HU218898B - Fibrin sebragasztó készítmények és eljárás előállításukra - Google Patents

Description

A találmány tárgyát fibrin sebragasztók képezik. Közelebbről meghatározva, a találmány tárgyát olyan fibrin sebragasztók és előállítáuk képezik, amelyeknél fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítményt használunk a fibrin sebragasztó komponenseként.

Emlősöknél a vérzéscsillapítás, azaz a vérveszteség megakadályozásának egy mechanizmusa vérrög képzéséből áll. Embernél a vérrög képzése, vagyis a vér koagulálása reakciók komplex sorozatának a segítségével megy végbe, ahol az utolsó lépés a fibrinogénnek - egy monomernek - trombin, kalciumionok és aktivált faktor XIII hatására történő átalakulása, amelynek során végül is térhálós fibrin II polimer képződik, ami a fibrinrögöt alkotja.

A térhálós fibrin II polimer képződése úgy megy végbe, hogy a fibrinogént a trombin fibrin I monomerré alakítja át, amely spontán polimerizálódik fibrin I polimerré, amelyet olykor oldható fibrin I-nek is nevezünk, mert megfelelő kémiai kezeléssel a fibrin I polimer visszaalakítható fibrin I monomerré. A fibrin I polimert a trombin azután átalakítja fibrin II polimerré, amelyet oldható fibrin II-nek is nevezünk, mert megfelelő kémiai kezeléssel a fibrin II polimer átalakítható fibrin II monomerré. A fibrin II polimer az aktivált faktor XIIIként ismert faktor XlIIa hatására azután térhálósodik, és így térhálós fibrin ΙΙ-t képez, ami a fibrinrög. A faktor XIII-at a trombin aktiválja kalciumionok jelenlétében. A térhálós fibrin Η-t oldhatatlan fibrin II-nek is nevezzük, mert nem alakítható át fibrin II monomerré.

Meg kell jegyeznünk, hogy a trombin protrominból képződik. A protrombint a faktor Xa alakítja át trombinná kalciumionok és más segédanyagok jelenlétében.

A fibrinogén a vérplazmafehérjéből körülbelül 2-4 gramm/litert képvisel. A fibrinogén egy monomer, amely (Aa)₂-nek, (BP)₂-nek és p₂-nek jelölt három pár diszulfidhídkötésekkel kapcsolódó polipeptidláncból áll. „A” és ,3” jelöli a fibrinopeptid A-ként, illetve fibrinopeptid B-ként ismert két kis aminoterminális peptidet. A fibrinopeptid A-nak a fibrinogénről való lehasítása a fibrinogénnek trombin hatására történő átalakítása során a fibrin I vegyületet eredményezi, és azt követően a fibrinopeptid B-nek a lehasítása a fibrin II vegyületet szolgáltatja. A fibrinopeptid A-nak és B-nek ez a lehasítása a fibrinogén molekulatömegét csak rendkívül kis mértékben, a 340 000 daltonból körülbelül 6000 daltonnal csökkenti, de hozzáférhetővé teszi a polimerizációs helyeket. A vér koagulálásának mechanizmusát és a fibrinogén szerkezetét tárgyaló áttekintést illetően lásd C. M. Jackson [Ann. Rév. Biochem., 49, 765-811 (1980)] és B. Fürié és B. C. Fürié [Cell, 53, 505-518 (1988)] közleményeit.

A fibrin sebragasztó olyan biológiai sebtapasz, amelynek hatása utánozza a koagulálás végső fokozatait, és ezáltal fibrinrögöt eredményez. A szokásos fibrin sebragasztók első komponensként koncentrált humán fibrinogént, szarvasmarha (bovine)-aprotinint és faktor XIII-at, második komponensként szarvasmarhatrombint és kalcium-kloridot tartalmaznak. Alkalmazásuk általában kéthengeres fecskendővel történik, amely lehetővé teszi a két komponens egyidejű alkalmazását arra a helyre, ahol a fibrinrögöt képezni kívánjuk. Az aprotinin egy fibrinolízisinhibitor, amelyet azért adnak a készítményhez, hogy javítsa a fibrin sebragasztók stabilitását.

A fibrin sebragasztók fibrinogénkomponensét összegyűjtött humán plazmából készítik. A fibrinogént a humán plazmából krioprecipitálással és különböző reagensek, így polietilénglikol, dietil-éter, etanol, ammóniumszulfát vagy glicin alkalmazásával végzett lecsapással koncentrálhatjuk.

A fibrin sebragasztókat tárgyaló kiváló áttekintéseket találunk a következő közleményekben: M. Brennan, Blood Reviews, 5, 240-244 (1991); J. W. Gibble és P. M. Ness, Transfusion, 30, 741-747 (1990); H. Matras, J. Órai Maxillofac Surg., 43, 605-611 (1985) és R. Lemer és N. Binur, J. of Surgical Research, 48, 165-181 (1990).

