JPH02129224A

JPH02129224A - フィブリンの製造法

Info

Publication number: JPH02129224A
Application number: JP63282403A
Authority: JP
Inventors: Yuzo Ezaki; 江嵜　祐造
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1988-11-10
Filing date: 1988-11-10
Publication date: 1990-05-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分！］本発明は、医療分野において生体適合性にすぐれた医療
材料として利用できるフィブリンの製造法に関する。

［従来の技術］従来のフィブリンを製造する方法としては、冷却遠心分
離法によって得たクリオプレシピテート、遠心分離によ
って得られる血漿等を出発材料として、それに主として
トロンビン溶液を加えると、重合硬化され、フィブリン
を得る方法が、よく用いられている。全面からのフィブ
リノーゲンの精製には、コーン（Ｃｏｈｎ　）のエタノ
ール分画（Ｅ。

Ｊ、　Ｃｏｈｎ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ
、　６８．４５９．１９４６　）がよく知られて」３つ
、更に、特開昭５０−７１８１２．５０９５４１３．５
３−６９８１９号で記載されているように、良好な効率
、純度を有するフィブリノーゲンを得る方法が、いくつ
か提示されている。

然し乍ら、他人血由来から作製される血液製剤は最近肝
炎ウィルス、エイズウィルス等ウィルス汚染の危険性が
指摘きれ、更に抗原性の問題もぬぐいされない、更に、
遠心分離操作により得られる血漿は大型機器の設備を必
要とし、例えば、緊急を要する手術室等では、時間がか
かるような大型機器をあらかじめ設置しておく必要性が
ある等の問題点がある。

［発明が解決しようとする問題点コ未発明渚らは、このような事情に鑑み、生体材料として
有用なフィブリンの作成方法を、鋭意研究し、短時間に
、はとんど無菌的にフィブリンを作成する方法を提供す
ることを目的とする。また、本発明は、医療分野におい
て、遠心分離操作や精製操作などの煩雑で細菌汚染の危
険性がなく、患者自身からの血漿を出発材料としてフィ
ブノンを作成する方法を提供することを目的とする。そ
して、本発明は、短時間で、はとんど無菌的に、その患
者由来のフィブリンが得られるような製造法を提供する
ことを目的とする。

［問題点を解決するための手段］本発明の要旨とするものは、採血した血液を、血漿分離
膜中を通過させ、短時間に、ｍ単な操作で、血漿を得、
この血漿を、トロンビン或いはレブチラーゼなどのトロ
ンビン様作用を有する酵素で処理することにより、フィ
ブリノーゲンを重合固化せしめることを特徴とするフィ
ブリンの作成法である。その場合、トロンビン或いはレ
ブチラーゼなどのトロンビン様作用を有する酵素で処理
する際に、更にＣａ”、ＦＸＩ［［を添加しであること
が好適である。

フィブリンは、多くの生理的機能を有することが認めら
れており、また、ウィルス汚染の問題、抗原性の問題を
解決すると、更に、フィブリン形成後、膜形成にする等
の物理的修飾、更に、種々の生理的活性物質や抗生物質
などを固定化する化学的修飾ｔ−ることか、可能となる
。換言すれば、外科的手法を施すことなく、その患者由
来のフィブリン膜を作成すると、その膜に種々な修飾を
施すことができるようになる。

本発明によって作成されるフィブリンの利用としては、
フィブリン接着剤というシステムが周知であり、皮膚、
神経、鍵に応用した文献（二見俊部：第６回バイオマテ
リアル学会大会抄録集、１０．１９８４年）があり、ま
た、遊離皮膚弁の移植に応用した文献（井原成男：　Ｍ
ｅｄｉｃａｌ　Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓ、　２０．
５．３３５．１９８２＞があり、良好な成績が示されて
いる０組織の治癒過程がシアノアクリレートの場合と異
なり、フィブリン膜の存在が繊維芽細砲の増殖に役立ち
、組織の再生、毛細管の新生が良好であると述べている
。更には、大血管の解離腔の充填、気管支断端の補強、
肺や肝臓等の実質臓器の切離面の補修など無数に上げる
ことができ、特に、肺の切離面へ応用した文献（桑原修
；１１本胸部外科学会誌；３３．１８１７．１９８５年
）では、良好な成績を示し、肺の容量縮小や変形が避け
られて、肺機能の温存に役立つとしている。

