CN104458674A - 一种筛选血管内皮生长因子1激酶抑制剂高通量筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明发现了一种筛选血管内皮生长因子1激酶抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)血管内皮生长因子1激酶抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验；(2)阳性药验证模型可靠性：选用合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分别加入2μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，加入2ul ATP反应，按优化时间室温孵育；每孔加入10μl终止液终止反应，室温孵育1小时后检测，分析得阳性药IC₅₀；(3)高通量筛选模型验证：按照上述步骤操作，使用Biomek NX^P自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样，计算Z因子。本发明的优点主要有：1)简便快捷；2)灵敏度高；3)结果稳定可靠，重现性好，可用于高通量筛选。

Description

一种筛选血管内皮生长因子1激酶抑制剂高通量筛选方法

技术领域

本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶(VEGFR)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对VEGFR激酶抑制活性的高通量检测。

背景技术

VEGFR家族主要包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1／KDR)、VEGFR-3(Flt-4)三个成员，属于受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)，由3部分组成，包括胞外的7个免疫球蛋白样结构域、跨膜区和胞内的酪氨酸激酶活性区。VEGFR-1是VEGF-A、VEGF-B和PIGF的高亲和性受体，存在于血管内皮细胞、造血干细胞、巨噬细胞和单核细胞表面，与这些细胞的迁移有关。受体或相应配体的过量表达，会通过多条路径、多种机制激活细胞内信号转导，信号蛋白进入细胞核激活转录因子，导致细胞增殖失调、凋亡抑制、血管生成、细胞侵袭和转移等，进而导致肿瘤和其他相关疾病的发生。VEGFR酪氨酸激酶抑制剂作用于VEGFR信号转导过程的最上游，能阻断多条通路，具有治疗范围广、疗效高和不易耐药等优点。因此，研究VEGFR激酶抑制剂具有重大意义。

时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。

目前，已有多种VEGFR1激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选VEGFR1激酶抑制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制VEGFR1激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：

本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型。

步骤一：VEGFR1激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：VEGFR1激酶浓度梯度优化实验结果。

图2：VEGFR1激酶温孵时间优化实验结果。

图3：VEGFR1激酶底物浓度优化实验结果。

图4：VEGFR1激酶ATP浓度优化实验结果。

图5：阳性药十字孢碱对VEGFR1激酶的抑制曲线图。

图6：VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。

图7：高通量筛选Z′值分布。

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

1.VEGFR1激酶抑制剂筛选方法建立

(1)实验材料

VEGFR1激酶检测试剂盒(Cisbio，法国)、VEGFR1激酶(Invitrogen，美国)、ATP(生兴，中国)、十字孢碱(碧云天，中国)、384低体积白板(Corning，美国)、枪头(Axygen，美国)。

(2)实验步骤

1)进行VEGFR1激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。

2)待测化合物精确称量，加入DMSO溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1×10^-3mol／L。

3)在反应容器中每孔加入VEGFR1激酶溶液2μl，底物溶液2μl，缓冲液或待筛化合物4μl，ATP2μl。室温反应1小时。

4)每孔加入Estradiol-XL665 5μl，Anti-Estradiol-cryptate 5μl，室温孵育1小时。

5)利用美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司检测平台HTRF模块分别检测665nm和610nm处的荧光强度。

6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC₅₀值，见图5。

7)采集检测信号并绘图，通过信号窗和Z’值确定高通量筛选模型的可靠性，见图6，7。

2.数据处理

(1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio665／610)；

(2)根据公式计算各孔的相对抑制率

(3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值，使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC₅₀。

实验结果

VEGFR1激酶筛选模型优化结果：最佳反应所需的VEGFR1激酶为0.2ng／μl(见图1)，最佳温孵时间为60min(见图2)，最佳底物浓度为148.8nM(见图3)，最佳ATP浓度为1.1μM(见图4)。阳性药半数抑制率IC₅₀为14.18nM(见图5)，并通过信噪比和Z’值(见图6，7)验证表明采用本方法建立的VEGFR1激酶抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求，实验结果稳定可靠，可以用于进行VEGFR1激酶抑制剂的高通量筛选。

Claims (6)

1.一种血管内皮生长因子1激酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： 

(1)激酶抑制剂筛选模型的建立与优化； 

(2)阳性药验证模型可靠性； 

(3)高通量筛选模型验证。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为血管内皮生长因子1激酶。 

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中进行血管内皮生长因子1激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。 

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，由步骤(1)可得到最佳反应所需的血管内皮生长因子1激酶浓度为0.2ng／μl，最佳温孵时间为60min，最佳底物浓度为148.8nM，最佳ATP浓度为1.1μM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)选用步骤(1)所到的合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km；将激酶和底物按1：2体积混合，每孔加入4μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，最后每孔加入2μl ATP开始反应，按优化时间室温孵育；配制SA-XL665和TK-Ab，将SA-XL665和TK Ab按体积比1：1混合，每孔加入10μl终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药半数抑制率IC₅₀为14.18nM。 

6.权利要求1-5中所述任一方法在筛选血管内皮生长因子1激酶抑制剂的应用。