Újabban érdeklődés mutatkozott az olyan fibrin sebragasztók készítése iránt, amelyek autológ fibrint alkalmaznak. Az autológ fibrin sebragasztó olyan fibrin sebragasztó, amelyben a fibrin sebragasztó fibrinogénkomponensét a beteg saját véréből vonják ki. Az autológ fibrin sebragasztók használata előnyös, mert kiküszöböli a vér által átvitt fertőzések, így a hepatitis B, a non A, non B hepatitis és a szerzett immunhiányos tünetegyüttes (AIDS) veszélyét, ami egyébként fennállhat az összegyűjtött humán plazmából kivont fibrinogénkomponens esetén. Erre vonatkozólag utalunk L. E. Silberstein és munkatársai [Transfusion, 28, 319-321 (1988)]; K. Laitakari és J. Luotonen [Laryngoscope, 99, 974-976 (1989)] és A. Dresdale és munkatársai [The Anals of Thoracic Surgery, 40, 385-387 (1985)] közleményeire.

A fibrin sebragasztóval fertőzést nemcsak a fibrinogén útján vihetünk át, hanem a szarvasmarha-aprotitin- és szarvasmarhatrombin-komponenssel is. A szarvasmarha trombinról tudott, hogy benne jelen lehetnek a szarvasmarha-enkephalitis (bovine spongiform encephalitis=BSE) fertőző ágensei és az emlősökre nézve patogén más vírusok. Továbbá a szarvasmarhatrombin potenciális antigén, amely az embernél immunológiai reakciókat válthat ki. így a szarvasmarhatrombin használata az azt befogadónál a kívánttal ellentétes hatást eredményezhet. Ezt illetően lásd D. M. Tayler [J. of Hospital Infection, 18, (Supplement A), 141-146 (1991)], S. B. Prusiner és munkatársai [Comell Vet., 81, (2), 85-96 (1991)] és D. Matthews [J. Roy, Soc. Health, 3-5 (February 1991)] közleményeit.

Ennek megfelelően fennáll az olyan fibrin sebragasztó iránti igény, amelyet vírusos fertőzés bevitele vagy más káros hatások veszélye nélkül alkalmazhatunk a betegnél.

A találmány eljárásokat is szolgáltat ilyen készítmény és az ilyen fibrinmonomert tartalmazó készítmények és készletek (kitek) előállítására.

A találmány eljárásokat is szolgáltat ilyen készítmény és az ilyen nem térhálós fibrint tartalmazó készítmények és készletek előállítására.

A találmány ismertetése során a következő meghatározásokat használjuk.

HU 218 898 Β

Fibrin. - Fibrin alatt a fibrin bármely formáját értjük. A fibrinnek a találmány oltalmi körét semmiképpen sem korlátozó példái közé tartozik a fibrin I, fibrin II és dezBB fibrin. A fibrin lehet monomer vagy polimer formában, ahol a polimerforma lehet nem térhálós vagy térhálós.

Fibrinmonomer. - A fibrinmonomer alatt a fibrinnek minden olyan formáját, így a fibrin I-et, fibrin ΙΙ-t vagy dezBB fibrint értjük, amelyben a fibrin monomer formában vagy a készítményben oldhatóvá tehető oligomer formában van jelen, és ahol a fibrinmonomer átalakítható fibrinpolimerré.

Fibrinpolimer. - Fibrinpolimemek nevezzük a fibrin bármely olyan formáját, így a fibrin I-et, fibrin Il-t vagy dezBB fibrint értjük, amelyben az említett fibrin polimer formában van jelen, amely lehet akár nem térhálós, akár térhálós.

Nem térhálós fibrin. - A nem térhálós fibrin fogalomkörébe számítjuk a fibrinnek minden olyan formáját, így a fibrin I-et, fibrin ΙΙ-t vagy dezBB fibrint, amelyben az említett fibrin nem térhálós, és átalakítható térhálós fibrinné. A nem térhálós fibrin lehet fibrinmonomer vagy nem térhálós fibrinpolimer.

Térhálós fibrin. - A térhálós fibrin alatt a fibrinnek minden olyan formáját, így a fibrin I-et, fibrin ΙΙ-t vagy dezBB fibrint értjük, amelyben a fibrin térhálós fibrinpolimer.

A találmány eljárásokat is szolgáltat az ilyen fibrinmonomert tartalmazó készítmény és készítmények és készletek előállítására.

A találmány eljárást biztosít nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény és készítmények és készletek előállítására is.

