DE69333080T2

DE69333080T2 - Fibrindichtungsmittelzusammensetzungen und Verfahren zu deren Verwendung

Info

Publication number: DE69333080T2
Application number: DE69333080T
Authority: DE
Inventors: Peter Andrew David Edwardson; John Esam Fairbrother; Ronald Stephen Gardner; Derek Andrew Hollingsbee; Stuart Anthony Cederholm-Williams
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: VIVOLUTION A/S, BIRKEROD, DK
Priority date: 1992-10-08
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2013-10-09
Also published as: EP0592242B1; US5962420A; PL173858B1; CA2566574A1; NO314412B1; SK109393A3; HU218898B; JPH06199685A; DE69333080D1; IL107211A0; US5739288A; NO933624D0; EP1266666A2; ES2202306T3; FI110616B; JP3771284B2; EP0592242A1; RU2143924C1; NZ248897A; ATE244581T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Fibrindichtungsmittel. Genauer wird in Übereinstimmung mit der Erfindung eine Zusammensetzung, die ein Fibrinmonomer oder eine nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung umfasst, als Komponente eines Fibrindichtungsmittels verwendet.
Ein Mechanismus der Hämostase, d. h. die Verhütung von Blutverlust, eines Säugers ist die Bildung eines Blutgerinnsels. Die Blutgerinnselbildung in Menschen, d. h. die Blutkoagulation, geschieht mittels einer komplexen Kaskade von Umsetzungen mit den entscheidenden Schritten der Umwandlung von Fibrinogen – einem Monomer – durch Thrombin, Calciumionen und aktiviertem Faktor XIII, um schließlich ein vernetztes Fibrin II-Polymer zu bilden, das das Fibrinkoagulum ist.
Die Bildung des vernetzten Fibrin II-Polymers geschieht durch das Fibrinogen, das durch Thrombin in ein Fibrin I-Monomer umgewandelt wird, das spontan polymerisiert, um das Fibrin I-Polymer zu bilden, auf das manchmal als lösliches Fibrin I Bezug genommen wird, weil das Fibrin I-Polymer durch Behandlung mit geeigneten chemischen Mitteln zurück in das Fibrin I-Monomer umgewandelt werden kann. Das Fibrin I-Polymer wird dann durch Thrombin in das Fibrin II-Polymer umgewandelt, das manchmal als lösliches Fibrin II bezeichnet wird, weil das Fibrin II-Polymer durch Behandlung mit geeigneten chemischen Mitteln in das Fibrin II-Monomer umgewandelt werden kann. Das Fibrin II-Polymer wird dann unter dem Einfluss des Faktor XIIIa – bekannt als aktivierter Faktor XIII – vernetzt, um vernetztes Fibrin II zu bilden, das das Fibrinkoagulum ist. Der Faktor XIII wird durch Thrombin in Gegenwart von Calciumionen aktiviert. Vernetztes Fibrin II wird manchmal als unlösliches Fibrin II bezeichnet, weil es nicht in das Fibrin II-Monomer umgewandelt werden kann. Es sollte beachtet werden, dass Thrombin aus Prothrombin gebildet wird. Prothrombin wird durch den Faktor Xa in Gegenwart von Calcium und anderen Hilfssubstanzen zu Thrombin umgewandelt.
Fibrinogen stellt etwa 2 bis 4 Gramm/Liter des Blutplasmaproteins dar. Fibrinogen ist ein Monomer, das aus drei Paaren disulfidverbundener Polypeptidketten besteht, die mit (Aα)₂, (Bβ)₂, γ₂ bezeichnet werden. „A" und „B" stellen die zwei kleinen aminoterminalen Peptide, bekannt als Fibrinopeptid A beziehungsweise Fibrinopeptid B, dar. Die Abspaltung des Fibrinopeptids A von dem Fibrinogen in der Umwandlung von Fibrinogen durch Thrombin führt zu der Fibrin I-Verbindung, und die nachfolgende Abspaltung des Fibrinopeptids B führt zu der Fibrin II-Verbindung. Die Abspaltung der Fibrinopeptide A und B verringert das Molekulargewicht des Fibrinogens um eine extrem kleine Menge, um etwa 6000 von 340000 Dalton, aber sie legt die Polymerisationsstellen frei. Für einen Überblick der Mechanismen der Blutkoagulation und der Struktur des Fibrinogens siehe C. M. Jackson, Ann. Rev. Biochem., 49: 765–811 (1980) und B. Furie und B. C. Furie, Cell, 53: 505–518 (1988).
Ein Fibrindichtungsmittel ist ein biologischer Klebstoff, dessen Wirkung die entscheidenden Schritte der Koagulation nachahmt, was zu einem Fibrinkoagulum führt. Herkömmliche Fibrindichtungsmittel bestehen aus konzentriertem humanen Fibrinogen, bovinem Aprotinin und Faktor XIII als erste Komponente und bovinem Thrombin und Calciumchlorid als zweite Komponente. Die Anwendung wird im Allgemeinen mit einer doppelläufigen Spritze durchgeführt, die das gleichzeitige Auftragen beider Komponenten an die Stelle, wo das Fibrinkoagulum gebildet werden soll, erlaubt. Aprotinin ist ein fibrinolytischer Inhibitor, der zugegeben wird, um die Stabilität der Fibrindichtungsmittel zu fördern.
Die Fibrinogenkomponente des Fibrindichtungsmittels wird aus humanem Poolplasma hergestellt. Das Fibrinogen kann aus dem humanen Plasma mittels Kryopräzipitieren und Präzipitieren unter Verwendung verschiedener Reagenzien, z. B. Polyethylenglykol, Ether, Ethanol, Ammoniumsulfat oder Glycin, konzentriert werden. Für einen ausgezeichneten Überblick über Fibrindichtungsmittel siehe M. Brennan, Blood Reviews, 5: 240–244 (1991); J. W. Gibble und P. M. Ness, Transfusion, 30: 741–747 (1990); H. Matras, J. Oral Maxillofac Surg., 43: 605–611 (1985) und R. Lerner und N. Binur, J. of Surgical Research, 48: 165–181 (1990).
Kürzlich gab es auch Interesse an der Herstellung von Fibrindichtungsmitteln, die autologes Fibrin nutzen. Ein autologes Fibrindichtungsmittel ist ein Fibrindichtungsmittel, wobei die Fibrinogenkomponente des Fibrindichtungsmittels aus dem Eigenblut des Patienten extrahiert wird. Die Verwendung eines autologen Fibrindichtungsmittels ist bevorzugt, weil es das Risiko der Übertragung von über das Blut übertragbaren Infektionen wie z. B. Hepatitis B, Hepatitis Non-A-Non-B und das erworbene Immunmangelsyndrom (AIDS), die andernfalls in der Fibrinogenkomponente, die aus humanem Poolplasma extrahiert wird, vorkommen können, ausschließt. Siehe L. E. Silberstein et al., Transfusion, 28: 319–321 (1988); K. Laitakari und J. Luotonen, Laryngoscope, 99: 974–976 (1989) und A. Dresdale et al., The Annals of Thoracic Surgery, 40: 385–387 (1985).
Eine Infektion kann durch ein Fibrindichtungsmittel nicht nur über das Fibrinogen, sondern auch über die bovine Aprotinin- und die bovine Thrombinkomponente übertragen werden. Man weiß von bovinem Thrombin, dass es das infektiöse Agens der bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE) und andere für Säuger pathogene Viren trägt. Darüber hinaus ist bovines Thrombin ein potentes Antigen, das beim Menschen immunologische Reaktionen verursachen kann. Deshalb könnte die Verwendung von bovinem Thrombin dazu führen, dass der Empfänger des bovinen Thrombins nachteilig beeinträchtigt wird. Siehe D. M. Taylor, J. of Hospital Infection, 18 (Supplement A): 141–146 (1991), S. B. Prusiner et al., Cornell Vet, 81 Nr. 2: 85– 96 (1991) und D. Matthews, J. Roy. Soc. Health, 3–5 (Februar 1991).
Folglich besteht Bedarf an einem Fibrindichtungsmittel, das einem Patienten ohne das Risiko einer viralen Kontamination oder anderer nachteiliger Wirkungen gegeben werden kann.
Der Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung von Fibrin, das ein nichtdynamisches Fibrinmonomer oder -oligomer ist, in der Herstellung einer Zusammensetzung zur Bildung eines Fibrindichtungsmittels, wobei das Fibrindichtungsmittel durch Umwandlung des nichtdynamischen Fibrinmonomers oder -oligomers in ein Fibrinpolymer erzeugt wird, gleichzeitig wenn die Zusammensetzung mit der gewünschten Stelle in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Fibrindichtungsmittel erzeugt wird; und wobei „nichtdynamisch" bedeutet, dass das Fibrinmonomer oder -oligomer für mindesten 1,5 Minuten nicht polymerisiert.
Verschiedene weitere Ausführungsformen der Erfindung sind hier im folgenden in den unabhängigen Ansprüchen bekannt gemacht.
Zum Zweck der vorliegenden Endung werden die folgenden Definitionen benutzt:
Fibrin – Fibrin bedeutet jede Form von Fibrin. Nicht einschränkende Beispiele von Fibrin schließen Fibrin I, Fibrin II und des BB Fibrin ein. Das Fibrin kann in monomerer Form oder polymerer Form vorliegen, wobei die Polymerform entweder nichtvernetzt oder vernetzt ist.
Fibrinmonomer – Das Fibrinmonomer schließt jede Form des Fibrins ein, z. B. Fibrin I, Fibrin II oder des BB Fibrin, wobei das Fibrin in monomerer Form oder oligomerer Form vorliegt, die in der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung solubilisiert werden können, und wobei das Fibrinmonomer in ein Fibrinpolymer umgewandelt werden kann.
Fibrinpolymer – Das Fibrinpolymer schließt jede Form des Fibrins ein, z. B. Fibrin I, Fibrin II oder des BB Fibrin, wobei das Fibrin in Polymerform vorliegt, entweder nichtvernetzt oder vernetzt.
Nichtvernetztes Fibrin – Das nichtvernetzte Fibrin schließt jede Form des Fibrins ein, z. B. Fibrin I, Fibrin II oder des BB Fibrin, wobei das Fibrin nichtvernetzt ist und in vernetztes Fibrin umgewandelt werden kann. Das nichtvernetzte Fibrin kann ein Fibrinmonomer oder ein nichtvernetztes Fibrinpolymer sein.
Vernetztes Fibrin – Das vernetzte Fibrin schließt jede Form des Fibrins ein, z. B. Fibrin I, Fibrin II oder des BB Fibrin, wobei das Fibrin ein Fibrinpolymer ist, das vernetzt ist.
DIE FIBRINMONOMER UMFASSENDE ZUSAMMENSETZUNG
Die Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung, die jede Form eines Fibrinmonomers beinhaltet, das in ein Fibrinpolymer umgewandelt werden kann. Nicht einschränkende Beispiel für das Fibrinmonomer schließen Fibrin I-Monomer, Fibrin II-Monomer oder des BB Fibrinmonomer ein, wobei das Fibrin I-Monomer bevorzugt ist. Natürlich können Gemische des Fibrinmonomers vorkommen. Auch schließt das Fibrinpolymer zum Zweck der vorliegenden Erfindung jedes Polymer ein, das aus der Polymerisation eines Fibrinmonomers erhalten wurde. Daher kann zum Beispiel die Umwandlung des Fibrin I-Monomers in ein Fibrinpolymer zu einem vernetzten oder nichtvernetzten Fibrin I-Polymer und/oder zu einem vernetzten oder nichtvernetzten Fibrin II-Polymer führen, in Abhängigkeit davon, wie der Umwandlungsschritt durchgeführt wird.
Das Fibrin I-Monomer ist bevorzugt, weil es im Gegensatz zu dem Fibrinogen leicht in ein Fibrinpolymer umgewandelt werden kann ohne die Verwendung von Thrombin oder Faktor XIII. Tatsächlich kann das Fibrin I-Monomer spontan ein Fibrin I-Polymer erzeugen, das wie das Fibrinkoagulum wirken kann, ungeachtet dessen, ob das Fibrin I-Polymer vernetzt oder nichtvernetzt ist oder weiter in ein Fibrin II-Polymer umgewandelt wird. Deshalb kann, da die Bildung des Fibrin I-Polymers aus dem Fibrin I-Monomer spontan ist, das Fibrin I-Polymer ohne Thrombin und Faktor XIII erzeugt werden, wobei die Probleme, die mit dem bovinen Thrombin einhergehen, vermieden werden. (Es sollte beachtet werden, dass, wenn das Fibrin I-Monomer benutzt wird, derart, dass das Fibrin I-Monomer mit dem Blut des Patienten zum Beispiel auf einer Wunde in Kontakt kommt, das Thrombin des Patienten und der Faktor XIII das Fibrin I-Polymer in vernetztes Fibrin II-Polymer umwandeln können.)
Die nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung, die jede Form nichtvernetzten Fibrins umfasst. Nicht einschränkende Beispiele von nichtvernetztem Fibrin sind nichtvernetztes Fibrin I, nichtvernetztes Fibrin II und des BB Fibrin, wobei nichtvernetztes Fibrin I bevorzugt ist. Natürlich können zum Beispiel Gemische von nichtvernetztem Fibrin vorliegen. Auch schließt zum Zweck des vorliegenden Endung „vernetztes Fibrin" jede Form von Fibrin ein, die aus der Umwandlung von nichtvernetztem Fibrin in vernetztes Fibrin erhalten wird. Deshalb kann zum Beispiel das vernetzte Fibrin, das aus der Umwandlung von nichtvernetztem Fibrin I zu vernetztem Fibrin erhalten wurde, vernetztes Fibrin I und/oder vernetztes Fibrin II sein, in Abhängigkeit davon, wie der Umwandlungsschritt durchgeführt wird.
