JPH04233458A - 可溶性フィブリン様モノマーを使ったアッセイ - Google Patents
可溶性フィブリン様モノマーを使ったアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、可溶性フィブリンモノ
マー、可溶性フィブリンまたはフィブリンを必要とする
免疫学的および生化学的アッセイおよび方法における、
フィブリン様物質としてのフィブリノーゲンの変更形の
利用に関する。
マー、可溶性フィブリンまたはフィブリンを必要とする
免疫学的および生化学的アッセイおよび方法における、
フィブリン様物質としてのフィブリノーゲンの変更形の
利用に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】可溶
性血漿タンパク質フィブリノーゲンは、血餅の不溶性フ
ィブリン網状構造を形成する前駆体である。この過程は
周知である。フィブリノーゲンがトロンビンにより活性
化され、活性化されたフィブリノーゲンが重合して凝塊
を形成する。活性化は、アミノ末端のフィブリノペプチ
ドＡを遊離するフィブリノーゲンＡα１５Ａｒｇ−１６
Ｇｌｙ 結合、およびアミノ末端のフィブリノペプチド
Ｂを遊離するＢα１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ 結合の開裂
を通して起こる。この新規アミノ末端は、近隣分子のカ
ルボキシ末端領域の相補性重合部位と相互作用し、かく
して活性化されたフィブリンモノマーを二本鎖プロトフ
ィブリルに整列させることにより会合できるようにする
重合領域として作用すると思われる。プロトフィブリル
は長さが増加しそして側部で会合し、密集したフィブリ
ン繊維を形成する。それらの繊維が更に会合して血餅網
状構造の濃密フィブリン鎖を形成する。
性血漿タンパク質フィブリノーゲンは、血餅の不溶性フ
ィブリン網状構造を形成する前駆体である。この過程は
周知である。フィブリノーゲンがトロンビンにより活性
化され、活性化されたフィブリノーゲンが重合して凝塊
を形成する。活性化は、アミノ末端のフィブリノペプチ
ドＡを遊離するフィブリノーゲンＡα１５Ａｒｇ−１６
Ｇｌｙ 結合、およびアミノ末端のフィブリノペプチド
Ｂを遊離するＢα１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ 結合の開裂
を通して起こる。この新規アミノ末端は、近隣分子のカ
ルボキシ末端領域の相補性重合部位と相互作用し、かく
して活性化されたフィブリンモノマーを二本鎖プロトフ
ィブリルに整列させることにより会合できるようにする
重合領域として作用すると思われる。プロトフィブリル
は長さが増加しそして側部で会合し、密集したフィブリ
ン繊維を形成する。それらの繊維が更に会合して血餅網
状構造の濃密フィブリン鎖を形成する。
【０００３】生体内でのフィブリンの形成は、止血に関
連する多数の生理学的過程、例えば血餅安定化酵素の活
性化（第ＸＩＩＩ因子）、フィブリン溶解および内皮細
胞分泌の調節に影響を及ぼす。それらの過程の実験室研
究は、典型的にはフィブリンの存在下での現象の分析を
伴う。活性に対するフィブリンの刺激（または必須の）
作用が証明されている。フィブリンは重合するので、中
性緩衝液中での方法は沈澱物または凝集物の形成を伴い
、従って生物学的および臨床的アッセイにおけるフィブ
リンの使用は制限されている。フィブリンの凝塊形は取
扱いが難しく、容易に定量できないので、フィブリンの
可溶化形、またはフィブリンのタンパク質分解的もしく
は化学的分解により形成されたフィブリンの断片が大部
分の研究において使用されている。
連する多数の生理学的過程、例えば血餅安定化酵素の活
性化（第ＸＩＩＩ因子）、フィブリン溶解および内皮細
胞分泌の調節に影響を及ぼす。それらの過程の実験室研
究は、典型的にはフィブリンの存在下での現象の分析を
伴う。活性に対するフィブリンの刺激（または必須の）
作用が証明されている。フィブリンは重合するので、中
性緩衝液中での方法は沈澱物または凝集物の形成を伴い
、従って生物学的および臨床的アッセイにおけるフィブ
リンの使用は制限されている。フィブリンの凝塊形は取
扱いが難しく、容易に定量できないので、フィブリンの
可溶化形、またはフィブリンのタンパク質分解的もしく
は化学的分解により形成されたフィブリンの断片が大部
分の研究において使用されている。
【０００４】可溶化されたフィブリンは、高濃度のカオ
トロピック変性試薬、例えば尿素、塩酸グアニジン、臭
化ナトリウムまたは酸（例えば酢酸）を含む緩衝液中に
凝塊を溶解することにより普通は調製される。第ＸＩＩ
Ｉ因子により安定化されていないフィブリンのみがそれ
らの試薬のいずれかを含む緩衝液に溶解することができ
る。 そのような方法により可溶化されたフィブリンは、酸ま
たはカオトロピック剤含有緩衝液の存在下でのみ溶液の
状態である。それらの条件は、着目の他の大部分のタン
パク質、酵素および細胞の生物学的性質を破壊し、この
理由により、酸またはカオトロピック剤で処理された可
溶性フィブリンは限定された用途のみを有する。
トロピック変性試薬、例えば尿素、塩酸グアニジン、臭
化ナトリウムまたは酸（例えば酢酸）を含む緩衝液中に
凝塊を溶解することにより普通は調製される。第ＸＩＩ
Ｉ因子により安定化されていないフィブリンのみがそれ
らの試薬のいずれかを含む緩衝液に溶解することができ
る。 そのような方法により可溶化されたフィブリンは、酸ま
たはカオトロピック剤含有緩衝液の存在下でのみ溶液の
状態である。それらの条件は、着目の他の大部分のタン
パク質、酵素および細胞の生物学的性質を破壊し、この
理由により、酸またはカオトロピック剤で処理された可
溶性フィブリンは限定された用途のみを有する。
【０００５】可溶性フィブリンは、重合阻害剤、例えば
ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ 〔Ｌａｕｄ
ａｎｏ，Ａ．Ｐ．， Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，Ｂ．Ａ． お
よびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ． （１９８３） ”
Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｍｏｄｅｌｅ
ｄ ｏｎ Ｆｉｂｒｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ Ｓｉｔｅｓ”， Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
．， ４０８巻， ３１５−３２９ 頁並びにその中に
引用された参考文献〕またはフィブリノーゲン断片Ｄの
存在下で、フィブリノーゲンをフィブリンに変換するこ
とによっても調製される。この場合、フィブリノーゲン
の活性化は通常、ヘビ毒酵素、例えばバトロキソビン〔
Ｗｉｍａｎ，Ｂ．およびＲａｎｂｙ，Ｍ． （１９８６
）， ”Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｌｕ
ｂｌｅ Ｆｉｂｒｉｎ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｂｙ ａ
Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓ
ｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ”，
Ｔｈｒｏｍｂ．ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓ， ５
５， １８９−１９３ 〕を使ってＡα鎖においてのみ
行われる。重合部位の１セットのみがこの方法により活
性化され、そして単一の重合阻害剤、例えばＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ， Ｉｎｃ， Ｇｒｅ
ｅｎｗｉｃｈ， ＣＴからの ＤＥＳＡＦＩＢＴＭを用
いてフィブリンの凝集を効果的に防止することができる
。しかしながら、溶液中に存在する重合阻害剤が適当な
高濃度である場合にのみ、フィブリンは生理的緩衝液中
で可溶性のままである。希釈により重合阻害剤の濃度が
低下するとフィブリンの沈澱が起こる。
ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ 〔Ｌａｕｄ
ａｎｏ，Ａ．Ｐ．， Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，Ｂ．Ａ． お
よびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ． （１９８３） ”
Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｍｏｄｅｌｅ
ｄ ｏｎ Ｆｉｂｒｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ Ｓｉｔｅｓ”， Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
．， ４０８巻， ３１５−３２９ 頁並びにその中に
引用された参考文献〕またはフィブリノーゲン断片Ｄの
存在下で、フィブリノーゲンをフィブリンに変換するこ
とによっても調製される。この場合、フィブリノーゲン
の活性化は通常、ヘビ毒酵素、例えばバトロキソビン〔
Ｗｉｍａｎ，Ｂ．およびＲａｎｂｙ，Ｍ． （１９８６
）， ”Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｌｕ
ｂｌｅ Ｆｉｂｒｉｎ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｂｙ ａ
Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓ
ｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ”，
Ｔｈｒｏｍｂ．ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓ， ５
５， １８９−１９３ 〕を使ってＡα鎖においてのみ
行われる。重合部位の１セットのみがこの方法により活
性化され、そして単一の重合阻害剤、例えばＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ， Ｉｎｃ， Ｇｒｅ
ｅｎｗｉｃｈ， ＣＴからの ＤＥＳＡＦＩＢＴＭを用
いてフィブリンの凝集を効果的に防止することができる
。しかしながら、溶液中に存在する重合阻害剤が適当な
高濃度である場合にのみ、フィブリンは生理的緩衝液中
で可溶性のままである。希釈により重合阻害剤の濃度が
低下するとフィブリンの沈澱が起こる。
【０００６】生理的条件下でフィブリンを可溶化する難
しさのため、溶解性を維持するための特定の条件を必要
としない新規形態のフィブリン、またはフィブリンの性
質を有する物質は、特にフィブリンモノマーまたは可溶
性フィブリンを要求する生化学的および免疫学的アッセ
イにおける使用に非常に有用であろう。
しさのため、溶解性を維持するための特定の条件を必要
としない新規形態のフィブリン、またはフィブリンの性
質を有する物質は、特にフィブリンモノマーまたは可溶
性フィブリンを要求する生化学的および免疫学的アッセ
イにおける使用に非常に有用であろう。
【０００７】ＰｒｏｃｙｋおよびＢｌｏｍｂａｃｋは、
トロンビンで処理した時に長い凝固時間を有する、ジス
ルフィド結合の還元によるフィブリノーゲンの変形の調
製を記載している〔Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ． およびＢｌｏ
ｍｂａｃｋ，Ｂ． （１９９０） ”Ｄｉｓｕｌｆｉｄ
ｅ Ｂｏｎｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｂｒｉ
ｎｏｇｅｎ ： Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｃｌｏｔｔａｂｉｌ
ｉｔｙ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９， １５
０１−１５０７ 〕。カルシウムイオンの非存在下での
穏和な還元により変形フィブリノーゲンが調製され、そ
して第ＸＩＩＩ因子により触媒されるオリゴマー化およ
び架橋を伴う機構によってのみゲルが形成された。しか
しながら、今までに、この物質の性質、安定性、可溶性
、または可溶性フィブリンもしくは可溶性フィブリンモ
ノマーを必要とする用途における適切性については全く
知られていない。
トロンビンで処理した時に長い凝固時間を有する、ジス
ルフィド結合の還元によるフィブリノーゲンの変形の調
製を記載している〔Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ． およびＢｌｏ
ｍｂａｃｋ，Ｂ． （１９９０） ”Ｄｉｓｕｌｆｉｄ
ｅ Ｂｏｎｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｂｒｉ
ｎｏｇｅｎ ： Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｃｌｏｔｔａｂｉｌ
ｉｔｙ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９， １５
０１−１５０７ 〕。カルシウムイオンの非存在下での
穏和な還元により変形フィブリノーゲンが調製され、そ
して第ＸＩＩＩ因子により触媒されるオリゴマー化およ
び架橋を伴う機構によってのみゲルが形成された。しか
しながら、今までに、この物質の性質、安定性、可溶性
、または可溶性フィブリンもしくは可溶性フィブリンモ
ノマーを必要とする用途における適切性については全く
知られていない。
【０００８】本出願人らは、フィブリンと実質的に生化
学的および免疫学的等価値を有する変形フィブリノーゲ
ンを発見し、そしてこの発見を利用してアッセイおよび
方法における変形フィブリノーゲンの有用な用途を発明
した。この発明は、アッセイ方法に可溶性フィブリンま
たはフィブリノーゲン断片の形を必要とする凝固および
／またはフィブリン溶解の診断測定において特別の用途
を有する。
学的および免疫学的等価値を有する変形フィブリノーゲ
ンを発見し、そしてこの発見を利用してアッセイおよび
方法における変形フィブリノーゲンの有用な用途を発明
した。この発明は、アッセイ方法に可溶性フィブリンま
たはフィブリノーゲン断片の形を必要とする凝固および
／またはフィブリン溶解の診断測定において特別の用途
を有する。
【０００９】定義
Ａ４９０ ：４９０ ｎｍでの吸光度
Ａｒｇ ：アルギニン
ＡＴＵ ：抗トロンビン単位
Ｂβ１５−２１ ：残基番号１５〜２１のフィブリノー
ゲンＢβ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド Ｂβ１５−４２ ：残基番号１５〜４２のフィブリノー
ゲンＢβ鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド Ｂβ１５−１１８：残基番号１５〜１１８ のフィブリ
ノーゲンＢβ鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド Ｂβ１５−４６１：残基番号１５〜４６１ のフィブリ
ノーゲンＢβ鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド Ｃｙｓ ： システイン ｄｅｓ ＡＡ−フィブリン：２つのフィブリノペプチド
Ａを欠くフィブリン（フィブリンＩ） ｄｅｓＡＡＢＢ−フィブリン：２つのフィブリノペプチ
ドＡおよびＢを欠くフィブリン（フィブリンＩＩ）ＤＴ
Ｔ ： ジチオトレイトール Ｅ（１％，１ｃｍ）：吸光係数 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＥＬＩＳＡ ：エンザイムリンクドイムノソルベントア
ッセイフィブリニン：下記実施例１〜３に記載のフィブ
リン様モノマー ｆｍｏｌ：フェントモル Ｇｌｙ ：グリシン Ｍ ：モル ｍＭ ：ミリモル ＮＩＨ ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （合衆国公衆衛生局） ｎｍ ：ナノメーター ＰＡＩ ：プラスミン活性化因子阻害剤ｐｍｏｌ：ピコ
モル Ｐｒｏ ：プロリン ＲＩＡ ：ラジオイムノアッセイ （Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ：ポリペプチド断片（Ａα１６−５１
，Ｂβ１５−１１８， γ１−７８）２ を含む、ヒ
トフィブリノーゲンのトロンビン処理アミノ末端臭化シ
アン生成断片ＴＮＥ ：Ｔｒｉｓ−食塩−ＥＤＴＡ緩衝
液ｔ−ＰＡ：組織プラスミノーゲン活性化因子Ｔｒｉｓ
：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＵ：単位 μＣ ：ミクロキュリー
ゲンＢβ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド Ｂβ１５−４２ ：残基番号１５〜４２のフィブリノー
ゲンＢβ鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド Ｂβ１５−１１８：残基番号１５〜１１８ のフィブリ
ノーゲンＢβ鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド Ｂβ１５−４６１：残基番号１５〜４６１ のフィブリ
