EA017269B1 - ПРОИЗВОДНЫЕ ПИРИМИДИНА И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ КАК ИНГИБИТОРЫ КИНАЗЫ c-kit И PDGFR - Google Patents

Abstract

В изобретении приведены описания нового класса соединений, фармацевтических композиций, включающих такие соединения, и способов применения таких соединений для лечения или предупреждения заболеваний или нарушений, связанных с аномальной или характеризующейся нарушенной регуляцией активностью киназы, в особенности заболеваний или нарушений, которые включают аномальную активацию киназ c-kit, ТРФРРα и ТРФРРβ.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет по предварительной заявке и8 № 60/916035, поданной 4 мая 2007 г. Полное раскрытие этой заявки во всей ее полноте включено в настоящее изобретение в качестве ссылки для всех объектов.

Предпосылки создания изобретения Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому классу соединений, фармацевтическим композициям, включающим такие соединения, и к способам применения таких соединений для лечения или предупреждения заболеваний или нарушений, связанных с аномальной или характеризующейся нарушенной регуляцией активностью киназы, в особенности заболеваний или нарушений, которые включают аномальную активацию киназ с-кй, ТРФРРа и ТРФРР[Ь

Уровень техники

Протеинкиназы представляют собой большую группу белков, которые играют центральную роль в регуляции большого количества клеточных процессов и обеспечивают регулирование клеточных функций. Частичный, неограничивающий перечень этих киназ включает рецепторные тирозинкиназы, такие как киназа рецептора тромбоцитарного фактора роста (ТРФРР или ΡΌΟΡΚ), рецептора фактора роста нервов, 1гкБ, и рецептора фактора роста фибробластов, РОРК3; нерецепторные тирозинкиназы, такие как ЛЫ, и киназы слияния ВСР-ЛЫ. Ьск, Втх и с-згс; и серин/треонинкиназы, такие как киназы, с-РЛР. здк, ΜΑΡ (например, МКК4, МКК6 и т.п.) и 8ΑΡΚ2α и 8ΆΡΚ2β. Аберрантная активность киназ обнаружена при многих патологических состояниях, включая доброкачественные и злокачественные пролиферативные заболевания, а также заболевания, обусловленные неадекватной активацией иммунной и нервной систем.

Новые соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, ингибируют активность одной или большего количества протеинкиназ и поэтому предположительно применимы для лечения связанных с киназами заболеваний.

Краткое изложение сущности изобретения

Первым объектом настоящего изобретения являются соединения формулы I

I в которой Ь обозначает 5-членное гетероарильное кольцо, содержащее 3 атома азота, выбранное из

К₁, Р₂,, и В_2Ь обозначают водород;

В₃ выбран из С₆-С₁₀-арила и 5-15-членного гетероарила, содержащего гетероатом, выбранный из О, N или 8; где указанный арил или гетероарил в качестве Р₃ замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей С;-С₆-алкоксигруппу, С;-С₆-алкоксигруппу, замещенную галогеном, и -Х₂ОВ_5а; где Х₂ выбран из связи и С1-С₄-алкилена и В_5а выбран из водорода и С1-С₆-алкила; и его фармацевтически приемлемые соли.

Вторым объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит соединение формулы I в смеси с одним или большим количеством подходящих инертных наполнителей.

Соединения формулы (I) могут быть использованы для лечения заболевания животного, при котором ингибирование активности киназы, в особенности активности с-кй, ТРФРРа и/или ТРФРРЗ, может предупредить, подавить или облегчить патологию и/или симптоматику заболеваний, путем ведения животному терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Соединения формулы (I) могут быть использованы для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания животного, при котором активность киназы, в особенности активность с-кй, ТРФРРа и/или ТРФРРЗ, способствует патологии и/или симптоматике этого заболевания.

- 1 017269

Подробное описание изобретения

Определения.

Алкил в качестве группы или структурного элемента других групп, например галогензамещенного алкила и алкоксигруппы, может обладать линейной или разветвленной цепью. С1-С4-Алкоксигруппы включают метоксигруппу, этоксигруппу и т.п. Галогензамещенный алкил включает трифторметил, пентафторэтил и т.п.

Арил означает моноциклическую или конденсированную бициклическую ароматическую кольцевую систему, содержащую 6-10 кольцевых атомов углерода. Например,Сб-С₁₀-арил при использовании в настоящем описании включает, но не ограничивается только ими, фенил или нафтил, предпочтительно фенил. Арилен означает двухвалентный радикал, образованный из арильной группы.

Гетероарил означает 5-15-членную ненасыщенную кольцевую систему, содержащую от 1 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из группы, включающей -О-, -Ν=, -ΝΒ-, -С(О)-, -8-, -8(0)- и -8(О)₂-, где В обозначает водород, С₁-С₄-алкил или защитную группу атома азота. Например, С₁-С₁₀-гетероарил (С₁-С₁₀- указывает, что в кольцевой системе содержатся от 1 до 10 атомов углерода) при использовании в настоящем описании включает, но не ограничивается только ими, пиразолил, пиридинил, индолил, тиазолил, 3-оксо-3,4-дигидро-2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-6-ил, фуранил, бензо [Ь]фуранил, пирролил,

1Н-индазолил, имидазо[1,2-а]пиридин-3-ил, оксазолил, бензо [б]тиазол-6-ил, 1Н-бензо[б][1,2,3]триазол-5ил, хинолинил, 2,3-дигидробензофуран-5-ил, 1Н-индолил, 3,4-дигидро-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридинил и 2,3-дигидрофуро[2,3-Ь]пиридинил, 3-оксо-3,4-дигидро-2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-7-ил и т.п.

Циклоалкил означает насыщенную или частично ненасыщенную моноциклическую, конденсированную бициклическую или мостиковую полициклическую кольцевую систему, содержащую указанное количество кольцевых атомов. Например, С3-С10-циклоалкил включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.

Гетероциклоалкил означает 3-8-членную насыщенную или частично ненасыщенную кольцевую систему, содержащую от 1 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из группы, включающей -О-, -Ν=, -ΝΒ-, -С(О)-, -8-, -8(0)- и -8(0)₂-, где В обозначает водород, С1-С₄-алкил или защитную группу атома азота. Например, С₃-С₈-гетероциклоалкил при использовании в настоящем изобретении при описании соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, включает, но не ограничивается только ими, морфолиновую группу, пирролидинил, азепанил, пиперидинил, изохинолинил, тетрагидрофуранил, пирролидинил, пирролидинил-2-он, пиперазинил, пиперидинилон, 1,4-диокса-8-азаспиро[4,5]дец-8-ил и т.п.

Галоген предпочтительно означает хлор или фтор, но также может означать бром или йод.

Набор киназ представляет собой перечень киназ, включающий АЬ1 (человека), АЬ1 (Т3151), 1АК2, 1АК3, АЬК, 1ΝΚ1α1, АЬК4, КЭВ, Аигога-А, Ьск, В1к, МАРК1, Втх, МАРКАР-К2, ВВК, МЕК1, СаМК11 (крысы), Ме1, СОК1/циклин В, р7086К, СНК2, РАК2, СК1, ΡΌΟΡΒα, СК2, Р1Ж1. с-кй, Р1т-2, сВАР, РКА(й), С8К, РКВа, с8гс, РКСа, ОУВК2, Р1к3, ЕОРВ, ВОСК-Ι, Рек, Воп, Р0РВ3, Вок, РЙ3, 8АРК2а, Ртк, 8ОК, Руп, 81К, О8К33, 8ук, ЮР-1В, Т1е-2, Ι«β, ТгКВ, 1В, \\'\КХ 1ВАК4, 2АР-70, 1ТК, АМРК (крысы), Ь1МК1, Вкк2, Ах1, ЬКВ1, 8АРК23, Вг8К2, Ьуп(й), 8АРК3, ВТК, МАРКАР-К3, 8АРК4, СаМК1У, МАВК1, 8пк, СОК2/циклин А, МПМК, 8ВРК1, СОК3/циклин Е, МКК4(т), ТАК1, СОК5/р25, МКК6(й), ТВК1, СОК6/циклин Ό3, МЬСК, ТгкА, СОК7/циклин Н/МАТ1, МВСКЗ, Т88К1, СНК1, М8К1, Уек, СК16, М8Т2, 21РК, с-Кй (Ό816Υ), Ми8К, ОАРК2, №К2, 1)1)112, №К6, ОМРК, РАК4, БВАК1, РАВ-1Ва, ЕрЬА1, РООЕВЗ, ЕрйА2, Р1т-1, ЕрйА5, РКВЗ, ЕрйВ2, РКС31, ЕрйВ4, РКС5, Е0ЕВ1, РКСц, Е0ЕВ2, РКС0, Е0ЕВ4, РКО2, Е§г, РКО13, ЕЙ1, РВК2, Нск, РУК2, Н1РК2, Ве1, 1ККа, В1РК2, 1ВВ, ВОСК-ΙΙ (человека), РМК2а2, Вке, ΙΝΙΟ Вкк1(й), Р13-Ку, Р13-К5 и ΡΙ3-Ι<β. Для соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, проведен скрининг воздействия на этот набор киназ (дикого типа и/или их мутаций) и установлено, что они ингибируют активность по меньшей мере одного представителя указанного набора киназ.

Лечение относится к способу облегчения или смягчения заболевания и/или сопутствующих ему симптомов.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Ген с-кй кодирует рецепторную тирозинкиназу, и лиганд рецептора с-ΒίΙ называется фактором стволовых клеток (ФСК), который является главным фактором роста, обеспечивающим жизнеспособность мастоцитов. Активность с-кй рецепторной протеинтирозинкиназы в нормальных клетках регулируется, и нормальная функциональная активность продукта гена с-кй важна для поддержания нормального гематопоэза, меланогенеза, генетогенеза и роста и дифференциации мастоцитов. Мутации, которые вызывают конститутивную активацию киназной активности с-кй при отсутствии связывания с ФСК, участвуют в различных заболеваниях в диапазоне от мастоцитоза до раковых заболеваний человека.

В одном варианте осуществления В₃ выбран из фенила, замещенного группой, выбранной из дифторметоксигруппы, гидроксиметила, трифторметоксигруппы, метилсульфонила, метоксигруппы и этоксигруппы; и 2,3-дигидробензофуран-5-ила.

