CN104204201B

CN104204201B - 用于提高碱性蛋白酶的溶解度的方法

Info

Publication number: CN104204201B
Application number: CN201380014362.XA
Authority: CN
Inventors: 东畑正敏; 西村祐美; 和田恭尚; 佐伯胜久; 奥田光美
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2012-04-10
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2033-04-09
Also published as: WO2013154201A3; EP2836594A2; US20150056681A1; JP2013233141A; WO2013154201A2; US9650623B2; EP2836594B1; JP6067409B2; DK2836594T3; AU2013247640B2; CN104204201A

Abstract

提供在液体洗涤剂中表现出提高的溶解度的碱性蛋白酶。由SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多序列同一性的氨基酸序列组成的突变碱性蛋白酶，其中选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的预定位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基被取代。

Description

用于提高碱性蛋白酶的溶解度的方法

技术领域

本发明涉及用于提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法。

背景技术

蛋白酶已经在工业领域使用很长一段时间，并应用到极为广泛种类的产品，例如包括织物洗涤剂的洗涤剂、纤维改良剂、皮革处理剂、化妆品、沐浴盐、食品改良剂和医药产品。其中，工业上最大量地制造的是用于洗涤剂的蛋白酶。例如，通常已知的是Alcalase、Savinase(注册商标；Novozymes)、Maxacal(注册商标；Genencor)、BLAP(注册商标；Henkel))和KAP(Kao Corp.)。

将蛋白酶添加到洗涤剂的目的是使主要由蛋白质构成的、附着到衣物材料上的污渍分解为低分子物质，从而加速表面活性剂的增溶。然而，污渍实际上是复合物，其不仅含有蛋白质，而且含有多个组分，包括组合的有机物质和无机物质(例如源自皮脂的脂质和固体颗粒)。然后，已经开发出对复合污渍(即不仅含有蛋白质，而且含有皮脂和其他物质)表现出优异洗涤性能的分子量为约43,000的碱性蛋白酶并申请了专利(参见专利文件1)。该碱性蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶(其为常规已知的源自芽孢杆菌属细菌的丝氨酸蛋白酶)不同，具有不同的分子量、初级结构和酶学性质，并且与枯草杆菌蛋白酶尤其不同的是碱性蛋白酶具有极强的抗氧化性。因此，提议将碱性蛋白酶分类到新的枯草杆菌蛋白酶亚族中(非专利文件1)。

洗涤剂可基于其形式而分为粉末洗涤剂和液体洗涤剂。液体洗涤剂与粉末洗涤剂相比具有优异的溶解性。液体洗涤剂具有优点，因为未稀释的液体洗涤剂可以直接施用于污渍上。另外，近来，通过使用一半量而与常规液体洗涤剂起等同作用的液体洗涤剂(所谓的浓缩液体洗涤剂)已市售可得。由于这样的浓缩液体洗涤剂包含在小容器内，其不需要大的储存空间或大量用于运输的燃料。除了这些优点之外，基于洗涤机制的彻底重新考虑，一些产品显示出改善的漂洗性能。以这种方式，可以减少洗衣所需的时间，并且可以节省所需的水。

为了恒定地保持含酶液体洗涤剂的预定的酶活性，需要使液体洗涤剂中溶解的酶例如蛋白酶稳定。此外，为了增强洗涤剂的去污力，期望的是将酶尽可能多地加入到洗涤剂中。然而，众所周知，技术上难以稳定地将酶与液体洗涤剂混合。例如，在常温下将酶储存在液体中容易引起蛋白质的变性。此外，表面活性剂、脂肪酸、溶剂和其他物质包含在液体洗涤剂中并且其pH为弱碱性。因此，液体洗涤剂对于酶是极其严酷的环境条件。此外，蛋白酶是蛋白水解酶。因为该特征，蛋白酶遭受自身消化，这进一步使得难以将蛋白酶稳定地储存在液体洗涤剂中。此外，浓缩液体洗涤剂(与常规液体洗涤剂相比是浓缩的)的低水含量使得难以溶解大量的酶。

作为在液体洗涤剂中稳定地保持酶活性的技术，已知的是添加酶稳定剂，例如钙离子、硼砂、硼酸、硼化合物、羧酸如甲酸、和多元醇。此外，已经研究了通过抑制蛋白酶活性来克服自身消化。已经报道了通过4-取代的苯基硼酸(专利文件2)和通过某种肽醛和硼组合物(专利文件3)可逆抑制蛋白酶而使蛋白酶稳定的方法。而且，据报道，用右旋糖酐化学改性的蛋白酶的稳定性可以在含有表面活性剂的水溶液中得到改善(非专利文件2)。此外，关于表面活性剂稳定性提高的蛋白酶突变体也是已知的(专利文件4至6)。

相比之下，目前还没有开发出用于提高酶关于液体洗涤剂的溶解度的技术。

引用列表

专利文件

[专利文件1]WO 99/18218A

[专利文件2]JP-A-11-507680

[专利文件3]JP-A-2000-506933

[专利文件4]JP-A-2009-034062

[专利文件5]JP-A-2009-034063

[专利文件6]WO 2010/126156A

非专利文件

[非专利文件1]Saeki等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,279,313-319,2000.

[非专利文件2]Cosmetics&Toiletries magazine,111,p79-88,1996.

发明内容

更具体地，在一个实施方式中，本发明提供提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法，该方法包括，在由SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中，将选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表1-1和表1-2的列(i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基用表1-1和表1-2的列(ii)中所述的氨基酸残基取代。

[表1-1]

	(i)位置	(ii)氨基酸残基
			(A)	405	亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸
(B)	81	亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺
			(C)	40	异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸
(D)	191	亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或色氨酸
			(E)	59	缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸
(F)	11	甘氨酸、天冬酰胺或丝氨酸
			(G)	16	异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸
(H)	20	丙氨酸
			(I)	22	色氨酸
(J)	23	天冬酰胺
			(K)	37	苏氨酸
(L)	41	异亮氨酸
			(M)	52	甘氨酸或丝氨酸
(N)	53	丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸
			(O)	56	缬氨酸
(P)	60	苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸
			(Q)	63	天冬氨酸或亮氨酸
(R)	80	丙氨酸或组氨酸
			(S)	82	谷氨酰胺
(T)	91	半胱氨酸
			(U)	100	苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸
(V)	101	苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸
			(W)	109	苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸
(X)	113	亮氨酸或色氨酸
			(Y)	120	苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸或酪氨酸
(Z)	135	亮氨酸
			(AA)	140	苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸
(AB)	151	苯丙氨酸
			(AC)	166	苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸
(AD)	194	酪氨酸
			(AE)	200	色氨酸
(AF)	204	异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸
			(AG)	212	亮氨酸、缬氨酸或色氨酸

[表1-2]

	(i)位置	(ii)氨基酸残基
			(AH)	233	异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸
(AI)	238	亮氨酸
			(AJ)	243	异亮氨酸、亮氨酸或酪氨酸
(AK)	246	苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸
			(AL)	275	苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸
(AM)	277	苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸
			(AN)	297	苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸
(AO)	326	色氨酸
			(AP)	330	苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸
(AQ)	332	甘氨酸、苏氨酸或缬氨酸
			(AR)	334	亮氨酸
(AS)	342	谷氨酸、亮氨酸、苏氨酸或色氨酸
			(AT)	343	苏氨酸
(AU)	357	亮氨酸
			(AV)	359	苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甘氨酸
(AW)	361	异亮氨酸、缬氨酸或色氨酸
			(AX)	376	色氨酸
(AY)	378	亮氨酸或色氨酸
			(AZ)	385	甲硫氨酸、脯氨酸或酪氨酸
(BA)	386	丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸
			(BB)	387	苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或色氨酸
(BC)	390	苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸
			(BD)	393	谷氨酰胺
(BE)	396	甘氨酸
			(BF)	403	赖氨酸或苏氨酸
(BG)	406	苯丙氨酸、缬氨酸或色氨酸
			(BH)	407	半胱氨酸或甘氨酸
(BI)	408	异亮氨酸、天冬酰胺、色氨酸或酪氨酸
			(BJ)	409	色氨酸或酪氨酸
(BK)	411	丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸
			(BL)	427	缬氨酸
(BM)	433	亮氨酸

在另一个实施方式中，本发明提供由SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的突变碱性蛋白酶，其中选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表2-1和表2-2的列(i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基是表2-1和表2-2的列(ii)中所述的氨基酸残基。

[表2-1]

	(i)位置	(ii)氨基酸残基
			(A’)	405	亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸
(B’)	81	亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺
			(C’)	40	异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸
(D’)	191	亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或色氨酸
			(E’)	59	缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸
(F’)	11	甘氨酸、天冬酰胺或丝氨酸
			(G’)	16	亮氨酸或色氨酸
(H’)	20	丙氨酸
			(I’)	22	色氨酸
(J’)	23	天冬酰胺
			(K’)	37	苏氨酸
(L’)	41	异亮氨酸
			(M’)	52	甘氨酸或丝氨酸
(N’)	53	丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸
			(O’)	56	缬氨酸
(P’)	60	苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸
			(Q’)	63	天冬氨酸或亮氨酸
(R’)	80	丙氨酸或组氨酸
			(S’)	91	半胱氨酸
(T’)	100	苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸
			(U’)	109	苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸
(V’)	113	亮氨酸或色氨酸
			(W’)	120	苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸或酪氨酸
(X’)	135	亮氨酸
			(Y’)	140	苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸
(Z’)	151	苯丙氨酸
			(AA’)	166	苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸
(AB’)	200	色氨酸
			(AC’)	204	亮氨酸或甲硫氨酸
(AD')	212	亮氨酸、缬氨酸或色氨酸
			(AE’)	233	异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸
(AF’)	238	亮氨酸
			(AG’)	243	异亮氨酸、亮氨酸或酪氨酸