ノーゲンＢβ鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド Ｃｙｓ ： システイン ｄｅｓ ＡＡ−フィブリン：２つのフィブリノペプチド
Ａを欠くフィブリン（フィブリンＩ） ｄｅｓＡＡＢＢ−フィブリン：２つのフィブリノペプチ
ドＡおよびＢを欠くフィブリン（フィブリンＩＩ）ＤＴ
Ｔ ： ジチオトレイトール Ｅ（１％，１ｃｍ）：吸光係数 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＥＬＩＳＡ ：エンザイムリンクドイムノソルベントア
ッセイフィブリニン：下記実施例１〜３に記載のフィブ
リン様モノマー ｆｍｏｌ：フェントモル Ｇｌｙ ：グリシン Ｍ ：モル ｍＭ ：ミリモル ＮＩＨ ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （合衆国公衆衛生局） ｎｍ ：ナノメーター ＰＡＩ ：プラスミン活性化因子阻害剤ｐｍｏｌ：ピコ
モル Ｐｒｏ ：プロリン ＲＩＡ ：ラジオイムノアッセイ （Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ：ポリペプチド断片（Ａα１６−５１
，Ｂβ１５−１１８， γ１−７８）２ を含む、ヒ
トフィブリノーゲンのトロンビン処理アミノ末端臭化シ
アン生成断片ＴＮＥ ：Ｔｒｉｓ−食塩−ＥＤＴＡ緩衝
液ｔ−ＰＡ：組織プラスミノーゲン活性化因子Ｔｒｉｓ
：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＵ：単位 μＣ ：ミクロキュリー
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、アッセ
イの成分の１つとして可溶性フィブリンまたは可溶性フ
ィブリンモノマー試薬を必要とするアッセイを提供する
ことである。上記目的、並びに他の目的、ねらいおよび
利点は本発明によりかなえられる。
イの成分の１つとして可溶性フィブリンまたは可溶性フ
ィブリンモノマー試薬を必要とするアッセイを提供する
ことである。上記目的、並びに他の目的、ねらいおよび
利点は本発明によりかなえられる。
【００１１】本発明は、アッセイの１つの成分として可
溶性フィブリンまたは可溶性フィブリンモノマー試薬を
必要とするアッセイ方法であって、前記試薬がフィブリ
ノーゲンと同様な溶解性および安定性を有するフィブリ
ン様物質であり、フィブリン重合阻害剤または溶解性を
維持するための試薬の非存在下において、前記試薬が前
記アッセイで使用する濃度、例えば０．０８ ｍｇ／ｍ
ｌ〜１５ ｍｇ／ｍｌの濃度において生理的条件下で可
溶性で且つ安定なままであることを特徴とするアッセイ
方法に関する。
溶性フィブリンまたは可溶性フィブリンモノマー試薬を
必要とするアッセイ方法であって、前記試薬がフィブリ
ノーゲンと同様な溶解性および安定性を有するフィブリ
ン様物質であり、フィブリン重合阻害剤または溶解性を
維持するための試薬の非存在下において、前記試薬が前
記アッセイで使用する濃度、例えば０．０８ ｍｇ／ｍ
ｌ〜１５ ｍｇ／ｍｌの濃度において生理的条件下で可
溶性で且つ安定なままであることを特徴とするアッセイ
方法に関する。
【００１２】アッセイ方法としては、例えば、（１）
可溶性フィブリンモノマー、 （２） プラスミン活性化因子阻害剤活性、（３） 血
漿中の組織プラスミノーゲン活性化因子活性の定量のた
めのアッセイ、および （４） イムノアッセイ が挙げられる。
可溶性フィブリンモノマー、 （２） プラスミン活性化因子阻害剤活性、（３） 血
漿中の組織プラスミノーゲン活性化因子活性の定量のた
めのアッセイ、および （４） イムノアッセイ が挙げられる。
【００１３】本発明において使用されるフィブリン様物
質は、好ましくは、溶解性を維持するための試薬または
フィブリン重合阻害剤を必要とすることなしに、生理的
緩衝液中で、そしてフィブリノーゲンの溶解性および安
定性にとって適当である条件下で、例えば３ 〜１０の
ｐＨおよび広範囲の濃度、即ち０．０８ ｍｇ／ｍｌほ
どの低濃度から１５ ｍｇ／ｍｌほどの高濃度までの条
件下で、可溶性で且つ安定なままである物質である。
質は、好ましくは、溶解性を維持するための試薬または
フィブリン重合阻害剤を必要とすることなしに、生理的
緩衝液中で、そしてフィブリノーゲンの溶解性および安
定性にとって適当である条件下で、例えば３ 〜１０の
ｐＨおよび広範囲の濃度、即ち０．０８ ｍｇ／ｍｌほ
どの低濃度から１５ ｍｇ／ｍｌほどの高濃度までの条
件下で、可溶性で且つ安定なままである物質である。
【００１４】驚くべきことに、そのようなフィブリン様
物質（“フィブリニン”）が他のタイプの可溶性フィブ
リンと同様な免疫学的および生化学的性質を有し、従っ
てそれらの他の変形体と同じ範疇において使用できるこ
とが発見された。それらの用途としては、種々のタイプ
のイムノアッセイ、更には可溶性フィブリンモノマー、
プラスミン活性化因子阻害剤（”ＰＡＩ”） 活性また
は血漿中の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ
）活性の定量のための試験における使用が挙げられる。
物質（“フィブリニン”）が他のタイプの可溶性フィブ
リンと同様な免疫学的および生化学的性質を有し、従っ
てそれらの他の変形体と同じ範疇において使用できるこ
とが発見された。それらの用途としては、種々のタイプ
のイムノアッセイ、更には可溶性フィブリンモノマー、
プラスミン活性化因子阻害剤（”ＰＡＩ”） 活性また
は血漿中の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ
）活性の定量のための試験における使用が挙げられる。
【００１５】本発明において使用することができるフィ
ブリン様可溶性試薬は、トロンビンによる変形フィブリ
ノーゲンの活性化が凝固化を導かないようなフィブリノ
ーゲンの構造の変更をもたらす方法により製造される。 この変更は、少量の還元試薬を用いたフィブリノーゲン
の幾つかのジスルフィド結合の開裂に基づく。この開裂
は、タンパク質の幾つかの性質を変えるタンパク質の構
造のわずかな破壊を導く。トロンビンまたは他の凝固化
酵素に暴露すると、変形フィブリノーゲンは、フィブリ
ノペプチドの遊離に関して未変形フィブリノーゲンと同
様な様式で、そのような酵素と相互作用する。しかしな
がら、たとえフィブリノペプチドが遊離されても、変形
フィブリノーゲンは重合せず、溶液中で可溶性のままで
ある。
ブリン様可溶性試薬は、トロンビンによる変形フィブリ
ノーゲンの活性化が凝固化を導かないようなフィブリノ
ーゲンの構造の変更をもたらす方法により製造される。 この変更は、少量の還元試薬を用いたフィブリノーゲン
の幾つかのジスルフィド結合の開裂に基づく。この開裂
は、タンパク質の幾つかの性質を変えるタンパク質の構
造のわずかな破壊を導く。トロンビンまたは他の凝固化
酵素に暴露すると、変形フィブリノーゲンは、フィブリ
ノペプチドの遊離に関して未変形フィブリノーゲンと同
様な様式で、そのような酵素と相互作用する。しかしな
がら、たとえフィブリノペプチドが遊離されても、変形
フィブリノーゲンは重合せず、溶液中で可溶性のままで
ある。
【００１６】フィブリン様可溶性フィブリン試薬は、次
の段階： （ａ） タンパク質フィブリノーゲンを還元し、二価カ
チオンの非存在下で該タンパク質の限定数のジスルフィ
ド結合を開裂せしめ、 （ｂ） （ａ） から得られたフィブリノーゲンをブロ
ッキング剤と接触させることにより、還元中に形成され
る遊離システインのチオール基を可逆的にブロックし、
（ｃ） （ｂ） から得られたフィブリノーゲンを酵素
トロンビンと接触させて生じたタンパク質のアミノ末端
を開裂せしめ、それによってフィブリノペプチドＡおよ
びＢを遊離させ、そして （ｄ） 適当な阻害剤を添加するかまたは（ｃ） の可
溶性フィブリン様モノマーから前記酵素を分離すること
により、前記酵素の作用を停止させる、 を含んで成る。
の段階： （ａ） タンパク質フィブリノーゲンを還元し、二価カ
チオンの非存在下で該タンパク質の限定数のジスルフィ
ド結合を開裂せしめ、 （ｂ） （ａ） から得られたフィブリノーゲンをブロ
ッキング剤と接触させることにより、還元中に形成され
る遊離システインのチオール基を可逆的にブロックし、
（ｃ） （ｂ） から得られたフィブリノーゲンを酵素
トロンビンと接触させて生じたタンパク質のアミノ末端
を開裂せしめ、それによってフィブリノペプチドＡおよ
びＢを遊離させ、そして （ｄ） 適当な阻害剤を添加するかまたは（ｃ） の可
溶性フィブリン様モノマーから前記酵素を分離すること
により、前記酵素の作用を停止させる、 を含んで成る。
【００１７】
【作用】本発明において使用することができそしてフィ
ブリンの幾つかの生化学的性質を有する可溶性で且つ安
定な試薬は、本質的にはＰｒｏｃｙｋおよびＢｌｏｍｂ
ａｃｋ〔Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ． およびＢｌｏｍｂａｃｋ
，Ｂ． （１９９０） ”Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎ
ｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ
： Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｃｌｏｔｔａｂｉｌｉｔｙ”，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９， １５０１−
１５０７ 〕に従って、ただし該方法を単純化するため
に考案された改良を伴って、調製される。
ブリンの幾つかの生化学的性質を有する可溶性で且つ安
定な試薬は、本質的にはＰｒｏｃｙｋおよびＢｌｏｍｂ
ａｃｋ〔Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ． およびＢｌｏｍｂａｃｋ
，Ｂ． （１９９０） ”Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎ
ｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ
： Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｃｌｏｔｔａｂｉｌｉｔｙ”，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９， １５０１−
１５０７ 〕に従って、ただし該方法を単純化するため
に考案された改良を伴って、調製される。
【００１８】フィブリノーゲンは、まず限定（部分）還
元にかけることにより変形される。この還元は、約３
〜２５マイクロモルの範囲のフィブリノーゲン濃度を使
って行われ、好ましい濃度は２０．６マイクロモルであ
る。わずかに高められた温度、即ち３０〜４０℃、例え
ば３７℃が必要である。還元は非変性条件下、即ち生理
的緩衝液、緩衝化塩類溶液、適当なイオン強度およびｐ
Ｈ、例えば７．２ 〜８．３ のｐＨの緩衝液、例えば
フィブリノーゲンの沈澱を引き起こさないような緩衝液
中で行われる。少量の還元試薬、例えば還元試薬の還元
力に依存してフィブリノーゲン１ナノモルあたり０．２
５ミリモルまでの還元試薬が使用される。還元試薬は、
例えば、チオール、例えばジチオトレイトール、２−メ
ルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオネート、
２−アミノエタンチオールもしくは他の類似の試薬；還
元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウム等；または生物学
的還元試薬、例えばグルタチオン、システインもしくは
チオレドキシンから成るものであることができる。還元
は二価カチオンの非存在下で行われ、これは、適当な濃
度であって且つ溶液中のタンパク質の沈澱を引き起こさ
ないであろう濃度、例えば０．１ 〜１０ｍＭの二価カ
チオンキレート化剤〔例えばエチレンジアミン四酢酸、
エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸〕またはカルシウム
もしくは他の二価カチオンを結合するであろう他のキレ
ート化剤を反応混合物中に存在させることにより、達成
することができる。
元にかけることにより変形される。この還元は、約３
〜２５マイクロモルの範囲のフィブリノーゲン濃度を使
って行われ、好ましい濃度は２０．６マイクロモルであ
る。わずかに高められた温度、即ち３０〜４０℃、例え
ば３７℃が必要である。還元は非変性条件下、即ち生理
的緩衝液、緩衝化塩類溶液、適当なイオン強度およびｐ
Ｈ、例えば７．２ 〜８．３ のｐＨの緩衝液、例えば
フィブリノーゲンの沈澱を引き起こさないような緩衝液
中で行われる。少量の還元試薬、例えば還元試薬の還元
力に依存してフィブリノーゲン１ナノモルあたり０．２
５ミリモルまでの還元試薬が使用される。還元試薬は、
例えば、チオール、例えばジチオトレイトール、２−メ
ルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオネート、
２−アミノエタンチオールもしくは他の類似の試薬；還
元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウム等；または生物学
的還元試薬、例えばグルタチオン、システインもしくは
チオレドキシンから成るものであることができる。還元
は二価カチオンの非存在下で行われ、これは、適当な濃
度であって且つ溶液中のタンパク質の沈澱を引き起こさ
ないであろう濃度、例えば０．１ 〜１０ｍＭの二価カ
チオンキレート化剤〔例えばエチレンジアミン四酢酸、
エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸〕またはカルシウム
もしくは他の二価カチオンを結合するであろう他のキレ
ート化剤を反応混合物中に存在させることにより、達成
することができる。
【００１９】還元時間は、感受性ジスルフィド結合の開
裂をほとんど完了させるように選択され、ほとんどの場
合、フィブリノーゲン濃度および還元試薬の選択に依存
して０．５ 〜１．５ 時間、好ましくは約１ 時間ま
でである。
裂をほとんど完了させるように選択され、ほとんどの場
合、フィブリノーゲン濃度および還元試薬の選択に依存
して０．５ 〜１．５ 時間、好ましくは約１ 時間ま
でである。
【００２０】上記の部分還元の後に、還元中に形成され
た遊離システインのチオール基を、ブロッキング試薬、
例えばヨード酢酸、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマ
レイミド、またはタンパク質生成物の沈澱を引き起こさ
ないであろう他のチオールブロッキング試薬でブロック
する。ブロッキングは２０〜２７℃の温度で０．５ 〜
２ 時間の期間行われる。必要とされるブロッキング試
薬の濃度は、ブロッキング試薬の添加前に反応混合物か
ら還元試薬が除去されるか否かに依存して異なり（実施
例１と２を参照のこと）、１．５ 〜４０ミリモルであ
ることができる。
た遊離システインのチオール基を、ブロッキング試薬、
例えばヨード酢酸、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマ
レイミド、またはタンパク質生成物の沈澱を引き起こさ
ないであろう他のチオールブロッキング試薬でブロック
する。ブロッキングは２０〜２７℃の温度で０．５ 〜
２ 時間の期間行われる。必要とされるブロッキング試
薬の濃度は、ブロッキング試薬の添加前に反応混合物か
ら還元試薬が除去されるか否かに依存して異なり（実施
例１と２を参照のこと）、１．５ 〜４０ミリモルであ
ることができる。
【００２１】回収されたフィブリノーゲンは、フィブリ
ノペプチドＡおよびＢの遊離を含む該タンパク質のアミ
ノ末端を変更するために処理される。これは酵素的に、
生理的緩衝液中で、例えばＴｒｉｓ−緩衝化塩溶液中で
、カルシウムのような二価カチオンの非存在下で行うこ
とができる。次いで該タンパク質を凝固化酵素、例えば
トロンビン、バトロキソビンもしくは他のヘビ毒酵素、
または同様なタンパク質分解特異性を有する他の酵素と
反応させる。この処理は、２０〜２７℃の温度、好まし
くは室温において、フィブリノーゲンからフィブリノペ
プチドＢの少なくとも９９％以上を遊離せしめるのに十
分な量の酵素、例えば０．２ 〜３ ＮＩＨ 単位のト
ロンビンまたは等価物を使って行われる。これは３ 〜
１２マイクロモル、好ましくは８．８ マイクロモルの
濃度の変形フィブリノーゲンを用いて、そして１ ｍｌ
あたり０．５ ＮＩＨ 単位のトロンビンを使って、反
応混合物を１．５ 〜３ 時間、好ましくは２ 時間イ
ンキュベートすることにより達成できる。
ノペプチドＡおよびＢの遊離を含む該タンパク質のアミ
ノ末端を変更するために処理される。これは酵素的に、
生理的緩衝液中で、例えばＴｒｉｓ−緩衝化塩溶液中で
、カルシウムのような二価カチオンの非存在下で行うこ
とができる。次いで該タンパク質を凝固化酵素、例えば
トロンビン、バトロキソビンもしくは他のヘビ毒酵素、
または同様なタンパク質分解特異性を有する他の酵素と
反応させる。この処理は、２０〜２７℃の温度、好まし
くは室温において、フィブリノーゲンからフィブリノペ
プチドＢの少なくとも９９％以上を遊離せしめるのに十
分な量の酵素、例えば０．２ 〜３ ＮＩＨ 単位のト
ロンビンまたは等価物を使って行われる。これは３ 〜
１２マイクロモル、好ましくは８．８ マイクロモルの
濃度の変形フィブリノーゲンを用いて、そして１ ｍｌ
あたり０．５ ＮＩＨ 単位のトロンビンを使って、反
応混合物を１．５ 〜３ 時間、好ましくは２ 時間イ
ンキュベートすることにより達成できる。
【００２２】添加した酵素の活動は、適当な酵素阻害剤
