BR112012028466B1 - Composição de produtos com variantes de protease e método para tratar e/ou limpar uma superfície - Google Patents

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Glenn Steven Ward
Ayrookaran Joseph. Poulose
David A. Estell
James T. Kellis
Katherine D. Collier
Luis Gustavo Cascão-Pereira
Viktor Yuryevich Alekseyev
Neelam S. Amin
Jian Yao
Katherine AUGUSTYN
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Abstract

produtos destinados ao consumidor com variantes de protease. a presente invenção refere-se a produtos destinados ao consumidor que compreendem proteases, particularmente, proteases de água fria e processos para produzir e usar tais produtos. tais produtos destinados ao consumidor fornecem limpeza, brancura e/ou frescor otimizado. tais proteases são derivadas de uma enzima parental, por exemplo, bacillus lentus, por substituição, inserção e/ou deleção de uma ou mais dos aminoácidos das enzimas parentais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO DE PRODUTOS COM VARIANTES DE PROTEASE E MÉTODO PARA TRATAR E/OU LIMPAR UMA SUPERFÍCIE".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a produtos destinados ao consumidor que compreendem proteases, bem como a métodos de preparo e uso de tais produtos destinados aos consumidores.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os fabricantes de detergente incorporam proteases a seus produtos para proporcionar boa limpeza de manchas (como sangue). Entretanto, devido às tendências de sustentabilidade e do consumidor para baixar as temperaturas de lavagem, vem se tornando cada vez mais difícil proporcionar benefícios aceitáveis ao consumidor, e permanece a necessidade por aprimorar o perfil de limpeza e frescor dessas composições detergentes para lavagem de roupas. Os inventores descobriram que incorporar, adicionalmente, certas proteases em produtos para o consumidor, por exemplo, uma composição detergente para lavagem de roupas que pode, em um aspecto, compreender um agente de matiz, um alvejante solúvel em água fria, catalisador de branqueamento, uma primeira lipase para lavagem, uma celulase de limpeza bacteriana, um tensoativo não iônico de Guerbet e/ou uma cápsula de perfume, aprimora um ou mais dos perfis de limpeza, brancura, percepção de brancura e/ou frescor de tal produto destinado ao consumidor.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Essa invenção refere-se a produtos destinados ao consumidor que compreendem proteases, particularmente, proteases em água fria e processos para a produção e o uso desses produtos. Essas composições proporcionam limpeza e frescor otimizados. Tais proteases são derivadas de uma enzima parental, subtilisina derivada de Bacillus lentus, por substituição, inserção e/ou deleção de um ou mais dos aminoácidos da enzima parental.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 fornece um alinhamento das proteases com referência madura incluindo: Protease de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefa-ciens (SEQ ID n°:2) e de subtilisina GG36 de B. lentus (SEQ ID n°:1). Cada-posição de aminoácido de cada variante de protease aqui descrita, incluindo cada variante de protease em água fria, é numerada de acordo com a numeração da posição de aminoácido correspondente na sequência de aminoáci-dos de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na figura 1 conforme determinada pelo alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens. A figura 2 mostra o plasmídeo de expressão pHPLT-GG36. A figura 3 mostra o plasmídeo de expressão pRA68.
A figura 4 mostra o plasmídeo de expressão pRA96. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições Para uso na presente invenção "produto destinado ao consumidor" significa produto para cuidados com tecidos e casa.
Para uso na presente invenção, o termo "produto para cuidados com tecido e casa" se refere a produtos para cuidado com tecidos e casa e/ou destinados, em geral, a serem usados ou consumidos na forma em que são vendidos e que são para o tratamento de tecidos, superfícies duras e quaisquer outras superfícies e sistemas de limpeza, todos para o cuidado e limpeza de superfícies inanimadas, bem como produtos condicionadores de tecido e outros produtos projetados especificamente para o cuidado e manutenção de tecidos, e produtos de cuidado com o ar, incluindo: cuidados com o ar incluindo desodorizadores de ambientes e sistemas de liberação de aroma, cuidados com o automóvel, cuidados para animais de estimação, cuidados para gado, cuidados pessoais, cuidados para joias, lavagem de louças, condicionamento de tecidos (incluindo amaciante e/ou refrescante), detergência para lavagem de roupas, aditivo e/ou cuidado para lavanderia e enxágue, composições de limpeza de pré-tratamento, limpeza e/ou trata mento de superfícies duras, incluindo limpadores de piso e vaso sanitário, limpadores e/ou tratamentos de vidro, limpadores e/ou tratamentos de ladrilhos, limpadores e/ou tratamentos de cerâmica e outras limpezas para o consumidor ou uso institucional. Em algumas modalidades, os produtos para cuidado com tecidos e casa são adequados ao uso em ferimentos e/ou pele. "Produto para cuidados com tecido e casa" inclui produtos destinados ao consumidor e produtos institucionais. Essa definição, não inclui produtos (a) destinados a serem usados para limpar lentes de contato ou membranas de ultrafiltração, ou (b) na cicatrização de feridas ou para o tratamento médico de condições da pele. Esses produtos para cuidado com tecidos e casa são geralmente destinados a serem usados ou consumidos na forma em que são vendidos.
Para uso na presente invenção, o termo "composição de limpeza e/ou tratamento" é um subconjunto de produtos para cuidado com tecidos e casa. Esses produtos incluem, mas não se limitam a, produtos para tratamento de tecidos, superfícies duras e quaisquer outras superfícies na área de tratamento de tecidos e cuidados domésticos, inclusive: cuidados com o ar, incluindo desodorizadores de ambientes e sistemas de liberação de aroma, cuidados com o automóvel, lavagem de louça, condicionamento de tecidos (incluindo amaciante e/ou refrescante), detergência para lavagem de roupas, cuidados e/ou aditivos para lavanderia e enxágue, limpeza e/ou tratamento de superfícies duras incluindo limpadores de piso e vaso sanitário, agentes de lavagem sob forma granulada ou em pó, para múltiplas finalidades ou para "tarefas pesadas", especialmente detergentes para limpeza; agentes de lavagem para múltiplas finalidades sob a forma de líquido, gel ou pasta, especialmente os tipos líquidos chamados "para tarefas pesadas"; detergentes líquidos para tecidos delicados; agentes para lavagem manual de pratos ou agentes para lavagem de pratos para tarefas leves, especialmente aqueles do tipo altamente espumante; agentes para lavagem de pratos à máquina, incluindo os vários tipos em tablete, granulares, líquidos e de auxílio ao enxágue para uso doméstico e institucional, xampus para carros ou tapetes, limpadores para banheiro, incluindo limpadores de vaso sanitá rio; bem como compostos auxiliares de limpeza como aditivos alvejantes e "bastão removedor de manchas" ou tipos para pré-tratamento, produtos de substrato carregado como folhas para adição na secagem à máquina.
Para uso na presente invenção, o termo "composição de tratamento e/ou limpeza de tecido e/ou de superfícies duras" é um subconjunto de composições de limpeza e tratamento que inclui, a não ser que indicado de outra forma, agentes de lavagem sob forma granulada ou em pó, para múltiplas finalidades ou para "tarefas pesadas", especialmente detergentes para limpeza; agentes de lavagem para múltiplas finalidades sob a forma de líquido, gel ou pasta, especialmente os tipos líquidos chamados "para tarefas pesadas"; detergentes líquidos para tecidos delicados; agentes para lavagem manual de pratos ou agentes para lavagem de pratos para tarefas leves, especialmente aqueles do tipo altamente espumante; agentes para lavagem de pratos à máquina, incluindo os vários tipos em tablete, granula-res, líquidos e de auxílio ao enxágue para uso doméstico e institucional; a-gentes líquidos de limpeza e desinfecção, xampus para carros ou tapetes, limpadores para banheiro incluindo limpadores de vaso sanitário; produtos para condicionamento de tecidos incluindo amaciante e/ou refrescante que podem estar sob a forma líquida, sólida e/ou folha de secagem; bem como compostos auxiliares de limpeza como aditivos alvejantes e "bastão removedor de manchas" ou tipos para pré-tratamento, produtos de substrato carregado como folhas para adição na secagem à máquina. Todos os produtos desse tipo que forem aplicáveis podem estar sob forma convencional, concentrada ou mesmo altamente concentrada, mesmo até o ponto em que esses produtos possam, em certos aspectos, ser não aquosos.
Para uso na presente invenção, o termo "variante de protease em água fria" significa uma variante de uma protease original, sendo a dita sequência de protease original é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou 100% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1, em que a dita variante tem uma ou mais das seguintes características: a) um índice de desempenho no Método de Teste 2 de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2; de 1,1 a cerca de 10, de 1,1 a cerca de 8 ou mesmo de 1,1 a cerca de 5; b) um índice de desempenho no Método de Teste 3 de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2; de 1,1 a cerca de 10, de 1,1 a cerca de 8 ou mesmo de 1,1 a cerca de 5; c) um índice de desempenho no Método de Teste 4 de pelo menos 1,0, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1.4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2, de 1,0 a cerca de 10, de 1,0 a cerca de 8 ou mesmo de 1,0 a cerca de 5; d) um índice de desempenho no Método de Teste 6 de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1.5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2; de 1,1 a cerca de 10, de 1,1 a cerca de 8 ou mesmo de 1,1 a cerca de 5, sendo cada posição de aminoácido é numerada de acordo com a numeração da posição de aminoácido correspondente na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens. As proteases em água fria preferenciais adequadas para o uso na presente invenção têm as características de acordo com o Método de Teste 6 conforme definido em d) acima. O Método de Teste 2, Método de Teste 3, Método de Teste 4 e Método de Teste 6 são explicitamente descritos abaixo na seção intitulada "MÉTODOS DE TESTE".
Para uso na presente invenção, o termo "variante de protease" significa uma variante de uma protease, sendo a dita sequência de protease original é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou 100% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1, sendo cada posição de ami- noácido é numerada de acordo com a numeração da posição de aminoácido correspondente na sequência de aminoácido da subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Para uso na presente invenção, artigos como "um" e "uma" quando usados em uma reivindicação, são compreendidos como significando um ou mais do que é reivindicado ou descrito.
Para uso na presente invenção, os termos "incluir", "inclui" e "incluindo" destinam-se a ser não limitadores.
Para uso na presente invenção, o termo "sólido" inclui formas de produto granulares, em pó, em barra e em tablete.
Para uso na presente invenção, o termo "fluido" inclui produtos na forma de líquido, gel, pasta e gás.
Para uso na presente invenção, o termo "situs" inclui tecidos, peças de vestuário e/ou superfícies duras.
Exceto onde especificado em contrário, todos os níveis de componente ou de composição se referem à porção ativa daquele componente ou composição e são exclusivos de impurezas, por exemplo, solventes residuais ou subprodutos, os quais podem estar presentes em fontes comercialmente disponíveis de tais componentes ou composições.
Todas as porcentagens e razões são calculadas em peso, exceto onde indicado em contrário. Todas as porcentagens e razões são calculadas com base na composição total, exceto onde indicado em contrário.
Deve-se compreender que cada limite numérico máximo mencionado neste relatório descritivo inclui cada um dos limites numéricos inferiores, como se tais limites numéricos inferiores estivessem expressamente registrados no presente documento. Cada limite numérico mínimo mencionado neste relatório descritivo inclui cada um dos limites numéricos superiores, como se tais limites numéricos superiores estivessem expressamente registrados no presente documento. Cada intervalo numérico mencionado neste relatório descritivo inclui cada intervalo numérico mais restrito que esteja situado dentro desse intervalo numérico mais amplo, como se tais intervalos numéricos mais restritos estivessem expressamente registrados no presente documento.
Produtos destinados ao consumidor Conforme descrito aqui, os produtos destinados ao consumidor que compreendem as proteases variantes reveladas aqui encontra uso particular na indústria de limpeza, por exemplo, detergentes para lavanderia e louças. Essas aplicações colocam as enzimas sob muitos estresses ambientais. As proteases variantes empregadas na presente invenção fornecem vantagens sobre muitas enzimas usadas atualmente, devido, pelo menos em parte a, sua estabilidade sob várias condições.
De fato, existe uma variedade de condições de lavagem incluindo formulações de diferentes detergentes, volumes de água de lavagem, temperaturas de água de lavagem e durações do tempo de lavagem, à qual proteases envolvidas na lavagem são expostas. Além disso, formulações de detergente usadas em diferentes áreas geográficas têm diferentes concentrações de seus componentes relevantes presentes na água de lavagem. Por exemplo, detergentes europeus têm, tipicamente, cerca de 4500 a 5000 ppm de componentes detergentes na água de lavagem, enquanto que detergentes japoneses têm, em geral, aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes na água de lavagem. Na América do Norte, particularmente, nos Estados Unidos, os detergentes têm tipicamente cerca de 975 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem.
Um sistema de baixa concentração de detergente inclui detergentes onde menos que cerca de 800 ppm dos componentes detergentes estão presentes na água de lavagem. Os detergentes japoneses são tipicamente considerados um sistema de baixa concentração de detergente visto que têm aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem.
Uma média concentração de detergente inclui detergentes onde entre cerca de 800 ppm e cerca de 2000 ppm dos componentes detergentes estão presentes na água de lavagem. Os detergentes norte-americanos são geralmente considerados como sistemas de média concentração detergente visto que têm aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem. O Brasil tem, tipicamente, aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem.
Um sistema de alta concentração de detergente inclui detergentes onde mais que cerca de 2000 ppm dos componentes detergentes estão presentes na água de lavagem. Os detergentes europeus são, geralmente, considerados como sistemas de alta concentração de detergente visto que têm aproximadamente 4500 a 5000 ppm de componentes detergentes na água de lavagem.
Os detergentes da América Latina são, geralmerite, detergentes de coadjuvante à base de fosfato com alta concentração de espuma de sabão e a faixa de detergentes usada na América Latina podem ser incluídos tanto em médias quanto em altas concentrações de detergente visto que se situam na faixa de 1500 ppm a 6000 ppm de componentes detergentes na água de lavagem. Conforme mencionado acima, o Brasil tem, tipicamente, aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem. Entretanto, outras regiões de detergente de coadjuvante à base de fosfato com alta concentração de espuma de sabão, não se limitando a outros países da América Latina, podem ter sistemas de alta concentração de detergente até cerca de 6000 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem. À luz do supracitado, é evidente que as concentrações de composições detergentes em soluções de lavagem típicas por todo o mundo variam de menos que cerca de 800 ppm de composição detergente ("regiões com baixa concentração de detergente"), por exemplo, cerca de 667 ppm no Japão, para entre cerca de 800 ppm a cerca de 2000 ppm ("regiões com média concentração de detergente"), por exemplo, cerca de 975 ppm em EUA e cerca de 1500 ppm no Brasil, até mais que cerca de 2000 ppm ("regiões com alta concentração de detergente"), por exemplo, cerca de 4500 ppm a cerca de 5000 ppm na Europa e cerca de 6000 ppm em regiões com coadjuvante à base de fosfato de alta concentração de espuma de sabão.
As concentrações das típicas soluções de lavagem são determinadas empiricamente. Por exemplo, nos EUA, uma máquina de lavar típica mantém um volume de cerca de 64,4 L de solução de lavagem. Consequentemente, com a finalidade de obter uma concentração de cerca de 975 ppm de detergente dentro da solução de lavagem, cerca de 62,79 g de composição detergente devem ser adicionados a 64,4 L de solução de lavagem. Essa quantidade é a quantidade típica medida na água de lavagem pelo consumidor com o uso da caneca de medição fornecida juntamente do detergente.
Como um exemplo adicional, regiões diferentes usam temperaturas de lavagem diferentes. A temperatura da água de lavagem o Japão é, tipicamente, menor que aquela usada na Europa. Por exemplo, a temperatura da água de lavagem na América do Norte e Japão está, tipicamente, entre cerca de 10 e cerca de 30°C (por exemplo, cerca de 20°C), ao passo que a temperatura da água de lavagem na Europa está, tipicamente, entre cerca de 30 e cerca de 60°C (por exemplo, cerca de 40°C). Entretanto, com o interesse em economizar energia, muitos consumidores estão mudando para o uso de lavagem com água fria. Além disso, em algumas regiões adicionais, a água fria é, tipicamente, usada para lavanderia, bem como em aplicações para lavagem de louças. Em algumas modalidades, a "lavagem com água fria" da presente invenção utiliza lavagem em temperaturas de cerca de 10°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 20°C a cerca de 30°C, ou de cerca de 15°C a cerca de 25°C, bem como todas as outras combinações dentro da faixa de cerca de 15°C a cerca de 35°C, e todas as faixas dentro de 10°C a 40°C.
Como um exemplo adicional, regiões diferentes têm, tipicamente, durezas da água diferentes. A dureza da água é normalmente descrita em termos do Ca2+/Mg2+ misturado em grãos por galão. A dureza é uma medida da quantidade de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) na água. A maior parte da água nos EUA é dura, mas o grau de dureza varia. A água moderadamente dura (60 a 120 ppm) a dura (121 a 181 ppm) tem 60 a 181 partes por milhão (partes por milhão convertida em grãos por galão de EU A, onde n° de ppm dividido por 17,1 é igual a grãos por galão) de minerais de dureza. A dureza da água europeia é, tipicamente, maior que cerca de 179,1 (por exemplo, cerca de 179,1 a 341,1) mg/l (10,5 (por exemplo, cerca de 10,5 a cerca de 20,0) grãos por galão) de Ca2+/Mg2+ misturado(por exemplo, cerca de 255,8 mg/l (15 grãos por galão) Ca2+/Mg2+) misturado. A dureza da água norte-americana é, tipicamente, maior que a dureza da água japonesa, mas menor que a dureza da água europeia. Por exemplo, a dureza da água norte-americana pode estar entre cerca de 51,2 a cerca de 170,5 mg/l (cerca de 3 a cerca de 10 grãos), cerca de 51,2 a cerca de 136,4 ou cerca de 102,3 mg/l (cerca de 3 a cerca de 8 grãos ou cerca de 6 grãos). A dureza da água japonesa é, tipicamente, menor que a dureza da água norte-americana, normalmente, menor que cerca de 68,2, por exemplo, cerca de 51,2 mg/l (cerca de 4, por exemplo, cerca de 3 grãos por galão) de Ca2+/Mg2+ misturado.
Consequentemente, em algumas modalidades, a presente invenção apresenta produtos destinados ao consumidor que mostram desempenho de água surpreendente em pelo menos um conjunto de condições de lavagem (por exemplo, temperatura da água, dureza da água e/ou concentração de detergente).
Em particular, a presente invenção compreende um método para lavagem.
Em algumas modalidades, os produtos destinados ao consumidor da presente invenção são comparáveis em desempenho de lavagem a outros produtos destinados ao consumidor que compreendem outras proteases subtilisina. Em algumas modalidades, os produtos destinados ao con sumidor da presente invenção apresentam desempenho de lavagem acentuado em comparação com produtos destinados ao consumidor que compreendem proteases subtilisina atualmente disponíveis para comercialização. Dessa forma, em algumas modalidades da presente invenção, os produtos destinados ao consumidor que compreendem as proteases variantes fornecidas aqui apresentam limpeza acentuada devido, pelo menos em parte a, estabilidade oxidativa acentuada, estabilidade térmica otimizada, capacidades de limpeza acentuadas sob várias condições e/ou estabilidade que-lante acentuada das enzimas empregadas.
Produtos destinados ao consumidor Em todas as suas formas, as composições reveladas aqui são produtos destinados ao consumidor.
Em um aspecto, uma composição que compreende um material auxiliar e uma variante de protease em água fria, sendo a dita composição é um produto destinado ao consumidor, é revelada. O Método de Teste 2, Método de Teste 3, Método de Teste 4 e Método de Teste 6 são discutidos abaixo na seção intitulada "MÉTODOS DE TESTE".
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende uma ou mais, ou mesmo duas ou mais ou, de preferência, três ou mais das mutações a seguir X1R, X2S, X2M, X2A, X2R, X2W, X3R, X4R, X4S, X4C, X8A, X9A, X9F, X9W, X10S, X10A, X10H, X10M, X12F, X12R, X14K, X14F, X14Q, X15R, X15F, X16S, X17R, X17M, X17F, X18R, X18K, X20F, X20K, X20R, X22A, X22R, X22Y, X22V, X22Q, X22L, X22W, X23A, X23S, X23F, X24R, X24F, X24W, X24Q, X24H, X24L, X25V, X25F, X25R, X26F, X27L, X27F, X27R, X27V, X28A, X28N, X28E, X29T, X30E, X31F, X33S, X33G, X33D, X34P, X35M, X36T, X36F, X36R, X38L, X38F, X38R, X40N, X40L, X40T, X40W, X40H, X40R, X42I, X43A, X43F, X43I, X43S, X43R, X43M, X43W, X43D, X45T, X46R, X48R, X50C, X51W, X51F, X51H, X52F, X52E, X52N, X55Y, X57R, X59A, X59F, X59R, X60P, X60Q, X60A, X62E, X62Q, X63V, X63M, X63T, X63I, X63A, X63S, X63H, X63Q, X63D, X63E, X63P, X64F, X64T, X68A, X68C, X69N, X69T, X69P, X69W, X71G, X72C, X74C, Χ75Α, X75F, Χ75Ε, X75R, X76D, X78R, Χ78Ν, Χ78Ι, X79W, X79Q, X81R, X82F, Χ82Τ, X82V, X82R, Χ82Μ, Χ85Μ, X86W, X86L, Χ86Ι, Χ89Ρ, Χ89Τ, X89G, Χ89Η, X89L, X89V, X89W, X89F, Χ89Ι, Χ91Ν, X91F, X92F, Χ94Ν, X99F, Χ99Τ, Χ99Ρ, X99G, Χ99Μ, X100S, Χ100Ν, X100Q, Χ100Ι, Χ101Α, Χ101Ν, X101G, Χ101Τ, X101D, Χ101Ε, Χ101Ρ, X101F, Χ102Α, Χ102Τ, Χ102Ν, Χ102Η, Χ102Ε, X103G, Χ103Ν, X103D, Χ103Α, X104L, Χ104Ι, Χ104Ε, X104D, Χ105Τ, Χ105Ε, X105Q, X106G, Χ106Τ, Χ106Ε, X106D, Χ106Α, X106V, X106F, Χ107Μ, X107F, Χ108Ι, X108G, Χ109Μ, X111V, Χ111Ι, X112V, X112L, X112Q, X114G, Χ115Κ, X115R, Χ116Κ, Χ116Α, X116L, X117F, X118R, Χ118Ι, X119C, Χ120Α, X120F, X120R, X121F, Χ121Ε, X123G, Χ123Ε, X124S, X128D, X128F, X128L, Χ128Ν, Χ128Η, Χ128Μ, Χ128Ι, X128Q, Χ129Ε, Χ132Α, Χ132Ε, X138G, X144R, X147L, Χ148Ι, Χ158Ε, X159D, Χ159Ε, X159C, X160D, X166D, Χ166Ε, X167W, X175V, X177C, Χ181Α, X182R, Χ183Ι, X183D, Χ183Μ, X183F, X183R, Χ185Ε, X185V, Χ185Ι, Χ186Η, Χ186Κ, Χ188Ε, X188D, X188R, Χ192Η, X192W, Χ194Ε, X194V, X194F, X197F, X198L, X198F, Χ203Ε, X203C, X208S, X209S, Χ209Ν, X209F, Χ209Τ, Χ209Ε, Χ209Η, X209G, X209L, X210R, X210V, X210L, X211Q, X211R, Χ212Ι, Χ212Μ, X212F, Χ213Α, X214F, Χ215Ν, X215D, Χ215Ε, Χ215Η, X215F, X216F, Χ216Α, Χ217Ε, Χ217Ν, X217D, X218D, Χ218Ρ, Χ218Ε, Χ224Α, X224G, Χ227Ι, Χ230Ε, Χ231Ι, X231C, X232V, X233C, X234F, X235F, X236F, Χ236Ν, Χ236Η, X238R, Χ238Κ, X238L, Χ239Κ, X239G, X239R, Χ239Η, Χ239Τ, Χ239Ν, X239S, X239F, X240R, X241R, X242L, X242R, X243F, X243R, X244R, X245R, X246S, X248D, X248V, Χ248Ι, X248R, X249R, Χ249Τ, Χ250Ι, X251R, X251S, Χ252Ι, X252F, X252R, Χ252Κ, Χ252Η, Χ253Ι, X253R, X253F, X254C, Χ256Ν, X258R, X260V, Χ260Ι, X262D, Χ262Η, X263F, X265F, X267V, Χ267Ν, Χ267Μ, Χ269Ι, X269R, X270C, Χ271Ι, X271V, Χ271Η, Χ271Μ, X271L, Χ271Ρ, Χ271Α, X271F, Χ271Τ, X272F, X272F, X272R, X273F, Χ273Ι e X274G.
Em um aspecto preferencial da dita composição, a dita variante de protease compreende uma ou mais, de preferência, duas ou, de preferência, três ou mais das seguintes mutaçõesXIR, X2S, X4R, X4S, X9A, X10S, Χ14Κ, X16S, X17R, X18R, X20R, Χ22Α, X22R, X24R, X24W, X25R, X25V, X26F, Χ42Ι, X43R, Χ43Α, X46R, X52F, Χ52Ε, Χ52Ν, X57R, Χ59Α, Χ62Ε, X62Q, Χ68Α, X68C, X71G, X72C, X74C. Χ75Α, X75F, X75R, X76D, X78R, X82R, X86W, Χ89Ρ, Χ89Τ, X89G, Χ89Η, Χ89Ι, X89V, X89W, Χ91Ν, Χ94Ν, X100S, Χ101Α, Χ101Ν, X101G, X101D, X103G, Χ103Ν, X104L, Χ104Ι, X106V, X106G, Χ108Ι, X111V, X112V, Χ115Κ, X115R, X117F, Χ118Ι, X121F, X128D, X128F, X128L, Χ128Ν, Χ129Ε, X144R, Χ148Ι, Χ158Ε, Χ159Ε, X160D, X166D, Χ185Ε, Χ185Ι, Χ186Η, Χ188Ε, X188D, X197F, Χ203Ε, X209S, Χ209Ν, X209F, Χ209Τ, Χ209Ε, Χ209Η, X209G, X210R, Χ212Ι, X212F, X214F, Χ215Ν, X215D, Χ215Ε, Χ217Ε, Χ217Ν, Χ224Α, Χ230Ε, Χ231Ι, X236F, X238R, Χ238Κ, Χ239Κ, X239G, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, Χ248Ι, X248V, X249R, Χ250Ι, X252R, X253R, X262D, X263F, X265F, X267V, Χ267Ν, Χ269Ι, X269R, X271F, Χ271Ι, Χ271Η, Χ271Ρ, Χ271Τ, X271V, X271L e X272F, e, opcionalmente, uma ou mais das seguintes mutações: X103A, X159D, X236H, X245R, X248DeX252K.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende uma ou mais dos seguintes conjuntos de mutações X022R-X024R, X009A-X271L, X018R-X241R, X018R-X115R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X020R-X024R, X018R-X249R, X009A-X020R, X020R-X241R, X009A-X078R, X020R-X115R, X018R-X024R, X024R-X242R, X022R-X115R, X018R-X043R, X020R-X043R, X018R-X242R, X242R-X269R, X018R-X244R, X024R-X269R, X020R-X271L, X024R-X271L, X004R-X009A, X020R-X269R, X001R-X024R, X244R-X271L, X009A-X018R, X241R-X271L, X004R-X024R, X009A-X249R, X009A-X022R, X062E-X129E, X062E-X159E, X016S-X148I, X158E-X249R, X016S-X062E, X111V-X188D, X022A-X062E, X062E-X148I, X022A-X129E, X062E-X271F, X062E-X158E, X016S-X159E, X062E-X186H, X128N-X159E, X062E-X188D, X062E-X128N, X148I-X159E, X103G-X158E, X111V-X159E, X158E-X271F, X016S-X188D, X022A-X111V, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X128N-X186H, X159E-X209E, X062E-X101A, X111V-X209E, X148I-X188D, X101A-X209E, X022A-X188D, X016S-X022A, X128N-X129E, X016S-X209E, X016S-X128N, Χ022Α-Χ089Ρ, Χ128Ν-Χ209Ε, Χ089Ρ-Χ158Ε, X062E-X103G, X186H-X271F, X016S-X129E, Χ089Ρ-Χ159Ε, X111V-X249R, Χ101Α-Χ129Ε, Χ148Ι-Χ209Ε, Χ022Α-Χ159Ε, X129E-X249R, Χ129Ε-Χ209Ε, X104L-X129E, X128N-X188D, X111V-X158E, Χ022Α-Χ158Ε, Χ062Ε-Χ209Ε, X062E-X249R, Χ101Α-Χ186Η, Χ089Ρ-Χ129Ε, X129E-X271F, X22A-X111V-X159E, X101A-X103G-X104L-X209E, X101A-X103G-X104L-Χ159Ε, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, Χ22Α-X103G-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X209E-X271F, Χ22Α-Χ101Α-Χ209Ε, X101A-X209E-X271F, X22A-X111V-X128N, Χ22Α-Χ101Α-Χ159Ε, X101A-X103G-X104L, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L, X101G-X103A-X104I, X101A-X103G-X104L-X128N, Χ103Α-Χ104Ι-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X104Ι-Χ159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, Χ62Ε-Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X271F, Χ62Ε-Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X249R, Χ22Α-Χ101 ΟΧΙ 03Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X249R, Χ101G-X103Α-Χ1041-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X24R, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X253R, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ158E-X232V-X245R-X248D-X249R, Χ22Α-Χ101G-X103Α-Χ1041-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X271F, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159E-X232V-X245R-X248D-X249R, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X238R, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ158Ε-X232V-X245R-X248D-X271F, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, Χ101 ΟΧΙ 03A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D e X101G-X103A-X104I-Χ159E-X232V-X245R-X248D-X271F.
Em um aspecto da dita composição, sendo a dita variante de protease compreende um total de três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mesmo 25 mutações, de preferência, três ou quatro, com a máxima preferência, três mutações selecionadas a partir de: X1R, X2S, X2M, X2A, X2R, X2W, X3R, X4R, X4S, X4C, X8A, X9A, X9F, X9W, X10S, X10A, X10H, X10M, X12F, X12R, X14K, X14F, X14Q, X15R, X15F, X16S, X17R, X17M, X17F, X18R, X18K, X20F, X20K, X20R, X22A, X22R, X22Y, X22V, X22Q, X22L, X22W, X23A, X23S, X23F, X24R, X24F, X24W, X24Q, X24H, X24L, X25V, X25F, X25R, X26F, X27L, X27F, X27R, X27V, X28A, X28N, X28E, X29T, X30E, X31F, X33S, X33G, X33D, X34P, X35M, X36T, X36F, X36R, X38L, X38F, X38R, X40N, X40L, X40T, X40W, X40H, X40R, X42I, X43A, X43F, X43I, X43S, X43R, X43M, X43W, X43D, X45T, X46R, X48R, X50C, X51W, X51F, X51H, X52F, X52E, X52N, X55Y, X57R, X59A, X59F, X59R, X60P, X60Q, X60A, X62E, X62Q, X63V, X63M, X63T, X63I, X63A, X63S, X63H, X63Q, X63D, X63E, X63P, X64F, X64T, X68A, X68C, X69N, X69T, X69P, X69W, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X75E, X75R, X76D, X78R, X78N, X78I, X79W, X79Q, X81R, X82F, X82T, X82V, X82R, X82M, X85M, X86W, X86L, X86I, X89P, X89T, X89G, X89H, X89L, X89V, X89W, X89F, X89I, X91N, X91F, X92F, X94N, X99F, X99T, X99P, X99G, X99M, X100S, X100N, X100Q, X100I, X101A, X101N, X101G, X101T, X101D, X101E, X101P, X101F, X102A, X102T, X102N, X102H, X102E, X103G, X103N, X103D, X103A, X104L, X104I, X104E, X104D, X105T, X105E, X105Q, X106G, X106T, X106E, X106D, X106A, X106V, X106F, X107M, X107F, X108I, X108G, X109M, X111V, X111I, X112V, X112L, X112Q, X114G, X115K, X115R, X116K, X116A, X116L, X117F, X118R, X118I, X119C, X120A, X120F, X120R, X121F, X121E, X123G, X123E, X124S, X128D, X128F, X128L, X128N, X128H, X128M, X128I, X128Q, X129E, X132A, X132E, X138G, X144R, X147L, X148I, X158E, X159D, X159E, X159C, X160D, X166D, j X166E, X167W, X175V, X177C, X181A, X182R, X183I, X183D, X183M, X183F, X183R, X185E, X185V, X185I, X186H, X186K, X188E, X188D, X188R, X192H, X192W, X194E, X194V, X194F, X197F, X198L, X198F, X203E, X203C, X208S, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X209L, X210R, X210V, X210L, X211Q, X211R, X212I, X212M, X212F, Χ213Α, X214F, Χ215Ν, X215D, Χ215Ε, Χ215Η, X215F, X216F, Χ216Α, Χ217Ε, Χ217Ν, X217D, X218D, Χ218Ρ, Χ218Ε, Χ224Α, X224G, Χ227Ι, Χ230Ε, Χ231Ι, X231C, X232V, X233C, X234F, X235F, X236F, Χ236Ν, Χ236Η, X238R, Χ238Κ, X238L, Χ239Κ, X239G, X239R, Χ239Η, Χ239Τ, Χ239Ν, X239S, X239F, X240R, X241R, X242L, X242R, X243F, X243R, X244R, X245R, X246S, X248D, X248V, Χ248Ι, X248R, X249R, Χ249Τ, Χ250Ι, X251R, X251S, Χ252Ι, X252F, X252R, Χ252Κ, Χ252Η, Χ253Ι, X253R, X253F, X254C, Χ256Ν, X258R, X260V, Χ2601, X262D, Χ262Η, X263F, X265F, X267V, Χ267Ν, Χ267Μ, Χ269Ι, X269R, X270C, Χ271Ι, X271V, Χ271Η, Χ271Μ, X271L, Χ271Ρ, Χ271Α, X271F, Χ271Τ, X272F, X272F, X272R, X273F, Χ273Ι e X274G.