- 2 017269

Другой вариант осуществления относится к соединениям, выбранным из группы, включающей {5-[5-(3-дифторметоксифенил)-2Н-[1,2,4]триазол-3-ил]-2-метилфенил}-(4-пиридин-3-илпиримидин2-ил)амин;

Ы-(2-метил-5-(5-(3 -(трифторметокси)фенил)-1Н- 1,2,4-триазол-3 -ил)фенил)-4-(пиридин-3ил)пиримидин-2-амин;

Ы-(2-метил-5-(5-(3-(метилсульфонил)фенил)-1Н-1,2,4-триазол-3-ил)фенил)-4-(пиридин-3ил)пиримидин-2-амин;

Ν-(5-(5-(3 -метоксифенил)-1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)-2-метилфенил)-4-(пиридин-3 -ил)пиримидин-2амин;

№(5-(5-(3-этоксифенил)-1Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2-метилфенил)-4-(пиридин-3-ил)пиримидин-2амин;

№(5-(5-(2,3-дигидробензофуран-5-ил)-1Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2-метилфенил)-4-(пиридин-3ил)пиримидин-2-амин;

№(5-(5-(4-(дифторметокси)фенил)-1Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2-метилфенил)-4-(пиридин-3ил)пиримидин-2-амин и (3 -(3-(4-метил-3 -(4-(пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)-1Н-1,2,4-триазол-5ил)фенил)метанол.

Соединения формулы I могут быть использованы для лечения заболевания или патологического состояния, модулирующегося киназами рецепторов с-кй и ТРФРРа/β, путем введения соединений формулы I или их фармацевтически приемлемых солей или содержащих их фармацевтических композиций.

Примеры опосредуемых с помощью с-кй заболеваний или патологических состояний, которые можно опосредовать с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, опухолевое нарушение, аллергическое нарушение, воспалительное нарушение, аутоиммунное нарушение, реакцию трансплантант против хозяина, заболевание, связанное с Р1а8шобшш, заболевание, связанное с мастоцитами, метаболический синдром, нарушение, связанное с ЦНС, нейродегенеративное нарушение, боль, токсикоманию, прионное заболевание, рак, заболевание сердца, фиброзное заболевание, идиопатическую артериальную гипертензию (ИДАП) и первичную легочную гипертензию (ПЛГ).

Примеры заболевания, связанного с мастоцитами, которое можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, акне и акне, вызыванные РгорюшЬас1епит, прогрессирующую оссифицирующую фибродисплазию (ПОФ), воспаление и разрушение ткани, вызванное воздействием химического или бактериологического оружия (такого как сибирская язва и сернистый иприт), муковисцидоз, заболевание почек, воспалительные мышечные нарушения, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), диабет типа II, ишемию головного мозга, мастоцитоз, лекарственную зависимость и симптомы отмены, нарушения ЦНС (центральная нервная система), предупреждение или сведение к минимуму потери волос, бактериальные инфекции, интерстициальный цистит, воспалительную болезнь кишечника (ВБК), ангиогенез опухоли, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, рассеянный склероз (РС), аллергические нарушения (включая астму) и потерю костной массы.

Примеры опухолевых нарушений, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, мастоцитоз, желудочно-кишечную стромальную опухоль, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, острый миелоцитарный лейкоз, острый лимфолейкоз, миелодиспластический синдром, хронический миелолейкоз, колоректальный рак, рак желудка, тестикулярный рак, глиобластому и астроцитому.

Примеры аллергических нарушений, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, астму, аллергический ринит, аллергический синусит, анафилактический синдром, уртикарию, ангионевротический отек, атопический дерматит, аллергический контактный дерматит, нодозную эритему, полиморфную эритему, кожный некротический венулит, кожное воспаление вследствие укуса насекомого и заражение кровососущими паразитами.

Примеры воспалительных нарушений, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, ревматоидный артрит, конъюнктивит, анкилозирующий спондилит, остеоартрит и подагрический артрит.

Примеры аутоиммунных нарушений, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, рассеянный склероз, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, ревматоидный артрит, полиартрит, ограниченную или системную склеродермию, системную красную волчанку, дискоидную красную волчанку, кожную волчанку, дерматомиозит, полимиозит, синдром Шегрена, нодозный панартериит, аутоиммунную энтеропатию и пролиферативный гломерулонефрит.

- 3 017269

Примеры реакций трансплантант против хозяина, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, отторжение трансплантата после трансплантации органа, такого как трансплантация почки, трансплантация поджелудочной железы, трансплантация печени, трансплантация сердца, трансплантация легкого или трансплантация костного мозга.

Примеры метаболического синдрома, который можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, диабет типа I, диабет типа II и ожирение.

Примеры нарушений, связанных с ЦНС, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, депрессию, дистимическое нарушение, циклотимическое нарушение, анорексию, булимию, предменструальный синдром, постменопаузный синдром, замедление мышления, ухудшение концентрации внимания, пессимистическую тревогу, тревожное возбуждение, самоуничижение и пониженное либидо, тревожное нарушение, психическое нарушение и шизофрению.

Примеры депрессивных состояний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, биполярную депрессию, тяжелую или меланхолическую депрессию, атипическую депрессию, стойкую депрессию и сезонную депрессию. Примеры тревожных нарушений, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, тревожное нарушение, связанное с гипервентиляцией и аритмиями сердца, фобические нарушения, обсессивно-компульсивное нарушение, посттравматический стресс, острый стресс и генерализованное тревожное нарушение. Примеры психиатрических нарушений, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, приступы паники, включая психоз, бредовые нарушения, конверсионные нарушения, фобии, мании, бред, диссоциативные приступы, включая диссоциативную амнезию, диссоциативное бегство и диссоциативное суицидальное поведение, неряшливость, буйное или агрессивное поведение, травму, пограничные личностные характеристики и острый психоз, такой как шизофрению, включая параноидную шизофрению, дезорганизованную шизофрению, кататоническую шизофрению и недифференцированную шизофрению.

Примеры нейродегенеративного нарушения, которое можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, прионные заболевания, заболевание двигательных нейронов (ЗДН) и боковой амиотрофический склероз (БАС).

Примеры болей, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, острую боль, послеоперационную боль, хроническую боль, ноцицептивную боль, боль при раке, невропатическую боль и психогенный болевой синдром.

Примеры токсикомании, которую можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, привыкание к чрезмерному употреблению лекарственного средства или наркотика, злоупотребление лекарственным средством или наркотиком, привыкание к лекарственному средству или наркотику, зависимость от лекарственного средства или наркотика, синдром отмены или передозировку.

Примеры раковых заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, меланому, желудочно-кишечную стромальную опухоль (ЖКСО), колоректальный рак, мелкоклеточный рак легких и другие солидные опухоли.

Примеры фиброзных заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, гепатит С (НСУ), фиброз печени, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), цирроз печени, склеродермию, фиброз легких и фиброз костного мозга.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения заболевания или патологического состояния, модулирующегося киназой рецептора с-кй и/или ΡΌΟΡΚα/β, включающим введение соединений формулы I или их фармацевтически приемлемых солей или содержащих их фармацевтических композиций.

- 4 017269

Фармакология и применение.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, модулируют активность киназ и, как таковые, применимы для лечения заболеваний или нарушений, при которых киназы способствуют патологии и/или симптоматике этого заболевания. Примеры киназ, которые ингибируются соединениями и композициями, описанными в настоящем изобретении, и по отношению к которым применимы способы, описанные в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, киназы с-кй, ΡΌΟΕΚα, ΡΌΟΡΚβ, Ьуи, ΜΑΡΚ14 (р38-дельта), АКС, ВСК-АЫ, ВКК, ЕрйВ, Рш§, Руп, КИК, ЬСК, Ь-КаР, с-КаР, 8ΑΡΚ2, 8тс, Т1е2 и ТгкВ.

Мастоциты (МЦ) являются тканевыми элементами, образованными из особой подгруппы гематопоэтических стволовых клеток, которые продуцируют много разных медиаторов, большинство из которых обладает высокой провоспалительной активностью. Поскольку МЦ распределены почти по всем участкам организма, гиперсекреция медиаторов активированными элементами может привести к поражениям множества органов. Поэтому мастоциты являются главными элементами, участвующими во многих заболеваниях. Настоящее изобретение относится к способу лечения связанных с мастоцитами заболеваний, включающему введение человеку, нуждающемуся в таком лечении, соединения, способного уменьшать количество мастоцитов, или соединения, подавляющего дегрануляцию мастоцитов. Такие соединения можно выбрать из числа ингибиторов с-кй и более предпочтительно - из числа нетоксичных, селективных и активных ингибиторов с-кй. Предпочтительно, если указанные ингибиторы неспособны стимулировать гибель зависимых от 1Ь-3 клеток, выращенных в присутствии 1Ь-3.

Связанные с мастоцитами заболевания включают, но не ограничиваются только ими, акне и акне, вызванные ΡΐΌρίοηΦ;κΚπι.ιιη (акне включает все формы хронического воспаления кожи, включая вызванные акне, вызванные Ρ^οр^οη^Ьасΐе^^ит); чрезвычайно редкое и приводящее к потере трудоспособности генетическое заболевание соединительной ткани, известное, как прогрессирующая оссифицирующая фибродисплазия (ПОФ); вредные последствия воспаления и разрушения ткани, вызванного воздействием химического или бактериологического оружия (такого как сибирская язва, сернистый иприт и т.п.); муковисцидоз (генетическое заболевание легких, пищеварительной и репродуктивной системы); заболевание почек, такое как синдром острого нефрита, гломерулонефрит, почечный амилоидоз, почечный интерстициальный фиброз (конечное общее направление, приводящее к терминальной стадии заболевания почек при различных нефропатиях); воспалительные мышечные нарушения, включая миозит и мышечную дистрофию; ВИЧ (например, уменьшение количества инфицированных посредством ВИЧ мастоцитов может представлять собой новый путь лечения инфицирования посредством ВИЧ и родственных заболеваний); лечения диабета типа II, ожирения и родственных нарушений (мастоциты регулируют целый ряд процессов, которые способствуют развитию атеросклероза, включая гипергликемию, гиперхолестеринемию, гипертензию, эндотелиальную дисфункцию, резистентность к инсулину и ремоделирование сосудов); ишемию головного мозга; мастоцитоз (очень неоднородная группа нарушений, характеризующаяся аномальным накоплением мастоцитов в различных тканях, преимущественно в коже и костном мозге, а также в селезенке, печени, лимфатических узлах и желудочно-кишечном тракте); токсикоманию и симптомы отмены (в особенности привыкание к чрезмерному употреблению лекарственного средства или наркотика, злоупотребление лекарственным средством или наркотиком, привыкание к лекарственному средству или наркотику, зависимость от лекарственного средства или наркотика, синдром отмены и передозировку); нарушения ЦНС (в особенности депрессию, шизофрению, тревожное состояние, мигрень, потерю памяти, боль и нейродегенеративные заболевания); стимулирование роста волос (включая предупреждение или сведение к минимуму потери волос); бактериальные инфекции (в особенности инфекции, вызванные бактериями, экспрессирующими Р1тН); синдром раздраженной толстой кишки (СРК) и патологическое состояние с раздражением толстой кишки (ПРК); интерстициальный цистит (хроническое воспаление стенки мочевого пузыря, приводящее к повреждению ткани, в особенности в интерстициальном пространстве между клетками в выстилке мочевого пузыря); воспалительные заболевания кишечника (обычно это относится к четырем заболеваниям кишечника, а именно болезни Крона, язвенному колиту, колиту неопределенной этиологии и инфекционному колиту); ангиогенез опухоли; аутоиммунные заболевания (в особенности рассеянный склероз, язвенный колит, болезнь Крона, ревматоидный артрит и полиартрит, склеродермия, красная волчанка, дерматомиозит, пемфигус, полимиозит, васкулит и заболевания трансплантат против хозяина); воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит (РА); рассеянный склероз (ГС); аллергические нарушения (в особенности астма, аллергический ринит, аллергический синусит, анафилактический синдром, уртикария, ангионевротический отек, атопический дерматит, аллергический контактный дерматит, нодозная эритема, полиморфная эритема, кожный некротический венулит и кожное воспаление вследствие укуса насекомого, бронхиальная астма); полипоз носа и потерю костной массы.