[表2-2]

在另一个实施方式中，本发明提供编码突变碱性蛋白酶的基因。

在另一个实施方式中，本发明提供包括该基因的重组载体。

在另一个实施方式中，本发明提供包括该重组载体的转化体。

在另一个实施方式中，本发明提供通过使用该转化体产生突变碱性蛋白酶的方法。

在另一个实施方式中，本发明提供包括突变碱性蛋白酶的液体洗涤剂组合物。

具体实施方式

在本说明书中，“氨基酸残基”是指构成蛋白质的20种氨基酸残基中的任何一种，包括丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。

在本说明书中，“(氨基酸序列的)同一性”是指当对两个氨基酸序列进行比对以获得最大同一性时，在两个氨基酸序列中出现相同氨基酸残基的位置数目相对于全长氨基酸残基的数目的比值(％)。更具体地，该比值可根据Lipman-Pearson方法计算(Science,227,1435,(1985))并经由基因信息处理软件Genetyx-Win(版本5.1.1；Software Development)的同源性分析(同源性搜索)程序通过将用以比较的单元尺寸(ktup)设定为2而计算获得。

本发明涉及提供用于提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法以及在液体洗涤剂中表现出提高的溶解度的突变碱性蛋白酶。本发明还涉及提供包括碱性蛋白酶突变体的液体洗涤剂组合物。

本发明的发明人发现，具有约43,000分子量的碱性蛋白酶KP43在液体洗涤剂中的溶解度通过将预定的氨基酸残基用另一氨基酸残基取代而被提高。

根据本发明，可以提供易溶于液体洗涤剂中的碱性蛋白酶。本发明的碱性蛋白酶突变体在液体洗涤剂中、特别是在浓缩液体洗涤剂中具有提高的溶解度，并且可以以较大的量添加到这些洗涤剂中。因此，包括本发明的碱性蛋白酶的液体洗涤剂与常规液体洗涤剂相比具有更高的酶活性，并且可以表现出高去污力。

本发明提供用于提高碱性蛋白酶的溶解度的方法。本发明方法期望的碱性蛋白酶是由SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶。在本说明书中，这些有时各自被称为“亲代碱性蛋白酶”。换句话说，在本说明书中，“亲代碱性蛋白酶”是将要通过对其氨基酸残基提供预定的突变而被修饰成表现出提高的溶解度的突变碱性蛋白酶的碱性蛋白酶。

作为由SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列组成的亲代碱性蛋白酶，例如，可提到源自KP43[芽孢杆菌属(Bacillus sp.)KSM-KP43(FERM BP-6532)]的碱性蛋白酶(国际公开第WO99/18218A号)。

作为由与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的亲代碱性蛋白酶，提到具有与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列不同但与SEQ IDNo:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多、优选地85％或更多、更优选地90％或更多、进一步优选地95％或更多、进一步更优选地97％或更多、还优选地97.5％或更多、还更优选地98％或更多、并且还进一步优选地99％或更多的序列同一性的氨基酸序列的碱性蛋白酶；以及通过在SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列中缺失、取代或***一个至数个氨基酸而制备的碱性蛋白酶。在本说明书中，术语“一个至数个”是指1至40、优选1至20、并且更优选为1至10的数目。

由与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的亲代碱性蛋白酶的实例包括蛋白酶KP9860[源自芽孢杆菌属KSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218，GenBank登录号AB046403]；蛋白酶E-1[源自芽孢杆菌No.D-6(FERM P-1592)，JP-A-49-71191，GenBank登录号AB046402]；蛋白酶Ya[源自芽孢杆菌属Y(FERM BP-1029)，JP-A-61-280268，GenBank登录号AB046404]；蛋白酶SD521[源自芽孢杆菌SD521(FERM P-11162)，JP-A-3-191781，GenBank登录号AB046405]；蛋白酶A-1[源自NCIB12289，WO88/01293，GenBank登录号AB046406]；蛋白酶A-2[源自NCIB12513，WO98/56927]；和蛋白酶9865[源自芽孢杆菌属KSM-9865(FERM P-18566)，GenBank登录号AB084155]。

由与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的亲代碱性蛋白酶的其它实例包括通过在源自KP-43菌株的碱性蛋白酶中引入JP-A-2002-218989、JP-A-2002-306176、JP-A-2003-125783、JP-A-2004-000122、JP-A-2004-057195、JP-A-2004-0305175、JP-A-2004-305176、JP-A-2006-129865、JP-A-2008-212084、JP-A-2009-034063、JP-A-2009-034062、JP-A-2010-273672或JP-A-2010-273673中所述的至少一种突变而制备的碱性蛋白酶突变体。

优选地，在由与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的亲代碱性蛋白酶中，至少与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的30位相对应的氨基酸残基是天冬氨酸，与其68位相对应的氨基酸残基是组氨酸并且与其255位相对应的氨基酸残基是丝氨酸。估计这些氨基酸残基对于碱性蛋白酶是必需氨基酸(Saeki等人,Journal of bioscience and Bioengineering,103,501-508,2007)。

更优选地，在由与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的亲代碱性蛋白酶中，在与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表3的以下列(i)中所述的每个位置相对应的位置处的氨基酸残基是表3的列(ii)中所述的氨基酸残基。在表3的以下列(i)中指出的位置是上述的亲代碱性蛋白酶之间高度保守的氨基酸残基的位置(Saeki等人,Journal of bioscience and Bioengineering,103,501-508,2007)，前述专利文件中所述的氨基酸残基和本发明的氨基酸残基的位置不包括在其中。

[表3]

	(i)位置	(ii)氨基酸		(i)位置	(ii)氨基酸
						(a)	10	丙氨酸	(y)	161	甘氨酸
(b)	18	甘氨酸	(Z)	162	天冬酰胺
						(c)	21	甘氨酸	(aa)	164	甘氨酸
(d)	26	缬氨酸	(ab)	173	脯氨酸
						(e)	27	丙氨酸	(ab)	182	缬氨酸
(f)	28	缬氨酸	(ad)	183	甘氨酸
						(g)	30	天冬氨酸	(ae)	184	丙氨酸
(h)	32	甘氨酸	(af)	203	丙氨酸
						(i)	64	天冬氨酸	(ag)	206	丝氨酸
(j)	68	组氨酸	(ah)	209	甘氨酸
						(k)	69	甘氨酸	(ai)	223	脯氨酸
(l)	70	苏氨酸	(aj)	224	甘氨酸
						(m)	72	缬氨酸	(ak)	225	苏氨酸
(n)	73	丙氨酸	(al)	229	丝氨酸
						(o)	74	甘氨酸	(am)	248	酪氨酸
(p)	85	甘氨酸	(an)	254	苏氨酸
						(q)	87	丙氨酸	(ao)	255	丝氨酸
(r)	88	脯氨酸	(ap)	258	苏氨酸
						(s)	92	亮氨酸	(aq)	259	脯氨酸
(t)	118	丙氨酸	(ar)	261	缬氨酸
						(u)	129	丝氨酸	(as)	262	丙氨酸
(v)	131	甘氨酸	(at)	263	甘氨酸
						(w)	145	缬氨酸	(au)	266	丙氨酸
(x)	159	丙氨酸	(av)	289	亮氨酸

或者，具有以下由SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶所具有的酶性质中的任何一种的碱性蛋白酶更优选作为本发明的亲代碱性蛋白酶。1)表现出抗氧化性，在碱性条件(pH 8或更高)下表现出活性并是稳定的。本文短语“表现出抗氧化性”意指在20℃于50mM过氧化氢(含有5mM氯化钙)溶液(20mM Britton-Robinson缓冲液，pH 10)中孵育碱性蛋白酶20分种之后表现出至少50％的残余碱性蛋白酶活性(合成底物方法)。2)在50℃、pH 10处理碱性蛋白酶10分钟后表现出80％或更多的残余活性。3)被二异丙基氟磷酸(DFP)和苯甲烷磺酰氟(PMSF)抑制。4)具有由SDS-PAGE测定的43,000±2,000的分子量。

在本发明的方法中，碱性蛋白酶的溶解度通过将亲代碱性蛋白酶中目标位置处的氨基酸残基用另一氨基酸残基取代而提高。为了更具体地描述，在由SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中，以下表4-1至4-3中所述的位置处的至少一个氨基酸残基被表中示出的突变后的氨基酸残基取代。或者，在由与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中，在与以下表4-1至4-3中所述的位置相对应的位置处的至少一个氨基酸残基被表中示出的突变后的氨基酸残基取代。具有以上氨基酸取代的突变碱性蛋白酶可以通过本发明的方法获得。与亲代碱性蛋白酶相比，突变碱性蛋白酶在液体洗涤剂、优选地浓缩液体洗涤剂中表现出碱性蛋白酶活性和提高的溶解度。

[表4-1]

[表4-2]

[表4-3]

在本发明的方法中，亲代碱性蛋白酶中待被取代的氨基酸残基的位置优选包括选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的405位、81位、40位、191位和59位的至少一个位置；更优选地包括上述位置中的至少两个；并且进一步优选地包括上述位置中的至少三个。

另外优选地，待被取代的位置包括405位和81位、40位或191位的至少一个组合；并且更优选地包括405位和81位，和40位、191位或59位的组合。还更优选地，所有的405位、81位、40位、191位和59位都被取代。