Em um aspecto preferencial da dita composição, a dita variante de protease compreende um total de três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou mesmo, 25 mutações, de preferência, três ou quatro, com a máxima preferência, três mutações, selecionadas a partir de: X1R, X2S, V4R, V4S, X9A, X10S, X14K, X16S, H17R, X18R, X20R, X22A, X22R, X24R, X24W, X25R, X25V, X26F, X42I, X43R, X43A, G46R, X52F, X52E, X52N, T57R, Q59A, X62E, X62Q, X68A, X68C, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X75R, X76D, X78R, L82R, P86W, X89P, X89T, X89G, X89H, X89I, X89V, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X106V, X106G, X108I, X111V, X112V, X115K, X115R, X117F, X118I, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X144R, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X185I, X186H, X188E, X188D, D197F, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, X248I, X248V, X249R, X250I, X252R, X253R, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H, X271P, X271T, X271V, X271L e X272F; e opcionalmente uma ou mais dentre as seguintes mutações: X103A, X159D, X236H, X245R, X248D e X252K.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende: a) duas ou mais das seguintes mutações: X1R, X2S, V4R, V4S, X9A, X10S, X14K, X16S, X22A, X22R, X24R, X25V, X26F, X42I, X52F, X52E, X52N, X62E, X62Q, X68A, X68C, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X78R, X89P, X89T, X89G, X89H, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X108I, X111V, X112V, X115K, X117F, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X186H, X188E, X188D, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X248V, X249R, X250I, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H eX272F; e/ou b) um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: X062E- X129E, X062E-X159E, X016S-X148I, X158E-X249R, X016S-X062E, X111V-X188D, X022A-X062E, X062E-X148I, X022A-X129E, X062E-X271F, X062E-X158E, X016S-X159E, X062E-X186H, X128N-X159E, X062E-X188D, X062E-X128N, X148I-X159E, X103G-X158E, X111V-X159E, X158E-X271F, X016S-X188D, X022A-X111V, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X128N-X186H, X159E-X209E, X062E-X101A, X111V-X209E, X148I-X188D, X101A-X209E, X022A-X188D, X016S-X022A, X128N-X129E, X016S-X209E, X016S-X128N, X022A-X089P, X128N-X209E, X089P-X158E, X062E-X103G, X186H-X271F, X016S-X129E, X089P-X159E, X111V-X249R, X101A-X129E, X148I-X209E, X022A-X159E, X129E-X249R, X129E-X209E, X104L-X129E, X128N-X188D, X111V-X158E, X022A-X158E, X062E-X209E, X062E-X249R, X101A-X186H, X089P-X129E, X129E-X271F, X22A-X111V-X159E, X101A-X103G-X104L-X209E, X101A-X103G-X104L-X159E, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X22A-X103G-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X209E-X271F, X22A-X101A-X209E, X101A-X209E-X271F, X22A-X111V-X128N, X22A-X101A-X159E, X101A-X103G-X104L, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G- X104L, X101G-X103A-X104I, X101A-X103G-X104L-X128N, Χ103Α-Χ104Ι-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X104Ι-Χ159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, Χ101G-X103Α-Χ104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, Χ62Ε-Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X271F, Χ62Ε-Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X249R, Χ22Α-Χ101G-Χ103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X249R, Χ101G-X103Α-Χ1041-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X24R, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X253R, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159E-X232V-X245R-X248D-X249R, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D-X238R, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ158Ε-X232V-X245R-X248D-X271F, Χ101G-X103Α-Χ104Ι-Χ159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D e X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F; a dita variante que tem uma carga líquida total de 0, -1, -2, -3, -4 ou -5, de preferência, 0, -1, -2 ou -3, em relação à protease de subtilisina GG36 de B. lentus que tem a sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1. Essas variantes de protease podem ser particularmente preferenciais em um líquido aquoso para lavagem com baixa resistência iônica ou baixas concentrações de detergente.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende: a) duas ou mais das seguintes mutações X4R, X17R, X18R, X20R, X22R, X24R, X24W, X25R, X43R, X43A, X46R, X52F, X52N, X57R, X59A, X62Q, X71G, X75R, X76D, X78R, X82R, X86W, X89P, X89W, X89T, X89I, X89H, X89V, X104L, X106V, X106G, X115R, X118I, X121F, X144R, X185I, X197F, X209N, X209S, X217E, X231I, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, Χ248Ι, X249R, X252R, X253R, Χ271Τ, X271V, X271L, Χ271Η, X271F, Χ271Ρ, X1R, Χ9Α, X212F e X269R; e/ou b) um ou mais dos seguintes conjuntos de mutaçõesX022R-X024R, X009A-X271L, X018R-X241R, X018R-X115R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X020R-X024R, X018R-X249R, X009A-X020R, X020R-X241R, X009A-X078R, X020R-X115R, X018R-X024R, X024R-X242R, X022R-X115R, X018R-X043R, X020R-X043R, X018R-X242R, X242R-X269R, X018R-X244R, X024R-X269R, X020R-X271L, X024R-X271L, X004R-X009A, X020R-X269R, X001R-X024R, X244R-X271L, X009A-X018R, X241R-X271L, X004R-X024R, X009A-X249R, X009A-X022R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-Χ104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K; a dita variante de protease que tem uma carga líquida total de 0, +1, +2, +3, +4 ou +5, de preferência, que tem uma carga líquida total positiva, com a máxima preferência, +1, +2 ou +3, em relação à protease de subtilisina GG36 de B. lentus que tem a sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1. Essas variantes de protease podem ser particularmente preferenciais em um líquido aquoso para lavagem com alta resistência iônica ou altas concentrações de detergente.
Em um aspecto, a dita protease original pode ser selecionada do grupo que consiste nas enzimas disponíveis para comercialização sob os nomes comerciais Savinase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liqua-nase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme® por Novozymes A/S (Dinamarca), aquelas vendidas sob o nome comercial Maxacal®, Properase®, Purafect®, FN3®, FN4®, Excellase® e Purafect OXP® por Genencor International e aquelas disponíveis junto à Henkel/ Kemira, ou seja, BLAP (sequência mostrada na figura 29 de US 5.352.604 com as mutações a seguir S99D + S101 R + S103A + V104I + G159S, deste ponto em diante no presente documento chamada de BLAP) e BLAP X (BLAP com S3T + V4I + V205I).
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease (por exemplo, subtilisina variante) cuja progenitora tem atividade proteolítica, sendo a dita protease variante compreende uma sequência de aminoácido que se difere da sequência de ami-noácido mostrada na SEQ ID n°:1 por não mais que 50, não mais que 40, não mais que 35, não mais que 30, não mais que 25, não mais que 20, não mais que 19, não mais que 18, não mais que 17, não mais que 16, não mais que 15, não mais que 14, não mais que 13, não mais que 12, não mais que 11, não mais que 10, não mais que 9, ou não mais que 8 de resíduos de a-minoácido, em que as posições de aminoácido são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2, conforme determinado pelo alinhamento da sequência de aminoácido de protease variante com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens, sendo a subtilisina variante inclui um dos seguintes conjuntos de substituições: (a) X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K; ou (b) X87N; ou (c) X87N-S101G-V104N; ou (d) X76D, X103A- X104I.; ou (e) Y167A-R170S-A194P; ou (f) X87N-G118V-X129Q-X130A
Em um aspecto da dita composição, o dito material auxiliar pode compreender um ingrediente selecionado do grupo que consiste em: um encapsulado que compreende um perfume, um agente de matiz, tensoati-vos, coadjuvantes, agentes quelantes, agentes inibidores de transferência de corantes, dispersantes, enzimas adicionais, estabilizadores de enzima, materiais catalíticos, ativadores de alvejamento, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados, agentes poliméricos dispersantes, agentes antirreposição/remoção de sujeira à base de argila, branqueadores, supressores de espuma, corantes, perfumes, agentes elasti- ficantes de estrutura, amaciantes de tecido, carreadores, hidrótropos, elementos auxiliares ao processamento, solventes, pigmentos e misturas dos mesmos.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição pode compreender um material auxiliar selecionado do grupo que consiste em: a) encapsulados de perfume; b) agentes de matiz para tecidos; c) alvejantes solúveis em água fria; d) um catalisador de alvejante que pode compreender um catalisador metálico como um catalisador à base de metal de transição, ou, com mais preferência, um material selecionado do grupo consistindo em cátions de imínio, poliíons de imínio; zwiteríons de imínio; aminas modificadas; óxi-dos de amina modificados; N-sulfonil iminas; N-fosfonil iminas; N-acil iminas; dióxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas de açúcar cíclico e misturas dos mesmos e) lipases para primeira lavagem; f) celulases para limpeza bacteriana; g) tensoativos nãoiônicos de Guerbet; e h) misturas dos mesmos Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende uma ou mais, ou mesmo, duas ou mais das seguintes mutações A001R, Q002S, Q002M, Q002A, Q002R, Q002W, S003R, V004R, V004S, V004C, I008A, S009A, S009F, S009W, R010S, R010A, R010H, R010M, Q012F, Q012R, P014K, P014F, P014Q, A015R, A015F, A016S, H017R, H017M, H017F, N018R, N018K, G020F, G020K, G020R, T022A, T022R, T022Y, T022V, T022Q, T022L, T022W, G023A, G023S, G023F, S024R, S024F, S024W, S024Q, S024H, S024L, G025V, G025F, G025R, V026F, K027L, K027F, K027R, K027V, V028A, V028N, V028E, A029T, V030E, L031F, T033S, T033G, T033D, G034P, I035M, S036T, S036F, S036R, T038L, T038F, T038R, P040N, P040L, P040T, P040W, P040H, P040R, L042I, N043A, N043F, N043I, N043S, N043R, N043M, N043W, N043D, R045T, G046R, A048R, F050C, V051W, V051F, V051H, P052F, Ρ052Ε, Ρ052Ν, Ρ055Υ, T057R, Q059A, Q059F, Q059R, D060P, D060Q, D060A, Ν062Ε, N062Q, G063V, G063M, G063T, G063I, G063A, G063S, G063H, G063Q, G063D, G063E, G063P, H064F, Η064Τ, V068A, V068C, Α069Ν, Α069Τ, Α069Ρ, A069W, T071G, I072C, A074C, L075A, L075F, L075E, L075R, N076D, S078R, S078N, S078I, I079W, I079Q, V081R, L082F, L082T, L082V, L082R, L082M, Α085Μ, P086W, P086L, Ρ086Ι, Ε089Ρ, Ε089Τ, E089G, Ε089Η, E089L, E089V, E089W, E089F, Ε089Ι, Υ091Ν, Y091F, A092F, Κ094Ν, S099F, S099T, S099P, S099G, S099M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, Ι107Μ, I107F, Α108Ι, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, Ν116Κ, Ν116Α, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, Η120Α, H120F, H120R, V121F, V121E, N123G, Ν123Ε, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, Ρ129Ε, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, Α158Ε, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, Ν183Ι, N183D, Ν183Μ, N183F, N183R, Ν185Ε, N185V, Ν185Ι, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Υ192Η, Y192W, Α194Ε, A194V, A194F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Υ209Ν, Y209F, Υ209Τ, Υ209Ε, Υ209Η, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, Τ213Α, Y214F, Α215Ν, A215D, Α215Ε, Α215Η, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, Ν218Ρ, Ν218Ε, Τ224Α, T224G, V227I, Α230Ε, Α231Ι, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, Ν238Κ, N238L, Ρ239Κ, P239G, P239R, Ρ239Η, Ρ239Τ, Ρ239Ν, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, Ν248Ι, N248R, H249R, Η249Τ, L250I, K251R, K251S, Ν252Ι, N252F, N252R, Ν252Κ, Ν252Η, Τ253Ι, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, Τ260Ι, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, Ν269Ι, N269R, A270C, Ε271Ι, E271V, Ε271Η, Ε271Μ, E271L, Ε271Ρ, Ε271Α, E271F, Ε271Τ, A272F, A272F, A272R, A273F, Α273Ι e T274G.
Em um aspecto preferencial da composição, a dita variante de protease compreende uma ou mais, ou mesmo, duas ou mais das seguintes mutações A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N, N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L e A272F, e, opcionalmente, uma ou mais das seguintes mutações: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D e N252K.
Em um aspecto preferencial da invenção, é fornecida uma composição que compreende um material auxiliar e uma variante de protease, sendo a dita variante de protease compreende um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: G020R-N043R, N062E-A158E, S103G-A158E, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, E089P-A158E, L111V-A158E, T022A-A158E, S101A-A158E, L148I-A158E, P129E-A158E, T022A-E089P, A016S-E089P, N062E-E089P, N062E-E271F, A158E-E271F, R186H-E271F, P129E-E271F, L111V-E271F, Y209E-E271F, A016S-E271F, S188D-E271F, T022A-E271F, G159E-E271F, V104L-E271F, S101A-E271F, E089P-E271F, S128N-E271F, S103G-E271F, L148I-E271F, H249R-E271F, N062E-G159E, A016S-G159E, S128N-G159E, L148I-G159E, L111V-G159E, E089P-G159E, T022A-G159E, P129E-G159E, S103G-G159E, V104L-G159E, A158E-G159E, S101A-G159E, A158E-H249R, L111V-H249R, P129E-H249R, N062E-H249R, A016S-H249R, R186H-H249R, L148I-H249R, G159E-H249R, S101A-H249R, S188D-H249R, V104L-H249R, Y209E-H249R, T022A-H249R, S128N-H249R, S103G-H249R, E089P-H249R, Τ022Α-L111V, S101A-L111V, A016S-L111V, V104L-L111V, N062E-L111V, S103G-L111V, E089P-L111V, A016S-L148I, N062E-L148I, T022A-L148I, Ρ129Ε-L148I, V104L-L148I, S103G-L148I, S128N-L148I, S101A-L148I, Ε089Ρ-L148I, L111V-L148I, A016S-N062E, T022A-N062E, N062E-P129E, T022A-P129E, S128N-P129E, A016S-P129E, S101A-P129E, V104L-P129E, E089P-P129E, S103G-P129E, L111V-P129E, N062E-R186H, S128N-R186H, S101A-R186H, T022A-R186H, A016S-R186H, A158E-R186H, E089P-R186H, P129E-R186H, G159E-R186H, S103G-R186H, V104L-R186H, L111V-R186H, L148I-R186H, N062E-S101A, T022A-S101A, A016S-S101A, E089P-S101A, N062E-S103G, T022A-S103G, A016S-S103G, S101A-S103G, E089P-S103G, N062E-S128N, A016S-S128N, T022A-S128N, S101A-S128N, V104L-S128N, E089P-S128N, S103G-S128N, L111V-S128N, L111V-S188D, N062E-S188D, A016S-S188D, L148I-S188D, T022A-S188D, S128N-S188D, S101A-S188D, V104L-S188D, E089P-S188D, P129E-S188D, G159E-S188D, R186H-S188D, S103G-S188D, A158E-S188D, A016S-T022A, A016S-V104L, T022A-V104L, S101A-V104L, N062E-V104L, S103G-V104L, E089P-V104L, G159E-Y209E, L111V-Y209E, S101A-Y209E, A016S-Y209E, S128N-Y209E, L148I-Y209E, P129E-Y209E, N062E-Y209E, T022A-Y209E, S103G-Y209E, A158E-Y209E, S188D-Y209E, V104L-Y209E, E089P-Y209E, R186H-Y209E, N018R-W241R, G020R-W241R, S024R-W241R, S009A-W241R, G020R-W241R, V004R-W241R, N043R-W241R, S078R-W241R, T022R-W241R, G115R-W241R, A001R-W241R, S212F-W241R, L082R-W241R, N018R-V244R, S024R-V244R, S078R-V244R, G020R-V244R, S212F-V244R, S009A-V244R, L082R-V244R, A001R-V244R, N043R-V244R, T022R-V244R, V004R-V244R, G115R-V244R, W241R-V244R, S242R-V244R, A001R-V004R, S009A-T022R, N018R-T022R, G020R-T022R, V004R-T022R, A001R-T022R, S024R-S242R, N018R-S242R, V004R-S242R, G020R-S242R, S212F-S242R, L082R-S242R, S078R-S242R, A001R-S242R, S009A- S242R, T022R-S242R, G115R-S242R, N043R-S242R, W241R-S242R, N018R-S212F, T022R-S212F, V004R-S212F, S024R-S212F, A001R-S212F, G115R-S212F, G020R-S212F, S009A-S212F, N043R-S212F, S078R-S212F, L082R-S212F, S009A-S078R, G020R-S078R, S024R-S078R, T022R-S078R, N018R-S078R, V004R-S078R, A001R-S078R, N043R-S078R, T022R-S024R, G020R-S024R, N018R-S024R, A001R-S024R, V004R-S024R, S009A-S024R, V004R-S009A, A001R-S009A, S242R-N269R, S024R-N269R, G020R-N269R, T022R-N269R, H249R-N269R, S212F-N269R, N043R-N269R, V244R-N269R, A001R-N269R, N018R-N269R, S078R-N269R, S009A-N269R, G115R-N269R, W241R-N269R, V004R-N269R, L082R-N269R, N018R-N043R, G020R-N043R, V004R-N043R, T022R-N043R, S009A-N043R, A001R-N043R, S024R-N043R, S009A-N018R, V004R-N018R, A001R-N018R, S024R-L082R, S009A-L082R, N018R-L082R, A001R-L082R, S078R-L082R, G020R-L082R, T022R-L082R, V004R-L082R, N043R-L082R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, N018R-H249R, S009A-H249R, S212F-H249R, T022R-H249R, S024R-H249R, G115R-H249R, A001R-H249R, L082R-H249R, S242R-H249R, W241R-H249R, V244R-H249R, S078R-H249R, N018R-G115R, G020R-G115R, T022R-G115R, S078R-G115R, S009A-G115R, V004R-G115R, A001R-G115R, L082R-G115R, N043R-G115R, S024R-G115R, S009A-G020R, N018R-G020R, V004R-G020R, A001R-G020R, S009A-E271L, G020R-E271L, S024R-E271L, V244R-E271L, W241R-E271L, N043R-E271L, T022R-E271L, H249R-E271L, S212F-E271L, G115R-E271L, S242R-E271L, S078R-E271L, V004R-E271L, N269R-E271L, A001R-E271L, N018R-E271L, e L082R-E271L, G020K-N062E, S024F-N116L, G020K-S024F, S024R-A174T, S024R-G118R, S024R-K235F, S024R-P086R, S024R-P086W, S078R-G118R, T033S-G118R, T033S-K235F, Y209A-W241R, G020R-N076D, N018R-Q245R, S024R-R045T, A232V-Q245R, G118R-A172V, G118R-A194T, I008T-S024R, K235F-N243F, N018R-S103A, N018R-V104I, P086W-G118R, P086W-N243F, P086W-Y209A, S024C-T033S, S024R-A232V, S024R-N243F, S024R-P239Q, S024R-S101G, S024R-S141G, S024R-T033S, S024R-T274I, S024R-Y209A, S078R-P086W, S101G-A232V, T033S-L148F, T033S-P086W, T033S-P201S, T033S-S078R, T033S-W241R, T033S-Y209A, A230E-H249R, A232V-H249R, G118R-K235F, N076D-Q245R, P086W-K235F, S024R-R247H, S024R-V104A, S078R-K235F, S101G-H249R, S103A-A232V, T033S-A048T, T033S-P239T, T033S-T253A, Τ143Α-Υ209Α, Y209A-K235F, N018R-R045T, Y209A-N243F, S024R-A272P, S024R-R269C, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R, e S024R-N076D, G020R-N076D, S024R-R045T, A230E-H249R, N018R-R045T, N018R-Q245R, S101G-A232V, S024R-A232V, A232V-Q245R, S024R-S101G, N018R-V104I, N018R-S103A, S101G-H249R, A232V-H249R, S103A-A232V, N076D-Q245R, S101G-V104I, V104I-A232V, N076D-H249R, S024R-N076D, S024F-N116L, G020K-S024F, G020K-N062E, T033S-G118R, S024R-P086W, S024R-G118R, S024R-P086R, Y209A-W241R, S024R-W241R, S024R-K235F, G118R-Y209A, S078R-G118R, T033S-K235F, S024R-A174T, P086W-Y209A, I008T-S024R, P086W-G118R, T033S-W241R, S024R-N243F, S024R-Y209A, T033S-P086W, S024R-T033S, P086W-N243F, T033S-P201S, S024R-P239Q, S078R-P086W, K235F-N243F, G118R-A172V, T033S-L148F, T033S-S078R, T033S-N243F, S024C-T033S, G118R-A194T, T033S-Y209A, S024R-S141G, S024R-T274I, P086W-K235F, A015T-T033S, Y209A-K235F, S024R-R247H, S078R-K235F, S024R-V104A, T033S-A048T, G118R-K235F, T033S-T253A, T143A-Y209A, T033S-P239T, Y209A-N243F, S024R-A272P, e S024R-R269C e sendo a carga líquida total da variante é 0,+1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 ou -5 em relação à carga líquida total da protease de subtilisina GG36 de Bacillus lentus, e sendo a carga líquida total é, opcionalmente obtida por uma ou mais substituições selecionadas a partir de: N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G11.8R, Q245R, H249R, N269R, E271F, e E271L, e sendo as posições de aminoácido da variante de protease são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2, sendo a dita composição é um produto destinado ao consumidor.
Em uma modalidade preferencial, a composição compreende uma variante de protease conforme descrito acima, em que em adição a um ou mais dos conjuntos definidos de mutações, a carga líquida total da variante é ajustada a uma carga líquida total de 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4, ou -5 em relação à carga líquida total da protease de subtilisina GG36 de Bacillus lentus (SEQ ID n°:1) por uma ou mais substituições adicionais selecionadas a partir de N43D, R45T, N62E, N76D, S101D, P129E, A158E, G159D, G159E, S166D, S188D, A230E, N18R, G20K, G20R, T22R, S24R, N43R, G118R, Q245R, H249R, N269R, E271F e E271L. Em uma modalidade preferencial, a carga negativa é adicionada por uma ou mais substituições selecionadas a partir de N043D, R045T, N076D e A230E. Em uma modalidade preferencial, a carga positiva é adicionada por uma ou mais substituições selecionadas a partir de G020K, S024R, G118R, Q245R, H249R, E271FeE271L.
Em uma composição preferencial, a variante de protease é selecionada a partir de variantes de protease que têm um ou mais dos conjuntos de mutações selecionadas do grupo que consiste em: G020R-N043R, N062E-A158E, S103G-A158E, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, E089P-A158E, L111V-A158E, T022A-A158E, S101A-A158E, L148I-A158E, P129E-A158E, T022A-E089P, A016S-E089P, N062E-E089P, N062E-E271F, A158E-E271F, R186H-E271F, P129E-E271F, L111V-E271F, Y209E-E271F, A016S-E271F, S188D-E271F, T022A-E271F, G159E-E271F, V104L-E271F, S101A-E271F, E089P-E271F, S128N-E271F, S103G-E271F, L148I-E271F, H249R-E271F, N062E-G159E, A016S-G159E, S128N-G159E, L148I-G159E, L111V-G159E, E089P-G159E, T022A-G159E, P129E-G159E, S103G-G159E, V104L-G159E, A158E-G159E, S101A-G159E, A158E-H249R, L111V-H249R, P129E-H249R, N062E-H249R, A016S-H249R, R186H-H249R, L148I-H249R, G159E-H249R, S101A-H249R, S188D-H249R, V104L-H249R, Y209E-H249R, T022A-H249R, S128N-H249R, S103G-H249R, E089P-H249R, T022A-L111V, S101A-L111V, A016S-L111V, V104L-L111V, N062E-L111V, S103G-L111V, E089P-L111V, A016S-L148I, N062E-L148I, T022A-L148I, P129E-L148I, V104L-L148I, S103G-L148I, S128N-L148I, S101A-L148I, E089P-L148I, L111V-L148I, A016S-N062E, T022A-N062E, N062E-P129E, T022A-P129E, S128N-P129E, A016S-P129E, S101A-P129E, V104L-P129E, E089P-P129E, S103G-P129E, L111V-P129E, N062E-R186H, S128N-R186H, S101A-R186H, T022A-R186H, A016S-R186H, A158E-R186H, E089P-R186H, P129E-R186H, G159E-R186H, S103G-R186H, V104L-R186H, L111V-R186H, L148I-R186H, N062E-S101A, T022A-S101A, A016S-S101A, E089P-S101A, N062E-S103G, T022A-S103G, A016S-S103G, S101A-S103G, E089P-S103G, N062E-S128N, A016S-S128N, T022A-S128N, S101A-S128N, V104L-S128N, E089P-S128N, S103G-S128N, L111V-S128N, L111V-S188D, N062E-S188D, A016S-S188D, L148I-S188D, T022A-S188D, S128N-S188D, S101A-S188D, V104L-S188D, E089P-S188D, P129E-S188D, G159E-S188D, R186H-S188D, S103G-S188D, A158E-S188D, A016S-T022A, A016S-V104L, T022A-V104L, S101A-V104L, N062E-V104L, S103G-V104L, E089P-V104L, G159E-Y209E, L111V-Y209E, S101A-Y209E, A016S-Y209E, S128N-Y209E, L148I-Y209E, P129E-Y209E, N062E-Y209E, T022A-Y209E, S103G-Y209E, A158E-Y209E, S188D-Y209E, V104L-Y209E, E089P-Y209E, R186H-Y209E, N018R-W241R, G020R-W241R, S024R-W241R, S009A-W241R, G020R-W241R, V004R-W241R, N043R-W241R, S078R-W241R, T022R-W241R, G115R-W241R, A001R-W241R, S212F-W241R, L082R-W241R, N018R-V244R, S024R-V244R, S078R-V244R, G020R-V244R, S212F-V244R, S009A-V244R, L082R-V244R, A001R-V244R, N043R-V244R, T022R-V244R, V004R-V244R, G115R-V244R, W241R-V244R, S242R-V244R, A001R-V004R, S009A-T022R, N018R-T022R, G020R-T022R, V004R-T022R, A001R-T022R, S024R-S242R, N018R-S242R, V004R-S242R, G020R-S242R, S212F-S242R, L082R-S242R, S078R-S242R, A001R-S242R, S009A-S242R, T022R-S242R, G115R-S242R, N043R-S242R, W241R-S242R, N018R-S212F, T022R-S212F, V004R-S212F, S024R-S212F, A001R-S212F, G115R-S212F, G020R-S212F, S009A-S212F, N043R-S212F, S078R-S212F, L082R-S212F, S009A-S078R, G020R-S078R, S024R-S078R, T022R-S078R, N018R-S078R, V004R-S078R, A001R-S078R, N043R-S078R, T022R-S024R, G020R-S024R, N018R- S024R, A001R-S024R, V004R-S024R, S009A-S024R, V004R-S009A, A001R-S009A, S242R-N269R, S024R-N269R, G020R-N269R, T022R-N269R, H249R-N269R, S212F-N269R, N043R-N269R, V244R-N269R, A001R-N269R, N018R-N269R, S078R-N269R, S009A-N269R, G115R-N269R, W241R-N269R, V004R-N269R, L082R-N269R, Ν018R-N043R, G020R-N043R, V004R-N043R, T022R-N043R, S009A-N043R, A001R-N043R, S024R-N043R, S009A-N018R, V004R-N018R, A001R-N018R, S024R-L082R, S009A-L082R, N018R-L082R, A001R-L082R, S078R-L082R, G020R-L082R, T022R-L082R, V004R-L082R, N043R-L082R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, N018R-H249R, S009A-H249R, S212F-H249R, T022R-H249R, S024R-H249R, G115R-H249R, A001R-H249R, L082R-H249R, S242R-H249R, W241R-H249R, V244R-H249R, S078R-H249R, N018R-G115R, G020R-G115R, T022R-G115R, S078R-G115R, S009A-G115R, V004R-G115R, A001R-G115R, L082R-G115R, N043R-G115R, S024R-G115R, S009A-G020R, N018R-G020R, V004R-G020R, A001R-G020R, S009A-E271L, G020R-E271L, S024R-E271L, V244R-E271L, W241R-E271L, N043R-E271L, T022R-E271L, H249R-E271L, S212F-E271L, G115R-E271L, S242R-E271L, S078R-E271L, V004R-E271L, N269R-E271L, A001R-E271L, N018R-E271L e L082R-E271L.
Em outro aspecto, os inventores descobriram que proteases preferenciais compreendem pelo menos uma, ou mesmo, duas ou mais mutações carregadas selecionadas do grupo que consiste em N062E, S101D, P129E, A158E, G159D/E, S166D e/ou S188D. Essas proteases são particularmente preferenciais para a incorporação em composições detergentes adequadas para a adição em água para produzir um líquido de lavagem, de preferência, que tem baixa resistência iônica ou baixa concentração de detergente. Dessa forma, em um aspecto preferencial da invenção, essas proteases formarão parte de uma composição detergente que é adicionada em água, para um processo de lavagem manual ou lavagem à máquina, tipicamente, dentro de uma máquina de lavar, para formar um líquido de lavagem, cuja condutividade é de cerca de 0,1 mS/cm a cerca de 3 mS/cm, de cerca de 0,3 mS/cm a cerca de 2,5 mS/cm, ou mesmo de cerca de 0,5 mS/cm a cerca de 2 mS/cm.
Em um outro aspecto, essas proteases que compreendem pelo menos uma, ou mesmo, duas ou mais mutações carregadas selecionadas do grupo que consiste em N062E, S101D, P129E, A158E, G159D/E, S166D, e/ou S188D tem uma carga de 0, -1, -2, -3, -4 ou -5, de preferência, 0, -1, -2 ou -3, com a máxima preferência, -1 ou -2 em relação à enzima da SEQ ID n°:1. As mutações preferenciais para chegar a uma carga líquida desejada compreendem uma, duas ou mais mutações selecionadas do grupo que consiste em: G20K, S024R, G118R, Q245R, H249R e E271F/L.
De acordo com a presente invenção, as proteases particularmente preferenciais para uso na invenção: (a) compreendem uma ou mais mutações carregadas selecionadas do grupo que consiste em N062E, S101D, P129E, A158E, G159D/E, S166D, e/ou S188D; e/ou (b) têm uma carga de 0, -1, -2, -3, -4 ou -5, de preferência, 0, -1, -2 ou -3, com a máxima preferência, -1 ou -2 em relação à enzima da SEQ ID n°:1; e/ou (c) compreendem uma, duas, três ou mais mutações para chegar a uma carga líquida desejada selecionada a partir do grupo que compreende G20K, S024R, G118R, Q245R, H249R e/ou E271F/L.
Por "mutações para chegar a uma carga líquida desejada," se destina a significar que quando a variante de enzima é comparada com a protease de subtilisina GG36 de Bacillus lentus, a carga líquida total da variante em relação à subtilisina GG36 de Bacillus lentus pode ser ajustada para estar dentro da faixa desejada através da seleção de uma ou mais mutações adicionais, de preferência, selecionada a partir das mutações identificadas, por exemplo, listadas em (c) acima.
De preferência, essas proteases preferenciais formam parte de uma composição detergente que é adicionada em água, em um processo de lavagem manual ou lavagem à máquina, tipicamente, dentro de uma máquina de lavar, para formar um líquido de lavagem, cuja condutividade é de cerca de 0,1 mS/cm a cerca de 3 mS/cm, de cerca de 0,3 mS/cm a cerca de 2,5 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 0,5 mS/cm a cerca de 2 mS/cm.
Sem se ater à teoria, acredita-se que essas mutações para chegar a uma carga líquida desejada fornecem desempenho de protease avançado geral, garantindo excelente carga da molécula para condições de baixa resistência iônica, ou líquidos de lavagem que compreendem baixa concentração de detergente - é somente através da combinação cuidadosa de determinadas mutações, das quais essas são preferenciais, que tais proteases preferenciais podem ser obtidas.
Em outro aspecto, os inventores descobriram que proteases preferenciais compreendem pelo menos uma ou mais mutações carregadas selecionadas do grupo que consiste em N018R, G020K/R, T022R, S024R, N043R, Q245R, H249R e/ou N269R. Essas proteases são particularmente preferenciais para a incorporação em composições detergentes que serão adicionadas em água para produzir um líquido de lavagem, de preferência, que têm alta resistência iônica ou alta concentração de detergente. Por e-xemplo, essas proteases preferenciais podem formar parte de uma composição detergente que é adicionada em água, para lavagem manual ou lavagem à máquina, tipicamente, dentro de uma máquina de lavar, para formar um líquido de lavagem, cuja condutividade é acima de cerca de 3 mS/cm a cerca de 30 mS/cm, de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 20 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 4 mS/cm a cerca de 10 mS/cm.
Em um outro aspecto, tais proteases compreendem pelo menos uma, ou duas ou mesmo mais mutações carregadas selecionadas do grupo que consiste em N018R, G020K/R, T022R, S024R, N043R, Q245R, H249R e/ou N269R têm uma carga de 0, +1, +2, +3, +4 ou +5, de preferência, +1, +2 ou +3, com a máxima preferência, +2 em relação à enzima da SEQ ID n°:1. As mutações preferenciais para chegar a uma carga líquida desejada compreendem uma, duas ou mais mutações selecionadas do grupo que consiste em: N043D, R045T, N076D e/ou A230E.
Em particular, as proteases preferenciais: (a) compreendem uma ou duas ou mais mutações carregadas selecionadas do grupo que consiste em N018R, G020K/R, T022R, S024R, N043R, Q245R, H249R e/ou N269R; e/ou (b) têm uma carga de 0, +1, +2, +3, +4 ou +5, de preferência, +1, +2 ou +3, com a máxima preferência, +2 em relação à enzima da SEQ ID n°:1; e/ou (c) compreendem mutações para chegar a uma carga líquida desejada selecionada do grupo que consiste em N043D, R045T, N076D e/ou A230E.
De preferência, essas proteases formam parte de uma composição detergente que é adicionada em água em um processo de lavagem manual ou lavagem à máquina, tipicamente, dentro de uma máquina de lavar, para formar um líquido de lavagem, cuja condutividade é acima de cerca de 3 mS/cm a cerca de 30 mS/cm, de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 20 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 4 mS/cm a cerca de 10 mS/cm.