- 5 017269

ТРФР (тромбоцитарный фактор роста) является широко распространенным фактором роста, который играет важную роль и при нормальном росте, и при патологической пролиферации клеток, такой как наблюдающаяся при канцерогенезе и заболеваниях гладкомышечных клеток кровеносных сосудов, например при атеросклерозе и тромбозе. Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, могут ингибировать активность рецептора ТРФР (ТРФРР) и поэтому пригодны для лечения опухолевых заболеваний, таких как глиомы, саркомы, опухоли предстательной железы и опухоли толстой кишки, молочной железы и яичников, гиперэозинофилии, фиброза, такого как фиброз легких, легочной гипертензии и сердечно-сосудистых заболеваний.

Путь передачи сигнала Рак-РаГ-МЕК-ЕРК опосредует клеточный ответ на сигналы роста. Рак мутирует в онкогенную форму в ~15% случаях рака человека. Группа РаГ относится к серин/треонинпротеинкиназам и включает трех представителей, Л-РаГ. Ь-РаГ и с-РаГ (или РаР-1). Воздействие на РаГ, как на мишень лекарственного средства, направлено на роль РаГ, как расположенного в прямом направлении эффектора Рак. Однако последние данные показывают, что Ь-РаГ может играть заметную роль в образовании некоторых опухолей без необходимости наличия активированного Рак аллеля (№Шгс. 417, 949-954 (01 1и1., 2002). В частности, мутации Ь-РаГ обнаружены в значительной части злокачественных меланом.

Имеющиеся медицинские средства лечения меланомы обладают ограниченной эффективностью, в особенности на поздних стадиях меланом. Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, также подавляют клеточные процессы, включающие Ь-РаГ киназу, и предоставляют новые возможности для лечения раковых заболеваний людей, в особенности меланомы.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, также подавляют клеточные процессы, включающие с-РаГ киназу. с-РаГ активируется онкогеном Рак, который мутрован при большом количестве раковых заболеваний людей. Поэтому ингибирование киназной активности с-РаГ может предоставить средство для предупреждения роста опухоли, опосредуемого Рак [СатрЬе11, 8.Ь., Опсодепе, 17, 1395 (1998)].

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять и для лечения незлокачественных пролиферативных нарушений, таких как атеросклероз, тромбоз, псориаз, склеродермия и фиброз, а также для защиты стволовых клеток, например, для противодействия гемотоксическому воздействию химиотерапевтических средств, таких как 5-фторурацил, и при астме.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, оказывают полезное воздействие при лечении нарушений, возникающих вследствие трансплантации, например аллогенной трансплантации, в особенности отторжения тканей, в особенности такого как облитерирующий бронхиолит (ОБ), т.е. хроническое отторжение аллогенных трансплантатов легких. В отличие от пациентов, не страдающих ОБ, у страдающих ОБ часто обнаруживается повышенная концентрация ТРФР в жидких бронхоальвеолярных выделениях.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, также эффективны при заболеваниях, связанных с миграцией и пролиферацией гладкомышечных клеток сосудов (при которых часто играют роль ТРФР и ТРФРР), таких как рестеноз и атеросклероз. Эти эффекты и их последствия для пролиферации или миграции гладкомышечных клеток сосудов ίη νίΐτο и ίη νίνο можно продемонстрировать путем введения соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, а также путем исследования их влияния на утолщение интимы сосудов ίη νίνο после механического повреждения.

Группа 1гк нейротропиновых рецепторов (РгкА, РгкВ, РгкС) стимулирует жизнеспособность, рост и дифференциацию нейронных и не нейронных тканей. Белок ТгкВ экспрессируется в клетках нейроэндокринного типа в тонком кишечнике и толстой кишке, в альфа-клетках поджелудочной железы, в моноцитах и макрофагах лимфатических узлов и селезенки и в зернистом слое эпидермиса (8ЫЬауата апй ΚοίζιιιηΡ 1996). Экспрессирование белка ТгкВ связывали с неблагоприятным прогрессированием опухолей Вилма и нейробластомами. Кроме того, ТгкВ экспрессируется в раковых клетках предстательной железы, но не в нормальных клетках. Путь передачи сигналов в прямом направлении от рецепторов Ргк включает каскад активации АМПК с помощью 8Ьс, активированный Рак, гены ЕРК-1 и ЕРК-2 и путь трансдукции РЬС-гамма (διίβίιηοίο е1 а1., 2001).

Киназа с-кгс передает онкогенные сигналы многих рецепторов. Например, сверхэкспрессирование ЕОБР или НЕР2/пеи в опухолях приводит к конститутивной активации с-кгс, характерной для злокачественной клетки, но отсутствующей в нормальной клетке. С другой стороны, мыши, у которых отсутствует экспрессирование с-кгс, обладают остеопетротическим фенотипом, что указывает о ключевой роли с-кгс в функции остеокластов и о возможном участии в связанных с этим нарушениях.

Киназа семейства Тес, Втх, нерецепторная протеинтирозинкиназа, регулирует пролиферацию раковых клеток эпителия млекопитающих.

Показано, что рецептор 3 фактора роста фибробластов оказывает негативное регуляторное влияние на рост костей и ингибирование пролиферации хондроцитов. Летальная дисплазия вызывается различными мутациями рецептора 3 фактора роста фибробластов, и одна мутация, ТОП БОБР3, обладает конститутивной тирозинкиназной активностью, что активирует фактор транскрипции 81аИ, что приводит к экспрессированию ингибитора клеточного цикла, остановке роста и аномальному развитию костей (8и е1

- 6 017269 а1., ΝηΙιιΐΌ. 1997, 386, 288-292). РСРН3 также часто экспрессируется при раковых заболеваниях типа множественной миеломы. Ингибиторы активности РСРН3 применимы для лечения опосредуемых Т-клетками воспалительных или аутоиммунных заболеваний, включая, но не ограничиваясь только ими, ревматоидный артрит (РА), коллагеновый II артрит, рассеянный склероз (РС), системную красную волчанку (СКВ), псориаз, юношеский диабет, болезнь Шегрена, заболевание щитовидной железы, саркоидоз, аутоиммунный увеит, воспалительную болезнь кишечника (болезнь Крона и язвенный колит), глютеиновую болезнь и миастению дгаук.

Активность киназы, экспрессируемой под действием сыворотки или глюкокортикоидов (СГК), коррелирует с измененными активностями ионных каналов, в частности натриевых и/или калиевых каналов, и соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно использовать для лечения гипертензии.

Ь1и е! а1. (1997) 1. Сйи. 1пуе§1. 100, 8: 2072-2078 и Р. Ыи (1998). ΡΝΑ8 95, 8829-8834 с помощью моделей ксенотрансплататов опухоли молочной железы и меланомы показали, что происходит подавление роста опухоли и васкуляризации, а также уменьшение метастазирования в легкие при аденовирусных инфекциях или при инъекции внутриклеточного домена Т1е-2 (Тек). Ингибиторы Т1е2 можно использовать в случаях, когда происходит неприемлемая неоваскуляризация (т.е. при диабетической ретинопатии, хроническом воспалении, псориазе, саркоме Капоши, хронической неоваскуляризации вследствие дегенерации желтого пятна, ревматоидном артрите, младенческой гемангиоме и раковых заболеваниях).

Ьек участвует в Т-клеточной сигнализации. Мыши, лишенные гена Ьек, обладают плохой способностью вырабатывать тимоциты. Функция Ьек, как положительного активатора Т-клеточной сигнализации, показывает, что ингибиторы Ьек могут быть полезными для лечения аутоиммунного заболевания, такого как ревматоидный артрит.

Разные 1ΝΚ, как и другие АМПК, участвуют в опосредовании клеточного ответа на рак, индуцируемой тромбином агрегации тромбоцитов, иммунодефицитных состояниях, аутоиммунных заболеваниях, гибели клеток, аллергиях, остеопорозе и заболевании сердца. Объекты лечебного воздействия, связанные с активацией пути 1ΝΚ, включают хронический миелолейкоз (ХМЛ), ревматоидный артрит, астму, остеоартрит, ишемию, рак и нейродегенеративные заболевания. Вследствие важности активации 1ΝΚ, связанной с заболеванием печени или приступами печеночной ишемии, соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, также могут быть применимы для лечения различных заболеваний печени. Также описана роль 1ΝΚ в сердечно-сосудистом заболевании, таком как инфаркт миокарда или застойная сердечная недостаточность, и было показано, что 1ΝΚ опосредует гипертрофический ответ на различные формы сердечного стресса. Показано, что каскад 1ΝΚ также участвует в активации Т-клеток, включая активацию промотора 1Ь-2, таким образом, ингибиторы 1ΝΚ могут быть полезны для применения при измененных патологических иммунных ответах. Также выявлена роль активации 1ΝΚ при различных раковых заболеваниях, что свидетельствует о возможности применения ингибиторов 1ΝΚ при раке. Например, конститутивно активированный 1ΝΚ связан с опосредуемым НТЬУ-1 онкогенезом [Опсодепе 13:135-42 (1996)]. 1ΝΚ может играть роль при саркоме Капоши (СК). Другие пролиферативные эффекты других цитокинов, участвующих в пролиферации при СК, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (СЭФР), 1Ь-6 и ЮТа, также могут опосредоваться с помощью 1ΝΚ. Кроме того, регуляция гена с-)ип в р210 ВСН-АВЬ трансформированных клетках соответствует активности 1ΝΚ и свидетельствует о роли ингибиторов 1ΝΚ при лечении хронического миелолейкоза (ХМЛ) |В1оой. 92:2450-60 (1998)].