在与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列中，待被取代的位置优选包括选自与SEQ ID No:2的405位、81位、40位、191位和59位相对应的位置的至少一个位置；更优选地包括上述位置中的至少两个；并且进一步优选地包括上述位置中的至少三个。

另外优选地，待被取代的位置包括与405位相对应的位置以及与81位、191位和40位中的任何一个相对应的位置的至少一个组合；并且更优选地包括与405位和81位相对应的位置以及与40位、191位和59位中的任何一个相对应的位置的组合。还更优选地，与405位、81位、40位、191位和59位相对应的所有位置都被取代。

除405位、81位、40位、191位和59位或与其相对应的位置的单取代、双或多取代之外，表4-1至表4-3中示出的其他位置或与其相对应的位置的氨基酸残基也可被取代。

在405位或与其相对应的位置处取代的氨基酸残基优选为亮氨酸或色氨酸；亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或色氨酸优选在81位或与其相对应的位置；异亮氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸优选在40位或与其相对应的位置；亮氨酸或缬氨酸优选在191位或与其相对应的位置；并且缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸优选在59位或与其相对应的位置。

在说明书中，“相对应位置处的氨基酸残基”通过使用已知的算法和序列比对将所需氨基酸序列与基准序列(SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列)比较使得各个独自的碱性蛋白酶的氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基指示最大同源性而进行识别。通过经这样的方法进行碱性蛋白酶的氨基酸序列的比对，即使氨基酸序列具有***或缺失，也可以确定各个独自的碱性蛋白酶的序列中同源氨基酸残基的位置。比对可手动进行，例如，基于以上提及的Lipman-Pearson方法；然而，可通过使用Clustal W多重比对程序(Thompson,J.D.等人,(1994)Nucleic Acids Res.22,p.4673-4680)缺省(by default)进行。Clustal W多重比对程序可从网站上获得：例如，European Bioinformatics Institute：(EBI,[www.ebi.ac.uk/index.html])和DNA Data Bank of Japan(DDBJ,[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])，由National Institute of Genetics管理。

如果需要，本领域技术人员可对以上获得的比对进行微调以便获得最佳比对。这样的最佳比对优选在考虑氨基酸序列的相似性和间隙***的频率的情况下来确定。氨基酸序列的相似性是如下所指。当比对两个氨基酸序列时，在两个序列中存在相同或类似氨基酸残基的位置的数目与全长氨基酸残基的数目的比值(％)称为相似性。类似氨基酸残基是指构成蛋白质的20种氨基酸中的在极性和电荷方面彼此具有类似性质的(更具体地能够引起保守性取代)的氨基酸残基。本领域技术人员众所周知的这样的类似的氨基酸残基的群组，例如但不限于，精氨酸和赖氨酸或谷氨酰胺；谷氨酸和天冬氨酸或谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸或丙氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺或精氨酸；以及亮氨酸和异亮氨酸。

通过上述比对而与基准序列的任意位置相对应的位置对齐的所需氨基酸序列的氨基酸残基的位置被视为与该任意位置“相对应的位置”。该氨基酸残基被称为“相对应位置处的氨基酸残基”。

更具体地，根据以上方法，可以指定以下的相对应位置处的氨基酸残基：(a)405位处的氨基酸残基(天冬酰胺残基)，(b)81位处的氨基酸残基(丝氨酸残基)，(c)40位处的氨基酸残基(丝氨酸残基)，(d)191位处的氨基酸残基(丝氨酸残基)以及(e)59位处的氨基酸残基(苏氨酸残基)，例如，在SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列中，如蛋白酶KP9860中的(a)405位处的天冬酰胺残基，(b)81位处的丙氨酸残基，(c)40位处的丝氨酸残基在，(d)191位处的丝氨酸残基以及(e)59位处的苏氨酸残基。

蛋白酶KP43的氨基酸序列(SEQ ID No:2)的(a)405位、(b)81位、(c)40位、(d)191位、(e)59位的相对应位置以及以上提及的蛋白酶KP9860、蛋白酶9865、蛋白酶E-1、蛋白酶Ya、蛋白酶SD521、蛋白酶A-1以及蛋白酶A-2的与其相对应的位置处的氨基酸残基的具体实例在下文示出(表5)。这些位置处的氨基酸残基是高度保守的或作为类似氨基酸残基保守的。

[表5]

此外，例如，在具有***到SEQ ID No:2所表示的碱性蛋白酶的133位与134位之间的单一氨基酸残基的突变碱性蛋白酶中，如上述JP-A-2006-129865中所述，与SEQ ID No:2序列的134位的下游相对应的位置经一个残基的***而移动。

由此识别的“相对应的位置”显示出较高的氨基酸序列同一性，并且预测其三维位置在碱性蛋白酶蛋白质之间是保守的。因此，相对应位置中存在的氨基酸残基的相同突变影响相同的特定蛋白酶功能。

除表4-1至表4-3中所述的位置或与其相对应的位置的氨基酸残基的取代之外，由本发明方法获得的碱性蛋白酶突变体还可任选在另一位置处具有突变(例如，缺失、取代、添加、***)，只要不防止提高液体洗涤剂中的溶解度的效果即可。该突变可以是天然发生的或人工引入的突变。

在本发明的方法中，作为取代碱性蛋白酶的氨基酸残基的方法，可使用本领域中已知的各种诱变技术。例如，在编码亲代碱性蛋白酶的氨基酸序列的碱性蛋白酶基因(在下文中称为亲代碱性蛋白酶基因)内，编码待被取代的氨基酸残基的核苷酸序列是通过用编码由取代引入的所需氨基酸残基的核苷酸序列进行取代而突变的；并且，由突变基因表达突变碱性蛋白酶，以获得具有氨基酸残基被所需氨基酸残基取代的氨基酸序列的突变碱性蛋白酶。

例如，可基于PCR扩增使用亲代碱性蛋白酶基因作为模板DNA以及经各种类型的DNA聚合酶对其进行扩增，通过本领域技术人员已知的各种定点诱变方法来进行所需突变向亲代碱性蛋白酶基因中的引入。定点诱变可通过合适的方法诸如反向PCR方法和退火方法(由Muramatsu等人编辑的"Revised 4th Edition,New Gene Engineering Handbook"，由Yodosha公布，82-88页)来进行。如果需要，可使用来自Stratagene和其他公司的市售定点诱变试剂盒，诸如QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit、QuickChangeMulti Site-Directed Mutagenesis Kit。

向亲代碱性蛋白酶基因中的定点诱变最通常可通过使用含有核苷酸突变的突变引物来进行。这样的突变引物可以设计成，该突变引物可用含有编码待通过亲代碱性蛋白酶基因中的取代而突变的氨基酸残基的核苷酸序列的区域进行退火，并且该突变引物含有编码待通过取代引入的氨基酸残基的核苷酸序列(密码子)。编码待通过取代突变的氨基酸残基和待通过取代引入的氨基酸残基的核苷酸序列(密码子)可由本领域技术人员基于一般的操作方案和其他操作方案适当地识别和选择。

在本发明中，可使用SOE(重叠延伸剪接)-PCR(Horton R.M.等人,Gene(1989)77(1),61-68页)方法，其中含有待引入的核苷酸突变的两个彼此互补的突变引物分别用于扩增突变位点的上游侧和下游侧的DNA片段，其被连接成一个片段。在实施例中更具体地描述使用SOE-PCR方法引入突变的工序(稍后描述)。

可由细菌诸如如上所述的芽孢杆菌属KSM-KP43(FERM BP-6532)、芽孢杆菌属KSM-KP9860(FERM BP-6534)、芽孢杆菌No.D-6(FERM P-1592)、芽孢杆菌属Y(FERM BP-1029)、芽孢杆菌SD521(FERM P-11162)和芽孢杆菌属KSM-9865(FERM P-18566)或其突变体通过根据常规方法提取基因组DNA或通过提取RNA并根据逆转录合成cDNA而制备包括亲代碱性蛋白酶基因的模板DNA。或者，基于亲代碱性蛋白酶的氨基酸序列，可合成相应的核苷酸序列并将其用作模板DNA。

基因组DNA可由上述芽胞杆菌属菌株通过例如Pitcher等人，Lett.Appl.Microbiol.,1989,8:p.151-156中所述的方法制备。包括亲代碱性蛋白酶基因的模板DNA可通过将从基因组DNA获得的包括亲代碱性蛋白酶基因的cDNA或DNA片段***到合适的载体中来制备。

引物可以通过已知的寡核苷酸合成方法诸如亚磷酰胺法(Nucleic AcidsResearch,17,7059-7071,1989)来制备。这样的引物合成可通过使用例如市售的寡核苷酸合成仪(例如，由ABI制造)来进行。使用包括突变引物和作为模板DNA的亲代碱性蛋白酶基因的引物组，进行如上所述的定点诱变，以获得所需突变引入其中的突变碱性蛋白酶基因。本发明还涉及由此获得的突变碱性蛋白酶基因。注意，本发明的“突变碱性蛋白酶基因”是指编码突变碱性蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸片段(包括例如DNA、mRNA和人工核酸)。除开放阅读框(ORF)之外，根据本发明的“基因”还可包含另一核苷酸序列例如非翻译区(UTR)。