Nichtvernetztes Fibrin I ist bevorzugt, weil es, verglichen mit Fibrinogen, leichter zu vernetztem Fibrin umgewandelt werden kann. Tatsächlich geht man davon aus, dass Fibrin I vernetztes Fibrin I erzeugen kann, das als das Fibrindichtungsmittel wirken kann. Deshalb kann die Bildung des vernetzten Fibrin I aus nichtvernetztem Fibrin I ohne Thrombin durchgeführt werden, wobei die Probleme, die mit dem bovinen Thrombin einher gehen, vermieden werden, wenn auch der aktivierte Faktor XIII erforderlich sein kann. (Es sollte beachtet werden, dass, wenn nichtvernetztes Fibrin I benutzt wird, derart, dass nichtvernetztes Fibrin I mit dem Blut des Patienten, zum Beispiel auf einer Wunde, in Kontakt kommt, das Thrombin des Patienten und der Faktor XIII das Fibrin I in vernetztes Fibrin II umwandeln können.)
Auch kann das nichtvernetzte Fibrin ein Polymer, Oligomer oder Monomer sein, wenn auch ein Oligomer oder Monomer, d. h. ein Fibrinmonomer, bevorzugt ist. Dies beruht darauf, dass nichtvernetztes Fibrin in Polymerform im Allgemeinen ein Gel ist, und es ist deshalb sehr schwer an die gewünschtes Stelle zu bringen und stellt einen weniger engen Kontakt mit den Zellen an der gewünschten Stelle bereit. Im Gegensatz dazu ist ein so erhaltenes, nichtvernetztes Fibrin in Oligomerform oder Monomerform löslich, wodurch es leichter an die gewünschte Stelle geliefert werden kann und einen engeren Kontakt mit den Zellen aufweist. Natürlich kann die Zusammensetzung ein Gemisch derartiger Formen nichtvernetzten Fibrins enthalten.
Die Quelle der ein Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung kann jede bekannte oder zu entwickelnde Quelle sein, so lange wie das Fibrinmonomer in ein Fibrinpolymer umgewandelt werden kann oder das nichtvernetzte Fibrin in vernetztes Fibrin umgewandelt werden kann. Nicht einschränkende Quellen der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzungen sind Blut, bevorzugt Blut von Säugern, und noch stärker bevorzugt humanes Blut, Zellkulturen, die Fibrinogen und rekombinantes Fibrinogen absondern, wobei Blut bevorzugt ist. Das Blut kann in jeder Form von Blut vorliegen, einschließlich zum Beispiel Vollblut oder hergestellte Fibrinogenzubereitungen. Das Blut kann auch benutzt werden, um ein autologes Fibrindichtungsmittel herzustellen.
Es ist beobachtet worden, dass eine Zusammensetzung, die nichtvernetztes Fibrin I enthält, entweder als Fibrin I-Monomer oder als Fibrin I-Polymer, hergestellt aus Vollblut wie nachstehend beschrieben, in vernetztes Fibrin II ohne die Zugabe von Thrombin, Faktor XIII und anderen für die Blutgerinnung notwendigen Substanzen umgewandelt werden kann! Man nimmt an, dass dies auf der Tatsache beruht, dass die nichtvernetztes Fibrin I umfassende Zusammensetzung, hergestellt aus Vollblut, ausreichende Mengen von Prothrombin, Faktor XIII und derartigen anderen notwendigen Substanzen aus dem Plasma zurückbehält, derart, dass das nichtvernetzte Fibrin I in vernetztes Fibrin II ohne die Zugabe von exogenem Thrombin und Faktor XIII umgewandelt werden kann. Dieses endogene Prothrombin und dieser endogene Faktor XIII können in dem Fibrindichtungsmittel der vorliegenden Erfindung als Komponenten der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung benutzt werden.
Jedoch sollte beachtet werden, dass so keine ausreichende Mengen dieses endogenen Thrombins und dieses endogenen Faktors XIII zurückbehalten werden, um Fibrinogen in vernetztes Fibrin II mit einer Umsetzungsrate umzuwandeln, die für ein Fibrindichtungsmittel geeignet ist. Man nimmt an, dass mehr Thrombin erforderlich ist, um Fibrinogen in vernetztes Fibrin II umzuwandeln, als nichtvernetztes Fibrin I in vernetztes Fibrin II bei einer äquivalenten Umsetzungsrate.
Jede der drei Quellen enthält Fibrinogen, das in das Fibrinmonomer oder in das nichtvernetzte Fibrin umgewandelt werden kann. Zusätzlich zu dem Umwandlungsschritt muss die so erhaltene Zusammensetzung, die Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin enthält, in einer konzentrierten Form vorliegen. Es ist bevorzugt, dass die Konzentration des Fibrinmonomers nicht weniger als etwa 10 mg/ml, stärker bevorzugt von etwa 20 mg/ml bis etwa 200 mg/ml, noch stärker bevorzugt von etwa 20 mg/ml bis etwa 100 mg/ml und am meisten bevorzugt von etwa 25 mg/ml bis etwa 50 mg/ml beträgt.
Zusätzlich ist das Fibrinmonomer oder das nichtvernetzte Fibrin nichtdynamisch. Zum Zweck der vorliegenden Endung bedeutet eine nichtdynamische, nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung, dass das nichtvernetzte Fibrin in dieser Zusammensetzung für mindestens etwa 1,5 Minuten, bevorzugt für mindestens etwa 3 Minuten und stärker bevorzugt für mindestens 30 Minuten nach der Herstellung einer derartigen Zusammensetzung sich nicht vernetzt. Zum Zweck der vorliegenden Erfindung bedeutet eine nichtdynamische, ein Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung, dass das Fibrinmonomer in dieser Zusammensetzung für mindestens etwa 1,5 Minuten, bevorzugt für mindestens etwa 3 Minuten, stärker bevorzugt für mindestens etwa 30 Minuten und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 2 Stunden nach der Herstellung einer derartigen Zusammensetzung nicht polymerisiert. Es sollte in der Tat beachtet werden, dass die ein Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung mindestens für mehrere Tage, d. h. etwa 72 Stunden nach ihrer Herstellung, nichtdynamisch sein kann!
Die ein Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung kann aus Blut hergestellt werden. Das Verfahren kann zu einem über Wasserstoffbrücken verbundenen Fibrinpolymer führen, das eine Form des nichtvernetzten Fibrins ist. Ein derartiges Polymer kann dann als eine Komponente des Fibrindichtungsmittels verwendet werden oder in ein Fibrinmonomer mittels eines Verfahrens, auf das mit Solubilisierung verwiesen wird, umgewandelt werden, alles wie hierin nachstehend beschrieben. Es ist auch bevorzugt, dass die ein Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung in einer sterilen Umgebung hergestellt wird.
Die ein Fibrinmonomer oder ein nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzungen können aus Vollblut hergestellt werden, indem Blut von einem Spender und bevorzugt in Gegenwart eines Antikoagulans abgenommen wird. Jedes Antikoagulans kann verwendet werden. Nichteinschränkende Beispiele von Antikoagulanzien sind Heparin, EDTA, Hirudin, Citrat oder jedes andere Mittel, das direkt oder indirekt die Bildung von Thrombin verhindern kann, wobei Citrat bevorzugt ist.
Das Plasma, das Fibrogen enthält, wird dann vom Vollblut getrennt. Jede Trenntechnik kann verwendet werden, zum Beispiel Sedimentation, Zentrifugation oder Filtration. Die Zentrifugation kann bei etwa 3000 g für etwa 10 Minuten durchgeführt werden. Wenn es jedoch erwünscht ist, ein an Blutplättchen reiches Plasma zu erhalten, kann die Zentrifugation bei niedrigerer Beschleunigungskraft, z. B. 500 g für etwa 20 Minuten durchgeführt werden. Der Überstand, der das Plasma enthält, kann durch Standardverfahren entfernt werden.
Die Filtration kann durch Passieren des Vollbluts durch einen geeigneten Filter, der die Blutzellen vom Plasma trennt, erfolgen. Es ist bevorzugt, dass der Filter eine mikroporöse Membran ist, die eine gute Proteindurchlässigkeit aufzeigt.
Das so erhaltene Plasma wird dann behandelt, um das Fibrinogen in das Fibrinmonomer oder in nichtvernetztes Fibrin umzuwandeln. Diese Umwandlung kann durch jede auf dem Fachgebiet bekannte oder noch zu entwickelnde Technik durchgeführt werden.
Eine bevorzugte Technik, um das Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin herzustellen, ist mittels eines thrombinähnlichen Enzyms, das Thrombin einschließt. Ein thrombinähnliches Enzym ist ein Enzym, das die Bildung von Fibrin aus Fibrinogen katalysieren kann. Eine übliche Quelle für thrombinähnliche Enzyme sind Schlangengifte. Vorzugsweise ist das thrombinähnliche Enzym aus dem Schlangengift aufbereitet. In Abhängigkeit von der Wahl des thrombinähnlichen Enzyms kann ein derartiges thrombinähnliches Enzym Fibrinopeptid A (welches Fibrin I bildet), Fibrinopeptid B (welches des BB Fibrin bildet) oder beides, Fibrinopeptid A und B (welche Fibrin II bilden) freisetzen. Es sollte beachtet werden, dass diese thrombinähnlichen Enzyme, die Fibrinopeptid A und B freisetzen, dies in unterschiedlichen Raten tun können. Deshalb könnte die so erhaltene Zusammensetzung zum Beispiel ein Gemisch aus Fibrin II und Fibrin I oder ein Gemisch von Fibrin II und des BB Fibrin sein.
TABELLE I ist eine nicht einschränkende Liste der Quellen der Schlangengifte, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, des Namens des thrombinähnlichen Enzyms und welches Fibrinopeptid (welche Fibrinopeptide) durch Behandlung mit dem Enzym freigesetzt werden.
TABELLE I
Für einen Überblick über thrombinähnliche Enzyme aus Schlangengiften siehe H. Pirkle und K. Stocker, Thrombosis and Haemostasis, 65 (4): 444–450 (1991).
Das bevorzugte thrombinähnliche Enzym ist Batroxobin, insbesondere von B. Moojeni, B. Maranhao und B. atrox und Ancrod, insbesondere von A. rhodostoma.
Das Fibrinmonomer oder das nichtvernetzte Fibrin kann durch Inkontaktbringen des Plasmas mit dem thrombinähnlichen Enzym hergestellt werden, wobei man das Fibrinogen im Plasma sich in ein Fibrinmonomer umwandeln lässt. Jedoch polymerisiert das so erhaltene Fibrinmonomer spontan, um ein über Wasserstoffbrücken verbundenes Polymer in Form eines Gels zu bilden, das sich vom restlichen Serum, das eine Lösung ist, abtrennt. Das Gel ist eine Form der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung.
Dieses nichtvernetzte Fibringel kann zum Beispiel durch Zentrifugation (3000 g für 10 Minuten), durch direkte manuelle Abtrennung des nichtvernetzten Fibrins vom Serum, durch Filtration, direkt oder unter Druck, gefolgt von der Beseitigung des abgetrennten Serums, gesammelt werden. (Ein Filter mit 1–100 Mikron Porengröße kann verwendet werden, zum Beispiel ein gesinterter Polypropylenfilter mit 20 Mikron Porengröße von Porex, Inc., ein Teflonfilter mit 20 –70 Mikron Porengröße von Fluorotechniques, Inc. oder ein Nylon 66 Filter mit 22–46 Mikron Porengröße von Costar, Inc.).
Dieses Ernten trennt das nichtvernetzte Fibringel vom Serum, das eine Lösung ist, und konzentriert dadurch das nichtvernetzte Fibringel gegenüber dem Plasma. Es sollte beachtet werden, dass das nichtvernetzte Fibringel zumindest etwas Prothrombin, Faktor XIII und andere notwendige derartige Substanzen aus dem Plasma zurückbehält, derart, dass das nichtvernetzte Fibrin I in vernetztes Fibrin II ohne die Zugabe von exogenem Thrombin oder Faktor XIII umgewandelt werden kann. Dieses endogene Prothrombin und dieser endogene Faktor XIII können in dem Fibrindichtungsmittel der vorliegenden Erfindung als Komponenten der ein Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung verwendet werden.
Die Kraft der Zentrifugation oder der Druck der Filtration während des Sammelns wird festlegen, wie viel des Serums aus dem nichtvernetzten Fibringel entfernt wird, wobei gilt, je höher die Kraft oder der Druck, desto mehr ist das so erhaltene nichtvernetzte Fibringel konzentriert. Jedoch ist es bevorzugt, dass die Kraft oder der Druck nicht so groß ist, dass das Prothrombin und der Faktor XIII aus dem nichtvernetzten Fibringel entfernt werden.