を過剰に添加することにより停止させることができる。 トロンビンの場合、阻害剤ヒルジンが適当である（実施
例１および２参照）。あるいは、アフィニティークロマ
トグラフィー技術により（実施例３）、またはエタノー
ル−グリシン溶液もしくは硫酸アンモニウムのような塩
を用いてフィブリノーゲンを選択的に沈澱させることに
より、反応混合物から酵素を除去することができる。別
の態様によれば、様々な化学的もしくは物理的手段〔例
えば臭化シアン、カルボジイミド等の剤を必要とする常
用の方法によるセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ， Ｎ．Ｊ．） への結合〕により酵素を固定化し、
そして変形フィブリノーゲンを暴露して変形フィブリノ
ーゲンのアミノ末端の所望の変更を与えることができる
。最終生成物（仮に“フィブリニン”と呼ぶ）は、凝固
せず且つ十分に可溶性のままであるフィブリンの形態で
ある。フィブリニンを調製するための幾つかの方法（変
形を含む）が下記の実施例１〜４に記載されている。
を過剰に添加することにより停止させることができる。 トロンビンの場合、阻害剤ヒルジンが適当である（実施
例１および２参照）。あるいは、アフィニティークロマ
トグラフィー技術により（実施例３）、またはエタノー
ル−グリシン溶液もしくは硫酸アンモニウムのような塩
を用いてフィブリノーゲンを選択的に沈澱させることに
より、反応混合物から酵素を除去することができる。別
の態様によれば、様々な化学的もしくは物理的手段〔例
えば臭化シアン、カルボジイミド等の剤を必要とする常
用の方法によるセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ， Ｎ．Ｊ．） への結合〕により酵素を固定化し、
そして変形フィブリノーゲンを暴露して変形フィブリノ
ーゲンのアミノ末端の所望の変更を与えることができる
。最終生成物（仮に“フィブリニン”と呼ぶ）は、凝固
せず且つ十分に可溶性のままであるフィブリンの形態で
ある。フィブリニンを調製するための幾つかの方法（変
形を含む）が下記の実施例１〜４に記載されている。
【００２３】フィブリニン調製物は、臨床的および生物
学的アッセイ系において使用される生理的緩衝液、例え
ば典型的な緩衝剤、例えばＴｒｉｓ〔トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン〕；リン酸塩；バルビタール等
のいずれかで緩衝化された標準塩類溶液中で安定であり
且つ可溶性である。標準塩濃度（０．１５） の範囲の
イオン強度を有する生物学的緩衝液も適当であり、その
ようなものとしては、ＡＣＥＳ：２−〔（２−アミノオ
キソエチル）アミノ〕エタンスルホン酸；ＰＩＰＥＳ：
ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）
；ＭＯＰＳ：３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸；ビス−トリスプロパン：１，３−ビス〔トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチルアミノ〕プロパン；ＢＥＳ：Ｎ
，Ｎ−ビス〔（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエ
タンスルホン酸；ＨＥＰＥＳ：Ｎ−（２−ヒドロキシエ
チル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）；
イミダゾール等が挙げられる。生理的ｐＨは７．４ で
あり、これはフィブリニンの保存および使用に好ましい
ｐＨであるけれども、この物質は５．５ 〜１０．０の
ｐＨ範囲で可溶性であっても、フィブリニンのｐＨの有
用範囲は、フィブリノーゲンと同様に、知られる限りで
は５．５ 〜１０．０のｐＨ範囲である。フィブリニン
調製物の安定性および溶解性はフィブリノーゲンのもの
と相違がなく、従ってフィブリニンはフィブリノーゲン
にとって適当であるような方法で取り扱うことができる
。フィブリニンを４ ℃で１ 〜１５ ｍｇ／ｍｌの濃
度で保存することが実用的であり、好ましい濃度は３
〜５ ｍｇ／ｍｌ である。フィブリニンは、所望の濃
度を与えるであろう特定のアッセイもしくはプロトコル
に特有の緩衝液または溶液で原液を希釈することにより
使用できる（所望の濃度は実施例１の手順に従って測定
することができる）。
学的アッセイ系において使用される生理的緩衝液、例え
ば典型的な緩衝剤、例えばＴｒｉｓ〔トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン〕；リン酸塩；バルビタール等
のいずれかで緩衝化された標準塩類溶液中で安定であり
且つ可溶性である。標準塩濃度（０．１５） の範囲の
イオン強度を有する生物学的緩衝液も適当であり、その
ようなものとしては、ＡＣＥＳ：２−〔（２−アミノオ
キソエチル）アミノ〕エタンスルホン酸；ＰＩＰＥＳ：
ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）
；ＭＯＰＳ：３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸；ビス−トリスプロパン：１，３−ビス〔トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチルアミノ〕プロパン；ＢＥＳ：Ｎ
，Ｎ−ビス〔（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエ
タンスルホン酸；ＨＥＰＥＳ：Ｎ−（２−ヒドロキシエ
チル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）；
イミダゾール等が挙げられる。生理的ｐＨは７．４ で
あり、これはフィブリニンの保存および使用に好ましい
ｐＨであるけれども、この物質は５．５ 〜１０．０の
ｐＨ範囲で可溶性であっても、フィブリニンのｐＨの有
用範囲は、フィブリノーゲンと同様に、知られる限りで
は５．５ 〜１０．０のｐＨ範囲である。フィブリニン
調製物の安定性および溶解性はフィブリノーゲンのもの
と相違がなく、従ってフィブリニンはフィブリノーゲン
にとって適当であるような方法で取り扱うことができる
。フィブリニンを４ ℃で１ 〜１５ ｍｇ／ｍｌの濃
度で保存することが実用的であり、好ましい濃度は３
〜５ ｍｇ／ｍｌ である。フィブリニンは、所望の濃
度を与えるであろう特定のアッセイもしくはプロトコル
に特有の緩衝液または溶液で原液を希釈することにより
使用できる（所望の濃度は実施例１の手順に従って測定
することができる）。
【００２４】生来のフィブリンのものと同様であるフィ
ブリニンの免疫学的性質は、可溶性形のフィブリン抗原
を必要とする種々のタイプのイムノアッセイに有用であ
る。これは特に、生理的緩衝液または生物学的液体中、
例えば血漿もしくは血液中で、即ち未変性の形で、フィ
ブリンを可溶化するために典型的に用いられる変性剤、
例えば尿素、グアニジンまたは酸の非存在下で、フィブ
リン抗原を必要とするアッセイにおいて当てはまる。前
記に列挙した剤のいずれかに可溶化されたフィブリンは
、免疫学的アッセイに使用することができない。しかし
ながら、これは生来のフィブリンと同様な免疫学的性質
を有することが発見されたフィブリニンによって可能に
なる。例えば、フィブリニンのβ鎖のアミノ末端領域は
生来のフィブリンとは免疫学的に識別不可能であり、従
ってフィブリニンは、模範的な直接結合アッセイまたは
模範的な直接もしくは間接競合ＥＬＩＳＡ 、またはフ
ィブリンもしくはフィブリン分解生成物を測定するＲＩ
Ａ において有用である。
ブリニンの免疫学的性質は、可溶性形のフィブリン抗原
を必要とする種々のタイプのイムノアッセイに有用であ
る。これは特に、生理的緩衝液または生物学的液体中、
例えば血漿もしくは血液中で、即ち未変性の形で、フィ
ブリンを可溶化するために典型的に用いられる変性剤、
例えば尿素、グアニジンまたは酸の非存在下で、フィブ
リン抗原を必要とするアッセイにおいて当てはまる。前
記に列挙した剤のいずれかに可溶化されたフィブリンは
、免疫学的アッセイに使用することができない。しかし
ながら、これは生来のフィブリンと同様な免疫学的性質
を有することが発見されたフィブリニンによって可能に
なる。例えば、フィブリニンのβ鎖のアミノ末端領域は
生来のフィブリンとは免疫学的に識別不可能であり、従
ってフィブリニンは、模範的な直接結合アッセイまたは
模範的な直接もしくは間接競合ＥＬＩＳＡ 、またはフ
ィブリンもしくはフィブリン分解生成物を測定するＲＩ
Ａ において有用である。
【００２５】本発明の直接型の結合アッセイについては
、フィブリンまたはフィブリン分解生成物（例えばフィ
ブリンのプラスミン誘導化アミノ末端断片）上のエピト
ープと反応しリポート基（例えば１２５−ヨウ素のよう
な放射性核種、または西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素
のような発色試薬）が取り付けられている抗体が、ミク
ロタイタープレートのプラスチックウエルに結合させる
ために使用される。この場合、該ウエルのうちの幾つか
は分析しようとする試料でコーティングされ、そしてそ
の他はフィブリニンでコーティングされている。ウエル
に結合したフィブリニンは抗体が認識しそして結合する
であろうフィブリン特異的エピトープを含むので、フィ
ブリニンでコーティングされたウエルが正の対照として
使用されるだろう。
、フィブリンまたはフィブリン分解生成物（例えばフィ
ブリンのプラスミン誘導化アミノ末端断片）上のエピト
ープと反応しリポート基（例えば１２５−ヨウ素のよう
な放射性核種、または西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素
のような発色試薬）が取り付けられている抗体が、ミク
ロタイタープレートのプラスチックウエルに結合させる
ために使用される。この場合、該ウエルのうちの幾つか
は分析しようとする試料でコーティングされ、そしてそ
の他はフィブリニンでコーティングされている。ウエル
に結合したフィブリニンは抗体が認識しそして結合する
であろうフィブリン特異的エピトープを含むので、フィ
ブリニンでコーティングされたウエルが正の対照として
使用されるだろう。
【００２６】本発明に従った模範的な直接または間接競
合ＥＬＩＳＡ については、フィブリニンはミクロタイ
タープレートのウエルに結合される抗原として（上記の
直接結合アッセイにおけるものと同様な）または溶液中
の競合抗原として、即ち競合アッセイにおける標準物と
して、等の用途を有する。それらのアッセイについては
、抗体が利用できるフィブリン関連エピトープを含む物
質でミクロタイタープレートのウエルがコーティングさ
れるので、フィブリニンはこの目的に適当であろう。抗
体が利用できるエピトープを有する未知量のフィブリン
関連物質、例えば非重合フィブリン分子（可溶性フィブ
リン分子）またはフィブリン分解生成物を含有する混合
物または血漿といった試料の逐次希釈液が、一定量の抗
体と混合されるだろう。全希釈度における試料の濃度は
、過剰の抗体が得られるようにするべきである。これは
、全試料が抗体に結合した後で、残った過剰の未反応の
抗体が自由にウエル中のプラスチック被覆抗原と相互作
用するであろうことを意味する。同様に、既知濃度（分
光光度的にまたは容易に利用可能なタンパク質定量のた
めの実験室アッセイのいずれかにより測定）のフィブリ
ニンの原液を連続希釈し、そして一定量の抗体と混合す
る。平衡に達するまで試料をインキュベートした後、全
ての混合物をプラスチックウエルに移し、そして試料と
会合しない抗体の画分が抗原被覆ウエルに結合する。直
接アッセイでは、結合した抗体（予め西洋ワサビペルオ
キシダーゼで標識されている）の量を基質−色素の色の
変化により評価する。間接アッセイでは、特異的に結合
した抗体を、第一抗体に対して向けられたペルオキシダ
ーゼ接合第二抗体により検出する（実施例５参照）。
合ＥＬＩＳＡ については、フィブリニンはミクロタイ
タープレートのウエルに結合される抗原として（上記の
直接結合アッセイにおけるものと同様な）または溶液中
の競合抗原として、即ち競合アッセイにおける標準物と
して、等の用途を有する。それらのアッセイについては
、抗体が利用できるフィブリン関連エピトープを含む物
質でミクロタイタープレートのウエルがコーティングさ
れるので、フィブリニンはこの目的に適当であろう。抗
体が利用できるエピトープを有する未知量のフィブリン
関連物質、例えば非重合フィブリン分子（可溶性フィブ
リン分子）またはフィブリン分解生成物を含有する混合
物または血漿といった試料の逐次希釈液が、一定量の抗
体と混合されるだろう。全希釈度における試料の濃度は
、過剰の抗体が得られるようにするべきである。これは
、全試料が抗体に結合した後で、残った過剰の未反応の
抗体が自由にウエル中のプラスチック被覆抗原と相互作
用するであろうことを意味する。同様に、既知濃度（分
光光度的にまたは容易に利用可能なタンパク質定量のた
めの実験室アッセイのいずれかにより測定）のフィブリ
ニンの原液を連続希釈し、そして一定量の抗体と混合す
る。平衡に達するまで試料をインキュベートした後、全
ての混合物をプラスチックウエルに移し、そして試料と
会合しない抗体の画分が抗原被覆ウエルに結合する。直
接アッセイでは、結合した抗体（予め西洋ワサビペルオ
キシダーゼで標識されている）の量を基質−色素の色の
変化により評価する。間接アッセイでは、特異的に結合
した抗体を、第一抗体に対して向けられたペルオキシダ
ーゼ接合第二抗体により検出する（実施例５参照）。
【００２７】フィブリニンはサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ
アッセイにおいても有用である。ミクロタイタープレ
ートのウエルをフィブリン特異抗体でコーティングする
。既知濃度のフィブリニンの原液を逐次希釈し、そして
ウエルに適用して標準曲線の作成のためのデータを提供
する。 試料、例えば血漿を逐次希釈し、他のウエルに適用する
。特異的に結合したフィブリニンまたは試料を、ペルオ
キシダーゼ接合しまたは容易に利用可能な方法により容
易に検出できるように標識した第二の一般抗体（例えば
放射能標識した第二のペルオキシダーゼ接合抗体等）（
ポリクローナル抗体、またはウエルにコーティングした
ものと異なるモノクローナル抗体）で検出する。
アッセイにおいても有用である。ミクロタイタープレ
ートのウエルをフィブリン特異抗体でコーティングする
。既知濃度のフィブリニンの原液を逐次希釈し、そして
ウエルに適用して標準曲線の作成のためのデータを提供
する。 試料、例えば血漿を逐次希釈し、他のウエルに適用する
。特異的に結合したフィブリニンまたは試料を、ペルオ
キシダーゼ接合しまたは容易に利用可能な方法により容
易に検出できるように標識した第二の一般抗体（例えば
放射能標識した第二のペルオキシダーゼ接合抗体等）（
ポリクローナル抗体、またはウエルにコーティングした
ものと異なるモノクローナル抗体）で検出する。
【００２８】本発明のＲＩＡ 競合アッセイについては
、フィブリニンは、それを放射能標識し、フィブリンに
対する十分量の抗体と試料とを混合し、次いでＲＩＡ
と同様に処理することができるという点で有用な用途を
有する。 これは、放射能標識フィブリニン（または試料）と結合
した抗体を未結合の種から分離し、そして結合した画分
の放射能を測定することを伴う（実施例６参照）。可溶
性フィブリンおよび単量体フィブリンは生理的条件下で
または重合阻害剤の余分な使用を伴わずに調製すること
ができないので、可溶性形のフィブリン抗原に基づくそ
れらのタイプのアッセイは、該抗原を含む実際の可溶性
フィブリンの代わりに、フィブリンの断片、または着目
のエピトープを含む精製オリゴペプチドに頼らざるをえ
なかった。フィブリニンの使用によって、それらのタイ
プのアッセイの開発が可能になる。フィブリニンは、フ
ィブリンまたはフィブリン分解生成物上のものと同様で
あろうコンホメーションエピトープに対する特異性を有
するモノクローナル抗体を必要とするあらゆるタイプの
ＥＬＩＳＡ またはＲＩＡ にも有用である。
、フィブリニンは、それを放射能標識し、フィブリンに
対する十分量の抗体と試料とを混合し、次いでＲＩＡ
と同様に処理することができるという点で有用な用途を
有する。 これは、放射能標識フィブリニン（または試料）と結合
した抗体を未結合の種から分離し、そして結合した画分
の放射能を測定することを伴う（実施例６参照）。可溶
性フィブリンおよび単量体フィブリンは生理的条件下で
または重合阻害剤の余分な使用を伴わずに調製すること
ができないので、可溶性形のフィブリン抗原に基づくそ
れらのタイプのアッセイは、該抗原を含む実際の可溶性
フィブリンの代わりに、フィブリンの断片、または着目
のエピトープを含む精製オリゴペプチドに頼らざるをえ
なかった。フィブリニンの使用によって、それらのタイ
プのアッセイの開発が可能になる。フィブリニンは、フ
ィブリンまたはフィブリン分解生成物上のものと同様で
あろうコンホメーションエピトープに対する特異性を有
するモノクローナル抗体を必要とするあらゆるタイプの
ＥＬＩＳＡ またはＲＩＡ にも有用である。
【００２９】今までに未知の他の有用なフィブリニンの
性質は、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換の際
のｔ−ＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）活性を
刺激する能力である。フィブリニンによるｔ−ＰＡの刺
激は、既知のフィブリン型刺激剤、例えば ＤＥＳＡＦ
ＩＢＴＭ（ｄｅｓ−ＡＡ−フィブリノーゲン）またはＦ
