后实例中使用了以下测定。下文所述测定的任何偏差将在产生这种偏差的实例中得到解决。
性能指数
酶的性能指数(PI)比较了在相同的蛋白质浓度下的变体(测量值)与亲本酶(理论值或测量值)的性能，该亲本酶选自AprL野生型(WT)(SEQ ID NO:2)(在下文中称为“AprL亲本”)、BliD02339WT(SEQ ID NO:9)(在下文中称为“BliD亲本”)或SQCBV35变体(SEQ ID NO:63)(在下文中称为SQCBV35亲本)。可以使用从亲本标准曲线的朗缪尔(Langmuir)拟合提取的参数计算亲本的理论浓度。PI大于1(PI>1)表明变体相较于亲本，性能得到改善，而PI为1(PI＝1)鉴定为变体与亲本具有相同的性能，并且PI小于1(PI<1)鉴定为变体的性能比亲本差。
蛋白质测定分析
培养物上清液中的AprL或BliD变体的蛋白质测定使用Agilent U-HPLC或HPLC***进行。对于U-HPLC方法，准备纯化的亲本蛋白质的校准曲线(0-500ppm)并用于产生标准曲线。将澄清的培养物上清液中的AprL或BliD变体在稀释缓冲液(Tris 25mM，pH 7.4，5mMCaCl2)中稀释10倍，并且然后以1:1的比例与乙腈缓冲液(22.5mM Tris，pH 7.4，4.5mMCaCl2，9％乙腈)混合。然后，使用45μm过滤板过滤样品，并通过自动进样器加载到反相柱(Zorbax 300 SB-C3柱，2.1x 100mm&2.1x 50mm，均具有1.8μm珠粒尺寸)上。用缓冲液A(0.1％三氟乙酸(TFA))和缓冲液B(0.07％乙腈)的梯度从该柱中洗脱样品。流速为1mL/min，运行4分钟且运行后1分钟柱平衡。在220nm处测量吸光度，并使用ChemStation软件(安捷伦科技公司)对峰进行积分。基于纯化的亲本的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。在某些情况下，用于蛋白质测定的Bradford方法与HPLC一起使用。使用Bradford试剂(BradfordQuickstart 1X染料试剂，伯乐公司(BioRad))并在Spectramax酶标仪上测量595/450nm处的吸光度。
可替代地，使用Agilent 1100/1200***通过HPLC进行来自培养物上清液的AprL变体的蛋白质测定。使用纯化的亲本蛋白质准备校准曲线(0-1500ppm)并用于产生标准曲线。来自澄清的培养物上清液的AprL变体通过两种方法之一进行分析。在某些情况下，将培养物上清液在稀释缓冲液(Tris 100mM，pH 8.6，0.005％Tween 80)中稀释2倍，并通过自动进样器加载到在69℃-70℃预平衡的Agilent C8柱(AgilentPoroshell 5μm 300SB-C82.1x 75mm)上。用缓冲液A(0.1％TFA)和缓冲液B(100％乙腈和0.1％TFA)的梯度从该柱中洗脱样品。流速是2mL/min，运行2min。在其他情况下，含有AprL变体的澄清的培养物上清液在酸/SDS溶液中预处理。将75μL样品与6.4μL的4NHCl混合并在冰上混合10分钟。每孔添加20.4μL的10％SDS溶液并混合，过滤样品，然后加载到室温下设置的HPLC HIP-ALS Aquity125A USEC柱中。样品用25mM乙酸钠、pH 5.5、100mM NaCl、0.5％SDS的溶液洗脱，流速为0.35mL/min，运行8min。在220nm或230nm处测量吸光度，并使用ChemStation(安捷伦科技公司)软件对峰进行积分。
对于所有三种蛋白质测定方法，基于纯化的亲本酶的标准曲线计算每种样品的蛋白质浓度。
蛋白酶活性
通过测量N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白(DMC)底物的水解来测试亲本及其变体的蛋白酶活性。
对于AAPF测定，使用的试剂溶液是：100mM Tris pH 8.6，10mM CalCl2，0.005％-80(Tris/Ca缓冲液)和在DMSO中的160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA原液)(西格玛：S-7388)。为了制备工作溶液，将1mL suc-AAPF-pNA原液添加到100mL Tris/Ca缓冲液中并混合。将酶样品添加到含有1mg/mL suc-AAPF-pNA工作溶液的微量滴定板(MTP)中，并且使用SpectraMax板读数器以动力学方式在室温下经3-5min在405nm下测量活性。将蛋白酶活性表达为mOD/min。
对于DMC测定，所使用的试剂溶液是：在100mM碳酸钠(pH 9.5)中的2.5％DMC(西格玛)、在试剂A中的0.075％TNBSA(2,4,6-三硝基苯磺酸，赛默科技公司(ThermoScientific))。试剂A：在15mL 4N NaOH中的45.4g Na2B4O7.10H2O(默克公司(Merck))，在MQ水中达到1000mL的终体积，稀释溶液：10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％Tween-80、0.02％叠氮化钠。添加2.5μL 20ppm蛋白酶上清液后，用47.5μL DMC底物填充MTP。然后添加50μL在试剂A中的TNBSA，同时缓慢混合。使用SpectraMax酶标仪以动力学方式在室温下经5min在405nm下测量活性。如上针对AAPF测定所述，活性以mOD/min表示。
评价洗涤剂组合物
这些研究中使用的洗涤剂配方列于表1中，并且包括重垢液体衣物洗涤(HDL)、重垢粉末衣物洗涤(HDD)和自动餐具洗涤(ADW)配方。将商业洗涤剂热灭活以除去酶活性并如表1所述进行给予。用于酶灭活的洗涤剂处理如下。含有酶的HDL衣物洗涤剂(不包括测试HDL1、测试HDL 2和宝莹非生物(Persil Non-Bio)HDL洗涤剂)通过在95℃下在水浴中加热纯液体16小时而灭活。通过制备相对于在最终清洁测定中使用的10X浓缩溶液并将其在95℃下加热16小时，将HDD洗涤剂中的酶灭活。如下将商业ADW洗涤剂配方在65℃下热灭活30-45min。将ADW洗涤剂片剂溶解在700mL 21GH水中并通过在65℃下将溶液孵育30-45min来灭活酶活性。在用于测定之前，将酶灭活的溶液在21GH水中稀释10倍。使用AAPF底物灭活后测定蛋白酶活性，以确保蛋白酶完全灭活。在HDD、ADW和HDL洗涤剂的热处理后，检测不到蛋白酶活性。HDL洗涤剂：宝莹非生物(Persil Non-Bio)、测试HDL 1和测试HDL 2被认为是无硼的，因为当测试硼元素含量时，它们含有≤5mg/Kg的硼。将GSM-B粉末配方溶解至3g/L以便使用并且不调节pH。
*调节洗涤剂的洗涤溶液的pH值，提供了值并且不调节那些ND标记的洗涤溶液的pH值。
洗涤剂来源：ALL、超级科克兰和科克兰超净(太阳产品公司(Sun Products))，彩色奥妙、奥妙克莱因&克拉克蒂格、Surf Excel、和SUN多效合一洗涤剂片剂(联合利华)，Finish多效合一和Finish Quantum洗涤剂片剂(利洁时公司(Reckitt Benckiser))，和蓝月亮(广州蓝月亮(Guangzhou Blue Moon))。上面列出的洗涤剂是在2012年从当地超市购买的。宝莹Small&Mighty非生物液体洗涤剂“宝莹非生物”(联合利华)于2014年购买。立白(广州立白公司(Guangzhou Liby Enterprise))购于2016年。测试HDL 1和测试HDL 2洗涤剂是内部定制的，并且各自的组成分别列于表1.2和1.3中。表1.4示出了GSM-B无磷酸盐ADW洗涤剂(购买时无酶，购自德国布鲁伊根(Brüggen)的WFK Testgewebe GmbH(www.testgewebe.de))的组成。通过将购买的GSM-B无磷酸盐洗涤剂的pH调低至pH 9来制备GSM-B 9配方。表1.5示出用于测试的、调节至pH 7和pH 9的定制液体ADW洗涤剂配方的组成。
洗衣(HDL和HDD)和ADW洗涤剂的清洁性能
针对各种技术污垢：BMI(EMPA-116，棉花上的血液/奶/墨汁)、蛋(CS-38，蛋黄和加热熟化的颜料)和POM(CFT-C10，颜料/油/奶)，测试变体相对于亲本的清洁性能，用于基于洗衣的应用；并针对技术污垢：蛋黄(PAS-38，聚丙烯酸纤维(熟化和用炭黑染料着色)上的蛋黄)，测试变体相对于亲本的清洁性能，用于餐具应用。将EMPA-116、CS-38和CFT-C10样品用去离子水预漂洗20分钟并在室温下干燥过夜。将PAS-38织物用10mM CAPS缓冲液(pH 11)在60℃下在iEMS振荡器中以900rpm预漂洗30min，用2ml去离子水漂洗并干燥过夜。对于所有污渍，MTP板(康宁(Corning)3641)中的预先穿孔的样品由荷兰弗拉尔丁恩(Vlaardingen)的测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV)制备。在添加酶之前，将这些含微样品的板用洗涤剂填充。
稳定性测定通用样品设置
通过在升高的温度下孵育之后测量残余活性，在各种应激条件(缓冲液和洗涤剂如下表2所示)下测试变体的稳定性。设置升高的温度以获得应激的样品的约30％的残留活性(相比于无应激的样品)。将稀释的酶样品在应激源中混合，并测量无应激的蛋白酶活性。将应激源中的稀释样品在升高的温度下孵育并持续在表2中列出的时间段，然后通过AAPF或DMC水解测量应激蛋白酶活性。在用于稳定性测定之前，如上所述将洗涤剂酶热灭活。
对于非应激条件，立即测定酶对AAPF或DMC的活性(见上文)。对于应激条件，将PCR板密封并使用Eppendorf 385 MasterCycler Pro热循环仪或PTC-200 Peltier热循环仪在升高的温度下孵育5分钟，然后测定活性。如上所述，通过水解合成底物或通过DMC法测量有应激的和无应激的活性。％残留活性是通过取应激活性与非应激活性的比例并乘以100来计算的。通过将变体的残留活性除以亲本的残留活性获得稳定性PI。
将酶的等分试样添加到含有微样品的洗涤剂填充的MTP中，达到最终体积为200μL，用于衣物洗涤测定，最终酶浓度为0.5-5ppm。使用HDL或HDD配方的衣物洗涤清洁测定在25℃下进行15-30分钟，而ADW测定在40℃下进行30分钟。孵育后，将100-150μL的上清液转移到新鲜的MTP中，并且使用SpectraMax酶标仪在600nm处读取EMPA-116样品的吸光度或在405nm处读取CS-10、CS-38和PAS-38样品的吸光度。通过从每个样品值中减去空白对照(无酶)的值来获得吸光度结果。通过将给定变体的吸光度值除以相同浓度的预测亲本的吸光度值来获得每种测定条件下的清洁PI。通过将纯化的亲本样品的标准曲线拟合成朗缪尔拟合来确定亲本值。
熟化衣物清洁测定
(A)MTP测定：96孔MTP的每孔都装填迷你搅拌盘，然后加入270μL 100％宝莹非生物洗涤剂。将18.1μl的、稀释至约500ppm的酶上清液添加到洗涤剂填充的MTP中，并使用磁性滚压混合装置(V&P科技公司(V&P Scientific)的VP710系列)混合5分钟。对于初始时间点(T＝0)，将25μL含酶洗涤剂转移到填充有125μL缓冲液(5mM HEPES，250ppm 3:1Ca:Mg水硬度，pH 8)的MTP上。然后将5μL等分试样的、在洗涤剂中稀释的酶添加到185μL缓冲液(5mMHEPES，250ppm硬度，pH 8)中，该缓冲液被预先添加到含EMPA-116 BMI微样品的MTP中。在时间点0(T＝0)，按照上述用于即时清洁(fresh cleaning)的类似方式进行清洁测定。对于剩余的时间点，将洗涤剂酶板在37℃下孵育3天或3周或在55℃下孵育：1.5h、5h或24h；在每个时间点结束时取出等分试样；并且按照上述用于即时清洁的类似方式进行清洁测定。通过将各种剩余时间点的清洁与T＝0时的初始清洁进行比较，获得残留清洁值。
(B)圆锥管测定：将澄清的酶培养物上清液和100％测试HDL 1洗涤剂添加到15mL聚苯乙烯离心管中，终体积为1.1mL，以使洗涤剂中的最终酶浓度达到88ppm。立即从管中取出每种变体的5μL样品并冷冻以便稍后作为初始时间点(T＝0)进行测定。将样品在37℃下孵育3天。孵育后，取出5μL样品并冷冻。为了制备用于清洁测定的样品，将所有样品解冻并向样品中添加660μL缓冲液(5mM HEPES、250ppm 3:1Ca:Mg水硬度，pH 8)。将200μL等分试样的稀释样品添加到含有EMPA-116BMI微样品的MTP中。衣物洗涤清洁测定在25℃下在以1400rpm振荡的iEMS孵育器中进行60min。在孵育后，将120μL上清液转移到新鲜的MTP中，并使用SpectraMax板读数器在600nm下读取吸光度。通过从每个样品值中减去空白对照(无酶)的值来获得吸光度结果。每种变体的残留清洁计算为3天后的剩余清洁与T＝0时的清洁之比，并报告为剩余清洁百分比。
实例2
AprL进化枝蛋白酶变体的组合设计与表达
对芽孢杆菌属物种AprL和地衣芽孢杆菌Bra7 BliD02339枯草杆菌蛋白酶(它们都是AprL进化枝的成员)进行修饰以产生具有改善的清洁性能和洗涤剂稳定性的AprL-进化枝白酶变体。AprL进化枝在2016年5月13日提交的并公开为WO 2016183509的国际申请号PCT/US 16/32514中更全面地进行了描述。
成熟AprL亲本酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码AprL亲本蛋白酶的合成基因(SEQ ID NO:1)由GeneArt，生命技术公司(Life Technologies)合成并用于利用常规分子生物学技术产生变体序列(参见，例如，Sambrook等人，“Molecular Cloning[分子克隆]”,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社])。还合成了编码AprL变体的基因。然后将各种AprL基因克隆到pHYT表达载体(衍生自pHY300PLK(Takara-Clontech公司))中。表达载体含有aprE启动子(SEQ ID NO:3)、aprE信号肽(SEQ ID NO:4)、AprL前肽(SEQ ID NO:5)和BPN'终止子序列(SEQ ID NO:6)。使用本领域已知的技术引入编码各种目的成熟蛋白酶序列(野生型和变体)的DNA片段。用含有AprL亲本和蛋白酶变体基因序列的表达质粒转化合适的枯草芽孢杆菌宿主菌株。细胞在培养基(基于MOP缓冲液的富集的半限定培养基，尿素为主要氮源，葡萄糖为主要碳源，补充1％大豆胨用于稳健细胞生长，含有抗生素选择)中的96孔MTP中在32℃，300rpm下在具有80％湿度的振荡孵育器中生长2天。离心和过滤后，将含有目的蛋白酶的澄清培养物上清液用于测定。使用相同的方法用于BliD02339野生型和变体表达盒构建、随后的枯草芽孢杆菌宿主菌株转化和培养。
在一些情况下，AprL变体由靶向枯草芽孢杆菌aprE基因座的整合盒产生。将编码目的基因的DNA池引入表达盒中，随后使用本领域已知的方法将其整合到合适的枯草芽孢杆菌菌株的染色体中。DNA片段含有以下成分：BPN’终止子(SEQ ID NO:6)、来自金黄色葡萄球菌的氯霉素抗性标记(SEQ ID NO:165)、枯草芽孢杆菌aprE启动子(SEQ ID NO:3)、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列(SEQ ID NO:4)和AprL前肽(SEQ ID NO:5)，是表达盒的一部分。如上所述培养转化细胞，并类似地分离目的蛋白。
实例3
AprL变体在衣物洗涤应用中的性能评价
如实例3-7中所述评价如实例2中所述制备并列于表3中的AprL亲本蛋白酶(SEQID NO:2)的变体(下文称为“AprL变体”)的清洁性能和稳定性。
使用EMPA-116 BMI污垢和以下衣物洗涤剂：超级科克兰HDD、彩色奥妙HDD、SurfExcel、科克兰超净HDL、奥妙克莱因&克拉克蒂格HDL、和蓝月亮HDL在实例1中所述的衣物洗涤清洁性能测定中测试表3中所述的AprL变体。表4中列出了相对于AprL亲本具有PI>1.1的表3 AprL变体。
实例4
在餐具洗涤应用中AprL变体的性能评价