Das nichtvernetzte Fibringel ist nun gebrauchsfertig als Komponente des Fibrindichtungsmittels als eine Form der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung. Es ist beobachtet worden, dass, wenn eine derartige Zusammensetzung aus Vollblut hergestellt wurde, etwa 60% bis etwa 90% des ursprünglichen Fibrinogens in der Zusammensetzung vorkommen, aber selbstverständlich in der Form des nichtvernetzten Fibrins.
Die nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung kann sofort, nachdem sie hergestellt wurde, verwendet werden. Tatsächlich ist es besonders bevorzugt, die Zusammensetzung gleich nach ihrer Herstellung zu verwenden, wenn die Zusammensetzung autolog ist. Wenn die Zusammensetzung nicht sofort nach ihrer Herstellung verwendet wird, kann die Zusammensetzung gelagert werden. Die Lagerung der Zusammensetzung erfordert, dass die Zusammensetzung zum Beispiel durch Einfrieren oder Lyophilisieren der Zusammensetzung konserviert wird, oder indem die Zusammensetzung bei 4°C gehalten wird. In gefrorener oder lyophilisierter Form bleibt die Zusammensetzung über einen Zeitraum von Monaten stabil. Wenn die Zusammensetzung bei 4°C gehalten wird, wird angenommen, dass die Zusammensetzung mindestens für einen Zeitraum von Tagen stabil ist.
Wenn die Zusammensetzung gefroren ist, muss die Zusammensetzung vor dem Zeitpunkt der Verwendung aufgetaut werden.
Diese Technik, die zur Bildung von nichtvernetztem Fibringel führt, wandelt das Fibrinogen in das nichtvernetzte Fibringel um und konzentriert das Gel im Wesentlichen in einem Schritt. In einer anderen und weniger bevorzugten Ausführungsform kann man das Fibrinogen durch übliche Techniken, z. B. Kryopräzipitieren und Präzipitieren unter Verwendung verschiedener Reagenzien, z. B. Polyethylenglykol, Ether, Ethanol, Ammoniumsulfat oder Glycin, konzentrieren. Das konzentrierte Fibrinogen kann dann in das nichtvernetzte Fibringel durch die vorstehend beschriebenen Techniken umgewandelt werden, oder das Fibrinogen kann dann bevorzugt, da das Fibrinogen bereits konzentriert ist, in eine Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung umgewandelt werden, ohne die Notwendigkeit, erst das nichtvernetzte Fibringel zu erzeugen. Dies kann durchgeführt werden durch Inkontaktbringen des konzentrierten Fibrinogens mit einem chaotropen Mittel, um eine Fibrinogenlösung zu erhalten.
Das chaotrope Mittel ist notwendig, um das Fibrinmonomer, das unter dem Kontakt des Fibrinogens mit dem thrombinähnlichen Enzym gebildet wird, daran zu hindern, spontan zu polymerisieren. Das chaotrope Mittel wird mit der Fibrinogenzusammensetzung gemischt und dann für etwa 1 bis 2 Minuten geschüttelt, um die Fibrinogenlösung zu bilden. Das Fibrinogen kann dann in ein Fibrinmonomer umgewandelt werden, zum Beispiel durch ein thrombinähnliches Enzym, wie vorstehend beschrieben, oder durch ein thrombinähnliches Enzym, das an einem Träger immobilisiert ist, wie nachstehend beschrieben.
Geeignete chaotrope Mittel schließen Harnstoff, Natriumbromid, Guanidin Hydrochlorid, KCNS, Kaliumiodid und Kaliumbromid ein. Die bevorzugte Konzentration des chaotropen Mittels beträgt etwa 0,2 bis etwa 0,6 molar und am stärksten bevorzugt etwa 0,3 bis etwa 2,0 molar. Es ist bevorzugt, die kleinstmögliche Menge des chaotropen Mittels zu verwenden, die das Fibrinmonomer noch an dem spontanen Polymerisieren hindert.
Es sollte beachtet werden, dass es bevorzugt ist, dass keine Calciumionenquelle dem chaotropen Mittel zugegeben wird, bis es gewünscht ist, dass sich das Fibrinmonomer in Fibrinpolymer umwandelt, wie nachstehend beschrieben. Dies garantiert, dass sich das Fibrinmonomer nicht infolge der Aktivierung eines der endogenen Blutgerinnungsfaktoren vernetzen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das thrombinähnliche Enzym an einem Träger immobilisiert. Diese Ausführungsform ist bevorzugt, weil man das immobilisierte Enzym leicht vom Plasma trennen kann, wodurch verhindert wird, dass die nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung mit dem Enzym kontaminiert wird.
Jeder Träger, an den das thrombinähnliche Enzym anhaften kann, kann in der vorliegenden Endung verwendet werden. Nicht einschränkende Beispiele von geeigneten Trägern sind Cellulose, Polydextrane, Agarose, Polystyrole, Silica, Polyacrylsäuren, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Glaskügelchen, Polytetrafluorethylen, Polycarbonat, Collagen, Cellulosederivate, Teflon und seine Verbundstoffe, wobei Silica, Polystyrol und Agarose bevorzugt sind und Agarose am meisten bevorzugt ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das thrombinähnliche Enzym an einem Träger befestigt, der ein Filter ist oder der auf einer Seite des Filters ist und an einem anderen Träger, z. B. einem Kügelchen, befestigt ist. Andernfalls wird das thrombinähnliche Enzym durch den Filter passieren. Deshalb sollte die Porengröße des Filters derart sein, dass das immobilisierte thrombinähnliche Enzym nicht durch den Filter passieren kann, jedoch das nichtvernetzte Fibrin durch den Filter passieren kann. Das nichtvernetzte Fibrin wird durch Inkontaktbringen des Plasmas mit dem thrombinähnlichen Enzym auf der einen Seite des Filters hergestellt, um ein Fibrinmonomer zu erzeugen, das zusammen mit dem Rest des Plasmas durch den Filter passiert. So wird die so erhaltene, nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung notwendigerweise von dem thrombinähnlichen Enzym getrennt. Das Fibrinmonomer polymerisiert nach der Passage durch den Filter spontan, um ein nichtvernetztes Fibrinpolymer zu erzeugen.
Um das thrombinähnliche Enzym an einem Träger zu immobilisieren, muss der Träger aktiviert werden. Dies kann durch jede geeignete Technik durchgeführt werden. Verschiedene Aktivierungschemien, die zur Derivatisierung von Trägern erhältlich sind, sind zum Beispiel: Diazogruppen, Isocyanatgruppen, Säurechloridgruppen, Säureanhydridgruppen, Sulphonylchloridgruppen, Dinitrofluorphenylgruppen, Isothiocyanatgruppen, Hydroxylgruppen, Aminogruppen, N-Hydroxysuccinimidgruppen, Triazingruppen, Hydrazingruppen, Carbodiimidgruppen, Silangruppen und Cyanbromid. Siehe (a) Pentapharm Patent DT 2440 254 A1; (b) P. D. G. Dean, W. S. Johnson und F. A. Middle (Herausgeber) (1991), IRL Press Oxford – Affinity Chromatography – A practical approach – Kapitel 2 – Activation Procedures, dessen Offenbarungen hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Die bevorzugte Aktivierungschemie erfolgt mittels einer Hydrazingruppe. Die Verwendung eines mit Hydrazid aktivierten Trägers führt zu einem maximalen Prozentsatz (mindestens etwa 30% bis etwa 50%, wie durch den 52238 Test gemessen – siehe Axelsson, G. et al., Thromb. Haemost., 36: 517 (1976)) des seine Aktivität bewahrenden thrombinähnlichen Enzyms, wobei im Wesentlichen kein Enzym ausgewaschen wird. Auch können niedrige pH-Werte, z. B. pH 4– 6, zur Enzymkopplung verwendet werden, um einen Enzymabbau zu verhindern.
Im Allgemeinen wird der Träger durch eine hoch reaktive Verbindung aktiviert, die später mit der funktionellen Gruppe eines Liganden, z. B. -OH, -NH₂, -SH, -COOH, -CHO reagiert, um eine kovalente Bindung zu erzeugen. Die bevorzugten Aktivierungschemien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind:

(a) mittels einer Triazingruppe und bevorzugt Triazinhalogenidgruppen,
(b) mittels einer Tresylchloridgruppe,
(c) mittels einer Carbonyldiimidazolgruppe,
(d) mittels einer Cyanbromidgruppe; und
(e) mittels einer Hydrazid- oder Aminogruppe.

In (a)–(d) ist das Protein durch Umsetzung mit -NH₂-, -SH- oder -OH-Gruppen gekoppelt, wohingegen in (e) das Protein durch eine oxidierte Kohlenhydrateinheit, d. h. -CHO, gekoppelt ist. Die Verwendung dieser Chemien führt zu einem maximalen Prozentsatz (mindestens etwa 30 % bis etwa 50% wie mittels des S2238-Tests gemessen) des seine Aktivität bewahrenden thrombinähnlichen Enzyms, wobei im Wesentlichen kein Enzym ausgewaschen wird.
Für die Triazinaktivierung werden zwei unterschiedliche Verfahren verwendet. Das erste Verfahren umfasste das Ankoppeln des Triazinrings direkt an die Oberflächen der OH-Gruppen. Dies ist dem CNBr-Aktivierungsverfahren ähnlich, das eingesetzt wird, wo die Oberflächendiolgruppen mit CNBr umgesetzt wurden. Für die Triazinaktivierung wurden OH-Gruppen von Agarose mit Triazin (Cyanurchlorid) umgesetzt.
Im Allgemeinen wird der Träger durch eine hoch reaktive Verbindung aktiviert, die später mit einer funktionellen Gruppe des Liganden, z. B. -OH, -NH₂, -SH, -CHO reagiert, um eine kovalente Bindung zu bilden. Die verbleibenden aktiven Gruppen, die kein thrombinähnliches Enzym gebunden haben, können, aber das ist nicht erforderlich, mit nichtreaktiven Verbindungen wie Ethanolamin, Essigsäureanhydrid oder Glycin blockiert werden.
Die bevorzugten Aktivierungschemien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind:

(a) Cyanbromidaktivierung, gefolgt von direktem Koppeln des Enzyms über -NH₂-Gruppen an das Protein.
(b) Aktivierung des Trägers mit Monochlortriazin, gefolgt vom Koppeln eines Enzyms über -NH₂, -OH oder -SH-Gruppen.
(c) Aktivierung des Trägers mit Dichlortriazin, gefolgt vom Koppeln des Enzyms über -NH₂-, -OH- oder -SH-Gruppen.
(d) Tresylchloridaktivierung des Trägers, gefolgt vom Koppeln des Enzyms über -NH₂, -OH oder -SH.
(e) Aktivierung des Trägers mit Adipinsäurehydrazid oder Hydrazin gefolgt vom Koppeln des oxidierten Enzyms über -CHO-Gruppen.
(f) Aktivierung des Trägers mit einem Aminoliganden, gefolgt vom Koppeln des oxidierten Enzyms über -CHO-Gruppen.

All die vorstehend bevorzugten Verfahren verwenden Agarose als Träger, jedoch ist es auch möglich, Silica zu verwenden. Wenn dieser Träger verwendet wird, sind die bevorzugten Aktivierungschemien:

(a) Gamma-Glycidoxypropyltrimethoxysilanaktivierung mit direktem Koppeln des thrombinähnlichen Enzyms über -NH₂-Gruppen an dem Protein.
(b) Cyanbromidaktivierung gefolgt von direktem Koppeln des Enzyms über -NH₂-Gruppen an dem Protein.
(c) Gamma-Glycidoxytrimethoxysilanaktivierung gefolgt vom Öffnen des Epoxidrings, um eine Diolgruppe zu bilden, die später mit Cyanbromid aktiviert werden kann. Das direkte Ankoppeln des Enzyms kann über -NH₂-Gruppen an dem Protein erreicht werden.
(d) Gammaglycidoxypropyltrimethoxysilanaktivierung gefolgt von der Herstellung von Amino-Silica mit Ammoniaklösung.

Das Amino-Silica kann anschließend mit Cyanurchloride (Triazin) aktiviert und das Enzym über -NH₂-, -OH- oder -SH-Gruppen gekoppelt werden.
Das Koppeln des Enzyms an den aktivierten Träger muss bei einem bestimmten pH-Wert gepuffert werden, um eine optimale Bindung des Enzyms zu erreichen. Im Allgemeinen erfordern Standard-Aktivierungstechniken wie die Gamma-Glycidoxypropyltrimethoxysilan-Kopplung eines Enzyms an einen aktivierten Träger und die Cyanbromid-Kopplung eines jeden Proteins an aktivierte Gruppen das Puffern bei einem pH-Wert, der 1–2 Einheiten höher liegt als der pKa-Wert der primären und sekundären Amine des Enzyms. Jedoch ermöglicht die Verwendung von Cyanurchlorid als Aktivator die Verwendung viel niedrigerer pH-Puffer (ein optimaler Kopplungs-pH-Wert ist 4–6). Ein anderes Verfahren zur Kopplung von Glycoproteinen wie Batroxobin an einen inerten Träger ist über ihre Kohlenhydrateinheiten. Dies schließt zuerst die Oxidation der Zuckergruppe zu -CHO-Gruppen, gefolgt von dem direkten Koppeln bei einem sauren pH-Wert an eine Aminogruppe wie ein Hydrazid. Ein breiter Bereich von Kopplungspuffern kann verwendet werden. Siehe zum Beispiel Tabelle 2.