Предполагается, что некоторые аномальные пролиферативные патологические состояния связаны с экспрессированием На! и поэтому предположительно чувствительны к подавлению экспрессирования На!. Аномально высокие уровни экспрессирования белка На! также связаны с трансформацией и аномальной пролиферацией клеток. Также предполагается, что эти аномальные пролиферативные патологические состояния чувствительны к ингибированию экспрессирования На!. Например, экспрессирование белка с-На! предположительно играет роль при аномальной пролиферации клеток, поскольку сообщали, что 60% всех линий клеток карциномы легких экспрессируют необычно высокие уровни мРНК и белка с-На!. Другими примерами аномальных пролиферативных патологических состояний являются гиперпролиферативные нарушения, такие как раковые заболевания, опухоли, гиперплазия, фиброз легких, ангиогенез, псориаз, атеросклероз и пролиферация гладкомышечных клеток кровеносных сосудов, такие как стеноз или рестеноз после ангиопластики. Клеточные сигнальные пути, частью которых является На!, также участвуют в воспалительных нарушениях, характеризующихся пролиферацией Т-клеток (активация и рост Т-клеток), таких как, например, отторжение тканевого лоскута, эндотоксиновый шок и гломерулонефрит.

Активированные стрессом протеинкиназы (АСПК) представляют собой семейство протеинкиназ, которые характеризуют предпоследнюю стадию путей передачи сигналов, которые приводят к активации фактора транскрипции с-)ип и экспрессированию генов, регулируемых с помощью с-щп. В частности, с-)ип участвует в транскрипции генов, кодирующих белки, участвующие в репарации ДНК, которая повреждена вследствие генотоксичных инсультов. Поэтому средства, которые ингибируют активность АСПК в клетке, предотвращают репарацию ДНК и сенсибилизируют клетку по отношению к средствам, которые индуцируют повреждение ДНК или ингибируют синтез ДНК и индуцируют апоптоз клетки, или

- 7 017269 по отношению к средствам, которые подавляют пролиферацию клеток.

Активированные митогеном протеинкиназы (АМПК) являются представителями консервативных путей передачи сигналов, которые активируют факторы транскрипции, факторы трансляции и другие целевые молекулы в ответ на различные внеклеточные сигналы. АМПК активируются фосфорилированием по двойному мотиву фосфорилирования, обладающему последовательностью Тйт-Х-Тут, с помощью активированных митогеном протеинкиназкиназ (МКК). У высших эукариотов физиологическая роль передачи сигналов с помощью АМПК была скоррелирована с такими клеточными проявлениями, как пролиферация, онкогенез, развитие и дифференциация. В соответствии с этим способность регулировать трансдукцию сигналов по этим путям (в особенности через МКК4 и МКК6) может привести к разработке средств лечения и профилактики заболеваний, связанных с передачей сигналов с помощью АМПК, таких как воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания и рак.

Группа рибосомных протеинкиназ 86 человека включает по меньшей мере 8 представителей (В8К1, В8К2, В8К3, В8К4, М8К1, М8К2, р7086К и р7086КЬ). Протеинкиназы рибосомного белка 86 выполняют важные плейотропные функции, в частности, играют ключевую роль в регуляции трансляции мРНК при биосинтезе белка (Еиг. 1. Вюсйет. 2000 ШтетЬег; 267(21): 6321-30, Ехр. Се11. Век. Νον. 25, 1999; 253(1):100-9, Мо1. Се11. ЕпйосгшоГ Мау 25, 1999; 151(1-2):65-77). Также показано, что фосфорилирование рибосомного белка 86 посредством р7086 участвует в регуляции клеточной подвижности (1ттипо1. Се11 Βίο1. 2000 Аидик!; 78(4):447-51) и росте клеток (Ргод. №.1с1ею Ас1й Век. Мо1. Вю1., 2000; 65:101-27) и поэтому может быть важным для метастазирования опухоли, иммунного ответа и восстановления ткани, а также для других патологических состояний.

АСПК (также называющиеся _щи Ν-концевые киназы или ΣΝΒ'κ) представляют собой семейство протеинкиназ, которые характеризуют предпоследнюю стадию путей передачи сигналов, которые приводят к активации фактора транскрипции с-]ип и экспрессированию генов, регулируемых с помощью с-]ип. В частности, с-щп участвует в транскрипции генов, кодирующих белки, участвующие в репарации ДНК, которая повреждена вследствие генотоксичных инсультов. Средства, которые ингибируют активность АСПК в клетке, предотвращают репарацию ДНК и сенсибилизируют клетку по отношению к средствам лечения рака, которые действуют путем индуцирования повреждения ДНК.

ВТК играет роль в аутоиммунном и/или воспалительном заболевании, таком как системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит, множественные васкулиты, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), миастения дга\зк и астма. Вследствие участия ВТК в активации В-клеток ингибиторы ВТК применимы в качестве ингибиторов опосредуемой В-клетками патогенной активности, такой как продуцирование аутоантител, и применимы для лечения В-клеточной лимфомы и лейкоза.

СНК2 является представителем семейства сйескрот! киназ серин/треонинпротеинкиназ и участвует в механизме, использующемся для контроля повреждения ДНК, такого как повреждение, вызванное мутагенами окружающей среды и эндогенными реакционноспособными кислородсодержащими соединениями. В результате она связана с подавлением опухоли и является объектом противораковой терапии.

С8К влияет на метастатическую способность раковых клеток, в особенности при колоректальном раке.

Рек является нерецепторной протеинтирозинкиназой, которая участвует в различных путях передачи сигналов цитокинов, а также в дифференциации миелоидных клеток. Рек также является основным компонентом дифференциации гранулоцитов.

Активность Р1!3 рецепторной тирозинкиназы связана с лейкозами и миелодиспластическим синдромом. Примерно в 25% случаев ОМЛ лейкозные клетки экспрессируют конститутивно активную форму аутофосфорилированной (р) РЬТ3 тирозинкиназы на поверхности клеток. Активность р-РЬТ3 способствует росту и жизнеспособности лейкозных клеток. Для пациентов, страдающих острым лейкозом, лейкозные клетки которых экспрессируют активную киназу р-РЬТ3, прогноз результатов химиотерапии является плохим. Ингибирование активности киназы р-РЬТ3 индуцирует апоптоз (запрограммированную гибель клеток) лейкозных клеток.

Ингибиторы 1ККа и ΙΙ/1/β (1 и 2) являются средствами лечения заболеваний, которые включают ревматоидный артрит, отторжение трансплантата, воспалительную болезнь кишечника, остеоартрит, астму, хроническое обструктивное заболевание легких, атеросклероз, псориаз, рассеянный склероз, удар, системную красную волчанку, болезнь Альцгеймера, ишемию головного мозга, травматическое поражение головного мозга, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, субарахноидальное кровоизлияние и другие заболевания или нарушения, связанные с избыточным продуцированием воспалительных медиаторов в головном мозге и центральной нервной системе.

Ме! связана с большинством типов основных раковых заболеваний человека, и ее экспрессия часто коррелирует с плохим прогнозом и метастазами. Ингибиторы Ме! являются средствами лечения заболеваний, которые включают раковые заболевания, такие как рак легких, НМКРЛ (немелкоклеточный рак легких), рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, колоректальный рак, рак молочной железы, гинекологические опухоли (например, саркомы матки, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища и карцинома

- 8 017269 вульвы), болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы (например, рак щитовидной железы, паращитовидной железы или надпочечников), саркомы мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, хронический или острый лейкоз, солидные опухоли у детей, лимфоцитарные лимфомы, рак мочевого пузыря, рак почек или мочеточника (например, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки), злокачественные новообразования у детей, неоплазмы центральной нервной системы (например, первичная лимфома ЦНС, опухоли оси позвоночника, глиома ствола головного мозга или аденомы гипофиза), раковые заболевания крови, такие как острый миелолейкоз, хронический миелолейкоз и т.п., язву пищевода Баррета (предраковый синдром), опухолевое кожное заболевание, псориаз, фунгоидную гранулему и доброкачественную гипертрофию предстательной железы, связанные с диабетом заболевания, такие как диабетическая ретинопатия, ретинальная ишемия и ретинальная реваскуляризация, цирроз печени, сердечно-сосудистое заболевание, такое как атеросклероз, иммунологическое заболевание, такое как аутоиммунное заболевание и заболевание почек. Предпочтительным заболеванием является рак, такой как острый миелолейкоз и колоректальный рак.

Связанная с Νίιηη киназа 2 (№к2) является регуляторной протеинкиназой клеточного цикла с максимальной активностью в начале митоза, которая локализуется в центросоме. Исследования ее воздействия показали, что №к2 участвует в регуляции отделения центросомы и образовании веретена. В линиях клеток, полученных из опухолей человека, включая опухоли шейки матки, яичников, предстательной железы и в особенности молочной железы, белок №к2 содержит от 2 до 5 складок.

Опосредуемые с помощью р7086К заболевания или патологические состояния включают, но не ограничиваются только ими, пролиферативные нарушения, такие как рак и туберозный склероз.

В соответствии с приведенным выше настоящее изобретение также относится к способу предупреждения или лечения любого из заболеваний или нарушений, описанных выше, у субъекта, нуждающегося в таком лечении, и этот способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества (см. ниже Введение и фармацевтические композиции) соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. Для любого из указанных случаев применения необходимая доза меняется в зависимости от пути введения, конкретного подвергающегося лечению патологического состояния и необходимого эффекта.

Введение и фармацевтические композиции.

Обычно соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят в терапевтически эффективных количествах посредством любого из обычных и приемлемых путей, известных в данной области техники, по отдельности или в комбинации с одним или большим количеством терапевтических средств. Терапевтически эффективное количество может меняться в широких пределах в зависимости от тяжести заболевания, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, активности применяющегося соединения и других факторов. Имеются указания о том, что обычно удовлетворительные результаты получают при системном воздействии и суточных дозах, равных примерно от 0,03 до 2,5 мг/(кг массы тела). Указанная суточная доза для более крупного млекопитающего, например человека, находится в диапазоне от примерно 0,5 до примерно 100 мг, обычно вводится, например, в виде разделенных доз вплоть до 4 раз в сутки или в форме пролонгированного действия. Разовые дозированные формы, подходящие для перорального введения, включают примерно от 1 до 50 мг активного ингредиента.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить в виде фармацевтических композиций любым обычным путем, в частности энтерально, например перорально, например в виде таблеток или капсул, или парентерально, например в виде растворов или суспензий для инъекций, местно, например в виде лосьонов, гелей, мазей или кремов, или в назальной, ингаляционной форме или в форме суппозиториев. Фармацевтические композиции, включающие соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли совместно по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, можно приготовить обычным путем по методикам смешивания, гранулирования или нанесения покрытий. Например, композиции для перорального введения могут представлять собой таблетки или желатиновые капсулы, включающие активный ингредиент совместно с а) разбавителями, например лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином; Ь) смазывающими веществами, например диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее магниевой или кальциевой солью и/или полиэтиленгликолем; для таблеток также со с) связующими, например алюмосиликатом магния, крахмальной пастой, желатином, трагакантовой камедью, метилцеллюлозой, натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидоном; при необходимости с б) разрыхлителями, например крахмалами, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью, или шипучими смесями; и/или е) абсорбентами, красителями, вкусовыми добавками и подсластителями. Композиции для инъекций могут представлять собой водные изотонические растворы или суспензии, и суппозитории можно приготовить из эмульсий или суспензий жирных веществ. Композиции могут быть стерилизованы и/или содержать вспомогательные вещества, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие агенты, стимуляторы растворения, соли для регулирования осмотического давления и/или буферные вещества. Кроме того, они также могут содержать другие терапевтически полезные вещества. Препараты, подходящие для чре