A fibrinmonomert tartalmazó, találmány szerinti készítmény olyan készítmény, amely a fibrinmonomernek fibrinpolimerré átalakítható bármely formáját tartalmazza. A fibrinmonomemek a találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó példái közül megemlítjük a fibrin I monomert, fibrin II monomert vagy a dezBB fibrinmonomert, amelyek közül előnyös a fibrin I monomer. Természetesen fibrinmonomer jelentheti a fibrinmonomerek elegyeit is. Úgyszintén, a találmány céljai szempontjából, a fibrinpolimer alatt bármely olyan polimert értünk, amely fibrinmonomer polimerizációjából származik. így például a fibrin I monomer átalakítása fibrinpolimerré eredményezhet térhálós vagy nem térhálós fibrin I polimert és/vagy térhálós vagy nem térhálós fibrin II polimert, attól függően, hogy hogyan végeztük az átalakítási lépést.

Előnyös a fibrin I monomer, mert a fibrinogénnel ellentétben trombin vagy faktor XIII alkalmazása nélkül is könnyen átalakítható fibrinpolimerré. Valójában a fibrin I monomer spontán módon fibrin I polimert képezhet, amely fibrinrögként szerepelhet, függetlenül attól, hogy a fibrin I polimer térhálós vagy nem térhálós, vagy át van alakítva fibrin II polimerré. Így, minthogy a fibrin I polimer fibrin I monomerből való képződése spontán módon megy végbe, a fibrin I polimer képezhető trombin és faktor XIII nélkül, ezáltal kiküszöbölve a szarvasmarhatrombin használatával kapcsolatos problémákat. (Megjegyzendő, hogy ha a fibrin I monomert úgy alkalmazzuk, hogy az érintkezésbe kerül a beteg vérével, például egy sebfelületen, a beteg trombinja és faktor ΧΙΙΙ-a átalakíthatja a fibrin I polimert térhálós fibrin II polimerré.)

A nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény olyan készítmény, amely a nem térhálós fibrin bármely formáját tartalmazza. A nem térhálós fibrinnek a találmány oltalmi körét semmiképpen sem korlátozó példái közé tartozik a nem térhálós fibrin I, nem térhálós fibrin II és dezBB fibrin, amelyek közül előnyös a nem térhálós fibrin I. Természetesen jelen lehetnek a nem térhálós fibrin elegyei is. A találmány céljai szempontjából a „térhálós fibrin” körébe tartozik a fibrin minden olyan formája, amely a nem térhálós fibrinnek térhálós fibrinné való átalakításából származik. így például a nem térhálós fibrin I-nek térhálós fibrinné való átalakításából származó térhálós fibrin lehet térhálós fibrin I és/vagy térhálós fibrin II, attól függően, hogy hogyan hajtottuk végre az átalakítási lépést.

Előnyös a nem térhálós fibrin I, mert a fibrinogénhez viszonyítva könnyebben alakítható át térhálós fibrinné. Ténylegesen, úgy tartják, hogy a fibrin I-ből képződhet térhálós fibrin I, amely azután szerepelhet fibrin sebragasztóként. így a térhálós fibrin I-nek nem térhálós fibrin I-ből való képzése végrehajtható trombin nélkül, ezáltal elkerülve a szarvasmarhatrombin használatával kapcsolatos problémákat, bár szükséges lehet az aktivált faktor XIII. (Meg kell jegyeznünk, hogy ha nem térhálós fibrin I-et oly módon használunk, hogy a nem térhálós fibrin I érintkezésbe kerül a beteg vérével, például a sebfelületen, a beteg trombinja és faktor XIIIa átalakíthatja a fibrin I-et térhálós fibrin Il-vé.)

Úgyszintén a nem térhálós fibrin lehet polimer, oligomer vagy monomer, bár előnyös az oligomer vagy monomer, vagyis a fibrinmonomer. Ez annak a ténynek tulajdonítható, hogy a nem térhálós fibrin polimer-formában általában gélt képez, és ezért nagyon nehezen juttatható a kívánt testfelületre, ahol kevésbé bensőséges érintkezés jön létre a sejtekkel. Ezzel szemben az oligomer vagy monomer formájú nem térhálós fibrin oldható, ezért könnyebben juttatható a kívánt testfelületre, ahol a sejtekkel bensőségesebb érintkezés jön létre. A készítmény természetesen tartalmazhatja a nem térhálós fibrin ilyen formáinak elegyét is.

A fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény számára a forrás bármely olyan ismert vagy kifejlesztendő forrás lehet, amelynél az így nyert fibrinmonomer átalakítható fibrinpolimerré vagy az így nyert nem térhálós fibrin átalakítható térhálós fibrinné. A fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmények forrásainak a találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó példái közül megemlítjük a vért, előnyösen emlősök vérét, még előnyösebben az emberi vért, a fibrinogént és rekombináns fibrinogént kiválasztó sejttenyészeteket, amelyek közül előnyös a vér. Vér alatt itt a vérnek bármely formáját értjük, köztük például a teljes vért vagy fibrinogénkészítményeket. A vér felhasználható az autológ fibrin sebragasztók készítéséhez is.