ノイブリン膜の創傷保護材としての利用は、特開昭５８
−１８５１６２号、同５７−１５３６４５号等に記載さ
れており、また、止血用、傷の手当て材として特開昭５
８−３６５４５号に、更に、−１ラーゲン・フィブリノ
ーゲンの両方を含有さけ、フィブリン膜を形成させ、傷
口不肖て材として応用した例は、ドイツ公開特許出願３
０３７５１３に記載されている。

その他のフィブリンの応用として、フィブリン膜にリゾ
チームを固定化し、出血部位に適用するすることにより
、血液を吸収し、組織修復の促進、化膿を防止できる。

更に、その後、組織中で消化きれる材料とし−〔提示し
た例が、特開昭４８−８０７７９号に記載される。更に
、フィブリン膜を担体とした酵素の固定化方法が研究さ
れ、例えば、白血病酵素療法として、フィブリン膜にＬ
−アスパラギナーゼ製剤を固定化した例が、特開昭５２
−１５１７２３号に記載され、フィブリン膜にウロキナ
ーゼを固定化した例が、特開昭５９−９３０１９号に記
載されている。

フィブリン膜は、生成する反応は生理条件Ｆで進行する
ため、固定化しようとする酵素の変性が少ないことをＬ
ｌ１点としている。

以上の応用面での機能の他に、フィブリンの生理的機能
の１つとして、組織アクリレート−（ｔ−ＰＡ）による
プラスミノーゲン（ｐｌｇ）活性化がフィブリン存在下
で亢進することは、よく知られており、文献（Ｈｏｙｌ
ａｅｒｔｓ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、
　２５７．２９１２〜２９２９．１９８２＞では、その
メカニズムとして、ｔ−ＰＡ、ｐ　ｌ　ｇ、フィブリン
膜の間のトリモレキュラーコンブレメクスの形成による
ものとしている。更に、ウロキナーゼによるｐｌｇの活
性化は、フィブリン膜の影響を受けないときれていたが
、ある文献（Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ、Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　４２．９０１〜９０８．
１９７９）では、ブイプリン膜存在下でプラスミノーゲ
ン（Ｇｌｕ−ｐｌｇ＞は、ウロキナーゼで速やかに活性
化することを示し、更に、ｔ−ＰＡと異なり、ウロキナ
ーゼは生理的にはフィブリン膜と結合しないので、この
活性化は、Ｇｌｕ−ｐｌ巨とフィブリン膜との反応の結
果であるとしている。

以」二のように、フィブリン膜には、生体内に元から存
在するプラスミノーゲン（Ｇｌｕ−ｐｌｇ）のウロキナ
ーゼによる活性化を著しく亢進する作用が認められるこ
とがあり、フィブリンの本来持っている生理的機能とし
て、線溶系亢進作用があることを示し、本発明により作
成されるフィブリン膜が、有効に用いられることを示し
ている。

以北のように、フィブリン膜は、未だ未知の部分がある
が、これから先、人工血管の内面コート材や人工皮膚の
基材なと医療用材料として、大きな分野に発展すること
が期待される。

本発明によるフィブリンの作成方法では、採血した血液
に、例えば、クエン酸塩を主とした公知の抗凝固剤によ
り抗凝固処理を施した全血を出発原料とする。この時の
全血の容器は、滅菌されたものを用いることが好ましく
、例えば、注射器、軟質医療用プラスチックバッグ等が
使用される。

例えば、患者から１／１０量の３．８％クエン酸塩の入
った注射器に採血し、次に、血漿分離膜から構成される
第１図に示す如きプラズマセパレータの血液人口１へ接
続する。血液に適当な圧力を加えながら、プラズマセパ
レータに血液を入れると、血漿分離膜４を通して、血漿
が得られ、血漿用【１２から出てくる。このとき、血漿
は滅菌処理された容器、例えば試験管、シャーレ等の目
的に合わせた形状の合成高分子材料からなる容器に入れ
られる。