在实例1中所述的ADW清洁性能测定中使用PAS-38蛋黄污垢和以下ADW洗涤剂：GSM-B pH 10、GSM-B pH 9、多效合一、Quantum和多效合一测试表3中所述的AprL变体。表5列出了在这些ADW洗涤剂中的至少一种中相对于AprL亲本具有PI>1.01的AprL变体(列出于表3中)。表6列出了在这些ADW洗涤剂的全部中相对于AprL亲本具有PI>1.01的表3的AprL变体。
实例5
具有改善的稳定性的AprL变体
在实例1中所述的稳定性测定中在以下洗涤剂和缓冲液：LAS-EDTA缓冲液在53.5℃，10％超级科克兰HDL pH 8.2在56℃、和奥妙克莱因&克拉克蒂格HDL pH 8.2在51℃中测试表3中所述的AprL变体。表7中列出了具有(i)在实例1中所述的稳定性测定中的至少一个中相对于AprL亲本的稳定性PI>1.1，和(ii)在实例1中所述的衣物洗涤和ADW清洁性能测定中清洁PI>1.01的表3中的AprL变体。表8中示出了实例1中所述的衣物洗涤(HDL或HDD)、ADW、或稳定性测定中的至少一个中相对于AprL亲本具有PI>1.1的表3中的AprL变体。
实例6
另外的AprL变体的性能评价
在实例1所述的蛋白酶活性测定(AAPF或DMC测定)中、实例1中所述的衣物清洁性能测定中(使用EMPA-116 BMI污垢和All HDL和奥妙克莱因&克拉克蒂格HDL洗涤剂)、实例1所述的ADW清洁性能测定中(使用PAS-38蛋黄污垢和GSM-B pH 10和Quantum餐具洗涤剂)以及在实例1中所述的稳定性测定中(在以下缓冲液：LAS-EDTA缓冲液，在53.5℃；和Tris-EDTA缓冲液，在51℃)中，测试了表3中所述的AprL变体。表9中列出了相对于AprL亲本具有衣物清洁PI>1.01的表3中的AprL变体。表10中列出了相对于AprL亲本具有ADW清洁PI>1.01的表3中的AprL变体。表11中列出了相对于AprL亲本具有稳定性PI>1.01的表3中的AprL变体。表12中列出了在至少一种洗涤剂中相对于AprL亲本具有衣物清洁、ADW清洁和稳定性PI>1.01的表3中的AprL变体。
实例7
AprL变体在不含硼的洗涤剂中的清洁性能
纯化的AprL变体：M123I-Q136R、M123I-Q136R-G165Q、V045R-Q136R-G165Q-S258E、V045R-M123I-Q136R-G165Q-S258E和V045R-M123I-Q136R的清洁性能在以下洗涤剂中测试，这些洗涤剂不含可检测量的硼或含硼化合物：All 3X、Dirt Lift和宝莹非生物。在实例1中所述的衣物清洁性能测定中测试这些AprL变体。表13中示出了结果，为相对于AprL亲本计算的PI。以2.5ppm的剂量测试这些蛋白酶。通过元素分析来定量本实例的不含硼的洗涤剂中存在的硼的量，并且在所有情况下，仅检测到痕量(小于5mg)硼/kg洗涤剂。
实例8
AprL和BliD02339蛋白酶变体的清洁性能和洗涤剂稳定性
如实例2中所述产生表14中列出的AprL变体。在实例1中所述的一个或多个清洁性能或稳定性测定中测试表14变体的清洁性能和稳定性。
针对EMPA-116微样品在测试HDL 1和宝莹非生物(Persil Non-Bio)洗涤剂(表1.1，测定条件8和10)中测试表14中列出的AprL变体的衣物清洁性能。在10％测试HDL 1洗涤剂中在52.5℃和/或54℃(表2，测定条件5)中测试酶稳定性。表15示出了结果，其为当与AprL亲本相比时的PI值，其中ND表示未确定。
表17列出了根据实例1中所述的衣物清洁性能和稳定性测定测试的AprL变体的性能：(i)在宝莹非生物、测试HDL 1和测试HDL 2洗涤剂中针对EMPA-116、CFT CS-38和CFT-C10微样品的清洁性能，和(ii)在10％PNB在63℃持续15-20min和/或10％测试HDL 1在60℃持续15-20min的稳定性。清洁性能结果报告为相对于SQCBV35变体(SEQ ID NO:63)的PI值，并且稳定性结果报告为相对于无应激条件应激后样品的剩余活性％。ND表示该值是未确定的。
在表18所述的BliD02339亲本蛋白酶的变体(SEQ ID NO:9)(下文称“BliD变体”)如实例2中所述产生并且如实例1中所述测定清洁性能和稳定性。
表18列出了BliD变体，当在宝莹非生物和测试HDL 2衣物洗涤剂中测试时，其示出针对3种技术污垢微样品：EMPA-116、CFT CS-38和CFT-C10的清洁性能相对于BliD亲本的改善，并且当在10％宝莹非生物(PNB)衣物洗涤剂(在63℃应激持续15-20min)中测试还示出改善的稳定性。清洁性能和稳定性结果列于表19中。清洁性能结果报告为相对于BliD亲本(SEQ ID NO:9)的PI值，并且稳定性结果报告为相对于无应激条件应激后样品的剩余活性％。ND表示该值是未确定的。
实例9
AprL蛋白酶与相关分子的比较
鉴定同源蛋白酶
针对NCBI非冗余蛋白质数据库(NCBI non-redundant protein database)，通过BLAST搜索(Altschul等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],25:3389-402,1997)鉴定了与AprL蛋白酶(SEQ ID NO:2)相关的蛋白质，并在表20中示出了一个子集。在基因组查询专利数据库(Genome Quest Patent database)上运行类似的搜索，其中搜索参数设置为默认值，并且子集示出在表21中。将AprL蛋白酶(SEQ ID NO:2)的成熟氨基酸序列(274个氨基酸)用作两种搜索的查询序列。将两个搜索集的百分比同一性(PID)定义为相同残基的数量除以成对比对中经比对残基的数量。标记为“序列长度”的列对应于标记为“登录号”的列中由登录号标识的蛋白质的长度(以氨基酸计)，而“比对长度”是指用于比对和PID计算的序列的长度(以氨基酸计)。
枯草杆菌蛋白酶序列与AprL的比对
成熟AprL(SEQ ID NO:2)和BliD02339(SEQ ID NO:9)蛋白质的氨基酸序列与表20和21中的多种枯草杆菌蛋白酶的成熟序列使用具有默认参数的CLUSTALW软件(Thompson等人,Nucleic Acids Research[核酸研究],22:4673-4680,1994)进行比对。这一比对在图1中示出，其中一种或多种氨基酸基序周围画了一个框，所述氨基酸基序选自SEQ ID NO:166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178和179。
实例10
包括AprL和BliD02339的枯草杆菌蛋白酶的***发生树
AprL蛋白(SEQ ID NO:2)、BliD02339蛋白(SEQ ID NO:9)、AprL蛋白酶变体：SQM-30(SEQ ID NO:36)、SQCBV 20(SEQ ID NO:57)、SQCBV 35(SEQ ID NO:63)、SQCBV37(SEQ IDNO:65)、SQCBV188(SEQ ID NO:105)、SQCBV269(SEQ ID NO:140)、SQBLV134(SEQ ID NO:160)、SQCBV328(SEQ ID NO:268)、SQCBV419(SEQ ID NO:302)、SQCBV555(SEQ ID NO:358)、SQCBV567(SEQ ID NO:370)和SQCBV582(SEQ ID NO:384)的成熟序列的***发生树使用表20和21中示出的枯草杆菌蛋白酶的序列的子集构建。在Vector NTI Advance套件中输入序列，并且使用邻接(NJ)法创建引导树(Guide Tree)(Saitou,N.；和Nei,M.(1987)Mol BiolEvol[分子生物学与进化]4,406-425)。NJ法用于待分析的所有序列对之间的距离矩阵。这些距离与序列之间的散度有关。在序列比对后计算引导树。使用以下参数计算树状构建体：针对序列距离的木村(Kimura)校正并且忽略具有空位的位置。使用MEGA 6程序来显示图2中所示的***发生树。基于***发生树的分布，某些枯草杆菌蛋白酶如图2所示被分组以形成AprL进化枝。
实例11
另外的AprL变体
如实例2所述产生了表22中列出的AprL变体。
实例12
另外的AprL变体的衣物清洁性能和洗涤剂稳定性
如实例1中所述测试表22中列出的AprL变体和SQCBV35的衣物清洁性能和稳定性。使用在宝莹非生物、蓝月亮和立白洗涤剂中的BMI(EMPA-116)微样品(表2，测定条件6、10和16)。在10％宝莹非生物、蓝月亮和立白洗涤剂中在62℃-65℃下测试酶稳定性(表2)。
表23示出了在宝莹非生物中的清洁性能结果，为相比于SQCBV35变体(SEQ ID NO:63)的PI值。表23还示出在10％PNB中在62℃15min、在10％蓝月亮在64℃15min、和在10％立白在65℃15min的稳定性结果，报告为相对于未应激条件应激后样品的剩余活性％。表24示出了在宝莹非生物(PNB)、蓝月亮和立白洗涤剂中的清洁性能结果，为相比于SQCBV35变体(SEQ ID NO:63)的性能指数(PI)值。表24还示出在10％PNB洗涤剂中在62℃15min、在10％蓝月亮洗涤剂在64℃15min、和在10％立白洗涤剂在65℃15min的稳定性结果，报告为相对于未应激条件应激后样品的剩余活性％。表25示出了使用了EMPA-116、CS-38和CFT-10污渍，在宝莹非生物洗涤剂中的清洁性能的结果，为相比于SQCBV35变体(SEQ ID NO:63)的PI值。表25还示出在10％PNB中在66℃20min、在10％蓝月亮在68℃20min、和在10％立白在69℃20min的稳定性结果，报告为相对于未应激条件应激后样品的剩余活性％。表26提供了在立白、蓝月亮和PNB洗涤剂中各种AprL变体的衣物清洁性能和稳定性的结果。我们在实例1表2中描述了稳定性条件。表27提供了在熟化衣物清洁测定中各种AprL变体的性能(如在实例1：熟化衣物清洁测定(A)中所述进行)。熟化清洁性能报告为在100％蓝月亮洗涤剂中在37℃下样品孵育3周后的％清洁活性。
实例13
另外的AprL变体的ADW清洁性能和洗涤剂稳定性
表22中列出的AprL蛋白酶变体、AprL wt和SQCBV35的清洁性能在基于餐具的应用(ADW)中使用表1.1中列出的各种洗涤剂配方以及在测定前预漂洗或未漂洗的预先穿孔的蛋黄微样品(PAS-38)进行测量。为了制备预漂洗的PAS-38样品，将180μl的10mM CAPS缓冲液pH 11添加到含有微样品的MTP中，并将板密封并在iEMS孵育器中在60℃和1100rpm下孵育30min。然后除去缓冲液，并且用去离子水漂洗样品并空气干燥。为了测量ADW配方中的酶清洁性，将175μL洗涤剂溶液(以374ppm水硬度制备的3g/L洗涤剂)添加到MTP的每个孔中，然后添加5μL酶。将MTP密封并在iEMS孵育器中在40℃和1100rpm下孵育30min。孵育后，将来自每孔的100μL洗涤液转移到新的MTP上，并且在SpectraMax酶标仪上测量在405nm处的该上清液的吸光度。通过从GSM-B pH 10.5配方中的每个样品中减去空白对照(无酶)的值来获得净吸光度。当使用定制液体ADW洗涤剂配方(在pH 7和9)时，在酶孵育后从MTP孔中除去所有上清液并将其转移到另一个MTP上以测定405nm处的吸光度。用去离子水漂洗MTP中的样品，然后每孔添加180μL的10mM CAPS缓冲液pH 11，并将板在iEMS孵育器中在40℃和1100rpm下再孵育10min。在最后一次孵育后，将100μL的所得洗涤液转移至新的MTP，并在405nm处测量吸光度。为了确定定制液体ADW洗涤剂配方中的总清洁性能(在pH 7和9下)，加上所取的两个吸光度测量值，并且施用该总值计算每种酶的性能指数(PI)。
在所有情况下，通过将减去空白的总吸光度除以亲本蛋白酶的总吸光度(在相同浓度下测试)来计算每种条件和蛋白酶变体的PI。从亲本蛋白酶的标准曲线确定亲本蛋白酶的值，该亲本蛋白酶包括在该测试中并拟合成朗缪尔(Langmuir)拟合。表28示出了在GSM-B pH 10.5或定制液体ADW洗涤剂配方(调节至pH 7和pH 9)中测试的AprL变体(使用漂洗或未漂洗的样品)的ADW性能结果。结果报告为与AprL野生型蛋白酶(“AprL wt”)相比的PI值。

Claims (29)

1.一种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在对应于SEQ ID NO:2的位置处的两个、三个或四个或更多个变异，其中所述位置选自：
(i)1、3、9、10、15、22、24、26、27、28、29、30、31、35、37、40、43、45、48、52、68、71、76、77、78、86、87、95、96、98、99、100、101、102、103、105、108、111、114、115、117、119、123、125、126、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、158、160、161、165、184、187、193、202、203、204、210、211、216、217、234、238、239、242、243、250、255、258、259、260、264和274；
(ii)1、3、9、10、15、22、24、26、28、29、30、31、35、37、40、45、48、52、68、71、76、77、78、86、87、95、96、98、99、100、101、102、105、108、111、114、115、117、119、123、125、126、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、158、160、161、165、184、187、193、202、203、204、210、211、216、217、234、238、239、242、243、250、255、258、259、260、264和274；
(iii)1、3、9、10、24、26、29、30、31、35、37、40、45、48、52、68、71、77、78、86、87、95、96、98、99、100、101、102、105、108、111、115、117、119、123、127、128、129、130、136、143、146、147、151、155、158、160、161、165、184、187、193、202、203、204、210、211、216、217、234、238、239、242、243、250、258、259、260、264和274；
(iv)3、9、10、35、68、77、78、86、87、99、101、115、123、127、128、165、184、187、202、203、210、217、242、250、258和264；或
(v)3、68、77、78、123、127、128、165、184、202、210、217和258；条件是所述两个、三个或四个或更多个变异中的一个或多个是人为突变或取代；
其中所述变体与包含基序A和/或基序B的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有至少85％但小于100％的氨基酸序列同一性；
其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；
其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且
其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
2.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含在对应于SEQ ID NO:2的两个、三个或四个或更多个位置处包含两个、三个或四个或更多个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述取代选自：