所获得的突变碱性蛋白酶基因根据常规方法***到载体中并连接。以这种方式，可制备重组载体。本发明中所用的载体没有特别限制，并且可以使用任何载体，例如质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒、YAC载体和穿梭载体。作为这样的载体，虽然它不受限制，但是更优选能够在细菌中例如在芽孢杆菌属细菌中扩增的载体，并且进一步优选能够诱导引入基因在芽孢杆菌属细菌中的表达的表达载体。其中，在芽孢杆菌属细菌和另一有机体中均可复制的穿梭载体可更优选地用于通过重组技术产生突变碱性蛋白酶。优选载体的实例包括但不限于，穿梭载体例如pHA3040SP64(稍后描述)、质粒pHSP64R或pASP64(JP-B-3492935)、pHY300PLK(能够同时转化大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的表达载体；Ishikawa,H.和Shibahara,H.,Jpn.J.Genet,(1985)60,p.235-243)和pAC3(Moriyama,H.等人,Nucleic Acids Res.(1988)16,p.8732)；可用于转化芽孢杆菌细菌的质粒例如pUB110(Gryczan,T.J.等人,J.Bacteriol.(1978)134,p.318-329)和pTA10607(Bron,S.等人,Plasmid,18(1987)p.8-15)；以及能够向重组蛋白质提供分泌信号的分泌载体(Yamane等人,"Fusion Protein by Bacillus subtilis SecretionVector",Starch Science,34.(1987),p.163-170)。此外，可使用源自大肠杆菌的质粒(例如，pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19和pBluescript)。

为了通过重组技术产生突变碱性蛋白酶，待使用的载体优选是表达载体。如果需要，表达载体可含有，宿主有机体中表达必需的元件(如转录启动子、终止子和核糖体结合位点)之外的有用序列，例如选择标记基因、包括多接头和增强子的顺式元件、聚A添加信号和核糖体结合序列(SD序列)。

转化体可通过使用包括突变碱性蛋白酶基因的重组载体来制备。在本发明中，根据本发明的包括突变碱性蛋白酶基因的重组载体(具体地，重组表达载体)被引入到宿主细胞中以制备转化体(转化的细胞)，其被培养于用于诱导重组蛋白表达的条件以产生突变碱性蛋白酶。

作为待引入重组载体的宿主细胞，可使用微生物包括细菌例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌以及酵母细胞。除此之外，可使用任何细胞例如昆虫细胞和动物细胞(例如，哺乳动物细胞)和植物细胞。例如，在本发明中，使用芽孢杆菌属细菌例如枯草芽孢杆菌是优选的。

对于转化，例如，可以使用已知的转化技术，例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法、粒子枪法和PEG法。例如，作为可用于芽孢杆菌细菌的转化方法，提到感受态细胞转化方法(Bott.K.F.和Wilson,G.A.,J.Bacteriol.(1967)93,1925)、电穿孔方法(Brigidi.P.等人,FEMS Microbiol.Lett.(1990)55,135)、原生质体转化方法(Chang,S.和Cohen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,(1979)168,p.111-115)和Tris-PEG方法(Takahashi W.等人,J.Bacteriol.(1983)156,p.1130-1134)。

用于产生重组蛋白的转化体可以按照本领域技术人员已知的一般方法培养。作为用于培养例如使用微生物例如大肠杆菌和酵母细胞作为宿主的转化体的培养基，可以使用天然培养基或合成培养基，只要该培养基含有碳源、氮源、无机盐和宿主微生物可以利用的其他物质并且转化体可有效地培养于该培养基中。根据选择标记物(如果使用的话)的类型，可以向该培养基中加入例如氨苄青霉素和四环素。在培养使用诱导型启动子通过表达载体转化的微生物的过程中，可向培养基中加入需要的诱导物。为了更具体地描述，在培养例如使用Lac启动子通过表达载体转化的细菌的过程中，例如，可向培养基中加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)。在培养使用trp启动子通过表达载体转化的微生物的过程中，例如，可向培养基中加入吲哚乙酸(IAA)。虽然培养条件没有特别限定，优选在适用于转化用宿主有机体的条件下进行培养。例如，为了培养枯草芽孢杆菌转化体以产生重组蛋白，例如，可以使用LB培养基、2×YT培养基、2×L-麦芽糖培养基或CSL发酵培养基。

在本发明的方法中，突变碱性蛋白酶可通过使用无细胞翻译体系由突变碱性蛋白酶基因或其转录产物表达。“无细胞翻译体系”是指体外转录翻译体系或体外翻译体系，其是通过向经机械均质的宿主细胞获得的混悬液中加入试剂例如蛋白质翻译所需的氨基酸而制备的。可以由培养液、均质细胞或无细胞翻译体系通过用于蛋白质纯化的一般方法，例如离心、硫酸铵沉淀、凝胶色谱、离子交换色谱和亲和色谱(这些方法可以单独使用或以适当的组合使用)获得所表达的碱性蛋白酶突变体。通过离心和超滤过滤器而分离或浓缩的溶液例如培养物上清液和裂解物上清液可以直接用作粗酶溶液。如果所表达的突变碱性蛋白酶不被分泌出细胞，则可将细胞均质化，以分离和纯化蛋白质。

本发明中使用的操作例如mRNA的制备、cDNA的制备、PCR、RT-PCR、文库的制备、向载体中的连接、细胞的转化、DNA碱基序列的测定、核酸的化学合成、蛋白质N端侧氨基酸序列的测定、突变的诱导和蛋白质的提取可以根据一般操作方案中描述的方法进行。作为这样的操作方案，例如，可提到Sambrook等人，Molecular Cloning,A laboratory manual,(2001)第3版，(Sambrook,J.&Russell,DW.Cold Spring Harbor Laboratory Press)。具体地，对于枯草芽孢杆菌的基因重组实验，例如，可参考枯草芽孢杆菌的基因操作的一般操作方案，例如“7.2Bacillus subtilis system”，“Biochemical Experiment Course,PartII,1.Gene Study Method II”，由Hirofumi Yoshikawa所著，(1986)Tokyo Kagaku Dojin(Tokyo),p.150-169。

与亲代碱性蛋白酶相比，通过本发明方法而由此获得的碱性蛋白酶突变体在液体洗涤剂、优选地浓缩液体洗涤剂中表现出提高的溶解度。因此，本发明还提供通过本发明方法制备的用于提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的突变碱性蛋白酶、编码该突变体的基因(多核苷酸)、包括该基因的载体、包括该载体的转化体和使用该转化体产生突变碱性蛋白酶的方法。

此外，本发明的突变碱性蛋白酶与亲代碱性蛋白酶相比在液体洗涤剂中表现出提高的溶解度。因此，本发明的突变碱性蛋白酶可用作待加入到粉末洗涤剂中的酶，优选可用作待加入到液体洗涤剂中的酶，并且更优选地，可用作待加入到浓缩液体洗涤剂中的酶。包括本发明的突变碱性蛋白酶的液体洗涤剂与常规的液体洗涤剂相比可以包含大量的碱性蛋白酶，因此可比常规的液体洗涤剂具有更高的蛋白酶活性，结果是由于酶可以表现更高的去污力。因此，本申请的发明还提供包括本发明的突变碱性蛋白酶的液体洗涤剂组合物。

在本发明的液体洗涤剂组合物中，本发明的突变碱性蛋白酶的含量没有特别限制，只要该碱性蛋白酶表现出活性即可。含量优选为0.1～25000U/kg洗涤剂组合物，更优选0.1～5000U并且进一步优选0.1～2500U。

碱性蛋白酶活性通过以下方法测量：将1/15M磷酸盐缓冲液pH7.4(0.9mL)和40mMGlt-Ala-Ala-Pro-Leu-对硝基苯胺/二甲基亚砜溶液(0.05mL)加入试管中，并在30℃下保持5分钟。向该混合物中加入酶液(0.05mL)并使其在30℃下反应10分钟。此后，加入5％(w/v)柠檬酸水溶液(2.0mL)以终止反应。420nm处的吸光度由分光光度计测量。本文中，酶的一个单位(U)定义为在上述反应中一分钟内产生1μmol对硝基苯胺的酶量。

本发明的液体洗涤剂组合物含有本发明的碱性蛋白酶突变体之外的表面活性剂和水。作为表面活性剂，可单独或两种或更多种组合使用表面活性剂，例如阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子表面活性剂。

作为非离子表面活性剂，可使用任何非离子表面活性剂，只要其含有液体洗涤剂中通常包含的C8-C22烃基并且C2氧基亚烷基以数摩尔或更多的量加入到该烃基中。例如，提到以下非离子表面活性剂：

R₁O-(AO)m-H(R₁＝C8-C22烃，AO＝C2-C5氧基亚烷基，m＝16-35)[JP-A-2010-275468]；

R₁O-(EO)l-(AO)m-(EO)n-H(R₁＝C8-C18烃，EO＝C2氧基亚烷基，AO＝C3-C5氧基亚烷基，l＝3-30，m＝1-5，l+n＝14-50)[JP-A-2010-265445，JP-A-2011-63784]；

R₁O-(EO)m/(AO)n-H(R₁＝C8-C22烃，EO＝C2氧基亚烷基，AO＝C3-C5氧基亚烷基，m＝10-30，n＝0-5，EO和AO随机或嵌段结合)[JP-A-2010-189551]；

R₁(CO)lO-(EO)m/(AO)n-R₂(R₁＝C8-C22烃，EO＝C2氧基亚烷基，AO＝C3-C5氧基亚烷基，l＝0-1，m＝14-50，n＝1-5，R2＝氢(l＝0)或C1-C3烷基，EO和AO随机或嵌段结合)[JP-A-2010-229385]；