TABELLE 2
Nach der Aktivierung wird der Träger mehr aktive Stellen besitzen, als für die Enzymkopplung erforderlich sind. Diese Stellen können, wenn sie nicht deaktiviert sind, kontaminierende Proteine kovalent binden, die die biologische Funktion des immobilisierten Enzyms beeinträchtigen könnten.
Überschüssige Gruppen können durch kovalentes Koppeln kleiner, nicht störender Amine wie Ethanolamin deaktiviert werden.
Wenn Hydrazid- oder Amino-aktivierte Träger verwendet werden, kann das Blockieren der restlichen reaktiven Gruppen, das auf die Enzymkopplung folgt, durch die Verwendung von Essigsäureanhydrid erreicht werden.
In Abhängigkeit von dem Immobilisierungsverfahren und von dem Träger erfolgt die Enzyminaktivierung während des Immobilisierungsverfahrens. Wird ein Silica-Träger mit der am meisten gewünschten Aktivierungschemie verwendet (z. B. Cyanbromid), gehen bis zu 80-90% der Enzymaktivität verloren. Jedoch führt die Verwendung von Agarose als Träger mit der Cyanurchloridaktivierung zu geringeren Verlusten der Enzymaktivität.
Um die Wirksamkeit des immobilisierten Enzyms auf dem Träger zu charakterisieren, können zwei Verfahren verwendet werden, um die Menge des aktiven Enzyms, das auf dem Träger immobilisiert ist, einzuschätzen; der Clot Time Assay – Clauss A., Acta Haematol., 17: 237 (1957) und der S2238 Test – Siehe Axelsson G. et al., Thromb. Haemost., 36: 517 (1976).
Um das Auswaschen des Enzyms vom Träger zu beurteilen, kann der folgende Test verwendet werden. Das Auswaschen kann durch radioaktives Markieren des thrombinähnlichen Enzyms, z. B. I¹²⁵ Batroxobin, getestet werden. Jedoch ist es erforderlich, jeglichen nichtgebundenen radioaktiven Marker vor der Durchführung des Auswaschungstests zu entfernen. Dies kann erreicht werden durch aufeinander folgendes Waschen des Trägers mit: 50 ml 50 mM Natriumacetat pH 5,5, 100 ml 50 mM Glycin/1 M Natriumchlorid pH 3,0, 100 ml 50 mM Natriumcarbonat/1 M Natriumchlorid pH 10,0, 100 ml 50 mM Natriumphosphat/1 M Natriumchlorid pH 7,0, 100 ml Wasser und 100 ml 50 mM Natriumphosphat/1 M Natriumchlorid pH 7,0. Nach einem derartigen Waschvorgang war kein nachweisbarer radioaktiver Marker in den Waschflüssigkeiten, wobei >50% des anfänglich radioaktiv markierten Enzyms an den Träger gekoppelt waren.
(a) Erforderliche Menge des Enzyms
Die erforderliche Menge Enzym für die Behandlung von 30–70 ml Plasma (erhalten aus 60– 150 ml Vollblut) beträgt 30 bis 200 Einheiten nach etwa 10–15 Minuten Mischen.
Wenn Agarose als Trägermatrix verwendet wird, führen 30–200 U von Batroxobin in etwa 7– 20 Minuten zur Bildung des nichtvernetzten Fibrins. Dieses System verwendet die Hydrazid-Aktivierung und 0,25 g–1,0 g trockene Agarose. In diesem Fall ist kein Blockieren der verbleibenden aktiven Gruppen erforderlich.
(b) Umsetzung des immobilisierten Enzyms mit Plasma-Fibrinogen
Im Allgemeinen wird die Umsetzung des immobilisierten Enzyms mit dem Fibrinogen im Plasma wie folgt durchgeführt: Ungefähr 30–70 ml Plasma werden zu einer bekannten Menge eines getrockneten Trägers zugegeben, der das immobilisierte thrombinähnliche Enzym enthält. Die Suspension wird sanft für etwa 7–20 Minuten gemischt (Rotation auf einem Spiralmischer oder Mischen von Hand). Während dieser Zeit wird das Fibrinogen im Plasma durch das immobilisierte Enzym gespalten, um das Fibrinopeptid A und/oder das Fibrinopeptid B freizusetzen, was zur Bildung eines über Wasserstoffbrücken verbundenen Fibrin I-Polymers, eines über Wasserstoffbrücken verbundenen des BB Fibrin-Polymers oder eines über Wasserstoffbrücken verbundenen Fibrin II-Polymers führt, wobei jedes Polymer mit dem immobilisierten Enzym assoziiert ist.
Wie vorstehend beschrieben, liegt das über Wasserstoffbrücken verbundene Fibrinpolymer in Form eines Gels vor und kann zum Beispiel durch Zentrifugation (3000 g für 10 Minuten) oder Filtration (durch einen 1–50 Mikron Membranfilter) geerntet werden.
Dieses Ernten trennt das über Wasserstoffbrücken verbundene Fibrinpolymer vom Serum und konzentriert dadurch das Polymer.
Es sollte beachtet werden, dass, wenn ein thrombinähnliches Enzym im Plasma verwendet wird, was die Aktivierung des Faktors XIII zur Folge hat, es dann bevorzugt ist, dass die Plasmazusammensetzung zum Zeitpunkt der Anwendung des thrombinähnlichen Enzyms modifiziert wird, um das nichtvernetzte Fibrin, z. B. nichtvernetztes Fibrin I oder II, daran zu hindern, vernetztes Fibrin, z. B. vernetztes Fibrin I oder II, zu bilden. Natürlich mag es nicht notwendig zu sein, die Plasmazusammensetzung zu modifizieren, wenn die Zusammensetzung unmittelbar, nachdem das Fibrinogen zu nichtvernetztem Fibrin umgewandelt wurde, als ein Fibrindichtungsmittel verwendet wird.
Die Plasmazusammensetzung kann durch jede bekannte oder zu entwickelnde Technik modifiziert werden, um das Vernetzen des nichtvernetzten Fibrins zu verhindern. Dies kann durch Blockieren des endogenen Thrombins, das den Faktor XIII aktivieren kann, z. B. durch Hirudin- oder Thrombininhibitoren, oder durch Blockieren der Wirkung des aktivierten Faktors XIII, z. B. mittels Schwermetallen (Hg), Thiomerosal oder inhibitorische Antikörper, durchgeführt werden. Das Vernetzen von Fibrin I oder II erfordert die Anwesenheit von Calciumionen. Infolgedessen kann das Vernetzen von Fibrin I oder II inhibiert werden, wenn das Calcium aus der Plasmazusammensetzung entfernt wird. Siehe Carr et al., J. Biochem., 239: 513 (1986); Kaminski et al., J. Biol. Chem., 258: 10530 (1983) und Kanaide et al., 13: 229 (1982). Calciumchelatoren können der Zusammensetzung zugegeben werden, um das Vernetzen des Fibrins I oder II zu verhindern. Derartige Chelatoren binden an das Calcium, wodurch sie das Vernetzen verhindern. Jeder Calciumchelator kann verwendet werden. Nicht einschränkende Beispiele von Calciumchelatoren schließen Zitronensäure, Zuckersäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Nitrilotriessigsäure (NTA), Hydroxyethylendiamintriessigsäure (HEEDTA), Ethylendiamindi-[o-hydroxyphenylessigsäure] (EDDHA), Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether)tetraessigsäure (EGTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure (DCTA), N,N-Bishydroxyethylglycin, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und N-Hydroxyethyliminodiessigsäure (HIMDA) und Salze davon ein, wobei die Salze der Zitronensäure bevorzugt sind.
Jede Zellkultur, die Fibrinogen absondert, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Fibrinogen in der Zellkultur kann in ein Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin mit den gleichen Techniken, wie den vorstehend hinsichtlich des Plasmas beschriebenen, umgewandelt werden. Jedoch ist es bevorzugt, dass vor der Umwandlung die Zelltrümmer entfernt werden.
Das Verfahren kann durchgeführt werden wie folgt: HEPG2-Zellen werden aufgezogen und versorgt wie in den Standardschriften zu Zellkulturen von Säugern beschrieben. Siehe auch Liu et al., Cytotechnology, 5: 129–139 (1991). Die Zellen werden in Kolben mit einem Splitverhältnis von 1 : 4 bis 1 : 8 in minimal-essentiellem Medium, das 10% Kälberserum enthält und mit 5% CO₂ gepuffert ist, angesetzt.
Nach 24–36 Stunden Wachstum bei 37°C wird das Medium entfernt und durch ein serumfreies Medium ersetzt, das einen geeigneten Proteaseinhibitor und 2 IU/ml Heparin enthält. Die Kultur wird für weitere 24 h-Zeiträume mit drei aufeinander folgenden Wechseln des serumfreien Mediums fortgesetzt.
Das konditionierte Medium wird bei 3000 g für 10 Minuten zentrifugiert, um alle Zelltrümmer zu entfernen, und der geklärte Überstand, der Fibrinogen enthält, wird dann sanft mit einem thrombinähnlichen Enzym für 4–5 Stunden vermischt. Bevorzugt ist das thrombinähnliche Enzym immobilisiert. Ein Verhältnis von etwa 1,0 ml bis etwa 50 ml erstarrtes Volumen Agarose-thrombinähnliches Enzym pro 500 ml Medium ist geeignet. Wie vorstehend beschrieben können andere Träger als Agarose verwendet werden. Das so erhaltene Fibrinmonomer polymerisiert spontan und ist um den immobilen Träger gewickelt.
Der Überstand, der nun kein Fibrinogen enthält, wird von dem Träger/Fibringel dekantiert, das dann nacheinander mit vier Wechseln von NaCl, 0,15 M, in einem Verhältnis von etwa 10 ml bis etwa 100 ml pro 1,0 ml ursprünglichem erstarrten Volumen des Trägers gewaschen wird. Das gewaschene Gel wird dann semidehydratisiert unter Verwendung eines gesinterten Glastrichters unter Vakuum.
Die Verwendung von Zellkulturen, die Fibrinogen absondern, ist besonders bevorzugt, wenn eine Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung verwendet wird. Dies ist so, weil man annimmt, dass eine derartige Zusammensetzung verwendet werden kann, um ein Fibrinpolymer zu erzeugen, das als Fibrindichtungsmittel nützlich ist, ungeachtet dessen, ob das Fibrinpolymer sich schließlich vernetzt. Deshalb, weil eine derartige Zellkultur keinen Faktor XIII enthält, der für das Vernetzen wesentlich ist, muss kein exogener Faktor XIII zugegeben werden, um ein wirksames Fibrindichtungsmittel herzustellen.
Die nichtvernetztes Fibrin enthaltende Zusammensetzung kann auch aus rekombinantem Fibrinogen hergestellt werden. Erst kürzlich wurde Fibrinogen durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Siehe S. Roy et al., The Journal of Biological Chemistry, 266: 4758– 4763 (1991), dessen Inhalte hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Roy et al. scheinen die erste Gruppe zu sein, die alle drei Ketten des Fibrinogens exprimiert und lehrt, das COS-Zellen die Ketten in einer Form exprimieren, zusammenbauen und absondern, die fähig ist, ein Thrombin-induziertes Koagulum zu bilden. Die so erhaltene Fibrinogenzusammensetzung kann dann verwendet werden, um die ein Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung durch die gleichen Techniken herzustellen, wie hier hinsichtlich der Zellkulturen, die Fibrinogen absondern, vorstehend beschrieben. Jedoch ist es erforderlich, dass vor der Bildung der ein Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung die Zelltrümmer durch die gleichen Techniken entfernt werden, wie vorstehend hinsichtlich der Zellkulturen beschrieben. Die Zelltrümmer können durch Zentrifugation oder Filtration entfernt werden.
Die Verwendung von rekombinantem Fibrinogen ist besonders bevorzugt, wenn eine ein Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung verwendet wird. Dies ist so, weil man annimmt, dass eine derartige Zusammensetzung verwendet werden kann, um ein Fibrinpolymer zu bilden, das als Fibrindichtungsmittel nützlich ist, ungeachtet dessen, ob das Fibrinpolymer schließlich vernetzt. Da die rekombinante Fibrinogen-Zellkultur keinen Faktor XIII enthält, der für das Vernetzen wesentlich ist, braucht kein exogener Faktor XIII zugegeben werden, um ein wirksames Fibrindichtungsmittel herzustellen.
Die Umwandlung des Fibrinogens in nichtvernetztes Fibrin durch zum Beispiel ein thrombinähnliches Enzym hat die Bildung von Fibrin in Form eines über Wasserstoffbrücken verbundenen Fibrinpolymers zu Folge. Jedoch ist es, wie vorstehend diskutiert, bevorzugt und es ist wesentlich für die ein Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung, dass die nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung in oligomerer oder monomerer Form vorliegt. Dies kann durch Solubilisierung der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung durchgeführt werden.
Die Solubilisierung ist besonders bevorzugt, wenn das nichtvernetzte Fibrin mittels eines thrombinähnlichen Enzyms, das auf einem Träger immobilisiert ist, gebildet wird. Dies ist durch die Tatsache bedingt, dass die Verwendung eines thrombinähnlichen Enzyms, das auf einem Träger immobilisiert ist, im Allgemeinen zu einem nichtvernetzten, über Wasserstoffbrücken verbundenen Fibrinpolymer führt, das mit dem immobilisierten Enzym assoziiert ist. Deshalb erlaubt es die Solubilisierung, da es bevorzugt ist, dass der Träger in der so erhaltenen Zusammensetzung nicht enthalten ist, auch den Träger aus der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung zu entfernen, zusammen mit dem immobilisierten Enzym.