次に、主としてトロンビン溶液からなる溶液が、加えら
れ、フィブリン膜が、重合反応で得られる。

この場合、トロンビンの代わりに、レブチラーゼ、バト
ロキソビンなどのトロンビン様作用を有する酵素を用い
て重合許せることができる。

プラスミノーゲンを重合固化せしめるために、トロンビ
ン或いはレブチラーゼなどのトロンビン様作用を有する
酵素で処理する際に、Ｃａ’″　ＦＸ■、アプロチニン
・トラネキサム酸等のａｍ素分解抑制物質を添加するこ
とも可能である。

製造したフィブリン膜の使用目的に合うように、ゲルタ
ールアルデヒド等の公知の多官能試薬による架橋処理や
、凍結乾燥、自然乾燥処理等を行なうことが、できる、
また、フィブリン膜の使用ＩＴ的によっては、フィブリ
ン膜の形成前、形成中、又は形成後に、フィブリノーゲ
ン或いはフィブリンを担体として、抗生物質、殺菌作用
物質、酵素、生理活性物質、抗凝固剤或いはアルブミン
、フィブロネクチン等の糖蛋白質を固定化することもで
きる。

本発明のフィブリン膜は、フィブリノーゲン或いはフィ
ブリノーゲンを含有する血漿を、トロンビン或いはレブ
チラーゼなどのトロンビン様作用を有する酵素で処理す
ることにより、重合固定化されたものである。

この酵素による重合反応は、好ましくは中性付近の緩衝
液溶液で行なわれる。この緩衝液溶液とシテハ、ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液等が用いられる。

また、Ｃａ”トロンビン溶液は、適宜の量が用いられる
が、トロンビン溶液はフィブリン１ｇ当り１屯位以北好
ましくは５０〜３５０屯位が用いられる。トロンビン溶
液は、５０単位以ドでは、′ノイブリノーゲンに作用す
るにネト分であり、約３５０　、ｉｌｊ、位／　ｍ　Ｒ
で、物理的強度が飽和に達し、それ以七に増やしても効
果が上がらないため、３５０屯位以下で十分であるため
である。

フィブリン膜を形成させた後に、０．０１〜２容量％の
グルタルアルデヒド含有生理食塩水溶液を用いて、ブイ
プリン膜を処理することにより、生理特性にすぐれた膜
を得ることができる０以上のフィブリン膜は、使用目的
によっては、余分な未反応液の洗滌を兼ねて生理食塩水
で処理することが好適である。

本発明に用いられる血漿分離膜としては、平膜、中空糸
膜いずれでも使用でき、また、膜を構成する材料として
は、ポリプロピレン、セルロースアセテート等公知の医
療用高分子材料を用いることができる。

［作用］本発明により作成される“フィブリン膜”は、創傷治癒
の過程に重要であり、コラーゲン等と違って、生理的に
は、存在せず、非生理的な状況で出現する蛋白質である
が、生理的に種々のすぐれた特性を有する材料であり、
広い医療分野での適用が見出きれるものである。

次に、本発明のフィブリンの作成を具体例により説明す
るが、本発明は、次の説明に限定きれるものではない。

［実施例１］正常成人男子より、１／１０容の３．８％クエン酸塩の
入った滅菌済み注射器へ５０ｍ１採血し、よく混合した
１次に注射器の針を外し、第１図に示したポリプロピレ
ン製の分離膜４から成るプラズマセパレータ（テルモ社
製）の血液流入口１へ接続し、圧をかけながら血液を入
れ、それから血漿を分離した。

この時、全血で５０ｍ１通過させたところ、採血漿量は
、約２６ｍｊｊであった。また、かかった時間は、約６
０秒であった。第１図に示した血漿出口２に滅菌された
遠心沈降管（テルモ社製、ベトレイ［登録商標］）を接
続し、血漿を入れ、５００単位のトロンビン溶液（持出
製薬社製、局方）及びアプロチニン（トラジロール［登
録商標］：バイエル社製）１０００単位を加えたところ
、約２分後に、フィブリンゲルが形成された。