R₁O-(EO)m-(AO)n-H(R₁＝C8-C22烃，EO＝C2氧基亚烷基，AO＝C3-C5氧基亚烷基，m＝15-30，n＝1-5)[JP-A-2010-229387]；

R₁O-(AO)m/(Gly)n-H和/或R₂-COO-(AO)p/(Gly)q-H(R₁＝C8-C22烃基，R₂＝C7-C21烃基，AO＝C2-C3氧基亚烷基，Gly＝甘油基团，m＝0-5，n＝2-10，p＝0-5，q＝2-10，AO和Gly随机或嵌段结合)[JP-A-2010-254881]；

R₁-COO-(PO)m/(EO)n-R₂(R₁＝C7-C21烃基，COO＝羰基氧基，R₂＝C1-C3烷基，PO＝氧基亚丙基，EO＝氧基亚乙基，m＝0.3-5，n＝8-25，PO和EO随机或嵌段结合)[JP-A-2010-265333]；

R₁O-(EO)l-(PO)m-(EO)n-H(R₁＝C8-C20烃，EO＝C2氧基亚烷基，PO＝氧基亚丙基，l>＝1，n>＝1，0<m<l+n，EO和PO嵌段结合)[WO98/24865]；

R₁O-(EO)m-(PO)n-H(R₁＝C10-C16烷基或烯基，EO＝环氧乙烷基团，PO＝环氧丙烷基团，m＝5-15，n＝1-3)[JP-A-8-157867]；

R₁(CO)-(EO)m-OR₂(R₁＝C11-C13直链或支链烷基或烯基，R₂＝C1-C3烷基，EO＝环氧乙烷基团，m＝10-20)[JP-A-2008-7706，JP-A-2009-7451，JP-A-2009-155594，JP-A-2009-155606]；

R₁(CO)-(AO)m-OR₂(R₁＝C9-C13直链或支链烷基或烯基，AO＝C2-C4氧基亚烷基，R2＝C1-C3烷基，m＝5-30)[JP-A-2009-144002，JP-A-2009-173858，JP-A-2010-189612]；以及

脂肪酸烷醇酰胺、脂肪酸烷醇葡糖酰胺和烷基聚葡糖苷。

作为阴离子表面活性剂，提到羧酸盐阴离子表面活性剂、磺酸或硫酸酯阴离子表面活性剂、非皂类阴离子表面活性剂、直链烷基苯磺酸、苯磺酸或其盐、聚氧乙烯烷基硫酸酯盐、α-烯烃磺酸盐、烷基苯磺酸盐、α-磺基脂肪酸盐、脂肪酸皂、磷酸酯盐类表面活性剂、酰基丙氨酸盐、酰基牛磺酸盐、烷基醚羧酸、醇硫酸酯和其他物质。优选地，提到包含具有8至22个碳原子的单一长链烷基的季铵表面活性剂和包含具有8至22个碳原子的单一长链烷基的叔胺。

作为阳离子表面活性剂，例如，提到具有长链烷基的季铵盐、具有单一长链烷基的叔胺、烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐和烷基吡啶盐。作为两性表面活性剂，提到烷基甜菜碱型、烷基酰胺甜菜碱型、咪唑啉型、烷基氨基砜型、烷基氨基羧酸型、烷基酰胺羧酸型、酰胺氨基酸型或磷酸型两性表面活性剂，例如烷基乙酸甜菜碱、烷醇酰胺丙基乙酸甜菜碱、烷基咪唑啉和烷基丙氨酸。优选地，可提到含有具有10至18个碳原子的烷基的磺基甜菜碱(sulfobetaine)或羰基甜菜碱(carbobetaine)。

本发明的液体洗涤剂组合物优选是浓缩液体洗涤剂组合物。在本说明书中，“浓缩液体洗涤剂”可以指包括40质量％或更高浓度的表面活性剂和小于60质量％浓度的水的液体洗涤剂，优选地，包括40～90质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于60质量％浓度的水的液体洗涤剂，更优选地，包括45～90质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于55质量％浓度的水的液体洗涤剂，进一步优选地，包括50～75质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于50质量％浓度的水的液体洗涤剂，并且进一步更优选地，包括50～75质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于30质量％浓度的水的液体洗涤剂。

本发明的液体洗涤剂组合物还可以含有通常用于液体洗涤剂的组分，例如水溶性聚合物、水混溶的有机溶剂、碱剂、螯合试剂、有机酸或其盐、本发明的突变碱性蛋白酶之外的酶、酶稳定剂、荧光剂、防再污染剂(anti-refouling agent)、整理剂、漂白剂如过氧化氢、抗氧化剂、pH调节剂、缓冲剂、防腐剂、香料、盐、醇及糖。

水溶性聚合物的实例包括：聚合物化合物(JP-A-2010-275468，JP-A-10-060496)，其具有(i)包括源自具有2至5个碳原子的环氧化物的聚合单元的聚醚链部分及(ii)包括源自选自丙烯酸、甲基丙烯酸和马来酸中的至少一种不饱和羧酸单体的聚合单元以及接枝结构的聚合物链部分，其中(i)或(ii)用作为主链，而其他的用作为支链；以及水溶性聚合物(JP-A-2009-155606)，其具有对苯二甲酸亚烷基酯单元和/或间苯二甲酸亚烷基酯单元、以及氧基亚烷基单元和/或聚氧基亚烷基单元。

水混溶的有机溶剂的实例包括烷醇的亚烷基二醇、甘油、聚亚烷基二醇、(聚)亚烷基二醇(单或二)烷基醚、烷基甘油基醚和(聚)亚烷基二醇的芳族醚。优选的是具有2至6个碳原子的亚烷基二醇如乙二醇、丙二醇、丁二醇或己二醇，甘油，聚乙二醇单苯醚，乙二醇单苄醚，二乙二醇单苄醚等。在本发明的液体洗涤剂组合物中，水混溶的有机溶剂的含量为1～40质量％，并且优选为1～35质量％。

碱剂的实例包括具有1至3个C2-C4烷醇的烷醇胺如单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、聚氧基亚烷基胺和二甲基氨基丙基胺。优选的是单乙醇胺或三乙醇胺。在本发明的液体洗涤剂组合物中，碱剂的含量为0～20质量％，并且优选为0～10质量％。

作为螯合剂，例如，提到氨基聚乙酸例如次氮基三乙酸、亚氨基二乙酸、乙二胺乙酸、二乙烯三胺五乙酸、乙二醇醚二胺四乙酸、羟乙基亚氨基二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸和黎豆氨酸，或它们的盐；有机酸例如二甘醇酸、氧基二琥珀酸、羧基甲氧基琥珀酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、草酸、苹果酸、氧基二琥珀酸、葡糖酸、羧基甲基琥珀酸和羧基甲基酒石酸，或它们的盐；以及氨基三(亚甲基膦酸)、1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，这些的碱金属或低级胺盐。在本发明的液体洗涤剂组合物中，螯合剂的含量优选为0.1～5质量％，并且更优选为0.1～4质量％。

作为有机酸或其盐，例如，提到多价羧酸，例如饱和脂肪酸、琥珀酸、马来酸、富马酸或其盐；羟基羧酸，例如柠檬酸、苹果酸、乙二醇酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸或其盐。其中，柠檬酸或其盐是更优选的。在本发明的液体洗涤剂组合物中，有机酸或其盐的含量为0～5质量％，并且优选0～3质量％。

防再污染剂和分散剂的实例包括聚丙烯酸、聚马来酸、羧甲基纤维素、具有5000或更大的重均分子量的聚乙二醇、马来酸酐-二异丁烯共聚物、马来酸酐-甲基乙烯基醚共聚物、马来酸酐-乙酸乙烯酯共聚物、萘磺酸酯***缩合产物和JP-A-59-62614的权利要求1至21中所述的聚合物(第1页第3栏第5行至第3页第4栏第14行)。如果它们不适合于共混，则可以不添加它们。

作为防沾色剂，例如，提到聚乙烯吡咯烷酮。其含量优选为0.01～10质量％。

漂白剂的实例包括过氧化氢、过碳酸盐和过硼酸盐。其含量优选为1～10质量％。当使用漂白剂时，可以以0.01～10质量％的量添加如在JP-A-6-316700中所述的四乙酰乙二胺(TAED)和漂白活化剂。

荧光剂的实例包括联苯荧光剂(例如Tinopal CBS-X)和芪荧光剂(例如DM荧光染料)。荧光剂的含量优选为0.001～2质量％。

除本发明的突变碱性蛋白酶之外的其他酶的实例包括其它类型的蛋白酶和水解酶例如纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂酶、过氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸酯裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、其他类型的甘露聚糖酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和转谷氨酰胺酶以及两种或更多种这些酶的混合物。

作为其他组分，例如，可以添加酶稳定剂例如硼化合物、钙离子源(钙离子供应化合物)、双羟基化合物和甲酸；抗氧化剂例如丁基羟基甲苯、二苯乙烯化甲酚，亚硫酸钠和亚硫酸氢钠；增溶剂例如对甲苯磺酸、枯烯磺酸、间二甲苯磺酸、苯甲酸酯(可有效作为防腐剂)、包括石蜡如辛烷、癸烷、十二烷和十三烷的水不混溶的有机溶剂；烯烃例如癸烯和十二碳烯；卤代烷基例如二氯甲烷和1,1,1-三氯乙烷；萜烯例如D-柠檬烯、颜料、香料、抗生素防腐剂和消泡剂例如硅酮。