Die Solubilisierung kann durch jede bekannte oder zu entwickelnde Technik durchgeführt werden, die zu einem Fibrinmonomer führt. Die Solubilisierung kann durch Inkontaktbringen der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung mit einer geeigneten sauren Pufferlösung, bevorzugt einem sauren Puffer, der einen pH-Wert von weniger als 5 und bevorzugt von etwa 1 bis etwa 5 aufweist, durchgeführt werden. Nichteinschränkende Beispiele geeigneter saurer Pufferlösungen schließen Essigsäure, Bernsteinsäure, Glucuronsäure, Cysteinsäure, Crotonsäure, Itaconsäure, Glutaminsäure, Ameisensäure, Asparaginsäure, Adipinsäure und Salze davon ein, und wobei Bernsteinsäure, Asparaginsäure, Adipinsäure und Salze der Essigsäure bevorzugt sind und Natriumacetat am meisten bevorzugt ist. Es ist beobachtet worden, dass die bevorzugten sauren Puffer viel effizienter als die anderen sauren Puffer, die getestet wurden, funktionierten.
Die bevorzugte Konzentration der sauren Puffer ist etwa 0,02 M bis etwa 1 M und am meisten bevorzugt von etwa 0,1 M bis etwa 0,3 M. Eine derartige bevorzugte Konzentration macht die Ionenstärke der Zusammensetzung biologisch verträglicher.
Es ist bevorzugt, das kleinstmögliche Volumen des sauren Puffers zu verwenden, das das nichtvernetzte Fibrin gerade noch solubilisiert, um eine Fibrinmonomer umfassende wässrige Lösung zu erzeugen. Dies ergibt eine Fibrinmonomer umfassende wässrige Lösung, die an Fibrinmonomer hoch konzentriert ist. Im Allgemeinen sind etwa 1 ml bis etwa 4 ml des sauren Puffers pro etwa 1 ml der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung erforderlich.
Der saure Puffer wird mit dem nichtvernetzten Fibrin gemischt und dann für etwa 1 bis 2 Minuten energisch geschüttelt, um sicherzustellen, dass die Solubilisierung vollständig ist.
Die Solubilisierung kann auch bei einem neutralen pH-Wert mittels eines chaotropen Mittels durchgeführt werden. Geeignete chaotrope Mittel schließen Harnstoff, Natriumbromid, Guanidin Hydrochlorid, KCNS, Kaliumiodid und Kaliumbromid ein. Die bevorzugte Konzentration des chaotropen Mittels ist von etwa 0,2 bis etwa 6,0 molar und am stärksten bevorzugt von etwa 3,5 bis etwa 5,0 molar.
Wie bei dem sauren Puffer ist es bevorzugt, die kleinstmögliche Menge des chaotropen Mittels zu verwenden, die das nichtvernetzte Fibrin noch solubilisiert. Im Allgemeinen sind etwa 1,0 ml bis etwa 1,5 ml des chaotropen Mittels pro etwa 1 ml der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung erforderlich.
Das chaotrope Mittel wird mit der Zusammensetzung gemischt und dann für etwa 1 bis 2 Minuten energisch geschüttelt, um sicherzustellen, dass die Solubilisierung vollständig ist.
Dementsprechend führt die Solubilisierung zu einer Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung und insbesondere zu einer wässrigen, Fibrinmonomer umfassenden Lösung. Es ist bevorzugt, dass die Fibrinmonomerkonzentration in der wässrigen Lösung bei nicht weniger als etwa 10 mg/ml, stärker bevorzugt bei etwa 20 mg/ml bis etwa 200 mg/ml, noch stärker bevorzugt bei etwa 20 mg/ml bis etwa 100 mg/ml und am meisten bevorzugt bei etwa 25 mg/ml bis etwa 50 mg/ml liegt.
Wenn ein auf einem Träger immobilisiertes thrombinähnliches Enzym verwendet wird, was dazu führt, dass das Enzym in der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung vorhanden ist, kann das immobilisierte Enzym nach der Solubilisierung aus der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung entfernt werden. Dies kann zum Beispiel mittels Filtration durch jeden geeigneten Filter, der das Enzym abtrennen kann, durchgeführt werden. Geeignete Filter schließen einen gesinterten Polypropylenfilter mit 20 Mikron Porengröße von Porex, Inc., einen Teflonfilter mit 20–70 Mikron Porengröße von Fluorotechniques, Inc. oder einen Nylon 66-Filter mit 22–46 Mikron Porengröße von Costar, Inc. ein.
Ein alternatives Verfahren, um sicherzustellen, dass kein thrombinähnliches Enzym, z. B. Batroxobin, in der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung vorhanden ist, ist, ein lösliches thrombinähnliches Enzym in dem System zu verwenden, und das Enzym nach der Solubilisierung des über Wasserstoffbrücken verbundenen Fibrinpolymers zu entfernen. Das Entfernen des Enzyms kann durch Verwendung einer Affinitätsmatrix, z. B. einen an einen inerten Träger gebundenen Liganden, der eine spezifische Affinität für das thrombinähnliche Enzym aufweist, oder durch einen Innenaustausch- oder einen hydrophoben Interaktionsträger oder am meisten wirksam unter Verwendung eines Avidin-Biotin-Systems erreicht werden. Die Avidin-Biotin-Interaktion zeigt eine der stärksten Bindungskonstanten für nicht kovalente Bindungen (K_DIS = 10^–15 M), die in der Natur beobachtet wurden. Siehe E. A. Bayer und Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, 26: 1 (1980).
In diesem Verfahren ist Biotin kovalent an zum Beispiel Batroxobin gebunden, und das Biotin-Batroxobin-Konjugat (welches löslich ist) wird direkt mit Plasma umgesetzt, d. h. 10 BU plus 50 ml Plasma werden bei 37°C für 10 Minuten umgesetzt. Das so hergestellte Fibrin I-Polymer wird durch Zentrifugation oder Filtration geerntet und in etwa 4 ml 0,2 M Natriumacetat pH 4,0, das 30 mM Calciumchlorid enthält, resolubilisiert. Der Fibrin I-Lösung wird ein molarer Überschuss des an einen inerten Träger wie Agarose gekoppelten Avidins zugegeben. Der Agarose : Avidin : Biotip-Batroxobin-Komplex wird dann von dem Fibrin I durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt, was zu einer Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung führt, die im Wesentlichen frei von Batroxobin ist, die wie nachstehend beschrieben repolymerisiert werden kann, um ein Fibrindichtungsmittel zu erzeugen.
Dementsprechend ist die Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung im wesentlichen frei von dem thrombinähnlichen Enzym. Im wesentlichen frei bedeutet jedoch entweder, dass das gesamte thrombinähnliche Enzym entfernt wurde oder dass einiges an thrombinähnliches Enzym in der Zusammensetzung in Mengen verbleibt, die nicht ausreichen, um eine unerwünschte pharmakologische Wirkung bereitzustellen. Deshalb können Zusammensetzungen dieser Endung, von denen gewünscht wird, dass sie „im wesentlichen frei" sind, thrombinähnliches Enzym in einer Menge zwischen etwa Null und 10 Prozent des ursprünglichen Enzyms und bevorzugt zwischen etwa Null und 2 Prozent des thrombinähnlichen Enzyms, das verwendet wurde, um die Fibrinmonomer-Zusammensetzung herzustellen, enthalten.
Obwohl diese Ausführungsformen Zusammensetzungen beschreiben, in denen das thrombinähnliche Enzym nach der gewünschten Umwandlung in lösliches Fibrin entfernt wurde, werden Zusammensetzungen, die das meiste oder das gesamte thrombinähnliche Enzym beibehalten ebenfalls für nützlich gehalten und sind als solche ein Teil der vorliegenden Erfindung.
Die Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung ist nun gebrauchsfertig als eine Komponente des Fibrindichtungsmittels. Es ist beobachtet worden, dass, wenn eine derartige Zusammensetzung aus Vollblut hergestellt wird, etwa 60% bis etwa 90% des ursprünglichen Fibrinogens in der Zusammensetzung vorhanden sind, jedoch selbstverständlich in der Form des Fibrinmonomers.
Die Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung kann sofort, nachdem sie zubereitet wurde, verwendet werden. Tatsächlich ist es besonders bevorzugt, eine derartige Zusammensetzung sofort nach ihrer Zubereitung zu verwenden, wenn die Zusammensetzung autolog ist. Wenn die Zusammensetzung nicht sofort nach ihrer Zubereitung verwendet wird, kann die Zusammensetzung gelagert werden. Die Lagerung der Zusammensetzung erfordert, dass die Zusammensetzung konserviert wird, zum Beispiel durch Einfrieren oder Lyophilisieren der Zusammensetzung oder indem man die Zusammensetzung bei 4°C hält. Es wird angenommen, dass die Zusammensetzung in gefrorener oder lyophilisierter Form über einen Zeitraum von Monaten stabil bleibt. Wenn die Zusammensetzung bei 4°C gehalten wird, wird angenommen, dass die Zusammensetzung für mindestens einen Zeitraum von Tagen stabil bleibt.
Wenn die Zusammensetzung gefroren ist, muss die Zusammensetzung zum Zeitpunkt der Anwendung aufgetaut sein. Wenn die Zusammensetzung lyophilisiert ist, ist es zum Zeitpunkt der Anwendung bevorzugt, dass die Zusammensetzung durch die Zugabe des gleichen sauren Puffers, der in dem Solubilisierungsschritt verwendet wurde, wenn diese Säure flüchtig war, z. B. Essigsäure, wieder hergestellt wird oder, wenn ein chaotropes Mittel verwendet wurde, durch die Zugabe von destilliertem Wasser. Wie bei dem Solubilisierungsschritt sollte zur Wiederherstellung die kleinste Menge der sauren Pufferlösung oder des destillierten Wassers, die noch dazu führt, dass das Fibrinmonomer löslich ist, verwendet werden. Tatsächlich kann das Wiederherstellen einer lyophilisierten, Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung zu einer wässrigen, Fibrinmonomer umfassenden Lösung führen, wobei die Monomerkonzentration bei bis zu 200 mg/ml liegt. Vor der Lyophilisation kann ein Füllstoff, z. B. Mannit oder Lactose, der Zusammensetzung zugegeben werden. In einer anderen Ausführungsform kann die lyophilisierte Zusammensetzung in lyophilisierter Form verwendet werden. Ein derartige Form ist besonders bevorzugt, wenn gewünscht ist, Hilfsstoffe, z. B. Antibiotika, der Zusammensetzung zuzugeben.
Die Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung kann eigentlich in jeder Form, zum Beispiel als Lösung, Suspension, Emulsion oder als Feststoff vorliegen, wobei eine Lösung bevorzugt ist. Deshalb kann eine derartige Zusammensetzung zum Beispiel eine Flüssigkeit, ein Gel, eine Paste oder eine Salbe sein. Die Zusammensetzung kann selbstverständlich auch in Form eines „Granulats" vorliegen, zum Beispiel ein lyophilisiertes Fibrinmonomer, das behandelt werden kann, aber nicht muss, um eine Lösung, Emulsion oder Suspension unmittelbar vor der Anwendung zu erzeugen.
Jedes geeignete Lösungsmittel kann verwendet werden, um die Lösung zu bilden, jedoch ist es selbstverständlich bevorzugt, dass das Lösungsmittel nicht toxisch ist. Nicht einschränkende Beispiele von Lösungsmitteln schließen Wasser, Ethylalkohol, Glycerin und Propylenglycol ein, wobei Wasser bevorzugt ist.
Ein Beispiel für eine Suspension ist, dass die Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung mit organischen Lösungsmitteln, z. B. Ethanol, auf eine Ethanolendkonzentration von 3,0 M im Überschuss gemischt und geschüttelt werden kann. Das Fibrinmonomer wird ausfallen und kann durch Zentrifugieren wiedergewonnen werden. Die Ausfällung sollte mit einer organischen Phase gewaschen werden, um die in dem Solubilisierungsschritt verwendete wässrige Lösung zu entfernen. Eine Ethanolsuspension des monomeren Fibrins kann dann direkt auf einen Verband oder einen anderen Träger oder sogar direkt an der Wundstelle aufgebracht werden. Die organische Phase lässt man verdunsten. Im Fall eines Verbandes oder eines anderen Trägers kann die Suspension durch Inkontaktbringen mit der Stelle der Anwendung oder einigen anderen Mitteln rehydratisiert werden, und man lässt das Fibrin polymerisieren.
In einer anderen Ausführungsform kann eine organische Suspension von Fibrinmonomer, das in einer hoch flüchtigen Phase, z. B. Diethylether, zubereitet wurde, zerstäubt und als eine Spraysuspension an die gewünschte Stelle abgegeben werden. Es ist bevorzugt, dass die flüchtige Phase nicht entflammbar ist. Es ist möglich, dass eine organische Fibrinmonomer-Suspension in das Ohr, die Nase, den Hals oder die Lungen durch ein Spray oder Einatmen abgegeben werden kann oder an eine blutende ösophageale oder gastrische Läsion durch Injektion abgegeben wird.