HU 218 898 Β

Megfigyeltük, hogy a teljes vérből az alább leírtak szerint készült nem térhálós fibrin I-et akár fibrin I monomer, akár fibrin I polimer formában tartalmazó készítmény átalakítható térhálós fibrin ΙΙ-vé trombin, faktor XIII és a vér koagulációjához szükséges egyéb anyagok hozzáadása nélkül! Úgy véljük, hogy ez annak a ténynek tulajdonítható, hogy a teljes vérből előállított nem térhálós fibrin I-et tartalmazó készítmény tartalmaz még a plazmából származó elegendő mennyiségű protrombint, faktor XIII-at és más szükséges anyagokat úgy, hogy a nem térhálós fibrin I külső eredetű trombin vagy faktor XIII hozzáadása nélkül is átalakítható térhálós fibrin ΙΙ-vé. Ez a belső eredetű (endogén) protrombin és faktor XIII felhasználható a találmány szerinti fibrin sebragasztóban a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény komponenseként.

Meg kell azonban jegyeznünk, hogy ebből az endogén trombinból és faktor XIII-ból nem marad vissza ahhoz elegendő mennyiség, hogy a fibrinogént térhálós fibrin ΙΙ-vé egy fibrin sebragasztónak megfelelő reakciósebességgel alakítsa át. Úgy véljük, hogy több trombin szükséges a fibrinogénnek térhálós fibrin ΙΙ-vé azonos reakciósebességgel történő átalakításához, mint a nem térhálós fibrin I-nek térhálós fibrin ΙΙ-vé való átalakításához.

A három forrás mindegyike tartalmaz fibrinogént, amelyet át lehet alakítani fibrinmonomerré vagy nem térhálós fibrinné. Az ilyen átalakítólépésen kívül a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítménynek koncentrált formában kell jelen lennie. A fibrinmonomer koncentrációja előnyösen nem alacsonyabb körülbelül 10 mg/ml-nél, előnyösebben körülbelül 20 mg/ml és körülbelül 200 mg/ml között, még előnyösebben körülbelül 20 mg/ml és körülbelül 100 mg/ml között, legelőnyösebben körülbelül 25 mg/ml és körülbelül 50 mg/ml között van.

Ezenfelül előnyös, ha a fibrinmonomer vagy a nem térhálós fibrin nem dinamikus. A találmány céljai szempontjából a nem térhálós fibrint tartalmazó nem dinamikus készítmény azt jelenti, hogy az ilyen készítményben lévő nem térhálós fibrin nem térhálósodik az ilyen készítmény előállítása után legalább körülbelül 1,5 percig, előnyösen legalább körülbelül 3 percig, előnyösebben legalább körülbelül 30 percig. A találmány céljai szempontjából a fibrinmonomert tartalmazó nem dinamikus készítmény azt jelenti, hogy az ilyen készítményben lévő fibrinmonomer nem polimerizálódik az ilyen készítmény előállítása után legalább körülbelül 1,5 percig, előnyösen legalább körülbelül 3 percig, előnyösebben legalább körülbelül 30 percig, még előnyösebben legalább körülbelül 2 óráig. Valójában meg kell jegyezni, hogy a fibrinmonomert tartalmazó készítmény nem dinamikus lehet előállítása után legalább néhány napig, vagyis körülbelül 72 óráig.

A fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítményt előállíthatjuk vérből. Az eljárás hidrogénkötésű fibrinpolimert eredményezhet, amely a nem térhálós fibrin egy formája. Az ilyen polimert azután felhasználhatjuk a fibrin sebragasztó egyik komponenseként, vagy átalakíthatjuk fibrinmonomerré az oldható tételnek (szolubilizálásnak) nevezett eljárással az alábbiakban leírtak szerint. Előnyös továbbá, ha a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítményt steril körülmények között állítjuk elő.

A fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítményeket előállíthatjuk teljes vérből úgy, hogy donorból vért veszünk, előnyösen valamilyen antikoaguláns jelenlétében. A célra bármely antikoaguláns felhasználható. Az antikoagulánsoknak a találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó példáiként megemlítjük a heparint, EDTA-t, a hirudint, cifrátokat vagy bármely más olyan ágenst, amely közvetlenül vagy közvetve megakadályozhatja trombin képződését; ezek közül előnyösnek tartják a citrátot.