作为本发明的优选液体洗涤剂组合物，提到JP-A-2010-189551、JP-A-2010-265333、JP-A-2010-275468、WO2010/058832、WO2010/119935或WO2010/137635中实施例中所述的组合物。更具体地，可使用如JP-A-2010-275468中实施例所述的任何液体洗涤剂组合物。作为具体的实例，可提到实施例3中所述的液体洗涤剂组合物，其可通过将酶加入到包括例如66％的表面活性剂(非离子表面活性剂：46％；阴离子表面活性剂：20％)、3％的水溶性聚合物(聚乙二醇(氧化乙烯的平均加成摩尔数：25)、烯丙基醚/丙烯酸＝75/25(质量比)共聚物)、14％的水混溶有机溶剂(二甘醇单丁醚、丙二醇)、5％的碱剂(单乙醇胺)、11％的离子交换水和颜料、香料(组合物C)的组合物中而制备。

例如，以下市售的液体洗涤剂组合物是包括40％或更多表面活性剂的浓缩液体洗涤剂。产品标签中所述的组分将在下文示出。

组合物A(Attack Neo；由Kao Corp.制造)：表面活性剂(非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂：直链烷基苯类，脂肪酸类)74％、稳定剂(丁基卡必醇)、碱剂、分散剂和酶。

组合物B(NANOX；由Lion Corporation制造)：表面活性剂(聚氧乙烯烷基硫酸盐)55％、稳定剂和酶。

本发明的液体洗涤剂组合物优选地用于衣物材料或织物(床单、窗帘、地毯、墙布)，尽管其并不限于这些。因为根据本发明的洗涤剂组合物与常规的洗涤剂组合物相比可含有大量本发明的突变碱性蛋白酶，因此可以提供高的酶去污力。

本发明还包括如实施方式所例示的以下组合物、制造方法、用途或方法。

<1>一种提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法，该方法包括以下步骤，在由SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中，将选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表1-1和表1-2的列(i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基用表1-1和表1-2的列(ii)中所述的氨基酸残基取代。

<2>一种由SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的突变碱性蛋白酶，其中选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表2-1和表2-2的列(i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基是表2-1和表2-2的列(ii)中所述的氨基酸残基。

<3>在上述<1>和<2>中，与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的碱性蛋白酶是与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有优选85％或更多、更优选90％或更多、进一步优选95％或更多、进一步更优选97％或更多、还优选97.5％或更多、还更优选98％或更多、并且还进一步优选99％或更多的同一性的碱性蛋白酶。

<4>在上述<1>至<2>中，与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的碱性蛋白酶优选是由SEQ ID No:2所表示的且具有优选1至40个、更优选1-20个、并且进一步优选1-10个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶。

<5>在上述<1>至<2>中，与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的碱性蛋白酶优选地是选自以下的蛋白酶：

蛋白酶KP9860[源自芽孢杆菌属KSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218，GenBank登录号AB046403]；

蛋白酶E-1[源自芽孢杆菌No.D-6(FERM P-1592)，JP-A-49-71191，GenBank登录号AB046402]；

蛋白酶Ya[源自芽孢杆菌属Y(FERM BP-1029)，JP-A-61-280268，GenBank登录号AB046404]；

蛋白酶SD521[源自芽孢杆菌SD521(FERM P-11162)，JP-A-3-191781，GenBank登录号AB046405]；

蛋白酶A-1[源自NCIB12289，WO88/01293，GenBank登录号AB046406]；

蛋白酶A-2[源自NCIB12513，WO98/56927]；或

蛋白酶9865[源自芽孢杆菌属KSM-9865(FERM P-18566)，GenBank登录号AB084155]；

<6>在上述<1>至<2>中，与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的碱性蛋白酶是通过优选地将SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的195位的酪氨酸用谷氨酰胺取代，将369位的天冬氨酸用天冬酰胺取代，将65位的苏氨酸用脯氨酸取代，将273位的缬氨酸用异亮氨酸取代，将359位的苏氨酸用丝氨酸取代，将387位的丝氨酸用丙氨酸取代，将166位的天冬酰胺用甘氨酸取代，将167位的甘氨酸用缬氨酸取代，将133位的丙氨酸用丝氨酸取代并将134位的缬氨酸用苏氨酸取代，并通过将丝氨酸***到133位与134位之间而获得的碱性蛋白酶；更优选地，是由SEQ ID No:250所表示的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶。

<7>在上述<1>至<6>中，优选地，与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的碱性蛋白酶在与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的30、68和255位相对应的位置处具有以下氨基酸残基：

与30位相对应的位置：天冬氨酸

与68位相对应的位置：组氨酸

与255位相对应的位置：丝氨酸。

<8>在上述<7>中，与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列具有80％或更多同一性的碱性蛋白酶在与SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表3的列(i)中所述的位置相对应的位置处具有表3的列(ii)中所述的氨基酸残基。

<9>在上述<1>至<8>中，优选地，至少一个氨基酸残基包括选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的405位、81位、40位、191位和59位或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个。

<10>在上述<1>至<9>中，优选地，至少一个氨基酸残基包括选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的405位、81位、40位、191位和59位或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少两个。

<11>在上述<1>、<3>至<10>中所述的用于提高碱性蛋白酶的溶解度的方法中，优选地，将选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的405位、81位、40位、191位和59位或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基用下面所述的氨基酸残基取代：

405位或与其相对应的位置：亮氨酸或色氨酸；

81位或与其相对应的位置：亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或色氨酸；

40位或与其相对应的位置：异亮氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸；

191位或与其相对应的位置：亮氨酸或缬氨酸；以及

59位或与其相对应的位置：缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。

<12>在上述<2>至<10>中所述的碱性蛋白酶突变体中，优选地，选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的405位、81位、40位、191位和59位或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基是下面所述的氨基酸残基：

405位或与其相对应的位置：亮氨酸或色氨酸；

40位或与其相对应的位置：异亮氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸；

191位或与其相对应的位置：亮氨酸或缬氨酸；以及

59位或与其相对应的位置：缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。

<13>在上述<1>、<3>至<11>中，液体洗涤剂含有，优选地，40质量％或更高浓度的表面活性剂和小于60质量％浓度的水，更优选地，40～90质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于60质量％浓度的水，进一步优选地，45～90质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于55质量％浓度的水，进一步更优选地，50～75质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于50质量％浓度的水，并且还更优选地，50～75质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于30质量％浓度的水。

<14>一种基因，其编码上述<2>至<10>和<12>中任一项所述的突变碱性蛋白酶或上述<1>至<11>和<13>中任一项所述的表现出提高的溶解度的碱性蛋白酶。

<15>一种包括上述<14>中所述的基因的重组载体。

<16>一种包括上述<17>中所述的重组载体的转化体。

<17>一种使用上述<16>中所述的转化体制造突变碱性蛋白酶的方法。

<18>一种液体洗涤剂组合物，其包括上述<2>至<10>和<12>中任一项所述的突变碱性蛋白酶或上述<1>至<11>和<13>中任一项所述的表现出提高的溶解度的碱性蛋白酶。

<19>在上述<18>中，上述液体洗涤剂组合物包括，优选地，40质量％或更高浓度的表面活性剂和小于60质量％浓度的水，更优选地，40～90质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于60质量％浓度的水，进一步优选地，45～90质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于55质量％浓度的水，进一步更优选地，50～75质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于50质量％浓度的水，并且还更优选地，50～75质量％浓度的表面活性剂和5质量％或更高且小于30质量％浓度的水。

实施例

下文将以实施例的方式更具体地描述本发明。然而，本发明的技术范围不限于这些实施例。

实施例1：突变碱性蛋白酶的制备

下文将通过例如突变体“D11G”的制备作为例子描述本发明用于制备突变碱性蛋白酶的方法，该突变体“D11G”的制备是通过将野生型KP43蛋白酶成熟酶区域的氨基酸序列(SEQ ID No:2)11位的天冬氨酸残基(D11)突变为甘氨酸而进行的。

使用参考例1(2)(稍后描述)中所述的充分稀释的质粒pHA64TSB作为模板、互补退火到起始密码子的上游区域的引物KG24S2(SEQ ID No:3：ATAAGGATCCGTGAGGAGGGAACCGA，具有BamHI位点)、和互补退火到与D11密码子相邻的上游区域的引物D11_R(SEQ ID No:4：CGCTTTGACAATTCCACGCGCAAC)，进行PCR以扩增编码KP43蛋白酶N端区域的DNA序列。然后，使用质粒pHA64TSB作为模板、用于将密码子D11用甘氨酸密码子取代的引物D11G_F(SEQ IDNo:5：GGAATTGTCAAAGCGGGAGTGGCTCAGAGCAGCTAC，其5′侧的一部分互补结合到引物D11_R)、和互补退火到终止密码子的下游区域的引物KG11S(SEQ ID No:6：CCCCTCTAGACGATTACCATATTAATTCCTCTACCC，具有XbaI位点)，进行PCR以扩增编码KP43蛋白酶C端区域的DNA序列。使用获得的编码N端区域的PCR产物和获得的编码C端区域的PCR产物的混合物作为模板，并且使用先前的引物KG24S2和引物KG11S，进行PCR以获得具有KP43蛋白酶突变体全长基因的PCR产物，在该基因中，D11密码子变为甘氨酸密码子。随后，PCR产物通过乙醇沉淀纯化，同时用限制性内切酶BamHI和XbaI消化，并且与参考例1(1)(稍后描述)中所述的基因***/表达载体混合，以通过使用Ligation High(由Toyobo Co.,Ltd.制造)进行连接反应。连接产物通过乙醇沉淀纯化。此后，宿主细菌芽孢杆菌属KSM-9865菌株(FERM P-18566)根据电穿孔方法用该连接产物转化，并且涂抹到含脱脂乳的碱性LB琼脂培养基。几天后，在琼脂培养基中形成菌落。从菌落中，分离具有在脱脂乳上形成斑(plaque)的能力的转化体，以获得产生D11突变为甘氨酸的突变KP43蛋白酶“D11G”的转化体。