(i)1Q、3Q/V、9E、10M、15I、22Y、24N/Q、26Q、27R、28A、29S、30T、31I、35A、37T、40E、43A、45I/Q/R、48I/T/V、52R、68S、71A、76K、77D/E/H/N/Q/S、78I、86H/N/R、87S/T、95A/F/Q、96S、98H/R、99A/E/Q/S、100N、101A、102D/T、103I、105N、108H/K、111Q、114N、115F、117S、119Q、123I、125N、126Q、127E/F/Q/S/T/V、128P/R/S、129H/R、130S、136N/R、143Q/V、146A/S、147L、151G、155E/G/N、158D/N/Q、160C/D/K、161D/Q、165A/E/Q/S、184E/Q、187E/P、193D/Q、202V、203E/N/Q、204I、210E/H/I/P、211S、216Q、217S、234I/W、238Q/R、239K/S/T、242G/N、243I、250G、255R、258D/E/P、259E/P、260W、264H/Q/S和274A；
(ii)1Q、3Q/V、9E、10M、15I、22Y、24N/Q、26Q、28A、29S、30T、31I、35A、37T、40E、45I/Q/R、48I/T/V、52R、68S、71A、76K、77D/E/H/N/S、78I、86H/N/R、87S/T、95A/F/Q、96S、98K/R、99A/E/Q/S、100N、101A、102D/T、105N、108H/K、111Q、114N、115F、117S、119Q、123I、125N、126Q、127E/F/Q/S/T/V、128P/R/S、129H/R、130S、136N、143Q/V、146A/S、147L、151G、155E/G/N、158D/N/Q、160D/K、161D/Q、165A/E/Q/S、184E/Q、187E/P、193D/Q、194E、202V、203E/N/Q、204I、210I/P、211S、216Q、217S、234I/W、238Q/R、239K/S/T、242G/N、243I、250G、255R、258D/P、259E/P、260W、264H/Q/S和274A；
(iii)1Q、3V、9E、10M、24Q、26Q、29S、30T、31I、35A、37T、40E、45I/Q/R、48T/V、52R、68S、71A、77E/N、78I、86H/R、87S、95A/F、96S、98R、99A/E/Q/S、100N、101A、102D/T、105N、108H、111Q、115F、117S、119Q、123I、127E/Q/S/T/V、128P/R、129H/R、130S、136N、143Q/V、146A、147L、151G、155G/N、158D/N/Q、160D/K、161D/Q、165A/E/Q、184E/Q、187E/P、193Q、202V、203E/N/Q、204I、210I/P、211S、216Q、217S、234W、238Q、239S、242G/N、243I、250G、258D/P、259E/P、260W、264H/Q/S和274A；
(iv)3V、9E、10M、35A、68S、77N、78I、86H、87S、99Q/S、101A、115F、123I、127S/T、128P/R、165E/Q、184Q、187E、202V、203E、210P、217S、242G、250G、258D/P和264H；或
(v)3V、68S、77N、78I、123I、127S、128P、165Q、184Q、202V、210P、217S和258D/P。
3.如权利要求1或2所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：
(i)A/G1Q、T3Q/V、P/S9E、L/Q10M、K15I、K22Y、A24N/Q、V26Q、K27R、G/V28A、A/G29S、I/V30T、I/L31I、I35A、A/S37T、P/S/T40E、N/K43A、S/V45I/Q/R、A48I/T/V、A/S52R、A68S、V71A、N76K、S/T77D/E/H/N/Q/S、T78I、N/S86H/N/R、V87S/T、L95A/F/Q、N96S、S98H/R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S/T102D/T、Y103I、A/G105N、S108H/K、E111Q、T114N、A/Q/S/T115F、G/N117S、D119Q、M123I、L125N、G126Q、G127E/F/Q/S/T/V、A/P/S128P/R/S、S129H/R、G/V130S、Q136N/R、A/S143Q/V、A/I/V146A/S、V147L、A/S151G、S155E/G/N、S158D/N/Q、N/S/Y160C/D/K、A/S/Q/T161D/Q、G165A/E/Q/S、N/Q184E/Q、S187E/P、A/P/S193D/Q、A/S202V、A/G/S203E/N/Q、V204I、S/T210E/H/I/P、N211S、L216Q、N217S、L234I/W、P238Q/R、A/N/T239K/S/T、A242G/N、S243I、S250G、N/Y255R、D/S258D/E/P、S259E/P、F260W、K/N/R264H/Q/S和Q274A；
(ii)A1Q、T3Q/V、P9E、L10M、K15I、K22Y、A24N/Q、V26Q、K27R、V28A、A29S、V30T、L31I、I35A、A37T、P40E、N43A、V45I/Q/R、A48I/T/V、A52R、A68S、V71A、N76K、S77D/E/H/N/Q/S、T78I、S86H/N/R、V87S/T、L95A/F/Q、N96S、S98H/R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S102D/T、Y103I、G105N、S108H/K、E111Q、T114N、T115F、G117S、D119Q、M123I、L125N、G126Q、G127E/F/Q/S/T/V、A128P/R/S、S129H/R、G130S、Q136N/R、A143Q/V、V146A/S、V147L、A151G、S155E/G/N、S158D/N/Q、N160C/D/K、T161D/Q、G165A/E/Q/S、N184E/Q、S187E/P、A193D/Q、A202V、G203E/N/Q、V204I、T210E/H/I/P、N211S、L216Q、N217S、L234I/W、P238Q/R、N239K/S/T、A242G/N、S243I、S250G、Y255R、S258D/E/P、S259E/P、F260W、K264H/Q/S和Q274A；
(iii)A/G1Q、T3Q/V、P/S9E、L/Q10M、K15I、K22Y、A24N/Q、V26Q、G/V28A、A/G29S、I/V30T、I/L31I、I35A、A/S37T、P/S/T40E、S/V45I/Q/R、A48I/T/V、A/S52R、A68S、V71A、N76K、S/T77D/E/H/N/S、T78I、N/S86H/N/R、V87S/T、L95A/F/Q、N96S、S98R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S/T102D/T、A/G105N、S108H/K、E111Q、T114N、A/Q/S/T115F、G/N117S、D119Q、M123I、L125N、G126Q、G127E/F/Q/S/T/V、A/P/S128P/R/S、S129H/R、G/V130S、Q136N、A/S143Q/V、A/I/V146A/S、V147L、A/S151G、S155E/G/N、S158D/N/Q、N/S/Y160D/K、A/S/Q/T161D/Q、G165A/E/Q/S、N/Q184E/Q、S187E/P、A/P/S193D/Q、A/S202V、A/G/S203E/N/Q、V204I、S/T210I/P、N211S、L216Q、N217S、L234I/W、P238Q/R、A/N/T239K/S/T、A242G/N、S243I、S250G、N/Y255R、D/S258D/P、S259E/P、F260W、K/N/R264H/Q/S和Q274A；
(iv)A1Q、T3Q/V、P9E、L10M、K15I、K22Y、A24N/Q、V26Q、V28A、A29S、V30T、L31I、I35A、A37T、P40E、V45I/Q/R、A48I/T/V、A52R、A68S、V71A、N76K、T77D/E/H/N/S、T78I、S86H/N/R、V87S/T、L95A/F/Q、N96S、S98R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S102D/T、G105N、S108H/K、E111Q、T114N、T115F、G117S、D119Q、M123I、L125N、G126Q、G127E/F/Q/S/T/V、A128P/R/S、S129H/R、G130S、Q136N、A143Q/V、V146A/S、V147L、A151G、S155E/G/N、S158D/N/Q、N160D/K、T161D/Q、G165A/E/Q/S、N184E/Q、S187E/P、A193D/Q、A202V、G203E/N/Q、V204I、T210I/P、N211S、L216Q、N217S、L234I/W、P238Q/R、N239K/S/T、A242G/N、S243I、S250G、Y255R、S258D/P、S259E/P、F260W、K264H/Q/S和Q274A；
(v)A/G1Q、T3V、P/S9E、L/Q10M、A24Q、V26Q、A/G29S、I/V30T、I/L31I、I35A、A/S37T、P/S/T40E、S/V45I/Q/R、A48T/V、A/S52R、A68S、V71A、S/T77E/N、T78I、N/S86H/R、V87S、L95A/F、N96S、S98R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S/T102D/T、A/G105N、S108H、E111Q、A/Q/S/T115F、G/N117S、D119Q、M123I、G127E/Q/S/T/V、A/P/S128P/R、S129H/R、G/V130S、Q136N、A/S143Q/V、A/I/V146A、V147L、A/S151G、S155G/N、S158D/N/Q、N/S/Y160D/K、A/S/Q/T161D/Q、G165A/E/Q、N184E/Q、S187E/P、A/P/S193Q、A/S202V、A/G/S203E/N/Q、V204I、S/T210I/P、N211S、L216Q、N217S、L234W、P238Q、A/N/T239S、A242G/N、S243I、S250G、D/S258D/P、S259E/P、F260W、K/N/R264H/Q/S和Q274A；
(vi)A1Q、T3V、P9E、L10M、A24Q、V26Q、A29S、V30T、L31I、I35A、A37T、P40E、V45I/Q/R、A48T/V、A52R、A68S、V71A、T77E/N、T78I、S86H/R、V87S、L95A/F、N96S、S98R、G99A/E/Q/S、S100N、G101A、S102D/T、G105N、S108H、E111Q、T115F、G117S、D119Q、M123I、G127E/Q/S/T/V、A128P/R、S129H/R、G130S、Q136N、A143Q/V、V146A、V147L、A151G、S155G/N、S158D/N/Q、N160D/K、T161D/Q、G165A/E/Q、N184E/Q、S187E/P、A193Q、A202V、G203E/N/Q、V204I、T210I/P、N211S、L216Q、N217S、L234W、P238Q、N239S、A242G/N、S243I、S250G、S258D/P、S259E/P、F260W、K264H/Q/S和Q274A；
(vii)T3V、P/S9E、L/Q10M、I35A、A68S、S/T77N、T78I、N/S86H、V87S、G99Q/S、G101A、A/Q/S/T115F、M123I、G127S/T、A/P/S128P/R、G165E/Q、N184Q、S187E、A/S202V、A/G/S203E、S/T210P、N217S、A242G、S250G、D/S258D/P和K/N/R264H；
(viii)T3V、P9E、L10M、I35A、A68S、T77N、T78I、S86H、V87S、G99Q/S、G101A、T115F、M123I、G127S/T、A128P/R、G165E/Q、N184Q、S187E、A202V、G203E、T210P、N217S、A242G、S250G、S258D/P和K264H；
(ix)T3V、A68S、S/T77N、T78I、M123I、G127S、A/S128P、G165Q、N184Q、A/S202V、S/T210P、N217S和D/S258D/P；或
(x)T3V、A68S、T77N、T78I、M123I、G127S、A128P、G165Q、N184Q、A202V、T210P、N217S和S258D/P。
4.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，条件是：
(i)在对应于SEQ ID NO:2的位置处的所述变异不是***或缺失；
(ii)当所述变体的氨基酸序列在选自位置37、187、193和258的一个或多个对应的SEQID NO:2位置处包含变异时，该变异不是脯氨酸；
(iii)当所述变体的氨基酸序列在选自位置26、38、234和250的两个或更多个对应的SEQ ID NO:2位置处包含变异时，所述变异不是26R、38S、234R、或250E/N；
(iv)当所述变体的氨基酸序列在位置128处包含变异时，在对应于SEQ ID NO:2的位置处的所述变异不是在位置130或193处；和/或
(v)所述变体不是由WO 2016074925中的SEQ ID NO:5或JP201300714中的SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列组成的。
5.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，条件是：
(i)当所述变体的氨基酸序列在位置37、187、193和258中的一个或多个处包含取代时，所述取代不是脯氨酸；
(ii)当所述变体的氨基酸序列在位置26、38、234和250中的两个或更多个处包含取代时，所述取代不是26R、38S、234R或250E/N；
(iii)当所述变体的氨基酸序列在位置128处包含取代时，所述取代不是在位置130或193处；和/或
(iv)所述变体不是由WO 2016074925中的SEQ ID NO:5或JP201300714中的SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列组成的。
6.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含一个或多个选自以下的氨基酸取代组：