A fibrinogént tartalmazó plazmát azután elválasztjuk a teljes vértől. Erre a célra bármely elválasztási technika alkalmazható, például az ülepítés, centrifugálás vagy szűrés. A centrifúgálást végrehajthatjuk körülbelül 3000 g mellett körülbelül 10 percig tartó centrifúgálással. Ha azonban olyan plazmát kívánunk kinyerni, amely vérlemezkékben gazdag, akkor a centrifúgálást alacsonyabb g-érték (így 500 g) mellett például 20 percig végezzük. A plazmát tartalmazó felülúszót (szupernatánst) standard technikák alkalmazásával kaphatjuk meg.

A szűrést úgy végezhetjük, hogy a teljes vért olyan megfelelő szűrőn vezetjük át, amely elválasztja a vérsejteket a plazmától. Előnyös, ha a szűrő jó fehérjeáteresztést biztosító mikropórusos membrán.

Az így kapott plazmát azután kezeljük a fibringonnek fibrinmonomerré vagy nem térhálós fibrinné való átalakítása céljából. Ezt az átalakítást végrehajthatjuk bármely már ismert vagy még kidolgozandó technikával.

Egy előnyös technika fibrinmonomer vagy nem térhálós fibrin előállítására valamilyen trombinszerű enzimet alkalmaz, amelyek között szerepelhet a trombin is. Trombinszerű enzimnek itt bármely enzimet tekintünk, amely képes katalizálni a fibrinnek fibrinogénből való képződését. A trombinszerű enzimek közönségesen ismert forrásai a kígyómérgek. A trombinszerű enzimet előnyösen tisztítással nyerik ki a kígyóméregből. A trombinszerű enzim megválasztásától függően az ilyen trombinszerű enzim szabaddá tehet fibrinopeptid A-t, amelyből fibrin I képződik, fibrinopeptid B-t, amelyből dezBB fibrin I képződik, vagy mind fibrinopeptid A-t, mind fibrinopeptid B-t, amelyekből fibrin II képződik. Megjegyzendő, hogy a fibrinopeptid A-t és B-t szabaddá tevő trombinszerű enzimek aktivitásukat különböző sebességgel fejtik ki. Ezért az így keletkező készítmény állhat például a fibrin II és fibrin I elegyéből, vagy a fibrin II és a dezBB fibrin elegyéből.

Az 1. táblázatban a találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó módon felsoroljuk a találmány céljaira felhasználható kígyómérgek forrásait, az így nyert trombinszerű enzimek nevét és azt, hogy az ilyen enzimmel végzett kezeléssel milyen fibrinopeptid(ek)et teszünk szabaddá.

HU 218 898 Β

1. táblázat

Forrás	Az enzim neve	Szabaddá tett fibrinopeptid
Agkistrodon acutus	akutin	A
A. contortrix contortrix	venzim	B, (A)*
A halys Pallas		B, (A)*
A.(Calloselasma) rhodostoma	ankrod, arvin	A
Bothrops asper (B. atrox)	aszperáz	A
B. Atrox	batroxobin, reptilázreagens	A
B. insularis		A, B
B. jararaca	botropáz	A
B. Moojeni (B. Atrox)	batroxobin, defibráz	A
Lachesis muta muta		A, B
Crotalus adamanteus	krotaláz	A
C. Durissus terrificus		A
Trimeresurus flavoviridis	flavoxobin	A
T. gramineus		A
Bitis gabonica	gabonáz	A, B

* () csekély aktivitást jelent.

A kígyómérgekből kinyerhető trombinszerű enzimeket tárgyaló áttekintést lásd H. Pirkle és K. Stocker tanulmányában [Thrombosis and Haemostasis, 65, (4) 444-450 (1991)].

Előnyös trombinszerű enzimek a különösen B. Moojeniből, B. Maranhából és B. atroxból kinyert batroxobin és a különösen A. rhodostomából kinyert ankrod.

A fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint úgy állíthatjuk elő, hogy a plazmát összehozzuk a trombinszerű enzimmel, így lehetővé téve a plazmában lévő fibrinogénnek fibrinmonomerré való átalakulását. Az így keletkező fibrinmonomer azonban spontán módon polimerizálódik, és gélformában egy hidrogénhíd-kötésű polimert képez, amely elválik az oldat formájú szérumtól. A gél a nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény egyik formája.

Ez a nem térhálós fibringél kinyerhető például centrifugálással (3000 g mellett 10 perc), a nem térhálós fibrinnek a szérumtól való közvetlen manuális elválasztásával, közvetlen vagy nyomás alatti szűréssel, amit az elválasztott szérum eltávolítása követ. (Felhasználható egy 1-100 pm pórusméretű szűrő, például a Porex Inc. cég 20 pm pórusméretű zsugorított polipropilénszűrője, a Fluorotechniques Inc. cég 20-70 pm pórusméretű teflonszűrője vagy a Costar Inc. cég 22-46 pm pórusméretű nejlon 66 szűrője.)