相似地，通过使用以下表6-1至表6-13中“突变引物R”列和“突变引物F”列中所述的两种引物分别代替引物D11_R和引物D11G_F来重复相同的操作，以获得产生具有以下表6-1至表6-13中“KP43蛋白酶突变”列中所述突变的突变KP43蛋白酶的转化体。以与参考例1(2)中所述相同的方法培养每种获得的转化体，以获得含蛋白酶突变体的培养物上清液。

实施例2：突变碱性蛋白酶的溶解度的评价

根据参考例2(1)(稍后描述)中所述的方法获得实施例1中所获得的培养物上清液中突变碱性蛋白酶的蛋白质浓度。此外，根据参考例2(2)(稍后描述)中所述的方法，测量以预定量加入有培养物上清液的组合物C的浊度。根据该浊度，得到相对浊度(％)。对于每种碱性蛋白酶突变体，获得相对浊度值(N＝3或更多)，对其取平均并用作每种突变碱性蛋白酶的相对浊度。

结果在表7中示出。每种突变碱性蛋白酶显示出对于亲代碱性蛋白酶(WT)的相对浊度为95％或更低，表明溶解度提高。

实施例3：多重突变体的溶解度的评价

实施例2中发现的用于提高溶解度的突变被多重化，并且对由此获得的多重突变体的效果进行评价。为更具体地解释，从产生实施例2中的表现出提高的溶解度的蛋白酶突变体的宿主细菌中提取质粒。使用该质粒作为模板，以与实施例1中相同的方式引入实施例2中发现的用于提高溶解度的另一突变以形成双重突变体。此外，从产生双重突变体的宿主细菌中提取质粒。使用该质粒作为模板，重复相同的工序以制备三重突变体。关于双重突变体和三重突变体，以与实施例2中相同的工序获得对于亲代碱性蛋白酶(WT)的相对浊度(％)(N＝3或更多的平均值)。结果在表8中示出。

[表8]

突变体	相对浊度(％)
		T59L	68
T59L/S40L	28
		T59L/S40L/N405W	19
T59L/S40L/S191V	17
		T59L/S40L/S81W	14
T59L/S40L/S81L	12

T59L/N405L	47
		T59L/N405L/S81L	30
T59L/N405L/S191L	28
		T59L/N405L/S40L	25

		T59L/S191L	28
T59L/S191L/S40L	21
		T59L/S191L/S81W	21
T59L/S191L/S81L	16

WT	100

实施例4：多重突变体对市售浓缩液体洗涤剂的溶解度的评价。

作为实施例3中构建的多重突变体对每种市售浓缩液体洗涤剂[组合物A：AttackNeo(Kao Corp.)和组合物B：NANOX(lion)，每种组合物都在表9中示出]的溶解度，以与实施例2中相同的方式获得对于亲代碱性蛋白酶(WT)的相对浊度(％)(N＝3或更多的平均值)。将市售的洗涤剂在70℃对洗涤酶灭活8小时之后用于评价。结果在表10中示出。

[表9]

[表10]

实施例5：源自作为亲代蛋白酶的突变KP43蛋白酶的突变碱性蛋白酶的溶解度的评价。

参考JP-A-2002-218989、JP-A-2002-303176、JP-A-2004-000122、JP-A-2004-35176和JP-A-2006-129865的描述，将以下突变相继地引入到KP43蛋白酶(SEQ ID No:2)中以制备KP43蛋白酶突变体(SEQ ID No:250)：

195位的酪氨酸用谷氨酰胺取代(JP-A-2002-218989)；

369位的天冬氨酸用天冬酰胺取代(JP-A-2002-303176)；

65位的苏氨酸用脯氨酸取代，273位的缬氨酸用异亮氨酸取代，359位的苏氨酸用丝氨酸取代，并且387位的丝氨酸用丙氨酸取代(JP-A-2004-000122)；

166位的天冬酰胺用甘氨酸取代，并且167位的甘氨酸用缬氨酸取代(JP-A-2004-35176)。

133位的丙氨酸用丝氨酸取代，134位的缬氨酸用苏氨酸取代，并且丝氨酸***到133位与134位之间(JP-A-2006-129865)。

其中引入有这些突变的KP43蛋白酶突变体(SEQ ID No:250)的氨基酸序列与野生型KP43；WT具有97.5％的同一性。

使用上述突变KP43蛋白酶(mKP43)作为亲代，以与实施例1中相同的方式制备具有提高的溶解度的突变体。更具体地，设计并制备用于亲代蛋白酶的突变引物。使用这些引物，以与实施例1中相同的方式引入突变以制备突变碱性蛋白酶。关于得到的碱性蛋白酶突变体，以与实施例2中相同的工序获得对于亲代碱性蛋白酶(mKP43)的相对浊度(％)(N＝3或更多的平均值)，并且评价在液体洗涤剂中的溶解度。

结果在表11中示出。在突变KP43蛋白酶(mKP43)用作亲代的情况下，证实了与野生型KP43蛋白酶用作亲代的情况下相同的增加突变碱性蛋白酶在液体洗涤剂中溶解度的效果。

[表11]

实施例6：源自作为亲代蛋白酶的突变KP43蛋白酶(mKP43)的碱性蛋白酶多重突变体的溶解度的评价。

结合使用实施例2和实施例5中发现的提高溶解度的突变，并且评价溶解度提高效果。为了更具体地解释，通过使用实施例5中所制备的突变KP43蛋白酶(mKP43、SEQ ID No:250)作为亲代碱性蛋白酶以与实施例3中相同的工序制备如表12中所示的单一突变体、双重突变体、三重突变体、四重突变体和五重突变体。以与实施例2中相同的工序获得每种突变体对于亲代碱性蛋白酶的相对浊度(％)(N＝2或更多的平均值)。结果在表12中示出。

[表12]

突变体	相对浊度(％)
		N405L	74.6
N405L/T59V	61.8
		N405L/T59I/S40F	26.6
N405L/T59I/S40I	29.3
		N405L/T59I/S81W	14.9
N405L/T59V/S40F	24.8
		N405L/T59V/S40I	31.3
N405L/T59V/S81W	21.1
		N405W/S40F/T59I	21.9
N405W/S40F/T59V	30.1
		N405W/S40I/T59I	21.8
N405W/S40I/T59V	22.0
		N405L/T59I/S40F/S191L	10.5
N405L/T59V/S40I/S81L	8.6
		N405L/T59V/S40I/S81Y	11.0
N405L/T59V/S40I/S191L	10.1
		N405W/T59I/S40F/S191L	10.9
N405W/T59I/S40I/S191L	7.9
		N405L/T59V/S40I/S191L/S81L	6.7
N405L/T59V/S40I/S191L/S81P	10.2
		N405L/T59V/S40I/S191L/S81Y	7.8

实施例7：通过加速测试评价源自作为亲代蛋白酶的突变KP43蛋白酶(mKP43)的碱性蛋白酶多重突变体的溶解度

对实施例6中所制备的源自突变KP43蛋白酶(SEQ ID No:250)的多重突变体通过以与实际使用条件更接近的体积使用液体洗涤剂进行加速的沉淀形成测试。为了更具体地解释，将9mL液体洗涤剂(例如，上述组合物C；JP-A-2010-275468的实施例3中所述)放入玻璃瓶(Maruemu第5号螺纹管)中，并且加入适当稀释的碱性蛋白酶多重突变体以便获得0.2～0.4g/L的最终浓度，充分搅拌，气密闭合并在40℃或50℃储存。每周，检查瓶底部存在或不存在沉淀。结果在表13中示出。

[表13]

o:视觉上观察到沉淀

n/o:视觉上观察不到沉淀

实施例8：源自作为亲代蛋白酶的突变KP43蛋白酶(mKP43)的碱性

蛋白酶多重突变体的去污力的评价

对源自作为亲代碱性蛋白酶的突变KP43蛋白酶(mKP43、SEQ ID No:250)的实施例6中制备的多重突变体评价去污力。通过Tergot-O-Meter(由Ueshima Seisakusho Co.,Ltd.制造)进行去污力评价。将液体洗涤剂(例如，JP-A-2010-275468的实施例3中所述的上述组合物C)(350μL)加入到工业水(service-water)(1L)中以获得洗涤液。向其中加入酶以便获得0.0716mg/L的最终浓度。随后，加入事先切割成6×6cm正方形片的染污布EMPA117(由EMPA制造，血液/牛奶/碳)并在20℃下洗涤(80rpm)。在用工业水漂洗染污布片之后，通过色差计(MINOLTA，CM3500d)测量其亮度。基于洗涤前和洗涤后亮度的变化，计算洗涤率(以下公式)。

洗涤率(％)＝(L2-L1)/(L0-L1)×100

L0：原始染污布的亮度

L1：洗涤前染污布的亮度

L2：洗涤后染污布的亮度

在将亲代碱性蛋白酶的洗涤率视作100的基础上，相对洗涤率是突变体的洗涤率。结果在表14中示出。实施例6中所制备的每种突变体表现出与亲代碱性蛋白酶的洗涤率相等的洗涤率。

[表14]