ＣＢ−２ フィブリノーゲン分画（両者ともＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．， Ｇｒｅ
ｅｎｗｉｃｈ， ＣＴから入手可能）のものと同程度ま
たはそれを上回る。 従って、フィブリニンは、種々のタイプのアッセイ、例
えばプラスミンのアミド分解活性に基づくアッセイにお
けるｔ−ＰＡの定量に有用である。それらには、色素生
成性基質Ｓ−２２５１ （Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃａ，Ｍｏｌｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する
血漿中のｔ−ＰＡの測定のためのアッセイが挙げられる
（実施例８）。このアッセイは、プラスミノーゲン、希
釈した試験血漿または既知量のｔ−ＰＡを含む標準物、
フィブリニン（ｔ−ＰＡ刺激剤として）および色素生成
性基質を試験管に添加し、そして内容物を或る期間イン
キュベートすることにより行うことができる。試料中の
ｔ−ＰＡの利用可能量に比例してプラスミノーゲンから
生じるプラスミンは、色素生成性基質に作用してｐ−ニ
トロアニリン基を遊離させ、これが４０５ ｎｍでの吸
光度の変化をもたらす。試料中の色素の生成を酢酸の添
加により停止させ、そして終点（最終色）を分光光度的
に測定することができる。あるいは、時間とともに吸光
度の変化を記録しながら、分光光度計の内側のキュベッ
ト中で反応を行うことができる。色の変化量（例えば、
時間に対する吸光度のプロットの傾き）が試料中のｔ−
ＰＡの量に関連づけられるだろう。それらのアッセイ方
法は、次のものにも適応できる：ミクロタイタープレー
トを使った微量分析；ｔ−ＰＡ（またはｔ−ＰＡを含む
複合体）を捕獲するための技術および捕獲されたｔ−Ｐ
Ａの活性を測定するための発色型アッセイの両方を使用
するバイオイムノアッセイ；並びに遠心分析装置。その
ようなアッセイへのフィブリンの有用性は、調製が簡単
であり、安定であり、可溶性であり、そして血漿および
それらのタイプのアッセイにおいて使用される希釈緩衝
液と適合性であること、更には吸光度の十分な変化を生
じるのに必要とされるフィブリニンの有効濃度が他のｔ
−ＰＡ刺激剤のものと同様であることである（実施例８
）。
性質は、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換の際
のｔ−ＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）活性を
刺激する能力である。フィブリニンによるｔ−ＰＡの刺
激は、既知のフィブリン型刺激剤、例えば ＤＥＳＡＦ
ＩＢＴＭ（ｄｅｓ−ＡＡ−フィブリノーゲン）またはＦ
ＣＢ−２ フィブリノーゲン分画（両者ともＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．， Ｇｒｅ
ｅｎｗｉｃｈ， ＣＴから入手可能）のものと同程度ま
たはそれを上回る。 従って、フィブリニンは、種々のタイプのアッセイ、例
えばプラスミンのアミド分解活性に基づくアッセイにお
けるｔ−ＰＡの定量に有用である。それらには、色素生
成性基質Ｓ−２２５１ （Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃａ，Ｍｏｌｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する
血漿中のｔ−ＰＡの測定のためのアッセイが挙げられる
（実施例８）。このアッセイは、プラスミノーゲン、希
釈した試験血漿または既知量のｔ−ＰＡを含む標準物、
フィブリニン（ｔ−ＰＡ刺激剤として）および色素生成
性基質を試験管に添加し、そして内容物を或る期間イン
キュベートすることにより行うことができる。試料中の
ｔ−ＰＡの利用可能量に比例してプラスミノーゲンから
生じるプラスミンは、色素生成性基質に作用してｐ−ニ
トロアニリン基を遊離させ、これが４０５ ｎｍでの吸
光度の変化をもたらす。試料中の色素の生成を酢酸の添
加により停止させ、そして終点（最終色）を分光光度的
に測定することができる。あるいは、時間とともに吸光
度の変化を記録しながら、分光光度計の内側のキュベッ
ト中で反応を行うことができる。色の変化量（例えば、
時間に対する吸光度のプロットの傾き）が試料中のｔ−
ＰＡの量に関連づけられるだろう。それらのアッセイ方
法は、次のものにも適応できる：ミクロタイタープレー
トを使った微量分析；ｔ−ＰＡ（またはｔ−ＰＡを含む
複合体）を捕獲するための技術および捕獲されたｔ−Ｐ
Ａの活性を測定するための発色型アッセイの両方を使用
するバイオイムノアッセイ；並びに遠心分析装置。その
ようなアッセイへのフィブリンの有用性は、調製が簡単
であり、安定であり、可溶性であり、そして血漿および
それらのタイプのアッセイにおいて使用される希釈緩衝
液と適合性であること、更には吸光度の十分な変化を生
じるのに必要とされるフィブリニンの有効濃度が他のｔ
−ＰＡ刺激剤のものと同様であることである（実施例８
）。
【００３０】プラスミノーゲンからプラスミンへの変換
におけるｔ−ＰＡ活性を刺激するフィブリニンの能力は
、他のタイプのアッセイ、例えば血漿中のフィブリンモ
ノマー濃度の測定にも有用である。典型的には、血漿試
料中のフィブリンモノマーの量は、該試料に或る量のプ
ラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび色素生成性基質Ｓ−２
３９０ （ＫａｂｉＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ， Ｍｏｌ
ｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）を添加することにより測定
される。存在するフィブリンモノマーがｔ−ＰＡを刺激
し、これが次いでプラスミノーゲンからプラスミンへの
変換を促進するだろう。Ｓ−２３９０に対する生成プラ
スミンのアミド分解活性（即ち、ｐ−ニトロアニリンの
遊離および４０５ ｎｍで検出される色の変化をもたら
す）を分光光度的に測定し、そして新しく解凍した正常
血漿に種々の量のフィブリニンを添加することにより得
られた標準曲線を基にして、フィブリンモノマーの濃度
に関連づける。
におけるｔ−ＰＡ活性を刺激するフィブリニンの能力は
、他のタイプのアッセイ、例えば血漿中のフィブリンモ
ノマー濃度の測定にも有用である。典型的には、血漿試
料中のフィブリンモノマーの量は、該試料に或る量のプ
ラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび色素生成性基質Ｓ−２
３９０ （ＫａｂｉＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ， Ｍｏｌ
ｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）を添加することにより測定
される。存在するフィブリンモノマーがｔ−ＰＡを刺激
し、これが次いでプラスミノーゲンからプラスミンへの
変換を促進するだろう。Ｓ−２３９０に対する生成プラ
スミンのアミド分解活性（即ち、ｐ−ニトロアニリンの
遊離および４０５ ｎｍで検出される色の変化をもたら
す）を分光光度的に測定し、そして新しく解凍した正常
血漿に種々の量のフィブリニンを添加することにより得
られた標準曲線を基にして、フィブリンモノマーの濃度
に関連づける。
【００３１】プラスミノーゲンからプラスミンへの変換
におけるｔ−ＰＡ活性を刺激するフィブリニンの能力は
、血漿中のプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ
） 活性の測定にも有用である。プラスミノーゲン活性
化因子阻害剤は、フィブリン分解の調節に重要であり、
そして多数の臨床的状態、例えば静脈血栓症、心筋梗塞
、敗血症、妊娠および糖尿病に関係がある。プラスミノ
ーゲン活性化因子阻害剤活性は、未知濃度のＰＡＩ を
既知濃度のｔ−ＰＡと混合した後に残った遊離のｔ−Ｐ
Ａの量をアッセイすることにより測定され、この場合の
ｔ−ＰＡ濃度は、一般に予想されるＰＡＩ 濃度より過
剰である。残りのｔ−ＰＡは、実施例７または８に記載
のようなアッセイにより、即ち残ったｔ−ＰＡの活性を
定量することにより測定される。フィブリニンは、この
目的におよびプラスミノーゲンからプラスミンへの変換
におけるｔ−ＰＡ活性の刺激を伴う任意の一般的用途に
非常に適当である。例えば、プラスミノーゲンからプラ
スミンへのｔ−ＰＡ変換を刺激する性質を有するため、
フィブリニンは、様々な形のｔ−ＰＡ（組換えｔ−ＰＡ
を含む）の標準化および特徴付け、またはｔ−ＰＡとウ
ロキナーゼとの間の識別〔例えばＫａｒｌａｎ，Ｂ．Ｙ
．， Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｓ． およびＬｉｔｔｌｅｆｉ
ｅｌｄ，Ｂ．Ａ．（１９８７）， ”Ａ Ｈｉｇｈｌｙ
Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｍｉ
ｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ
Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ Ｗｈ
ｉｃｈ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ Ｄｉｓｃｒｉ
ｍｉｎａｔｅｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｕｒｏｋｉ
ｎａｓｅ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｙｐｅ Ａｃｔｉ
ｖａｔｏｒｓ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １４２， １４７−１
５４〕に使用することができる。
におけるｔ−ＰＡ活性を刺激するフィブリニンの能力は
、血漿中のプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ
） 活性の測定にも有用である。プラスミノーゲン活性
化因子阻害剤は、フィブリン分解の調節に重要であり、
そして多数の臨床的状態、例えば静脈血栓症、心筋梗塞
、敗血症、妊娠および糖尿病に関係がある。プラスミノ
ーゲン活性化因子阻害剤活性は、未知濃度のＰＡＩ を
既知濃度のｔ−ＰＡと混合した後に残った遊離のｔ−Ｐ
Ａの量をアッセイすることにより測定され、この場合の
ｔ−ＰＡ濃度は、一般に予想されるＰＡＩ 濃度より過
剰である。残りのｔ−ＰＡは、実施例７または８に記載
のようなアッセイにより、即ち残ったｔ−ＰＡの活性を
定量することにより測定される。フィブリニンは、この
目的におよびプラスミノーゲンからプラスミンへの変換
におけるｔ−ＰＡ活性の刺激を伴う任意の一般的用途に
非常に適当である。例えば、プラスミノーゲンからプラ
スミンへのｔ−ＰＡ変換を刺激する性質を有するため、
フィブリニンは、様々な形のｔ−ＰＡ（組換えｔ−ＰＡ
を含む）の標準化および特徴付け、またはｔ−ＰＡとウ
ロキナーゼとの間の識別〔例えばＫａｒｌａｎ，Ｂ．Ｙ
．， Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｓ． およびＬｉｔｔｌｅｆｉ
ｅｌｄ，Ｂ．Ａ．（１９８７）， ”Ａ Ｈｉｇｈｌｙ
Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｍｉ
ｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ
Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ Ｗｈ
ｉｃｈ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ Ｄｉｓｃｒｉ
ｍｉｎａｔｅｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｕｒｏｋｉ
ｎａｓｅ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｙｐｅ Ａｃｔｉ
ｖａｔｏｒｓ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １４２， １４７−１
５４〕に使用することができる。
【００３２】望ましいフィブリニンのｔ−ＰＡ刺激活性
は、わずかに減少した効力を有するにもかかわらず、フ
ィブリニンの調製の最終段階、即ちフィブリノペプチド
ＡおよびＢの除去を含む方法（実施例１〜３）において
必要とされるように、部分的に還元されたフィブリノー
ゲンのアミノ末端を変更することなく、獲得することが
できる。この短縮された方法はフィブリニン様物質の調
製をもたらし、これもまた少量の還元試薬を用いたフィ
ブリノーゲン中の幾つかのジスルフィド結合の開裂に基
づき、そして未変形フィブリノーゲンよりも一層大きく
ｔ−ＰＡ活性を刺激することを可能にするタンパク質の
構造のわずかな破壊をもたらす（実施例８，図４，曲線
３を参照のこと）。
は、わずかに減少した効力を有するにもかかわらず、フ
ィブリニンの調製の最終段階、即ちフィブリノペプチド
ＡおよびＢの除去を含む方法（実施例１〜３）において
必要とされるように、部分的に還元されたフィブリノー
ゲンのアミノ末端を変更することなく、獲得することが
できる。この短縮された方法はフィブリニン様物質の調
製をもたらし、これもまた少量の還元試薬を用いたフィ
ブリノーゲン中の幾つかのジスルフィド結合の開裂に基
づき、そして未変形フィブリノーゲンよりも一層大きく
ｔ−ＰＡ活性を刺激することを可能にするタンパク質の
構造のわずかな破壊をもたらす（実施例８，図４，曲線
３を参照のこと）。
【００３３】望ましいフィブリニンのｔ−ＰＡ刺激活性
は、オリゴマー化によって増強することもできる（実施
例９）。このオリゴマー化は、架橋酵素、例えば血漿の
第ＸＩＩＩ因子または組織もしくは肝臓トランスグルタ
ミナーゼの添加により酵素的に、または化学的架橋試薬
、例えばグルタルアルデヒドもしくは類似の試薬の添加
により化学的に行うことができる（実施例４）。
は、オリゴマー化によって増強することもできる（実施
例９）。このオリゴマー化は、架橋酵素、例えば血漿の
第ＸＩＩＩ因子または組織もしくは肝臓トランスグルタ
ミナーゼの添加により酵素的に、または化学的架橋試薬
、例えばグルタルアルデヒドもしくは類似の試薬の添加
により化学的に行うことができる（実施例４）。
【００３４】フィブリニンは、試験管内または生体内で
フィブリン溶解活性を測定または研究するためにも用い
ることができる。本発明のフィブリニンの１つのユニー
クな特徴は、それが生理的緩衝液中に維持され、そして
おそらく非毒性であり、従って、例えば静注により循環
中に投与できるであろうことである。フィブリニンは全
循環にわたり分配され、そして血液および血管床中での
フィブリン溶解活性のため分解され、循環から消失する
であろう。フィブリニンの分解速度は、生体の全フィブ
リン溶解能力の指標である。このフィブリン溶解パラメ
ーターは試験管内で測定することもできる。分析を促進
するために、例えば１２５−ヨウ素のような放射性核種
、ビオチン、または発色試薬でフィブリニンを直接標識
することができる。あるいは、直接反応によりまたは第
二抗体を経て標識されたフィブリニンに対する抗体を用
いて、フィブリニンを検出することができる。
フィブリン溶解活性を測定または研究するためにも用い
ることができる。本発明のフィブリニンの１つのユニー
クな特徴は、それが生理的緩衝液中に維持され、そして
おそらく非毒性であり、従って、例えば静注により循環
中に投与できるであろうことである。フィブリニンは全
循環にわたり分配され、そして血液および血管床中での
フィブリン溶解活性のため分解され、循環から消失する
であろう。フィブリニンの分解速度は、生体の全フィブ
リン溶解能力の指標である。このフィブリン溶解パラメ
ーターは試験管内で測定することもできる。分析を促進
するために、例えば１２５−ヨウ素のような放射性核種
、ビオチン、または発色試薬でフィブリニンを直接標識
することができる。あるいは、直接反応によりまたは第
二抗体を経て標識されたフィブリニンに対する抗体を用
いて、フィブリニンを検出することができる。
【００３５】
【実施例】次の非限定例を参照しながら本発明を説明す
る。 実施例１ 別々の還元および遮蔽段階によりフィブリニンを調製す
ることが好都合であるかもしれない。ヒトフィブリノー
ゲンを溶液として調製し（０．３Ｍ ＮａＣｌ中 ２％
）、そして約１００ 容のＴＮＥ−緩衝液〔 Ｔｒｉｓ
−食塩−ＥＤＴＡ 緩衝液 ： ０．０５Ｍトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン，０．１Ｍ ＮａＣｌ，
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸， ｐＨ ７．４〕に
対して、外液を３回交換しながら３時間透析する。存在
するフィブロネクチンをゼラチン−セファロース上での
アフィニティークロマトグラフィーにより除去してもよ
い。フィブリノーゲン原液（約１２ ｍｇ／ｍｌ）を使
用まで−７０℃で保存する。２８２ ｎｍでのＥ（１％
，１ｃｍ）＝１．６５を使って、アルカリ性尿素（０．
２Ｎ ＮａＯＨ 中４０％尿素）中で分光光度的にフィ
ブリノーゲン濃度を測定する。
る。 実施例１ 別々の還元および遮蔽段階によりフィブリニンを調製す
ることが好都合であるかもしれない。ヒトフィブリノー
ゲンを溶液として調製し（０．３Ｍ ＮａＣｌ中 ２％
）、そして約１００ 容のＴＮＥ−緩衝液〔 Ｔｒｉｓ