Sem se ater à teoria, acredita-se que essas mutações para chegar a uma carga líquida desejada fornecem desempenho de protease avançado geral em alta resistência iônica ou condições de alta concentração de detergente - é somente através da combinação cuidadosa de determinadas mutações, das quais essas são preferenciais, que tais proteases preferenciais podem ser obtidas.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende um ou mais, de preferência, dois ou mais, ou três ou mais dos seguintes conjuntos de mutações T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E- S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, Τ022Α-Ε089Ρ, S128N-Y209E, Ε089Ρ-Α158Ε, Ν062Ε-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, Ρ129Ε-Υ209Ε, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, Τ022Α-Α158Ε, Ν062Ε-Υ209Ε, N062E-H249R, S101A-R186H, Ε089Ρ-Ρ129Ε, P129E-E271F, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101 Αεί 03G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101 Αεί 03G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S'101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, 8101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-8103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, 8101G-S103A-V104!-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D- E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D e S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: G020K-G023A-N043W-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D, G020K-G023A-N062E-N116L, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D, G020K-G023A-N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-G1OOS-N116L-A158E-S166D-N243F, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D, G020K-N062E, G020K-N062E-N116L, G020K-N062E-N116L-S188D, G020K-N062E-N116L-T213A, G020K-N062E-S188D-T213A, G020K-S024F-N062E-N116L-G118R-S188D, G020K-S024F-N062E-N116L-S188D, G020K-S024F-N062E-S188D-T213A, G023A-N062E-N116L-S188D, G023A-S024F-N062E-N116L-T213A, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043W-N062E-N116L, N043W-S101D-S212M-N243F, N062E-N116L-G118R-S188D, N062E-N116L-G118R-T213A, N062E-N116L-S188D-T213A, S024F-G118R-S128I-P129E-G159D, S024F-N062E-N116L-S188D, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101D-S103N-N116L-S144R-A215D, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D- S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-L217E-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022L-T038F-A048R-N062E-G100S-R186K, T033S-N043W-N218D-P239G-N243F, V026F-A048R-S105T-T213A-N218D-T224A, V026F-L031F-S078N-G102A-S160D, V026F-V051W-V104L-S106E, V104L-S105T-T213A-L217E-S256N, A016S-N062E-A158E-H249R, A016S-N062E-A158E-R186H-E271F, A016S-N062E-A158E-R186H-H249R, A016S-N062E-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, G020K-G023A-N062E-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-G118R-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-S188D-T213A-P239G, G020K-S024F-N062E-S188D-P239G, G023A-N062E-N116L-G118R, G023A-N062E-N116L-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-N062E-N116L-G118R, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N062E-A158E-G159E-H249R, N062E-A158E-H249R, N062E-A158E-R186H-E271F, N062E-A158E-R186H-H249R, N062E-A158E-R186H-H249R-E271F, N062E-A158E-S188D-H249R, N062E-A158E-S188D-H249R-E271F, N062E-G159E-H249R, N062E-G159E-H249R-E271F, N062E-G159E-R186H-H249R, N062E-G159E-S188D-H249R, N062E-R186H-S188D-H249R-E271F, N062E-S101A-A158E-H249R, N062E-S101A-A158E-R186H-E271F, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R-E271F, N062E-S101A-G159E-H249R, N062E-S101A-R186H-H249R, N062E-S101A-S188D-H249R, N062E-S101A-S188D-H249R-E271F, N062E-S101A-V104L-A158E-R186H-E271F, N062E-S128N-A158E-G159E-E271F, N062E-V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S024F-N062E-N116L-P239G, S024F-N062E-S188D-T213A, S024F-N116L, S024R-N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D- H249R, S024R-S101G-S103A-V104Ι-Α158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104Ι-Α158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104Ι-Α158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148l-A 158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101A-S103A-V1041-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F-E271F, S101A-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S128N-A158E-R186H-E271F, S101A-S128N-A158E-Y209E-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222Q-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-M222Q-Q245R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E- S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103G-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S128N-A158E-G159E-E271F, S128N-A158E-H249R, S128N-A158E-R186H-E271F, S128N-A158E-R186H-H249R, S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, S128N-A158E-S188D-E271F, S128N-A158E-S188D-H249R, S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, S128N-Α158E-Y209E-, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N062E-A158E, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E- S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S024R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-H249R, V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-H249R, e/ou V104L-S128N-A158E-S188D-H249R. Essas variantes de protease são variantes de protease altamente preferenciais para uso em métodos de tratamento e/ou limpeza de superfícies em que (i) a superfície é colocada em contato com uma composição que compreende um material auxiliar e uma variante de protease em um líquido aquoso para lavagem; e (ii) uma superfície é, então, enxaguada e/ou seca em que o líquido aquoso para lavagem tem, de preferência, baixa resistência iônica e/ou baixa concentração de detergente.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: A016S-N062E-A158E-H249R-E271F, A016S-N062E-S128N-R186H-E271F, A016S-N062E-V104L-R186H-S188D-E271F, A016S-S101A-S128N-R186H, A016S-S128N-A158E-R186H, A016S-V104L-A158E-R186H-E271F, A016S-V104L- S188D-H249R, A158E-R186H-H249R, A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, G020K-G023A-N116L-S188D, G020K-G023A-S024F-N062E-N116L-S188D-T213A, G020K-N043W-N062E-N116L-P239G, G020K-S024F-N043W-N062E-N116L-T213A, G020K-S024F-N062E, G023A-N043W-Ν062Ε-Ν116L-G118R-T213Α, G023A-T038F-S078N-G100S-S212M-A215D, G100S-N116L-A158E-T213A, G102A-S103N-S105T-A194E, H017R-T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N043W-N062E-N116L-S188D, N062E-A158E-H249R-E271F, N062E-A158E-R186H-S188D-H249R, N062E-L148I-G159E, N062E-N116L-S188D, N062E-R186H-H249R, N062E-S078N-G102A-N116L-S144R-L250I, N062E-S101A-A158E-R186H-H249R, N062E-S101A-A158E-S188D-H249R, N062E-S101A-R186H, N062E-S101A-R186H-E271F, N062E-S101A-R186H-H249R-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-E271F, N062E-S101A-R186H-S188D-H249R, N062E-S101A-V104L-R186H-S188D-E271F, N062E-S128N-A158E, N062E-S128N-G159E-H249R, N062E-S188D-P239G, N062E-V104L-G159E-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N076D-S101 Αεί 03A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A114V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, S024F-A048R-G118R-S166D-L217E, S024F-N062E-N116L, S024F-N062E-N116L-T213A-P239G, S024F-N062E-S188D-P239G, S024F-S101D-G118R-A215D-L250I-A272F, S024R-K027R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104Ι-Ρ129E-L148I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104Ι-Ρ129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104Ι-Ρ129Q-S130Α-Α158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S078N-V104L-G118R-S128D, S101A-A158E-R186H-H249R, S101A-A158E-R186H-S188D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101A-S103G-A158E-R186H-H249R, S101A-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S128N-A158E-H249R, S101A-S128N-A158E-S188D-Y209E-E271F, S101A-S128N-A158E-Y209E, S101A-S128N-P129E-R186H-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-H249R, S101A-V104L-A158E-R186H-S188D-E271F, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-A232V-M222S-Q245R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-S130A-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D- A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128L-S130A-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S130A-A158E-N183D-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104L-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103S-V104V-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N043R-N062E-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S101D-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-N043R-S103A-V104I-G118R-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-N043R-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S024R-N043R-S101D-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S101D-S103A-V104I-G118R-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-L148I-A158E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D-E271F, T022A-S024R-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101A-A158E-R186H- H249R, T022A-S101G-S103A-V104Ι-Α158E-G159E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104Ι-Α158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104Ι-Ρ129Ε-Α158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104Ι-Ρ129Ε-Α158E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104Ι-Ρ129E-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022L-L031F-G102A-S128D-T224A-N243F, T022L-T038F-V121F-S160D-A272F, V026F-S078N-G159C-R186K-N243F, V104L-A158E-H249R, V104L-A158E-R186H-H249R, V104L-A158E-R186H-H249R-E271F, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, V104L-A158E-R186H-S188D-H249R-E271F, V104L-A158E-S188D-H249R-E271F, V104L-S128N-A158E-R186H-S188D-E271F, V104L-S128N-G159E-E271F, V104L-S128N-R186H-S188D-H249R, e/ou V121F-N185E-T224A-P239G. Essas variantes de protease são variantes preferenciais para uso em métodos de tratamento e/ou limpeza de superfícies em que (i) a superfície é colocada em contato com uma composição que compreende um material auxiliar e uma variante de protease em um líquido a-quoso para lavagem; e (ii) uma superfície é, então, enxaguada e/ou seca em que o líquido aquoso para lavagem tem, de preferência, baixa resistência iônica e/ou baixa concentração de detergente.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: A016S-S128N-R186H-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-M222S-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R- Ε271G, S024R-S101G-S103A-V104I-S128L-P129Q-S130A-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-P129Q-A158E-N183D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, T022A-S101G-G102A-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, A016S-A158E-H249R, A016S-A158E-H249R-E271F, A016S-A158E-R186H-H249R, A016S-L111V-S188D-, A016S-T022A-A158E-R186H-E271F, A048R-S078N-N116L-N185E-L217E-P239G, A048R-S128D-N185E-P239G, A158E-R186H-H249R-E271F, E089P-S101A-P129E-R186H, G020K-G023A-N043W-N116L-S188D-T213A-P239G, G020K-G023A-N062E-N116L-G118R-T213A, G020K-G023A-S024F-N062E-S188D-T213A-P239G, G020K-K027R-P129E-S166D-P239G, G020K-S024F-N062E-P239G, G020K-S024F-T033S-P129E-A194E, G023A-G100S-A194E-S212M, G023A-N043W-N116L-G118R-S188D, G023A-S024F-G118R-S188D-P239G, G023A-S024F-K027R-N062E, G023A-S024F-N043W-N062E-N116L-G118R, G023A-S024F-N116L-G118R-S188D-T213A, G023A-S024F-N116L-S188D-P239G, K027R-G100S-G118R-S160D-S188D-N243F, K027R-S101D-S103N-S105T-A272F, N043R-N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, N062E-S078N-N116L-T224A, N062E-V104L-A158E-R186H-S188D-H249R, N076D-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S166D-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024F-G102A-R186K-T213A-L217E-N243F, S024F-N043W-G118R-S188D, S024F-N043W-V104L-V121F-P129E, S024F-N116L-G118R-S188D-P239G, S024F-S103N-V104L-G118R-S188D, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N043R-S101A-S103A-V104I-A158E-S188D-L217E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R-E271F, S024R-S101G-S103A-V104I-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-A158E-G159E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101A-L111V-P129E, S101A-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-S103S- V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101A-V104L-S128N-A158E-R186H, S101G-S103A-V104I-P129E-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103S-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101S-S103A-V104L-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S128N-P129E-R186H, T022A-A158E-R186H-H249R-E271F, T022A-S024K-S101G-S103A-V1041-S128N-A158E-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T022A-S024R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-N248D, T022A-S101G-S103À-V104I-L148I-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-G159E-A232V-Q245R-N248D, T022A-S101G-S103A-V104I-S128N-P129E-A158E-A232V-N238R-Q245R-N248D, T022A-S128N-A158E-R186H, T022A-S128N-R186H-S188D-, T022A-V104L-A158E-H249R, T022A-V104L-R186H-S188D-H249R, T022L-G023A-K027R-S101D-V104L-S216F, T022L-S078N-N116L-P129E-S256N, T022L-S078N-S128D-T213A, T033S-G118R-P129E-A194E-P239G, T033S-S105T-S188D-S216F, V026F-V104L-S256N-A272F, T022A-N043R-S103A-V104I-S128I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D, T022A-S024R-N043R-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-N248D, T022A-S101D-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G118R-P129E-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F, T022A-S103A-V104I-G159D-S188D-L217D-A232V-Q245R-N248D-E271F e/ou T022A-S103A-V104I-S128I-P129E-G159D-S188D-A232V-N248D-E271F. Essas variantes de protease são úteis especialmente em métodos de tratamento e/ou limpeza de superfícies em que (i) uma superfície é colocada em contato com uma composição que compreende um material auxiliar e uma variante de protease em um líquido aquoso para lavagem; e (ii) uma superfície é, então, enxaguada e/ou seca em que o líquido aquoso para lavagem tem, de preferência, baixa resistência iônica e/ou baixa concentração de detergente.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: G118R- Υ209Α, G118R-Y209A-N243F, L021M-S024R-T033S, P005S-S078R-G118R-W241R, P086W-G118R-A133V, P086W-G118R-N243F, P086W-G118R-Y209A, P086W-Y209A-N243F, S024R-A174T, S024R-G118R, S024R-G118R-Y209A, S024R-G118R-Y209A-K235F, S024R-G118R-Y209A-N243F, S024R-K235F, S024R-P086R, S024R-P086S-S141G, S024R-P086W, S024R-P086W-G118R, S024R-P086W-G118R-V203I, S024R-P086W-N243F, S024R-P086W-Y209A, S024R-S078R-P086W, S024R-S078R-P086W-G118R-A270T, S024R-S078R-P086W-N243F, S024R-T033S-A133V, S024R-T033S-G118R, S024R-T033S-P086S-S085N-K235F, S024R-T033S-P086S-S087N-Y209A, S024R-T033S-P086W, S024R-T033S-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-P086W, S024R-T033S-S078R-P086W-G118R, S024R-T033S-S078R-Y209A, S024R-T033S-W241R, S024R-T033S-Y209A-K235F, S024R-Y209A-W241R, S078R-G118R, S078R-P086W-K235F, S078R-P086W-N243F, S078R-P086W-Y209A, S078R-Y209A-K235F, T033S-A172V-Y209A, T033S-G118R, T033S-G118R-G159D-Y209A, T033S-G118R-N243F, T033S-G118R-W241R, T033S-G118R-Y209A-N243F, T033S-K235F, T033S-P086W-G118R, T033S-P086W-G118R-Y209A-N243F, T033S-P086W-N243F, T033S-S078R-P086W, T033S-S078R-P086W-G118R-Y209A, T033S-S078R-Y209A, T033S-Y209A-N243F, Y209A-W241R, A001R-S009A-N043R, A001R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, A001T-N018R-S024R-N076D-N116A-T213A-H249R, A194F-G211Q-Q236N, E089I-N116A-N117F-T224A-H249R, G020R-G025R-N116A-Y167W, G020R-H249R-N269R, G020R-N043D-N076D-A230E-H249R, G020R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N043R-A230E, G020R-N043R-A230E-S242R, G020R-N043R-E271L, G020R-N043R-H249R, G020R-N043R-H249R-E271L, G020R-N043R-N269R, G020R-N043R-R045T-A230E, G020R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-N043R-R045T-S242R, G020R-N043R-S101A-N116A-T213A-A215F, G020R-N043R-S101A-N269R, G020R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043R-S212F, G020R-N043R S212F-W241R, G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-S242R-E271L, G020R-N043R-S242R-H249R, G020R-N043R-V244R, G020R-N043R-W241R, G020R-N062Q-E089I-R186K-S212M, G020R-N076D, G020R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N076D-S101G-S103Α-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-N116A-N269R, G020R-P052N-N062Q-Y091F-Y192W, G020R-Q059A-S144R-Y192W-T224A, G020R-S024R-K27E-N043R-N076D-A230E, G020R-S024R-N043D-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S242R, G020R-S024R-N043R-R045T, G020R-S024R-N043R-R045T-H249R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116Α, G020R-S024R-N043R-R045T-N116Α-Τ213Α, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-N269R, G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-T213A, G020R-S024R-N043R-S242R, G020R-S024R-N076D-H249R, G020R-S024R-N116A, G020R-S024R-N116A-A215F, G020R-S024R-N116A-T213A, G020R-S024R-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-P052N-Q059A-S216F, G020R-S024R-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-R045T-N116A-N269R, G020R-S024R-R045T-N269R, G020R-S024R-S101A-A215F, G020R-S024R-S101Α-Ν116Α, G020R-S024R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-H249R, G020R-S024R-S242R-H249R, G020R-S024R-T213A, G020R-S024R-T213A-A215F, G020R-S078R-S101A-S103A-V104Ι-Ν11 ΘΑ-NI 83D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104Ι-Α215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104Ι-Ν116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V1041-Ν116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-N116A-N269R, G020R-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-G118R-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104L-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103S-V104V-A232V-Q245R, G020R-S101G-I198L-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104Ι-Α215F-A232V- Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S101G- S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, 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S024R-N076D-V104I-A232V-Q245R, S024R-N116A-T213A-N269R, S024R-R045T, S024R-R045T-N076D-A230E-S242R-H249R, S024R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S078R-S212F, S024R-S078R-V104L-N116A-N183D, S024R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101A-H120F-A194F-H249R, S024R-S101A-N269R, S024R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S024R-S101G-V104I-Q245R, S024R-S103A-Q245R, S024R-S103A-V104I-A232V-H249R, S024R-S103A-V1041-H249R, S024R-S103A-V104I-Q245R, S024R-Y167W-T224A-H249R, S078R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S078R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S078R-S103N-S106G-Y167W-Q236N, S078R-V104L-T213A-A215F-T224A, S078R-Y091F-V121F-L233C-N252R, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S087R-S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S099F-S144R-Y167W-N252R, S101A-H120F-Y192W-A215F-T224A, S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-E271L, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-V244R-Q245R, S101G-S103A-V104I-G115R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-N116A-T213A-A232V-Q245R-N269R, S101G-S103A-V10410109R-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-Q109R-S212P-A232V-Q245R-E271V, S101G-S103A-V104I-S212F-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R- H249R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, S105T-S128N-S144R-L148I-S212M, S106G-N117F-N238L, S144R-G211Q-N238L-P239S-H249R, T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, T022W-S078R-Y167W-S212M-A270C, T057R-E089I-I198L, T057R-S099F-S105T-I198L-T213A, T057R-S099F-V121F-N185I-Y192W, T057R-Y167W-H249R, V004R-G020R-H249R, V004R-G020R-N043R, V004R-G020R-S024R, V004R-G020R-S024R-H249R, V004R-G020R-S024R-N043R, V004R-G020R-S024R-N043R-S242R, V004R-G020R-S024R-V244R, V004R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V004R-S009A-G020R-N043R, V004R-S009A-G020R-N043R-S242R, V004R-S009A-G020R-S024R-S242R, V004R-S009A-G020R-S242R, V004R-S009A-N043R-W241R, V004R-S009A-S024R-N043R-W241R, V004R-S009A-S078R-W241R, V004R-S009A-W241R, V004R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, V104L-L217E-T224A-H249R-N252R, V104L-T213A-S216F, V121F-N252R-A270C, e/ou Y091F-S099F-S101A-S105T-Y167W. Essas variantes de protease são variantes de protease altamente preferenciais para uso em métodos de tratamento e/ou limpeza de superfícies em que (i) a superfície é colocada em contato com uma composição que compreende um material auxiliar e uma variante de protease em um líquido aquoso para lavagem; e (ii) a superfície é, então, enxaguada e/ou seca em que o líquido aquoso tem alta resistência iônica e/ou alta concentração de detergente.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: S101G-S103A-V104I-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, A232V-Q245R, E089I-N117F-N185I-A215F-L233C, G020R-E089I-L217E, G020R-G023A-V104L-Y192W-L233C, G020R-N043D-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-N043R-N076D-A230E-H249R, G020R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V- Q245R-N269R, G020R-N116A-A215F-N269R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-R045T-N116A-N269R, G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-A215F, G020R-S024R-K27R-N043D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S024R-N043R-N076D, G020R-S024R-N043R-R045T-A215F, G020R-S024R-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043R-R045T-N116A-T213A-A215F, G020R-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-T38I-N043R-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-1198L-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V1041-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-A131V-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R-E271G, G020R-S078R-S101G-S103A-V104I-T180A-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101 Αεί 03A-V1 04I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103G-V104V-A232V-Q245R, G020R-8101G-S103A-V104I-N116A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N183D-G211Q-A232V-Q245R-, G020R-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S242R-H249R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-1198L-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104Ι-Ν116Α-Ν183D-G211Q-T213Α-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116Α-Ν183D-T213Α-Α215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101A-S103Α-V104Ι-Ν183D-1198L-T213Α-Α215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S078R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-N116A-1198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-A215F-A232V-Q245R, 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G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-1198L-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S103A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S078R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101A-S103A-V104I-N116A-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T22W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R- T22W-S101G-S103A-V1041 - Ν116Α-Ν183D-T213Α-Α215F-A232V-Q245R, G025R-N043A-Y091F-I198L-A270C, G025R-S105T-S128N-S144R-A270C, G046R-E089I-S099F-R186K-S212M, G118R-A172V, G118R-A194T, G118R-Y209A-K235F, H017Y-S024R-T033S-P086W, I008T-S024R, K027R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, K027R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, K235F-N243F, N018R-G020R-H249R, N018R-G020R-N043D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-A230E-S242R, 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N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-Ν116A-I198L-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101 A-N 116A-1198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101 A-N 116A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-1198L-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-G211Q-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-S101A-N116A-I198L-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-T213A-A215F-H249R, N018R-V104I, N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-A272V, N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R-R275S, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-V234I-Q245R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-N218S-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N062Q-S101A-Q236N-N252R-A270C, N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N076D-S101G-S103A-V1041-A232V-S242R-Q245R, P005S-S024R-T033S-N243F, P014L-G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-A215F, P052N-V104L-N183D-S216F-H249R, P086W-G118R, P086W-N243F, P086W-Y209A, Q012H-G020R-S078R-S101G-S103A-V1041-1198L-G211Q-T213A-A232V-Q245R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, R045T-S242R-H249R, S024C-T033S, S024R-A232V, S024R-G046R-Y091F-V121F, S024R-G118R-K235F, S024R-N043A-S105T-S106G-I198L, S024R-N043D-R045T-S242R-H249R, S024R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043D-S242R-H249R, S024R-N043R-N076D, S024R-N043R-N076D-A230E-S242R, S024R-N043R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S242R-H249R, S024R-N043R-S101A-T213A, S024R-N076D-Q245R, S024R-N076D-S101G-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-M175L-A232V-Q245R, S024R-N076D-S101G-Q245R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-N076D- S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-V104I-Q245R, S024R-N243F, S024R-P086R-G118R, S024R-P086W-Y209A-K235F, S024R-P239Q, S024R-Q245R-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-S101G, S024R-S101G-Q245R, S024R-S101G-V104I-H249R, S024R-S103A-A232V, S024R-S103A-M175L-A232V-H249R, S024R-S141G, S024R-T033S, S024R-T033S-A194T, S024R-T033S-G118R-K235F, S024R-T033S-G118R-Y209A, S024R-T033S-K235F, S024R-T033S-S078R-G118R, S024R-T033S-S078R-N243F, S024R-T033S-Υ209Α, S024R-T033S-Y209A-N243F, S024R-T274I, S024R-V104I-H249R, S024R-V104I-Q245R, S024R-Y091F-I198L-A215F-P239S, S024R-Y209A, S024R-Y209A-K235F, S024R-Y209A-S242P, S078R-P086W, S078R-S099F-N116A-R186Κ-Τ224Α, S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S101G-A232V, S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, S101G-S103A-V104I-Q245R, S105T-G211Q-S216F, S106G-N185I-S216F-Q236N, T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, T033S-G118D-A138V-Y209A, T033S-G118R-Y209A-, T033S-L148F, T033S-N243F, T033S-P086W, T033S-P201S, T033S-S078R, T033S-W241R, T033S-Y209A, T033S-Y209A-K235F, V004M-Ν018R-S024R-N076D-N116Α-1198L-G211Q-T213A-H249R, V104I-A232V-H249R, e/ou V104L-H120F-R186K-S216F-N252R. Essas variantes de protease são variantes de protease preferenciais para uso em métodos de tratamento e/ou superfícies de limpeza nas quais (i) uma superfície é colocada em contato com uma composição que compreende um material auxiliar e uma variante de protease em um líquido aquoso para lavagem; e (ii) a superfície é, então, enxaguada e/ou seca em que o líquido aquoso tem alta resistência iônica e/ou alta concentração de detergente.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: A015T-T033S, A016T-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, A230E-H249R, A232V-H249R, E089I-S105T-N116A-A215F-S216F, E089I-Y091F-N185I-G211Q-A270C, G020R-A090S-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-N043D-S078R-S101G- S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-N043R-N076D, G020R-N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-P052N-S101 A-l 198L-L233C, G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, G020R-S024R-N043D-N076D-H249R, G020R-S024R-N043D-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-N043D-R045T-A230E-S242R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N043D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S024R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, G020R-S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S024R-R045T-N076D-S242R-H249R, G020R-S024R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, G020R-S078R-S101A-S103A-V104I-G115E-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101 A-S 103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R-T274I, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101A-S103A-V104I-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022R-N269R, G020R-T022R-S078R-S212F-W241R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-N269S, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-A232V-Q245R-T274I, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-Ν116A-N183D-G211Q-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104I-N116A-N183D-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104Ι-Ν183D-G211Q-T213Α-Α215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104Ι-Ν183D-1198L-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101A-S103A-V104Ι-Ν183D-T213Α-Α215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104Ι-Ν116Α-Ν183D-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104Ι-Ν116Α-Ν183D-G211Q-A232V-Q245R-N263S, G020R-T022W-S101G-S103A-V104Ι-Ν116Α-Ν183D-G211Q-T213Α-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N116A-N183D-G211Q-T213A-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A215F-A232V-Q245R, G020R-T022W-S101G-S103A-V104I-N183D-A232V-Q245R, G025R-N062Q-S128N-S144R-N185I, G025R-N116A-H120F-T224A-A270C, G118R-K235F, K027R-N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018K-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-N076D-S242R-H249R, Ν018R-G020R-N043D-R045T-N076D-H249R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043D-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-N043D-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N018R-G020R-N043R-R045T-H249R, N018R-G020R-N043R-R045T-N076D-A230E-H249R, N018R-G020R-N076D, Ν018R-G020R-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V1041-A232V-Q245R, N018R-G020R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, Ν018R-G020R-S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V1041-A232V-Q245R-N269R, N018R-G020R-S024R-N043R-N076D, N018R-G020R-S024R-N076D-A131T-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-H249R, Ν018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-N243D-H249R, Ν018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213Α-Α215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-1198L-A215F-H249R, Ν018R-G020R-S024R-N076D-1198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-I198L-T213A-A215F-H249R, N018R- G020R-S024R-N076D-N116A-G211Q-T213Α-Α215F-H249R, Ν018R-G020R-S024R-N076D-N116A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D- Ν116Α-1198L-G211Q-A215F-H249R-N269S, N018R-G020R-S024R-N076D-Ν116Α-1198L-G211Q-A215F-Q245R, ΝΟ18R-G020R-S024R-N076D-N116Α-1198L-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116Α-Ν183D-G211Q-A215F-H249R, ΝΟ18R-G020R-S024R-N076D-N116Α-Ν183D-G211Q-T213Α-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-1198L-G211Q-A215F-H249R, NO18R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-1198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-1198L-H249R, NO18R-G020R-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, NO18R-G020R-S024R-N076D-N183D-A215F-H249R, NO18R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-N204D-T213A-H249R, NO18R-G020R-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R-N269D, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101 A-l 198L-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-G020R-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R, 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Ν018R-T022W-S024R-N076D-N116Α-Ν183D-1198L-G211Q-A215F-H249R, Ν018R-T022W-S024R-N076D-N116Α-Ν183D-1198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-A209V-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-I198L-G211Q-T213A-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-1198L-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-1198L-Y209H-G211Q-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N116A-N183D-T213A-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-1198L-A215F-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-N183D-1198L-G211Q-A215F-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-N183D-1198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-N183D-I198L-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-N183D-T213A-H249R, NO18R-T022W-S024R-N076D-S101A-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101 A-l 198L-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-I198L-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101 A-N 116A-N183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101 A-N 116A-N183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101 A-N 116A-N183D-1198L-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-I198L-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-1198L-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A- N116A-N183D-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A- Ν116A-T213A-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116A-T213A-A215F-H249R-L267I, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N116Τ-1198L-A215F-H249R, Ν018R-T022W-S024R-N076D-S101Α-Ν183D-G211Q-A215F-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-G211Q-H249R, Ν018R-T022W-S024R-N076D-S101 Α-Ν 183D-G211Q-T213Α-Α215F-H249R, Ν018R-T022W-S024R-N076D-S101Α-Ν183D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-I198L-A215F-H249R, Ν018R-T022W-S024R-N076D-S101Α-Ν183D-I198L-T213A-H249R, Ν018R-T022W-S024R-N076D-S101Α-Ν183D-I198L-Y209H-H249R, Ν018R-T022W-S024R-N076D-S101A-N183D-T213A-A215F-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-G211Q-T213A-H249R, N018R-T22W-S024R-N076D-N116Α-1198L-T213A-H249R, Ν018R-T22W-S024R-N076D-S101Α-1198L-H249R, N018R-V104I-A232V, N043A-Q059A-S101A-S216F-T224A, N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043D-R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103Α-V104I-A232V-Q245R, N043D-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043D-S242R-H249R, N043R-A230E-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, N043R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-N076D-S101G-S103T-V104I-A232V-Q245R-H249R-N269R, N043R-R045T-H249R, N043R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, N043R-R045T-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-R045T-S101G-S103A-V104Ι-A232V-Q245R-H249R, N043R-S078R-S101G-S103A-V104I-L217E-A232V-Q245R, N043R-S101G-S103A-V104I-Q245R-H249R, N043R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R-N269R, N076D-A232V-Q245R, N076D-Q245R, N076D-S101G-A232V-Q245R, N076D-S101G-S103A-Q245R, N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-H249R, N076D-S101G-S103A-V104Ι-H249R, N076D-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, N076D-S101G-V104I-H249R, N076D-S101G-V104I-Q245R, N076D-S103A-V104I-A232V-Q245R, N076D-S103A-V104I-Q245R, N076D-V104I-A232V-Q245R, N076D V104I-Q245R, P005S-N018R-T022W-S024R-N076D-S101Α-Τ213Α-Α215F-H249R, P086W-K235F, P086W-Y209A-K235F, Q012H-V104A-G118R, R045T-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, R045T-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S024R-G118R-N243F-R269H, S024R-K235F-N243F, S024R-N043D-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N269R, S024R-N043R-N076D-A230E-H249R, S024R-N076D-A232V-H249R, S024R-N076D-S078R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-N076D-S101G, S024R-N076D-S101G-A232V-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-A232V, S024R-N076D-S101G-S103A-V104Ι-Μ175L-H249R, S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-Q245R, S024R-N076D-S101G-V104I-A232V-H249R, S024R-N076D-S103A-H249R, S024R-N076D-S103A-Q245R, S024R-N076D-S103A-V104I-H249R, S024R-R045T-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-H249R, S024R-R045T-S242R-A273V, S024R-R247H, S024R-S101G-S103A, S024R-S101G-S103A-A232V, S024R-S101G-S103A-V104I, S024R-S103A-Q245R-H249R, S024R-S103A-V104I, S024R-S106G-N116A-S212M-T224A, S024R-T033S-A151V, S024R-T033S-A174V-K235F, S024R-T033S-A228T, S024R-T033S-K235F-W241R, S024R-T033S-N243F, S024R-V104A, S024R-V104I-A232V, S024R-Y209A-N243F, S078R-K235F, S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-S242R-Q245R, S099F-S105T-S106G-A194F-S212M, S101G-H249R, S101G-S103A-V104I, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R, S103A-A232V, S103A-A232V-H249R, S103A-A232V-Q245R, S103A-V104I-Q245R, S103N-H120F-Y167W-I198L-L233C, T022W-A194F-T213A-L233C-N238L, T022W-E089I-S216F, T033S-A048T, T033S-P086W-S156L-Y209A, T033S-P239T, T033S-T253A, T057R-N183D-Q236N, T143A-Y209A, V004E-T033S-S078R, V004R-S009A-T022R-S078R-S212F, e/ou Y209A-K235F. Essas variantes de protease são variantes de protease úteis para uso em métodos de tratamento e/ou limpeza de superfícies em que (i) a superfície é colocada em contato com uma composição que compreende um material auxiliar e uma variante de protease em um líquido aquoso para lavagem; e (ii) a superfície é, então, enxaguada e/ou seca em que o líquido aquoso tem alta resistência iônica e/ou alta concentração de detergente.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou mesmo, 25 mutações dentro do grupo de posições que compreendem posições 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 50, 51, 52, 55, 57, 59, 60, 62, 63, 64, 68, 69, 71, 72, 74, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 85, 86, 89, 91, 92, 94, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 128, 129, 132, 138, 144, 147, 148, 158, 159, 160, 166, 167, 175, 177, 181, 182, 183, 185, 186, 188, 192, 194, 197, 198, 203, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 224, 227, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 256, 258, 260, 262, 263, 265, 267, 269, 270, 271,272, 273 e 274.
Em um aspecto preferencial da dita composição, a dita variante de protease compreende três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou mesmo, 25 mutações dentro do grupo de posições que compreendem posições 1, 2, 4, 9, 10, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 42, 43, 46, 52, 57, 59, 62, 68, 71, 72, 74, 75, 76, 78, 82, 86, 89, 91, 94, 100, 101, 103, 104, 106, 108, 111, 112, 115, 117, 118, 121, 128, 129, 144, 148, 158, 159, 160, 166, 185, 186, 188, 197, 203, 209, 210, 212, 214, 215, 217, 224, 230, 231, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 248, 249, 250, 252, 253, 262, 263, 265, 267, 269, 271 e 272.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende um total de três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou mesmo, 25 mutações sele- cionadas a partir de: A001R, Q002S, Q002M, Q002A, Q002R, Q002W, S003R, V004R, V004S, V004C, I008A, S009A, S009F, S009W, R010S, R010A, R010H, R010M, Q012F, Q012R, P014K, P014F, P014Q, A015R, A015F, A016S, H017R, H017M, H017F, N018R, N018K, G020F, G020K, G020R, T022A, T022R, T022Y, T022V, T022Q, T022L, T022W, G023A, G023S, G023F, S024R, S024F, S024W, S024Q, S024H, S024L, G025V, G025F, G025R, V026F, K027L, K027F, K027R, K027V, V028A, V028N, V028E, Α029Τ, V030E, L031F, T033S, T033G, T033D, G034P, Ι035Μ, S036T, S036F, S036R, T038L, T038F, T038R, Ρ040Ν, P040L, Ρ040Τ, P040W, Ρ040Η, P040R, L042I, Ν043Α, N043F, Ν043Ι, N043S, N043R, Ν043Μ, N043W, N043D, R045T, G046R, A048R, F050C, V051W, V051F, V051H, P052F, Ρ052Ε, Ρ052Ν, Ρ055Υ, T057R, Q059A, Q059F, Q059R, D060P, D060Q, D060A, Ν062Ε, N062Q, G063V, G063M, G063T, G063I, G063A, G063S, G063H, G063Q, G063D, G063E, G063P, H064F, Η064Τ, V068A, V068C, Α069Ν, Α069Τ, Α069Ρ, A069W, T071G, I072C, A074C, L075A, L075F, L075E, L075R, N076D, S078R, S078N, S078I, I079W, I079Q, V081R, L082F, L082T, L082V, L082R, L082M, Α085Μ, P086W, P086L, Ρ086Ι, Ε089Ρ, Ε089Τ, E089G, Ε089Η, E089L, E089V, E089W, E089F, Ε089Ι, Υ091Ν, Y091F, A092F, Κ094Ν, S099F, S099T, S099P, S099G, S099M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, Ι107Μ, I107F, Α108Ι, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, Ν116Κ, Ν116Α, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, Η120Α, H120F, H120R, V121F, V121E, N123G, Ν123Ε, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, Ρ129Ε, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, Α158Ε, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, Ν183Ι, N183D, Ν183Μ, N183F, N183R, Ν185Ε, N185V, Ν185Ι, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Υ192Η, Y192W, Α194Ε, A194V, A194F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Υ209Ν, Y209F, Υ209Τ, Υ209Ε, Υ209Η, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, Τ213Α, Y214F, Α215Ν, A215D, Α215Ε, Α215Η, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, Ν218Ρ, Ν218Ε, Τ224Α, T224G, V227I, Α230Ε, Α231Ι, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, Ν238Κ, N238L, Ρ239Κ, P239G, P239R, Ρ239Η, Ρ239Τ, Ρ239Ν, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, Ν248Ι, N248R, H249R, Η249Τ, L250I, K251R, K251S, Ν252Ι, N252F, N252R, Ν252Κ, Ν252Η, Τ253Ι, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, Τ260Ι, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, Ν269Ι, N269R, A270C, Ε271Ι, E271V, Ε271Η, Ε271Μ, E271L, Ε271Ρ, Ε271Α, E271F, Ε271Τ, A272F, A272F, A272R, A273F, Α273Ι, e T274G.
Em um aspecto preferencial da dita composição, a dita variante de protease compreende um total de três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou mesmo, 25 mutações selecionadas a partir de: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L e A272F; e opcionalmente uma ou mais dentre as seguintes mutações: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D e N252K.