(i)T77N-G165Q、T77N-N217S、G165Q-N217S、A68S-T77N、N184Q-N217S、A68S-G165Q、G165Q-N184Q、T77N-A128P、T77N-N184Q、A68S-N217S、A128P-N217S、A128P-G165Q、A68S-A128P、A68S-N184Q、A128P-N184Q、T3V-N217S、A202V-N217S、T3V-T77N、T3V-N184Q、N184Q-A202V、G165Q-A202V、M123I-G165Q、T3V-G165Q、T3V-A128P、T3V-A68S、T77N-A202V、M123I-N217S、A68S-A202V、M123I-N184Q、A128P-A202V、T77N-M123I、T3V-A202V、N217S-S258P、A68S-M123I、N184Q-S258P、G165Q-S258P、M123I-A128P、T77N-S258P、T3V-M123I、A128P-S258P、A202V-S258P、A68S-S258P、T3V-S258P、M123I-A202V、M123I-S258P、A68S-G127S、G127S-A128P、T77N-G127S、G127S-A202V、G127S-N184Q、G127S-N217S、G127S-G165Q、T3V-G127S、G127S-S258P、M123I-G127S、T77N-T210P、G165Q-T210P、T210P-N217S、A128P-T210P、A68S-T210P、N184Q-T210P、T210P-S258P、A202V-T210P、M123I-T210P、T3V-T210P、G127S-T210P、G127T-N184Q、G127T-N217S、V87S-G165Q、M123I-Q136R、A68S-G127T、G127T-A128P、T77N-V87S、G127T-G165Q、T77N-G127T、T78I-A202V、A68S-S258D、G165Q-S258D、T77N-S258D、T77N-T78I、T78I-G165Q、N184Q-S258D、N217S-S258D、P9E-M123I、A128P-A242G、A202V-S258D、A68S-T78I、G165Q-A242G、T77N-A242G、T78I-A128P、T78I-G127S、P9E-G165Q、Q136R-G165Q、T78I-N184Q、V87S-A128P、V87S-N217S、A68S-V87S、G127T-A202V、I35A-T77N、T3V-T78I、T78I-N217S、A68S-A242G、A68S-G99S、G99S-A128P、G99S-G165Q、I35A-G165Q、L10M-A202V、T3V-G127T、T77N-G99S、T78I-S258P、V45R-M123I、V87S-M123I、M123I-N239S、P9E-N184Q、S155G-G165Q、T78I-M123I、V45R-Q136R、V87S-A202V、A128P-S258D、I35A-A202V、M123I-G127T、M123I-S258D、N184Q-N239S、P9E-N217S、Q136R-S258E、S86H-S258P、T3V-A242G、T3V-S258D、G99S-N184Q、G99S-N217S、I35A-V87S、N217S-A242G、P9E-Q136R、G127T-S258P、I35A-A128P、I35A-A68S、I35A-N217S、L10M-M123I、P9E-S258P、P9E-T210P、P9E-T77N、S86H-A202V、S86H-G165Q、S86H-N184Q、T77N-S155G、T77N-V147L、T78I-T210P、V87S-S155G、A202V-A242G、A242G-S258P、A68S-G165E、G127S-A242G、G165E-N184Q、G165E-N217S、M123I-S258E、N184Q-A242G、S86H-T115F、T3V-G99S、V147L-G165Q、A128R-G165Q、A128R-S258D、A68S-A128R、A68S-V147L、G127S-S258D、G165E-A202V、G165Q-S258E、G165S-T210P、G203E-T210P、G99S-G127S、G99S-M123I、G99S-T210P、L10M-A128P、L10M-A68S、L10M-N184Q、L10M-N217S、L10M-S258P、L10M-T77N、M123I-A242G、M123I-G165E、M123I-S187P、N239S-S258P、P9E-A128P、P9E-A202V、P9E-A68S、P9E-V45R、Q136R-N184Q、Q136R-N239S、S86H-N217S、T115F-S258P、T210P-A242G、T3V-G165E、T3V-L10M、T3V-P9E、T77N-A128R、T77N-G165E、T78I-A242G、V45R-G165Q、V87T-M123I、V87T-N184Q、V87T-N239S、V87T-Q136R、A68S-G101A、A68S-V71A、G101A-A128P、G101A-G165Q、G101A-S258P、G165A-N184Q、G165E-S258P、G99S-S258P、I35A-M123I、K15I-G165S、K15I-T210P、L10M-G127S、L10M-G165Q、Q136R-S187P、S187E-A202V、S187P-S258P、S250G-S258P、T115F-A202V、T115F-G165Q、T3V-G101A、T3V-I35A、T3V-V87S、T77N-G101A、T77N-G203E、T78I-S258D、V71A-G165Q、V71A-T77N、V87S-S258P、V87S-V147L、A128P-G165E、A128P-S155G、A128P-V147L、A128R-A202V、A128R-N184Q、A128R-N217S、A1Q-S86H、A68S-G99Q、A68S-S155G、G101A-A202V、G101A-G127S、G101A-N184Q、G101A-N217S、G165Q-G203E、G165Q-N239S、G165S-N239S、G99Q-A128P、G99Q-G165Q、G99Q-N184Q、G99Q-N217S、G99S-A242G、I35A-N184Q、I35A-T78I、I35A-V147L、L10M-T210P、L10M-T78I、M123I-G165S、N184Q-G203E、N184Q-S187P、N43A-M123I、P9E-G127S、P9E-S258E、Q136R-S258P、T115F-N217S、T3V-S86H、T77H-M123I、T77H-N184Q、T77H-N239S、T77H-Q136R、T77H-V87T、T77N-G99Q、T77N-S250G、T78I-G99S、T78I-V87S、V146S-G165S、V146S-N239S、V146S-T210P、V45R-S258E、V87S-A242G、V87S-N184Q、A128S-T210P、A143V-A202V、A143V-G165Q、A143V-S258P、A1Q-N184Q、A1Q-S258P、A68S-G203E、A68S-S187E、A68S-T114N、G101A-M123I、G101A-T210P、G165A-N217S、G165Q-S187P、G99Q-A202V、G99S-A202V、I35A-A242G、I35A-S258P、L10M-I35A、L10M-V87S、M123I-A128R、M123I-V146S、N184Q-S187E、N217S-L234W、N239S-S250G、N43A-Q136R、N43A-V45R、P9E-N239S、P9E-V87T、S155G-N217S、S187E-N217S、S86H-A143V、S86H-Q274A、S86H-S250G、T114N-A128P、T114N-G165Q、T114N-N184Q、T114N-N217S、T115F-A143V、T115F-N184Q、T210P-N239S、T210P-S250G、T3V-A128R、T3V-G99Q、T77H-G165Q、T77N-S187E、T77N-T114N、V147L-N217S、V45R-N184Q、V71A-N184Q、V71A-N217S、V71A-T210P、T77N-G165Q-N217S、A68S-T77N-G165Q、T77N-N184Q-N217S、A68S-T77N-N217S、T77N-A128P-G165Q、T77N-A128P-N217S、A68S-T77N-A128P、G165Q-N184Q-N217S、T77N-G165Q-N184Q、A68S-A128P-G165Q、A68S-G165Q-N217S、A128P-N184Q-N217S、A128P-G165Q-N217S、A68S-A128P-N217S、A68S-N184Q-N217S、A68S-T77N-N184Q、T77N-A128P-N184Q、A68S-G165Q-N184Q、A128P-G165Q-N184Q、A68S-A128P-N184Q、T3V-N184Q-N217S、T3V-T77N-N217S、N184Q-A202V-N217S、T3V-T77N-N184Q、T3V-A128P-N217S、T3V-T77N-A128P、G165Q-A202V-N217S、T3V-A128P-N184Q、T77N-A202V-N217S、T3V-G165Q-N217S、T3V-T77N-G165Q、T3V-A68S-N217S、T3V-A68S-T77N、A68S-A202V-N217S、T3V-G165Q-N184Q、A128P-A202V-N217S、G165Q-N184Q-A202V、T77N-G165Q-A202V、T77N-N184Q-A202V、T3V-A128P-G165Q、T3V-A68S-A128P、T3V-A68S-N184Q、A128P-N184Q-A202V、A68S-N184Q-A202V、A68S-T77N-A202V、T3V-A68S-G165Q、T77N-A128P-A202V、A128P-G165Q-A202V、A68S-A128P-A202V、A68S-G165Q-A202V、M123I-G165Q-N217S、M123I-N184Q-N217S、T77N-M123I-G165Q、T77N-M123I-N217S、T3V-A202V-N217S、M123I-G165Q-N184Q、T77N-M123I-N184Q、T3V-N184Q-A202V、A68S-M123I-N217S、T3V-T77N-A202V、T3V-A128P-A202V、T3V-G165Q-A202V、M123I-A128P-N217S、T3V-A68S-A202V、A68S-M123I-N184Q、A68S-T77N-M123I、M123I-A128P-N184Q、T3V-M123I-N217S、T77N-M123I-A128P、A68S-M123I-G165Q、M123I-A128P-G165Q、A68S-M123I-A128P、N184Q-N217S-S258P、T3V-M123I-N184Q、T3V-M123I-G165Q、T3V-T77N-M123I、T77N-N217S-S258P、G165Q-N217S-S258P、T3V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123I-S258P、T3V-T77N-G127S、A68S-G127S-S258P、G127S-A128P-S258P、M123I-A128P-S258P、T3V-G127S-A202V、T3V-G127S-N184Q、T3V-G127S-N217S、A68S-M123I-S258P、T3V-G127S-G165Q、T77N-G127S-S258P、M123I-G165Q-S258P、T77N-M123I-S258P、G127S-A202V-S258P、G127S-N184Q-S258P、G127S-N217S-S258P、T3V-G127S-S258P、G127S-G165Q-S258P、A68S-M123I-G127S、M123I-G127S-A128P、M123I-G127S-A202V、M123I-G127S-N184Q、M123I-G127S-N217S、T77N-M123I-G127S、T3V-M123I-G127S、M123I-G127S-G165Q、M123I-G127S-S258P、A68S-A128P-T210P、A68S-T77N-T210P、T77N-A128P-T210P、N184Q-A202V-T210P、T3V-A128P-T210P、T3V-A68S-T210P、T3V-T77N-T210P、T77N-G165Q-T210P、T77N-T210P-S258P、A128P-G165Q-T210P、A128P-T210P-S258P、A202V-T210P-N217S、A68S-G165Q-T210P、A68S-T210P-S258P、N184Q-T210P-N217S、T3V-G165Q-T210P、T77N-A202V-T210P、A128P-A202V-T210P、A128P-N184Q-T210P、A128P-T210P-N217S、A202V-T210P-S258P、A68S-A202V-T210P、A68S-N184Q-T210P、A68S-T210P-N217S、G165Q-A202V-T210P、G165Q-T210P-S258P、T3V-A202V-T210P、T3V-N184Q-T210P、T3V-T210P-S258P、T77N-N184Q-T210P、T77N-T210P-N217S、G165Q-N184Q-T210P、N184Q-T210P-S258P、T210P-N217S-S258P、T3V-T210P-N217S、G165Q-T210P-N217S、A68S-G127S-T210P、G127S-A128P-T210P、T77N-G127S-T210P、G127S-T210P-S258P、T3V-G127S-T210P、G127S-G165Q-T210P、A68S-M123I-T210P、G127S-A202V-T210P、G127S-N184Q-T210P、G127S-T210P-N217S、M123I-A128P-T210P、M123I-A202V-T210P、M123I-N184Q-T210P、M123I-T210P-N217S、T3V-M123I-T210P、T77N-M123I-T210P、M123I-G165Q-T210P、M123I-T210P-S258P、A68S-G165Q-S258D、A68S-T77N-S258D、T77N-G165Q-S258D、T77N-T78I-G165Q、A68S-N184Q-S258D、A68S-N217S-S258D、G127T-N184Q-N217S、G165Q-N184Q-S258D、G165Q-N217S-S258D、M123I-G127S-T210P、T77N-N184Q-S258D、T77N-N217S-S258D、A68S-T77N-T78I、A68S-T78I-A128P、A68S-T78I-G127S、A68S-T78I-G165Q、T77N-T78I-A128P、T77N-T78I-G127S、T78I-A128P-G165Q、T78I-G127S-A128P、T78I-G127S-G165Q、A68S-G127T-N184Q、A68S-G127T-N217S、N184Q-N217S-S258D、T77N-T78I-N184Q、T78I-G165Q-N184Q、A202V-N217S-S258D、A68S-A202V-S258D、G127T-A128P-N184Q、G127T-A128P-N217S、G127T-A202V-N217S、G127T-N184Q-A202V、G165Q-A202V-S258D、T3V-T77N-T78I、T3V-T78I-G165Q、T77N-A202V-S258D、T77N-T78I-A202V、T77N-T78I-N217S、T78I-G165Q-A202V、T78I-G165Q-N217S、T78I-N184Q-A202V、T78I-N184Q-N217S、A68S-G127T-A128P、A68S-T78I-A202V、A68S-T78I-N184Q、A68S-T78I-N217S、G127T-G165Q-N184Q、G127T-G165Q-N217S、T3V-A68S-T78I、T3V-T78I-A128P、T3V-T78I-G127S、T77N-G127T-N184Q、T77N-G127T-N217S、T77N-T78I-S258P、T78I-A128P-A202V、T78I-A128P-N184Q、T78I-A128P-N217S、T78I-A202V-N217S、T78I-G127S-A202V、T78I-G127S-N184Q、T78I-G127S-N217S、T78I-G165Q-S258P、A68S-G127T-A202V、A68S-T77N-G127T、G127T-A128P-G165Q、N184Q-A202V-S258D、T3V-G127T-N184Q、T3V-G127T-N217S、T77N-G127T-A128P、T78I-M123I-A202V、A128P-G165Q-A242G、A128P-G165Q-S258D、A128P-N184Q-S258D、A128P-N217S-S258D、A68S-A128P-S258D、A68S-G127T-G165Q、A68S-T78I-S258P、G127T-A128P-A202V、T3V-A128P-A242G、T3V-A68S-G127T、T3V-A68S-S258D、T3V-G127T-A202V、T3V-G165Q-A242G、T3V-G165Q-S258D、T3V-T77N-A242G、T3V-T77N-S258D、T3V-T78I-N184Q、T3V-T78I-N217S、T3V-T78I-S258P、T77N-A128P-A242G、T77N-A128P-S258D、T77N-G127T-G165Q、T77N-G165Q-A242G、T78I-A128P-S258P、T78I-G127S-S258P、A68S-M123I-S258D、G127T-G165Q-A202V、M123I-G165Q-S258D、T3V-G127T-A128P、T3V-N217S-S258D、T3V-T78I-A202V、T77N-G127T-A202V、T77N-M123I-S258D、T77N-T78I-M123I、T78I-M123I-G165Q、T78I-M123I-N184Q、T78I-N184Q-S258P、A68S-T78I-M123I、A68S-T78I-T210P、G127T-N184Q-S258P、G127T-N217S-S258P、M123I-A202V-S258D、M123I-N217S-S258D、T3V-A202V-S258D、T3V-M123I-S258D、T3V-N184Q-S258D、T3V-T77N-G127T、T3V-T78I-T210P、T77N-T78I-T210P、T78I-A128P-T210P、T78I-A202V-S258P、T78I-G127S-T210P、T78I-G165Q-T210P、T78I-M123I-A128P、T78I-M123I-G127S、T78I-M123I-N217S和T78I-N217S-S258P。