−食塩−ＥＤＴＡ 緩衝液 ： ０．０５Ｍトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン，０．１Ｍ ＮａＣｌ，
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸， ｐＨ ７．４〕に
対して、外液を３回交換しながら３時間透析する。存在
するフィブロネクチンをゼラチン−セファロース上での
アフィニティークロマトグラフィーにより除去してもよ
い。フィブリノーゲン原液（約１２ ｍｇ／ｍｌ）を使
用まで−７０℃で保存する。２８２ ｎｍでのＥ（１％
，１ｃｍ）＝１．６５を使って、アルカリ性尿素（０．
２Ｎ ＮａＯＨ 中４０％尿素）中で分光光度的にフィ
ブリノーゲン濃度を測定する。
【００３６】フィブリノーゲン原液をＴＮＥ−緩衝液で
７ ｍｇ／ｍｌ の最終濃度に希釈し、次いで水中の濃
原液からＤＴＴ を５ ｍＭ（最終モル濃度）になるよ
うに添加する。試料の上に窒素を吹きつけ、試験管を封
管し、そして３７℃の湯浴中に還元期間（４５分間）置
く。ゲル濾過により試料からＤＴＴ を除去する。１
ｍｌ容量までの試料については、ＰＤ−１０ カラム（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．
Ｊ．） を使用することができる。ゲル濾過カラムを窒
素で飽和されたＴＮＥ−緩衝液で平衡化する。予め決め
られた溶出量でタンパク質を収集し、２Ｍ Ｔｒｉｓ，
ｐＨ ８．５ の添加により溶出液のｐＨを８．１
に調整し、そして１．６ｍＭ の最終モル濃度を与える
ようにヨード酢酸（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ
ＭＯ ； 使用前に石油エーテルから３回再結晶した
もの）を添加する。ヨード酢酸原液（１２ ｍＭ） は
０．１Ｎ ＮａＯＨ 中に作製する。試料の上に窒素を
吹きつけ、試験管を封管し、そして室温で４５分間遮光
下に置く。その後、ゲル濾過（ＴＮＥ−緩衝液で平衡化
されたカラム）により、または外液を３回交換しながら
４００ 〜１０００容のＴＮＥ−緩衝液に対して３時間
透析することにより、または他の任意の手段、例えばタ
ンパク質を沈澱せしめそしてこれを適当な緩衝液、例え
ばＴＮＥ−緩衝液に再溶解することにより、未反応の試
薬を除去する。
７ ｍｇ／ｍｌ の最終濃度に希釈し、次いで水中の濃
原液からＤＴＴ を５ ｍＭ（最終モル濃度）になるよ
うに添加する。試料の上に窒素を吹きつけ、試験管を封
管し、そして３７℃の湯浴中に還元期間（４５分間）置
く。ゲル濾過により試料からＤＴＴ を除去する。１
ｍｌ容量までの試料については、ＰＤ−１０ カラム（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．
Ｊ．） を使用することができる。ゲル濾過カラムを窒
素で飽和されたＴＮＥ−緩衝液で平衡化する。予め決め
られた溶出量でタンパク質を収集し、２Ｍ Ｔｒｉｓ，
ｐＨ ８．５ の添加により溶出液のｐＨを８．１
に調整し、そして１．６ｍＭ の最終モル濃度を与える
ようにヨード酢酸（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ
ＭＯ ； 使用前に石油エーテルから３回再結晶した
もの）を添加する。ヨード酢酸原液（１２ ｍＭ） は
０．１Ｎ ＮａＯＨ 中に作製する。試料の上に窒素を
吹きつけ、試験管を封管し、そして室温で４５分間遮光
下に置く。その後、ゲル濾過（ＴＮＥ−緩衝液で平衡化
されたカラム）により、または外液を３回交換しながら
４００ 〜１０００容のＴＮＥ−緩衝液に対して３時間
透析することにより、または他の任意の手段、例えばタ
ンパク質を沈澱せしめそしてこれを適当な緩衝液、例え
ばＴＮＥ−緩衝液に再溶解することにより、未反応の試
薬を除去する。
【００３７】回収された部分還元・アルキル化フィブリ
ノーゲンをＴＮＥ−緩衝液で３ ｍｇ／ｍｌ に希釈し
、そして０．５ ＮＩＨ 単位／ｍｌ のトロンビン（
ヒトの血漿から精製したもの、または市販のもの）で室
温にて２時間処理し、Ａα−およびＢβ−鎖のアミノ末
端セグメントを遊離させる。２ 〜７ ＡＴＵ／ｍｌの
濃度のトロンビン阻害剤ヒルジン（Ｐｅｎｔａｐｈａｒ
ｍ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の添加
により反応を停止させる。
ノーゲンをＴＮＥ−緩衝液で３ ｍｇ／ｍｌ に希釈し
、そして０．５ ＮＩＨ 単位／ｍｌ のトロンビン（
ヒトの血漿から精製したもの、または市販のもの）で室
温にて２時間処理し、Ａα−およびＢβ−鎖のアミノ末
端セグメントを遊離させる。２ 〜７ ＡＴＵ／ｍｌの
濃度のトロンビン阻害剤ヒルジン（Ｐｅｎｔａｐｈａｒ
ｍ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の添加
により反応を停止させる。
【００３８】実施例２
連続した還元およびアルキル化によりフィブリニンを調
製することもまた好都合であろう。フィブリノーゲン原
液をＴＮＥ−緩衝液で７ ｍｇ／ｍｌ の最終濃度に希
釈し、次いでＤＴＴ を５ ｍＭの最終モル濃度になる
ように添加する（水中の濃縮原液から）。試料の上に窒
素を吹きつけ、試験管を封管し、そして３７℃の湯浴中
に還元期間（４５分間）置く。２Ｍ Ｔｒｉｓ， ｐＨ
８．５ の添加により試料のｐＨを８．１ に調整し
、そして２０〜３０ ｍＭ の最終モル濃度を与えるよ
うにヨード酢酸（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ
ＭＯ ； 使用前に石油エーテルから３回再結晶したも
の）を添加する。ヨード酢酸原液（５００ ｍＭ）は０
．１Ｎ ＮａＯＨ 中に作製する。試料の上に窒素を吹
きつけ、試験管を封管し、そして室温で４５分間遮光下
に置く。その後、ゲル濾過（ＴＮＥ−緩衝液で平衡化さ
れたカラム）により、または外液を３ 〜４回交換しな
がら４００ 〜１０００容のＴＮＥ−緩衝液に対して４
〜２０時間透析することにより、または他の任意の手
段により、未反応の試薬を除去する。
製することもまた好都合であろう。フィブリノーゲン原
液をＴＮＥ−緩衝液で７ ｍｇ／ｍｌ の最終濃度に希
釈し、次いでＤＴＴ を５ ｍＭの最終モル濃度になる
ように添加する（水中の濃縮原液から）。試料の上に窒
素を吹きつけ、試験管を封管し、そして３７℃の湯浴中
に還元期間（４５分間）置く。２Ｍ Ｔｒｉｓ， ｐＨ
８．５ の添加により試料のｐＨを８．１ に調整し
、そして２０〜３０ ｍＭ の最終モル濃度を与えるよ
うにヨード酢酸（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ
ＭＯ ； 使用前に石油エーテルから３回再結晶したも
の）を添加する。ヨード酢酸原液（５００ ｍＭ）は０
．１Ｎ ＮａＯＨ 中に作製する。試料の上に窒素を吹
きつけ、試験管を封管し、そして室温で４５分間遮光下
に置く。その後、ゲル濾過（ＴＮＥ−緩衝液で平衡化さ
れたカラム）により、または外液を３ 〜４回交換しな
がら４００ 〜１０００容のＴＮＥ−緩衝液に対して４
〜２０時間透析することにより、または他の任意の手
段により、未反応の試薬を除去する。
【００３９】回収された部分還元・アルキル化フィブリ
ノーゲンをＴＮＥ−緩衝液で３ ｍｇ／ｍｌ に希釈し
、そして０．５ ＮＩＨ 単位／ｍｌ のトロンビン（
ヒトの血漿から精製したもの、または市販のもの）で室
温にて２時間処理し、アミノ末端ペプチドを遊離させる
。２ 〜７ ＡＴＵ／ｍｌの濃度のトロンビン阻害剤ヒ
ルジン（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ，Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎｄ）の添加により反応を停止させる。
ノーゲンをＴＮＥ−緩衝液で３ ｍｇ／ｍｌ に希釈し
、そして０．５ ＮＩＨ 単位／ｍｌ のトロンビン（
ヒトの血漿から精製したもの、または市販のもの）で室
温にて２時間処理し、アミノ末端ペプチドを遊離させる
。２ 〜７ ＡＴＵ／ｍｌの濃度のトロンビン阻害剤ヒ
ルジン（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ，Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎｄ）の添加により反応を停止させる。
【００４０】実施例３
実施例１および２に記載のようにして還元アルキル化さ
れたフィブリノーゲンを調製し、そしてこれをトロンビ
ンで処理した後、不溶化されたヒルジンまたは高結合力
の抗トロンビン抗体を含むカラムに試料を通過させるこ
とにより、反応混合物から該酵素を除去することが便利
であろう。トロンビンはカラムに結合し、そしてフィブ
リニンのみが純粋な物質として溶出するだろう。
れたフィブリノーゲンを調製し、そしてこれをトロンビ
ンで処理した後、不溶化されたヒルジンまたは高結合力
の抗トロンビン抗体を含むカラムに試料を通過させるこ
とにより、反応混合物から該酵素を除去することが便利
であろう。トロンビンはカラムに結合し、そしてフィブ
リニンのみが純粋な物質として溶出するだろう。
【００４１】実施例４
単量体のフィブリニンでは保持しないような標準生理的
緩衝液中および条件下でもまだ十分に溶解性および安定
性を保持している高分子量のフィブリニン複合体、例え
ば共有結合により一緒に架橋した幾つかのフィブリニン
分子の凝集体、を調製することが好都合であろう。アミ
ノ末端ペプチドを遊離させるための処理をしていない、
即ちトロンビンで処理していない、フィブリニン調製プ
ロトコルからの物質の高分子量複合体を調製することも
好都合であろう。それらのタイプの高分子量試料は、活
性化された血漿第ＸＩＩＩ因子への一定期間の暴露によ
って、溶液中の近隣のフィブリニンまたはフィブリニン
様モノマーにおいて特定のグルタミンとリジン残基との
間の共有結合架橋の形成を誘導することにより、調製す
ることができる。
緩衝液中および条件下でもまだ十分に溶解性および安定
性を保持している高分子量のフィブリニン複合体、例え
ば共有結合により一緒に架橋した幾つかのフィブリニン
分子の凝集体、を調製することが好都合であろう。アミ
ノ末端ペプチドを遊離させるための処理をしていない、
即ちトロンビンで処理していない、フィブリニン調製プ
ロトコルからの物質の高分子量複合体を調製することも
好都合であろう。それらのタイプの高分子量試料は、活
性化された血漿第ＸＩＩＩ因子への一定期間の暴露によ
って、溶液中の近隣のフィブリニンまたはフィブリニン
様モノマーにおいて特定のグルタミンとリジン残基との
間の共有結合架橋の形成を誘導することにより、調製す
ることができる。
【００４２】実施例１，２または３からの物質をＴＮＥ
−緩衝液で０．５ 〜１０ ｍｇ／ｍｌの濃度（適当な
濃度は１ ｍｇ／ｍｌ である）に希釈する。その溶液
に濃原液から２ 〜１０ ＡＴＵ／ｍｌ の最終濃度に
ヒルジンを添加する。８ ＡＴＵ／ｍｌが好ましい濃度
である。次いで１Ｍの塩化カルシウム濃原液から２０ｍ
Ｍの最終濃度にカルシウムを添加する。トロンビン活性
化第ＸＩＩＩ因子を０．１ 〜１ Ｕ／ｍｌの最終濃度
になるように試料に添加する。最適濃度は０．４ Ｕ／
ｍｌである。室温で３０〜９０分間架橋反応を進行させ
る。６０分間が好ましい。架橋の進行は３５０ ｎｍに
おいて分光光度的に追跡することができる。反応中は吸
光度があまり変化しないであろう。第ＸＩＩＩ因子阻害
剤、例えばヨードアセトアミド、ヨード酢酸等の添加に
より反応を停止させる。これは、ヨードアセトアミド（
５００ ｍＭ原液、任意の中性緩衝液中に調製したばか
りのもの）を５ ｍＭの最終濃度に添加することにより
行うことができる。
−緩衝液で０．５ 〜１０ ｍｇ／ｍｌの濃度（適当な
濃度は１ ｍｇ／ｍｌ である）に希釈する。その溶液
に濃原液から２ 〜１０ ＡＴＵ／ｍｌ の最終濃度に
ヒルジンを添加する。８ ＡＴＵ／ｍｌが好ましい濃度
である。次いで１Ｍの塩化カルシウム濃原液から２０ｍ
Ｍの最終濃度にカルシウムを添加する。トロンビン活性
化第ＸＩＩＩ因子を０．１ 〜１ Ｕ／ｍｌの最終濃度
になるように試料に添加する。最適濃度は０．４ Ｕ／
ｍｌである。室温で３０〜９０分間架橋反応を進行させ
る。６０分間が好ましい。架橋の進行は３５０ ｎｍに
おいて分光光度的に追跡することができる。反応中は吸
光度があまり変化しないであろう。第ＸＩＩＩ因子阻害
剤、例えばヨードアセトアミド、ヨード酢酸等の添加に
より反応を停止させる。これは、ヨードアセトアミド（
５００ ｍＭ原液、任意の中性緩衝液中に調製したばか
りのもの）を５ ｍＭの最終濃度に添加することにより
行うことができる。
【００４３】架橋反応に使用する活性化された第ＸＩＩ
Ｉ因子は、トロンビンを第ＸＩＩＩ因子の原液に３０〜
６０分間導入し、次いでトロンビン活性を過剰のヒルジ
ンでブロックすることにより前もって調製される。例え
ば、Ｂｌｏｍｂａｃｋ，Ｂ．， Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ．，
Ａｄａｍｓｏｎ，Ｌ．およびＨｅｓｓｅｌ，Ｂ． （
１９８５）， ”ＦＸＩＩＩ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｇｅｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ
− ＡｎＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｔｈｉｏｌ Ｅｎ
ｈａｎｃｅｄ， Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｉｎｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ”， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒ
ｅｓ．， ３７， ６１３−６２８ を参照のこと。 簡単に言えば、これはトロンビン（４単位／ｍｌ）を第
ＸＩＩＩ因子の原液（８ Ｕ／ｍｌ）に４５分間添加し
、そして１６ ＡＴＵ／ｍｌ のヒルジンの添加により
活性化過程を停止させることにより、行うことができる
。
Ｉ因子は、トロンビンを第ＸＩＩＩ因子の原液に３０〜
６０分間導入し、次いでトロンビン活性を過剰のヒルジ
ンでブロックすることにより前もって調製される。例え
ば、Ｂｌｏｍｂａｃｋ，Ｂ．， Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ．，
Ａｄａｍｓｏｎ，Ｌ．およびＨｅｓｓｅｌ，Ｂ． （
１９８５）， ”ＦＸＩＩＩ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｇｅｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ
− ＡｎＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｔｈｉｏｌ Ｅｎ
ｈａｎｃｅｄ， Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｉｎｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ”， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒ
ｅｓ．， ３７， ６１３−６２８ を参照のこと。 簡単に言えば、これはトロンビン（４単位／ｍｌ）を第
ＸＩＩＩ因子の原液（８ Ｕ／ｍｌ）に４５分間添加し
、そして１６ ＡＴＵ／ｍｌ のヒルジンの添加により
活性化過程を停止させることにより、行うことができる
。
【００４４】実施例５
実施例１〜３に記載のようにして調製したフィブリニン
は、フィブリン標準物として典型的な間接結合ＥＬＩＳ
Ａ または間接競合ＥＬＩＳＡ に有用である。ポリビ
ニル製ミクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ， Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ） のウエルを、酸可溶化フィ
ブリン（１０ ％酢酸中の４ ｍｇ／ｍｌ フィブリン
原液を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ ９．６
で８ μｇ／ｍｌに希釈したもの）または実施例１〜３
に記載のように調製したフィブリニン（１ 〜３ ｍｇ
／ｍｌ 原液を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ
９．６ で８ μｇ／ｍｌに希釈したもの）のいずれか
でコーティングする。カップリング時間は４ ℃にて通
常一晩である。
は、フィブリン標準物として典型的な間接結合ＥＬＩＳ
Ａ または間接競合ＥＬＩＳＡ に有用である。ポリビ
ニル製ミクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ， Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ） のウエルを、酸可溶化フィ
ブリン（１０ ％酢酸中の４ ｍｇ／ｍｌ フィブリン
原液を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ ９．６
で８ μｇ／ｍｌに希釈したもの）または実施例１〜３
に記載のように調製したフィブリニン（１ 〜３ ｍｇ
／ｍｌ 原液を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ
９．６ で８ μｇ／ｍｌに希釈したもの）のいずれか
でコーティングする。カップリング時間は４ ℃にて通
常一晩である。