Das Fibrindichtungsmittel zur Verwendung innerhalb der Erfindung wird angewandt durch Inkontaktbringen der gewünschten Stelle mit der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung und Umwandeln des Fibrinmonomers in Fibrinpolymer oder nichtvernetztes Fibrin zu vernetztem Fibrin gleichzeitig mit dem Schritt des Inkontaktbringens, wodurch das Fibrinkoagulum erzeugt wird.
Zum Zweck der vorliegenden Erfindung ist „die gewünschte Stelle" der Ort, wo gewünscht wird, dass ein Fibrinkoagulum erzeugt wird. Was oder wo die gewünschte Stelle ist, hängt von der Verwendung des Fibrindichtungsmittels in der vorliegenden Erfindung ab. Es sollte auch beachtet werden, dass man annimmt, dass das Fibrindichtungsmittel nicht nur am Menschen, sondern auch an anderen Säugern angewendet werden kann. Es ist auch bevorzugt, aber nicht wesentlich, dass, wenn die Quelle des Fibrindichtungsmittels Blut ist, das Blut dann von der gleichen Spezies stammt, an der das Fibrindichtungsmittel angewendet werden wird.
Das Fibrindichtungsmittel kann für jede bekannte oder noch zu entwickelnde Verwendung eines Fibrindichtungsmittels verwendet werden. Die Verfahren, Kits oder das Fibrindichtungsmittel der vorliegenden Erfindung können zum Verbinden von Geweben oder Organen, zur Blutungsstillung, zur Wundheilung, zum Verschließen einer chirurgischen Wunde verwendet werden, die Verwendung in der Gefäßchirurgie schließt das Bereitstellen der Hämostase für das Bluten aus Nahtlöchern einer distalen koronaren Arterien-Anastomose, aus linksventrikulären Nahtlinien, aus den Stellen einer Aortotomie oder Punktion, bei einer diffusen epimyokardialen Blutung, gesehen in wiederholten Operationen, und für das Durchsickern aus venösen Blutungsstellen, z. B. bei atrialen, kavalen oder rechtsventrikulären Positionen, ein.
Die vorliegende Erfindung ist auch nützlich zum Verschließen von Arterientransplantaten aus Dacron vor dem Transplantieren, zum Verschließen von Geweben außerhalb des Körpers, zum Herstellen von Fibrinflößen für Zellwachstum, zur Blutungsstillung der beschädigten Milz (wodurch das Organ gerettet wird), der Leber und anderer parenchymatöser Organe; zum Verschließen trachealer und bronchialer Anastomosen und Luftlecks oder Risswunden der Lunge, zum Verschließen von bronchialen Stümpfen, bronchialen Fisteln und ösophagealen Fisteln, zum naht- und narbenlosen Heilen („Reißverschluss"-Technik), und zur Embolisation von intracerebralen AVM's, Leber-AVM's in der Gefäß-Radiologie, bei Angiodysplasien des Dickdarms, ösophagealen Varizen, gastrointestinalen „pumping bleeders" aufgrund Ulcus pepticum etc.
Der Gegenstand der Erfindung ist weiter nützlich zum Bereitstellen der Hämostase bei Hornhauttransplantationen, Nasenbluten, nach Tonsillektomien, Zahnextraktionen und anderen Anwendungen. Siehe G. F. Gestring und R. Lermer, Vascular Surgery, 294–304, Sept./Okt. 1983. Das Fibrindichtungsmittel der vorliegenden Erfindung ist auch besonders geeignet für Personen mit Gerinnungsdefekten.
Die Dosierung der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung hängt von der besonderen Verwendung des Fibrindichtungsmittels ab, jedoch sollte die Dosierung eine wirksame Menge sein, damit die Zusammensetzung ihre beabsichtigte Verwendung ausführen kann. Im Allgemeinen wird von einer Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung, die eine wässrige Lösung ist, angenommen, dass etwa 3 ml bis etwa 5 ml einer derartigen Zusammensetzung ausreichend sind, um ein wirksames Fibrindichtungsmittel zu sein. Jedoch kann in Abhängigkeit von der Verwendung der Zusammensetzung die Dosierung im Bereich von etwa 0,05 ml bis etwa 40 ml liegen. Auch sollte dann, wenn eine nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung in Polymerform verwendet wird oder die Zusammensetzung in fester Form vorliegt, die Zusammensetzung die Menge des Fibrins enthalten, die in der wässrigen Lösung vorliegt.
Zum Zweck der vorliegenden Erfindung bedeutet die Umwandlung des Fibrinmonomers zu Fibrinpolymer oder des nichtvernetzten Fibrins zu vernetztem Fibrin „gleichzeitig" mit dem Schritt des Inkontaktbringens, dass der Umwandlungsschritt und der Schritt des Inkontaktbringens innerhalb des Zeitraumes eines jeden Schritts geschehen, um das Fibrinkoagulum an der gewünschten Stelle zu erzeugen. Demgemäß kann gleichzeitig bedeuten, dass nach dem Schritt des Inkontaktbringens das Fibrinmonomer zu Fibrinpolymer oder das nichtvernetzte Fibrin zu vernetztem Fibrin umgewandelt wird. Dies wird durchgeführt durch Inkontaktbringen der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung, nachdem die Zusammensetzung an der gewünschte Stelle aufgetragen wurde, mit einer Zusammensetzung, die das Fibrinmonomer in Fibrinpolymer oder das nichtvernetzte Fibrin zu vernetztem Fibrin umwandeln kann. Der Umwandlungsschritt sollte im Allgemeinen innerhalb von etwa 0,5 Minuten nach dem Schritt des Inkontaktbringens erfolgen. Andernfalls kann die Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung, insbesondere wenn das nichtvernetzte Fibrin ein Fibrinmonomer ist, von der gewünschten Stelle wegfließen.
Gleichzeitig kann auch bedeuten, dass der Schritt des Inkontaktbringens und der Umwandlungsschritt simultan stattfinden. Dies wird durchgeführt durch Inkontaktbringen der gewünschten Stelle mit der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung zur gleichen Zeit, in der die Zusammensetzung mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird, die das Fibrinmonomer zu Fibrinpolymer und das nichtvernetzte Fibrin zu vernetztem Fibrin umwandeln kann.
Schließlich und bevorzugt kann gleichzeitig auch bedeuten, dass der Umwandlungsschritt vor dem Schritt des Inkontaktbringens beginnt, wenn auch nicht soviel vor dem Schritt des Inkontaktbringens, dass das gesamte Fibrinmonomer in Fibrinpolymer oder das gesamte nichtvernetzte Fibrin in vernetztes Fibrin umgewandelt wurde. Andernfalls wird vor dem Schritt des Inkontaktbringens das gesamte Fibrinmonomer in Fibrinpolymer oder das gesamte nichtvernetzte Fibrin in vernetztes Fibrin umgewandelt werden, was ein sehr schlechtes Fibrindichtungsmittel zur Folge hat. Diese Ausführungsform wird durch Mischen der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung mit einer Zusammensetzung, die das Fibrinmonomer in Fibrinpolymer oder nichtvernetztes Fibrin in vernetztes Fibrin umwandeln kann, vor dem Schritt des Inkontaktbringens durchgeführt. Da es etwa 30 Sekunden dauert, bis der Umwandlungsschritt abgeschlossen ist, sollte der Umwandlungsschritt nicht mehr als 30 Sekunden und bevorzugt nicht mehr als 3 Sekunden vor dem Schritt des Inkontaktbringens beginnen. Diese Ausführungsform ist bevorzugt, weil sie sicherstellt, dass die maximale Menge der Fibrnmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung an der gewünschten Stelle verbleibt und außerdem auch ein ausgezeichnetes Fibrinkoagulum bildet.
Die Umwandlung des Fibrinmonomers in Fibrinpolymer oder des nichtvernetzten Fibrins in vernetztes Fibrin kann durch jede bekannte oder zu entwickelnde Technik durchgeführt werden. Jedoch, wie der Umwandlungsschritt durchgeführt wird, hängt von der Quelle der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin enthaltenden Zusammensetzung, z. B. Vollblut oder rekombinantes Fibrinogen, der Form des Fibrinmonomers oder des nichtvernetzten Fibrins, z. B. Fibrin I oder des BB Fibrin, ab, und in einem geringeren Umfang davon, ob die gewünschte Stelle Blut oder andere Körperflüssigkeiten des Patienten zum Zeitpunkt der Verwendung des Fibrindichtungsmittels enthalten wird.
Auch wenn eine getrennte Zusammensetzung wie ein alkalischer Puffer für den Umwandlungsschritt verwendet wird (nachstehend diskutiert), kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Beispiel mit einer doppelläufigen Spritze durchgeführt werden. Die doppelläufige Spritze kann die Form eines Y aufweisen, wodurch sie das Mischen der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung und der für den Umwandlungsschritt verwendeten Zusammensetzung gestattet, um unmittelbar vor dem Schritt des Inkontaktbringens zu mischen. Auch kann, eher noch als eine doppelläufige Spritze in Y-Form, eine doppelläufige Spritze mit zwei Öffnungen verwendet werden. Dies gestattet das simultane Inkontaktbringen mit der gewünschten Stelle und dass die Umwandlung in Fibrinpolymer oder vernetztes Fibrin stattfindet. Die Zusammensetzungen der doppelläufigen Spritze können auch auf die gewünschte Stelle gesprüht werden. Siehe H. B. Kram et al., The American Surgeon, 57: 381 (1991).
Wenn die Quelle der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung Blut ist, wird wie vorstehend diskutiert angenommen, dass die Zusammensetzung genug Prothrombin, Faktor XIII und andere notwendige Substanzen, z. B. Aktivatoren des Prothrombins, zurückbehält, um das Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrinpolymer in vernetztes Fibrin umzuwandeln. Wenn das nichtvernetzte Fibrin ein Fibrinpolymer ist, d. h. das nichtvernetzte Fibrin wurde nicht solubilisiert, kann das nichtvernetzte Fibrin in vernetztes Fibrin durch die Aktivierung des Prothrombins und des Faktors XIII einer derartigen Zusammensetzung umgewandelt werden, um vernetztes Fibrin zu bilden. Diese Aktivierung kann durch Inkontaktbringen der Zusammensetzung mit einer Calciumionenquelle durchgeführt werden. Nicht einschränkende Quellen von Calciumionen schließen Calciumchlorid, bevorzugt in einer Konzentration von 30 mM, ein. In einer anderen Ausführungsform und weniger bevorzugt können die Calciumionen durch das Blut an der gewünschten Stelle bereitgestellt werden.
Wie das Fibrinmonomer in vernetztes Fibrin umgewandelt wird, wenn nichtvernetztes Fibrin solubilisiert wurde, d. h. ein Fibrinmonomer ist, ist abhängig davon, wie die Solubilisierung durchgeführt wurde. Wenn das nichtvernetzte Fibrin durch einen sauren Puffer solubilisiert wurde, kann das vernetzte Fibrin durch Anheben des pH-Wertes der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung erzeugt werden, derart, dass das Fibrinmonomer polymerisieren kann. Dies kann durch Inkontaktbringen der Zusammensetzung mit jedem geeigneten alkalischen Puffer durchgeführt werden. Nicht einschränkende Beispiele für geeignete alkalische Puffer schließen HEPES, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Bicarbonatpuffer wie Natriumbicarbonat und Kaliumbicarbonat, Trimetallsalze der Zitronensäure, Salze der Essigsäure und Salze der Schwefelsäure ein. Bevorzugte alkalische Puffer schließen ein: 0,5– 0,75 M Natriumcarbonat/-bicarbonat pH 10–10,5, 0,5–0,75 M Natriumbicarbonat/NaOH pH 10,0, 1,5 M Glycin/NaOH pH 10,0, 0,5–1,0 M Bishydroxyethylaminoethansulfonsäure (BES) pH 7,5, 1 M Hydroxyethylpiperazinpropansulfonsäure (EPPS) pH 8,5, 0,5 M Tricin pH 8,5, 1 M Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) pH 8,0, 1 M Trishydroxymethylaminoethansulfonsäure (TES) pH 8,0 und 0,5 M Cyclohexylaminoethansulfonsäure (CHES) pH 10,0; wobei 0,5–0,75 M Natriumcarbonat/-bicarbonat pH 10–10,5, 0,5–1,0 M Bishydroxyethylaminoethansulfonsäure (BES) pH 7,5, 1 M Hydroxyethylpiperazinpropansulfonsäure (EPPS) pH 8,5 und 1 M Trishydroxymethylaminoethansulfonsäure (TES) pH 8,0 am meisten bevorzugt sind.
Die Menge des verwendeten alkalischen Puffers sollte ausreichend sein, um das nichtvernetzte Fibrin zu polymerisieren. Es ist bevorzugt, dass etwa 10 Teile bis etwa 1 Teil der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung mit etwa 1 Teil des alkalischen Puffers gemischt wird. Es ist noch stärker bevorzugt, dass das Verhältnis bei etwa 9 : 1 liegt. Es sollte beachtet werden, dass das bevorzugte Verhältnis von der Wahl des Puffers und der gewünschten „Stärke" des Fibrinpolymers abhängt. Natürlich ist die gewünschte Stärke des Fibrinmonomers abhängig von der letztendlichen Verwendung des Fibrindichtungsmittels.