- 9 017269 скожного введения, включают эффективное количество соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, вместе с носителем. Носитель может включать впитывающиеся фармакологически приемлемые растворители, содействующие проникновению через кожу реципиента. Например, чрескожные устройства представляют собой повязку, включающую защитный элемент, резервуар, содержащий соединение, необязательно совместно с носителями, необязательно регулирующий скорость барьерный элемент для доставки соединения к коже реципиента с регулируемой и заранее заданной скоростью в течение продолжительного периода времени и средства для закрепления устройства на коже. Также можно использовать матричные препараты для чрескожного введения. Препаратами, подходящими для местного нанесения, например на кожу и в глаза, предпочтительно являются водные растворы, мази, кремы или гели, хорошо известные в данной области техники. Они могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, усиливающие тоничность агенты, буферные вещества и консерванты.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить в терапевтически эффективных количествах в комбинации с одним или большим количеством терапевтических средств (фармацевтические комбинации). Например, синергетический эффект может проявляться при использовании других средств лечения астмы, например стероидов и антагонистов лейкотриена.

Например, синергетический эффект может проявляться при использовании других иммуномодулирующих или противовоспалительных средств, например при использовании в комбинации с циклоспорином, рапамицином или аскомицином или с их иммунодепрессантными аналогами, например циклоспорином А (СжА). циклоспорином С, ТК-506, рапамицином или сравнимыми соединениями, кортикостероидами, циклофосфамидом, азатиоприном, метотрексатом, брехинаром, лефлуномидом, мизорибином, микофеноловой кислотой, микофенолятмитефилом, 15-дезоксиспергуалином, иммунодепрессантными антителами, в особенности моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например МНС, СЭ2, СЭ3, СЭ4, СЭ7, СО25, СЭ28, В7, СО45, СО58 или их лигандами, или другими иммуномодулирующими соединениями, такими как СТЬА41д. Когда соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят совместно с другими средствами, разумеется, дозы вводимых совместно соединений будут меняться в зависимости от типа используемого совместно лекарственного средства, конкретного используемого лекарственного средства, подвергающегося лечению патологического состояния и т.п.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим комбинациям, например к набору, включающему а) первое средство, которое является соединением, предлагаемым в настоящем изобретении, описанным в настоящем изобретении, в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли; и Ь) по меньшей мере одно дополнительное средство. Набор может включать инструкции по его введению.

Термины совместное введение или комбинированное введение и т.п. при использовании в настоящем изобретении означают введение выбранных терапевтических средств одному пациенту и включают режимы лечения, при которых средства необязательно вводят по одному и тому же пути введения или в одно и то же время.

Термин фармацевтическая комбинация при использовании в настоящем изобретении означает препарат, который получен смешиванием или объединением более одного активного ингредиента и включает и фиксированные, и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин фиксированная комбинация означает, что активные ингредиенты, например соединение формулы I и дополнительное средство, оба, вводят пациенту одновременно в виде одного препарата или дозированной формы. Термин нефиксированная комбинация означает, что активные ингредиенты, например соединение формулы I и дополнительное средство, оба, вводят пациенту в виде отдельных препаратов одновременно, по отдельности или последовательно без наложения специальных ограничений по времени, и при таком введении в организме пациента создаются терапевтически эффективные уровни этих 2 соединений. Последнее также относится к смешанному лечению, например с введением 3 или большего количества активных ингредиентов.

Способы получения соединений, предлагаемых в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение также относится к способам получения соединений, предлагаемых в настоящем изобретении. Для описанных реакций может оказаться необходимой защита реакционноспособных функциональных групп, например гидрокси-, амино-, имино-, тио- или карбоксигрупп, если необходимо, чтобы они содержались в конечном продукте, чтобы избежать их нежелательного участия в реакциях. Можно использовать обычные защитные группы в соответствии со стандартной практикой; см., например, Т.^. Сгеепе апб Р.С.М. ХУий ίη Рго1ссОус Сгоирк ίη Отдаше Сйетщру, ίοΐιη \Убсу апб 8оп5, 1991.

Соединения формулы I можно получить по следующей схеме реакций I.

- 10 017269

Схема реакций I

где К₁, Кг,,· В₂ь и В₃ являются такими, как описано в разделе Краткое изложение сущности изобретения, и Ь обозначает 1Н-1,2,4-триазол-5-ил (как показано на схеме реакций). (Схема реакций I иллюстрирует образование соединения формулы I, в которой Ь обозначает 1Н-1,2,4-триазол, и не ограничивает объем настоящего изобретения). Соединение формулы I можно получить по реакции соединения формулы (2) с соединением формулы (3) в присутствии подходящего растворителя (например, ΝΜΡ, ДМФ (диметилформамид), пВиОН и т.п.) и подходящего основания (например, К₂СО₃ и т.п.). Реакция протекает в температурном диапазоне от примерно 0 до примерно 180°С и до завершения может продолжаться в течение до 24 ч.

Подробное описание синтеза соединение формулы I приведено в представленных ниже примерах. Дополнительные методики синтеза соединений, предлагаемых в настоящем изобретении.

Соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, можно получить в виде фармацевтически приемлемой соли присоединения с кислотой по реакции соединения в свободной форме с фармацевтически приемлемой неорганической или органической кислотой. Альтернативно, фармацевтически приемлемую соль присоединения соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, с основанием можно получить по реакции соединения в форме свободной кислоты с фармацевтически приемлемым неорганическим или органическим основанием. Альтернативно, солевые формы соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, можно получить с использованием солей исходных веществ или промежуточных продуктов.

Формы свободной кислоты или свободного основания соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, можно получить из соответствующих солей присоединения с основаниями или солей присоединения с кислотами соответственно. Например, соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, в форме соли присоединения с кислотой можно превратить в соответствующее свободное основание путем обработки подходящим основанием (например, раствором гидроксида аммония, гидроксидом натрия и т.п.). Например, соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, в форме соли присоединения с основанием можно превратить в соответствующую свободную кислоту путем обработки подходящей кислотой (например, хлористо-водородной кислотой и т.п.).

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, в неокисленной форме можно получить из Ν-оксидов соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, путем обработки восстановительным реагентом (например, серой, диоксидом серы, трифенилфосфином, борогидридом лития, борогидридом натрия, трихлоридом, трибромидом фосфора и т. п.) в подходящем инертном органическом растворителе (например, ацетонитриле, этаноле, водном растворе диоксана и т.п.) при температуре от 0 до 80°С.

Пролекарственные производные соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, можно получить по методикам, известным специалистам с общей подготовкой в данной области техники (дополнительные подробности см., например, в публикации 8аи1шег с1 а1. (1994), Вюогдашс апб Меб1сша1 СйспйМгу Ьейега, Уо1. 4, р. 1985). Например, подходящие пролекарства можно получить по реакции не являющегося производным соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, с подходящим карбамоилирующим реагентом (например, 1,1-ацилоксиалкилкарбанохлоридатом, п-нитрофенилкарбонатом и т.п.).

Защищенные производные соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, можно получить по методикам, известным специалистам с общей подготовкой в данной области техники. Подробное описание методик, применимых для введения защитных групп и их удаления приведено в публикации Т.^. Сгеепе, Рго1ес1тд Сгоирк ίη Огдашс СйетШгу, 3^гб еПН1оп, ίοΐιη \УПеу и 8оп5, Шс., 1999.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно легко получить или сформировать способом, предлагаемым в настоящем изобретении, в виде сольватов (например, гидратов). Гидраты соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, можно легко получить путем перекристаллизации из водно/органических смесей растворителей с использованием органических растворителей, таких как диоксан, тетрагидрофуран или метанол.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получить в виде отдельных стереоизомеров с помощью реакции рацемической смеси соединения с оптически активным разделяющим реагентом с образованием пары диастереоизомерных соединений, разделения диастереоизомеров и выделения оптически чистых энантиомеров. Хотя разделение энантиомеров можно провести с использованием ковалентных диастереоизомерных производных соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, предпочтительны диссоциирующие комплексы (например, кристаллические соли диастереоизомеров).

- 11 017269

Диастереоизомеры обладают разными физическими характеристиками (например, температурами плавления, температурами кипения, растворимостями, реакционной способностью и т.п.) и их можно легко разделить с использованием этих различий. Диастереоизомеры можно разделить с помощью хроматографии или предпочтительно по методикам разделения, основанным на различиях их растворимостей. Затем оптически чистый энантиомер вместе с разделяющим реагентом извлекают по любой возможной методике, которая не приводит к рацемизации. Более подробное описание методик, пригодных для выделения стереоизомерных соединений из их рацемической смеси, приведено в публикации 1еап Ьасциск. Апйге Со11е1, 8атие1 Н. ^йеп, Епаийотегк, Васета1ек и Веко1и1юпк, 1оНп \УПсу Апй 8опк, Шс., 1981.

Резюмируя, можно сказать, что соединения формулы I можно получить способом, который включает:

(a) проведение реакций по схеме реакций I;

(b) необязательное превращение соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, в фармацевтически приемлемую соль;

(c) необязательное превращение солевой формы соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, в несолевую форму;

(й) необязательное превращение неокисленной формы соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, в фармацевтически приемлемый Ν-оксид;

(е) необязательное превращение Ν-оксидной формы соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, в его неокисленную форму;

(I) необязательное выделение индивидуального изомера соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, из смеси изомеров;

(д) необязательное превращение не являющегося производным соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, в фармацевтически приемлемое пролекарственное производное;

(II) необязательное превращение пролекарственного производного соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, в его не являющуюся производным форму.

Если получение исходных веществ не описано, то эти соединения являются известными или их можно получить по методикам, аналогичным известным в данной области техники или раскрытым в приведенных ниже примерах.

Специалист в данной области техники должен понимать, что описанные выше превращения являются только примерами методик получения соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, и что также можно использовать другие хорошо известные методики.

ниже

Примеры

Настоящее изобретение дополнительно описывается, но не ограничивается приведенными примерами, которые иллюстрируют получение соединений формулы I, предлагаемых в настоящем изобретении.