A kinyerésnek ez a módja elválasztja a nem térhálós fibringélt a szérumtól, ami oldat, ezáltal a plazmával szemben koncentrálja a nem térhálós fibringélt. Megjegyzendő, hogy a nem térhálós fibringél tartalmaz még a plazmából származó legalább némi protrombint, faktor XIII-at és más szükséges anyagokat, úgyhogy a nem térhálós fibrin I külső eredetű trombin vagy faktor XIII hozzáadása nélkül is átalakítható térhálós fibrin IIvé. Ez a belső eredetű (endogén) protrombin és faktor XIII felhasználható a találmány szerinti fibrin sebragasztóban fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény komponenseként.

A kinyerési eljárás folyamán a centrifugális erő vagy a szűrésnél alkalmazott nyomás határozza meg, hogy mennyi szérumot választunk el a nem térhálós fibringéltől, amikor is minél nagyobb ez az erő vagy nyomás, annál koncentráltabb lesz a keletkező nem térhálós fibringél. Előnyös azonban, ha ez az erő vagy nyomás nem oly nagy, hogy így a protrombint és faktor XIII-at is eltávolítsuk a nem térhálós fibringéltől.

A nem térhálós fibringél így most már készen áll a fibrin sebragasztó komponenseként való felhasználásra mint a nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény egy formája. Megfigyeltük, hogy ha ilyen készítményt teljes vérből állítunk elő, akkor a készítményben az eredeti fibrinogénnek körülbelül 60%-a és körülbelül 90%-a közötti mennyisége jelen van, de természetesen nem térhálós fibrin formájában.

A nem térhálós fibrint tartalmazó készítményt előállítása után azonnal felhasználhatjuk. Valójában különösen előnyös az ilyen készítményt előállítása után azonnal felhasználni, ha a készítmény autológ. Abban az esetben, ha a készítményt nem használjuk fel közvetlenül előállítása után, úgy azt tárolhatjuk. A készítmény tárolása azt kívánja meg, hogy ezt megóvjuk, például úgy, hogy a készítményt fagyasztjuk vagy liofilizáljuk, vagy 4 °C-on tartjuk. Fagyasztott vagy liofilizált alakban a készítmény hónapokig stabilis. Ha a készítményt 4 °C-on tartjuk, úgy az várhatóan legalább napokig stabilis.

A fagyasztott készítményt használat előtt meg kell olvasztani.

Ez a technika, amely nem térhálós fibringélt eredményez, a fibrinogént átalakítja nem térhálós fibringéllé, és ezt a gélt lényegileg egy lépésben koncentrálja. Más módszer szerint, és kevésbé előnyösen, a fibrinogént a szokásos technikákkal, így krioprecipitációval és különböző reagensek, így polietilénglikol, dietiléter, etanol, ammónium-szulfát vagy glicin alkalmazásával végzett lecsapással koncentráljuk. A koncentrált fibrinogént azután a fent leírt technikák segítségével átalakíthatjuk nem térhálós fibringéllé, vagy előnyösen, minthogy a fibrinogén már koncentrált, a fibrinogént átalakíthatjuk fibrinmonomert tartalmazó készítménnyé anélkül, hogy előbb nem térhálós fibringélt kellene képezni. Ezt úgy hajthatjuk végre, hogy a koncentrált fibrinogént érintkezésbe hozzuk valamilyen kaotrop (chaotropic) ágenssel, hogy így fibrinogénoldatot kapjunk.

A kaotrop ágens szükséges ahhoz, hogy megakadályozza, hogy a fibrinogénnek a trombinszerű enzimmel történő érintkezésekor keletkező fibrinmonomer spon5

HU 218 898 Β tán polimerizálódjék. A kaotrop ágenst elegyítjük az ilyen fibrinogénkészítménnyel, és azután körülbelül 1-2 percig keverjük; így kapjuk a fibrinogénoldatot. A fibrinogént ezután átalakíthatjuk fibrinmonomerré például egy trombinszerű enzimmel a fent leírtak szerint, vagy az alábbiakban leírtak szerint valamilyen hordozón immobilizált trombinszerű enzimmel (Trombinszerű enzimen fibrinnek fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzimet értünk.)

Az alkalmas kaotrop ágensek közül megemlítjük a karbamidot, nátrium-bromidot, guanidin-hidrokloridot, kálium-tiocianátot, kálium-jodidot és kálium-bromidot. A kaotrop ágens előnyös koncentrációja körülbelül 0,2 és körülbelül 6,0 M között, a legelőnyösebben körülbelül 0,3 és körülbelül 2,0 M között van. Előnyös, ha a kaotrop ágens lehető legkisebb olyan mennyiségét használjuk, amely még megakadályozza a fibrinmonomer spontán polimerizálódását.