Em um aspecto da dita composição, em particular, para uso em altas concentrações de detergente ou resistência iônica, sendo a dita variante de protease compreende: a) duas ou mais das seguintes mutações: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, Ρ14Κ, A16S, Τ22Α, T22R, S24R, G25V, V26F, L42I, P52F, Ρ52Ε, Ρ52Ν, Ν62Ε, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, S78R, Ε89Ρ, Ε89Τ, E89G, Ε89Η, E89W, Υ91Ν, Κ94Ν, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, Α108Ι, L111V, E112V, G115K, N117F, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, Ρ129Ε, L148I, Α158Ε, G159E, S160D, S166D, Ν185Ε, R186H, S188E, S188D, V203E, Y209S, Υ209Ν, Y209F, Υ209Τ, Υ209Ε, Υ209Η, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, Α215Ν, A215D, Α215Ε, L217E, L217N, Τ224Α, Α230Ε, Α231Ι, Q236F, N238R, Ν238Κ, Ρ239Κ, P239G, P239R, N248V, H249R, L250I, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N, Ν269Ι, N269R, E271F, Ε271Ι, Ε271Η e A272F; e/ou b) um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: N062E- P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271F, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101 Αεί 03G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, 8101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-8128N, T22A-8101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-8103G-V104L, 8101A-8103G-V104L, 8101G-8103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R- N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D e S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F; sendo a dita variante de protease tem uma carga líquida total de 0, +1, +2, +3, +4 ou +5, de preferência, tem uma carga positiva líquida total, com a máxima preferência, +1, +2 ou +3, em relação à protease de subtilisina GG36 de B. lentus que tem a sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease, sendo a dita variante de protease é uma forma madura que tem atividade proteolítica e que compreende sequências de aminoácidos que compreendem uma combinação de substituições de aminoácidos selecionadas a partir de: X1R, X230E, X271L, X115R, X20R, X249R, X235F, X27V/F/L, X75E, X82R, X18R, X269R, X43D, X43R, X76D, X45T, X212F, X242R, X24R, X78R, X9A, X22R, X121E, X244R, X28E, X30E, X4R, eX241R, sendo as posições de aminoácido da variante de subtilisina são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens apresentada como SEQ ID n°:2.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição com preende uma variante de protease, que compreende uma sequência de aminoácido que se difere da sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1 em não mais que duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mutações selecionado a partir do grupo deA1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, e W241R, sendo as posições de aminoácido da variante de protease são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2 conforme determinada por alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease que compreende uma sequência de aminoácido que se difere da sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1 em não mais que duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mutações selecionadas do grupo deA1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, e W241R, e, opcionalmente, compreende pelo menos uma mutação selecionada do grupo de S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D e N252K, sendo as posições de aminoácido da variante de protease são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2 conforme determinado pelo alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease, sendo a dita variante de protease é uma forma madura que tem atividade proteolítica e que compreende sequências de aminoácidos que compreendem uma combinação de substituições de aminoácidos selecionadas a partir de: X16S, X18R, X20R, X22A, X24R, X43R/D, X45T, X76D, X101A, X103G, X104L, X111V, X128N, X148I, X230E, X242R, e X249R, em que as posições de aminoácido da variante de subtilisina são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens apresentada como SEQ ID n°:2.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease, sendo a dita variante de protease é uma forma madura que tem atividade proteolítica e que compreende sequências de aminoácidos que compreendem uma combinação de substituições de aminoácidos selecionadas a partir de: A16S, N18R, G20R, T22A, S24R, N43R, N43D, R45T, N76D, S101A, S103G, V104L, L111V, S128N, L148I, A230E, S242R, e H249R, em que as posições de aminoácido da variante de subtilisina são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens apresentada como SEQ ID n°:2.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease, sendo a dita variante de protease é uma forma madura que tem atividade proteolítica e que compreende sequências de aminoácidos que compreendem uma combinação de substituições de aminoácidos selecionadas a partir de: X20R-X43R-X249R, X20R-X22R-X43R, X20R-X43R-X242R, X20R-X43R-X271L, X20R-X43R-X244R, X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X22R-X78R-X212F-X241R, X9A-X20R-X43R-X212F, X9A-X43R-X212F, X20R-X43R-X212F, X20R-X22R-X43R-X212F, X24R-X78R-X212F, X9A-X43R-X78R, X9A-X43R-X78R-X242R, X9A-X20R-X43R-X78R, X20R-X24R-X43R-X78R-X242R, X22R-X24R-X78R-X212F, X9A-X20R-X43R-X78R-X242R, X20R-X43R-X78R-X249R, X20R-X43R-X78R, X9A-X78R-X212F, X9A-X22R-X43R-X78R, X9A-X20R-X24R-X43R, X9A-X22R-X78R-X212F, X4R-X9A-X22R-X78R-X212F, X20R-X24R-X43R, X1R-X9A-X43R, X20R-X24R-X43R-X115R, X9A-X24R-X43R, X20R-X22R-X24R-X43R, X1R-X24R-X43R, X9A-X20R-X24R-X43R-X242R, X9A-X20R- X22R-X78R-X212F, X9A-X24R-X43R-X244R, X9A-X24R-X43R-X242R, X4R-X9A-X22R-X24R-X212F, e X22R-X24R-X43R, em que as posições de aminoácido da variante de subtilisina são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens apresentada como SEQ ID n°:2.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease, sendo a dita variante de protease é uma forma madura que tem atividade proteolítica e que compreende sequências de aminoácidos que compreendem uma combinação de substituições de aminoácidos selecionadas a partir de: A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, W241R, G20R-N43R-H249R, G20R-T22R-N43R, G20R-N43R-S242R, G20R-N43R-E271L, G20R-N43R-V244R, G20R-S24R-N43R- S242R, S9A-T22R-S78R-S212F-W241R, S9A-G20R-N43R-S212F, S9A-N43R-S212F, G20R-N43R-S212F, G20R-T22R-N43R-S212F, S24R-S78R-S212F, S9A-N43R-S78R, S9A-N43R-S78R-S242R, S9A-G20R-N43R-S78R, G20R-S24R-N43R-S78R-S242R, T22R-S24R-S78R-S212F, S9A-G20R- N43R-S78R-S242R, G20R-N43R-S78R-H249R, G20R-N43R-S78R, S9A-S78R-S212F, S9A-T22R-N43R-S78R, S9A-G20R-S24R-N43R, S9A-T22R-S78R-S212F, V4R-S9A-T22R-S78R-S212F, G20R-S24R-N43R, A1R-S9A-N43R, G20R-S24R-N43R-G115R, S9A-S24R-N43R, G20R-T22R-S24R-N43R, A1R-S24R-N43R, S9A-G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-G20R-T22R-S78R-S212F, S9A-S24R-N43R-V244R, S9A-S24R-N43R-S242R, V4R-S9A-T22R-S24R-S212F, e T22R-S24R-N43R, em que as posições de aminoácido da variante de subtilisina são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens apresentada como SEQ ID n°:2.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease, sendo a dita variante de protease é uma forma madura que tem atividade proteolítica e que compreende sequências de aminoácidos que compreendem uma combinação de substituições de aminoácidos selecionadas a partir de: X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R, X101G-X103A-X104I-X232V-X245R-X248R, X101G-X103A-X104I-X159R-X232V-X245R-X248R, e X101G, X103A, X104I, X232V, X236H, X245R, e X252K, em que as posições de aminoácido da variante de subtilisina são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens apresentada como SEQ ID n°:2.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease, sendo a dita variante de protease é uma forma madura que tem atividade proteolítica e que compreende sequências de aminoácidos que compreendem uma combinação de substituições de aminoácidos selecionadas a partir de: S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R, S101G, S103A, V104I, A232V, Q236H, e Q245R, em que as posições de aminoácido da variante de subtilisina são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN’ de B. amyloliquefaciens apresentada como SEQ ID n°:2.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease, em que a dita variante de protease é uma forma madura que tem atividade proteolítica e compreende sequências de aminoácido que compreendem uma combinação de substituições de a-minoácidos selecionadas a partir de: X16S, X22A, X24R, X62E, X76D, X89P, X101A/G, X103G/A, X104L/I, X111V, X128N, X129E, X232V, X148I, X158E, X159D/E, X166D, X186H, X188D, X209E, X236H, X238R, X245R, X248D/R, X249R, X252K/R, X253R, e X271F, em que as posições de aminoácido da variante de subtilisina são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens a- presentada como SEQ ID n°:2.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease, em que a dita variante de protease é uma forma madura que tem atividade proteolítica e compreende sequências de aminoácido que compreendem uma combinação de substituições de a-minoácidos selecionadas a partir de: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R e E271F em que posições de aminoácido da variante de subtilisina são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens apresentada como SEQ ID n°:2.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease que compreende uma sequência de aminoácido que se difere da sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1 em não mais que duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mutações selecionadas do grupo deA16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R, e E271F, sendo posições de aminoácido da variante de protease são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2 conforme determinado pelo alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease que compreende uma sequência de aminoácido que se difere da sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1 e em que a carga líquida total da variante de protease é 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 ou -5 em relação à carga líquida total da protease de subtilisina GG36 de Bacillus lentus, e em que posições de aminoácido da variante de protea- se são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2 conforme determinado pelo alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease que compreende uma sequência de aminoácido que se difere da sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1 em não mais que duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mutações selecionadas do grupo deA1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E, G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L e A272F, e, opcionalmente, compreende pelo menos uma mutação selecionada do grupo de S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D e N252K, em que posições de aminoácido da variante de protease são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2 conforme determinado pelo alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease que compreende uma sequência de aminoácido que se difere da sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1 em não mais que duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mutações selecionadas do grupo deA16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, R186H, S188D, Y209E, Q236H, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R, e E271F, sendo posições de aminoácido da variante de protease são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2 conforme determinado pelo alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma variante de protease que compreende uma sequência de aminoácido que se difere da sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1 em não mais que duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mutações selecionadas do grupo de A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, eW241R, em que posições de aminoácido da variante de protease são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2 conforme determinado pelo alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Em um aspecto da dita composição, dita composição compreende a variante de protease que compreende uma sequência de aminoácido que se difere da sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1, em que a dita variante de protease compreende uma sequência de aminoácido que se di fere da sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1 em não mais que duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mutações selecionadas do grupo deA1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R, e W241R, e, opcionalmente, compreende pelo menos uma mutação selecionada do grupo de S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D e N252K, em que posições de aminoácido da variante de protease são numeradas de acordo com a numeração de posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID n°:2 conforme determinado pelo alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Em um aspecto da dita composição, a dita variante de protease compreende: a) duas ou mais das seguintes mutações V4R, H17R, N18R, G20R, T22R, S24R, S24W, G25R, N43R, N43A, G46R, P52F, P52N, T57R, Q59A, N62Q, T71G, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89W, E89T, E89I, E89H, E89V, V104L, S106V, S106G, G115R, G118I, V121F, S144R, N185I, D197F, Y209N, Y209S, L217E, A231I, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, H249R, N252R, T253R, E271T, E271V, E271L, E271H, E271F, E271P, A1R, S9A, S212FeN269R; e/ou b) um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K e S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K; sendo a dita variante de protease tem uma carga líquida total de 0, -1, -2, -3, -4 ou -5, de preferência, 0, -1, -2 ou -3, em relação à protease de subtilisina GG36 de B. lentus que tem a sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma segunda protease não imunoequivalente selecionada a partir do grupo que compreende: a) subtilisinas (EG 3.4.21.62); b) proteases similares a tripsina ou similares a quimotripsina; c) metaloproteases; e d) misturas dos mesmos.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma segunda protease não imunoequivalente selecionada a partir do grupo que compreende: a) subtilisinas (EC 3.4.21.62) derivadas de B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus e Bacillus gibsonii; b) proteases de tripsina e/ou proteases de quimotripsina derivadas de Cellumonas; c) metaloproteases derivadas de Bacillus amyloliquefaciens; e d) misturas dos mesmos.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende uma enzima adicional selecionada do grupo que consiste em hemi-celulases, peroxidases, proteases, celulases, celobiose desidrogenases, xi-loglucanases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectina-ses, mananases, pectato liases, queratinases, redutases, oxidases, fenoloxi-dases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, lique-nases glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, ami-lases e misturas dos mesmos.
Em um aspecto da dita composição, a dita enzima adicional é selecionada do grupo que consiste em: a) lipases para primeira lavagem; b) alfa-amilases; c) celulases para limpeza bacteriana; e d) misturas dos mesmos.
Em um aspecto da dita composição, com relação ao(s) materi-al(is) auxiliar(es), na dita composição a) o dito encapsulado compreende um perfume que compreende uma microcápsula de perfume; b) o dito agente de matiz compreende um material selecionado do grupo que consiste em corantes básicos, ácidos, hidrofóbicos, diretos e poliméricos, e conjugado de corantes que tem um comprimento de onda de absorção de pico de cerca de 550 nm a 650 nm e misturas dos mesmos; c) o dito tensoativo detergente compreende um material selecionado do grupo que consiste em tensoativos detergentes aniônicos, tenso-ativos detergentes nãoiônicos, tensoativos detergentes catiônicos, tensoativos detergentes zwiteriônicos e tensoativos detergentes anfotéricos e misturas dos mesmos; d) o dito coadjuvante compreende um material selecionado do grupo consistindo em zeólitos, fosfatos e misturas dos mesmos; e) o dito sal de silicato compreende um material selecionado do grupo consistindo em silicato de sódio, silicato de potássio e misturas dos mesmos; f) o dito branqueador compreende, de preferência, um material selecionado do grupo consistindo em alvejantes solúveis em água fria e misturas dos mesmos; g) o dito polímero de carboxilato compreende um material selecionado do grupo consistindo em copolímero aleatório de maleato/acrilato ou homopolímero de poliacrilato e misturas dos mesmos; h) o dito polímero para liberação de sujeiras compreende um material selecionado do grupo consistindo em copolímeros de tereftalato e misturas dos mesmos; i) o dito polímero celulósico compreende um material selecionado do grupo consistindo em alquil celulose, alquil alcoxialquil celulose, carboxialquil celulose, alquil carboxialquil celulose e misturas dos mesmos; j) o dito catalisador de alvejante compreende um catalisador à base de metal de transição ou ligando para formar um catalisador à base de metal de transição ou, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em cátions de imínio, poliíons de imínio; zwiteríons de imínio; ami-nas modificadas; óxidos de amina modificados; N-sulfonil iminas; N-fosfonil iminas; N-acil iminas; dióxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas de açúcar cíclico e misturas dos mesmos k) o dito ativador de alvejamento compreende um material selecionado do grupo consistindo em sulfonato de dodecanoíla oxibenzeno, sulfonato de decanoíla oxibenzeno, ácido decanoil oxibenzoico ou seus sais, sulfonato de 3,5,5-trimetil hexanoilóxi benzeno, tetra acetil etileno diamina (TAED), sulfonato de nonanoiloxibenzeno (NOBS) e misturas dos mesmos; l) a dita fonte de peróxido de hidrogênio compreende um material selecionado do grupo consistindo em sais de peridrato inorgânico, incluindo, sais de metais alcalinos como sais de sódio de perborato (normalmente, mono ou tetrahidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sais de persi-licato e misturas dos mesmos; m) o dito quelante compreende um material selecionado do grupo consistindo em DTPA (ácido dietileno triamina penta-acético), HEDP (ácido hidroxietano difosfônico), DTPMP (dietileno triamina penta(ácido meti-leno fosfônico)), ácido etilenodiaminadissuccínico (EDDS), hidrato de sal dissódico de ácido 1,2-diidróxi benzeno-3,5-dissulfônico, derivados dos ditos quelantes; e n) misturas dos mesmos.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende um agente de matiz para tecidos selecionados do grupo consistindo em a) corantes; b) conjugados corante-argila que compreendem pelo menos um corante básico catiônico e uma argila de esmectita; e c) misturas dos mesmos.
Em um aspecto da dita composição, a dita composição compreende um agente de matiz para tecidos selecionado do grupo consistindo em a) corantes de moléculas pequenas; corantes poliméricos e misturas dos mesmos; b) conjugados corante-argila que compreendem pelo menos um corante básico catiônico e uma argila de esmectita; e c) misturas dos mesmos.
Em um aspecto da dita composição detergente sólida para lavagem de roupas, a dita composição compreende, com base no peso do total da composição: a) de cerca de 0,0005%, em peso, a cerca de 0,1%, em peso, de cerca de 0,001%, em peso, a cerca de 0,05%, em peso, ou mesmo, de cerca de 0,002%, em peso, a cerca de 0,03%, em peso, da dita variante de protease; e b) um ou mais dentre os seguintes: (i) de cerca de 0,00003% a cerca de 0,1%, em peso, de agente de matiz para tecidos; (ii) de cerca de 0,001%, em peso, a cerca de 5%, em peso, de cápsulas de perfume; (iii) de cerca de 0,001%, em peso, a cerca de 1%, em peso, de alvejantes solúveis em água fria; (iv) de cerca de 0,00003%, em peso, a cerca de 0,1%, em peso, de catalisadores de alvejante; (v) de cerca de 0,00003%, em peso, a cerca de 0,1%, em peso, de lipases de primeira lavagem; (vi) de cerca de 0,00003%, em peso, a cerca de 0,1%, em peso, de celulases para limpeza bacteriana; (vii) de cerca de 0,05%, em peso, a cerca de 20%, em peso, de tensoativos nãoiônicos de Guerbet.
Uma composição, de acordo com qualquer um dos produtos destinados ao consumidor revelados aqui, sendo a dita composição está em uma dose unitária com um só ou com múltiplos compartimentos, é revelada.
Uma composição, de acordo com qualquer um dos produtos destinados ao consumidor revelados aqui, sendo a dita composição é uma dose unitária com múltiplos compartimentos, em que a variante de protease está em um compartimento diferente de qualquer fonte de peróxido de hidrogênio e/ou quelante.
Em um aspecto, um líquido aquoso para lavagem, que compreende um produto destinado ao consumidor que compreende um material auxiliar e uma variante de protease que compreende: a) duas ou mais das seguintes mutações: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, T22A, T22R, S24R, G25V, V26F, L42I, P52F, P52E, P52N, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, S78R, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, A108I, L111V, E112V, G115K, N117F, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, R186H, S188E, S188D, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, N248V, H249R, L250I, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N, N269I, N269R, E271F, E271I, E271H e A272F; e/ou b) um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, Τ022Α-Ε089Ρ, S128N-Y209E, Ε089Ρ-Α158Ε, Ν062Ε-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, Ρ129Ε-Υ209Ε, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, Τ022Α-Α158Ε, Ν062Ε-Υ209Ε, N062E-H249R, S101A-R186H, Ε089Ρ-Ρ129Ε, P129E-E271F, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101 Αεί 03G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D e S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F; sendo a dita variante de protease tem uma carga líquida total de 0, -1, -2, -3, -4 ou -5, de preferência, 0, -1, -2 ou -3, em relação à protease de subtilisina GG36 de B. lentus que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID n°:1 e; o dito líquido aquoso para lavagem tem, de preferência, condutividade de cerca de 0,1 mS/cm a cerca de 3 mS/cm, de cerca de 0,3 mS/cm a cerca de 2,5 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 0,5 mS/cm a cerca de 2 mS/cm, é revelado.
Um líquido de lavagem que compreende um produto destinado ao consumidor que compreende um material auxiliar e uma variante de protease que compreende: a) duas ou mais das seguintes mutações V4R, H17R, N18R, G20R, T22R, S24R, S24W, G25R, N43R, N43A, G46R, P52F, P52N, T57R, Q59A, N62Q, T71G, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89W, E89T, E89I, E89H, E89V, V104L, S106V, S106G, G115R, G118I, V121F, S144R, N185I, D197F, Y209N, Y209S, L217E, A231I, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, H249R, N252R, T253R, E271T, E271V, E271L, E271H, E271F, E271P, A1R, S9A, S212F e N269R; e/ou b) um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K e S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, sendo a dita variante de protease tem uma carga líquida total de 0, +1, +2, +3, +4 ou +5, tendo, de preferência, uma carga positiva líquida total, com a máxima preferência, +1, +2 ou +3, em relação à protease de subtilisina GG36 de B. lentus que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID n°:1; e o dito líquido de lavagem de detergente para lavagem de roupas que tem condutividade maior que cerca de 3 mS/cm a cerca de 30 mS/cm, de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 20 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 4 mS/cm a cerca de 10 mS/cm, é revelado.
Em um aspecto, esse produto destinado ao consumidor pode ser um detergente para lavagem de roupas em grânulo ou em pó.
Em um aspecto, qualquer um dos produtos destinados ao consumidor revelados aqui pode estar sob a forma de uma dose unitária com múltiplos compartimentos. Em um aspecto da dita dose unitária com múltiplos compartimentos, a variante de protease pode estar em um compartimento diferente para quaisquer enzimas adicionais e/ou quelante.
Em um aspecto, essas composições podem ser um detergente líquido para lavagem de roupas, um produto para lavagem de louças e/ou um detergente em grânulos ou em pó.
Em um aspecto, qualquer um dos produtos destinados ao consumidor revelados aqui pode estar sob a forma de uma dose unitária com múltiplos compartimentos. Em um aspecto da dita dose unitária com múltiplos compartimentos, a protease pode estar em um compartimento diferente para quaisquer enzimas adicionais e/ou quelante. O produto destinado ao consumidor pode assumir qualquer forma incluindo a forma fluida ou sólida. O produto destinado ao consumidor pode estar sob a forma de um saco de contenção de dose unitária, especificamente, quando sob a forma de um líquido e, tipicamente, o produto destinado ao consumidor é pelo menos parcialmente, ou mesmo, por completo, encerrado por um saco de contenção solúvel em água.
Em um ou mais aspectos do produto destinado ao consumidor supracitado, esse produto destinado ao consumidor pode ter qualquer combinação de parâmetros e/ou características detalhadas acima.
Descrição de Protease Adicional As variantes de protease adequadas incluem enzimas derivadas de uma protease original, sendo a dita sequência de protease original é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou 100% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID n°:1, em que a dita variante tem uma ou mais das seguintes características: a) um índice de desempenho no Método de Teste 2 de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9; pelo menos 2; de 1,1 a cerca de 10, de 1,1 a cerca de 8 ou mesmo, de 1,1 a cerca de 5; b) um índice de desempenho no Método de Teste 3 de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2; de 1,1 a cerca de 10, de 1,1 a cerca de 8 ou mesmo de 1,1 a cerca de 5; c) um índice de desempenho no Método de Teste 4 de pelo menos 1,0, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2, de 1,0 a cerca de 10, de 1,0 a cerca de 8 ou mesmo de 1,0 a cerca de 5.
As variantes de protease preferenciais que têm as características definidas de acordo com o Método de Teste 2 acima.
As proteases adequadas podem ser derivadas de subtilisinas, particularmente aquelas derivadas de subtilisina de Bacillus lentus da SEQ ID n° 1 e, em um aspecto, podem compreender uma ou mais dentre as seguintes mutações: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, Ν185Ε, Ν185Ι, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Υ209Ν, Y209F, Υ209Τ, Υ209Ε, Υ209Η, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, Α215Ν, A215D, Α215Ε, L217E, L217N, Τ224Α, Α230Ε, Α231Ι, Q236F, N238R, Ν238Κ, Ρ239Κ, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, Ν248Ι, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. Ν269Ι, N269R, E271F, Ε271Ι, Ε271Η, Ε271Ρ, Ε271Τ, E271V, E271L e/ou A272F. Em um aspecto preferencial, a variante de enzima compreende pelo menos duas das mutações acima.
Em um aspecto, as proteases adequadas incluem subtilisinas, particularmente de Bacillus Lentus com SEQ ID n° 1, que podem compreender um ou mais dentre os seguintes conjuntos de mutações, inserções ou deleções: T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, Α158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271F (b) T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101 Αεί 03G-V104L-G159E, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V1041-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D, e/ou S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F.
Em um aspecto, proteases adequadas incluem variantes de subtilisinas, particularmente, de Bacillus Lentus com SEQ ID n° 1, sendo as ditas variantes compreendem três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 mutações dentro do grupo de posições que compreende as posições 1, 2, 4, 9, 10, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 42, 43, 46, 52, 57, 59, 62, 68, 71, 72, 74, 75, 76, 78, 82, 86, 89, 91, 94, 100, 101, 103, 104, 106, 108, 111, 112, 115, 117, 118, 121, 128, 129, 144, 148, 158, 159, 160, 166, 185, 186, 188, 197, 203, 209, 210, 212, 214, 215, 217, 224, 230, 231, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 248, 249, 250, 252, 253, 262, 263, 265, 267, 269, 271 e 272.
Em um aspecto preferencial, as proteases adequadas incluem variantes de subtilisinas, particularmente, de Bacillus Lentus com SEQ ID n° 1, sendo as ditas variantes compreendem um total de três mutações selecionadas do grupo que compreende: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L111V, E112V, G115K, G115R, N117F, G118I, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271I, E271H, E271P, E271T, E271V, E271L e A272F; e opcionalmente uma ou mais dentre as seguintes mutações: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D e N252K; de preferência, a dita variante que compreende quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 das mutações acima e, opcionalmente, uma ou mais das mutações a seguir: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D e N252K.
Em um aspecto, é apresentada a dita protease que é uma variante de subtilisina GG36 com SEQ ID n° 1, sendo a dita variante compreende uma ou mais mutações, e tem uma carga líquida total de -5, -4, -3, -2, -1 ou 0 em relação à subtilisina GG36 de ocorrência natural.
Em um aspecto, as ditas variantes de protease são proteases de baixa resistência iônica. Essas proteases de baixa resistência iônica são variantes de subtilisina GG36 que tem SEQ ID n°:1, sendo as ditas variantes compreendem uma ou mais mutações, de preferência conforme definido a-cima, e têm uma carga líquida total de zero ou negativa de -5, -4, -3, -2, -1 ou 0, de preferência, 0, -1, -2 ou -3, em relação à subtilisina GG36 de ocorrência natural. Portanto, de acordo com um aspecto preferencial da invenção, é fornecido um processo de lavagem para tecidos que compreende a lavagem de tecidos em um líquido aquoso para lavagem que compreende essa protease de carga total líquida de zero ou negativa, e um material auxiliar, sendo o dito líquido de lavagem tem baixa resistência iônica. Por baixa resistência iônica entende-se um líquido de lavagem, cuja condutividade é de cerca de 0,1 mS/cm a cerca de 3 mS/cm, de cerca de 0,3 mS/cm a cerca de 2,5 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 0,5 mS/cm a cerca de 2 mS/cm. De preferência, tais variantes de protease serão usadas em composições detergentes de baixa concentração. A protease compreende, de preferência, mutações selecionadas a partir de: (a) duas ou mais das seguintes mutações: A1R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, T22A, T22R, S24R, G25V, V26F, L42I, P52F, P52E, P52N, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, S78R, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, A108I, L111V, E112V, G115K, N117F, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, R186H, S188E, S188D, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, N248V, H249R, L250I, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E2711, E271H e A272F; e/ou (b) um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações: N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271F, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101 Αεί 03G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E271F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D- E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D e S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F;
Em um aspecto, as proteases acima de baixa resistência iônica formam parte de uma composição detergente que é diluída em água, tipicamente, dentro de uma máquina de lavar, para formar um líquido de lavagem, cuja condutividade é de cerca de 0,1 mS/cm a cerca de 3 mS/cm, de cerca de 0,3 mS/cm a cerca de 2,5 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 0,5 mS/cm a cerca de 2 mS/cm.
Em um aspecto, as ditas proteases são proteases de alta resistência iônica. Essas proteases de alta resistência iônica são variantes de subtilisina GG36 que têm a SEQ ID n°:1, sendo as ditas variantes compreendem duas ou mais mutações, de preferência, conforme definido acima e têm uma carga líquida total de +5, +4, +3, +2, +1 ou 0, de preferência, uma carga líquida total positiva, com a máxima preferência, +1, +2 ou +3, em relação à subtilisina GG36 de ocorrência natural. Portanto, de acordo com um aspecto preferencial da invenção, é fornecido um processo de lavagem de tecidos que compreende a lavagem de tecidos em um líquido aquoso para lavagem que compreende essa protease de carga positiva líquida ou zero, e um material auxiliar, sendo o dito líquido de lavagem tem alta resistência iônica. Por alta resistência iônica entende-se um líquido de lavagem, cuja condutividade é acima de 3 mS/cm a cerca de 30 mS/cm, de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 20 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 4 mS/cm a cerca de 10 mS/cm.
Nessa modalidade, as mutações nas proteases são selecionadas, de preferência, dentre: a) duas ou mais das seguintes mutações V4R, H17R, N18R, G20R, T22R, S24R, S24W, G25R, N43R, N43A, G46R, P52F, P52N, T57R, Q59A, N62Q, T71G, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89W, E89T, E89I, E89H, E89V, V104L, S106V, S106G, G115R, G118I, V121F, S144R, N185I, D197F, Y209N, Y209S, L217E, A231I, P239R, P239S, W241R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, H249R, N252R, T253R, E271T, E271V, E271L, E271H, E271F, E271P,A1R, S9A, S212F e N269R; e/ou b) um ou mais dos seguintes conjuntos de mutações T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F, S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D- A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K
Em um aspecto, as proteases acima de alta resistência iônica formam parte de uma composição detergente que é diluída em água, tipicamente dentro de uma máquina de lavar, para formar um líquido de lavagem, cuja condutividade está acima de cerca de 3 mS/cm a cerca de 30 mS/cm, de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 20 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 4 mS/cm a cerca de 10 mS/cm. A carga das variantes de protease é expressa* em relação à protease de subtilisina GG36 de ocorrência natural com a sequência de aminoácidos da SEQ ID n° 1. Os aminoácidos que conferem uma única carga negativa são D e E e aqueles que conferem uma única carga positiva são R, H e K. Qualquer carga de aminoácido versus SEQ ID n°:1 que altere uma carga é usada para calcular a carga da variante de protease. Por exemplo, a introdução de uma mutação de carga negativa a partir de uma posição neutra de ocorrência natural adicionará uma carga líquida de -1 à variante de protease, enquanto que a introdução de uma mutação de carga negativa (D ou E) a partir de um resíduo de aminoácido positivo de ocorrência natural (R, H ou K) adicionará uma carga líquida de -2. A soma das alterações de carga de todos os resíduos de aminoácido que são diferentes para a variante de protease versus a protease de subtilisina GG36 de ocorrência natural com a sequência de aminoácidos da SEQ ID n° 1 resulta na alteração de carga da variante de protease. A faixa de carga preferencial para proteases a ser usada em soluções de detergente para lavagem de roupas de baixa condutividade é -5, -4, -3, -2, -1, 0, particularmente -2, -1; A faixa de carga preferencial para proteases a ser usada em soluções de detergente para lavagem de roupas de alta condutividade é +5, +4, +3, +2, +1, 0, particularmente, +2, +1. A seleção correta da carga pode obter níveis inesperadamente aprimorados de desempenho de limpeza em água fria.
As soluções de baixa condutividade são definidas como tendo uma condutividade de cerca de 0,1 mS/cm a cerca de 3 mS/cm, de cerca de 0,3 mS/cm a cerca de 2,5 mS/cm, ou mesmo de cerca de 0,5 mS/cm a cerca de 2 mS/cm.
As soluções de condutividade que têm alta condutividade são definidas como tendo uma condutividade de cerca de 3 mS/cm a cerca de 30 mS/cm, de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 20 mS/cm, ou mesmo, de cerca de 4 mS/cm a cerca de 10 mS/cm. Métodos de fabricação de proteases em água fria Inúmeros métodos adequados são conhecidos na técnica para a geração de sequências de polinucleotídeos modificados da presente invenção, incluindo, mas não se limitando à, mutagênese por saturação de sítio, mutagênese de varredura, mutagênese insercional, mutagênese dele-cional, mutagênese aleatória, mutagênese sítio-dirigida, e de evolução dirigida, bem como várias outras abordagens recombinatórias. Os métodos co-mumente usados incluem métodos de embaralhamento de DNA (Consulte, Stemmer, Proc Natl Acad Sei USA. 25:10747-51 [1994]), à base de recom-binação não homóloga de genes (por exemplo ITCHY) (Ostermeier et al., Bioorg Med Chem. 7:2139-44 [1999]), SCRATCHY (Lutz et al. Proc Natl A-cad Sei USA. 98:11248-53 [2001]), SHIPREC (Sieber et al., Nat Biotechnol., 19:456-60 [2001]), e NRR (Bittker et al., Nat Biotechnol., 20:1024-29 [2001]; Bittker et al., Proc Natl Acad Sei. USA. 101:7011-6 [2004]), e métodos que dependem do uso de oligonucleotídeos para inserir mutações aleatórias e direcionadas, deleções e/ou inserções (Ness et al., Nat Biotechnol., 20:1251-5 [2002]; Coco et al., Nat Biotechnol., 20:1246-50 [2002]; Zha et al., Chembi-ochem. 3:34-9 [2003], Glaser et al., J Immunol., 149:3903-13 [1992], Sondek e Shortle, Proc Natl Acad Sei USA 89:3581-5 [1992], Yánez et al., Nucleic Acids Res., 32:e158 [2004], Osuna et al., Nucleic Acids Res., 32:e136 [2004], Gaytán et al., Nucleic Acids Res., 29:E9 [2001], e Gaytán et al., Nucleic Acids Res., 30:e84 [2002]).
Em algumas modalidades, o polinucleotídeo parental de comprimento completo é ligado a um plasmídeo de expressão adequado, e o seguinte método de mutagênese é usado para facilitar a construção da protease modificada da presente invenção, embora outros métodos possam ser usados. O método tem por base aquele descrito por Pisarchik et al. (Pisar-chik et al., Prot. Eng. Des. Select., 20:257-265 [2007]). Em algumas modalidades, é obtida uma vantagem adicional, pelo fato de que a enzima de restrição usada aqui corta fora de sua sequência de reconhecimento, o que permite a digestão de praticamente qualquer sequência de nucleotídeo e impede a formação de uma cicatriz no sítio de restrição. Primeiro, conforme descrito aqui, um gene de ocorrência natural que codifica a protease de comprimento completo é obtido e sequenciado e varrido para uma ou mais pontos nos quais deseja-se realizar uma mutação (deleção, inserção, substituição ou uma combinação dos mesmos) em um ou mais aminoácidos. A mutação do gene para alterar sua sequência de modo a se adaptar à sequência desejada é realizada por extensão do iniciador, de acordo com métodos de conhecimento geral. Os fragmentos à esquerda e à direita do(s) ponto(s) de mutação desejado são amplificados por PCR e para incluir o sítio de restrição Eam1104l. Os fragmentos à esquerda e à direita são digeridos com Eam1104l para gerar uma pluralidade de fragmentos tendo três projeções de base complementares, que são então agrupadas e ligadas para gerar uma biblioteca de sequências modificadas contendo uma ou mais mutações. Esse método evita a ocorrência de mutações por deslocamento de quadro. Em adição, esse método também simplifica o processo de muta- gênese, pois todos os oligonucleotídeos podem ser sintetizados de modo a terem o mesmo sítio de restrição, e nenhum ligante sintético é necessário para criar os sítios de restrição, tal como seria necessário com o uso de alguns outros métodos.
Um conjunto não limitador de métodos usados para fabricar as proteases em água fria é dado nos exemplos 31 a 43.
Agentes de matiz para tecido adequados Os clareadores ópticos fluorescentes emitem pelo menos alguma luz visível. Em contraste, os agentes de matiz para tecidos podem alterar o tom de uma superfície, já que absorvem pelo menos uma porção do espectro de luz visível. Os agentes de matiz para tecidos adequados incluem corantes, conjugados corante-argila e pigmentos que satisfazem os requisitos do Método de teste 1, na seção "Método de teste" do presente relatório descritivo. Os corantes adequados incluem corantes de moléculas pequenas e corantes poliméricos. Os corantes de moléculas pequenas adequados incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em corantes que se enquadram nas classificações de índice de Cor (I.C.) de Azul Direto, Vermelho Direto, Violeta Direto, Azul Ácido, Vermelho Ácido, Violeta Ácido, Azul Básico, Violeta Básico e Vermelho Básico, ou misturas dos mesmos.