Синтез 3-(4-(пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)-4-метилбензойной кислоты 5

К раствору метилового эфира 3-амино-4-метилбензойной кислоты (0,6 моль) в иВиОН (50 мл) прибавляют 70% азотную кислоту (2,7 мл) и получают нитрат, который затем конденсируют с водным раствором цианамида (50 мас.%, 7 мл, 0,09 моль). Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 16 ч и охлаждают до температуры окружающей среды и затем прибавляют этиловый эфир (100 мл). После охлаждения при 0°С в течение 30 мин фильтрование и промывка смесью 1:1=метанол:диэтиловый эфир (120 мл) дают нитрат метилового эфира 3-гуанидино-4-метилбензойной кислоты 2.

К нитрату метилового эфира 3-гуанидино-4-метилбензойной кислоты 2 (0,02 моль) в иВиОН (40 мл) прибавляют 3 (0,02 моль) и чешуйки гидроксида натрия (0,02 моль). Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 12 ч и получают сложный эфир 4. 1н. водный раствор №1ОН (20 мл) прибавляют к раствору сложного эфира 4 в иВиОН и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин. После охлаждения до КТ (комнатная температура) 1н. (водный раствор) НС1 (20 мл) медленно прибавляют к смеси при энергичном перемешивании. Продукт собирают фильтрованием и промывают водой и

- 12 017269 получают кислоту 5.

Ή ЯМР (400 МГц, й₆-ДМСО): δ 9,28 (й, 1=1,8 Гц, 1Н), 9,08 (₈, 1Н), 8,7 (йй, 1=4,7, 1,5 Гц, 1Н), 8,55 (й, 1=5,1 Гц, 1Н), 8,46 (й1, 1=8, 1,8 Гц, 1Н), 8,31 (₈, 1Н), 7,65 (йй, 1=7,8, 1,5 Гц, 1Н), 7,54 (йй, 1=7,7, 4,7 Гц, 1Н), 7,49 (йй, 1=5,2 Гц, 1Н), 7,37 (й, 1=7,9 Гц, 1Н), 3,08 (₈, 3Н).

МС (т/ζ) (М+1)⁺: 307,2.

Реагент 3 можно получить по следующим методикам. Смесь 3-ацетилпиридина (2,47 моль) и диметилацеталя Ν,Ν-диметилформамид (240 мл) кипятят с обратным холодильником в течение 16 ч. Растворитель удаляют в вакууме и гексаны (100 мл) прибавляют к остатку для кристаллизации твердого вещества. Твердое вещество перекристаллизовывают из смеси метилен хлорид-гексаны и получают 3-диметиламино-1 -(3-пиридил)-2-пропен-1 -он.

Ή ЯМР (400 МГц, й-хлороформ): δ 9,08 (й, 1=2,4 Гц, 1Н), 8,66 (т, 1Н), 8,20 (т, 1Н), 7,87 (т, 1Н), 7,37 (т, 1Н), 5,68 (й, 1=16,4 Гц, 1Н), 3,18 (8, 3Н), 2,97 (8, 3Н).

Синтез 3-(4-(пиридин-3 -ил)пиримидин-2-иламино)-4-метилбензогидразида 6

Метиловый эфир 4-метил-3-(4-пиридин-3-илпиримидин-2-иламино)-бензойной кислоты 4 (3,2 г, 10 ммоль) и гидразин (6 ммоль) растворяют в сухом Е1ОН (20 мл) и кипятят с обратным холодильником в течение ночи. Смесь охлаждают до комнатной температуры. Твердое вещество отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме в течение ночи и получают продукт 6 в виде светло-желтого твердого вещества.

Ή ЯМР (400 МГц, йе-ДМСО): δ 9,68 (8, 1Н), 9,26 (т, 1Н), 9,06 (8, 1Н), 8,69 (йй, 1=4,7, 1,5 Гц, 1Н), 8,52 (й, 1=5,1, 1,2 Гц, 1Н), 8,43 (т, 1Н), 8,1 (йй, 1=5,8, 1,6 Гц, 1Н), 7,56 (т, 2Н), 7,46 (йй, 1=5,1, 1,6 Гц, 1Н), 7,3 (й, 1=7,9 Гц, 1Н), 4,45 (8, 1Н), 3,33 (8, 3Н), 3,31 (8, 1Н).

МС (т/ζ) (М+1)⁺: 321,1.

Синтез { 5-[5-(3 -дифторметоксифенил)-2Н-[1,2,4]триазол-3 -ил]-2-метилфенил}-(4-пиридин-3 илпиримидин-2-ил)амин Α1

Гидразин 6 (160 мг, 0,5 ммоль) и 3-дифторметоксибензонитрил (338 мг, 2 ммоль) суспендируют в сухом пВиОН (2 мл)/NΜΡ (0,5 мл) и нагревают при 180°С в микроволновой печи в течение 1 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры. Смесь очищают с помощью препаративной ЖХ/МС (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия) и получают продукт А1 в виде светло-желтого твердого вещества.

Ή ЯМР (400 МГц, й₄-МеОН): δ 9,32 (8, 1Н), 8,6 (т, 2Н), 8,51 (й, 1= 4,9 Гц, 1Н), 7,95 (й, 1=7,5 Гц, 1Н), 7,86 (8, 1Н), 7,78 (й, 1=7,6 Гц, 1Н), 7,52 (т, 2Н), 7,42 (т, 2Н), 7,25 (й, 1=8,0 Гц, 1Н), 6,9 (1, 1=73,8 Гц, 1Н), 2,41 (8, 3Н).

МС (т/ζ) (М+1)⁺: 472,2.

Аналогичные методики используют для получения конечных соединений А2-А8. {2-Метил-5-[5-(3-трифторметоксифенил)-2Н-[1,2,4]триазол-3-ил]фенил}-(4-пиридин-3илпиримидин-2-ил)амин А2:

Ή ЯМР (400 МГц, й₆-ДМСО): δ 10 (8, 1Н), 9,42 (й, 1=8,6 Гц, 1Н), 9,3 (т, 2Н), 9,09 (й, 1=5,2 Гц, 1Н), 8,99 (8, 1Н), 8,67 (й, 1=7,8 Гц, 1Н), 8,56 (8, 1Н), 8,31 (йй, 1=7,8, 1,6 Гц, 1Н), 8,18 (йй, 1=7,8, 5,5 Гц, 1Н), 8,1 (1, 1=8,0 Гц, 1Н), 8,0 (й, 1=5,2 Гц, 1Н), 7,87 (т, 2Н), 2,94 (8, 3Н).

МС (т/ζ) (М+1)⁺: 490,2

Путем повторения методик, описанных в приведенных выше примерах (промежуточные продукты и конечные соединения), с использованием подходящих исходных веществ получают следующие соединения формулы I, приведенные в таблице.

- 13 017269

Анализы.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, исследуют для определения их способности селективно подавлять пролиферацию клеток Ва/Р3 дикого типа и клеток Ва/Р3, трансформированных с киназой Те1 с-кй и со слитыми Те1 ТРФРР тирозинкиназами. Кроме того, соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, селективно подавляют зависимую от ФСК пролиферацию клеток Мо7е. Кроме того, соединения исследуют для определения их способности ингибировать киназы ЛЫ, ЛЯС. ВСЯ-ЛЫ, ВИК, ЕрйВ, Еш8, Еуи, К1Ж с-кКй, ЬСК, ТРФРР, Ь-Яа£, с-Яа£, 8ЛРК2, 8тс, Т1е2 и ТгкВ.

Исследование пролиферации: библиотека ВаР3 - протокол считывания Впд1Ц д1о.

Соединения исследуют для определения их способности подавлять пролиферацию клеток дикого типа Ва/Р3 и клеток Ва/Р3, трансформированных с помощью слитых с Те1 тирозинкиназ. Нетрансформированные клетки Ва/Р3 держат в средах, содержащих рекомбинантный 1Ь-3. Клетки помещают в 384луночные планшеты ТС при плотности 5000 клеток/лунка в 50 мкл среды на лунку и прибавляют исследуемое соединение в количестве от 0,06 нМ до 10 мкМ. Затем клетки инкубируют в течение 48 ч при 37°С, 5% СО₂. После в каждую лунку прибавляют 25 мкл ВЯ1СНТ СЬО® (Рготеда) в соответствии с инструкциями изготовителя и планшеты считывают с использованием Лиа1у81 СТ - режим люминесцен

- 14 017269 ции - 50000 интегрирований с представлением результата в виде интенсивностей люминесценции в относительных единицах. Значения 1С₅₀, концентрацию соединения, необходимую для 50% подавления, определяют по зависимости доза-ответ.

Исследование Мо7е.

Соединения, описанные в настоящем изобретении, исследуют для определения их способности подавлять зависимую от ФСК пролиферацию с использованием клеток Мо7е, которые эндогенно экспрессируют с-кй, с использованием 96-луночных планшетов. Вкратце, методика заключается в следующем, для двукратных серийных разведений исследуемых соединений (С_тах=10 мкМ) исследуют антипролиферативную активность по отношению к клеткам Мо7е, стимулированным с помощью рекомбинантного ФСК человека. После 48 ч инкубации при 37°С жизнеспособность клеток определяют с помощью колориметрического анализа МТТ фирмы Рготеда.

Методика исследования с-кй НТКЕ.

Аликвоту (5 мкл) 2х концентрации смеси для исследования фермента с-кй, содержащей 25 нг с-к11 (5 нг/мкл) и 2 мкМ пептида биотин-ЕЕЕРСУЕЕ1Р1УЕЕЕЕР-ХН₂ в киназном буфере (20 мМ Тпк рН 7,5, 10 мМ МдС1₂, 0,01% БСА, 0,1% Вту35, 1 мМ ДТТ (дитиотреитол), 5% глицерин, 0,05 мМ Ыа₃УО₄) прибавляют в каждую лунку 384-луночного планшета ртох1р1а1е (Раскатй). Каждая лунка последнего ряда ртох1р1а1е содержит 5 мкл смеси для исследования фермента с-кй, не содержащей с-кй, и предназначена для оценки фона. Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, прибавляют в каждую лунку и планшеты инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. 2х АТФ (40 мкМ) в киназном буфере (5 мкл) прибавляют в каждую лунку и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч. В каждую лунку прибавляют смесь для детектирования (50% КР, 40% киназного буфера, 10% ЭДТК, 1:100 разведенный Май РТ66-К (са1# 61Т66КБВ) и 1:100 разведенный стрептавидин-ХЬ (са1# 6118АХБВ)0 (10 мкл) и планшеты дополнительно инкубируют в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Затем сигнал НТКЕ считывают с детектора.

Исследование пролиферации ТС-НА-У8МС человека.