Wenn die Solubilisierung mit einem chaotropen Mittel durchgeführt wurde, dann kann das Fibrinmonomer durch Verdünnen der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung, zum Beispiel mit destilliertem Wasser, in vernetztes Fibrin umgewandelt werden. Das Verdünnen sollte derart durchgeführt werden, dass die minimale Menge des Verdünnungsmittels verwendet wird. Die so erhaltene Konzentration des chaotropen Mittels nach dem Verdünnen sollte im Allgemeinen etwa 0,5 bis etwa 0,1 molar betragen.
Zusätzlich zum Anheben des pH-Wertes oder zum Verdünnen des chaotropen Mittels der Fibrinmonomerumfassenden Zusammensetzung ist es bevorzugt, dass das Prothrombin und der Faktor XIII einer derartigen Zusammensetzung aktiviert werden, um vernetztes Fibrin zu bilden. Eine derartige Aktivierung kann durch das Inkontaktbringen der Zusammensetzung mit einer Calciumionenquelle durchgeführt werden. Die Quelle der Calciumionen kann Teil des alkalischen Puffers oder Teil des sauren Puffers sein, der in dem Solubilisierungsschritt verwendet wird. Nicht einschränkende Quellen von Calciumionen schließen Calciumchlorid, bevorzugt in einer Konzentration von 30 mM, ein. In einer anderen Ausführungsform und weniger bevorzugt kann die Calciumionenquelle von dem Blut an der gewünschten Stelle bereitgestellt werden.
Es sollte beachtet werden, dass, wenn der alkalische Puffer ein Carbonat/Bicarbonatpuffer ist, die Calciumionenquelle zu dem sauren Puffer während des Solubilisierungsschrittes zugegeben werden muss. Dies entspricht der Tatsache, dass das Calciumchlorid in dem Carbonat/Bicarbonatpuffer nicht löslich ist. Es ist bevorzugt, dass die Konzentration der Calciumionen in der sauren Pufferlösung etwa 5 millimolar bis etwa 150 millimolar und stärker bevorzugt etwa 5 mM bis etwa 50 mM beträgt.
Es wird angenommen, dass das so erhaltene Fibrinkoagulum vernetztes Fibrin II sein wird, ungeachtet dessen, welche Form des nichtvernetzten Fibrins, d. h. Fibrinmonomer oder Fibrinpolymer, vorhanden ist. Jedoch wird dann angenommen, dass, wenn die Form des nichtvernetzten Fibrins des BB Fibrin ist, zusätzlich eine Quelle von zusätzlichem Thrombin erforderlich sein kann, um des BB Fibrin in vernetztes Fibrin umzuwandeln. Eine derartige Quelle des Thrombins kann zum Beispiel Plasma von dem Patienten sein, wobei dieses Plasma der nichtvernetztes Fibrin enthaltenden Zusammensetzung zugegeben wird.
Wenn die gewünschte Stelle Blut enthält und eine Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung verwendet wird, d. h. das nichtvernetzte Fibrin wurde solubilisiert, dann kann dieses Blut als ein Verdünnungsmittel des chaotropen Mittels verwendet werden, oder um den pH-Wert der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung zu erhöhen. Deshalb braucht kein Verdünnungsmittel oder alkalischer Puffer verwendet werden. In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, dass die Calciumionenquelle in dem sauren Puffer oder dem chaotropen Mittel enthalten ist, die in dem Solubilisierungsschritt verwendet werden. Auch kann in dieser Ausführungsform der Erfindung die Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung auf einen festen Träger, z. B. einer Bandage, Nahtmaterial, einer Prothese oder einem Verband, der mit der gewünschten Stelle in Kontakt kommt, platziert werden. Dieser Träger wird dann in Kontakt mit der gewünschten Stelle platziert, solange bis sich zum Beispiel das Fibrinkoagulum bildet.
Es sollte jedoch beachtet werden, dass, wenn die Fibrinmonomer umfassende Zusammensetzung nicht genug Prothrombin und Faktor XIII zurückbehält, um vernetztes Fibrin zu bilden, eine derartige Zusammensetzung immer noch als Fibrindichtungsmittel nützlich ist, weil die Polymerisation des Fibrinmonomers per se nützlich ist, um ein Fibrinkoagulum zu erzeugen. Auch kann eine derartige Zusammensetzung noch verwendet werden, um vernetztes Fibrin durch Zugabe einer Calciumionenquelle und des aktivierten Faktors XIII (oder Vorstufen des aktivierten Faktors XIII) und gegebenenfalls von Thrombin zu erzeugen. Eine derartige Calciumionenquelle, aktivierter Faktor XIII und Thrombin können den Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzungen zugegeben werden. Der aktivierte Faktor XIII kann der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung in einer Endkonzentration von etwa 1,0 bis etwa 20 Einheiten Faktor XIII pro ml der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung zugegeben werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Faktor XIII durch das Blut oder Körperflüssigkeiten an der gewünschten Stelle zur Verfügung gestellt werden oder durch die Zugabe von autologem Plasma zu der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung. Nicht einschränkende Calciumionenquellen schließen Calciumchlorid, bevorzugt in einer Konzentration von 30 mM, ein. In einer anderen Ausführungsform und weniger bevorzugt können Calciumionen durch das Blut oder Körperflüssigkeiten an der gewünschten Stelle zur Verfügung gestellt werden. Es können etwa 4 Einheiten bis etwa 500 Einheiten von Thrombin pro ml der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung zugegeben werden, oder das Thrombin kann an der gewünschten Stelle bereitgestellt werden.
Wenn die Quelle der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung Zellkulturen sind, die Fibrinogen oder rekombinantes Fibrinogen absondern, und das nichtvernetzte Fibrin ein Fibrinpolymer ist, d. h. das nichtvernetzte Fibrin ist noch nicht solubilisiert worden, dann müssen eine Calciumionenquelle und der aktivierte Faktor XIII (oder Vorstufen des aktivierten Faktors XIII) verwendet werden, um vernetztes Fibrin zu erzeugen. Der Faktor XIII muss verwendet werden, weil diese Quellen des nichtvernetzten Fibrins keinen Faktor XIII enthalten. Der aktivierte Faktor XIII kann der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung in einer Endkonzentration von etwa 1,0 bis etwa 20 Einheiten Faktor XIII pro ml nichtvernetztes Fibrin umfassender Zusammensetzung zugegeben werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Faktor XIII durch das Blut oder Körperflüssigkeiten an der gewünschten Stelle bereitgestellt werden oder durch Zugabe von autologem Plasma zu der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung. Nicht einschränkende Calciumionenquellen schließen Calciumchlorid, bevorzugt in einer Konzentration von 30 mM, ein. In einer anderen und weniger bevorzugten Ausführungsform können Calciumionen durch das Blut oder Körperflüssigkeiten an der gewünschten Stelle bereitgestellt werden. Auch kann als eine Option das Thrombin einer derartigen Zusammensetzung zugegeben werden, um sicherzustellen, dass das vernetzte Fibrin II erzeugt wird. Es können etwa 4 Einheiten bis etwa 500 Einheiten Thrombin pro ml der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung zugegeben werden, oder das Thrombin kann von der gewünschten Stelle bereitgestellt werden.
Wie das Fibrinmonomer in Fibrinpolymer umgewandelt wird, wenn das nichtvernetzte Fibrin solubilisiert wurde, d. h., wenn es ein Fibrinmonomer ist, ist abhängig davon, wie die Solubilisierung durchgeführt wurde, z. B. saurer Puffer oder chaotropes Mittel. Die Bildung eines Fibrinpolymers kann durch die gleichen Verfahren durchgeführt werden, wie vorstehend beschrieben. Dieses Fibrinpolymer kann dann, falls gewünscht, in vernetztes Fibrin durch die Zugabe einer Calciumionenquelle und von aktiviertem Faktor XIII (oder Vorstufen des aktivierten Faktors XIII) und gegebenenfalls von Thrombin zu der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben, umgewandelt werden. Der aktivierte Faktor XIII kann der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung in einer Endkonzentration von etwa 1,0 bis etwa 20 Einheiten Faktor XIII pro ml nichtvernetztes Fibrin umfassender Zusammensetzung zugegeben werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Faktor XIII durch das Blut oder Körperflüssigkeiten an die gewünschte Stelle oder durch die Zugabe von autologem Plasma zu der nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung geliefert werden. Nicht einschränkende Calciumionenquellen schließen Calciumchlorid, bevorzugt in einer Konzentration von 30 mM ein. In einer anderen und weniger bevorzugten Ausführungsform können Calciumionen durch das Blut oder Körperflüssigkeiten an der gewünschten Stelle bereitgestellt werden. Es können etwa 4 Einheiten bis etwa 500 Einheiten Thrombin pro ml der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung zugegeben werden, oder das Thrombin kann von der gewünschten Stelle bereitgestellt werden.
Das Fibrindichtungsmittel kann zur Verwendung in der Erfindung auch Hilfsstoffe, zum Beispiel Antibiotika, z. B. Gentamycin, Cefotaxim, Nebacetin und Sisomicin, Histaminin H₂-Antagonisten, z. B. Ranitidin und Antikrebs-Arzneistoffe, z. B. OK-432, enthalten. Dies kann durch Zugabe des gewünschten Antibiotikums zu der Fibrinmonomer oder nichtvernetztes Fibrin umfassenden Zusammensetzung durchgeführt werden. Siehe M. C. H. Gersdorff und T. A. J. Robillard, Laryngoscope, 95: 1278–80 (1985); A. Ederle et al., Ital. J. Gastroenterol., 23: 354–56 (1991); V. Ronfard et al., Burns, 17: 181–84 (1991), T. Sakurai et al., J. Control. Release, 18: 39–43 (1992); T. Monden et al., Cancer, 69: 636–42 (1992), F. Greco, J. of Biomedical Materials Research, 25: 39–51 (1991) und H. B. Kram et al., Journal of Surgical Research, 50: 175–178 (1991), deren Inhalte hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Andere Hilfsstoffe können auch zugegeben werden, zum Beispiel Fibronectin, fibrinolytische Inhibitoren wie Aprotinin, Alpha-2-Antiplasmin, PAI-1, PAI-2, 6-Aminohexansäure, 4-Aminomethylcyclohexansäure, Collagen oder Keratinocyten. Es wird angenommen, dass die Dosierung eines derartigen Hilfsstoffs die gleiche ist, wie die in den herkömmlichen Fibrindichtungsmitteln verwendete.
5. BEISPIELE
5.1. PLASMAAUFBEREITUNG AUS VOLLBLUT
Vollblut (100 ml) wird in im Handel erhältlichen Standardblutbeuteln gesammelt, die ein Antikoagulans wie Citrat/Phosphat/Dextrose enthalten. Das Blut wird dann in einen für die Zentrifugation geeigneten Behälter überführt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Der klare Plasmaüberstand (annähernd 50 ml) wird dekantiert und die Zellkomponenten werden verworfen.
Ein alternatives Verfahren der Plasmaaufbereitung aus Vollblut ist durch Filtration. Wieder werden 100 ml Blut in einem Beutel gesammelt, der ein geeignetes Antikoagulans wie Citrat/Phosphat/Dextrose enthält. Das Blut wird dann über einem Filter, der eine gute Proteindurchlässigkeit aufzeigt, mittels einer peristaltischen Pumpe rezirkuliert. Der Druckabfall über der Membran führt dazu, dass das Plasma durchgedrückt wird, wobei die Zellkomponenten im rezirkulierenden Blut verbleiben. Das Plasma (50 ml) wird für die weitere Verarbeitung gesammelt.
5.2. IMMOBILISIERUNG DES BATROXOBINS AUF PERLFÖRMIGER AGAROSE
Kugelförmige Agarose (Pharmacia) wurde in Immobilisationsstudien verwendet. Die verwendete Agarose war zu 4% vernetzt, 45–165 μm (90% der Partikel). Dieses Material quillt auf das Fünffache seines Volumens auf, wenn es hydratisiert wird. Batroxobin wird zuerst mit 0,1 M Natriumperiodat für 1 Stunde bei Raumtemperatur in einem mit Deckel versehenen Szintillationsfläschchen oxidiert. Das Batroxobin wird mittels Passieren durch eine Sephadex PD-10 Permeationsgelsäule gereinigt. Das oxidierte Batroxobin wird dann an ein Hydrazid-Aktivierungs-Agarosegel über Nacht bei Raumtemperatur in 50 mM Natriumacetat pH 5,5 plus 10 mM Natriumborhydrid (30–200 U pro 1,75 g feuchtes Gel) gekoppelt. Die nicht gebundenen Umsetzungsprodukte werden von dem Gel entfernt durch Waschen mit: 50 ml mM Natriumacetat pH 5,5, 100 ml 50 mM Glycin/1 M Natriumchlorid pH 3,0, 100 ml 50 mM Natriumcarbonat/1 M Natriumchlorid pH 10,0, 100 ml 50 mM Natriumphosphat/1 M Natriumchlorid pH 7,0, 100 ml Wasser, 100 ml 50 mM Natriumphosphat/1M Natriumchlorid pH 7,0, 100 ml 50 mM Natriumphosphat pH 7,0.