Os corantes tonalizantes são formulados para que se depositem sobre os tecidos, a partir do líquido de lavagem, de modo a otimizar a percepção de brancura do tecido. Em um aspecto, o corante do agente de matiz e azul ou violeta. Em um aspecto, o(s) corante(s) tonalizador(es) pode ter um comprimento de onda de absorção de pico de cerca de 550 nm a 650 nm ou, em um aspecto, de 570 nm a 630 nm. Trata-se de uma combinação de corantes que, em conjunto, têm o efeito visual sobre o olho humano como o de um único corante com um pico para absorção de comprimento de onda, sobre poliéster, de 550 nm a 650 nm, ou de 570 nm a 630 nm. Isso pode ser obtido, por exemplo, mediante a mistura de corantes vermelho e azul esverdeado para produzir uma tonalidade azul ou violeta.
Os corantes são moléculas orgânicas coloridas que são solúveis em meios aquosos que contêm tensoativos. Os corantes estão descritos em 'Industrial Dyes', de Wiley VCH 2002, K.Hunger (Editor). Os corantes são mencionados em "Color Index International", publicado pela Society of Dyers and Colourists (Sociedade de Tingidores e Coloristas) e pela American As-sociation of Textile Chemists and Colorists (Associação Norte-americana de Químicos e Coloristas Têxteis). Os corantes são, tipicamente, selecionados a partir das classes de corantes básicos, ácidos, hidrofóbicos, diretos e poli-méricos, bem como de conjugados de corante. Os versados na técnica de formulação do detergente são capazes de selecionar corantes tonalizantes adequados a partir dessas publicações. Os corantes tonalizantes poliméricos são comercialmente disponíveis, por exemplo, junto à Milliken, Spartanburg, South Carolina, EUA.
Os exemplos de corantes adequados são Violeta Direto 7 Violeta Direto 9, Violeta Direto 11, Violeta Direto 26, Violeta Direto 31, Violeta Direto 35, Violeta Direto 40, Violeta Direto 41, Violeta Direto 51, Violeta Direto 66, Violeta Direto 99, Violeta Ácido 50, Azul Ácido 9 Violeta Ácido 17, Preto Ácido 1, Vermelho Ácido 17, Azul Ácido 29, Violeta Solvente 13, Violeta Disperso 27 Violeta Disperso 26, Violeta Disperso 28, Violeta Disperso 63 e Violeta Disperso 77, Azul Básico 16, Azul Básico 65, Azul Básico 66, Azul Básico 67, Azul Básico 71, Azul Básico 159, Violeta Básico 19, Violeta Básico 35, Violeta Básico 38, Violeta Básico 48; Azul Básico 3, Azul Básico 75, Azul Básico 95, Azul Básico 122, Azul Básico 124, Azul Básico 141, corantes de tiazólio, azul reativo 19, azul reativo 163, azul reativo 182, azul reativo 96, Liquitint® Violet CT (Milliken, Spartanburg, EUA) e Azo-CM-Cellulose (Me-gazyme, Bray, República da Irlanda).
Os agentes de matiz para tecidos anteriormente mencionados podem ser usados em combinação (qualquer mistura de agentes de matiz para tecidos pode ser usada). Os agentes de matiz para tecidos adequados podem ser comprados junto à Aldrich, Milwaukee, Wisconsin, EUA; Ciba Specialty Chemicals, Basel, Suíça; BASF, Ludwigshafen, Alemanha; Dayglo Color Corporation, Mumbai, índia; Organic Dyestuffs Corp., East Providence, Rhode Island, EUA; Dystar, Frankfurt, Alemanha; Lanxess, Leverkusen, A-lemanha; Megazyme, Wicklow, Irlanda; Clariant, Muttenz, Suíça; Avecia, Manchester, Reino Unido e/ou produzidos de acordo com os exemplos aqui contidos.
Os agentes de matiz adequados adicionais são descritos em maiores detalhes no documento US 7.208.459 B2.
Encapsulados Em um aspecto do supracitado produto destinado ao consumidor, o dito produto destinado ao consumidor pode compreender, com base no peso total do produto destinado ao consumidor, de cerca de 0,001%, em peso, a cerca de 5%, em peso, de cerca de 0,01%, em peso, a cerca de 2%, em peso, ou mesmo, de cerca de 0,03%, em peso, a cerca de 0,5%, em peso, do dito encapsulado que compreende um perfume, em um aspecto, o dito perfume encapsulado compreende uma microcápsula de perfume. Os encapsulados adequados compreendem tipicamente um núcleo, uma carcaça que tem uma superfície interna e externa, sendo a dita carcaça encapsula o dito núcleo. Em um aspecto do dito encapsulado, o dito núcleo pode compreender um material selecionado do grupo consistindo em perfumes; branqueadores, corantes; repelentes de inseto; silicones; ceras, flavorizantes; vitaminas; agentes amaciantes de tecido; agentes de tratamento de pele, em um aspecto, parafinas; enzimas agentes bactericidas; descolorantes; elementos sensoriais; bem como misturas dessas substâncias, e a dita carcaça pode compreender um material selecionado do grupo consistindo em polietilenos; poliamidas; poliestirenos; poliisoprenos; policarbonatos; poliéster; po-liacrilatos; aminoplásticos, em um aspecto, o dito aminoplástico pode compreender uma poliureia, poliuretano e/ou poliureauretano, em um aspecto, a dita poliureia pode compreender polióxi metileno ureia e/ou formaldeído de melamina; poliolefinas; polissacarídeos, em um aspecto, o dito polissacarí-deo pode compreender alginato e/ou quitosano; gelatina; goma-laca; resinas epóxi, polímeros de vinila; inorgânicos insolúveis em água; Silicone; e misturas dos mesmos.
Em um aspecto do dito encapsulado, o dito núcleo pode compreender perfume.
Em um aspecto do dito encapsulado, a dita cápsula pode com preender melamina formaldeído e/ou melamina formaldeído reticulado.
Em um aspecto, são apresentados encapsulados adequados podem compreender um material do núcleo e uma cápsula, sendo a dita cápsula ao menos parcialmente circunda o dito material do núcleo. Pelo menos 75%, 85% ou mesmo 90% dos ditos encapsulados podem ter uma resistência à fratura de cerca de 0,2 MPa a cerca de 10 MPa, de cerca de 0,4 MPa a cerca de 5 MPa, de cerca de 0,6 MPa a cerca de 3,5 MPa, ou mesmo de cerca de 0,7 MPa a cerca de 3 MPa; e um escoamento do agente de benefício de 0% a cerca de 30%, de 0% a cerca de 20%, ou mesmo de 0% a cerca de 5%.
Em um aspecto, ao menos 75%, 85% ou mesmo 90% dos ditos encapsulados podem ter um tamanho de partícula de cerca de 1 mícrons a cerca de 80 mícrons, de cerca de 5 mícrons a 60 mícrons, de cerca de 10 mícrons a cerca de 50 mícrons, ou mesmo de cerca de 15 mícrons a cerca de 40 mícrons.
Em um aspecto, ao menos 75%, 85% ou mesmo 90% dos ditos encapsulados podem ter uma espessura de parede de partícula de cerca de 30 nm a cerca de 250 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm, ou mesmo de cerca de 100 nm a cerca de 160 nm.
Em um aspecto, o dito material nuclear de encapsulados pode compreender um material selecionado do grupo consistindo em uma matéria prima de perfume e/ou, opcionalmente, um material selecionado a partir do grupo que consiste em óleo vegetal, incluindo óleos vegetais puros e/ou mesclados, incluindo óleo de rícino, óleo de coco, óleo de semente de algodão, óleo de uva, colza, óleo de soja, óleo de milho, óleo de babaçu, óleo de linhaça, óleo de açafrão, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de coco, óleo de caroço de palma, óleo de rícino, óleo de limão e misturas dos mesmos; ésteres de óleos vegetais, ésteres, incluindo adipato de dibutila, ftalato de dibutila, adipato de butil-benzila, adipato de benzila octila, fosfato de tricresil, fosfato de trioctila e misturas dos mesmos; hidrocarbonetos de cadeia linear ou ramificada, inclusive aqueles hidrocarbonetos de cadeia linear ou ramificada que têm um ponto de ebulição maior que cerca de 80°C; terfenilas par cialmente hidrogenadas, ftalatos de dialquila, alquila bifenila, incluindo mo-noisopropilbifenila, naftaleno alquilado, incluindo dipropilnaftaleno, éteres de petróleo, incluindo querosene, óleo mineral e misturas dos mesmos; solventes aromáticos, incluindo benzeno, tolueno e misturas dos mesmos; óleos de silicone; e misturas dos mesmos.
Em um aspecto, o material de parede dos ditos encapsulados pode compreender uma resina adequada incluindo o produto de reação de um aldeído e uma amina, sendo os aldeídos adequados incluem formaldeí-do. As aminas adequadas incluem melamina, ureia, benzoguanamina, glico-lurila, e misturas das mesmas. As melaminas adequadas incluem metilol melamina, metilada metilol melamina, imino melamina e misturas das mesmas. As ureias adequadas incluem, dimetilol ureia, metilada dimetilol ureia, ureia-resorcinol, e misturas das mesmas.
Em um aspecto, sequestrantes de formaldeído adequados podem ser empregados com os encapsulados, por exemplo, em uma pasta aquosa em cápsula e/ou adicionados a um produto destinado ao consumidor antes, durante ou depois que os encapsulados forem adicionados a tal produto destinado ao consumidor.
As cápsulas adequadas podem ser feitas de acordo com os ensinamentos contidos em USPA 2008/0305982 A1 e/ou USPA 2009/0247449 A1. Alternativamente, as cápsulas adequadas podem ser adquiridas junto à Appleton Papers Inc., de Appleton, Wisconsin, EUA.
Em adição, os materiais adequados para a preparação dos encapsulados supracitados podem ser obtidos junto à Solutia Inc. (St Louis, Missouri, EUA), Cytec Industries (West Paterson, New Jersey, EUA), sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA), CP Kelco Corp. de San Diego, Califórnia, EUA; BASF AG de Ludwigshafen, Alemanha; Rhodia Corp. de Cranbury, New Jersey, EUA; Hercules Corp. de Wilmington, Delaware, EUA; Agrium Inc. de Calgary, Alberta, Canadá, ISP de New Jersey, EUA, Akzo Nobel de Chicago, IL, EUA; Stroever Shellac Bremen de Bremen, Alemanha; Dow Chemical Company de Midland, Ml, EUA; Bayer AG de Leverkusen, Alemanha; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, EUA. Método de Fabricação de Variante de protease original Um conjunto não limitador de métodos usados para fabricar as proteases é dado nos exemplos 31 a 43.
Numeração de aminoácidos na protease, Nomenclatura de enzimas e definições adicionais A numeração de posições de aminoácido usada nesta patente é o sistema de numeração da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens BPN'. Cadaposição de aminoácido de cada variante de protease, incluindo cada variante de protease, é numerada de acordo com a numeração de posição de aminoácido correspondente na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada na figura 1, conforme determinada pelo alinhamento da sequência de aminoácido de variante de protease com a sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Um esquema de numeração alternativo consiste em numerar a sequência de aminoácidos específica da protease subtilisina GG36 de B. lentus, tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID n° 1. Nenhuma das posições de aminoácido das variantes de protease, inclusive as variantes de protease aqui descritas, é numerada usando-se esse esquema de numeração alternativo.
Na descrição das variantes de protease da presente invenção, a seguinte nomenclatura é usada para facilidade de referência: aminoácidos originais:posições:aminoácidos substituídos.
As mutações são nomeadas pelo código de uma letra para o aminoácido progenitor, seguido de um número de posição com três dígitos e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como "G087S" ou "G87S". As mutações múltiplas são indicadas pela inserção de um entre as mutações. As mutações nas posições 87 e 90 são representadas como "G087S-A090Y" ou "G87S-A90Y" ou "G87S + A90Y" ou "G087S + A090Y". Para deleções, o código de letra única "Z" é usado. Para uma inserção em relação à sequência progenitora, o código de uma letra "Z" está no lado esquerdo do número de posição. Para uma deleção, o código de uma letra "Z" está no lado direito do número de posição. Para inserção, o número de posição é o número de posição antes dos um ou mais aminoácidos inseridos, mais 0,01 para cada aminoácido. Por exemplo, uma inserção de três aminoácidos alanina (A), serina (S) e tirosina (Y) entre a posição 87 e 88 é mostrada como "Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y." Dessa forma, a combinação de todas as mutações acima mais uma deleção na posição 100 é: "G087S- Z087.01 A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z." Em todos os casos, é empregada a abreviação IUPAC para aminoácidos, de letra única ou tripla, comumente aceita. A letra única Xse refere a qualquer dos vinte aminoácidos. O termo "de tipo selvagem", em referência a uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos, indica que a sequência de aminoácidos ou a sequência de ácidos nucleicos é uma sequência nativa ou de ocorrência natural. Para uso na presente invenção, o termo "de ocorrência natural"se refere a qualquer coisa (por exemplo, proteínas, aminoácidos ou sequências de ácido nucleico) que seja encontrada na natureza (isto é, não foi manipulada por meio de métodos recombinantes). Para uso na presente invenção, o termo "que não tem ocorrência natural"se refere a qualquer coisa que não seja encontrada na natureza (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes produzidos em laboratório).
Para uso na presente invenção no que se refere a posições de resíduos de aminoácido, "correspondente a", ou "corresponde a", ou "cor-responde"se refere a um resíduo de aminoácido na posição enumerada em uma proteína ou peptídeo, ou um resíduo de aminoácido que é análogo, homólogo ou equivalente a um resíduo enumerado em uma proteína ou peptídeo. Para uso na presente invenção, "região correspondente" geralmente se refere a uma posição análoga ao longo de proteínas relacionadas ou de uma proteína de referência.
Os termos "derivado de" e "obtido a partir de" se referem não somente a uma protease produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também a uma protease codificada por uma sequência de DNA isolada dessa cepa e produzida em um organismo hospedeiro contendo essa sequência de DNA. Adicionalmente, o termo se refere a uma protease que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA, e que tem as características identificadoras da protease em questão. Para exemplificar, "proteases derivadas de Bacillus" se refere àquelas enzimas que têm atividade proteolítica e que são naturalmente produzidas por Bacillus, bem como às serina proteases, como aquelas produzidas por fontes de Bacillus mas que, através do uso de técnicas de engenharia genética, são produzidas por organismos não Bacillus transformados com um ácido nucleico que codifica as serina proteases. O termo "idêntico" no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos ou de polipeptídeos se refere aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhados para máxima correspondência, conforme medido com o uso de um dos seguintes algoritmos para comparação ou análise de sequências.
Para uso na presente invenção, "genes homólogos" refere-se a um par de genes provenientes de espécies diferentes mas geralmente relacionadas, que correspondem um ao outro e que são idênticos ou muito similares um ao outro. O termo abrange genes que são separados por especia-ção (isto é, o desenvolvimento de novas espécies) (por exemplo, genes ortó-logos), bem como genes que foram separados por duplicação genética (por exemplo, genes parálogos). O termo "maduro" quanto à forma de uma proteína, polipeptí-deo ou peptídeo se refere á forma funcional da proteína, do polipeptídeo ou do peptídeo, sem a sequência do peptídeo de sinalização e a sequência de propeptídeo.
Para uso na presente invenção, "homologia" se refere à similaridade ou identidade entre sequências, sendo preferencial a identidade. A homologia pode ser determinada com o uso de técnicas-padrão conhecidas na técnica (Consulte, por exemplo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 [1981]; Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 [1970\; Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444 [1988]; programas de software como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de software de Wiscon-sin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, Wl, EUA); e Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387 a 395 [1984]). Um exemplo de algoritmo útil é o PILEUP. O PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas com o uso de alinhamentos progressivos e pareados. O mesmo pode, também, plotar uma árvore mostrando as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle (Consulte, Feng e Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 a 360 [1987]). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp (consulte Higgins e Sharp, CA-BIOS 5:151-153 [1989]). Os parâmetros úteis de PILEUP, inclusive um peso-padrão de lacuna de 3,00, um peso-padrão de comprimento da lacuna de 0,10, e lacunas de terminação ponderadas. Outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al., (Consulte, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 a 410 [1990]; e Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873 a 5787 [1993]). Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 (Consulte, Altschul et al., Meth. Enzymol. 266:460 a 480 [1996]). O WU-BLAST-2 usa vários parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais estão ajustados para os valores-padrão. Os parâmetros ajustáveis são ajustados com os seguintes valores: extensão de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limite de palavra (T) = 11. Os parâmetros HSP S e HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio programa, dependendo da composição da sequência específica e da composição da base de dados específica contra as quais a sequência de interesse será pesquisada. Entretanto, os valores podem ser ajustados para aumentar a sensibilidade. A porcentagem de identidade de sequência entre uma sequência de referência e uma sequência de teste de interesse pode ser prontamente determinada pelo versado na técnica. A porcentagem de identidade compartilhada pelas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo é determinada por meio de comparação direta entre as informações da sequência entre as moléculas, mediante o alinhamento das sequências e a determina ção da identidade com o uso de métodos conhecidos na técnica. Um exemplo de um algoritmo que é adequado para a determinação da similaridade entre sequências é o algoritmo BLAST (consulte Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215:403 a 410 [1990]). O software para realização de análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Infor-mation (Centro nacional de Informações sobre Biotecnologia). Esse algoritmo envolve primeiro identificar pares de sequências com alta pontuação (HSPs, de "high scoring sequence pairs") mediante a identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta que ou correspondam ou satisfaçam alguma pontuação de limite T com valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. Esses resultados positivos iniciais por aproximação servem como pontos de partida para encontrar HSPs mais longos contendo as mesmas. Os acertos de palavras são expandidos em ambas as direções ao longo de cada uma das duas sequências sendo comparadas, por tanto quanto possa ser aumentada a pontuação cumulativa de alinhamento. A extensão dos acertos de palavras é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa diminui pela quantidade X a partir de um valor alcançado máximo; A pontuação cumulativa vai a zero ou abaixo; ou o fim de qualquer sequência é alcançado. Os parâmetros para o algoritmo BLAST, W, T e X, determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como configurações padrão um comprimento de onda (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (consulte, Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1992]) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M'5, N'-4, e uma comparação entre ambos os filamentos. O algoritmo BLAST realiza, então, uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (consulte, por exemplo, Karlin e Altschul, supra). Uma medida de similaridade oferecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), que oferece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre dois nucleotídeos ou sequências de aminoácido ocorreríam por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a um ácido nucleico de serina protease da presente inven ção se a probabilidade da menor soma em uma comparação entre o ácido nucleico de teste e um ácido nucleico de serina protease for menor que cerca de 0,1, com mais preferência menor que cerca de 0,01 e, com a máxima preferência, menor que cerca de 0,001. Nos casos em que o ácido nucleico de teste codifica um polipeptídeo de serina protease, o mesmo é considerado similar a um ácido nucleico de serina protease especificado se a comparação resultar em uma probabilidade da menor soma menor que cerca de 0,5 e, com mais preferência, menor que cerca de 0,2. A porcentagem de "idêntico" ou "identidade" no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo se refere a duas ou mais sequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de ácido nucleico ou resíduos de aminoácido, respectivamente, que são iguais, quando comparados e alinhados para máxima similaridade, conforme determinado com o uso de um algoritmo para comparação de sequências ou por inspeção visual. A "porcentagem de identidade de sequência", ou "% de identidade", ou "% de identidade de sequência", ou "% identidade entre sequências de aminoácidos" entre uma sequência de aminoácidos da presente invenção e uma sequência de aminoácidos de referência (isto é, consulta) significa que a sequência de aminoácidos da presente invenção é idêntica (isto é, em uma base de aminoácido-por-aminoácido) por uma porcentagem especificada à sequência de aminoácidos da consulta, ao longo de um comprimento de comparação quando as sequências estão otimamente alinhadas. Dessa forma, 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou 80% de identidade em relação a duas sequências de aminoácido significa que 80% dos resíduos de aminoácido em duas sequências de aminoácido otimamente alinhadas são idênticas. A "porcentagem de identidade de sequência", ou "% de identidade", ou "% de identidade de sequência", ou "% de identidade entre sequências de nucleotídeo" entre uma sequência de ácidos nucleicos da presente invenção e uma sequência de ácidos nucleicos de referência (isto é, consulta) significa que a sequência de ácidos nucleicos da presente invenção é idêntica (isto é, em uma base de nucleotídeo-por-nucleotídeo para uma sequência de polinucleotídeos) por uma porcentagem especificada à sequência de consulta, ao longo de um comprimento de comparação quando as sequências estão otimamente alinhadas. Dessa forma, 80% de identidade de sequência de nucleotídeos, ou 80% de identidade em relação a duas sequências de ácido nucleico significa que 80% dos resíduos de nucleotídeo em duas sequências de ácido nucleico otimamente alinhadas são idênticos.
Em algumas modalidades, a porcentagem de identidade de sequência, ou "% de identidade de sequência", ou "% de identidade" entre uma sequência da presente invenção e uma sequência de consulta pode ser calculada mediante o alinhamento ótimo das duas sequências e a comparação das duas sequências otimamente alinhadas ao longo do comprimento de comparação. O número de posições no alinhamento ótimo no qual resíduos idênticos ocorrem em ambas as sequências é determinado, fornecendo assim o número de posições correspondentes, e o número de posições correspondentes é, então, dividido pelo número total de posições do comprimento de comparação (que, exceto onde especificado em contrário, é o comprimento da sequência de consulta). O número resultante é multiplicado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência entre a sequência em questão e a sequência de consulta.
Os termos "alinhamento ótimo" ou "otimamente alinhado" se referem ao alinhamento de duas (ou mais) sequências resultando na mais alta pontuação de porcentagem de identidade. Por exemplo, o alinhamento ótimo de duas sequências de proteínas pode ser obtido mediante o alinhamento manual das sequências, de modo que o máximo número de resíduos de a-minoácido idênticos em cada sequência fiquem alinhados uns aos outros, ou mediante o uso de programas de software ou procedimentos aqui descritos ou conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de duas sequências de ácido nucleico pode ser obtido mediante o alinhamento manual das sequências, de modo que o máximo número de resíduos de nucleotídeo idênticos em cada sequência fiquem alinhados uns aos outros, ou mediante o uso de programas de software ou procedimentos aqui descritos ou conhecidos na técnica.
Em algumas modalidades, duas sequências de polipeptídeo são consideradas "otimamente alinhadas" quando estão alinhadas com o uso de parâmetros definidos, como uma matriz de substituição de aminoácido definida, penalidade por existência de lacuna (também denominada penalidade por abertura de lacuna), e penalidade por ampliação de lacuna, de modo a se atingir a mais alta pontuação de similaridade possível para aquele par de sequências. A matriz de pontuação BLOSUM62 (consulte Henikoff e Henikoff, supra) é frequentemente usada como padrão para matriz de pontuação por substituição nos algoritmos de alinhamento de sequências de polipeptídeo (por exemplo, BLASTP). A penalidade por existência de lacuna é imposta para a introdução de uma única lacuna de aminoácido em uma das sequências alinhadas, e a penalidade por ampliação de lacuna é imposta para cada posição de resíduo na lacuna. Os parâmetros de alinhamento exemplificadores usados são: Matriz de pontuação BLOSUM62, penalidade por existência de lacuna = 11, e penalidade por extensão de lacuna = 1. A pontuação de alinhamento é definida pelas posições de aminoácido de cada sequência na qual o alinhamento começa e termina (por exemplo, a janela de alinhamento) e, opcionalmente, pela inserção de uma ou mais lacunas em uma ou ambas as sequências, de modo a se obter a pontuação de similaridade mais alta possível. O alinhamento ótimo entre duas ou mais sequências pode ser determinado manualmente por inspeção visual ou mediante o uso de um computador como, mas não se limitando a, por exemplo o programa BLASTP para sequências de aminoácido e o programa BLASTN para sequências de ácido nucleico (consulte, por exemplo, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997); Consulte também o site da web do Na-tional Center for Biotechnology Information (NCBI)).
Enzima não imunoequivalente e/ou enzimas adicionais Os produtos destinados ao consumidor podem compreender uma ou mais enzimas que fornecem benefícios de desempenho de limpeza e/ou de tratamento de tecidos. Exemplos de enzimas adequadas incluem, mas não se limitam a, hemicelulases, peroxidases, proteases, celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, manana-ses, pectato liases, queratinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxi-genases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, β-glucanãses, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase e amilases, ou misturas dos mesmos. Uma combinação típica é um coquetel de enzimas que pode compreender, por exemplo, uma protease e uma lipase em conjunto com amilase. Quando presentes em um produto destinado ao consumidor, as enzimas adicionais anteriormente mencionadas podem estar presentes em teores na faixa de cerca de 0,00001% a cerca de 2%, de cerca de 0,0001% a cerca de 1% ou mesmo de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, de proteína de enzima em peso do produto destinado ao consumidor.
Em um aspecto, as enzimas adequadas deveríam incluir uma protease. As proteases adequadas incluem metaloproteases e proteases de serina, incluindo proteases de serina microbianas neutras ou alcalinas, como subtilisinas (EC 3.4.21.62). As proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Em um aspecto, tal protease adequada pode ser de origem microbiana. As proteases adequadas incluem mutantes química ou geneticamente modificados das proteases adequadas supracitadas. Em um aspecto, a protease adequada pode ser uma protease de serina, como uma protease microbiana alcalina e/ou uma protease do tipo tripsina. Os exemplos de proteases neutras ou alcalinas adequadas incluem: (a) subtilisinas (EC 3.4.21.62), inclusive aquelas derivadas Bacillus, como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus e Bacillus gibsonii descritas em U.S. 6.312.936 B1, U.S. 5.679.630, U.S. 4.760.025, U.S. 7.262.042 e W009/021867. (b) proteases do tipo tripsina ou do tipo quimotripsina, como tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina), inclusive a protease de Fusarium descrita em US5288627 e as proteases quimotripsinas derivadas de Cellumonas, descritas em US PA 2008/0063774A1. (c) metaloproteases, inclusive aquelas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens descritas em US PA 2008/0293610A1.
As proteases preferenciais incluem aquelas derivadas de Bacil- lus gibsonii ou Bacillus Lentus.
Enzimas protease adequadas comercialmente disponíveis incluem aquelas comercializadas sob os nomes comerciais Alcalase®, Savi-nase®, Primase®, Durazym®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liqua-nase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme®, Neutrase®, Everlase® e Espera-se® por Novozymes A/S (Dinamarca), aquelas vendidas sob o nome comercial de Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect Ox®, FN3®, FN4®, Excellase® e Purafect OXP® por Ge-nencor International, aquelas vendidas sob o nome comercial de Opticlean® e Optimase® por Solvay Enzymes, aquelas disponíveis junto à Henkel/ Ke-mira, a saber BLAP (sequência mostrada na figura 29 de US 5.352.604 com as mutações a seguir S99D + S101 R + S103A + V104I + G159S, mais adiante neste documento chamadas de BLAP), BLAP R (BLAP com S3T + V4I + V199M + V205I + L217D), BLAP X (BLAP com S3T + V4I + V205I) e BLAP F49 (BLAP com S3T + V4I + A194P + V199M + V205I + L217D) - todas junto à Henkel/Kemira; e KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus com mutações A230V + S256G + S259N) junto à Kao.
Em um aspecto, o produto destinado ao consumidor pode compreender uma protease que não é imunoequivalente à protease da presente invenção. Para os propósitos da presente invenção, uma protease i-munoequivalente terá um alto grau de identidade (>80%) com BPN' e apresentará reação cruzada com o mesmo anticorpo. As enzimas não imunoe-quivalentes adequadas incluirão aquelas derivadas de Bacillus Lentus, Bacillus gibsonii e a metaloprotease derivada de Bacillus amyloliquefaciens.
As alfa amilases adequadas incluem aquelas de origem bacte-riana ou fúngica. Os mutantes química ou geneticamente modificados (variantes) estão incluídos. Uma alfa amilase alcalina adequada pode ser derivada de uma cepa de Bacillus, como Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou outro Bacillus sp., como Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513, DSM 9375 (USP 7.153.818) DSM 12368, DSMZ n° 12649, KSM AP1378 (US 6.979.731), KSM K36 ou KSM K38 (US 6.916.645). As amilases adequadas incluem: (a) as variantes descritas em WO 94/02597, US6.297.037, US7.378.264 e US5.763.385, especificamente, as variantes com substituições em uma ou mais das posições a seguir versus a enzima listada como SEQ ID n° 2 em US 7.378.264: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391,408 e 444. (b) as variantes descritas em USP 5.856.164 e US 6.673.589, US 6.093.562, US 6.187.576 e US PA 2008/0193999A1, especificamente, as variantes com uma ou mais substituições nas posições a seguir versus a enzima AA560 listada como SEQ ID n° 12 em USPA2008/0193999A1: 26, 30, 33, 82, 37, 106, 118, 128, 133, 149, 150, 160, 178, 182, 186, 193, 203, 214, 231, 256, 257, 258, 269, 270, 272, 283, 295, 296, 298, 299, 303, 304, 305, 311, 314, 315, 318, 319, 339, 345, 361, 378, 383, 419, 421, 437, 441, 444, 445, 446, 447, 450, 461, 471, 482, 484, de preferência, que tam- bém contenham as deleções de D183* e G184*. (c) variantes que apresentam pelo menos 90% de identidade com SEQ ID No. 4 em USPA2008/0193999A1, a enzima do tipo selvagem de Bacillus SP722, especificamente, variantes com deleções nas posições 183 e 184 e variantes descritas em US 6.187.576, que estão aqui incorporadas, a título de referência. (d) variantes que apresentam pelo menos 95% de identidade com a enzima de ocorrência natural obtida de Bacillus sp.707 (SEQ ID n° 7 em US 6.093. 562), especialmente aquelas compreendendo uma ou mais dentre as seguintes mutações M202, M208, S255, R172, e/ou M261. Em um aspecto, a dita amilase compreende um ou mais dentre M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, M202W, S255N e/ou R172Q. Particularmente, adequadas são aquelas que compreendem a M202L ou mutações M202T.
As alfa-amilases adequadas disponíveis comercialmente incluem DURAMYL®, LIQUEZYME®, TERMAMYL®, TERMAMYL ULTRA®, NA-TALASE®, SUPRAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, FUNGAM-YL® e BAN® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), KEMZYM® AT 9000 (Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200, Viena, Áus tria), RAPIDASE®, PURASTAR®, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS® e PURASTAR OXAM® (Genencor International Inc., Paio Alto, Califórnia, EU-A) e KAM® (Kao, 14-10 Nihonbashi Kayabacho, 1-chome, Chuo-ku, 103-8210, Tóquio, Japão). Em um aspecto, as amilases adequadas incluem NA-TALASE®, STAINZYME® e STAINZYME PLUS® e misturas das mesmas.
Em um aspecto, essa enzima adicional pode ser selecionada do grupo consistindo em: lipases, inclusive "lipases de primeiro ciclo" como aquelas descritas na patente US n° 6.939.702 B1 e US PA 2009/0217464. Em um aspecto, a lipase é uma lipase de primeira lavagem, em um aspecto, uma variante da lipase do tipo selvagem de Thermomyces lanuginosus que compreende T231R e mutações N233R. A sequência de ocorrência natural é 269 aminoácidos (aminoácidos 23 a 291) do número de acesso de Swissprot Swiss-Prot 059952 (derivado de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanu-ginosa)). As lipases adequadas incluiríam aquelas vendidas sob os nomes comerciais Lipex®, Lipolex® e Lipoclean® da Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca.
Em um aspecto, a composição compreende uma variante de lipase de Thermomyces lanuginosa que tem >90% de identidade em relação ao aminoácido do tipo selvagem e que compreende substituição(ões) em T231 e/ou N233, em um aspecto, T231R e N233R.
Em um aspecto, outras enzimas incluem celulases de origem bacteriana ou fúngica. Estão incluídos os mutantes quimicamente modificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxyspo-rum apresentadas nos documentos U.S. 4.435.307, U.S. 5.648.263, U.S. 5.691.178, U.S. 5.776.757 e US 5.691.178. As celulases incluem as celulases alcalinas ou neutras oferecendo benefícios de cuidado das cores. E-xemplos de tais celulases são celulases descritas em US 5.520.838, US 5.948.672, US 5.919.691, US 6.001.639, W098/08940. Outros exemplos são variantes de celulase como aquelas descritas em US 6.114.296, US 5.457.046, US 5.457.046, US 5.686.593, US 5.763.254, US 6.117.664, US PA 2009/0170747A1 e PCT/DK98/00299. As celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme® e Carezyme® (Novozymes A/S), Clazinase® e Puradax HA® (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)® (Kao Corporati-on).
Em um aspecto, a celulase pode ser uma celulase de limpeza bacteriana. Tais celulases de limpeza bacteriana são endo beta 1,4- gluca-nases e têm uma estrutura que não compreende um módulo de ligação de carboidrato classe A (CBM). Um CBM classe A é definido de acordo com A. B. Boraston et al. Biochemical Journal 2004, Volume 382 (parte 3) páginas 769 a 781. Em particular, a celulase não compreende um CBM classe A das famílias 1, 2a, 3, 5 e 10.
Em um aspecto, a celulase de limpeza bacteriana pode ser uma glicosil hidrolase que tem atividade enzimática para substratos de celulose amorfos, sendo a glicosil hidrolase é selecionada a partir das famílias GH 5, 7, 12, 16, 44 ou 74. Em um aspecto, a celulase pode ser uma glicosil hidrolase selecionada a partir da família GH 5. Em um aspecto, a celulase pode ser Celluclean®, suprida por Novozymes. Essa celulase é descrita em maiores detalhes em US 7.141.403. A definição de família glicosil hidrolase (GH) é descrita em maiores detalhes em Biochem J. 1991, v280, 309 a 316.
Outra celulase de limpeza bacteriana adequada é uma glicosil hidrolase que tem atividade enzimática tanto para xiloglucano quanto para substratos de celulose amorfos, sendo a glicosil hidrolase é selecionada a partir das famílias GH 5, 12, 44 ou 74. Em um aspecto, a glicosil hidrolase é selecionada a partir da família GH 44. A enzima glicosil hidrolase pode pertencer à família glicosil hidrolase 44.
Glicosil hidrolases adequadas podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em: Glicosil hidrolases da família GH 44 de Paenibacil-lus polyxyma (de ocorrência natural) como XYG1006 descrito no US 7.361.736 ou são variantes da mesma; Glicosil hidrolases da família GH 12 de Bacillus licheniformis (de ocorrência natural) como SED. ID n° 1 descritas em US 6.268.197 ou são variantes da mesma; Glicosil hidrolases da família GH 5 de Bacillus agaradhaerens (de ocorrência natural) ou variantes da mesma; Glicosil hidrolases da família GH 5 de Paenibacillus (de ocorrência natural) como XYG1034 e XYG 1022 descritas no US 6.630.340 ou são variantes da mesma; Glicosil hidrolases da família GH 74 de Jonesia sp. (de ocorrência natural) como XYG1020 descritas no WO 2002/077242 ou variantes da mesma; e glicosil hidrolases da família GH 74 de Trichoderma Reesei (de ocorrência natural), como a enzima conforme descrita em maiores detalhes em sequência ID n° 2 de US 7.172.891 ou variantes da mesma.