Клетки ТС-НА-У8МС человека (АТСС) выращивают в МИСД, к которой прибавлено 10% ФБС, до слияния 80-90% и затем повторно суспендируют в МИСД, к которой прибавлено 1% ФБС и 30 нг/мл рекомбинантного ТРФР-ВВ человека по 6е4 клеток/мл. Затем аликвоты клеток помещают в 384-луночные планшеты по 50 мкл/лунка, инкубируют в течение 20 ч при 37°С, затем обрабатывают с помощью 0,5 мкл 100х соединений в течение 48 ч при 37°С. После обработки в каждую лунку прибавляют 25 мкл Се11Тйет-С1о в течение 15 мин, затем планшеты считывают с использованием СБ1РК (Мо1еси1аг Иеуйсек).

Методика исследования РИСЕКа/β Байсе™.

Аликвоту (2,5 мкл) 2х концентрации пептида Р^СЕКβ и смеси, содержащей АТФ (аденозинтрифосфат) (4 мкМ пептида биотинфАфАфА-АЕЕЕЕУУПЕАККК, 20 мкМ АТФ в буфере для исследования (20 мМ Нерек, 54 мМ МдС1₂, 0,01% БСА, 0,05% Т\тееп-20. 1 мМ ДТТ, 10% глицерин, 50 мкМ Иа₃УО₄)) прибавляют в каждую лунку 384-луночного планшета ртох1р1а1е (Раскатй). Планшеты центрифугируют и соединения, предлагаемые в настоящем изобретении (50 нл), прибавляют в каждую лунку с помощью дозатора рш!оо1. В каждую лунку прибавляют (2,5 мкл) 2х концентрации смеси ферментов (РИСЕКа при концентрации 4,5 нг/мкл (са1# РУ4117) или РИСЕ^ при концентрации 1,5 нг/мкл (са1# РУ3591) в буфере для анализа) или только буфер для анализа без фермента РБСЕКа/β. Планшеты инкубируют в течение 1,5 ч при комнатной температуре. В каждую лунку прибавляют смесь для детектирования (5 мкл; 50% 1 М КЕ, 40% киназного буфера, 10% ЭДТК, 1:100 разведенный Май РТ66-К (са1# 61Т66КБВ) и 1:100 разведенный стрептавидин-ХБ (са1# 6118АХБВ) и ртох1р1а1е инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, затем сигнал НТКЕ считывают с детектора.

Исследование пролиферации Ва/Е3 ЕБ ЕБТ3.

Используют линию клеток мышей Ва/Е3 рго-В, которая сверхэкспрессирует полноразмерную конструкцию ЕБТ3. Эти клетки держат в КРМ1 1640/10% фетальной бычьей сыворотки (КРМ1/ФБС), к которой прибавлены пенициллин 50 мкг/мл, стрептомицин 50 мкг/мл и Б-глутамин 200 мМ с прибавлением мышиного рекомбинантного 1Б-3. Ва/Е3 полноразмерные клетки ЕБТ3 выращивают при недостатке 1Б-3 в течение 16 ч и затем помещают в 384-луночные планшеты ТС при плотности 5000 клеток/лунка в 25 мкл среды на лунку и прибавляют исследуемое соединение в количестве от 0,06 нМ до 10 мкМ. После прибавления соединения прибавляют лиганд ЕБТ3 или 1Б-3 для контроля цитотоксичности в 25 мкл среды/лунка при соответствующих концентрациях. Затем клетки инкубируют в течение 48 ч при 37°С, 5% СО₂. После инкубации клеток в каждую лунку прибавляют 25 мкл ВК1СНТ СБО® (Рготеда) в соответствии с инструкциями изготовителя и планшеты считывают с использованием Апа1ук1 СТ - режим люминесценции - 50000 интегрирований с представлением результата в виде интенсивностей люминесценции в относительных единицах.

- 15 017269

Подавление пролиферации клеток, зависимой от ВСЯ-АЬ1 (высокопроизводительная методика).

Используют линию клеток мышей, представляющую собой гемопоэтическую родительскую линию клеток 32Ό, трансформированную с помощью ВСЯ-АЬ1 кДНК (32Ό-ρ210). Эти клетки выдерживают в МИСД (модифицированная Иглом среда Дульбекко)/10% фетальная телячья сыворотка (МИСД/ФТС) с прибавлением пенициллина 50 мкг/мл, стрептомицина 50 мкг/мл и Ь-глутамина 200 мМ. Нетрансформированные клетки 32Ό аналогичным образом выдерживают с прибавлением 15% кондиционированной среды \УЕН1 (\Уа11ег и Εΐίζα На11 БъШШе οί МеФса1 Яекеатсй) в качестве источника 1Ь-3.

мкл суспензии клеток 32Ό или 32Ό-ρ210 помещают в 384-луночные микропланшеты Сгешег (черные) при плотности 5000 клеток/лунка. В каждую лунку прибавляют 50 нл исследуемого соединения (1 мМ исходного раствора в ДМСО) (8ΤΙ571 включают в качестве положительного контроля). Клетки инкубируют в течение 72 ч при 37°С, 5% СО₂. В каждую лунку прибавляют 10 мкл 60% раствора А1атаг В1ие (Тек Фа§по511С5) и клетки инкубируют в течение еще 24 ч. Интенсивность флуоресценции (возбуждение при 530 нм, испускание при 580 нм) количественно определяют с помощью системы Асциек!™ (Мо1еси1аг Эеу1се5).

Подавление пролиферации клеток, зависимой от ВСЯ-АЫ.

Клетки 32Ό-ρ210 помещают в 96-луночные планшеты ТС при плотности 15000 клеток/лунка. 50 мкл двукратных серийных разведений исследуемого соединения (С_тах=40 мкМ) прибавляют в каждую лунку (8ΤΙ571 включают в качестве положительного контроля). После инкубации клетки в течение 48 ч при 37°С, 5% СО₂ 15 мкл МТТ (Рготеда) прибавляют в каждую лунку и клетки инкубируют в течение еще 5 ч. Оптическую плотность при 570 нм количественно определяют с помощью спектрофотомерии и значения 1С₅₀, концентрацию соединения, необходимую для 50% подавления, определяют по зависимости доза-ответ.

Влияние на распределение клеточного цикла.

Клетки 32Ό и 32Ό-ρ210 помещают в 96-луночные планшеты ТС по 2,5х10⁶ клеток/лунка в 5 мл среды и прибавляют исследуемые соединения в количестве 1 или 10 мкМ (8ΤΙ571 включают в качестве контроля). Затем клетки инкубируют в течение 24 или 48 ч при 37°С, 5% СО₂. 2 мл суспензии клеток промывают с помощью ФБС (фетальная бычья сыворотка), фиксируют в 70% Е1ОН в течение 1 ч и обрабатывают с помощью ФБС/ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота)/ЯЫа8е А в течение 30 мин. Прибавляют пропидиййодид (СГ=10 мкг/мл) и интенсивность флуоресценции количественно определяют с помощью проточной цитометрии с использованием системы ЕАС8са11Ьит™ (ВЭ Вюкшепсек). Исследуемые соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, обнаруживают апоптозное воздействие в случае клеток 32Ό-ρ210, но не вызывают апоптоз родительских клеток 32Ό.

Влияние на клеточное аутофосфорилирование ВСЯ-АЬ1.

Аутофосфорилирование ВСЯ-АЬ1 количественно исследуют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с захватом с использованием специфического по отношению к с-аЬ1 антитела для захвата и антитела к антифосфотирозину. Клетки 32Ό-ρ210 помещают в 96-луночные планшеты ТС по 2х10⁵ клеток/лунка в 50 мкл среды. 50 мкл двукратных серийных разведений исследуемых соединений (С_тах=10 мкМ) прибавляют в каждую лунку (8ΤΙ571 включают в качестве положительного контроля). Клетки инкубируют в течение 90 мин при 37°С, 5% СО2. Затем клетки в течение 1 ч на льду обрабатывают с помощью 150 мкл литического буфера (50 мМ Τπ5-ΗΟ (Ττίδ - трис-(гидроксиметил)аминометан), рН 7,4, 150 мМ №1С1. 5 мМ ЭДТК, 1 мМ ЭГТК (этиленгликольтетрауксусная кислота) и 1% ΝΡ-40), содержащего ингибиторы протеазы и фосфатазы. 50 мкл лизата клеток помещают в 96-луночные планшеты для оптических исследований, предварительно покрытые специфическими анти-аЬ1 антителами, и блокируют. Планшеты инкубируют в течение 4 ч при 4°С. После промывки буфером ΤВ8-Τ^ееη 20 (ΤВ8-забуференный с помощью Τπ5 физиологический раствор), прибавляют 50 мкл конъюгированных с щелочной фосфатазой антифосфотирозиновых антител и планшеты дополнительно инкубируют в течение ночи при 4°С. После промывки буфером ΤВ8-Τ^ееη 20 прибавляют 90 мкл люминесцентного субстрата и люминесценцию количественно исследуют с помощью системы Лсс.|ие51™ (Мо1еси1аг Эеу1се5). Исследуемые соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, которые ингибируют пролиферацию клеток, экспрессирующих ВСЯ-АЬ1, ингибируют клеточное аутофосфорилирование ВСЯ-АЬ1 зависимым от дозы образом.

Влияние на пролиферацию клеток, экспрессирующих мутантные формы Всг-аЬ1.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, исследуют для определения их антипролиферативного воздействия на клетки Ва/Е3, экспрессирующие форму дикого типа или мутантные формы ВСЯ-АЬ1 (С250Е, Е255У, Т3151, Е317Б, М351Т), которым придана резистентность или сниженная чувствительность по отношению к 8ΤΙ571. Антипролиферативное воздействие этих соединений на клетки, экспрессирующие мутантную ВСЯ-АЬ1, и на ^трансформированные клетки исследуют при 10, 3,3, 1,1 и 0,37 мкМ, как это описано выше (в средах без ГБ-3). Значения Ιί.'₅₀ для соединений, нетоксичных для нетрансформированных клеток, определяют по зависимостям доза-ответ, полученным, как это описано выше.

- 16 017269

БОБР3 (ферментный анализ).

Исследование активности киназы с использованием очищенного БОБР3 (ИрйаГе) проводят при конечном объеме, равном 10 мкл, содержащем 0,25 мкг/мл фермента в киназном буфере (30 мМ Ттк-НС1 рН 7,5, 15 мМ МдС1₂, 4,5 мМ МпС1₂, 15 мкМ №1₃УО₄ и 50 мкг/мл БСА (бычий сывороточный альбумин), и субстраты (5 мкг/мл биотин-поли-Е¥(61и, Туг) (С18-И8, 1пс.) и 3 мкМ АТФ). Готовят два раствора: сначала первый раствор объемом 5 мкл, содержащий фермент БОБР3 в киназном буфере, помещают в 384-луночные планшеты Ртох1Р1а1е® (Реткш-Е1тет) и затем прибавляют 50 нл соединений, растворенных в ДМСО, затем в каждую лунку прибавляют 5 мкл второго раствора, содержащего субстрат (поли-ΕΥ) и АТФ в киназном буфере. Реакционные смеси инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, реакции останавливают путем прибавления 10 мкл смеси для детектирования НТКЕ, которая содержит 30 мМ Тгк-НС1 рН 7,5, 0,5 М КБ, 50 мМ ЭДТК, 0,2 мг/мл БСА, 15 мкг/мл стрептавидин-ХЬ665 (С18-И8, 1пс.) и 150 нг/мл конъюгированных с криптатом антифосфотирозиновых антител (С18-И8, 1пс.). После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре для проведения взаимодействия стрептавидинбиотин с помощью Лпа1у51 ОТ (Мо1еси1аг Эеу1се5 Согр.) считывают сигналы флуоресценции с разрешением по времени. Значения 1С₅₀ рассчитывают с помощью линейного регрессионного анализа выраженного в процентах подавления каждым соединением при 12 концентрациях (разведения 1:3 от 50 мкМ до 0,28 нМ). В этом исследовании соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают значениями 1С₅₀, находящимися в диапазоне от 10 нМ до 2 мкМ.