【００４５】抗フィブリンモノクローナル抗体Ｔ２Ｇ１
はそのような間接アッセイに適当な試薬である。抗体Ｔ
２Ｇ１は、フィブリノーゲンともフィブリンＩとも反応
しない ＩｇＧ１ｋである〔Ｋｕｄｒｙｋ，Ｂ．， Ｒ
ｏｈｏｚａ，Ａ．， Ａｈａｄｉ，Ｍ， Ｃｈｉｎ，Ｊ
．， Ｗｉｅｂｅ，Ｍ．Ｅ． （１９８４） ”Ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ＮＨ２−ｔｅｒｍ
ｉｎａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｉｎ”， Ｍ
ｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１， ８９−９４ 〕。 抗体Ｔ２Ｇ１は、ヒトフィブリノーゲンのトロンビン処
理アミノ末端ＣＮＢｒ断片 （Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ 、単量
体ペプチドＢβ１５−２１，Ｂβ１５−４２，Ｂβ１５
−１１８， Ｂβ１５−４６１、並びにそのままのフィ
ブリンＩＩ（ｄｅｓ ＡＡＢＢ−フィブリン） と反応
する。１ ｍｇ／ｍｌ のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇ
ｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）と０．０１％の
アジ化ナトリウムを更に含むＴＮＥ−緩衝液中に、１．
０−２．０ のＡ４９０／１０分の値を与えるように前
記抗体を希釈する（下記参照）。 間接ＥＬＩＳＡ では、この濃度の半分の抗体をコーテ
ィングプレートのウエル中でインキュベートする。マウ
ス免疫グロブリンに対して向けられたペルオキシダーゼ
接合ウサギ抗体（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎｔａ
Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ） を用いて特異的に結合した
抗体を検出する。図１は、種々の希釈度の抗フィブリン
モノクローナル抗体が、酸可溶化フィブリンでコーティ
ングしたウエルにまたは本明細書に記載の可溶性フィブ
リン調製物でコーティングしたウエルに結合することを
示す。
はそのような間接アッセイに適当な試薬である。抗体Ｔ
２Ｇ１は、フィブリノーゲンともフィブリンＩとも反応
しない ＩｇＧ１ｋである〔Ｋｕｄｒｙｋ，Ｂ．， Ｒ
ｏｈｏｚａ，Ａ．， Ａｈａｄｉ，Ｍ， Ｃｈｉｎ，Ｊ
．， Ｗｉｅｂｅ，Ｍ．Ｅ． （１９８４） ”Ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ＮＨ２−ｔｅｒｍ
ｉｎａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｉｎ”， Ｍ
ｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１， ８９−９４ 〕。 抗体Ｔ２Ｇ１は、ヒトフィブリノーゲンのトロンビン処
理アミノ末端ＣＮＢｒ断片 （Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ 、単量
体ペプチドＢβ１５−２１，Ｂβ１５−４２，Ｂβ１５
−１１８， Ｂβ１５−４６１、並びにそのままのフィ
ブリンＩＩ（ｄｅｓ ＡＡＢＢ−フィブリン） と反応
する。１ ｍｇ／ｍｌ のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇ
ｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）と０．０１％の
アジ化ナトリウムを更に含むＴＮＥ−緩衝液中に、１．
０−２．０ のＡ４９０／１０分の値を与えるように前
記抗体を希釈する（下記参照）。 間接ＥＬＩＳＡ では、この濃度の半分の抗体をコーテ
ィングプレートのウエル中でインキュベートする。マウ
ス免疫グロブリンに対して向けられたペルオキシダーゼ
接合ウサギ抗体（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎｔａ
Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ） を用いて特異的に結合した
抗体を検出する。図１は、種々の希釈度の抗フィブリン
モノクローナル抗体が、酸可溶化フィブリンでコーティ
ングしたウエルにまたは本明細書に記載の可溶性フィブ
リン調製物でコーティングしたウエルに結合することを
示す。
【００４６】図１は、２，３５０ ｆｍｏｌの酸可溶性
フィブリン（□）または実施例３に記載のようにして調
製した２，３５０ ｆｍｏｌのフィブリニン（◆）のい
ずれかでコーティングしたミクロタイタープレートウエ
ルの結果を示す。ウエル当たり９．６ 〜６１１ ｆｍ
ｏｌのＴ２Ｇ１抗体を使って間接結合ＥＬＩＳＡ を行
った。マウス免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ
接合ウサギ抗体、Ｈ２Ｏ２およびｏ−ジアニシジンを用
いて、プラスチック製ウエル上に特異的に結合した抗体
を検出した。
フィブリン（□）または実施例３に記載のようにして調
製した２，３５０ ｆｍｏｌのフィブリニン（◆）のい
ずれかでコーティングしたミクロタイタープレートウエ
ルの結果を示す。ウエル当たり９．６ 〜６１１ ｆｍ
ｏｌのＴ２Ｇ１抗体を使って間接結合ＥＬＩＳＡ を行
った。マウス免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ
接合ウサギ抗体、Ｈ２Ｏ２およびｏ−ジアニシジンを用
いて、プラスチック製ウエル上に特異的に結合した抗体
を検出した。
【００４７】Ｔ２Ｇ１抗フィブリン抗体を使った間接競
合ＥＬＩＳＡ については、実施例３に記載のようにし
て調製したフィブリニンの希釈液（２〜４０ピコモル／
ｍｌ）と前記抗体の希釈液とを混合することにより、標
準曲線を作成する。混合物を平衡に達成させ（通常は室
温で２時間）、次いでプレートに添加する。マウス免疫
グロブリンに対して向けられたペルオキシダーゼ接合ウ
サギ抗体（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎｔａ Ｂａ
ｒｂａｒａ， ＣＡ） を用いて、特異的に結合した抗
体を検出する。図２は、適当な標準曲線がこのプロトコ
ルにより得られることを示す。
合ＥＬＩＳＡ については、実施例３に記載のようにし
て調製したフィブリニンの希釈液（２〜４０ピコモル／
ｍｌ）と前記抗体の希釈液とを混合することにより、標
準曲線を作成する。混合物を平衡に達成させ（通常は室
温で２時間）、次いでプレートに添加する。マウス免疫
グロブリンに対して向けられたペルオキシダーゼ接合ウ
サギ抗体（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎｔａ Ｂａ
ｒｂａｒａ， ＣＡ） を用いて、特異的に結合した抗
体を検出する。図２は、適当な標準曲線がこのプロトコ
ルにより得られることを示す。
【００４８】図２は、８ μｇ／ｍｌの酸可溶性フィブ
リン（○）または実施例３に記載のようにして調製した
８ μｇ／ｍｌのフィブリニン（●）のいずれかでコー
ティングしたミクロタイタープレートウエルを使用した
結果を示す。実施例３に記載のようにして調製した逐次
希釈フィブリニン（２．５ 〜２０ピコモル／ｍｌ）と
反応する一定量のＴ２Ｇ１抗体（６．１ ピコモル／ｍ
ｌ ）を使って、間接競合ＥＬＩＳＡ を行った。マウ
ス免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ接合ウサギ
抗体、Ｈ２Ｏ２およびｏ−ジアニシジンを用いて、プラ
スチック製ウエル上に特異的に結合した抗体を検出した
。
リン（○）または実施例３に記載のようにして調製した
８ μｇ／ｍｌのフィブリニン（●）のいずれかでコー
ティングしたミクロタイタープレートウエルを使用した
結果を示す。実施例３に記載のようにして調製した逐次
希釈フィブリニン（２．５ 〜２０ピコモル／ｍｌ）と
反応する一定量のＴ２Ｇ１抗体（６．１ ピコモル／ｍ
ｌ ）を使って、間接競合ＥＬＩＳＡ を行った。マウ
ス免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ接合ウサギ
抗体、Ｈ２Ｏ２およびｏ−ジアニシジンを用いて、プラ
スチック製ウエル上に特異的に結合した抗体を検出した
。
【００４９】可溶性フィブリン様調製物フィブリニンは
、フィブリノーゲンから直接調製したフィブリンＩＩと
共有するであろう可溶性フィブリニンの特定のコンホメ
ーションエピトープに対する特異性を有するモノクロー
ナル抗体を必要とする任意のタイプのＥＬＩＳＡ 、ま
たは試薬として可溶性フィブリンモノマーを必要とする
任意のアッセイに使用することができる。それらのアッ
セイの幾つかを下記に例示する。
、フィブリノーゲンから直接調製したフィブリンＩＩと
共有するであろう可溶性フィブリニンの特定のコンホメ
ーションエピトープに対する特異性を有するモノクロー
ナル抗体を必要とする任意のタイプのＥＬＩＳＡ 、ま
たは試薬として可溶性フィブリンモノマーを必要とする
任意のアッセイに使用することができる。それらのアッ
セイの幾つかを下記に例示する。
【００５０】実施例６
本発明に記載のようにして調製した可溶性フィブリンは
、フィブリニンとも反応する適当な抗体が利用可能であ
る血漿または関連試料中の可溶性フィブリンモノマーま
たはフィブリン分解精製物の濃度を測定するためのＲＩ
Ａにも有用である。このアッセイは、通常の方法で、例
えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ． およびＬａｎｅ，Ｄ． （１
９８８）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （この全内
容は参照として本明細書中に組み込まれる）に記載のよ
うにして、ＲＩＡ競合結合条件下で行われる。基本的に
は、該アッセイは、フィブリンに対して向けられた十分
量の抗体、例えば実施例５に言及したＴ２Ｇ１抗体、お
よび実施例３に記載のようにして調製した放射能標識フ
ィブリニンを、血漿または関連試料に添加し、その後、
放射能標識フィブリニン、可溶性フィブリンおよび／ま
たは関連するフィブリン分解生成物に結合した抗体を未
結合の種から分離し、そして結合した分画の放射能を測
定することを含んで成る。
、フィブリニンとも反応する適当な抗体が利用可能であ
る血漿または関連試料中の可溶性フィブリンモノマーま
たはフィブリン分解精製物の濃度を測定するためのＲＩ
Ａにも有用である。このアッセイは、通常の方法で、例
えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ． およびＬａｎｅ，Ｄ． （１
９８８）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （この全内
容は参照として本明細書中に組み込まれる）に記載のよ
うにして、ＲＩＡ競合結合条件下で行われる。基本的に
は、該アッセイは、フィブリンに対して向けられた十分
量の抗体、例えば実施例５に言及したＴ２Ｇ１抗体、お
よび実施例３に記載のようにして調製した放射能標識フ
ィブリニンを、血漿または関連試料に添加し、その後、
放射能標識フィブリニン、可溶性フィブリンおよび／ま
たは関連するフィブリン分解生成物に結合した抗体を未
結合の種から分離し、そして結合した分画の放射能を測
定することを含んで成る。
【００５１】フィブリニンを放射能標識する任意の方法
を使用することができる。便利には、化学的（クロラミ
ンＴ）方法または酵素的（ラクトペルオキシダーゼ）方
法により、チロシルまたはヒスチヂル成分を含むタンパ
ク質（フィブリニンはそのようなタンパク質の１種であ
る）中に １２５Ｉを導入することができる。本発明に
おいて記載されるフィブリニンを調製するのにも使用す
ることができる標識フィブリノーゲンを調製する詳細な
操作手順は、Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ．， Ａｄａｍｓｏｎ，
Ｌ．， Ｂｌｏｃｋ，Ｍ． およびＢｌｏｍｂａｃｋ，
Ｂ． （１９８５）， ”Ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩ Ｃ
ａｔａｌｙｚｅｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂ
ｒｉｎｏｇｅｎ−Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｏｌｉｇｏ
ｍｅｒｓ − Ａ Ｔｈｉｏｌ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐ
ｒｏｃｅｓｓ”， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， ４０
， ８３３−８５２ において見つけることができる。 あるいは、実施例１および２に記載の可溶性フィブリニ
ンの調製方法のブロッキング段階において、放射能標識
したブロッキング試薬、例えば ３Ｈ−または１２Ｃ−
標識ヨード酢酸を使用することができる。この調製の詳
細な手順は、Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ． およびＢｌｏｍｂａ
ｃｋ，Ｂ． （１９８５）， ”Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ
Ｂｏｎｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｂｒｉｎ
ｏｇｅｎ ： Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｃｌｏｔｔａｂｉｌｉ
ｔｙ”， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９， １
５０１−１５０７ において見つけることができる。そ
の全内容は参照として本明細書中に組み込まれる。
を使用することができる。便利には、化学的（クロラミ
ンＴ）方法または酵素的（ラクトペルオキシダーゼ）方
法により、チロシルまたはヒスチヂル成分を含むタンパ
ク質（フィブリニンはそのようなタンパク質の１種であ
る）中に １２５Ｉを導入することができる。本発明に
おいて記載されるフィブリニンを調製するのにも使用す
ることができる標識フィブリノーゲンを調製する詳細な
操作手順は、Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ．， Ａｄａｍｓｏｎ，
Ｌ．， Ｂｌｏｃｋ，Ｍ． およびＢｌｏｍｂａｃｋ，
Ｂ． （１９８５）， ”Ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩ Ｃ
ａｔａｌｙｚｅｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂ
ｒｉｎｏｇｅｎ−Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｏｌｉｇｏ
ｍｅｒｓ − Ａ Ｔｈｉｏｌ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐ
ｒｏｃｅｓｓ”， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， ４０
， ８３３−８５２ において見つけることができる。 あるいは、実施例１および２に記載の可溶性フィブリニ
ンの調製方法のブロッキング段階において、放射能標識
したブロッキング試薬、例えば ３Ｈ−または１２Ｃ−
標識ヨード酢酸を使用することができる。この調製の詳
細な手順は、Ｐｒｏｃｙｋ，Ｒ． およびＢｌｏｍｂａ
ｃｋ，Ｂ． （１９８５）， ”Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ
Ｂｏｎｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｂｒｉｎ
ｏｇｅｎ ： Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｃｌｏｔｔａｂｉｌｉ
ｔｙ”， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９， １
５０１−１５０７ において見つけることができる。そ
の全内容は参照として本明細書中に組み込まれる。
【００５２】一般的には、本発明に記載のようにして調
製したフィブリニンを、Ｉ−１２５（または他の放射性
同位体）により、使用する同位体に依存して１０〜１０
０ μＣｉ／ｍｇ の比放射能に標識する。放射能標識
された可溶性フィブリニンを、当業界で既知の適当な水
性緩衝液で希釈し、最適なアッセイ感度を提供すること
ができる。
製したフィブリニンを、Ｉ−１２５（または他の放射性
同位体）により、使用する同位体に依存して１０〜１０
０ μＣｉ／ｍｇ の比放射能に標識する。放射能標識
された可溶性フィブリニンを、当業界で既知の適当な水
性緩衝液で希釈し、最適なアッセイ感度を提供すること
ができる。
【００５３】未知の血漿試料またはフィブリン分解生成
物を含む試料を放射能標識フィブリニンと混合した後、
該混合物に可溶性フィブリンまたはフィブリン分解生成
物と免疫反応することができる抗体および本明細書に記
載のようにして調製した放射性フィブリニンを添加する
。前記抗体は、上記成分の両者に対する特異性を有して
おり、従って、与えられた量の抗体によって結合された
放射性フィブリニンの量は、未標識の可溶性フィブリン