Glicosil hidrolases adequadas podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em: Glicosil hidrolases da família GH 44 de Paenibacillus polyxyma (de ocorrência natural) como XYG1006 ou são variantes da mesma.
As celulases de limpeza bacteriana adequadas são vendidas sob os nomes comerciais Celluclean® e Whitezyme® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).
Em um aspecto, a composição pode compreender uma celula-se de limpeza fúngica pertencente à família de glicosil hidrolase 45 com um peso molecular de 17 kDa a 30 kDa, por exemplo, as endoglucanases vendidas sob o nome comercial de Biotouch® NCD, DCC e DCL (AB Enzymes, Darmstadt, Alemanha).
Outras enzimas adequadas incluem pectato liases vendidas sob os nomes comerciais Pectawash® e Pectaway®, e mananases vendidas sob os nomes comerciais Mannaway® (todas disponíveis junto à Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), e Purabrite® (Genencor International Inc., Paio Alto, Califórnia, EUA).
Em um aspecto, a composição compreende um tensoativo não iônico de Guerbet. O tensoativo não iônico de Guerbet é um tensoativo detergente à base de álcool secundário que tem a seguinte fórmula: sendo R1 = alquila C2-s linear ou ramificada, substituída ou não substituída, saturada ou insaturada; sendo R2 = alquila C2-s linear ou ramificada, substituída ou não substituída, saturada ou insaturada sendo o número total de átomos de carbono presentes nas porções de R1 + R2 está na faixa de 7 a 13; sendo EO/PO são porções alcóxi selecionadas a partir de etóxi, propóxi, ou misturas dos mesmos, sendo n é o grau médio de alcoxilação e está na faixa de 4 a 10. Coadjuvantes Os detergentes para lavanderia disponíveis comercialmente compreendem um coadjuvante inorgânico forte, sendo um coadjuvante à base de fosfato, tipicamente, tripolifosfato de sódio (STPP) ou um coadjuvante à base de zeólito, tipicamente, à base de aluminossilicato de sódio, é usado como o coadjuvante forte predominante. Em geral, tais coadjuvantes fortes estão presentes em teores relativamente altos como 15 a 20%, em peso, ou mesmo, maiores, por exemplo, mesmo até 40%, em peso. De a-cordo com um aspecto preferencial da presente invenção, a quantidade de coadjuvante forte selecionado a partir de coadjuvante à base de fosfato e/ou à base de zeólito não é maior que 10%, em peso, com base no peso total da composição detergente, de preferência, abaixo de 8%, em peso, ou mesmo, com mais preferência, abaixo de 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1%, em peso.
Desse modo, as composições preferenciais da invenção são composições de coadjuvante baixo que compreendem de 0%, em peso, a 10%, em peso, de coadjuvante à base de zeólito, e 0%, em peso, a 10%, em peso, de coadjuvante à base de fosfato, sendo a quantidade total de fosfato e/ou zeólito não excede 10%, em peso e, de preferência, está abaixo de 10%, em peso, conforme descrito acima. De preferência as composições da invenção compreendem de 0%, em peso, a 8%, em peso, ou de 0%, em peso, a 5 ou 4%, em peso, ou de 0%, em peso, a 3 ou mesmo menos que 2%, em peso, de coadjuvante à base de zeólito. Pode até mesmo ser preferencial que a composição seja essencialmente isenta de coadjuvante à base de zeólito. O termo "essencialmente isenta de coadjuvante à base de zeólito" significa, tipicamente, que a composição não compreende qualquer quantidade deliberadamente adicionada de coadjuvante à base de zeólito. Isto é especialmente preferencial se for desejável que a composição seja altamente solúvel, para minimizar a quantidade de resíduos insolúveis em água (que podem, por exemplo, depositar-se sobre as superfícies de tecido), e também se for altamente desejável a obtenção de um líquido de lavagem transparente. Os coadjuvantes à base de zeólito incluem zeólito A, zeólito X, zeólito P e zeólito MAP.
As composições da invenção podem compreender de 0%, em peso, a 10%, em peso, de coadjuvante à base de fosfato. A composição compreende, de preferência, de 0%, em peso, a 8%, em peso, ou de 0%, em peso, a 5 ou 4%, em peso, ou de 0%, em peso, a 3 ou mesmo de 2%, em peso, de coadjuvante à base de fosfato. Pode até mesmo ser preferencial que a composição seja essencialmente isenta de coadjuvante à base de fosfato. O termo "essencialmente isenta de coadjuvante à base de fosfato" significa, tipicamente, que a composição não compreende qualquer quantidade deliberadamente adicionada de coadjuvante à base de fosfato. Isto é especialmente preferencial se for desejável que a composição tenha um perfil ambiental muito bom. Os coadjuvantes à base de fosfato incluem tripolifosfa-to de sódio.
Em um aspecto ainda mais preferencial da invenção, o teor total de coadjuvantes fracos selecionados entre silicato em camadas (SKS-6), ácido cítrico, sais de citrato e ácido nitrilo triacético ou os sais dos mesmos, está abaixo de 15%, em peso, com mais preferência abaixo de 8%, em peso, com mais preferência abaixo de 4%, em peso ou mesmo abaixo de 3 ou 2% do peso total da composição detergente. Tipicamente, o teor de cada silicato em camadas, ácido cítrico, sal de citrato e ácido nitrilo triacético ou sais dos mesmos, estará abaixo de 10%, em peso, ou mesmo abaixo de 5% do peso total da composição.
Embora os coadjuvantes tragam vários benefícios ao formula-dor, seu papel principal é o de sequestrar íons metálicos divalentes (como íons de cálcio e de magnésio) da solução de lavagem que, de outro modo, interagiríam negativamente com o sistema tensoativo. Os coadjuvantes são, também, eficazes na remoção de íons metálicos e sujeiras inorgânicas da superfície do tecido, o que leva ao aprimoramento da remoção de particula-dos e de manchas de bebida. Portanto, seria de se esperar que a redução de seus teores impactaria negativamente o desempenho de lavagem e, por isso, a preparação das composições detergentes que são eficazes com os alegados níveis reduzidos de coadjuvantes à base de fostato e de zeólito é surpreendente.
Alcalinidade de reserva Para uso na presente invenção, o termo "alcalinidade de reserva" é a medida da capacidade de tamponagem da composição detergente (g de NaOH por 100 g da composição detergente) determinada pela titulação de uma solução a 1% (peso/volume) da composição detergente com ácido clorídrico até um pH de 7,5, isto é, para calcular a alcalinidade de reserva conforme aqui definida: Alcalinidade de reserva (até pH 7,5) como % de álcali em g de NaOH por 100 g de produto = T x M x40 x Vol. 10 x Peso x alíquota T = Titulação (ml) para pH 7,5 M = Molaridade de HCI = 0,2 40 = .~ Peso molecular do NaOH
Vol. = Volume total (isto é, 1000 ml) Peso = Peso do produto (10 g) Alíquota = (100 ml) Obter uma amostra de 10 g (pesada com precisão de duas casas decimais) da composição detergente totalmente formulada. A amostra deve ser obtida usando-se um amostrador Pascall e um gabinete à prova de poeira. Adicionar a amostra de 10 g em um béquer de plástico e adicionar 200 ml de água desionizada isenta de dióxido de carbono. Agitar usando um agitador magnético em uma placa de agitação a 150 rpm, até que esteja totalmente dissolvido e durante ao menos 15 minutos. Transferir o conteúdo do béquer para um frasco volumétrico de 1 litro e completar 1 litro com água desionizada. Misturar bem e tomar uma alíquota de 100 mis ± 1 ml usando imediatamente uma pipeta de 100 mis. Medir e anotar a temperatura e o pH da amostra usando um medidor de pH com capacidade de leitura de ±0,01 unidade de pH, com agitação, mantendo a temperatura em 21°C +/- 2°C. Titular, sob agitação, com ácido clorídrico a 0,2 M até que o pH seja exatamente 7,5. Anotar a quantidade (em mililitros) de ácido clorídrico usado. Tomar a titulação média de três repetições idênticas. Fazer o cálculo descrito acima para obter a AR para pH 7,5. A AR das composições detergentes da invenção pode ser, preferencialmente, maior que 7,5 e, preferencialmente, maior que 8. A AR pode ser maior que 9 ou mesmo maior que 9,5 ou 10 ou mais. A AR pode até ser 20 ou mais. A alcalinidade de reserva adequada pode ser fornecida, por exemplo, por um ou mais silicatos de metal alcalino (excluindo os silicatos cristalinos em camadas), tipicamente sais de sílica amorfa, geralmente sais de sódio com razões de 1,2 a 2,2, sendo o metal alcalino é tipicamente carbonato, bicarbonato e/ou sesquicarbonato de sódio. O STPP e os persais como perborato e percarbonatos também contribuem para a alcalinidade. A tamponagem é necessária para manter um pH alcalino durante o processo de lavagem, contrabalançando a acidez das sujeiras, especialmente dos á-cidos graxos liberados pela enzima lipase. A composição detergente compreende, de preferência, de 0%, em peso, a 50%, em peso, de sal de silicato, mais comumente de 5 a 30%, em peso, de sal de silicato ou 7 a 20%, em peso, de sal de silicato, comumente silicato de sódio.
Com a finalidade de fornecer a alcalinidade de reserva preferencial, as composições detergentes da invenção podem compreender um sal de carbonato, tipicamente, de 1%, em peso, a 70%, em peso, ou de 5%, em peso, a 50%, em peso, ou de 10%, em peso, a 30%, em peso, de sal de carbonato. Os sais de carbonato preferenciais são carbonato de sódio e/ou bicarbonato de sódio e/ou sesquicarbonato de sódio. O sal de carbonato pode ser incorporado à composição detergente totalmente ou parcialmente a través de um sal misto como burqueíta. Um sal de carbonato altamente preferencial é o carbonato de sódio. De preferência, a composição pode compreender de 5%, em peso, a 50%, em peso, de carbonato de sódio ou de 10 a 40%, em peso, ou mesmo de 15 a 35%, em peso, de carbonato de sódio. Pode ser desejável, também, que a composição compreenda de 1%, em peso, a 20%, em peso, de bicarbonato de sódio ou mesmo de 2 a 10 ou 8%, em peso.
Se o zeólito estiver presente, pode ser desejável que a razão entre o peso do carbonato de sódio e/ou o silicato de sódio e peso do coadjuvante à base de zeólito seja de ao menos 5:1, de preferência ao menos 10:1 ou ao menos 15:1 ou ao menos 20:1 ou mesmo ao menos 25:1. O sal de carbonato, ou ao menos parte do mesmo, está tipicamente sob a forma de um particulado, tipicamente com um tamanho médio ponderado da partícula na faixa de 200 a 500 micrômetros. Entretanto, pode ser preferencial para o sal de carbonato, ou pelo menos parte do mesmo, para ser sob a forma de um particulado micronizado, tipicamente tendo um tamanho médio ponderado da partícula na faixa de 4 a 40 micrômetros; Isto é especialmente preferencial quando o sal de carbonato, ou pelo menos parte do mesmo, está na forma de uma mistura por adição coparticulada com um tensoativo detergente, como um tensoativo detergente aniônico alcoxila-do.
Para fornecer a alcalinidade de reserva desejada, de preferência os teores de carbonato e/ou sais de silicato, tipicamente carbonato de sódio e silicato sódio, serão de 10 a 70%, em peso, ou de 10 ou mesmo 15 a 50% do peso total da composição. Materiais Auxiliares Em adição aos materiais previamente revelados no presente documento e, embora não seja essencial para os propósitos da presente invenção, a lista não limitadora de auxiliares ilustrada mais adiante no presente documento é adequada ao uso nos presentes produtos destinados ao consumidor e pode ser desejavelmente incorporada em certas modalidades da invenção, por exemplo, para ajudar ou acentuar o desempenho de limpeza, para tratamento do substrato a ser limpo ou para modificar a estética do ■ produto destinado ao consumidor, como é o caso de perfumes, colorantes, corantes ou similares. Os teores de qualquer desses compostos auxiliares incorporados em qualquer produto destinado ao consumidor o são em adição a quaisquer materiais anteriormente mencionados para incorporação. A natureza exata desses componentes adicionais/materiais auxiliares, bem como os teores de incorporação dos mesmos, dependerão da forma física do produto destinado ao consumidor e da natureza da operação de limpeza na qual o mesmo será usado. Os materiais auxiliares adequados incluem, mas não se limitam a, tensoativos, aceleradores, agentes quelantes, agentes inibidores de transferência de corantes, dispersantes, enzimas adicionais e estabilizantes de enzimas, materiais catalíticos, ativadores de alvejamento, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácido pré-formado, agentes poliméricos dispersantes, agentes antirreposição/remoção de sujeira à base de argila, alvejantes, supressores de espuma, corantes, perfumes, agentes elastificantes de estrutura, amaciantes de panos, veículos, hidrótropos, elementos auxiliares ao processamento, solvente e/ou pigmentos. Além da descrição abaixo, exemplos adequados desses outros compostos auxiliares, bem como seus níveis de uso, são encontrados nas patentes U.S. N° 5.576.282, N° 6.306.812 B1 e N° 6.326.348 B1, que estão aqui incorporadas, por referência.
Conforme declarado anteriormente, os ingredientes auxiliares não são essenciais aos produtos destinados ao consumidor dos Requerentes. Portanto, determinadas modalidades dos produtos destinados ao consumidor dos Requerentes não contêm um ou mais dos seguintes materiais auxiliares: tensoativos, coadjuvantes, agentes quelantes, agentes inibidores de transferência de pigmentos, dispersantes, enzimas adicionais e estabilizantes de enzimas, materiais catalíticos, ativadores de alvejamento, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados, agentes poliméricos dispersantes, agentes de remoção de sujei-ra/antirredeposição à base de argila, clareadores, supressores de espuma, corantes, perfumes, agentes elasticizantes de estrutura, amaciantes de tecido, veículos, hidrótropos, elementos auxiliares ao processamento, solventes e/ou pigmentos. No entanto, quando estão presentes um ou mais compostos auxiliares, estes podem estar presentes conforme detalhado abaixo: Agentes de alvejamento - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção podem compreender um ou mais agentes de alvejamento. Os agentes de alvejamento adequados, outros que não os catalisadores de alvejamento, incluem alvejantes fotoativados, ativadores de alvejamento, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados e combinações dos mesmos. Em geral, quando um agente de alvejamento é usado, os produtos destinados ao consumidor da presente invenção podem compreender de cerca de 0,1% a cerca de 50% ou mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 25% de agente de alvejamento em peso do produto destinado ao consumidor em questão. Exemplos de agentes de alvejamento adequados incluem: (1) fotobranqueadores, por exemplo ftalocianina de zinco sulfo-natada, ftalocianina de alumínio sulfonatada, corantes xanteno e misturas dos mesmos; (2) perácidos pré-formados: Os perácidos pré-formados adequados incluem, mas não se limitam a, compostos selecionados do grupo consistindo em ácidos e sais percarboxílicos, ácidos e sais percarbônicos, ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroximonossulfúricos, por exemplo Oxone®, e combinações dos mesmos. Ácidos percarboxílicos adequados incluem perácidos hidrofóbicos e hidrofílicos que tem a fórmula R-(C=O)O-O-M, em que R é um grupo alquila, opcionalmente ramificado, que tem, quando o perácido é hidrofóbico, de 6 a 14 átomos de carbono, ou de 8 a 12 átomos de carbono e, quando o perácido é hidrofílico, menos que 6 átomos de carbono ou mesmo menos que 4 átomos de carbono; e M é um contraí-on, por exemplo, sódio, potássio ou hidrogênio; (3) fontes de peróxido de hidrogênio, por exemplo, sais de peri-drato inorgânicos, inclusive sais de metais alcalinos como sais sódicos de perborato (geralmente mono ou tetra-hidrato), sais de percarbonato, persul-fato, perfosfato e persilicato, e combinações dos mesmos. Em um aspecto da invenção, os sais de peridrato inorgânicos são selecionados a partir do grupo consistindo em sais sódicos de perborato, de percarbonato, e combinações dos mesmos. Quando usados, os sais de peridrato inorgânico estão tipicamente presentes em quantidades de 0,05 a 40%, em peso, ou de 1 a 30%, em peso, do total do produto destinado ao consumidor, e são tipicamente incorporados a esses produtos destinados ao consumidor sob a forma de um sólido cristalino que pode ser aplicado como revestimento. Os revestimentos adequados incluem sais inorgânicos como metal alcalino silicato, carbonato ou sais de borato ou misturas dos mesmos, ou materiais orgânicos como água-solúvel ou polímeros dispersíveis, ceras, óleos ou sabões graxos; e (4) ativadores de alvejamento que tem R-(C=O)-L em que R é um grupo alquila, opcionalmente ramificado, que tem, quando o ativador de alvejamento é hidrofóbico, de 6 a 14 átomos de carbono, ou de 8 a 12 átomos de carbono e, quando o ativador de alvejamento é hidrofílico, menos que 6 átomos de carbono ou mesmo menos que 4 átomos de carbono; e L é grupo de saída. Exemplos de grupos de saída adequados são ácido benzoi-co e derivados do mesmo, especialmente benzeno sulfonato. Os ativadores de alvejamento adequados incluem dodecanoil oxibenzeno sulfonato, deca-noil oxibenzeno sulfonato, ácido decanoil oxibenzoico ou seus sais, 3,5,5-trimetil hexanoil oxibenzeno sulfonato, tetra acetil etileno diamina (TAED) e nonanoil oxibenzeno sulfonato (NOBS). Os ativadores de alvejamento adequados são, também, apresentados no US 6.380.144. Embora qualquer ativador de alvejamento adequado possa ser utilizado, em um aspecto da invenção, o produto destinado ao consumidor em questão pode compreender NOBS, TAED ou misturas dos mesmos.
Quando presente, o perácido e/ou ativador de alvejamento está geralmente presente no produto destinado ao consumidor em uma quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 60%, em peso, de cerca de 0,5 a cerca cfe 40%, em peso, ou mesmo, de cerca de 0,6 a cerca de 10%, em peso, com base no produto destinado ao consumidor. Um ou mais perácidos hidrofóbi-cos ou precursores dos mesmos podem ser usados em combinação com um ou mais perácidos hidrofílicos ou precursores dos mesmos.
As quantidades da fonte de peróxido de hidrogênio e de perá-cido ou ativador de alvejamento podem ser selecionadas de modo que a razão molar entre o oxigênio disponível (da fonte de peróxido) e o perácido seja de 1:1 a 35:1 ou mesmo 2:1 a 10:1.
Tensoativos - Os produtos destinados ao consumidor de acordo com a presente invenção podem compreender um tensoativo ou sistema tensoativo no qual o tensoativo pode ser selecionado a partir de tensoativos não iônicos, tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfolí-ticos, tensoativos zwiteriônicos, tensoativos não iônicos semipolares e misturas dos mesmos. Quando presente, o tensoativo está, tipicamente, presente em um teor de cerca de 0,1% a cerca de 60%, de cerca de 1% a cerca de 50%, ou mesmo de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso, do produto destinado ao consumidor em questão.
Os tensoativos detergentes aniônicos adequados incluem tensoativos detergentes de sulfato e sulfonato.
Os tensoativos detergentes de sulfonato adequados incluem alquil benzeno sulfonato, em um aspecto, alquil benzeno sulfonato C10-13. O alquil benzeno sulfonato (LAS) adequado pode ser obtido, por sulfonação de alquil benzeno linear (LAB) disponível para comercialização; O LAB adequado inclui 2-fenil LAB inferior, como aqueles fornecidos pela Sasol sob a designação comercial Isochem® ou aqueles fornecidos pela Petresa sob a designação comercial Petrelab®, outros LABs adequados incluem 2-fenil LAB superior, como aqueles fornecidos pela Sasol sob a designação comercial Hyblene®. Um tensoativo detergente aniônico adequado é o alquil benzeno sulfonato que é obtido pelo processo de catálise DETAL, embora outras rotas de síntese, como folículo capilar, possam também ser adequadas.
Os tensoativos detergentes de sulfato adequados incluem sulfato de alquila, em um aspecto, sulfato de alquila C8-18 ou, predominantemente, sulfato de alquila C12.
Outro tensoativo detergente de sulfato adequado é sulfato al-coxilado de alquila, em um aspecto, sulfato etoxilado de alquila, em um aspecto, um sulfato alcoxilado de C8-18 alquila, em outro aspecto, um sulfato etoxilado de C8-18 alquila, tipicamente, o sulfato alcoxilado de alquila tem um grau médio de alcoxilação de 0,5 a 20, ou de 0,5 a 10, tipicamente, o sulfato alcoxilado de alquila é um sulfato etoxilado de C8.18 alquila que tem um grau médio de etoxilação de 0,5 a 10, de 0,5 a 7, de 0,5 a 5 ou mesmo de 0,5 a 3. O sulfato de alquila, sulfato alcoxilado de alquila e sulfonatos benzeno de alquila podem ser lineares ou ramificados, substituídos ou não substituídos. O tensoativo detergente pode ser um tensoativo detergente de cadeia média ramificada, em um aspecto, um tensoativo detergente aniônico de cadeia média ramificada, em um aspecto, um sulfato de alquila de cadeia média ramificada e/ou um alquil benzeno sulfonato de cadeia média ramificada, por exemplo, um sulfato de alquila de cadeia média ramificada. Em um aspecto, a ramificações de cadeia média são grupos C-m grupos, tipicamente, grupos metila e/ou etila.
Tensoativos detergentes não iônicos adequados são selecionados a partir do grupo consistindo em: etoxilatos de alquila C8-Ci8, como tensoativos não iônicos NEODOL® disponíveis junto à Shell, alcoxilatos de alquil fenol C6-Ci2 sendo as unidades alcoxilato podem ser unidades etileno-óxi, unidades propileno-óxi ou uma mistura disso; álcool Ci2-C18 e condensados de alquil fenol C6-Ci2 com polímeros de bloco de óxido de etile-no/óxido como Pluronic® da BASF; Ci4-C22 álcoois de cadeia média ramificada, alcoxilatos de Cu-C22 alquila com cadeia média ramificada, tipicamente com um grau médio de alcoxilação de 1 a 30, polissacarídeos de alquila, em um aspecto, poliglicosídeos de alquila; poliidróxi amidas de ácido graxo, tensoativos de álcool poli(oxialquilado) terminados com éter, e misturas dos mesmos.
Os tensoativos detergentes não iônicos adequados incluem po-liglicosídeo de alquila e/ou um álcool alcoxilado de alquila.
Em um aspecto, tensoativos detergentes não iônicos incluem álcoois alcoxilados de alquila, em um aspecto, álcool alcoxilado de C8.18 alquila, por exemplo, um álcool etoxilado de C8.18 alquila, o álcool alcoxilado de alquila pode ter um grau médio de alcoxilação de 1 a 50, de 1 a 30, de 1 a 20, ou de 1 a 10. Em um aspecto, o álcool alcoxilado de alquila pode ser um álcool etoxilado de C8-ie alquila que tem um grau médio de etoxilação de 1 a 10, de 1 a 7, mais de 1 a 5 ou de 3 a 7. O álcool alcoxilado de alquila pode ser linear ou ramificado, e substituído ou não substituído.
Tensoativos detergentes catiônicos adequados incluem compostos de alquil piridínio, compostos de amônio alquil quaternário, compostos de fosfônio alquil quaternário, compostos de alquil sulfônio ternário e misturas dos mesmos.
Os tensoativos detergentes catiônicos adequados são compostos de amônio quaternário com a seguinte fórmula geral: (RXR^RaXRsJN* X- em que, R é uma porção de alquila ou alquenila C6-18 linear ou ramificada, substituída ou não substituída, Ri e R2 são independentemente selecionados a partir de porções metila ou etila, R3 é uma porção hidroxila, hidróxi metila ou hidróxi etila, X é um ânion que proporciona neutralidade de carga; ânions preferenciais incluem: haletos, por exemplo, cloreto; sulfato; e sulfonato. Os tensoativos detergentes catiônicos adequados são os cloretos de monoalquila C6-18 mono-hidróxi etil dimetil amônio quaternário. Os tensoativos detergentes catiônicos altamente adequados são cloreto de monoalquila Ce-io mono-hidróxi etil dimetil amônio quaternário, cloreto de monoalquila C10-12 mono-hidróxi etil dimetil amônio quaternário e cloreto de monoalquila C10 mono-hidróxi etil dimetil amônio quaternário.
Coadjuvantes - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção podem compreender um ou mais coadjuvantes ou sistemas de coadjuvante detergente. Quando é usado um coadjuvante, o produto destinado ao consumidor em questão tipicamente compreenderá pelo menos cerca de 1%, de cerca de 2% a cerca de 60% ou mesmo de cerca de 5% a cerca de 10%, em peso de coadjuvante do produto destinado ao consumidor em questão. A composição pode ser, ainda, substancialmente livre de coadjuvante; substancialmente livre significa zeólito e/ou fosfato "adicionado de maneira não deliberada". Coadjuvantes à base de zeólito típicos incluem zeólito A, zeólito P e zeólito MAP. Um encorpador à base de fosfato típico é o tripolifosfato de sódio.
Agentes Quelantes - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção podem conter um agente quelante. Os agentes quelantes adequados incluem agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês, e combinações dos mesmos. Quando é usado um agente quelante, o produto destinado ao consumidor em questão pode compreender de cerca de 0,005% a cerca de 15% ou mesmo de cerca de 3,0% a cerca de 10%, em peso de agente quelante do produto destinado ao consumidor em questão. Os quelantes adequados incluem DTPA (ácido dietileno triamina pentacéti-co), HEDP (ácido hidroxietano difosfônico), DTPMP (dietileno triamina pen-ta(ácido metileno fosfônico)), hidrato de sal dissódico de ácido 1,2-diidróxi benzeno-3,5-dissulfônico, etileno diamina, dietileno triamina, ácido etilenodi-amina dissuccínico (EDDS), ácido n-hidróxi etil etileno diamina tri-acético (HEDTA), ácido trietileno tetramina hexacético (TTHA), ácido N-hidróxi etil iminodiacético (HEIDA), diidróxi etilglicina (DHEG), ácido etileno diamina tetra propiônico (EDTP) e derivados dos mesmos.
Agentes Inibidores de Transferência de Corante - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção, também, podem incluir um ou mais agentes inibidores de transferência de corante. Agentes poliméricos inibidores de transferência de corantes adequados incluem, mas não se limitam a, polímeros de polivinil pirrolidona, polímeros de poliamina N-óxido, copolímeros de N-vinil pirrolidona e N-vinil imidazole, polivinil oxazolidonas e polivinil imidazoles, ou misturas desses itens. Quando presente em um produto destinado ao consumidor em questão, os agentes inibidores de transferência de corante podem estar presentes em níveis de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5% ou mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 3%, em peso, do produto destinado ao consumidor.
Branqueadores - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção, também, podem conter componentes adicionais que podem tonalizar sendo limpos, como branqueadores fluorescentes. A composição pode compreender branqueador fluorescente C.l. 260, de preferência, em forma alfa-cristalina que tem a estrutura a se- guir: Em um aspecto, o branqueador é um branqueador solúvel, como o branqueador fluorescente C.l. 260 sob a forma alfa-cristalina.
Em um aspecto, o branqueador está predominantemente sob a forma alfa-cristalina, o que significa que tipicamente pelo menos 50%, em peso, pelo menos 75%, em peso, pelo menos 90%, em peso, pelo menos 99%, em peso, ou mesmo substancialmente tudo, do branqueador fluorescente C.l. 260 está sob a forma alfa-cristalina. O branqueador está, de preferência, sob a forma de particulado micronizado, que tem um tamanho médio ponderado da partícula principal de 3 a 30 micrômetros, de 3 micrômetros a 20 micrômetros, ou de 3 a 10 micrômetros. A composição pode compreender branqueador fluorescente C.l. 260 sob forma beta-cristalina, e a razão entre o peso de: (i) branqueador fluorescente C.l. 260 sob a forma alfa-cristalina, e (ii) branqueador fluorescente C.l. 260 sob forma beta-cristalina pode ser pelo menos 0,1, ou pelo menos 0,6. BE680847 refere-se a um processo para produção de clareador fluorescente C.l. 260 sob forma alfa-cristalina.
Os teores adequados de clareador fluorescente incluem desde teores mais baixos, de cerca de 0,01, de cerca de 0,05, de cerca de 0,1 ou mesmo de cerca de 0,2%, em peso, até teores mais altos de 0,5 ou mesmo 0,75%, em peso.
Polímero de carboxilato - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção, também, podem incluir um ou mais polímeros de carboxilato como um copolímero aleatório de maleato/acrilato ou homopolí-mero de poliacrilato. Em um aspecto, o polímero de carboxilato é um homo-polímero de poliacrilato que tem um peso molecular de 4.000 Da a 9.000 Da, ou de 6.000 Da a 9.000 Da.
Polímero para liberação de sujeiras - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção, também, podem incluir um ou mais polímeros de liberação de sujeira que têm uma estrutura conforme definido por uma das estruturas a seguir (I), (II) ou (III): (I) -[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d (II) -[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e (III) -[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f em que: a, b e c são de 1 a 200; d, e e f são de 1 a 50;
Ar é um fenileno 1,4-substituído; sAr é fenileno 1,3-substituído na posição 5 por SO3Me, Me é Li, K, Mg/2, Ca/2, AI/3, amônio, mono, di, tri ou tetra-alquil amônio sendo os grupos alquila são alquila Ci-Ci8 ou hidroxialquila C2-C10 ou misturas dos mesmos, R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são independentemente selecionados dentre H ou Ci-C18 n ou iso-alquila; e R7 é uma alquila linear ou ramificada C^Cis ou uma alquenila linear ou ramificada C2-C30, ou um grupo cicloalquila com 5 a 9 átomos de carbono, ou um grupo arila C8-C30, ou um grupo arilalquila C6-C30.
Os polímeros de liberação de sujeira adequados são polímeros de liberação de sujeira à base de poliéster como polímeros Repel-o-tex, incluindo Repel-o-tex SF, SF-2 e SRP6 fornecidos por Rhodia. Outros polímeros de liberação de sujeira adequados incluem polímeros Texcare, incluindo Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 e SRN325 fornecidos por Clariant. Outros polímeros de liberação de sujeira adequados são polímeros Marloquest, como Marloquest SL fornecido por Sasol.
Polímero celulósico - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção também podem incluir um ou mais polímeros celulósicos inclusive aqueles selecionados a partir de alquil celulose, alquil alcoxialquil celulose, carboxialquil celulose, alquil carboxialquil celulose. Em um aspecto, os polímeros celulósicos são selecionados do grupo que compreende carbó-xi metil celulose, metil celulose, metil hidróxi etil celulose, metil carbóxi metil celulose, e misturas disso. Em um aspecto, a carbóxi metil celulose tem um grau de substituição de carbóxi metil de 0,5 a 0,9 e um peso molecular de 100.000 Da a 300.000 Da.
Catalisadores Alvejantes - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção, também, podem incluir um ou mais catalisadores alvejantes, como catalisadores de metal de transição ou ligantes que têm a capacidade de formar um catalisador à base de metal de transição por e-xemplo, conforme descrito no documento EP1109965, ou EP1240378 ou 9, ou catalisadores alvejantes que têm a capacidade de aceitar um átomo de oxigênio de um peroxiácido e/ou sal do mesmo, e transferir o átomo de oxigênio para um substrato passível de oxidação. Os catalisadores de alvejante adequados incluem, mas não se limitam a: cátions e poliíons de imínio; zwi-teríons de imínio; aminas modificadas; óxidos de amina modificados; N-sulfonil iminas; N-fosfonil iminas; N-acil iminas; dióxidos de tiadiazol; perfluo-roiminas; cetonas de açúcar cíclico e misturas dos mesmos, conforme descrito em US PA 2007/0173430 A1.
Em outro aspecto, a composição detergente para lavagem de roupas compreende um ingrediente alvejante, em que o ingrediente alvejante tem um coeficiente de partição octanol/água (logPo/w) não superior a 0, não superior a -0,5, não superior a -1,0, não superior a -1,5, não superior a -2,0, não superior a -2,5, não superior a -3,0, ou mesmo não superior a -3,5. O método para determinar coeficiente de partição octanol/água (logPo/w) é descrito em mais detalhes abaixo.
Tipicamente, o ingrediente alvejante tem a capacidade de gerar uma espécie de alvejamento que tem um XSo de 0,01 a cerca de 0,30, de 0,05 a cerca de 0,25, ou mesmo de cerca de 0,10 a 0,20. O método para determinar XSo θ descrito em maiores detalhes abaixo. Por exemplo, ingre dientes de alvejamento que têm uma estrutura de isoquilínio têm a capacidade de gerar uma espécie de alvejamento que tem uma estrutura de oxazi-ridínio. Nesse exemplo, o Xso θ aquele da espécie de alvejamento de oxazi-ridínio.
Sem ater-se à teoria, os inventores acreditam que controlar a capacidade eletrofílica e hidrofóbica dessa maneira descrita acima permite que o ingrediente alvejante seja entregue substancialmente apenas para áreas do tecido que são mais hidrofóbicas, e que contêm sujeiras ricas em elétrons, incluindo cromóforos visíveis, que são suscetíveis a alvejamento através de oxidantes altamente eletrofílicos.
Em um aspecto, o catalisador alvejante tem uma estrutura que corresponde à fórmula geral abaixo: sendo R13 é selecionado do grupo que consiste em 2-etilhexila, 2-propil-heptila, 2-butiloctila, 2-pentilnotila, 2-hexildecila, n-dodecila, n-tetradecila, n-hexadecila, n-octadecila, iso-nonila, iso-decila, iso-tridecila e iso-pentadecila; Método para determinar coeficiente de partição octanol/áqua (loqPo/w) O coeficiente de partição octanol/água (Log P0/w) é determinado de acordo com o método encontrado em Brooke, D. N., Dobbs, A. J., Williams, N, Ecotoxicology e Environmental Safety (1986) 11(3): 251 a 260. Método para determinar Xso O parâmetro Xso é determinado de acordo com o método descrito em Adam, W., Haas, W., Lohray, B. B. Journal of the American Chemi-cal Society (1991) 113(16) 6202-6208.
Sais de silicato - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção, também, podem conter sais de silicato, como silicato de sódio ou potássio. A composição pode compreender de 0%, em peso, a menos de 10%, em peso, de sal de silicato, a 9%, em peso, ou a 8%, em peso, ou a 7%, em peso, ou a 6%, em peso, ou a 5%, em peso, ou a 4%, em peso, ou a 3%, em peso, ou mesmo a 2%, em peso, e de preferência, acima de 0%, em peso, ou de 0,5%, em peso, ou mesmo de 1%, em peso de sal de silicato. Um sal de silicato adequado é o silicato de sódio.
Dispersantes - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção, também, podem conter dispersantes. Os materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem os ácidos homo ou copoliméricos, ou seus sais, em que o ácido policarboxílico contenha ao menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais de dois átomos de carbono.