7.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含一个或多个选自以下的取代组：
M123I-Q136R；P9E-M123I；V45R-M123I；G127T-G165S-T210E；
M123I-G165S-N239S；M123I-Q136R-G165Q；M123I-Q136R-S258E；
M123I-V146S-T210E；P9E-V45R-M123I；Q136R-G165Q-S258E；
V45R-M123I-Q136R；G127T-V146S-G165S-N239S；
L10M-K27R-S98H-M123I；M123I-Q136R-G165Q-S258E；
M123I-V146S-G165S-T210P；M123I-V146S-T210P-S250G；
P9E-M123I-Q136R-G165Q；P9E-Q136R-G165Q-S258E；
P9E-V45R-M123I-Q136R；V45R-M123I-Q136R-G165Q；
V45R-M123I-Q136R-S258E；V45R-Q136R-G165Q-S258E；
K27R-N43A-S98H-M123I-T210H；P9E-M123I-Q136R-G165Q-S258E；
P9E-V45R-M123I-Q136R-G165Q；P9E-V45R-M123I-Q136R-S258E；
V45R-M123I-Q136R-G165Q-S258E；Y103I-G127T-V146S-G165S-N239S；
T77H-V87T-M123I-Q136R-N184Q-N239S；
V26R-V45R-S98R-E111Q-M123I-Q136R；
T77H-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-N239S；
T77S-V87S-M123I-Q136R-G165Q-S187P-S258P；
T77S-V87S-M123I-Q136R-N160C-S187P-S258P；
T77H-V87T-M123I-Q136R-N184Q-S187P-N239S-S258P；
T3Q-K22Y-A24N-V45I-A48I-T77N-N217S-L234I-Y255R；
P9E-T77Q-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-N217S-N239S-S258E；
N43A-V45R-T77H-V87T-M123I-Q136R-G165A-N184Q-S187P-N239S-S258P；
P9E-N43A-V45R-T77S-V87S-M123I-Q136R-G165Q-S187P-N217S-S258P；
P9E-N43A-V45R-T77H-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-S187P-N239S-S258P；
P9E-N43A-V45R-T77Q-V87T-M123I-Q136R-G165Q-N184Q-N217S-N239S-S258E；
P9E-N43A-V45R-T77H-V87T-M123I-Q136R-G165A-N184Q-S187P-N217S-N239S-S258E；T77N-N217S-L234W；T77N-N217S、
T77N-G126Q-G165Q-T210P-N217S-L234W-S258P、
T77N-G127F-G165Q-A202V-T210P-N217S-L234W-S258P；
A1Q-T3V-V28A-I35A-A68S-T77N-S86H-T115F-N217S-N239S-S250G-S258P-Q274A；T77N-M123I-T210P-N239S-S250G-S258P；
V45I-A68S-T77N-M123I-L125N-G165Q-N217S-S258P；
A68S-V71A-T77N-L95A-G165Q-N184Q-T210P-S258P；
M123I-T210P-N217S-S258P；G127F-G165Q-N217S-S258P；
T77N-G165Q-N217S-S258P；T77S-G165A-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S；V71A-T77S-N184Q-S258P；
T77N-M123I-G165Q-N184Q-N217S；V71A-L95A-A128S-T210P；
V71A-M123I-A128S-T210P；V71A-M123I-A128S-G165E；
T77S-A128P-N184Q-N217S-F260W；T77H-A128S-G165Q-T210P；
T77D-S86R-S155E-G165A-N184Q；
A68S-V71A-T77N-A128S-G165Q-T210P-N217S；
V28A-I35A-A68S-T77N-A128S-G165Q-N184Q-G203N-T210P；
A128P-T210P；T210P-S258P；A128P-T210P-S259P；A128P-S187P-T210P；
A128P-S187P-T210P-S258P；P9E-T77S-V87T-T210P-N239K；
K15I-L95Q-M123I-G165S-T210P-N217S；
K15I-M123I-V146S-G165S-T210P-N239S；
K15I-N76K-M123I-V146S-G165S-T210P-N239S；
K15I-V146S-G165S-T210P-N239S；
P009E-V146S-N184Q-G203E-T210P-P238R-N239S；M123I-G165S-N217S；
K15I-L95Q-S108K-G165S-G203E-T210P-N217S；
K15I-L95Q-S108K-G165S-G203E-T210P；
P9E-K15I-G165S-A193D-G203E-T210P；T77N-M123I-G165Q-N217S；
T77H-G165Q；T77N-G165Q-N217S；A68S-V71A-T77N-G165Q-N217S；
T77N-V87S-M123I-S155G-G165Q-N217S；T77H-V87S-S155G-G165Q；
T77N-V87S-S155G-G165Q-N217S；T77N-M123I-G165Q；T77N-G165Q；
A68S-V71A-T77N-G165Q；T77N-V87S-M123I-S155G-G165Q；
I35A-A68S-T77N-V87S-V147L-G165Q；
A68S-T77N-V87S-V147L-S155E-G165Q；
T77N-V87S-M123I-V147L-S155G-G165Q；
A68S-T77N-M123I-G165Q-N184Q-N217S；
T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-V71A-T77N-S100N-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S-N239T；
T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S；A68S-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-G165Q-N184Q-N217S；A68S-T77N-A128P-N184Q-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N217S；A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q；
M123I-G165Q-N184Q-N217S；T77N-G165Q-N184Q-N217S；
T77N-M123I-N184Q-N217S；T77N-M123I-G165Q-N184Q；
T3V-A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-T77N-M123I-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-S108H-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-G99S-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-T114N-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-G99S-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-G99S-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-G99S-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-T114N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-T114N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-T114N-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-M123I-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-G127T-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-G99S-M123I-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
A68S-T77N-M123I-G127T-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
T3V-A68S-T77N-G99S-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-A68S-T77N-T114N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-G127T-A128P-G165Q-N184Q-N217S；
T3V-A68S-T77N-M123I-A128P-G165Q-N184Q-T210P-N217S；
S86H-T115F-A143V-G165Q-A202V-S258P；
S86H-L95A-N184Q-A202V-T210P-N217S-L234W-S250G-S258P；
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T3V-A68S-T77N-G99S-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S-S258P-F260W；
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A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-A202V-N217S；
A68S-T77N-A128P-G165Q-N184Q-N217S-S258D；
T3V-A68S-T77N-T78I-G99S-G101A-M123I-G127S-A128P-G165Q-N184Q-A202V-T210P-N217S-A242G-S258P；和V45R-S98R。
8.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体还包含：
i.基序A、基序B、或其组合；
ii.基序A和基序B；
iii.Asp32和His63之间的基序1；
iv.Lys236和Arg246之间的基序6或基序7；或
v.Asp32和His63之间的基序1以及Lys236和Arg246之间的基序6或基序7；
其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；
其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14；并且其中这些氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
9.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与图1中鉴定的AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的氨基酸序列同一性。
10.如任一前述权利要求所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的氨基酸序列同一性。
11.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体选自如下亲本，该亲本与AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，该AprL-进化枝枯草杆菌蛋白酶包含(i)基序A、基序B或其组合；或(ii)基序A和基序B；其中基序A选自基序1、基序2、基序3和基序4；并且其中基序B选自基序5、基序6、基序7、基序8、基序9、基序10、基序11、基序12、基序13和基序14。
12.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体选自如下亲本，该亲本包含SEQ ID NO:2或9的氨基酸序列。
13.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体具有蛋白酶活性和/或是分离的。
14.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中当与参比枯草杆菌蛋白酶相比时，所述变体具有一种或多种改善的性质；其中该改善的性质选自改善的蛋白酶活性、改善的洗涤剂清洁性能、改善的洗涤剂热稳定性、和改善的洗涤剂熟化衣物清洁；并且其中所述洗涤剂任选地是不含硼的组合物。