突变体	相对洗涤率(％)
		亲代突变碱性蛋白酶(mKP43)	100.0
N405L/T59V/S40I/S191L	97.7
		N405L/T59V/S40I/S191L/S81L	101.7
N405L/T59V/S40I/S191L/S81P	95.7
		N405L/T59V/S40I/S191L/S81Y	94.9

参考例1：用于制备酶的方法

下文将描述由例如野生型KP43蛋白酶制备酶的方法，将要对该酶进行其在液体洗涤剂中溶解度的评价。

(1)基因***/表达载体的制备

使用市售的穿梭载体pHY300PLK(由Takara Bio Inc.制造)作为模板、引物pHY+1(HindIII)F(ggggAAGCTTCTAGAGATCTGCAGGTCGACGG：SEQ ID NO:251)和引物pHY+3040(HindIII)R(ggggaagcttAAGGTAAAGGATAAAACAGCACAATTCCAAG：SEQ ID NO:252)，借助于PrimeSTAR诱变基础试剂盒(由Takara Bio Inc.制造)进行PCR扩增。将扩增的产物用限制性内切酶HindIII(Roche)消化，通过使用Ligation High(由Toyobo Co.,Ltd.制造)进行分子内环化，并且通过乙醇沉淀进行纯化。宿主细菌芽孢杆菌属KSM-9865菌株(FERM P-18566)根据电穿孔方法用该产物转化，并且涂抹到含脱脂乳的碱性LB琼脂培养基(含有1％Bacto胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、1％脱脂乳、1.5％琼脂、0.05％碳酸钠和15ppm的四环素)。几天后，将琼脂培养基中形成的菌落分离为转化体并且提取质粒。通过使用DNA测序仪Prism3100(由ABI制造)分析全长质粒的序列以确认没有通过PCR错误引入不想要的突变。将该质粒指定为pHA3040。

随后，使用芽孢杆菌属KSM-64(FERM P-10482)的基因组DNA作为模板、引物SP64-F(EcoRI)(gggggaattcGAACAAGTACTTACCATTTTAGAGTC：SEQ ID NO:253)和引物SP64-R(BamHI)(ggggggatccTTATTAAAGTAATTGAATCAAATAGC：SEQ ID NO:254)，进行PCR扩增以获得包括源自芽孢杆菌属KSM-64的内-1,4-β-葡聚糖酶(Genbank登录号M84963)上游的启动子区域的DNA片段。扩增产物和先前构建的pHA3040以适当的量混合，用限制性内切酶EcoRI(Roche)和BamHI(Roche)双重地消化，用Ligation High连接，并通过乙醇沉淀纯化。宿主细菌芽孢杆菌属KSM-9865菌株(FERM P-18566)根据电穿孔方法用该产物转化，并且涂抹到含脱脂乳的碱性LB琼脂培养基上。几天后，将琼脂培养基中形成的菌落分离为转化体并且提取质粒。分析***到多克隆位点内的启动子序列以确认是否没有通过PCR错误引入不想要的突变。该质粒指定为pHA3040SP64(SEQ ID No:255)。其同时用限制性内切酶BamHI和XbaI(Roche)消化以获得基因***/表达载体。

(2)KP43蛋白酶的制备

包括野生型KP43蛋白酶基因序列(SEQ ID No:1)(具有基因上游的BamHI位点、5'端和基因下游的XbaI位点、3'端)的DNA同时用BamHI和XbaI消化，与先前获得的基因***/表达载体混合并且使用Ligation High(由Toyobo Co.,Ltd.制造)进行连接反应。通过乙醇沉淀纯化连接产物，宿主细菌芽孢杆菌属KSM-9865菌株(FERM P-18566)根据电穿孔方法用该连接产物转化，并且涂抹到含脱脂乳的碱性LB琼脂培养基。几天后，从琼脂培养基中出现的菌落中，基于脱脂乳溶斑(dissolution plaque)来分离表现出引入其中的蛋白酶基因的转化体。从转化体提取质粒DNA，并且检查SEQ ID No:1所表示的蛋白酶基因是否正确地***。所得质粒指定为pHA64TSB。

将具有pHA64TSB的KSM-9865菌株转化体接种在5mL种子储备培养基[6.0％(w/v)的聚蛋白胨S、0.1％的酵母提取物、1.0％的麦芽糖、0.02％的硫酸镁·7水合物、0.1％的磷酸二氢钾、0.3％的无水碳酸钠、30ppm的四环素]中并在30℃下振摇培养16小时。随后，向30mL主培养基[8％的聚蛋白胨S、0.3％的酵母提取物、10％的麦芽糖、0.04％的硫酸镁·7水合物、0.2％的磷酸二氢钾、1.5％的无水碳酸钠、30ppm的四环素]中接种种子储备培养液(1％(v/v))并在30℃下振摇培养3天。对通过培养所获得的含KP43蛋白酶的培养液离心以获得培养物上清液。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认包含在培养物上清液中的蛋白质仅为KP43蛋白酶。如果需要，用于脱盐的纯化通过凝胶过滤柱Econopack 10-DG(Biorad)进行。

参考例2：用于评价酶溶解度的方法

(1)用于测量蛋白酶蛋白质量的方法

培养物上清液或脱盐纯化样品中所含的蛋白酶蛋白质的量通过使用蛋白质检定快速试剂盒(由Wako Pure Chemical Industries Ltd.制造)如下测量。更具体地，向96孔板的每个孔中，加入试剂盒的发色液(250μL)，并且混合适当稀释的酶样品(10μL)且在室温下搅拌30分钟。此后，660nm处的吸光度通过酶标仪VersaMax(Molecular Device)测量。根据同时使用试剂盒所附的牛胸腺白蛋白(BSA)标准液制备的校准曲线，计算蛋白酶蛋白质浓度(根据BSA，mg/mL)。

(2)蛋白酶在液体洗涤剂中溶解度的评价

使用含有亲代碱性蛋白酶(野生型KP43；WT)或突变碱性蛋白酶的培养物上清液，评价在液体洗涤剂中溶解度。更具体地，向96孔板的每个孔中，加入150μL液体洗涤剂(例如，前述组合物C；JP-A-2010-275468实施例3中所描述的)。向孔中，加入含有蛋白质浓度不同的碱性蛋白酶的培养物上清液或脱盐的纯化样品(6.5μL)并充分搅拌。在使混合物在室温下静置2小时之后，650nm处的吸光度通过酶标仪VersaMax(Molecular Device)测量。作为空白，测量加有离子交换水而不是培养物上清液的溶液的吸光度。从混合物的吸光度中减去空白的吸光度以获得数值，其测定为浊度(ΔOD650nm)并用作蛋白酶溶解度的指数。基于ΔOD650nm处所获得的值，每种突变体对于亲代碱性蛋白酶(WT)的相对浊度根据以下等式计算。

相对浊度(％)＝(突变体的浊度/突变体的浓度)/(亲代碱性蛋白酶的浊度/亲代碱性蛋白酶的浓度)×100

加有蛋白酶的组合物C的浊度(ΔOD650nm)与组合物的蛋白酶浓度具有比例关系。此外，即使将培养物上清液用作蛋白酶，并且即使使用凝胶过滤纯化样品，也获得相同的比例关系。

参考例3：

用于测量蛋白酶活性的方法

在实施例中，通过以下工序测量所获得的碱性蛋白酶的活性。更具体地，将0.9mL的1/15M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和40mM Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-对硝基苯胺/二甲基亚砜溶液(0.05mL)加入试管中，并在30℃下保持5分钟。向其中加入酶液(0.05mL)且在30℃下进行反应10分钟，此后加入5％(w/v)柠檬酸水溶液(2.0mL)以终止反应。在420nm处的吸光度由分光光度计测量。注意，酶的1单位(U)规定为在上述反应中每分钟产生1μmol对硝基苯胺的酶量。

上文描述了本发明的实施方式。应该理解，本发明将不限制于上文所述的具体实施方式。对于本领域技术人员明显的是，在本发明的范围之内对这些实施方式进行变化或修改。

本说明书中引用的文件和专利申请的全部内容并入本文以供参考。

Claims

1.一种提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法，所述方法包括，在由SEQ IDNO:2所表示的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中，将选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的405位的氨基酸残基用亮氨酸或色氨酸取代。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表1-1的列(i)中所述的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基用表1-1的列(ii)中所述的氨基酸残基取代：

[表1-1]

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一个氨基酸残基包括选自(B)81位、(C)40位、(D)191位和(E)59位的氨基酸残基的至少两个氨基酸残基。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述液体洗涤剂是包括40～90质量％的表面活性剂的浓缩液体洗涤剂。

5.一种突变碱性蛋白酶，其由SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列组成，其中选自SEQ IDNo:2所表示的氨基酸序列的405位的氨基酸残基是亮氨酸或色氨酸。

6.根据权利要求5所述的突变碱性蛋白酶，其中选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表3-1的列(i)中所述的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基是表3-1的列(ii)中所述的氨基酸残基：

[表3-1]

7.根据权利要求6所述的突变碱性蛋白酶，其中所述至少一个氨基酸残基包括选自(B')81位、(C')40位、(D')191位和(E')59位的氨基酸残基的至少两个氨基酸残基。

8.一种编码根据权利要求5至7中任一项所述的突变碱性蛋白酶的基因。

9.一种包括根据权利要求8所述的基因的重组载体。

10.一种包括根据权利要求9所述的重组载体的转化体。

11.一种使用根据权利要求10所述的转化体产生突变碱性蛋白酶的方法。

12.一种包括根据权利要求5至7中任一项所述的突变碱性蛋白酶的液体洗涤剂组合物。