Estabilizantes de enzimas - enzimas para uso em detergentes podem ser estabilizadas por meio de diversas técnicas. As enzimas empregadas na presente invenção podem ser estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de cálcio e/ou magnésio nos produtos destinados ao consumidor finalizados que fornecem tais íons para as enzimas. No caso de produtos destinados ao consumidor aquosos que compreendem protease, um inibidor reversível de protease, como um composto de boro, ou compostos como formato de cálcio, formiato de sódio e 1,2-propano diol podem ser adicionados para melhorar adicionalmente a estabilidade.
Complexos de metal catalítico - As composições dos requerentes podem incluir complexos de metal catalítico. Um tipo de catalisador de alvejante contendo metal é um sistema catalisador que contém um cátion de metal de transição com atividade catalítica definida para alvejante, como cá-tions de cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdênio ou manganês, um cátion de metal auxiliar com pouca ou nenhuma atividade catalítica para alvejante, como cátions de zinco ou alumínio, e um sequestrado que tem constantes de estabilidade definidas para os cátions de metal catalíticos e auxiliares, particularmente ácido etilenodiamino tetra-acético, etileno diamino tetra(ácido metileno fosfônico), e sais solúveis em água dessas substâncias. Esses catalisadores são apresentados em U.S. 4.430.243.
Caso se deseje, as composições da presente invenção podem ser catalisadas por meio de um composto de manganês. Esses compostos e teores de uso são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, os catalisadores baseados em manganês apresentados em U.S. 5.576.282.
Os catalisadores alvejantes à base de cobalto úteis à presente invenção são conhecidos, e são descritos, por exemplo, na patente U.S. 5.597.936; U.S. 5.595.967. Esses catalisadores baseados em cobalto são prontamente preparados por meio de procedimentos conhecidos, como ensinado, por exemplo, em U.S. N° 5.597.936 e U.S. N° 5.595.967.
As composições da presente invenção podem, também, incluir de modo estável um complexo de metal de transição de ligantes como bispi-donas (U.S. 7.501.389) e/ou ligantes rígidos macropolicíclicos - abreviados como "MRLs". Como uma matéria prática, e não a título de limitação, as composições e processos da presente invenção podem ser ajustados a fim de fornecer na ordem de pelo menos uma parte por cem milhões da espécie de LMR ativa no meio de lavagem aquoso, e fornecerá tipicamente de cerca de 0,005 ppm a cerca de 25 ppm, de cerca de 0,05 ppm a cerca de 10 ppm, ou mesmo de cerca de 0,1 ppm a cerca de 5 ppm, do MRL no líquido de lavagem.
Os metais de transição adequados no presente catalisador branqueador à base de metal de transição incluem, por exemplo, manganês, ferro e cromo. Os LMRs adequados incluem 5,12-dietil-1,5,8,12-tetra-azabiciclo[6.6.2]hexadecano. O MRLs de metal de transição adequados são prontamente preparados através de procedimentos conhecidos, como ensinado, por e-xemplo, na patente U.S. 6.225.464.
Solventes - Os solventes adequados incluem água e outros solventes, como fluidos lipofílicos. Exemplos de fluidos lipofílicos adequados incluem siloxanos, outros silicones, hidrocarbonetos, éteres de glicol, derivados de glicerina como éteres de glicerina, aminas perfluoradas, solventes perfluorados e à base de éter hidrofluorado, solventes orgânicos não fluora-dos de baixa volatilidade, solventes à base de diol, outros solventes ambientalmente amigáveis e misturas desses itens.
Processo para fabricar produtos destinados ao consumidor Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção podem ser formulados sob qualquer forma adequada e preparados por qualquer processo escolhido pelo formulador, alguns exemplos não limitadores dos mesmos estão descritos nos exemplos da Requerente e na patente U.S. 4.990.280; U.S. 20030087791A1; U.S. 20030087790A1; U.S. 20050003983A1; U.S. 20040048764A1; U.S. 4.762.636; U.S. 6.291.412; U.S. 20050227891A1; EP 1070115A2; U.S. 5.879.584; U.S. 5.691.297; U.S. 5.574.005; U.S. 5.569.645; U.S. 5.565.422; U.S. 5.516.448; U.S. 5.489.392; U.S. 5.486.303 todos as quais estão aqui incorporadas a título de referência. Método de uso A presente invenção inclui um método para limpeza e/ou tratamento de um situs entre outros uma superfície de tecido. Tal método inclui as etapas de colocar em contato uma modalidade do produto destinado ao consumidor de limpeza da Requerente, sob a forma pura ou diluído em um líquido de lavagem, com pelo menos uma porção de um local, então, opcionalmente enxaguar tal superfície de tecido. Pode-se submeter o local a uma etapa de lavagem antes da etapa de enxágue mencionada acima. Para as finalidades da presente invenção, a lavagem inclui, porém não se limita a, esfregamento e agitação mecânica. Consequentemente, a presente invenção inclui um método de lavagem de um tecido. O método compreende as etapas de colocar em contato um tecido a ser lavado com uma dita solução para lavagem de roupa de limpeza que compreende pelo menos uma modalidade do produto destinado ao consumidor da Requerente. O tecido pode conter qualquer tecido que possa ser lavado em condições de uso normais pelo consumidor. A solução tipicamente tem um pH de cerca de 7 a cerca de 11. Os produtos destinados ao consumidor podem ser usados em concentrações de cerca de 500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução. As temperaturas da água situam-se, tipicamente, na faixa de cerca de 5°C a cerca de 90°C. A razão entre a água e o tecido é, tipicamente, de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.
Em um aspecto, um situs tratado com qualquer um dos produtos destinados ao consumidor apresentados no presente documento é apresentado. Métodos de teste Método de teste 1 É fornecido aqui um protocolo para definir se um material corante ou pigmento é um agente de matiz para tecidos, para o propósito da invenção: 1.) Carregar dois recipientes de tergotômetro com 800 ml de Água da Cidade de Newcastle upon Tyne, Reino Unido (dureza total de ~204,6 (~12 grãos por galão norte-americano), fornecida por Northumbrian Water, Pity Me, Durham, Co. Durham, Reino Unido). 2) Inserir os potes no tergotômetro, com a temperatura da água controlada a 30°C e agitação ajustada para 40 rpm por toda a duração do experimento. 3) Adicionar 4,8 g de detergente IEC-B (IEC 60456 detergente base de referência para máquina de lavar tipo B), fornecido pela wfk, Brüg-gen-Bracht, Alemanha, a cada pote. 4) Após dois minutos, adicionar 2,0 mg de corante ativo ao primeiro pote. 5) Após um minuto, adicionar 50 g de tecido de algodão plano (fornecido pela Warwick Equest, Consett, County Durham, Reino Unido), cortado em amostras de 5 cm x 5 cm, a cada pote. 6) Após 10 minutos, drenar os recipientes e recarregar com (16°C) que tem um teor de dureza de água de English Clark Degrees Hard-ness de 14.4 com uma razão molar entre Cálcio e Magnésio de 3:1. 7) Após 2 minutos de enxágue, remover os tecidos. 8) Repetir as etapas de 3 a 7 por três ciclos adicionais, com o uso dos mesmos tratamentos. 9) Coletar os tecidos e secá-los em varal em ambiente interno, durante 12 horas. 10) Analisar as amostras com o uso de um espectrômetro Hun-ter Miniscan adaptado com D65 lluminante e filtro de corte UVA para obter valores Hunter a (eixo vermelho-verde) e Hunter b (eixo amarelo-azul). 11) Fazer a média dos valores Hunter a e Hunter b para cada conjunto de tecidos. Se os tecidos tratados com o colorante sob avaliação apresentarem uma diferença média de matiz superior a 0,2 unidades no eixo a ou no eixo b, o dito colorante é considerado um agente de matiz para tecidos, para o propósito da invenção. Métodos de Teste 2 a 6 Quaisquer desvios dos protocolos fornecidos são indicados nos Exemplos pertinentes.
Os ensaios foram realizados com o uso de um Robô Biomek FX (Beckman Coulter) ou um pipetador de múltiplos canais (por exemplo, Rainin PipetLite, Mettler-Toledo) e um Leitor SpectraMAX PMT (tipo 340; Molecular Devices).
Teste TCA para determinação do teor de proteína em placas de microtitula-ção com 96 cavidades Culturas de B. subtilis foram cultivadas 2 a 3 dias a 37°C, agitadas a 250 a 300 rpm com aeração umidificada. As células foram removidas da supernatante de cultura contendo enzima, através de centrifugação e/ou filtração. A concentração protease foi determinada com o uso de um ensaio de precipitação de TCA. Uma alíquota (20-25 ul) de supernatante de cultura foi transferida para uma placa de microtitulação de fundo plano com 96 cavidades (PMT; placa de poliestireno límpida de ligação de meio Costar 9017) contendo 100 μΙ/cavidade de 0,25 N de HCI. A leitura da "linha de base" foi determinada por dispersão de luz/leitura de absorbância a 405 nm após uma mistura de 5 segundos. 100 μΙ/cavidade de 30% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA) foi adicionada à placa contendo HCI e incubado por 10 minutos à temperatura ambiente para facilitar precipitação de proteína. A dispersão de luz/absorbância a 405 nm dessa placa "teste" foi determinada após uma mistura de 5 segundos. O aumento da turvação/dispersão de luz nas amostras se correlaciona à quantidade total de proteína precipitável no supernatante de cultura. Os cálculos foram realizados através da subtração da leitura de "linha de base" (obtida após a adição de HCI) da leitura "teste" (obtida após a adição de TCA) a fim de fornecer uma medida relativa de proteína total presente. Se for desejado, uma curva padrão pode ser criada através da ca- libração das leituras de TCA com ensaios de AAPF protease (consulte abaixo) de clones com atividade específica conhecida. Entretanto, os resultados de TCA são lineares em relação à concentração de proteína de 50 a 500 partes por milhão (ppm) de proteína (onde 1 ppm corresponde a 1 mg/L) e podem, portanto, ser representados graficamente diretamente contra o desempenho da enzima com o propósito de escolher variantes com desempenho desejado.
Teste de protease AAPF em placas de microtitulação com 96 cavidades Para determinar a atividade de protease das variantes de protease de serina, mediu-se a hidrólise de N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA). As soluções reagentes usadas foram: 100 mM de Tris/HCI, pH 8,6, contendo 0,005% de TWEEN®-80 (tampão de diluição de Tris); 100 mM de tampão de Tris, pH 8,6, contendo 1 mM de Ca-CI2 e 0,005% de TWEEN®-80 (tampão de Tris/Ca); e 160 mM de suc-AAPF-pNA em DMSO (solução de estoque de suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388). Para preparar uma solução de trabalho de suc-AAPF-pNA, 1 ml de solução de estoque de suc-AAPF-pNA foi adicionado a 100 ml de tampão Tris/Ca e bem misturado durante pelo menos 10 segundos. O teste foi realizado mediante a adição de 10 ml de solução de protease diluída a cada cavidade de uma PMT de 96 cavidades, imediatamente seguida pela adição de 190 μΙ da solução de trabalho de suc-AAPF-pNA a 1 mg/ml. As soluções foram misturadas durante 5 segindos e a alteração de absorbância no modo cinético (25 leituras em 5 minutos) foi lida a 405 nm em uma leitora de PMT, a 25°C. A atividade de protease foi expressa como AU (atividade = AOD*min-1 ml-1). Teste de inibição com Eglina C
Conforme descrito no presente documento, a concentração de protease de serina e a atividade específica foram determinadas por titulação com um inibidor denominado eglin c. Eglin c do parasita Hirudo medicinalis é um inibidor de proteína de ligação justa de subtilisinas e ASP protease (He-inz et al., Biochemistry, 31: 8755-66 [1992]), e pode, portanto, ser usado para medir concentração de enzima protease, que, por sua vez, permite que a atividade específica seja calculada. O gene para eglina c foi sintetizado e expresso em E. coli por métodos-padrão. Suas propriedades e sua potência inibitória eram iguais às da eglina c adquirida junto à Sigma. (i) Determinação da concentração de uma solução de estoque de eqlina c Uma amostra de subtilisina de Bacillus lentus com atividade específica conhecida foi diluída em 100 mM de tampão Tris, pH 8,6, contendo 1 CaCI2 mM de e 0,005% de TWEEN®-80 (tampão Tris/Ca), até uma concentração adequada para o teste AAPF de protease descrito acima. Várias diluições da solução de estoque de eglina c também foram feitas no tampão Tris/Ca. Uma alíquota de cada solução diluída de eglina c foi misturada com um volume igual de solução diluída de subtilisina de Bacillus lentus. Uma alíquota do tampão de Tris/Ca apenas, sem eglin c, foi usada também misturada com um volume igual da solução de subtilisina de Bacillus lentus diluída, a fim de medir atividade de subtilisina não inibida na ausência de eglin c. As soluções misturadas foram incubadas à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos e a atividade de protease de cada amostra foi, então, medida por ensaio de AAPF descrito acima. Com o uso da atividade específica conhecida da subtilisina de Bacillus lentus, foi determinada a concentração da protease ativa em cada amostra. A concentração de eglina c em cada amostra foi, então, calculada com base na diminuição da atividade de protease observada, em comparação à amostra de subtilisina não inibida que foi misturada somente com tampão Tris/Ca (sem eglina c). Dessa forma, com o uso das diluições e volumes conhecidos das soluções de eglina c, determinou-se a concentração de eglina c na solução de estoque. (ii) Determinação da concentração e da atividade específica das variantes de subtilisina As amostras de variantes de subtilisina foram diluídas em 100 mM de Tris buffer, pH 8,6, contendo 1 mM de CaCI2 e 0,005% de TWE-EN®-80 (tampão Tris/Ca). Várias diluições da solução de estoque de eglina c de concentração conhecida, também, foram feitas no tampão Tris/Ca. Uma alíquota de cada solução diluída de eglina c foi misturada com um volume igual de uma solução de variante de subtilisina. As soluções misturadas foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos, e a ativida de de protease de cada amostra foi, então, medida pelo teste AAPF. Usan-do-se a diminuição observada na atividade de protease mediante a adição de cada amostra de eglina c, e a concentração conhecida da eglina c, calcu-lou-se a concentração de eglina c necessária para a completa inibição de cada variante de enzima subtilisina. Essa concentração é equivalente à concentração de enzimas na amostra. Uma alíquota somente do tampão Tris/Ca, sem eglina c, foi também misturada com cada amostra de variante de subtilisina, e a atividade de protease na ausência de eglina c foi medida pelo teste AAPF. A atividade específica das variantes de subtilisina foi, então, calculada com o uso das concentrações de enzimas conforme determinado acima.
Ensaio de microamostra de BMI (ensaio de BMI) Microamostras manchadas (BMI) de sangue, leite e tinta perfuradas e pré-enxaguadas (EMPA116) com diâmetro circular de 5,5 milímetros em placas de microtitulação com 96 cavidades (PMT; Corning 3641) foram obtidas a partir do Centerfor Testmaterials BV (Vlaardingen, Holanda).
Os detergentes foram preparados através da mistura por pelo menos 30 minutos em 2 mM de carbonato de sódio, tamponados para pH 10,3 com o teor adequado de dureza de água (3:1 Ca:Mg. - CaCI2: Mg-CI2«6H2O) em água Milli-Q conforme descrito na Tabela 1-1 e Tabela 6-4. Os detergentes foram divididos em alíquotas em tubos cônicos de 50 ml (Fal-con), centrifugados para remover o precipitado, e resfriados em gelo por 30 minutos antes do uso.
As concentrações de enzimas foram equalizadas a uma concentração fixa desejada que se situa na faixa de 20 a 50 ppm em relação a um padrão de GG36 purificada (enzima de SEQ ID n°1). A atividade específica de GG36 com o uso de AAPF como um substrato foi usada para converter valores de TCA subtraídos da linha de base em concentração de enzima em ppm. Já que a concentração de enzima foi determinada em ppm, uma simples fórmula foi usada para calcular o volume de cada variante necessária para adicionar a um volume fixo de buffer/armazenar em buffer (300 a 600 pl) a fim de alcançar a concentração de enzima de estoque desejada: x=(ppm alvo)(vb)/(ppm y-alvo) onde x=volume da enzima, y= concentração de enzima, vb= volume de tampão Um robô Perkin-Elmer Janus com um braço de canal Versispan 8 foi usado para dispensar volumes variáveis de enzima da placa de fonte (placa de cavidade de meia profundidade Axygen com variantes colhidas agrupadas usadas no ensaio de concentração de enzima de TCA) na placa de destino carregada de tampão com o uso de pontas condutoras. As amostras foram misturadas três vezes através de pipetagem para cima e para baixo. A exatidão das diluições de enzima foi validada mediante a medição da atividade de AAPF da placa equalizado e da comparação disso àquela da placa de fonte, a fim de verificar que as diluições corretas foram feitas.
Após equalização, 5 a 15 μΙ_ de solução de enzima foram adicionados a uma placa de microamostra carregada com detergente para alcançar um volume final de ~200 μΙ_. Em alguns casos, as amostras de enzima não foram equalizadas, e, ao invés disso, foram todas diluídas igualmente da placa de estoque para proporcionar uma faixa de trabalho de 0,1 a 5 ppm. As concentrações alvo ideais para cada ensaio foram determinadas de uma curva de resposta à dosagem que mede a atividade de limpeza ao longo dessa faixa a um dado detergente. A PMT foi vedada com folha metálica (Bio-Rad) e incubada em incubadora/agitadora iEMS (Thermo/Labsystems) pré-ajustada em 16°C em um ambiente frio ajustado em 4°C ou em 32°C no topo da bancada por 30 minutos a 1400 rpm. Após a incubação, 120 μΙ de supernatante foi transferido para uma PMT fresca (Corning 9017) e lido a 600 nm com o uso do leitor SpectraMax. As leituras de absorbância verdadeira foram obtidas através da subtração de um controle em branco (sem enzima) de cada valor.
Um índice de desempenho (PI) foi calculado para cada variante. O índice de desempenho é a razão entre a absorbância do supernatante produzido por limpeza de enzima variante e a absorbância produzida por limpeza GG36 a uma concentração de enzima fixa. Para as placas equalizadas, valores de PI foram calculados através da divisão da absorbância de uma variante pela aquela do controle em uma dada placa. Para placas não equalizadas, uma curva padrão (por exemplo, Langmuir ou encaixe de modelo de regressão não linear logístico de quatro parâmetros) é gerada da atividade e concentração de enzima dos controles. Com o uso dessa curva padrão, o desempenho das variantes pode ser diretamente comparado ao controle em qualquer concentração de enzima. O PI é determinado através da divisão da absorbância das variantes pela absorbância calculada para o controle na mesma concentração de enzima.
Um índice de desempenho (PI) que é superior a 1 (Pl>1) indica limpeza superior através de uma variante quando comparado ao padrão (por exemplo, GG36), enquanto um PI de 1 (Pl=1) identifica uma variante que realiza o mesmo que o padrão, e um PI que é menor que 1 (Pl<1) identificas uma variante que realiza o mesmo de forma menos satisfatória que o padrão. * (3:1 Ca:Mg) Concentração conforme detalhada no texto. MÉTODO DE TESTE 2 - Para Método de Teste 2, o ensaio de microamostra de BMI é operado com o uso do detergente do Exemplo 29. O detergente é dissolvido em água que tem uma dureza de 204,6 mg/l (12 gpg) e ajustado a uma temperatura de 16°C. O desempenho das enzimas variantes é, então, determinado de acordo com o teste de microamostra com BMI aqui descrito. O índice de desempenho é determinado mediante a comparação entre o desempenho da variante e aquele da enzima da SEQ ID n°1, ( com, em todos os casos, a faixa de dosagem de enzima sendo 0,1 a 5 ppm. As enzimas que têm um índice de desempenho de 1,1 ou maior são vistas como proteases de água fria. MÉTODO DE TESTE 3 - Para Método de Teste 3, o ensaio de microamostra de BMI é operado com o uso do detergente do Exemplo 26. O detergente é dissolvido em água que tem uma dureza de 102,3 mg/l (6 gpg) e ajustado a uma temperatura de 16°C. O desempenho das enzimas variantes é, então, determinado de acordo com o teste de microamostra com BMI aqui descrito. O índice de desempenho é determinado mediante a comparação entre o desempenho da variante e aquele da enzima de SEQ ID n°1, com, em todos os casos, a faixa de dosagem de enzima sendo 0,1 a 5 ppm. As enzimas que têm um índice de desempenho de 1,1 ou maior são vistas como proteases de água fria. MÉTODO DE TESTE 4 - Para Método de Teste 4, o ensaio de microamostra de BMI é operado com o uso do detergente do Exemplo 26. O detergente é dissolvido em água que tem uma dureza de 102,3 mg/l (6 gpg) e ajustado a uma temperatura de 16°C. O desempenho das enzimas variantes é, então, determinado de acordo com o teste de microamostra com BMI aqui descrito. O índice de desempenho é determinado mediante comparação do desempenho da variante a aquele de uma enzima de referência, em que a dita enzima de referência é a enzima de SEQ ID n°1 consistindo na A158E mutação, em que em todos os casos a faixa de dosagem de enzima é 0,1 a 5 ppm. As enzimas que tem um índice de desempenho de 1,0 ou superior são vistas como proteases de água fria. MÉTODO DE TESTE 5 - A condutividade elétrica de uma solução aquosa é analisada de acordo com o método padrão ASTM D1125 e relatada em unidade de miliSiemens/cm, abreviada para mS/cm nessa patente. MÉTODO DE TESTE 6 - Para o Método de Teste 6, o ensaio de microamostra de BMI é operado com o uso de um dos detergentes dos Exemplos 36a a 36n. O detergente é dissolvido em água que tem uma dureza conforme especificado na Tabela 6-4 e ajustado a uma temperatura de 16°C. O desempenho das enzimas variantes é, então, determinado de acordo com o teste de microamostra com BMI aqui descrito. O índice de desempenho é determinado mediante a comparação entre o desempenho da variante e aquele da enzima de SEQ ID n°1, com, em todos os casos, a faixa de dosagem de enzima sendo 0,1 a 5 ppm. As enzimas que têm um índice de desempenho de 1,1 ou maior são vistas como proteases de água fria.
Exemplo Exemplos 1-8 Composições detergentes líquidas para lavagem de roupas a-dequadas para máquinas de lavar automáticas com carregamento frontal.
Exemplos 9-16 Composições detergentes líquidas para lavagem de roupas a-dequadas para máquinas de lavar automáticas com carregamento pelo topo.
Exemplos 17-22 Os seguintes são composições detergentes granulares produzidas de acordo com a invenção adequada para lavagem de tecidos. 1 Copolímero de enxerto aleatório é um copolímero de óxido de polietileno enxertado com acetato de polivinila que tem uma cadeia principal de óxido de polietileno e cadeias laterais de acetato de polivinila múltiplas. O peso molecular da cadeia principal de óxido de polietileno é cerca de 6000 e a razão entre o peso do óxido de polietileno e o peso do acetato de polivinila é cerca de 40 a 60 e não mais que 1 ponto de enxerto por 50 unidades de óxido de etileno. 2 Polietileno imina (peso molecular = 600) com 20 grupos etoxilatos por -NH. 3 O polímero alcoxilado anfifílico para limpeza de graxas é uma polietileno imina (PM = 600) com 24 grupos etoxilato por -NH e 16 grupos propoxila-to por -NH. 4 Inibidor reversível de protease com a estrutura: O corante tonalizante de tiofeno etoxilado é conforme descrito em US 7.208.459 B2. * Observação: todos os níveis de enzima expressos como % de matéria prima de enzima, exceto pela protease (dessa invenção) que é expressa como % de proteína ativa adicionada ao produto.
Exemplos 23 a 25 A seguir, são apresentadas composições detergentes líquidas para lavagem de roupas adequadas para máquinas de lavar com carregamento pelo topo (23 e 24) e máquinas de lavar com carregamento pela frente (25). 1 Copolímero de enxerto aleatório é um copolímero de óxido de polietileno enxertado com acetato de polivinila que tem uma cadeia principal de óxido de polietileno e cadeias laterais de acetato de polivinila múltiplas. O peso molecular da cadeia principal de óxido de polietileno é cerca de 6000 e a razão entre o peso do óxido de polietileno e o peso do acetato de polivinila é cerca de 40 a 60 e não mais que 1 ponto de enxerto por 50 unidades de óxido de etileno. 2 Polietileno imina (peso molecular = 600) com 20 grupos etoxilatos por -NH. 2 O polímero alcoxilado anfifílico para limpeza de graxas é uma polietileno imina (PM = 600) com 24 grupos etoxilato por -NH e 16 grupos propoxila-to por -NH.
Exemplos 26 a 30 A seguir, são apresentadas composições detergentes granula-res para lavagem de roupas adequadas para máquinas de lavar automáticas com carregamento pelo topo (26-28) e máquinas de lavar com carregamento pela frente (29-30). A protease dessa invenção é separadamente adicionada a essas formulações.
Notas para os exemplos 26 a 30: Os ingredientes de tensoativo podem ser obtidos a partir de BASF, Ludwigshafen, Alemanha (Lutensol®); Shell Chemicals, Londres, Reino Unido; Stepan, Northfield, lllinois, EUA; Huntsman, Huntsman, Salt Lake City, Utah, EUA; Clariant, Sulzbach, Alemanha (Praepagen®). O zeólito pode ser obtido junto à Industrial zeólito (UK) Ltd, Grays, Essex, Reino Unido. O ácido cítrico e o citrato de sódio podem ser obtidos junto à Jungbunzlauer de Basel, Suíça.
Percarbonato sódio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio e sesquicarbonato de sódio podem ser obtidos a partir de Solvay, Bruxelas, Bélgica.
Os copolímeros de acrilato/maleato podem ser obtidos a partir de BASF, Ludwigshafen, Alemanha.
Carbóxi metil celulose e carbóxi metil celulose hidrofobicamen-te modificada podem ser obtidas a partir de CPKelco, Arnhem, Holanda.
Branqueador fluorescente C.l. 260 pode ser obtido a partir de 3V Sigma, Bergamo, Itália como Optiblanc® Optiblanc® 2M/G, Optiblanc® 2MG/LT Extra, ou Optiblanc® Ecobright. O dissuccinato de S,S-etilenodiamina tetrassódico pode ser obtido junto à Innospec de Ellesmere Port, Reino Unido.
Copolímero de tereftalato pode ser obtido a partir de Clariant sob o nome comercial Repelotex SF 2. O ácido 1-hidróxi etano -1,1-difosfônico pode ser obtido junto à Thermphos, de Vlissingen-Oost, Holanda. O reforçador de alvejamento à base de oxaziridínio tem a seguinte estrutura, onde R1 = 2-butil octila, e foi produzido de acordo com US 2006/0089284A1.
Enzimas Natalase®, Termamyl®, Stainzyme Plus®, Cellucle-an® e Mannaway ®, podem ser obtidas a partir de Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca.
Ftalocianina tetrassulfonato de zinco pode ser obtido a partir de Ciba Specialty Chemicals, Basel, Suíça, as Tinolux® BMC. O grânulo supressor de espuma pode ser obtido junto à Dow Corning, de Barry, Reino Unido.
Copolímero de enxerto aleatório é um copolímero de óxido de polietileno enxertado com acetato de polivinila que tem uma cadeia principal de óxido de polietileno e cadeias laterais de acetato de polivinila múltiplas. O peso molecular da cadeia principal de óxido de polietileno é cerca de 6000 e a razão entre o peso do óxido de polietileno e o peso do acetato de polivinila é cerca de 40 a 60 e não mais que 1 ponto de enxerto por 50 unidades de óxido de etileno.
Exemplo 31 Geração de GG36 Bibliotecas de Avaliação de Sítio (SELs) A construção das SELs de GG36 descritas neste exemplo foi realizada pela GENEART com o uso de seus métodos e plataforma tecnologia para otimização de genes, síntese de genes, geração e análise de bibliotecas (WO 2004/059556A3, patentes europeias n° 0.200.362 e n° 0.201.184, e patentes US n° 4.683.195, 4.683.202 e 6.472.184). As SELs de GG36 foram produzidas nas posições pré-selecionadas pelos inventores, com o uso do plasmídeo de expressão pHPLT-GG36 de B. subtilis (consulte a figura 2). Esse plasmídeo de expressão de B. subtilis contém o cassete de expressão GG36 mostrado abaixo, o promotor LAT de B. licheniformis (Plat), e elementos adicionais obtidos de pUB110 (McKenzie et al., Plasmid, 15:93-103, 1986) inclusive um gene de replicase (reppUB), um gene de resistência a neomicina/canamicina (neo) e um marcador de resistência à bleomicina (bleo) (figura 4 na patente U.S. n° 6.566.112). A sequência de DNA de GG36 (a sequência de sinais é mostrada em letras minúsculas, o propeptídeo em minúsculas e sublinhado, e a sequência madura GG36 em letras maiúsculas) gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgctttcagttcatcgatcgc atcqqctqctqaaqaaqcaaaaqaaaaatatttaattqqctttaatqaqcaqqaaqctqtcaqtqaqtttqt aqaacaaqtaqaqqcaaatqacqaqqtcqccattctctctqaqqaaqaqqaaqtcqaaattqaattqctt catqaatttqaaacqattcctqttttatccqttqaqttaaqcccaqaaqatqtqqacqcqcttqaqctcqatcc aqcqatttcttatattqaaqaqqatqcaqaaqtaacqacaatqGCGCAAT CAGT GCCAT GGG GAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAG GTTCTGGTGTAAAAGTTGGTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCA GACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCA CTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTG CTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACT ATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTC GATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGC TAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCT GTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAA ATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAAT GGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACA GTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAG CACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCT ACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCAT CTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAG CTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCT GCAACTCGTTAA SEQ ID n°4 é a sequência completa, incluindo propeptídeo e peptídeo de sinalização.
A sequência de proteínas de GG36 (a sequência de sinais é mostrada em letras minúsculas, o propeptídeo em minúsculas e sublinhado, e a sequência de protease madura GG36 em letras maiúsculas) vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyliqfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellh efetipvIsvelspedydaleldpaisyieedaevttmAQSVPWG ISRVQAPAAH N RG LTGS GVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNN SIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLG SPSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATD
QNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAA ALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR SEQ ID n°1 é a sequência madura e SEQ ID n°3 inclui, também, sinal e propeptídeo. O método de mutagênese tem por base a abordagem de mutação códon-específica na qual todas as possíveis substituições de aminoácido são simultaneamente criadas em um códon de interesse específico, com o uso de iniciadores de mutagênese diretos e reversos que contêm um códon degenerado NNS ((A,C,T ou G), (A,C,T ou G), (C ou G)) no sítio de interesse. Para construir cada uma das SELs de GG36, três reações de PCR foram realizadas: duas reações de mutagênese (PCR1 e PCR2 primárias) para introduzir o códon mutado de interesse na sequência de DNA de GG36 madura com o uso dos iniciadores de mutagênese diretos e reversos NNS (25-45 nucleotídeos de comprimento), e uma terceira reação para fundir um ao outro os dois produtos de mutagênese da PCR, de modo a construir o vetor de expressão pHPLT-GG36 tendo os códons mutados desejados na sequência de GG36 madura.
As sequências iniciadoras usadas neste Exemplo são apresentadas abaixo: A DNA polimerase Phusion High-Fidelity (Finnzymes, n° de catálogo F-530L) foi usada para todas as PCRs, e as reações foram executadas de acordo com os protocolos do fabricante que foram fornecidos com a polimerase. Em particular, para a PCR 1 primária, usou-se 1 pl (10 μΜ) de cada um dentre o iniciador pHPLT-BglIl-Fw e um iniciador mutagênico reverso NNS, e para a PCR 2 primária, usou-se 1 μΙ (10 μΜ) do iniciador pHPLT-Bglll-Rv e um iniciador de mutagênese direto NNS. Cada reação incluiu, também, 1 μΙ do modelo de DNA do plasmídeo pHPLT-GG36 (0,1-1 ng/ μΙ). Um termociclador PTC-200 Peltier da MJ Research foi usado para as PCRs.
As reações renderam dois fragmentos de aproximadamente 2 a 3 kb tendo aproximadamente 30 nucleotídeos de sobreposição circundando o códon GG36 de interesse. Os fragmentos obtidos foram fundidos em uma terceira PCR similar àquelas descritas acima, com o uso de 1 pl de mistura de reação para PCR 1 primária, 1 μΙ de mistura de reação para PCR 2 primária e 1 μΙ (10 μΜ) de cada um dentre os iniciadores direto e reverso Sacl-Fw e Hin-dlll-Rv. O fragmento linear de 859 bp amplificado que codifica o gene variante GG36 foi purificado (usando-se o kit de purificação QIAGEN® Qiaquick PCR) e digerido com as enzimas de restrição Saci e Hindllll para criar extremidades coesivas em ambos os lados do fragmento de fusão. Cerca de 50 ng de plasmídeo pHPLT-GG36 também foram purificados após digestão com Saci e Hindllll, resultando em um fragmento de cadeia principal de vetor com 3,9 kb. O fragmento de vetor digerido foi ligado com 50 ng do fragmento 859 bp digerido que codifica a enzima variante com o uso da DNA ligase T4 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante para clonagem de extremidades coesivas. Subsequentemente, a mistura de ligação foi usada para transformar células de B. subtilis (AaprE, AnprE, oppA, AspollE, degUHy32, AamyE::[xylR1pxylA-comK\) conforme descrito (WO 2002/014490).
Para expressar as proteínas variantes para análise bioquímica adicional, as cepas de 8. subtilis portando os plasmídeos variantes GG36 foram inoculadas em placas de microtitulação contendo 150 μΙ de meio de caldo Luria suplementado com 10 pg/ml de neomicina. As placas foram cultivadas de um dia para o outro a 37°C sob agitação de 300 rpm e a 80% de umidade, com o uso de tampas Enzyscreen para placas de microtitulação (Enzyscreen). Dez microlitros da placa de cultura cultivada de um dia para o outro foram usados para inocular uma nova placa de microtitulação contendo 190 μΙ de meio MBD (um meio definido baseado em MOPS) com 10 ug/ml de neomicina. O meio de MBD foi preparado essencialmente conforme conhecido na técnica (consulte, Neidhardt et al., J. Bacteriol., 119: 736 a 747 [1974]), exceto que NH4CI, FeSO4, e CaCI2 foram emitidos do meio base, 3 mM de K2HPO4 foi usado, e o meio base foi suplementado com 60 mM de ureia, e 100 ml de uma solução produzida a partir de 210 g/l de glucose, e 350 g/l de maltodextrina. Os micronutrientes foram produzidos sob a forma de uma solução de estoque a 100X contendo, em um litro, 400 mg de FeSO4 7H2O, 100 mg de MnSO4.H2O, 100 mg de ZnSO4 7H2O, 50 mg de CuCI2 2H2O, 100 mg de CoCI2 6H2O, 100 mg de NaMoO4 2H2O, 100 mg de Na2B4O7 10H2O, 10 ml de CaCI2 a 1M, e 10 ml de citrato de sódio a 0,5 M. As placas de microtitulação contendo meio MBD foram cultivadas durante 68 horas a 37°C, sob 300 rpm, e 80% de umidade com o uso de tampas Enzys-creen (Enzyscreen) para determinar a expressão de proteína. No dia seguinte, as culturas foram filtradas através de uma placa de microfiltração (0,22 pm; Millipore) e o filtrado resultante foi usado para análise bioquímica. Os ensaios de microamostra de TCA, LAS/EDTA e BMI foram executados conforme descrito na Seção de Métodos de Teste. Os índices de desempenho, também, foram calculados conforme descrito sob a descrição de ensaio de BMI na Seção de Métodos de Teste, e os mesmos são mostrados na Tabela 2-1.