Megjegyzendő, hogy előnyös, ha kalciumion-forrást nem adunk a kaotrop ágenshez, amíg át nem kívánjuk alakítani a fibrinmonomert fibrinpolimerré az alábbiakban leírtak szerint. Ez biztosítja azt, hogy a fibrin monomer nem térhálósodik bármiféle endogén vérkoagulációs faktor aktiválóhatására.

A találmány egy előnyös megvalósításánál a trombinszerű enzimet immobilizáljuk valamilyen hordozón. Előnyös az ilyen megvalósítás, mert így könnyen elválaszthatjuk az immobilizált enzimet a plazmától, ezáltal megakadályozva azt, hogy a nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény szennyeződjék az enzimmel.

A találmány megvalósításánál bármely olyan hordozóanyag felhasználható, amelyhez a trombinszerű enzim hozzáköthető. A megfelelő hordozóknak a találmány oltalmi körét semmiképpen sem korlátozó példáiként megemlítjük a cellulózt, polidextránokat, agarózt, polisztirolokat, szílikagélt, poliakrilsavakat, poliakrilamidokat, poli(vinil-alkohol)-okat, üveggyöngyöt, poli(tetrafluor-etilén)-t, polikarbonátokat, kollagént, cellulózszármazékokat, teflont és annak kombinációit, amelyek közül előnyös a szilikagél, polisztirol és agaróz, legelőnyösebb az agaróz.

A találmány egy másik előnyös megvalósításánál a trombinszerű enzim olyan hordozóhoz van kötve, amely maga egy szűrő, vagy a trombinszerű enzim a szűrő egyik oldalán van, hozzákötve egy másik hordozóhoz, például üveggyöngyhöz. Különben a trombinszerű enzim átjutna a szűrőn. Ezért a szűrő pórusméretének olyannak kell lennie, hogy az immobilizált trombinszerű enzim ne mehessen át a szűrőn, de a nem térhálós fibrin átjuthasson. A nem térhálós fibrint úgy állítjuk elő, hogy a szűrő egyik oldalán érintkezésbe hozzuk a plazmát a trombinszerű enzimmel; így fibrinmonomert képezünk, amely a plazma többi részével együtt átjut a szűrőn. Az így kapott nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény szükségszerűen el van választva a trombinszerű enzimtől. A fibrinmonomer a szűrőn való áthaladás után spontán módon polimerizálódik, és nem térhálós fibrinpolimert képez.

Hogy a trombinszerű enzimet valamilyen hordozóhoz kötve immobilizálhassuk, a hordozót aktiválni kell.

Ezt bármely alkalmas technikával végrehajthatjuk. A hordozók derivatizálásánál rendelkezésre állnak különböző kémiai aktiválási eljárások, így a diazóniumcsoportok, izocianátocsoportok, sav-klorid-csoportok, savanhidridcsoportok, szulfonil-klorid-csoportok, dinitro-fluor-fenil-csoportok, izotiocianátocsoportok, hidroxicsoportok, aminocsoportok, N-hidroxi-szukcinimid-csoportok, triazincsoportok, hidrazinocsoportok, karbodiimidcsoportok, sziláncsoportok és cianogénbromid segítségével végzett aktiválási eljárások. Lásd

a) a 2440 254 Al számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírást (Pentapharm); b) a P. D. G. Dean, W. S. Johnson és F. A. Middle szerkesztőktől (1991) az IRL Press Oxford „Affinity Chromatography - a Practical Approach” című könyv 2. fejezetét (Activation Procedures), amelyet itt hivatkozásként megemlítünk.

Az előnyös aktivációs eljárást hidrazinocsoport segítségével végezzük. A hidrazinocsoporttal aktivált hordozó alkalmazása maximális %-ban /legalább körülbelül 30 és 50% közötti mértékben, miként azt az S 2238 jelű vizsgálattal - lásd Axelson G. és munkatársai közleményét [Thromb. Haemost., 36, 517 (1976] - végzett mérések mutatják/ eredményezi azt, hogy a trombinszerű enzim megtartja aktivitását úgy, hogy enzim lényegileg nem mosódik át. Úgyszintén alacsony pH-értékek (pH 4-6) alkalmazandók az enzim kapcsolásánál, hogy megakadályozzuk az enzim bomlását.

A hordozót általában valamilyen erősen reakcióképes vegyülettel aktiváljuk, amely azután valamilyen ligandumnak egy funkciós csoportjával, így hidroxi-, amino-, merkapto-, karboxi- vagy formilcsoportjával reagál, és így kovalens kötés képződik. A találmány szerinti felhasználásra előnyös aktivációs kémiai eljárások:

a) triazincsoport, előnyösen triazin-halogenid-csoport segítségével;

b) 2,2,2-trifluor-etánszulfonil-klorid (treszil-klorid) segítségével;

c) karbonil-diimidazol-csoport segítségével;

d) cianogén-bromid segítségével; és

e) hidrazino- vagy aminocsoport segítségével.