15.如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述参比枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:2、9或63的氨基酸序列。
16.如权利要求13或14所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述改善的性质是
(i)改善的蛋白酶活性，其中所述变体针对N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI>1；
(ii)改善的洗涤剂清洁性能，其中所述变体具有BMI、POM、蛋和/或蛋黄清洁PI>1；
(iii)改善的洗涤剂热稳定性，其中在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或更高的应激温度下15-20分钟后，所述变体具有稳定性PI>1或剩余活性％≥5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多；和/或
(iv)改善的洗涤剂熟化衣物清洁，其中所述变体具有(a)熟化衣物清洁PI>1，(b)在55℃下24小时后，剩余清洁活性>10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多，和/或(c)在37℃下3天或3周后剩余清洁活性>10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多。
17.如权利要求16所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述
(i)蛋白酶活性根据实例1所述的蛋白酶活性测定进行测量；
(ii)洗涤剂清洁性能根据实例1所述的衣物(HDL和HDD)和ADW洗涤剂测定中的清洁性能进行测量；
(iii)洗涤剂热稳定性根据实例1所述的稳定性测定通用样品设置进行测量；和/或
(iv)洗涤剂熟化衣物清洁根据实例1所述的熟化衣物清洁测定进行测量。
18.一种组合物，所述组合物包含一种或多种如任一前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、织物柔顺洗涤剂、餐具洗涤剂和硬表面清洁洗涤剂。
21.如权利要求18-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种钙离子和/或锌离子；一种或多种酶稳定剂；从约0.001％至约1.0重量％的所述枯草杆菌蛋白酶变体；一种或多种漂白剂；一种或多种辅助材料；和/或一种或多种选自下组的另外的酶或酶衍生物，该组由以下组成：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、***糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、DNA酶或核酸酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶、另外的丝氨酸蛋白酶及其组合。
22.如权利要求18-21中任一项所述的组合物，其中所述组合物含有磷酸盐或不含磷酸盐和/或含有硼或不含硼。
23.如权利要求18-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物是颗粒、粉末、固体、棒状、液体、片剂、凝胶、糊剂或单位剂量组合物。
24.一种清洁方法，所述清洁方法包括使需要清洁的表面或物品与如权利要求1-17中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体或如权利要求18-22中任一项所述的组合物接触；并且任选地进一步包括在使所述表面或物品与所述变体或组合物接触之后漂洗所述表面或物品的步骤，其中任选地所述物品是餐具或织物。
25.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求1-17中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸序列，其中所述多核苷酸是任选地分离的。
26.一种表达载体或表达盒，所述表达载体或表达盒包含如权利要求25所述的多核苷酸。
27.如权利要求26所述的表达载体或表达盒，其中所述核酸序列有效地连接到启动子。
28.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如权利要求26或权利要求27所述的载体或盒或如权利要求25所述的多核苷酸。
29.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-17中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述组合物是消毒剂组合物、工业或机构清洁组合物、医疗器械清洁组合物、动物饲料组合物、接触透镜清洁组合物、伤口清洁组合物、或纺织品加工组合物、皮革加工组合物或羽毛加工组合物。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846299A (zh) * 2019-11-22 2020-02-28 江南大学 一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用
CN111088241A (zh) * 2019-03-18 2020-05-01 江南大学 基因工程改造的高活力人溶菌酶
CN112301023A (zh) * 2020-11-14 2021-02-02 山西大学 基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用
CN117844784A (zh) * 2023-12-14 2024-04-09 江南大学 一种具有底物选择性的角蛋白酶突变体及其应用

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112204138A (zh) * 2018-06-19 2021-01-08 宝洁公司 自动盘碟洗涤剂组合物
US12012573B2 (en) 2018-07-02 2024-06-18 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020008024A1 (en) 2018-07-06 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
CN113166682A (zh) * 2018-09-27 2021-07-23 丹尼斯科美国公司 用于医疗器械清洁的组合物
CN113302270A (zh) 2018-12-03 2021-08-24 诺维信公司 低pH粉末洗涤剂组合物
US11959111B2 (en) 2018-12-21 2024-04-16 Novozymes A/S Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same
AU2020272127B2 (en) 2019-04-12 2022-12-08 Ecolab Usa Inc. Antimicrobial multi-purpose cleaner and methods of making and using the same
US20220403298A1 (en) 2019-07-12 2022-12-22 Novozymes A/S Enzymatic emulsions for detergents
US20220325204A1 (en) 2019-08-27 2022-10-13 Novozymes A/S Detergent composition
WO2021053127A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Novozymes A/S Detergent composition
EP4077656A2 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Novozymes A/S Polypeptides having proteolytic activity and use thereof
AU2020404593A1 (en) 2019-12-20 2022-08-18 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning compositions comprising dispersins VI
CN114929848A (zh) 2019-12-20 2022-08-19 诺维信公司 稳定的液体无硼酶组合物
WO2021214059A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Novozymes A/S Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity
EP4232539A2 (en) 2020-10-20 2023-08-30 Novozymes A/S Use of polypeptides having dnase activity
EP4032966A1 (en) 2021-01-22 2022-07-27 Novozymes A/S Liquid enzyme composition with sulfite scavenger
WO2022171872A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Novozymes A/S Stabilized biological detergents
WO2022189521A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Novozymes A/S Polypeptide variants
EP4206309A1 (en) 2021-12-30 2023-07-05 Novozymes A/S Protein particles with improved whiteness
WO2023138535A1 (en) * 2022-01-21 2023-07-27 Novozymes A/S Cleaning method, use of enzymes and cleaning composition
WO2023165507A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Novozymes A/S Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2024050346A1 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024050343A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0416967A1 (en) * 1989-08-11 1991-03-13 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Novel alkaline protease
WO2005124012A1 (de) * 2004-06-18 2005-12-29 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Neues enzymatisches bleichsystem
CN102575242A (zh) * 2009-07-31 2012-07-11 丹尼斯科美国公司 具有经修饰的前原区域的蛋白酶
CN104470370A (zh) * 2012-07-20 2015-03-25 杜邦营养生物科学有限公司 降解角蛋白的方法以及制备的角蛋白水解产物的用途
CN107835855A (zh) * 2015-05-13 2018-03-23 丹尼斯科美国公司 AprL‑进化枝蛋白酶变体及其用途

Family Cites Families (198)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (zh) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
GB2048606B (en) 1979-02-28 1983-03-16 Barr & Stroud Ltd Optical scanning system
US4302544A (en) 1979-10-15 1981-11-24 University Of Rochester Asporogenous mutant of B. subtilis for use as host component of HV1 system
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
GR76237B (zh) 1981-08-08 1984-08-04 Procter & Gamble
US4450235A (en) 1982-04-21 1984-05-22 Cpc International Inc. Asporogenic mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
JP2669457B2 (ja) 1983-07-06 1997-10-27 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ 工業微生物種中の分子クローニングおよび発現
US5801038A (en) 1984-05-29 1998-09-01 Genencor International Inc. Modified subtilisins having amino acid alterations
US5972682A (en) 1984-05-29 1999-10-26 Genencor International, Inc. Enzymatically active modified subtilisins
US5264366A (en) 1984-05-29 1993-11-23 Genencor, Inc. Protease deficient bacillus
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
JPH0697997B2 (ja) 1985-08-09 1994-12-07 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ 新規の酵素的洗浄剤添加物
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US4810414A (en) 1986-08-29 1989-03-07 Novo Industri A/S Enzymatic detergent additive
GB8629837D0 (en) 1986-12-13 1987-01-21 Interox Chemicals Ltd Bleach activation
US4765916A (en) 1987-03-24 1988-08-23 The Clorox Company Polymer film composition for rinse release of wash additives
US4972017A (en) 1987-03-24 1990-11-20 The Clorox Company Rinse soluble polymer film composition for wash additives
DE3851875T2 (de) 1987-05-29 1995-04-13 Genencor Int Cutinase haltige reinigungsmittelzusammensetzungen.