またはフィブリン分解生成物の存在下では減少する。
物を含む試料を放射能標識フィブリニンと混合した後、
該混合物に可溶性フィブリンまたはフィブリン分解生成
物と免疫反応することができる抗体および本明細書に記
載のようにして調製した放射性フィブリニンを添加する
。前記抗体は、上記成分の両者に対する特異性を有して
おり、従って、与えられた量の抗体によって結合された
放射性フィブリニンの量は、未標識の可溶性フィブリン
またはフィブリン分解生成物の存在下では減少する。
【００５４】インキュベーション段階の完了後、常法の
いずれかにより、例えばフィブリニン、可溶性フィブリ
ンまたはフィブリン分解生成物に対する特異性を持たな
い第一抗体に対するアガロースビーズ結合第二抗体を用
いて、未結合のフィブリニン、可溶性フィブリンまたは
フィブリン分解生成物を抗体結合物質から分離する。標
準的なＲＩＡにおいて通常行われるようにして、結合し
た複合体の放射能を測定し、そして試料中の可溶性フィ
ブリンまたはフィブリン分解生成物の量に関係づけるの
に使用する。
いずれかにより、例えばフィブリニン、可溶性フィブリ
ンまたはフィブリン分解生成物に対する特異性を持たな
い第一抗体に対するアガロースビーズ結合第二抗体を用
いて、未結合のフィブリニン、可溶性フィブリンまたは
フィブリン分解生成物を抗体結合物質から分離する。標
準的なＲＩＡにおいて通常行われるようにして、結合し
た複合体の放射能を測定し、そして試料中の可溶性フィ
ブリンまたはフィブリン分解生成物の量に関係づけるの
に使用する。
【００５５】実施例７
本明細書中に記載のようにして調製したフィブリニンは
、血漿試料中のフィブリンモノマー濃度の測定のための
標準物としても使用することができる。血漿中のフィブ
リンモノマーの光度定量のための市販のキット、例えば
Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｍｏｌｎｄａｌ，
Ｓｗｅｄｅｎ） により市販されている ＣＯＡ−Ｓ
ＥＴＲ フィブリンモノマーキットは、酵素プラスミノ
ーゲンが組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）
によりプラスミンに変換され、そしてこの変換の活性化
速度が可溶性フィブリンモノマーの存在下で増加すると
いう理論に基づいている。血漿試料中のフィブリンモノ
マーの量は、生成するプラスミンのアミド分解活性を測
定することにより決定される。というのは、フィブリン
モノマーの量はプラスミノーゲンをプラスミンに変換す
るｔ−ＰＡの能力の増加の程度に比例するであろうから
である。プラスミンは４０５ ｎｍでの吸光度の変化を
もたらすｐ−ニトロアニリン基の遊離を引き起こすため
、色素生成性基質Ｓ−２３９０（Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃａ， Ｍｏｌｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）
が使用される。
、血漿試料中のフィブリンモノマー濃度の測定のための
標準物としても使用することができる。血漿中のフィブ
リンモノマーの光度定量のための市販のキット、例えば
Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｍｏｌｎｄａｌ，
Ｓｗｅｄｅｎ） により市販されている ＣＯＡ−Ｓ
ＥＴＲ フィブリンモノマーキットは、酵素プラスミノ
ーゲンが組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）
によりプラスミンに変換され、そしてこの変換の活性化
速度が可溶性フィブリンモノマーの存在下で増加すると
いう理論に基づいている。血漿試料中のフィブリンモノ
マーの量は、生成するプラスミンのアミド分解活性を測
定することにより決定される。というのは、フィブリン
モノマーの量はプラスミノーゲンをプラスミンに変換す
るｔ−ＰＡの能力の増加の程度に比例するであろうから
である。プラスミンは４０５ ｎｍでの吸光度の変化を
もたらすｐ−ニトロアニリン基の遊離を引き起こすため
、色素生成性基質Ｓ−２３９０（Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃａ， Ｍｏｌｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）
が使用される。
【００５６】ＣＯＡ−ＳＥＴＲ フィブリンモノマーキ
ットに用意された検量線作成用標準物を、実施例３に記
載のようにして調製した同濃度のフィブリニンと共に試
験した（図３）。２つの標準曲線の傾きは同様であり、
実施例３に記載のようにして調製したフィブリニンは、
３０〜２００ ナノモル／リットルのフィブリンモノマ
ーの血漿濃度範囲において有用である。
ットに用意された検量線作成用標準物を、実施例３に記
載のようにして調製した同濃度のフィブリニンと共に試
験した（図３）。２つの標準曲線の傾きは同様であり、
実施例３に記載のようにして調製したフィブリニンは、
３０〜２００ ナノモル／リットルのフィブリンモノマ
ーの血漿濃度範囲において有用である。
【００５７】図３は、フィブリンモノマーアッセイにお
いて使用した標準物の吸光度のプロットである。 ＣＯ
Ａ−ＳＥＴＲ フィブリンモノマーキットにより供給さ
れたフィブリンモノマー標準物（□）；実施例２に記載
のようにして調製した可溶性フィブリニン（△）；実施
例２と３に記載のようにして調製した可溶性フィブリニ
ン（●）； ＤＥＳＡＦＩＢＴＭ ｄｅｓ−ＡＡ−フ
ィブリノーゲン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃａ Ｉｎｃ）（○）。ＣＯＡ−ＳＥＴ Ｒ フィブ
リンモノマーキット により供給されるフィブリンモ
ノマー標準物は凍結乾燥形で手に入り、そして製造業者
の指示に従った再水和によって或る粒状物質を時々含む
ことがある。本明細書に記載のようにして調製した可溶
性フィブリニンは、そのような溶解性の問題が全くなか
った。製造業者により教示された通りにアッセイ全体を
血漿の存在下で行い、そして本明細書に記載のようにし
て調製した可溶性フィブリニンが血漿の存在下でのその
ようなアッセイに適用できることを示す。
いて使用した標準物の吸光度のプロットである。 ＣＯ
Ａ−ＳＥＴＲ フィブリンモノマーキットにより供給さ
れたフィブリンモノマー標準物（□）；実施例２に記載
のようにして調製した可溶性フィブリニン（△）；実施
例２と３に記載のようにして調製した可溶性フィブリニ
ン（●）； ＤＥＳＡＦＩＢＴＭ ｄｅｓ−ＡＡ−フ
ィブリノーゲン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃａ Ｉｎｃ）（○）。ＣＯＡ−ＳＥＴ Ｒ フィブ
リンモノマーキット により供給されるフィブリンモ
ノマー標準物は凍結乾燥形で手に入り、そして製造業者
の指示に従った再水和によって或る粒状物質を時々含む
ことがある。本明細書に記載のようにして調製した可溶
性フィブリニンは、そのような溶解性の問題が全くなか
った。製造業者により教示された通りにアッセイ全体を
血漿の存在下で行い、そして本明細書に記載のようにし
て調製した可溶性フィブリニンが血漿の存在下でのその
ようなアッセイに適用できることを示す。
【００５８】実施例８
本明細書に記載のようにして調製した可溶性フィブリニ
ンは、血漿中のｔ−ＰＡ活性の測定にも有用である。常
用されるアッセイは、生成するプラスミンの量のアミド
分解活性に基づいている。ｔ−ＰＡの活性はｔ−ＰＡ刺
激剤の存在を必要とし、そして本明細書に記載のように
して調製した可溶性フィブリン様物質フィブリニンは、
市販の調製物の非常に適切な代替品である。図４に示さ
れるように、本明細書に記載のようにして調製したフィ
ブリニンは、 ＤＥＳＡＦＩＢＴＭ（ｄｅｓ−ＡＡ−フ
ィブリノーゲン）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃａ，Ｉｎｃ．， Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ， ＣＴ）
またはフィブリンモノマー標準物（Ｋａｂｉ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃａ， Ｍｏｌｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）
よりも非常に高い最大ｔ−ＰＡ刺激を与える。
ンは、血漿中のｔ−ＰＡ活性の測定にも有用である。常
用されるアッセイは、生成するプラスミンの量のアミド
分解活性に基づいている。ｔ−ＰＡの活性はｔ−ＰＡ刺
激剤の存在を必要とし、そして本明細書に記載のように
して調製した可溶性フィブリン様物質フィブリニンは、
市販の調製物の非常に適切な代替品である。図４に示さ
れるように、本明細書に記載のようにして調製したフィ
ブリニンは、 ＤＥＳＡＦＩＢＴＭ（ｄｅｓ−ＡＡ−フ
ィブリノーゲン）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃａ，Ｉｎｃ．， Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ， ＣＴ）
またはフィブリンモノマー標準物（Ｋａｂｉ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃａ， Ｍｏｌｎｄａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）
よりも非常に高い最大ｔ−ＰＡ刺激を与える。
【００５９】図４は、色素生成性基質Ｓ−２２５１の加
水分解から生成プラスミンのアミド分解活性を表す吸光
度のプロットである。プラスミノーゲンからプラスミン
への変換をｔ−ＰＡおよび種々のｔ−ＰＡ刺激剤の存在
下で実施した：実施例２と３に記載のようにして調製し
た可溶性フィブリニン（曲線１）；ＣＯＡ−ＳＥＴ Ｒ
フィブリンモノマーキットにより供給されたフィブリ
ンモノマー標準物（曲線２）；本明細書に記載のように
して調製し、ただしトロンビン消化段階を削除した可溶
性の部分還元・アルキル化フィブリノーゲン（曲線３）
； ＤＥＳＡＦＩＢＴＭ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ）（曲線４）；プラスミノ
ーゲン不含有フィブリノーゲン（ＩＭＣＯ， Ｓｔｏｃ
ｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄｅｎ ）（曲線５）；ｔ−ＰＡ
刺激剤なし（曲線６）。このアッセイにおける成分の最
終濃度は次のようであった：プラスミノーゲン（０．２
２μＭ） ； Ｓ−２２５１ （０．４５ｍＭ）； ｔ
−ＰＡ （３３ Ｕ／ｍｌ） ； 刺激剤（０．１ ｍ
ｇ／ｍｌ） 。アッセイ緩衝液は６３ｍＭ Ｔｒｉｓ，
ｐＨ ８．５， ０．０１％”Ｔｗｅｅｎ ８０”で
あった。
水分解から生成プラスミンのアミド分解活性を表す吸光
度のプロットである。プラスミノーゲンからプラスミン
への変換をｔ−ＰＡおよび種々のｔ−ＰＡ刺激剤の存在
下で実施した：実施例２と３に記載のようにして調製し
た可溶性フィブリニン（曲線１）；ＣＯＡ−ＳＥＴ Ｒ
フィブリンモノマーキットにより供給されたフィブリ
ンモノマー標準物（曲線２）；本明細書に記載のように
して調製し、ただしトロンビン消化段階を削除した可溶
性の部分還元・アルキル化フィブリノーゲン（曲線３）
； ＤＥＳＡＦＩＢＴＭ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ）（曲線４）；プラスミノ
ーゲン不含有フィブリノーゲン（ＩＭＣＯ， Ｓｔｏｃ
ｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄｅｎ ）（曲線５）；ｔ−ＰＡ
刺激剤なし（曲線６）。このアッセイにおける成分の最
終濃度は次のようであった：プラスミノーゲン（０．２
２μＭ） ； Ｓ−２２５１ （０．４５ｍＭ）； ｔ
−ＰＡ （３３ Ｕ／ｍｌ） ； 刺激剤（０．１ ｍ
ｇ／ｍｌ） 。アッセイ緩衝液は６３ｍＭ Ｔｒｉｓ，
ｐＨ ８．５， ０．０１％”Ｔｗｅｅｎ ８０”で
あった。
【００６０】実施例９
実施例８と同様に、ｔ−ＰＡ活性を刺激するためにフィ
ブリニンまたはフィブリニン様物質の種々の変形調製物
を使用することができる。図５は、色素生成性基質Ｓ−
２２５１の加水分解から生成プラスミンのアミド分解活
性を表す吸光度のプロットである。プラスミノーゲンか
らプラスミンへの変換をｔ−ＰＡおよび種々の架橋ｔ−
ＰＡ刺激剤の存在下で実施した：高分子量複合体として
実施例４に記載のようにして調製した可溶性フィブリニ
ン（曲線１）；実施例３に記載のようにして調製した可
溶性フィブリニン（曲線２）；実施例４において必要と
される条件と同じ条件下で第ＸＩＩＩ因子により架橋さ
れたプラスミノーゲン不含有フィブリノーゲン（曲線３
）；プラスミノーゲン不含有フィブリノーゲン（曲線４
）。どの場合でも、架橋試料が一層高い刺激活性を与え
たことは明白である。
ブリニンまたはフィブリニン様物質の種々の変形調製物
を使用することができる。図５は、色素生成性基質Ｓ−
２２５１の加水分解から生成プラスミンのアミド分解活
性を表す吸光度のプロットである。プラスミノーゲンか
らプラスミンへの変換をｔ−ＰＡおよび種々の架橋ｔ−
ＰＡ刺激剤の存在下で実施した：高分子量複合体として
実施例４に記載のようにして調製した可溶性フィブリニ
ン（曲線１）；実施例３に記載のようにして調製した可
溶性フィブリニン（曲線２）；実施例４において必要と
される条件と同じ条件下で第ＸＩＩＩ因子により架橋さ
れたプラスミノーゲン不含有フィブリノーゲン（曲線３
）；プラスミノーゲン不含有フィブリノーゲン（曲線４
）。どの場合でも、架橋試料が一層高い刺激活性を与え
たことは明白である。
【００６１】実施例１０
他の哺乳動物由来のフィブリノーゲンを使ってフィブリ
ニンを調製することが好都合であるかもしれない。例え
ば、ウシフィブリノーゲンがこの目的に適当である。ウ
シフィブリノーゲン（分画Ｉ，ＩＶ型）を溶液として調
製する（０．１４Ｍ ＮａＣｌ， ２０ｍＭクエン酸ナ
トリウム，ｐＨ ７．４ 中 ２％）。実施例１に記載
のようにして、存在するフィブロネクチンをゼラチン−
セファロース上でのアフィニティークロマトグラフィー
により除去する。ウシフィブリノーゲン原液をＴＮＥ−
緩衝液で７ ｍｇ／ｍｌ の最終濃度に希釈し、次いで
実施例２の通りに処理する。ＤＴＴ を５ｍＭの最終モ
ル濃度になるように添加する（水中の濃厚原液から）。
ニンを調製することが好都合であるかもしれない。例え
ば、ウシフィブリノーゲンがこの目的に適当である。ウ
シフィブリノーゲン（分画Ｉ，ＩＶ型）を溶液として調
製する（０．１４Ｍ ＮａＣｌ， ２０ｍＭクエン酸ナ
トリウム，ｐＨ ７．４ 中 ２％）。実施例１に記載
のようにして、存在するフィブロネクチンをゼラチン−
セファロース上でのアフィニティークロマトグラフィー
により除去する。ウシフィブリノーゲン原液をＴＮＥ−
緩衝液で７ ｍｇ／ｍｌ の最終濃度に希釈し、次いで
実施例２の通りに処理する。ＤＴＴ を５ｍＭの最終モ
ル濃度になるように添加する（水中の濃厚原液から）。
【００６２】試料の上に窒素を吹きつけ、試験管を封管
し、そして３７℃の湯浴中に還元期間（４５分間）置く
。２Ｍ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５ の添加により試料
のｐＨを８．１ に調整し、そして２０〜３０ｍＭの最
終モル濃度を与えるようにヨード酢酸（Ｓｉｇｍａ，
Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ ；使用前に石油エーテル
から３回再結晶したもの）を添加する。ヨード酢酸の原
液（５００ ｍＭ）は０．１Ｎ ＮａＯＨ 中に作製す
る。試料の上に窒素を吹きつけ、試験管を封管し、そし
て室温で４５分間遮光下に置く。その後、ゲル濾過（Ｔ
ＮＥ−緩衝液で平衡化されたカラム）により、または外
液を３ 〜４ 回交換しながら４００ 〜２０００容の
ＴＮＥ−緩衝液に対して４ 〜２０時間透析することに
より、または他の任意の手段により、未反応の試薬を除
去する。
し、そして３７℃の湯浴中に還元期間（４５分間）置く
。２Ｍ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５ の添加により試料
のｐＨを８．１ に調整し、そして２０〜３０ｍＭの最
終モル濃度を与えるようにヨード酢酸（Ｓｉｇｍａ，
Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ ；使用前に石油エーテル
から３回再結晶したもの）を添加する。ヨード酢酸の原
液（５００ ｍＭ）は０．１Ｎ ＮａＯＨ 中に作製す
る。試料の上に窒素を吹きつけ、試験管を封管し、そし
て室温で４５分間遮光下に置く。その後、ゲル濾過（Ｔ
ＮＥ−緩衝液で平衡化されたカラム）により、または外
液を３ 〜４ 回交換しながら４００ 〜２０００容の
ＴＮＥ−緩衝液に対して４ 〜２０時間透析することに
より、または他の任意の手段により、未反応の試薬を除
去する。
【００６３】回収された部分還元・アルキル化されたウ
シフィブリノーゲンをＴＮＥ−緩衝液で３ ｍｇ／ｍｌ
に希釈し、そして０．５ ＮＩＨ 単位／ｍｌ のト
ロンビン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．
， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．から市販されている
ウシトロンビン）で室温にて２．７ 時間処理し、アミ
ノ末端ペプチドを遊離させる。トロンビンを阻害するこ
とにより反応を停止させる。