5.3. UMSETZUNG DES IMMOBILISIERTEN ENZYMS MIT PLASMAFIBRINOGEN ZUR ERZEUGUNG EINER NICHTVERNETZTES FIBRIN UMFASSENDEN ZUSAMMENSETZUNG
Das immobilisierte Enzym (350 mg) wird zu annähernd 50 ml zentrifugiertem oder filtriertem Plasma zugegeben und für 7 bis 20 Minuten sanft gemischt, bis sich ein nichtvernetztes Fibrin I-Polymerkoagulum gebildet hat. Das Fibrin I-Polymer plus das assoziierte immobilisierte Enzym wird dann geerntet entweder durch: a) Zentrifugation bei 3000 g für 10 Minuten, gefolgt von dem Entfernen des Serumüberstands durch Dekantieren oder b) Filtration durch einen geeigneten Filter mit geringer Proteinbindung, gefolgt vom Verwerfen des filtrierten Serums und dem Einbehalten des Fibrin I-Polymers plus des immobilisierten Enzyms zur weiteren Behandlung. Dieses Fibrin I-Polymer ist ein Beispiel für eine nichtvernetztes Fibrin umfassende Zusammensetzung.
5.4. SOLUBILISIERUNG DES FIBRIN I-POLYMERS ZUR ERZEUGUNG EINER FIBRINMONOMER UMFASSENDEN ZUSAMMENSETZUNG
Die Solubilisierung des Fibrin I-Polymers wird durch Zugabe von etwa 1–4 ml 0,2 M Natriumacetat pH 4,0, das 30 mM Calciumchloridpuffer enthält, zu dem geernteten Fibrin I-Polymer plus immobilisiertem Enzym erreicht. Die Probe wird nachfolgend für 2 Minuten kräftig geschüttelt, z. B. auf einem Vortex Mischer. Das Entfernen des immobilisierten Enzyms kann dann durch Filtration der Fibrin I-Lösung durch einen 1 bis 20 μm Filter mit geringer Proteinbindung erreicht werden. Das Agaroseenzym wird durch den Filter zurückgehalten werden, so wird es ermöglicht, es aus dem System zu entfernen. Die verbleibende Lösung, eine Fibrin I-Monomer umfassende Zusammensetzung, besteht aus konzentrierter, saurer Fibrin I-Monomerlösung in Verbindung mit anderen Plasmaproteinen. Im Allgemeinen ergeben etwa 100 ml Vollblut etwa 4 oder 5 ml der Fibrinmonomer umfassenden Zusammensetzung, wobei die Konzentration des Fibrinmonomers etwa 25 mg/ml bis etwa 35 mg/ml beträgt. Diese ist nun bereit zur Abgabe an den Patienten entweder allein oder zusammen mit einem repolymerisierenden Puffer ausgestoßen (coextrudiert), um ein Fibrindichtungsmittel zu erzeugen.
5.5. REPOLYMERISATION DER FIBRIN I-MONOMER UMFASSENDEN ZUSAMMENSETZUNG
Die Repolymerisation wird durch gleichzeitiges Mischen von 9 Teilen der Fibrin I-Monomer umfassenden Lösung mit 1 Teil eines geeigneten Repolymerisierungspuffers, z. B. 0,75 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat, pH 10,0, erreicht. Das Mischungsverhältnis kann geändert werden; jedoch bewahrt ein 9 : 1 Verhältnis die hohe Konzentration des Fibrins im Endprodukt. Beim Coextrudieren repolymerisiert das Fibrin I spontan und wandelt sich zu Fibrin II um, gefolgt vom Vernetzen des Fibrins über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten.
Die vorliegende Erfindung wird im Umfang durch die beschriebenen spezifischen Ausführungsformen, die nur als einzelne Illustrationen von individuellen Ausführungformen der Endung beabsichtigt sind, nicht eingeschränkt. Tatsächlich werden viele Modifikationen der vorliegenden Endung zusätzlich zu den hierin gezeigten und beschriebenen dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung offenbar werden. Derartige Modifikationen sollen unter den Umfang der im Anhang aufgeführten Ansprüche fallen.
5.6. HYDRAZIDAKTIVIERUNG DER AGAROSE UND KOPPLUNG ÜBER DIE KOHLENHYDRATEINHEIT DES ENZYMS
Um die Kohlenhydrateinheit des Batroxobins mit einem hydrazidaktivierten Träger umzusetzen, muss der Zucker zuerst oxidiert werden, um freie -CHO-Gruppen zu ergeben. Dies wurde wie folgt ausgeführt.
Batroxobin, 1–7 mg, wird in 2 ml Wasser und 0,2 ml 0,1 M Natriumperiodat gelöst. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert, wonach es auf einer Sephadex G-25 Gelfiltrationssäule entsalzt wird. Das oxidierte aktive Batroxobin wird von der Säule mit 0,9% Gew./Vol. Natriumchlorid eluiert.
Im Handel erhältliche hydrazidaktivierte Standard-Agarose (Biorad Laboratories Ltd UK) oder jede andere Gruppe mit einer endständigen freien Aminogruppe kann verwendet werden, um die freien Aldehydgruppen (-CHO) direkt zu koppeln. Wenn Hydrazid-Agarose verwendet wird, ist der Kopplungsprozess wie folgt.
1–5 g Hydrazid-Agarosegel wird in 4 ml 50 mM Natriumacetat pH 5,5 suspendiert. Der Suspension wird 1 ml 10 mM Natriumborhydrid zusammen mit der gewünschten Menge von oxidiertem Batroxobin (typischerweise 100–200 BU pro g feuchtem Gel) zugegeben.
Die Probe wird über Nacht bei Raumtemperatur gemischt und anschließend auf einem gesinterten Glastrichter mit 50 ml 50 mM Natriumacetat pH 5,5, 100 ml 50 mM Glycin/1 M Natriumchlorid pH 3,0, 100 ml 50 mM Natriumcarbonat/1 M Natriumchlorid pH 10,0, 100 ml 50 mM Natriumphosphat/1 M Natriumchlorid pH 7,0, 100 ml Wasser und 100 ml 50 mM Natriumphosphat/1M Natriumchlorid pH 7,0 und schließlich 100 ml 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 gewaschen.
Das Verfahren zur Umsetzung des immobilisierten Batroxobins mit dem Plasma ist wie folgt.
Der pH-Wert des Plasmas (50 ml) wird durch Zugabe von Essigsäure auf pH 5,5 reduziert. Dem Plasma wird das Äquivalent von 100 bis 200 BU des auf etwa 1,75 g (Gewicht des feuchten Gels) Agarose immobilisierten Batroxobins zugegeben. Das Plasma wird bei 37°C für 10 – 15 Minuten inkubiert, nach dieser Zeit wird der pH-Wert durch die Zugabe von Natriumhydroxid auf pH 7,4 erhöht. Die Fibrin I-Polymerisation erfolgt fast augenblicklich. Das Fibrin I-Polymer wird durch Zentrifugation bei 3500 Upm für 10 Minuten geerntet und in 3–4 ml 0,2 M Natriumacetat pH 4,0, das 30 mM Calciumchlorid enthält, wieder gelöst. Das Agaroseenzym kann dann von dem Fibrin I durch Zentrifugation oder Filtration getrennt werden. Das Fibrin I wird anschließend repolymerisiert, um das Fibrindichtungsmittel durch die Zugabe von 9 Teilen Fibrin I-Lösung zu einem Teil 0,75 M Natriumcarbonat/-bicarbonat, pH 10,0, zu erzeugen.
5.7. DAS ENZYM-"CAPTURE"-SYSTEM UNTER VERWENDUNG VON BIOTIN-AVIDIN
Die Enzym-„Capture" wird durchgeführt durch erstens Biotinylieren des Batroxobins und Gewinnen des Biotinenzyms mit immobilisiertem Avidin (Avidin, gekoppelt an 6%-vernetzte Agarose).
Das Biotinylieren des Proteins kann durch Verwendung einer Reihe von Reagenzien erreicht werden. In diesem Fall wird N-Hydroxysuccinimidbiotin (wasserunlöslich) verwendet (im Handel erhältlich von Amersham). NHS-Biotin (50 μl) wurde zu 1 mg Batroxobin bei pH 8,6 zugegeben und die Lösung wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Überschüssiges Biotinylierungsreagens wird durch Gelfiltration auf einer Sephadex G-25 Säule mit 0,1 M Kaliumphosphat pH 7,5 als Elutionsmittel entfernt.
Das Äquivalent von 10 BU Biotin-Batroxobin wird zu 50 ml Plasma zugegeben und bei 37 °C für 10 Minuten inkubiert. Das Fibrin I Polymer wird durch Zentrifugation geerntet (3500 Upm für 10 Minuten) und in 3–4 ml 0,2 M Natriumacetat pH 4,0, das 30 mM Calciumchlorid enthält, wieder gelöst. Dem Fibrin I wird Avidin-Agarose (im Handel erhältlich von Sigma Chemical Co.) in einer Menge von 0,2 g (feuchtes Gel) pro ml Fibrin I zugegeben. Die Probe wird bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert und bei 2000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Das so hergestellte Fibrin I ist im Wesentlichen frei von Batroxobin. Die Repolymerisation des Fibrin I, um das Fibrindichtungsmittel zu erzeugen, wird wie in Beispiel 5.6. beschrieben erreicht.

Claims

Verwendung von Fibrin, welches ein nichtdynamisches Fibrinmonomer oder -oligomer ist, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Erzeugung eines Fibrindichtungsmittels, wobei das Fibrindichtungsmittel durch Umwandeln des nichtdynamischen Fibrinmonomers oder -oligomers in ein Fibrinpolymer erzeugt wird, gleichzeitig wenn die Zusammensetzung mit einer gewünschten Stelle in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Fibrindichtungsmittel erzeugt wird; und wobei "nichtdynamisch" bedeutet, dass das Fibrinmonomer oder -oligomer nach Herstellung einer derartigen Zusammensetzung für mindestens 1,5 Minuten nicht vernetzt oder polymerisiert.
Verwendung von Fibrin gemäß Anspruch 1, wobei das Fibrinmonomer aus einem nichtvernetzten Fibrin I, des BB Fibrin und einem nichtvernetzten Fibrin Π ausgewählt ist.
Verwendung von Fibrin gemäß Anspruch 2, wobei das Fibrinmonomer Fibrin I ist.
Verwendung von Fibrin gemäß Anspruch 1, wobei das Fibrinpolymer ein Fibrin II-Polymer ist.
Verwendung von Fibrin gemäß Anspruch 1, wobei das Fibrinpolymer vernetzt ist.
Verwendung von Fibrin gemäß einem vorstehenden Anspruch, wobei das nichtdynamische Fibrinmonomer im Wesentlichen frei von einem exogenen Enzym ist, welches die Bildung von Fibrin aus Fibrinogen katalysiert.
Verwendung von Fibrin gemäß einem vorstehenden Anspruch, welches aus einer Quelle, ausgewählt aus Blut, einem rekombinanten Fibrinogen und Zellkulturen, welche Fibrinogen absondern, erzeugt wird.
Verwendung von Fibrin gemäß Anspruch 7, wobei die Quelle Blut ist.
Verwendung von Fibrin gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei das Blut autologes Blut ist.
Verwendung von Fibrin gemäß Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung weiterhin Prothrombin, Aktivatoren des Prothrombin und Faktor XIII umfasst.
Verwendung gemäß einem vorstehenden Anspruch, wobei der Umwandlungsschritt mittels Zugabe einer alkalischen Pufferlösung oder von destilliertem Wasser zu dem Fibrinmonomer durchgeführt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei die alkalische Pufferlösung oder das destillierte Wasser weiterhin eine Calciumionenquelle umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die alkalische Pufferlösung aus Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Bicarbonatpuffern, Trimetallsalzen der Zitronensäure, Salzen der Essigsäure und Salzen der Schwefelsäure ausgewählt ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die alkalische Pufferlösung aus 0,5 bis 0,75 M Natriumcarbonat/Bicarbonat pH-Wert 10–10,5, 0,5 bis 0,75 M Natriumbicarbonat/NaOH pH-Wert 10,0, 1,5 M Glycin/NaOH pH-Wert 10,0, 0,5 bis 1,0 M Bis(hydroxyethyl)aminoethansulfonsäure (BES) pH-Wert 7,5, 1,0 M Hydroxyethylpiperazinpropansulfonsäure (EPPS) pH-Wert 8,5, 0,5 M Tricin pH-Wert 8,5, 1,0 M Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) pH-Wert 8,0, 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminoethansulfonsäure (TES) pH-Wert 8,0 und 0,5 M Cyclohexylaminoethansulfonsäure (CHES) pH-Wert 10,0 ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die alkalische Pufferlösung aus 0,5 bis 0,75 M Natriumcarbonat/Bicarbonat pH-Wert 10–10,5, 0,5 bis 1,0 M Bis(hydroxyethyl)aminoethansulfonsäure (BES) pH-Wert 7,5, 1,0 M Hydroxyethylpiperazinpropansulfonsäure (EPPS) pH-Wert 8,5, und 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminoethansulfonsäure (TES) pH-Wert 8,0 ausgewählt ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei der Schritt des in Kontaktbringens mittels einer doppelläufigen Spritze durchgeführt wird, wobei ein Lauf die Zusammensetzung enthält und der andere Lauf den alkalischen Puffer oder das destillierte Wasser enthält.
Verwendung gemäß einem vorstehenden Anspruch, wobei die gewünschte Stelle an einem Säuger ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die gewünschte Stelle aus Haut, dem kardiovaskulären System, Lymphsystem, Lungensystem, Ohr, Nase, Rachen, Auge, Leber, Milz, Schädel, Rückenmark, Kiefer, Knochen, Sehne, Pankreas, Urogenitalsystem und Verdauungstrakt ausgewählt ist.