ATE125865T1 (de) 1987-08-28 1995-08-15 Novo Nordisk As Rekombinante humicola-lipase und verfahren zur herstellung von rekombinanten humicola-lipasen.
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
DE68924654T2 (de) 1988-01-07 1996-04-04 Novo Nordisk As Spezifische Protease.
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US4977252A (en) 1988-03-11 1990-12-11 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Modified starch emulsifier characterized by shelf stability
WO1990009446A1 (en) 1989-02-17 1990-08-23 Plant Genetic Systems N.V. Cutinase
EP0410498B1 (en) 1989-06-29 1998-06-03 Genencor International, Inc. Mutant microbial alpha-amylases with increased thermal, acid and/or alkaline stability
DK0528828T4 (da) 1990-04-14 1998-08-31 Genencor Internat Gmbh Alkaliske bacillus-lipaser, DNA-sekvenser, der koder herfor, og bacilli der producerer sådanne lipaser
US5354559A (en) 1990-05-29 1994-10-11 Grain Processing Corporation Encapsulation with starch hydrolyzate acid esters
EP0495258A1 (en) 1991-01-16 1992-07-22 The Procter & Gamble Company Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays
GB9108136D0 (en) 1991-04-17 1991-06-05 Unilever Plc Concentrated detergent powder compositions
US5340735A (en) 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
KR100294361B1 (ko) 1992-07-23 2001-09-17 피아 스타르 돌연변이체알파-아밀라제,세정제,접시세척제,및액화제
DE69332885T2 (de) 1992-12-01 2004-03-04 Novozymes A/S Beschleunigung von Enzymreaktionen
ES2126743T5 (es) 1993-02-11 2010-02-05 Genencor International, Inc. Alfa-amilasa oxidativamente estable.
DK0697036T3 (da) 1993-05-08 2000-01-31 Henkel Kgaa Sølvkorrosionsbeskyttelsesmiddel II
WO1994026859A1 (de) 1993-05-08 1994-11-24 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Silberkorrosionsschutzmittel i
DK77393D0 (da) 1993-06-29 1993-06-29 Novo Nordisk As Aktivering af enzymer
EP0722490B2 (en) 1993-10-08 2013-10-23 Novozymes A/S Amylase variants
MA23346A1 (fr) * 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
DE4342680A1 (de) 1993-12-15 1995-06-22 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5861271A (en) 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
US5691295A (en) 1995-01-17 1997-11-25 Cognis Gesellschaft Fuer Biotechnologie Mbh Detergent compositions
ATE512226T1 (de) 1994-02-24 2011-06-15 Henkel Ag & Co Kgaa Verbesserte enzyme und detergentien damit
ES2364776T3 (es) 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG &amp; CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
MX196038B (es) 1994-03-29 2000-04-14 Novo Nordisk As Amilasa de bacillus alcalino.
DE69534369T2 (de) 1994-06-17 2006-03-09 Genencor International, Inc., Palo Alto Von der alpha-amylase aus b. licheniformis abgeleitete amylolytische enzyme mit verbesserten eigenschaften
ATE222286T1 (de) 1994-06-17 2002-08-15 Genencor Int Reinigungsverfahren mit pflanzenzellwände abbauendes hemicellulase enzym enthaltender zusammensetzung und deren verwendung in reinigungsverfahren
CN1158637A (zh) 1994-08-11 1997-09-03 金内克国际公司 改进的清洁组合物
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
US5534179A (en) 1995-02-03 1996-07-09 Procter & Gamble Detergent compositions comprising multiperacid-forming bleach activators
AU4483496A (en) 1995-02-03 1996-08-21 Novo Nordisk A/S A method of designing alpha-amylase mutants with predetermined properties
JPH11502562A (ja) 1995-03-24 1999-03-02 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド アミラーゼを含有する改善された洗濯洗剤組成物
DE69621131T2 (de) 1995-06-13 2002-11-28 Novozymes As 4-substituierte-phenylboronsäuren als enzymstabilisatoren
US5597936A (en) 1995-06-16 1997-01-28 The Procter & Gamble Company Method for manufacturing cobalt catalysts
WO1997004160A1 (en) 1995-07-19 1997-02-06 Novo Nordisk A/S Treatment of fabrics
US5576282A (en) 1995-09-11 1996-11-19 The Procter & Gamble Company Color-safe bleach boosters, compositions and laundry methods employing same
CN1199424A (zh) 1995-09-13 1998-11-18 金克克国际有限公司 嗜碱和嗜热微生物及由其所获得的酶
AU2692897A (en) 1996-04-30 1997-11-19 Novo Nordisk A/S Alpha-amylase mutants
US6211134B1 (en) 1996-05-14 2001-04-03 Genecor International, Inc. Mutant α-amylase
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
EP0939801A1 (en) 1996-09-26 1999-09-08 Novo Nordisk A/S An enzyme with amylase activity
EP0942994B1 (en) 1996-12-09 2005-04-20 Genencor International, Inc. H mutant alpha-amylase enzymes
BR9808657A (pt) 1997-03-07 2000-05-23 Procter & Gamble Métodos aperfeiçoados de produção de macropoliciclos ligados com ponte cruzada
US6008026A (en) 1997-07-11 1999-12-28 Genencor International, Inc. Mutant α-amylase having introduced therein a disulfide bond
GB2327947A (en) 1997-08-02 1999-02-10 Procter & Gamble Detergent tablet
US6080568A (en) 1997-08-19 2000-06-27 Genencor International, Inc. Mutant α-amylase comprising modification at residues corresponding to A210, H405 and/or T412 in Bacillus licheniformis
GB9719637D0 (en) 1997-09-15 1997-11-19 Genencor Int Bv Proteases from gram-positive organisms
GB9719636D0 (en) 1997-09-15 1997-11-19 Genencor Int Bv Proteases from gram-positive organisms
EP1023439B1 (en) 1997-10-13 2009-02-18 Novozymes A/S alpha-AMYLASE MUTANTS
AR015977A1 (es) 1997-10-23 2001-05-30 Genencor Int Variantes de proteasa multiplemente substituida con carga neta alterada para su empleo en detergentes
CA2845178A1 (en) 1997-10-30 1999-05-14 Novozymes A/S .alpha.-amylase mutants
US5935826A (en) 1997-10-31 1999-08-10 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Glucoamylase converted starch derivatives and their use as emulsifying and encapsulating agents
JP4246384B2 (ja) 1997-11-21 2009-04-02 ノボザイムス アクティーゼルスカブ プロテアーゼ変異体及び組成物
CA2313950A1 (en) 1997-12-24 1999-07-08 James T. Kellis, Jr. An improved method of assaying for a preferred enzyme and /or preferred detergent composition
GB9727471D0 (en) 1997-12-30 1998-02-25 Genencor Int Bv Proteases from gram positive organisms
GB9727464D0 (en) 1997-12-30 1998-02-25 Genencor Int Bv Proteases from gram positive organisms
WO1999042567A1 (en) 1998-02-18 1999-08-26 Novo Nordisk A/S Alkaline bacillus amylase
WO1999043793A1 (en) 1998-02-27 1999-09-02 Novo Nordisk A/S Amylolytic enzyme variants
CN1292028B (zh) 1998-02-27 2013-08-14 诺维信公司 麦芽α淀粉酶变体
WO1999046399A1 (en) 1998-03-09 1999-09-16 Novo Nordisk A/S Enzymatic preparation of glucose syrup from starch
EP2261359B1 (en) 1998-06-10 2014-08-20 Novozymes A/S Mannanases
US6376450B1 (en) 1998-10-23 2002-04-23 Chanchal Kumar Ghosh Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants
US6197565B1 (en) 1998-11-16 2001-03-06 Novo-Nordisk A/S α-Amylase variants
AU2026100A (en) 1998-11-30 2000-06-19 Procter & Gamble Company, The Process for preparing cross-bridged tetraaza macrocycles
DK1165762T3 (da) 1999-03-30 2007-09-03 Novozymes As Alpha-amylase varianter
JP4750284B2 (ja) 1999-03-31 2011-08-17 ノボザイムス アクティーゼルスカブ アルカリα−アミラーゼ活性を有するポリペプチド及びそれらをコードする核酸
EP2011864B1 (en) 1999-03-31 2014-12-31 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
CN1240832C (zh) 1999-08-20 2006-02-08 诺维信公司 碱性芽孢杆菌淀粉酶
WO2001034784A1 (en) 1999-11-10 2001-05-17 Novozymes A/S Fungamyl-like alpha-amylase variants
AU3724801A (en) 2000-03-03 2001-09-12 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
JP5571274B2 (ja) 2000-03-08 2014-08-13 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 改変された特性を有する変異体
WO2001088107A2 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Novozymes A/S Alpha-amylase variants with altered 1,6-activity
WO2001096537A2 (en) 2000-06-14 2001-12-20 Novozymes A/S Pre-oxidized alpha-amylase
WO2002010355A2 (en) 2000-08-01 2002-02-07 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered stability
US6440991B1 (en) 2000-10-02 2002-08-27 Wyeth Ethers of 7-desmethlrapamycin
AU2002210380A1 (en) 2000-10-13 2002-04-22 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
DE60234523D1 (de) 2001-05-15 2010-01-07 Novozymes As Alpha-amylasevariante mit veränderten eigenschaften
GB0114847D0 (en) 2001-06-18 2001-08-08 Unilever Plc Water soluble package and liquid contents thereof
DE60310264T2 (de) 2002-12-17 2007-07-05 Novozymes A/S Thermostabile alpha-amylase
DE10260903A1 (de) 2002-12-20 2004-07-08 Henkel Kgaa Neue Perhydrolasen
CN101374852B (zh) 2003-04-30 2012-06-06 金克克国际有限公司 杆菌mHKcel纤维素酶
DE60319347T2 (de) 2003-05-23 2009-02-19 The Procter & Gamble Company, Cincinnati Waschmittelzusammensetzung zum Gebrauch in einer Textilwasch- oder Geschirrspülmaschine
ES2425351T3 (es) 2003-06-25 2013-10-14 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican los mismos
MXPA06000212A (es) 2003-06-25 2006-03-21 Novozymes As Enzimas para procesar almidon.