シフィブリノーゲンをＴＮＥ−緩衝液で３ ｍｇ／ｍｌ
に希釈し、そして０．５ ＮＩＨ 単位／ｍｌ のト
ロンビン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．
， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．から市販されている
ウシトロンビン）で室温にて２．７ 時間処理し、アミ
ノ末端ペプチドを遊離させる。トロンビンを阻害するこ
とにより反応を停止させる。
【００６４】可溶性ウシフィブリニンは、ヒトフィブリ
ノーゲンから調製したフィブリニンについて実施例８に
記載した血漿中のｔ−ＰＡ活性の測定に有用である。図
６からわかるように、この実施例に記載のようにしてウ
シフィブリノーゲンから調製したフィブリニンは、ヒト
フィブリノーゲンから調製したフィブリニンと同じ程度
の、高度なｔ−ＰＡ刺激を与える。
ノーゲンから調製したフィブリニンについて実施例８に
記載した血漿中のｔ−ＰＡ活性の測定に有用である。図
６からわかるように、この実施例に記載のようにしてウ
シフィブリノーゲンから調製したフィブリニンは、ヒト
フィブリノーゲンから調製したフィブリニンと同じ程度
の、高度なｔ−ＰＡ刺激を与える。
【００６５】図６は、色素生成性基質Ｓ−２２５１の加
水分解から生成プラスミンのアミド分解活性を表す吸光
度の上昇のプロットである。プラスミノーゲンからプラ
スミンへの変換をｔ−ＰＡおよび：実施例２および３に
記載のようにしてヒトフィブリノーゲンから調製した可
溶性フィブリニン（曲線１）；この実施例に記載のよう
にしてウシフィブリノーゲンから調製した可溶性フィブ
リニン（曲線２）；プラスミノーゲン不含有フィブリノ
ーゲン（ＩＭＣＯ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄ
ｅｎ ）（曲線３）の存在下で実施した。このアッセイ
における成分の最終濃度は次のようであった：プラスミ
ノーゲン（０．２２μＭ） ； Ｓ−２２５１ （０．
４５ｍＭ） ； ｔ−ＰＡ （１１ Ｕ／ｍｌ） ；
刺激剤（０．１ ｍｇ／ｍｌ） 。アッセイ緩衝液は６
３ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５， ０．０１％ ”
Ｔｗｅｅｎ ８０” であった。
水分解から生成プラスミンのアミド分解活性を表す吸光
度の上昇のプロットである。プラスミノーゲンからプラ
スミンへの変換をｔ−ＰＡおよび：実施例２および３に
記載のようにしてヒトフィブリノーゲンから調製した可
溶性フィブリニン（曲線１）；この実施例に記載のよう
にしてウシフィブリノーゲンから調製した可溶性フィブ
リニン（曲線２）；プラスミノーゲン不含有フィブリノ
ーゲン（ＩＭＣＯ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄ
ｅｎ ）（曲線３）の存在下で実施した。このアッセイ
における成分の最終濃度は次のようであった：プラスミ
ノーゲン（０．２２μＭ） ； Ｓ−２２５１ （０．
４５ｍＭ） ； ｔ−ＰＡ （１１ Ｕ／ｍｌ） ；
刺激剤（０．１ ｍｇ／ｍｌ） 。アッセイ緩衝液は６
３ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５， ０．０１％ ”
Ｔｗｅｅｎ ８０” であった。
【００６６】本明細書は例示のため与えられ限定のため
ではなく、そして本発明の精神および範囲から逸脱する
ことなく種々の変更および改良を行い得ることは理解さ
れよう。
ではなく、そして本発明の精神および範囲から逸脱する
ことなく種々の変更および改良を行い得ることは理解さ
れよう。
【図１】図１は、酸可溶化フィブリンまたは本発明に従
って製造した可溶性フィブリン様モノマーのいずれかで
コーティングしたプラスチックウエルへの、フィブリン
に対する抗体（Ｔ２Ｇ１抗体）の結合を表すグラフであ
る。
って製造した可溶性フィブリン様モノマーのいずれかで
コーティングしたプラスチックウエルへの、フィブリン
に対する抗体（Ｔ２Ｇ１抗体）の結合を表すグラフであ
る。
【図２】図２は、酸可溶化フィブリンまたは本発明に従
って製造した可溶性フィブリン様モノマーのいずれかで
コーティングしたプラスチックウエルへの抗フィブリン
抗体の結合の阻害と、抗体試料に添加した抗原（即ち、
本発明に従って製造した可溶性フィブリン様モノマー）
の濃度との関係を表すグラフである。
って製造した可溶性フィブリン様モノマーのいずれかで
コーティングしたプラスチックウエルへの抗フィブリン
抗体の結合の阻害と、抗体試料に添加した抗原（即ち、
本発明に従って製造した可溶性フィブリン様モノマー）
の濃度との関係を表すグラフである。
【図３】図３は、フィブリンモノマーアッセイにおいて
使用される標準物の種々の濃度に対する吸光度のプロッ
トである。
使用される標準物の種々の濃度に対する吸光度のプロッ
トである。
【図４】図４は、種々の刺激剤の存在下での色素生成性
基質Ｓ−２２５１の加水分解から生成プラスミンのアミ
ド分解活性を表す吸光度のプロットである。
基質Ｓ−２２５１の加水分解から生成プラスミンのアミ
ド分解活性を表す吸光度のプロットである。
【図５】図５は、種々の架橋した刺激剤についての、図
４と同様のプロットである。
４と同様のプロットである。
【図６】図６は、ヒトとウシ起源のフィブリニンを比較
する、図４と同様のプロットである。
する、図４と同様のプロットである。
Claims (8)
- 【請求項１】 アッセイの１つの成分として可溶性フ
ィブリンまたは可溶性フィブリンモノマー試薬を必要と
するアッセイ方法であって、前記試薬がフィブリノーゲ
ンと同様な溶解性および安定性を有するフィブリン様物
質であり、前記試薬が、フィブリン重合阻害剤または溶
解性を維持するための試薬の非存在下で、前記アッセイ
において使用する濃度において生理的条件下で可溶性で
且つ安定なままであることを特徴とする改良されたアッ
セイ方法。 - 【請求項２】 前記濃度が０．０８ ｍｇ／ｍｌ〜１
５ ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記アッセイが可溶性フィブリンモノ
マーの定量のためのものである、請求項１に記載の方法
。 - 【請求項４】 前記アッセイがプラスミン活性化因子
阻害剤活性の定量のためのものである、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項５】 前記アッセイが組織プラスミノーゲン
活性化因子活性の定量ためのものである、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項６】 前記アッセイがイムノアッセイである
、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記フィブリン様物質が３ 〜１０の
ｐＨにおいて生理的緩衝液中で可溶性で且つ安定なまま
である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 前記フィブリン様物質が３ 〜１０の
ｐＨおよび０．０８ ｍｇ／ｍｌ〜１５ ｍｇ／ｍｌの
濃度において生理的緩衝液中で可溶性で且つ安定なまま
である、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US57218990A | 1990-08-23 | 1990-08-23 | |
| US572189 | 1990-08-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04233458A true JPH04233458A (ja) | 1992-08-21 |
Family
ID=24286744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3208131A Pending JPH04233458A (ja) | 1990-08-23 | 1991-08-20 | 可溶性フィブリン様モノマーを使ったアッセイ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6074837A (ja) |
| EP (1) | EP0472205B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04233458A (ja) |
| KR (1) | KR0171609B1 (ja) |
| AT (1) | ATE147513T1 (ja) |
| AU (1) | AU644205B2 (ja) |
| CA (1) | CA2049710A1 (ja) |
| DE (1) | DE69124030T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07191024A (ja) * | 1993-10-20 | 1995-07-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | イムノアッセイ用合成スタンダード |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1091315A (zh) * | 1992-10-08 | 1994-08-31 | E·R·斯奎布父子公司 | 血纤维蛋白封闭剂组合物及其使用方法 |
| DE4402631A1 (de) * | 1994-01-29 | 1995-08-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von Gerinnungsparametern |
| AU709134B2 (en) * | 1994-05-02 | 1999-08-19 | E.R. Squibb & Sons, Inc. | Recombinant fibrin chains, fibrin and fibrin-homologs |
| GB0002660D0 (en) * | 2000-02-04 | 2000-03-29 | Biomade B V | Method of stabilizing a hydrophobin-containing solution and a method of coatinga surface with a hydrophobin |
| US20030224994A1 (en) * | 2002-04-05 | 2003-12-04 | Newton Colin John | Storage stable liquid sealer protein complex |
| US8900822B2 (en) | 2011-11-21 | 2014-12-02 | Ethicon, Inc. | Fibrinogen assay |
| CN107589246B (zh) * | 2017-03-07 | 2019-10-01 | 上海原科实业发展有限公司 | 一种纤维蛋白激活剂、其制备方法，包括该激活剂的试剂盒及采用该试剂盒的检测方法 |
| CN112638427A (zh) * | 2018-06-29 | 2021-04-09 | 北卡罗莱纳州立大学 | 用于术后治疗的原位喷雾生物响应性免疫治疗凝胶 |
| CN113189183A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-07-30 | 浙江大学 | 含有还原剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3017707A1 (de) * | 1980-05-08 | 1981-11-12 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zum nachweis von fibrinmonomer |
| NL8201987A (nl) * | 1982-05-13 | 1983-12-01 | Tno | Werkwijze voor het bepalen van de activiteit van plasminogeenactivator van het weefseltype, alsmede voor gebruik bij deze werkwijze geschikte combinatie van het "kit"-type. |
| FR2565984B1 (fr) * | 1984-06-19 | 1986-08-29 | Rhone Poulenc Sante | Nouvelles substances biologiquement actives, leur procede de preparation a partir du fibrinogene bovin et les compositions qui les contiennent |
| SE447579B (sv) * | 1985-04-01 | 1986-11-24 | Biopool Ab | Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition och anvendning av kompositionen vid bestemning av fibrinolysparametrar |
| DE3512909A1 (de) * | 1985-04-11 | 1986-10-23 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur bestimmung von plasminogenaktivatoren (pa) |
| US4668621A (en) * | 1985-04-22 | 1987-05-26 | Wake Forest University | Detecting blood clotting factors with immobilized fibrinogen and labeled fibrinogen |
| EP0576038B1 (en) * | 1987-07-06 | 1999-10-06 | Biopool International, Inc. | Method for measuring tissue plasminogen activator, antithrombin III and soluble fibrin |
| DE3819923A1 (de) * | 1988-06-11 | 1989-12-21 | Behringwerke Ag | Fibrin(ogen)derivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
-
1991
- 1991-08-20 JP JP3208131A patent/JPH04233458A/ja active Pending
- 1991-08-20 AU AU82628/91A patent/AU644205B2/en not_active Ceased
- 1991-08-22 CA CA002049710A patent/CA2049710A1/en not_active Abandoned
- 1991-08-23 KR KR1019910014643A patent/KR0171609B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-08-23 AT AT91114134T patent/ATE147513T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-08-23 DE DE69124030T patent/DE69124030T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-23 EP EP91114134A patent/EP0472205B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-06 US US08/468,460 patent/US6074837A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07191024A (ja) * | 1993-10-20 | 1995-07-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | イムノアッセイ用合成スタンダード |
| JP2575296B2 (ja) * | 1993-10-20 | 1997-01-22 | ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー | イムノアッセイ用合成スタンダード |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0472205B1 (en) | 1997-01-08 |
| AU644205B2 (en) | 1993-12-02 |
| DE69124030T2 (de) | 1997-04-17 |
| EP0472205A1 (en) | 1992-02-26 |
| KR0171609B1 (ko) | 1999-05-01 |
| ATE147513T1 (de) | 1997-01-15 |
| US6074837A (en) | 2000-06-13 |
| DE69124030D1 (de) | 1997-02-20 |
| KR920004837A (ko) | 1992-03-28 |
| CA2049710A1 (en) | 1992-02-24 |
| AU8262891A (en) | 1992-02-27 |
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