Tabela 2-1: Os valores de índice de desempenho (PI) de variantes GG36 em relação à GG36 no ensaio de microamostra de BMI com o uso do Método de Teste 3 TABELA 2-2: Valores de índice de desempenho (PI) de variantes GG36 em relação à GG36 no ensaio de microamostra de BMI com o uso do detergente do Exemplo 29 O índice de desempenho das variantes abaixo foi avaliado com o uso do Método de Teste 2 at 16C.
Exemplo 32 Construção e desempenho de limpeza de conjuntos de variantes GG36 NHJ1 eWCE1 Os conjuntos de variantes GG36 NHJ1 e WCE1 aqui descritos foram construídos a DNA 2,0, Inc. (Menlo Park, CA, EUA) com seus métodos de proprietário com o uso do plasmídeo de expressão pHPLT-GG36 de B. subtilis descrito acima (figura 2). As variantes foram expressas em células de B. subtilis (genótipo: AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) conforme descrito no Exemplo 31, e foram adicionalmente caracterizadas com o uso dos ensaios de microamostra de TCA e BMI conforme descrito na Seção de Métodos de Teste.
Tabela 3-1: Valores de índice de desempenho (PI) de variantes NHJ1 em relação à GG36 no Método de Teste 3 Tabela 3-2: Valores de índice de desempenho (PI) de variantes WCE1 em relação à GG36 no ensaio de microamostra de BMI com o uso do Método de Teste 2 í Exemplo 33 Construção e desempenho de limpeza do conjunto NHJ4 das variantes GG36 Os conjuntos de variantes GG36 NHJ4 descritos na Tabela 4-4 abaixo foram construídos com o uso do plasmídeo de expressão pHPLT-GG36 de B. subtilis (figura 2) com o uso de fusão por PCR ou do kit de mutagênese de múltiplos sítios direcionada QuikChange® ("QCMS kit"; Strata-gene) conforme descrito abaixo. a) Construção de variantes NHJ4 através de QuikChange® Mutaqênese de Múltiplos Sítios Direcionada (QCMS) Variantes criadas pela Mutagênese de Múltiplos Sítios Direcionada QuikChange® são mostradas na Tabela 4-4. O plasmídeo parental pHPLT-GG36 (DNA modelo) foi metilado com o uso de dois microgramas de DNA e da Dam metilase (New England Biolabs), de acordo com as instruções do fabricante. Mutantes sítio-dirigidos foram feitos através de um Kit de Mutagênese de Múltiplos Sítios Direcionada QuikChange®("QCMS kit"; Stra-tagene) de acordo com o protocolo do fabricante (consulte, Tabela 4-1 para sequências iniciadoras). Para uma transformação eficiente do B. subtilis, o DNA da reação de QCMS foi amplificado mediante amplificação por círculo rolante (RCA) com o uso do kit lllustra Templiphi (GE Healthcare) de acordo com o protocolo do fabricante. Um microlitro de DNA amplificado diluído 10 vezes foi usado para transformar 50 pl de células de 8. subtilis competentes (genótipo: AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). A mistura de transformação foi agitada a 37°C durante 1 hora. Alíquotas de dez microlitros da mistura de transformação foram colocados sobre placas de ágar Luria com leite desnatado (1,6%) suplementadas com 10 pg/ml de neomicina. Subsequentemente, as colônias com halos foram inoculadas em 120 μΙ de meio de caldo Luria contendo 10 μg/ml de neomicina para extração de DNA de plas-mídio (kit QIAprep Spin Miniprep, Qiagen). Os plasmídeos extraídos foram sequenciados para confirmar a presença das mutações desejadas. b) Construção de variantes NHJ4 por PCR de extensão Dez mutantes combinatórios de GG36 foram criados por PCR de extensão (Tabela 4-4). A lista de mutações introduzidas em plasmídeo pHPLT-GG36 e iniciadores usados para essa finalidade é mostrada na Tabela 4-2. Para criar cada mutante, vários fragmentos (Tabela 4-3) foram amplificados por iniciadores mostrados na Tabela 4-2. Cada reação de amplificação de PCR continha 30 pmol de cada iniciador e 100 ng do modelo de DNA, plasmídeo pHPLT-GG36. As amplificações foram realizadas com o uso de polimerase Vent DNA (New England Biolabs). A reação de PCR (20 pl) foi inicialmente aquecida a 95°C por 2,5 min seguida de 30 ciclos de des-naturação a 94°C por 15 s, recozimento a 55°C por 15 s e extensão a 72°C durante 1 minuto. Em seguida à amplificação, de 2 a 4 fragmentos de PCR (Tabela 4-3) para cada variante foram purificados em gel, com o uso de um kit de purificação em banda de gel QIAGEN® e misturados (50 ng de cada fragmento). Essas misturas serviram como modelos de DNA para PCR de extensão por iniciadores P5954 e P5955 para gerar o fragmento de gene de comprimento total. As condições de PCR formas as mesmas conforme descrito acima, exceto pela fase de extensão, que foi executada a 72°C por 2 minutos. O fragmento de DNA de comprimento completo foi purificado em gel com o uso de um kit de purificação em banda de gel QIAGEN®, digerido com as enzimas de restrição BamHI e Hindlll e ligado com o vetor pHPLT-GG36, digerido com as mesmas enzimas de restrição. As misturas de ligação foram amplificadas com o uso de amplificação de círculo de rolamento e transformadas em células de B. subtilis conforme descrito para o método QCMS acima. As variantes GG36 obtidas foram sequenciadas para confirmar a presença das mutações desejadas. As variantes criadas pela PCR de extensão são mostradas na Tabela 4-4.
Para expressar o conjunto NHJ4 de proteínas variantes para análise bioquímica adicional, as cepas de B. subtilis portando os plasmídeos variantes foram inoculadas em placas de microtitulação contendo 150 pl de meio de caldo Luria suplementado com 10 pg/ml de neomicina. As culturas foram cultivadas para expressão de proteína conforme descrito no Exemplo 31, e foram filtradas através de uma placa de microfiltração (0,22 pm; Millipo-re) também conforme descrito no Exemplo 31. O filtrado resultante foi usado para análise bioquímica. O ensaio de inibição de eglin c para determinação de teor de proteína e ensaios de microamostra de BMI testados em vários detergentes foram executados conforme descrito na seção de Métodos de Teste. Os índices de desempenho, também, são calculados conforme descrito sob a descrição de ensaio de microamostra de BMI na seção de Métodos de Teste.
Exemplo 34 Construção e desempenho de limpeza do conjunto NHJ3 das variantes GG36 O conjunto NHJ3 de variantes aqui descrito tem por base uma variante de GG36 (chamada de GG36-9) contendo as seguintes mutações: S101G, S103A, V104I, G159D, A232V, Q236H, Q245R, N248D, e N252K (numeração BPN'). Essas variantes foram criadas com uso do Kit de Mutagênese de Múltiplos Sítios Direcionada de Iluminação QuikChange® (kit QCLMS; Stratagene), com o plasmídio pRA68 (consulte, figura 3) como o modelo de DNA. O plasmídio pRA68 foi derivado do vetor pBN3 (consulte, Babé etal., Biotech. Appl. Biochem. 27:117 a 124 [1998]). A sequência de DNA da variante GG36-9 (a sequência de si- nais é mostrada em letras minúsculas, o propeptídeo em minúsculas e sublinhado, e a sequência madura GG36-9 em letras maiúsculas) é apresentada abaixo: Gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgc atcqqctqctqaaqaaqcaaaaqaaaaatatttaattqqctttaatqaqcaqqaaqctqtcaqtqaqtttqt aqaacaaqtaqaqqcaaatqacqaqqtcqccattctctctqaqqaaqaqqaaqtcqaaattqaattqctt catqaatttqaaacqattcctqttttatccqttqaqttaaqcccaqaaqatqtqqacqcqcttqaactcqatcc aqcqatttcttatattqaaqaqqatqcaqaaqtaacqacaatqGCGCAAT CAGT GCCAT GGG GAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAG GTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCA GACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCA CTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTG CTCTAAACAATTCGATTGGCGTACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAAC TATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCT CGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTG CTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGC TGTTAATAGCGCGACTTGTAGGGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGA AATTCGGGTGCAGACTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAA TGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACA GTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAG CACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCT ACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCTTGTTAAACATAAGAACCCAT CTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCTAAAGAAAACGGCAACGAG CTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCCGAAGCT GCAACTCGTTAA (SEQ ID n°44) A sequência de proteínas da variante GG36-9 (a sequência de sinais é mostrada em letras minúsculas, o propeptídeo em minúsculas e sublinhado, e a sequência de protease madura GG36-9 em letras maiúsculas) é apresentada abaixo: vrskkl wivasta I lisvafsssiasaaeeakekyliqfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellh efetipvIsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWG ISRVQAPAAH N RG LTGS GVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNN SIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGGGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGS PSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQ NNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAV LVKHKNPSWSNVRIRDHLKKTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID n°45) Para criar as variantes NHJ3 com o uso do kit de QCLMS, os iniciadores mutagênicos foram projetados conforme mostrado na Tabela 5-1 para cada uma das variantes. A reação de mutagênese para cada variante consistiu em 0,5 pl de DNA de plasmídio pRA68 (168 ng/μΙ), 0,5 μΙ de iniciador mutagênico "f de avanço (25 μΜ), 0,5 μΙ de iniciador de mutagênese "r" reverso (25 μΜ), 1 ul de dNTPs (fornecido no kit de QCLMS), 1,5 μΙ de solução Quik (fornecido no kit de QCLMS), 1 μΙ de mescla de Enzima (fornecido no kit de QCLMS), e 39,5 μΙ de água desionizada destilada para compensar um 50 μΙ de volume de reação de acordo com as instruções do fabricante. O programa de ciclagem foi 1 ciclo a 95°C por 2 minutos, 18 ciclos de 95°C por 20 segundos, 60°C por 10 segundos e 68°C por 3 minutos, 22 segundos, e um ciclo final de 68°C por 5 minutos. Posteriormente, 1 μΙ de enzima de restrição Dpnl fornecido no kit foi usado para digerir o DNA de plasmídio na reação, e, então, 2 μΙ da reação foram usados para transformar células competentes de E. coli TOP 10 (Invitrogen). Os transformantes de E. coli foram selecionados em placas de LB contendo 50 ug/ml(ppm) de carbenicilina após crescimento de um dia para o outro a 37°C. O DNA de plasmídeo foi extraído de 4 a 8 colônias de E. coli cultivadas em meio LA contendo 50 ug/ml (ppm) de carbenicilina, com o uso do kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Os plasmídeos foram sequenciados para confirmar a presença das mutações desejadas. Os plasmídeos variantes foram, então, transformados em células de B. subtilis, conforme descrito no Exemplo 31. As cepas variantes de B. subtilis foram cultivadas conforme descrito no Exemplo 31 para análise bioquímica adicional, como determinação do teor de proteína com o uso de do ensaio de inibição por eglina c (seção de Métodos de Teste) e um ensaio de limpeza de microamostra com BMI (seção de Métodos de Teste). O desempenho de limpeza das variantes NHJ3 é mostrado nas Tabelas 5-2 e 5-3.
Exemplo 35 Construção e desempenho de limpeza do conjunto NHJ5 das variantes GG36 O conjunto NHJ5 de variantes aqui descrito tem por base uma variante de GG36 (chamada de GG36-7) contendo as seguintes mutações: S101G, S103A, V104I, G159D, A232V, Q245R, N248D (numeração BPN'). Essas variantes foram criadas conforme descrito no Exemplo 34 com o uso do Kit de Mutagênese de Múltiplos Sítios Direcionada de Iluminação Quik-Change® (kit QCLMS; Stratagene) com o plasmídio pRA96 como o modelo de DNA (figura 4; o plasmídio pRA96 foi derivado do vetor pBN3, que é descrito em Babe et al, Biotech. Appl. Biochem. 27:117 a 124, 1998). As muta ções incorporadas e as sequências dos iniciadores usadas para introduzir as mutações em GG36-7 são mostradas na Tabela 6-1. As variantes foram geradas com o uso dos métodos descritos no Exemplo 34. As cepas variantes de B. subtilis foram cultivadas conforme descrito no Exemplo 31 para análise bioquímica adicional, como determinação do teor de proteína com o uso de do ensaio de inibição por eglina c (seção de Métodos de Teste) e um ensaio de limpeza de microamostra com BMI (seção de Métodos de Teste). O desempenho de limpeza do conjunto NHJ5 de variantes é mostrado nas Tabelas 6-2 e 6-3.
SEQ ID n° 64 A sequência de proteínas da variante GG36-7 (a sequência de sinais é mostrada em letras minúsculas, o propeptídeo em minúsculas e sublinhado, e a sequência de protease madura GG36-7 em letras maiúsculas) Gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgc atcqqctqctqaaqaaqcaaaaqaaaaatatttaattqqctttaatqaqcaqqaaqctqtcaqtqaqtttqt aqaacaaqtaqaqqcaaatqacqaqqtcqccattctctctqaqqaaqaqqaaqtcqaaattqaattqctt catqaatttqaaacqattcctqttttatccqttqaqttaaqcccaqaagatqtqqacqcqcttqaactcqatcc aqcqatttcttatattqaaqaqqatqcaqaaqtaacqacaatqGCGCAAT CAGTGCCATGGG GAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAG GTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCA GACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCA CTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTG CTCTAAACAATTCGATTGGCGTACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAAC TATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCT CGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTG CTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGC TGTTAATAGÇGCGACTTCTAGGGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGA AATTCGGGTGCAGACTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAA TGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACA GTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAG CACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCT ACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCTTGTTAAACAAAAGAACCCAT
CTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCTAAAGAATACGGCAACGAG CTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCCGAAGCT GCAACTCGT
SEQ ID n° 65 A sequência de proteínas da variante GG36-7 (a sequência de sinais é mostrada em letras minúsculas, o propeptídeo em minúsculas e sublinhado, e a sequência de protease madura GG36-7 em letras maiúsculas) vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyliqfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellh efetipvIsvelspedvdaleldpaisvieedaevttmAQSVPWG ISRVQAPAAH N RG LTGS GVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNN SIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGGGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGS PSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQ NNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAV LVKQKNPSWSNVRIRDHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
Tabela 6-2: Desempenho de limpeza de NHJ5 variantes com o uso do Método de Teste 3. índice de desempenho (PI) em relação à GG36.
Exemplo 36 A tabela abaixo (6-4) exemplifica as concentrações de detergente e tampões usados enquanto os Exemplos 36a - 36n mostram os tipos de detergente usados. A seguir, são apresentadas composições detergentes granula-res para lavagem de roupas. A protease dessa invenção é separadamente adicionada a essas formulações.
Notas para os exemplos 36 a - n: Os ingredientes de tensoativo podem ser obtidos a partir de BASF, Ludwigshafen, Alemanha (Lutensol®); Shell Chemicals, Londres, Reino Unido; Stepan, Northfield, lllinois, EUA; Huntsman, Huntsman, Salt Lake City, Utah, EUA; Clariant, Sulzbach, Alemanha (Praepagen®). O zeólito pode ser obtido junto à Industrial zeólito (Reino Unido) Ltd, Grays, Essex, Reino Unido. O ácido cítrico e o citrato de sódio podem ser obtidos junto à Jungbunzlauer de Basel, Suíça.
Percarbonato sódio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio e sesquicarbonato de sódio podem ser obtidos a partir de Solvay, Bruxelas, Bélgica.
Os copolímeros de acrilato/maleato podem ser obtidos a partir de BASF, Ludwigshafen, Alemanha.
Carbóxi metil celulose e carbóxi metil celulose hidrofobicamen-te modificada podem ser obtidas a partir de CPKelco, Arnhem, Holanda.
Branqueador fluorescente C.l. 260 pode ser obtido a partir de 3V Sigma, Bergamo, Itália como Optiblanc® Optiblanc® 2M/G, Optiblanc® 2MG/LT Extra, ou Optiblanc® Ecobright. O dissuccinato de S,S-etilenodiamina tetrassódico pode ser obtido junto à Innospec de Ellesmere Port, Reino Unido.
Copolímero de tereftalato pode ser obtido a partir de Clariant sob o nome comercial Repelotex SF 2. O ácido 1-hidróxi etano -1,1-difosfônico pode ser obtido junto à Thermphos, de Vlissingen-Oost, Holanda. O reforçador de alvejamento à base de oxaziridínio tem a seguinte estrutura, onde R1 = 2-butil octila, e foi produzido de acordo com US 2006/0089284A1.
Enzimas Natalase®, Termamyl®, Stainzyme Plus®, Cellucle- an® e Mannaway®, podem ser obtidas a partir de Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca.
Ftalocianina tetrassulfonato de zinco pode ser obtido a partir de Ciba Specialty Chemicals, Basel, Suíça, as Tinolux® BMC. O grânulo supressor de espuma pode ser obtido junto à Dow Corning, de Barry, Reino Unido.
Copolímero de enxerto aleatório é um copolímero de óxido de polietileno enxertado com acetato de polivinila que tem uma cadeia principal de óxido de polietileno e cadeias laterais de acetato de polivinila múltiplas. O peso molecular da cadeia principal de óxido de polietileno é cerca de 6000 e a razão entre o peso do óxido de polietileno e o peso do acetato de polivinila é cerca de 40 a 60 e não mais que 1 ponto de enxerto por 50 unidades de óxido de etileno.
Exemplo 37 Construção da biblioteca combinatória NHJ2 Este Exemplo descreve a construção de uma biblioteca combinatória GG36 envolvendo uma ou mais dentre as seguintes mutações: A016S, T022A, S101A, S103G, V104L, L111V, S128N, e L148I (numeração BPN'). O plasmídeo de expressão de B. subtilis pHPLT-GG36 foi fornecido à DNA2.0 Inc., para a geração da biblioteca combinatória NHJ2. Uma reação de ligação da biblioteca NHJ2 construída foi fornecida pela DNA2.0, Inc. para transformação na cepa de B. subtilis (genótipo: AaprE, AnprE, am-yE::xylRPxylAcomK-phleo). As variantes geradas contendo uma ou algumas das mutações aqui descritas são testadas para aplicações de limpeza em água fria com o uso de métodos e composições detergentes aqui descritos. Exemplo 38 Construção de bibliotecas e variantes de GG36 adicionais As bibliotecas e variantes adicionais são construídas com o uso do seguinte conjunto de mutações: A001R, A230E, E271L, G115R, G020R, H249R, K235F, K027V/F/L, L075E, L082R, N018R, N269R, N043D, N043R, N076D, R045T, S212F, S242R, S024R, S078R, S009A, T022R, V121E, V244R, V028E, V030E, V004R, W241R (numeração BPN'). As variantes ge- radas que contêm uma ou mais dessas mutações foram testadas para limpeza de água fria no ensaio de limpeza de microamostras de BMI (Exemplo 1) com o uso dos métodos e composições detergentes aqui descritos. Os resultados são apresentados abaixo, na Tabela 8-1. Nas Tabelas a seguir, as composições detergentes ("Det.") correspondem àquelas mostradas no Exemplo 36, acima. Além disso, conforme indicado, a posição de aminoácido é mencionada de acordo com a numeração BPN'.
Conjuntos adicionais de variantes GG36 mostrados abaixo foram construídos e testados para limpeza de água fria no ensaio de limpeza de microamostras de BMI (Método de Teste 6) com o uso dos métodos e composições detergentes aqui descritos. Os resultados são apresentados abaixo, na Tabela 8-1. As variantes GG36 testadas foram: G020R-N043R-H249R, G020R-T022R-N043R, G020R-N043R-S242R, G020R-N043R-E271L, G020R-N043R-V244R, G020R-S024R-N043R-S242R, S009A-T022R-S078R-S212F-W241R, S009A-G020R-N043R-S212F, S009A-N043R-S212F, G020R-N043R-S212F, G020R-T022R-N043R-S212F, SQ24R-S078R-S212F, S009A-N043R-S078R, S009A-N043R-S078R-S242R, S009A-G020R-N043R-S078R, G020R-S024R-N043R-S078R-S242R, T022R-S024R-S078R-S212F, S009A-G020R-N043R-S078R-S242R, G020R-N043R-S078R-H249R, G020R-N043R-S078R, S009A-S078R-S212F, S009A-T022R-N043R-S078R, S009A-G020R-S024R-N043R, S009A-T022R-S078R-S212F, V004R-S009A-T022R-S078R-S212F, G020R-S024R-N043R, A001R-S009A-N043R, G020R-S024R-N043R-G115R, S009A-S024R-N043R, G020R-T022R-S024R-N043R, A001R-S024R-N043R, S009A-G020R-S024R-N043R-S242R, S009A-G020R-T022R-S078R-S212F, S009A-S024R-N043R-V244R, S009A-S024R-N043R-S242R, V004R-S009A-T022R-S024R-S212F, e T022R-S024R-N043R (numeração BPN').
Exemplo 39 Construção e desempenho de limpeza da biblioteca WCE2 de GG36 A biblioteca combinatória WCE2 foi gerada pela DNA2.0, Inc. com o uso do plasmídeo de expressão pHPLT-GG36 de B. subtilis. Uma reação de ligação da biblioteca WCE2 construída foi fornecida pela DNA2.0, Inc. para transformação na cepa de B. subtilis (genótipo: AaprE, AnprE, am-yE::xylRPxylAcomK-phleo). O conjunto de mutações usado para gerar a biblioteca WCE2 é A230E, G020R, H249R, N018R, N043R/D, N076D, R045T, S242R, e S024R (numeração BPN'). As variantes geradas que contêm uma ou mais dessas mutações são testadas para limpeza de água fria no ensaio de limpeza de microamostras (MÉTODO DE TESTE 6) com o uso dos métodos e composições detergentes aqui descritos. Os resultados são apresentados abaixo, na Tabela 9-1. Nas Tabelas a seguir, as composições detergentes ("Det.") correspondem àquelas mostradas no Exemplo 36, acima. Além disso, conforme indicado, a posição de aminoácido é mencionada de acordo com a numeração BPN'.
Exemplo 40 Construção e desempenho de limpeza do conjunto WCE3 das variantes GG36 Esse Exemplo descreve o conjunto WCE3 de mutantes com base em variantes GG36, GG36-7 (Exemplo 5) e GG36-9 (Exemplo 4). Essas variantes são: S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R, e S101G, S103A, V104I, A232V, Q236H, Q245R, e N252K. As mesmas foram criadas com o uso do Kit de Mutagênese Direcionada de Múltiplos Sítios de iluminação (kit QCLMS; Stratagene) com o plasmídio pRA96 como o modelo de DNA descrito no Exemplo 34. As variantes geradas foram testadas para limpeza de água fria no ensaio de microamostra de BMI (MÉTODO DE TESTE 6) com o uso dos métodos e composições detergentes descritas nesse pedido.
Exemplo 41 Construção de bibliotecas e variantes de GG36 adicionais Esse Exemplo descreve a limpeza de água fria de variantes combinatórias GG36 contendo uma ou mais das mutações a seguir: A016S, T022A, S024R, N062E, N076D, E089P, S101A/G, S103G/A, V104L/I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, S166D, R186H, S188D, Y209E, Q236H, N238R, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R, E271F (numeração BPN'). As variantes combinatórias foram construídas por DNA2.0, Inc., com o uso de um plasmídio de expressão de B. subtilis (por exemplo, pHPLT-GG36; Fig. 2) e da cepa de B. subtilis (genótipo: AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). No caso de bibliotecas de DNA, uma reação de ligação de cada uma das bibliotecas construídas com o uso de um plasmídio de expressão de B. subtilis (por exemplo, pHPLT-GG36; Fig. 2) foi fornecida por DNA 2.0, Inc. para transformação na cepa de B. subtilis (genótipo: AaprE, ÁnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). As variantes geradas que contêm uma ou mais das mutações listadas acima foram testadas para limpeza de água fria no ensaio de microamostra de BMI (MÉTODO DE TESTE 6) com o uso dos métodos e composições detergentes descritos nesse pedido.
Exemplo 42 Construção de bibliotecas e variantes de GG36 adicionais Este Exemplo descreve a construção de variantes e bibliotecas GG36 em B. subtilis com o uso de uma ou mais dentre as seguintes mutações (numeração BPN'): A001R, Q002S, Q002M, Q002A, Q002R, Q002W, S003R, V004R, V004S, V004C, I008A, S009A, S009F, S009W, R010S, R010A, R010H, R010M, Q012F, Q012R, P014K, P014F, P014Q, A015R, A015F, A016S, H017R, H017M, H017F, N018R, N018K, G020F, G020K, G020R, T022A, T022R, T022Y, T022V, T022Q, T022L, T022W, G023A, G023S, G023F, S024R, S024F, S024W, S024Q, S024H, S024L, G025V, G025F, G025R, V026F, K027L, K027F, K027R, K027V, V028A, V028N, V028E, A029T, V030E, L031F, T033S, T033G, T033D, G034P, I035M, S036T, S036F, S036R, T038L, T038F, T038R, P040N, P040L, P040T, P040W, P040H, P040R, L042I, N043A, N043F, N043I, N043S, N043R, N043M, N043W, N043D, R045T, G046R, A048R, F050C, V051W, V051F, V051H, P052F, P052E, P052N, P055Y, T057R, Q059A, Q059F, Q059R, D060P, D060Q, D060A, N062E, N062Q, G063V, G063M, G063T, G063I, G063A, G063S, G063H, G063Q, G063D, G063E, G063P, H064F, H064T, V068A, V068C, A069N, A069T, A069P, A069W, T071G, I072C, A074C, L075A, L075F, L075E, L075R, N076D, S078R, S078N, S078I, I079W, I079Q, V081R, L082F, L082T, L082V, L082R, L082M, A085M, P086W, P086L, P086I, E089P, E089T, E089G, E089H, E089L, E089V, E089W, E089F, E089I, Y091N, Y091F, A092F, K094N, S099F, S099T, S099P, S099G, S099M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120F, H120R, V121F, V121E, N123G, N123E, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, P129E, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, A158E, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, Ν183Ι, N183D, Ν183Μ, N183F, N183R, Ν185Ε, N185V, Ν185Ι, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Υ192Η, Y192W, Α194Ε, A194V, A194F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Υ209Ν, Y209F, Υ209Τ, Υ209Ε, Υ209Η, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, Τ213Α, Y214F, Α215Ν, A215D, Α215Ε, Α215Η, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, Ν218Ρ, Ν218Ε, Τ224Α, T224G, V227I, Α230Ε, Α231Ι, A231C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, Ν238Κ, N238L, Ρ239Κ, P239G, P239R, Ρ239Η, Ρ239Τ, Ρ239Ν, P239S, P239F, S240R, W241R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, Ν248Ι, N248R, H249R, Η249Τ, L250I, K251R, K251S, Ν252Ι, N252F, N252R, Ν252Κ, Ν252Η, Τ253Ι, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, Τ260Ι, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, Ν269Ι, N269R, A270C, Ε271Ι, E271V, Ε271Η, Ε271Μ, E271L, Ε271Ρ, Ε271Α, E271F, Ε271Τ, A272F, A272F, A272R, A273F, Α273Ι, e T274G. As variantes e bibliotecas foram construídas por DNA2.0, Inc., conforme descrito no Exemplo 41. As variantes geradas que contêm uma ou mais dessas mutações foram testadas para limpeza de água fria no ensaio de microamostra de BMI com o uso dos métodos e composições detergentes descritos nesse pedido no MÉTODO DE TESTE 6.
Exemplo 13 Construção de bibliotecas e variantes de GG36 adicionais Esse Exemplo descreve a limpeza de água fria de variantes GG36 adicionais e bibliotecas construídas em B. subtilis. A maioria das bibliotecas de DNA foi sintetizada a DNA2.0, Inc., com o uso do plasmídeo de expressão pHPLT-GG36 de B. subtilis. AS reações de ligação das bibliotecas construídas foram transformadas na cepa de B. subtilis (genótipo: AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo após amplificação do DNA com o uso de uma amplificação de círculo de enrolamento conforme descrito no Exemplo 33 As variantes de biblioteca WCE9 e NHJ10 foram criadas por PCR de extensão ou mutagênese QuickChange (consulte, Exemplo 33 para descrição de métodos). Variantes de biblioteca WCE9 e NHJ10 também foram criadas com o uso do plasmídeo de expressão pHPLT-GG36 de B. subtilis. As variantes foram expressas em células de B. subtilis (genótipo: AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) conforme descrito no Exemplo 31, e foram adicionalmente caracterizadas com o uso do ensaio de limpeza de microamostras de BMI conforme descrito no MÉTODO DE TESTE 6. Esses resultados são mostrados nas Tabelas 13-1 a 13-6. Nas Tabelas a seguir, as composições detergentes ("Det") correspondem àquelas mostradas no E- xemplo 36 acima. Além disso, conforme indicado, a posição de aminoácido é mencionada de acordo com a numeração BPN'.
As dimensões e valores apresentados na presente invenção não devem ser compreendidos como estando estritamente limitados aos e-xatos valores numéricos mencionados. Em vez disso, exceto de outro modo especificado, cada uma dessas dimensões se destina a significar tanto o i valor mencionado como uma faixa de valores funcionalmente equivalentes em torno daquele valor. Por exemplo, uma dimensão apresentada como "40 mm" pretende significar "cerca de 40 mm".
REIVINDICAÇÕES

Claims (8)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um material auxiliar e uma variante de protease de água fria, em que a dita variante de protease consiste em SEQ ID NO: 1 com um dos conjuntos de mutações a seguir: T022R-S024R T022R-G115R S009A-T022R S009A-T022R-S212F-W241R G020R-T022R-S242R- G020R-T022R-N043R- G020R-T022R-W241 R- G020R-T022R-S078R-S242R- S009A-T022R-N043R-S078R G020R-T022R-S212F-W241R- G020R-T022R-S078R-W241R- G020R-T022R-N043R-W241R- G020R-T022R-S024R-S242R- S009A-T022R-S078R-S212F S009A-T022R-S078R-S212F-W241R G020R-T022R-E271L G020R-T022R-N043R-S212F- V004R-S009A-T022R-S078R-S212F- G020R-T022R-S078R-S212F-W241R- G020R-T022R-N269R- T022R-S101G-S103A-V1041-A232V-Q245R N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R T022R-N043R-S101G-S103A-V1041-A232V-Q245R T022R-N076D-S101G-S103A-V1041-A232V-Q245R N018R-T022R-S024R-N076D-H249R N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R T022R-S087D-S101G-S103A-V1041-A232V-Q245R T022R-S101G-S103A-V1041 -V150L-A232V-Q245R em que as posições de aminoácido da variante de protease são numeradas de acordo com a numeração das posições de aminoácido correspondentes na sequência de aminoácido de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 2, a dita composição sendo um produto destinado ao consumidor.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito material auxiliar compreende um ou mais selecionados a partir de: (a) um encapsulado que compreende um perfume, o dito encapsulado compreende, de preferência, uma microcápsula de perfume; (b) um agente de matiz que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em corantes básicos, ácidos, hidrofóbicos, diretos e poliméricos, e conjugados de corante que têm um comprimento de onda de pico de absorção de 550 nm a 650 nm e misturas dos mesmos; (c) tensoativo detergente que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em tensoativos detergentes aniônicos, tensoativos detergentes não iônicos, tensoativos detergentes catiônicos, tensoativos detergentes zwiteriônicos e tensoativos detergentes anfotéricos e misturas dos mesmos; (d) coadjuvante que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em: zeólitos, fosfatos e misturas dos mesmos; (e) um sal de silicato, que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em: silicato de sódio, silicato de potássio e misturas dos mesmos; (f) branqueador que compreende um material selecionado do grupo que consiste em: branqueadores solúveis em água fria e misturas dos mesmos; (g) um polímero de carboxilato que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em: copolímero aleatório de maleato/acrilato ou homopolímero de poliacrilato e misturas dos mesmos; (h) um polímero para liberação de sujeiras que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em: copolímeros de tereftalato e misturas dos mesmos; (i) um polímero celulósico que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em: alquil celulose, alquil alcoxialquil celulose, carboxialquil celulose, alquil carboxialquil celulose e misturas dos mesmos; (j) um catalisador alvejante que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em: cátions de imínio, poliíons de imínio; zwiteríons de imínio; aminas modificadas; óxidos de amina modificados; N-sulfonil iminas; N-fosfonil iminas; N-acil iminas; dióxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas de açúcar cíclico e catalisadores à base de metal de transição ou ligantes para a formação dos mesmos, ou misturas dos mesmos; (k) um ativador de alvejamento que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em: sulfonato de dodecanoíla oxibenzeno, sulfonato de decanoíla oxibenzeno, ácido decanoil oxibenzoico ou sais dos mesmos, sulfonato de 3,5,5-trimetil hexanoiloxibenzeno, tetra-acetil etileno diamina (TAED), sulfonato de nonanoiloxibenzeno (NOBS) e misturas dos mesmos; (l) uma fonte de peróxido de hidrogênio que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em: sais de peridrato inorgânico, incluindo sais de metais alcalinos como sais de sódio de perborato (usualmente mono- ou tetra-hidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sais de persilicato e misturas dos mesmos; (m) um quelante que compreende, de preferência, um material selecionado do grupo que consiste em: DTPA (Ácido dietileno triamina penta-acético), HEDP (Ácido hidroxietano difosfônico), DTPMP (Dietileno triamina penta(ácido metileno fosfônico)), ácido etilenodiaminadissuccínico (EDDS), Hidrato de sal dissódico de ácido 1,2-Diidroxibenzeno-3,5-dissulfônico, derivados dos ditos quelantes; (n) uma enzima adicional selecionada do grupo que consiste em: (a) lipases de primeira lavagem; (b) celulases de limpeza bacteriana; (c) alfa-amilases; e (d) misturas das mesmas; e (o) misturas das mesmas.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita composição é fornecida na forma de uma dose unitária com compartimento único ou múltiplos, de preferência, uma dose unitária de compartimento múltiplo, em que a variante de protease está, de preferência, em um compartimento diferente para qualquer fonte de peróxido de hidrogênio e/ou quelante.
4. Método para tratamento e/ou limpeza de uma superfície, de preferência, uma superfície de tecido, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) colocar em contato a dita superfície com uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em um líquido de lavagem aquoso; (ii) enxaguar e/ou secar a superfície.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o líquido aquoso compreende de 0,1 g/L a 3 g/L de tensoativo.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a temperatura do líquido de lavagem aquoso é de 5 a 25°C.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o líquido de lavagem compreende um líquido de lavagem detergente para lavagem de roupas e apresenta condutividade de 0,1 mS/cm a 3 mS/cm, de 0,3 mS/cm a 2,5 mS/cm, ou mesmo de 0,5 mS/cm a 2 mS/cm.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o líquido de lavagem compreende um líquido de lavagem detergente para lavagem de roupas e apresenta condutividade de acima de 3 mS/cm a 30 mS/cm, de 3,5 mS/cm a 20 mS/cm, ou mesmo de 4mS/cm a 10 mS/cm.
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