CA2538349C (en) 2003-06-25 2014-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
US20080124427A1 (en) 2003-08-22 2008-05-29 Novozymes A/S Process for preparing a dough comprising a starch-degrading glucogenic exo-amy-lase of family 13
WO2005019443A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Novozymes A/S Fungal alpha-amylase variants
EP1692160B1 (en) 2003-11-06 2010-10-27 Danisco US Inc. Fgf-5 binding and supported peptides
DK1700917T3 (en) 2003-12-03 2016-07-25 Meiji Seika Pharma Co Ltd ENDOGLUCANASE STCE AND CELLULASE PREPARATION CONTAINING THE SAME
ES2361838T3 (es) 2003-12-03 2011-06-22 Danisco Us Inc. Perhidrolasa.
US7754460B2 (en) 2003-12-03 2010-07-13 Danisco Us Inc. Enzyme for the production of long chain peracid
ES2539955T3 (es) 2003-12-08 2015-07-07 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Celulasa tolerante a los tensioactivos y procedimiento de modificación de la misma
EP1709167B1 (en) 2004-01-08 2010-04-21 Novozymes A/S Amylase
DK1781790T3 (en) 2004-07-05 2016-01-18 Novozymes As ALFA-amylase variants WITH CHANGED PROPERTIES
AU2005269079A1 (en) 2004-08-02 2006-02-09 Novozymes A/S Maltogenic alpha-amylase variants
CA2575878A1 (en) 2004-08-02 2006-02-09 Novozymes A/S Creation of diversity in polypeptides
CN103181400B (zh) 2004-09-10 2016-08-10 诺维信北美公司 防止、去除、减少或破坏生物膜的方法
US7659101B2 (en) 2004-12-15 2010-02-09 Novozymes A/S Alkaline Bacillus amylase
AR051863A1 (es) 2004-12-22 2007-02-14 Novozymes As Enzimas hibridas
US20090275078A1 (en) 2004-12-23 2009-11-05 Novozymes A/S Alpha-Amylase Variants
BRPI0611932A2 (pt) 2005-06-24 2011-01-04 Novozymes As amilase, uso da mesma, composição farmacêutica, e, método para o tratamento de uma doença
CN105200027B (zh) 2005-10-12 2019-05-31 金克克国际有限公司 储存稳定的中性金属蛋白酶的用途和制备
WO2007106293A1 (en) 2006-03-02 2007-09-20 Genencor International, Inc. Surface active bleach and dynamic ph
MX2008015592A (es) 2006-06-05 2008-12-18 Procter & Gamble Estabilizante de enzima.
US20090226564A1 (en) 2006-06-30 2009-09-10 Novozymes A/S Bacterial alpha-amylase variants
BRPI0714329B1 (pt) 2006-07-18 2017-09-12 Danisco Us Inc.,Genencor Division A dishwashing detergent composition comprising protease variants active over a wide temperature range and dishwashing process
KR20090101193A (ko) 2006-12-21 2009-09-24 다니스코 유에스 인크. 바실러스 종 １９５ 의 알파-아밀라아제 폴리펩티드에 대한 조성물 및 용도
US20100112637A1 (en) 2007-02-01 2010-05-06 Novozymes A/S Polypeptides Having Alpha-Amylase Activity and Polynucleotides Encoding Same
US8021863B2 (en) 2007-02-19 2011-09-20 Novozymes A/S Polypeptides with starch debranching activity
MX2009008978A (es) 2007-02-27 2009-09-24 Danisco Us Inc Enzimas de limpieza y prevencion del mal olor.
WO2008106214A1 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Danisco Us Inc. Cleaning enzymes and fragrance production
US20080293607A1 (en) 2007-03-09 2008-11-27 Jones Brian E Alkaliphilic Bacillus Species alpha-Amylase Variants, Compositions Comprising alpha-Amylase Variants, And Methods of Use
RU2010121930A (ru) 2007-10-31 2011-12-10 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. (US) Применение и получение устойчивых к цитрату нейтральных металлопротеиназ
US8569034B2 (en) 2007-11-01 2013-10-29 Danisco Us Inc. Thermolysin variants and detergent compositions therewith
US8206966B2 (en) 2007-11-05 2012-06-26 Danisco Us Inc. Alpha-amylase variants with altered properties
NZ584434A (en) 2007-11-05 2011-12-22 Danisco Us Inc VARIANTS OF BACILLUS sp. TS-23 ALPHA-AMYLASE WITH ALTERED PROPERTIES
DK2245130T3 (da) 2008-02-04 2021-01-18 Danisco Us Inc Ts23 -alpha-amylasevarianter med ændrede egenskaber
EP2100947A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
MX2010010348A (es) 2008-03-26 2010-11-09 Novozymes As Composiciones de enzimas liquidas estabilizadas.
WO2009140504A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
CN102046783A (zh) 2008-06-06 2011-05-04 丹尼斯科美国公司 包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法
US9090887B2 (en) 2008-06-06 2015-07-28 Danisco Us Inc. Variant alpha-amylases from Bacillus subtilis and methods of use, thereof
BR122013014156A2 (pt) 2008-11-11 2015-07-14 Danisco Us Inc Composição de limpeza compreendendo variantes de subtilisina, bem como processo de limpeza
BR122013014157A2 (pt) 2008-11-11 2018-11-13 Danisco Us Inc. composições de limpeza compreendendo variantes de subtilisina de bacillus, bem como processo de limpeza
BRPI0920925A2 (pt) 2008-11-11 2015-08-18 Danisco Us Inc Composições e métodos compreendendo uma variante de subtilisina
WO2010059413A2 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2010088447A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
WO2010091221A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
US20120172275A1 (en) 2009-03-10 2012-07-05 Danisco Us Inc. Bacillus Megaterium Strain DSM90-Related Alpha-Amylases, and Methods of Use, Thereof
US8852912B2 (en) 2009-04-01 2014-10-07 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising alpha-amylase variants with altered properties
CN102388131B (zh) 2009-04-08 2014-04-30 丹尼斯科美国公司 盐单胞菌属菌株WDG195相关α-淀粉酶及其使用方法
EP2279804A1 (en) 2009-07-28 2011-02-02 Koninklijke Philips Electronics N.V. Washing and sterilizing unit
WO2011072099A2 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising protease variants
WO2011076897A1 (en) 2009-12-22 2011-06-30 Novozymes A/S Use of amylase variants at low temperature
WO2011076123A1 (en) 2009-12-22 2011-06-30 Novozymes A/S Compositions comprising boosting polypeptide and starch degrading enzyme and uses thereof
CN102918149A (zh) 2010-01-04 2013-02-06 诺维信公司 α-淀粉酶
CN102869759B (zh) 2010-02-10 2015-07-15 诺维信公司 在螯合剂存在下具有高稳定性的变体和包含变体的组合物
BR112012028466B1 (pt) 2010-05-06 2020-03-17 The Procter & Gamble Company Composição de produtos com variantes de protease e método para tratar e/ou limpar uma superfície
CA2834865C (en) 2011-05-05 2021-03-09 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising serine protease variants
JP5748338B2 (ja) 2011-06-21 2015-07-15 水ｉｎｇ株式会社 懸濁水のろ過装置及び方法
US9085750B2 (en) 2011-07-01 2015-07-21 Novozymes A/S Stabilized subtilisin composition
US20140287477A1 (en) 2011-10-28 2014-09-25 Danisco Us Inc. Variant Maltohexaose-Forming Alpha-Amylase Variants
ES2909509T3 (es) 2012-06-08 2022-05-06 Danisco Us Inc Variante de alfa-amilasas con mayor actividad en polímeros de almidón
ES2865080T3 (es) 2012-10-12 2021-10-14 Danisco Us Inc Composiciones y métodos que comprenden una variante de enzima lipolítica
KR20150082502A (ko) 2012-11-05 2015-07-15 다니스코 유에스 인크. 써몰리신 프로테아제 변이체를 포함하는 조성물 및 방법
EP2935575B1 (en) 2012-12-21 2018-04-18 Danisco US Inc. Alpha-amylase variants
CN105229147B (zh) 2013-03-11 2020-08-11 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶组合变体
JP6367930B2 (ja) 2013-05-29 2018-08-01 ダニスコ・ユーエス・インク 新規メタロプロテアーゼ
EP3110833B1 (en) 2013-05-29 2020-01-08 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
EP3004341B1 (en) 2013-05-29 2017-08-30 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
US20160160202A1 (en) 2013-05-29 2016-06-09 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
CN105555951A (zh) 2013-07-19 2016-05-04 丹尼斯科美国公司 包含脂解酶变体的组合物和方法
EP3653707A1 (en) 2013-09-12 2020-05-20 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising lg12-clade protease variants
CN105960456A (zh) 2013-11-20 2016-09-21 丹尼斯科美国公司 对蛋白酶裂解敏感性降低的变体α-淀粉酶及其使用方法
EP3553173B1 (en) 2013-12-13 2021-05-19 Danisco US Inc. Serine proteases of the bacillus gibsonii-clade
ES2723948T3 (es) 2013-12-13 2019-09-04 Danisco Us Inc Serina proteasas procedentes de especies de Bacillus
US20170096653A1 (en) 2014-03-21 2017-04-06 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
EP3164486B1 (en) 2014-07-04 2020-05-13 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
CN116240202A (zh) 2014-07-04 2023-06-09 诺维信公司 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸
BR112017000505A2 (pt) 2014-07-11 2018-06-12 Danisco Us Inc mananases de paenibacillus e bacillus spp.
US20170233710A1 (en) 2014-10-17 2017-08-17 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
EP3212780B1 (en) 2014-10-27 2019-12-25 Danisco US Inc. Serine protease
WO2016069557A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
EP3550017B1 (en) 2014-10-27 2021-07-14 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3212783B1 (en) 2014-10-27 2024-06-26 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3212662B1 (en) 2014-10-27 2020-04-08 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3212781B1 (en) 2014-10-27 2019-09-18 Danisco US Inc. Serine proteases
DE102014223296A1 (de) 2014-11-14 2016-05-19 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend mindestens zwei Proteasen
CN116286218A (zh) 2014-12-04 2023-06-23 诺维信公司 包括蛋白酶变体的液体清洁组合物
WO2016087617A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3268471B1 (en) 2015-03-12 2019-08-28 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising lg12-clade protease variants
MX2017013677A (es) 2015-04-29 2018-03-15 Novozymes As Polipeptidos adecuados para detergente.
CN107849549B (zh) 2015-06-17 2024-04-05 丹尼斯科美国公司 吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶
EP3872175A1 (en) * 2015-06-18 2021-09-01 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3106508B1 (en) 2015-06-18 2019-11-20 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising subtilase variants
EP3371307A1 (en) 2015-11-05 2018-09-12 Danisco US Inc. Paenibacillus and bacillus spp. mannanases
WO2017079751A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Danisco Us Inc Paenibacillus sp. mannanases

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0416967A1 (en) * 1989-08-11 1991-03-13 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Novel alkaline protease
WO2005124012A1 (de) * 2004-06-18 2005-12-29 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Neues enzymatisches bleichsystem
CN102575242A (zh) * 2009-07-31 2012-07-11 丹尼斯科美国公司 具有经修饰的前原区域的蛋白酶
CN104470370A (zh) * 2012-07-20 2015-03-25 杜邦营养生物科学有限公司 降解角蛋白的方法以及制备的角蛋白水解产物的用途
CN107835855A (zh) * 2015-05-13 2018-03-23 丹尼斯科美国公司 AprL‑进化枝蛋白酶变体及其用途

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111088241A (zh) * 2019-03-18 2020-05-01 江南大学 基因工程改造的高活力人溶菌酶
CN110846299A (zh) * 2019-11-22 2020-02-28 江南大学 一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用
CN110846299B (zh) * 2019-11-22 2021-09-24 江南大学 一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用
CN112301023A (zh) * 2020-11-14 2021-02-02 山西大学 基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用
CN112301023B (zh) * 2020-11-14 2022-09-23 山西大学 基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用
CN117844784A (zh) * 2023-12-14 2024-04-09 江南大学 一种具有底物选择性的角蛋白酶突变体及其应用

Also Published As

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US11661567B2 (en) 2023-05-30

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