БОБР3 (исследование в клетках).

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, исследуют для определения их способности подавлять пролиферацию трансформированных Ва/Б3-ТЕЬ-БОБР3 клеток, которая зависит от активности клеточной киназы БОБР3. Ва/Б3-ТЕЬ-БОБР₃ выращивают вплоть до 800000 клеток/мл в суспензии с МИСД 1640 с прибавлением 10% фетальной бычьей сыворотки в качестве культуральной среды. Клетки помещают в 384-луночный планшет по 5000 клеток/лунка в 50 мкл культуральной среды. Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, растворяют и разводят в диметилсульфоксиде (ДМСО). Готовят 12 серийных разведений 1:3 в ДМСО для получения набора концентраций, обычно находящегося в диапазоне от 10 мМ до 0,05 мкМ. К клеткам прибавляли 50 нл разведенных соединений и инкубируют в течение 48 ч в инкубаторе для культур клеток. А1ашатВ1ие® (ТРЕК И1адпо8Йс ЗуМепъ). который можно использовать для мониторинга восстановительной среды, образованной пролиферирующими клетками, прибавляют к клеткам при конечной концентрации, равной 10%. После еще 4 ч инкубации при 37°С в инкубаторе для культур клеток сигналы флуоресценции восстановленного А1атагВ1ие® (возбуждение при 530 нм, испускание при 580 нм) измеряют с помощью АпаБМ ОТ (Мо1еси1аг Иеуюек Согр.). Значения 1С₅₀ рассчитывают с помощью линейного регрессионного анализа выраженного в процентах подавления каждым соединением при 12 концентрациях.

Ь-РаГ- ферментный анализ.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, исследуют для определения их способности ингибировать активность Ь-РаГ. Исследование проводят в 384-луночных планшетах Мах18огр (ΝυΝΟ) с черными стенками и прозрачным дном. Субстрат, 1кВа, разводят в ЗФФД (забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко) (1:750) и в каждую лунку прибавляют 15 мкл. Планшеты инкубируют при 4°С в течение ночи и 3 раза промывают с помощью ТВ8Т (25 мМ Ттк, рН 8,0, 150 мМ №1С1 и 0,05% Тетееп-20) с использованием устройства для промывки планшетов ЕМВЬА. Планшеты блокируют с помощью 8иретЬ1оск (15 мкл/лунка) в течение 3 ч при комнатной температуре, 3 раза промывают с помощью ТВ8Т и сушат. В каждую лунку прибавляют буфер для анализа, содержащий 20 мкМ АТФ (10 мкл), и затем 100 или 500 нл соединения. Ь-РаГ разводят в буфере для анализа (1 мкл в 25 мкл) и в каждую лунку прибавляют 10 мкл разведенного Ь-РаГ (0,4 мкг/лунка). Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Реакцию киназы останавливают путем проводимой 6 раз промывки планшетов с помощью ТВ8Т. Антитела Рйо8рй-1кВа8ет32/36) разводят в 8иретЬ1оск (1:10,000) и в каждую лунку прибавляют 15 мкл. Планшеты инкубируют при 4°С в течение ночи и 6 раз промывают с помощью ТВ8Т. АР-конъюгированный козий-антимышиный 1дО разводят в 8иретЬ1оск (1:1,500) и в каждую лунку прибавляют 15 мкл. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч и 6 раз промывают с помощью ТВ8Т. В каждую лунку прибавляют 15 мкл флуоресцентного субстрата Л11ор1ю5 АР (Рготеда) и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Планшеты считывают с использованием Лсдией или Апа1у81 ОТ с использованием программы определения интенсивности флуоресценции (возбуждение при 455 нм, испускание при 580 нм).

Ь-РаГ - исследование в клетках.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, исследуют в клетках А375 для определения их способности ингибировать фосфорилирование МЕК. Линию клеток А375 (АТСС) получают из клеток меланомы человека, и она содержит мутацию У599Е в гене Ь-РаГ. Содержание фосфорилированного МЕК повышено вследствие мутации Ь-РаГ. Субконфлюэнтные и конфлюэнтные клетки А375 инкубируют с соединениями в течение 2 ч при 37°С в бессывороточной среде. Затем клетки один раз промывают холодным ЗФФ (забуференный фосфатом физиологический раствор) и подвергают лизису в литическом

- 17 017269 буфере, содержащем 1% Тгйоп Х100. После центрифугирования надосадочные жидкости подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия и затем переносят на мембраны из нитроцеллюлозы. Затем мембраны подвергают вестерн-блоттингу с антифосфо-МЕК антителами (§ег217/221) (Се11 81дпа1шд). За количеством фосфорилированного МЕК следят по плотности полос фосфо-МЕК на мембранах из нитроцеллюлозы.

Ир81а1е - радиоферментное исследование связывания с фильтром.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, исследуют для определения их способности ингибировать отдельные представители группы киназ. Соединения исследуют по два раза при конечных концентрациях, равных 10 мкМ, по этому типичному протоколу. Отметим, что составы киназного буфера и субстраты были разными для разных киназ, включенных в группу ирЧаЮ Ι<ίπ;·ΐ!^ΡΐΌΓίΚΓ™. Киназный буфер (2,5 мкл, 10х - при необходимости содержащий МпС1₂), активную киназу (0,001-0,01 Ед; 2,5 мкл), специфический или Ρο1\·(Ό1ιι4-Τ\τ) пептид (5-500 мкМ или 0,01 мг/мл) в киназном буфере и киназный буфер (50 мкМ; 5 мкл) смешивают в пробирке Эппендорфа на льду. Прибавляют смесь Мд/АТФ (10 мкл; 67,5 (или 33,75) мМ МдС1₂, 450 (или 225) мкМ АТФ и 1 мкКи/мкл [у-³²Р]-АТФ (3000 Ки/ммоль)) и реакционную смесь инкубируют примерно при 30°С в течение примерно 10 мин. Реакционную смесь наносят (20 мкл) на квадратики бумаги 2x2 см Р81 (фосфоцеллюлоза, для положительно заряженных пептидных субстратов) или \У11а1шап Νο. 1 (для Ρο1у(С1и4-Τу^) пептидного субстрата). Исследуемые квадратики промывают 4 раза по 5 мин с помощью 0,75% фосфорной кислоты и промывают один раз ацетоном в течение 5 мин. Исследуемые квадратики переносят в сцинтилляционный сосуд, прибавляют 5 мл сцинтилляционной смеси и содержание ³²Р (импульсов/мин) в пептидном субстрате количественно определяют с помощью сцинтилляционного счетчика Весктап. Для каждой реакции рассчитывают ингибирование, выраженное в процентах.

Соединения формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли обладают ценными фармакологическими характеристиками, например, как об этом свидетельствуют проведенные ш νίΐτο исследования, описанные в настоящем изобретении. Например, соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, по данным исследования Мо7е обладают значениями 1С₅₀, равными менее 1 мкМ, и обладают более чем 10-кратной селективностью по отношению к Всг-аЬ1.

Следует понимать, что описанные в настоящем изобретении примеры и варианты осуществления предназначены только для иллюстрации и что в соответствии с сущностью и объемом настоящего изобретения и объемом прилагаемой формулы изобретения специалист в данной области техники может внести в нее различные модификации и изменения. Все публикации, патенты и заявки на патенты, цитированные в настоящем изобретении, включены в настоящее изобретение в качестве ссылки для всех объектов.

Claims (4)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы I

   I в которой Ь обозначает 5-членное гетероарильное кольцо, содержащее 3 атома азота, выбранное из

   К1, К2а и К2Ь обозначают водород;

   К₃ выбран из С₆-С1₀-арила и 5-15-членного гетероарила, содержащего гетероатом, выбранный из О, N или 8; где указанный арил или гетероарил в качестве К₃ замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей С₃-С₆-алкоксигруппу, С₃-С₆-алкоксигруппу, замещенную галогеном, и -Х₂ОК_5а, где Х₂ выбран из связи и С1-С₄-алкилена и К_5а выбран из водорода и С1-С₆-алкила; и его фармацевтически приемлемые соли.
2. 2. Соединение по п.1, в котором К₃ выбран из фенила, замещенного группой, выбранной из дифторметоксигруппы, гидроксиметила, трифторметоксигруппы, метилсульфонила, метоксигруппы и этоксигруппы, и 2,3-дигидробензофуран-5-ила.
3. 3. Соединение по п.1, выбранное из группы, включающей {5-[5-(3-дифторметоксифенил)-2Н-[1,2,4]триазол-3-ил]-2-метилфенил}-(4-пиридин-3-илпиримидин-

   2-ил)амин;

   №(2-метил-5-(5-(3 -(трифторметокси)фенил)-1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)фенил)-4-(пиридин-3ил)пиримидин-2-амин;

   №(2-метил-5-(5-(3-(метилсульфонил)фенил)-1Н-1,2,4-триазол-3-ил)фенил)-4-(пиридин-3ил)пиримидин-2-амин;

   Ν-(5-(5-(3 -метоксифенил)-1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)-2-метилфенил)-4-(пиридин-3 -ил)пиримидин-2

   - 18 017269 амин;

   Ν-(5-(5-(3 -этоксифенил)-1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)-2-метилфенил)-4-(пиридин-3 -ил)пиримидин-2амин;

   №(5-(5-(2,3-дигидробензофуран-5-ил)-1Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2-метилфенил)-4-(пиридин-3ил)пиримидин-2-амин;

   №(5-(5-(4-(дифторметокси)фенил)-1Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2-метилфенил)-4-(пиридин-3ил)пиримидин-2-амин и (3-(3-(4-метил-3-(4-(пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)-1Н-1,2,4-триазол-5ил)фенил)метанол.
4. 4. Фармацевтическая композиция, включающая соединения по п.1 в терапевтически эффективном количестве в комбинации с фармацевтически приемлемым инертным наполнителем.

   Евразийская патентная организация, ЕАПВ

   Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2