形成されたフィブリンゲルを、室温放置後、３時間で、
１０％中性緩衝液ホルマリンに固定し、一般病理組織標
本作製法（病理組織標本の作り方、渡辺陽之輔監修、医
学書院、第６版、１９８６年）に準じた方法で、パラフ
ィン切片を作製し、ＨＥ染色及びＰＴＡＨ染色を施し、
組織観察を行なった。

その結果、ＨＥ染色で鮮赤色に、また、ＰＴＡＨ染色で
深青色に染まったフィブリン繊維網が観察された。この
時、全血からブイプリン作成まで約３分の所要時間であ
った。

［実施例２］１Ｆ常な家兎頚動脈より１／１０容の３．８％クエン酸
塩の含有した滅菌済み注射器へ、５０ｍｆｆ１採血し、
よく混合した。次に、動脈から注射針を外し、第１図に
示したポリプロピレン製分離膜４から成るプラズマセパ
レータ（テルモ社製）の血液流入口１へ接続し、採血し
た血液を、圧をかけながら、入れで、血漿を分離し、血
漿出口２から得た。血漿出口２で滅菌シャーレ（テルモ
社製、ベトレイ［登録商標］）に血漿を入れ、その中に
４クロブシチュスキ−（Ｋｌｏｂｕｓｉｔｚｋｙ）単位
のレプラーゼ（ゼリャ新薬製、Ｒｅｐｔｉｌａｓｅ［登
録商標］−５゜インジェクション）とアプロチニン１０
．０００ＫＩＥ単位（バイエル社製、トラジロール［登
録商標］）が含有きれた溶液を添加したところ比較的可
溶性のフィブリンゲルが得られた。この時の全血からフ
ィブリン作成まで、約５分の所要時間であった。

［比較例］対照として家兎全血よりフィブリノーゲンを精製し、フ
ィブリンを製造した。即ち、１／１０容の３．８％クエ
ン酸ナトリウム添加で家兎頚動脈より採血し、３０００
ｒｐｍ１５分間の遠心分離処理して、血漿を得た。その
後、ドーリットル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）等の方法（Ｄ
ｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｒ，Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　：Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ａｃｔａ、　１１８．４５６〜４６７、
１９６７）により、フィブリノーゲンを精製した。この
ときの所要時間は、約４時間であった０次に、フィブリ
ノーゲンに局方ト１７　ンビン（持出製薬製）を２ｍＭ
のＣａＣｌ２８、２ｍＭのＭｇＣＮｘ　、１５０ｍＭの
ＮａＣｊ！を含有する５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
７，４）を添加し、フィブリンゲルを製造した。

即ち、以上のように、本発明によるブイプリンの製造法
では、血液採取からフィブリン製造までの時間は、大幅
に短縮きれるものである。

［発明の効果］本発明は、以上に詳述したように、医療分野において、
有効なフィブリン膜を、血漿分離膜通過の血漿から作成
するものであり、医療に有効に使用できるフィブリン膜
を、短時間に、大型機器を必要することなく、安全に、
且つ抗原性の懸念が全くなく、自分由来の血漿からフィ
ブリン膜が、得られること、換言すれば、外科的手法を
施すことなく、患者由来のフィブリン膜がその場で安全
に即座に調達でき、且つそのフィブリン膜に種々な修飾
を施すことのできる方法を提供したこと、などの著しい
技術的効果が得られたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に用いられる血漿分離膜のプラズマセ
パレータの１例を示す模式断面図である。［主要部分の符号の説明］

Claims

【特許請求の範囲】

（１）採血した血液を、血漿分離膜中を通過させ、得ら
れた血漿を、トロンビン或いはレブチラーゼなどのトロ
ンビン様作用を有する酵素で処理することにより、血漿
中に含まれるフィブリノーゲンを重合固化することを特
徴とするフィブリンの製造法。
（２）トロンビン或いはレブチラーゼなどのトロンビン
様作用を有する酵素で処理する際に、Ｃａ＾２＾＋、Ｆ
ＸIIIを添加する請求項１記載のフィブリンの製造法。