Az a)-d) esetekben a fehérjét amino-, merkaptovagy hidroxicsoporttal végzett reakción át kapcsoljuk, míg az e) esetben a fehérjét oxidált szénhidrátcsoporton (formilcsoporton) át kapcsoljuk. Ezeknek a kémiai eljárásoknak az alkalmazása maximális %-ban (legalább körülbelül 30 és 50% közötti mértékben, miként azt az S 2238 jelű vizsgálattal végzett mérések mutatják) eredményezi azt, hogy a trombinszerű enzim megtartja aktivitását úgy, hogy enzim lényegileg nem mosódik át.

A triazinaktiváláshoz két különböző módszert használunk. Az első módszernél a triazingyűrűt közvetlenül kapcsoljuk a felületi hidroxicsoportokhoz. Ez hasonló az alkalmazott cianogén-bromiddal végzett aktiválási módszerhez, amelynél a felületi diolcsoportok reagálnak a cianogén-bromiddal. A triazinaktiválásnál az agaróz hidroxicsoportjait reagáltatjuk triazinnal (cianurkloriddal).

A hordozót általában valamilyen erősen reakcióképes vegyülettel aktiváljuk, amely azután reagál a ligan6

HU 218 898 Β dum egy funkciós csoportjával, így hidroxi-, amino-, merkapto- vagy formilcsoportjával, ilyen módon kovalens kapcsolatot létesítve. A fennmaradó aktív csoportokat, amelyekhez nincs trombinszerű enzim kapcsolva, blokkolhatjuk nem reakcióképes vegyületekkel, így amino-etanollal, ecetsavanhidriddel vagy glicinnel, de ez nem lényeges. A találmány szerinti felhasználásra előnyös aktivációs kémiai eljárások a következők:

a) cianogén-bromiddal végzett aktiválás, majd ezt követően az enzim közvetlen kapcsolása a fehérje aminocsoportjain keresztül;

b) a hordozó aktiválása klór-triazinnal, majd ezt követően az enzim kapcsolása az amino-, hidroxi- vagy merkaptocsoportok útján;

c) a hordozó aktiválása diklór-triazinnal, majd az enzim kapcsolása az amino-, hidroxi- vagy merkaptocsoportokon át;

d) a hordozó 2,2,2-trifluor-etánszulfonil-kloriddal (treszil-kloriddal) végzett aktiválása, és ezt követően az enzim kapcsolása az amino-, hidroxi- vagy merkaptocsoportok segítségével;

e) a hordozó aktiválása adipinsav-hidraziddal vagy -hidrazinnal, azután az oxidált enzim kapcsolása a formilcsoportokon át;

f) a hordozó aktiválása valamilyen aminoligandummal, majd azt követően az oxidált enzim kapcsolása a formilcsoportok segítségével.

Valamennyi fenti előnyös módszernél hordozóként agarózt használunk, lehetséges azonban szilikagélt is alkalmazni. Amennyiben ez utóbbi hordozót használjuk, az előnyös aktivációs kémiai eljárások a következők:

a) (gamma-glicid-oxi-propil)-trimetoxi-szilánnal végzett aktiválás, és a trombinszerű enzim közvetlen kapcsolása a fehérje aminocsoportjain keresztül;

b) cianogén-bromiddal végzett aktiválása, majd az enzim közvetlen kapcsolása a fehérje aminocsoportjain keresztül;

c) (gamma-glicid-oxi-propil)-trimetoxi-szilánnal végzett aktiválás, majd az epoxidgyűrű felnyitásával diolcsoport kialakítása, amelyet azután cianogén-bromiddal aktiválhatunk. Az enzim közvetlen kapcsolását végrehajthatjuk a fehérje aminocsoportjain át;

d) (gamma-glicid-oxi-propil)-trimetoxi-szilánnal végzett aktiválás, majd amino-szilikagél-képzés ammóniaoldattal történő kezeléssel. Az amino-szilikagélt azután aktiválhatjuk cianur-kloriddal (triazinnal), és az enzimet az amino-, hidroxi- vagy merkaptocsoportok segítségével kapcsolhatjuk.

Az enzimnek az aktivált hordozóhoz való kapcsolását bizonyos pH-értékre pufferoltan kell végezni, hogy az enzim optimális megkötését biztosíthassuk. Általában, standard aktiválási technikák, így az enzimnek az aktivált hordozóhoz (gamma-glicid-oxi-propil)-trimetoxi-szilánnal történő kapcsolása és a fehérjének az aktív csoportokhoz cianogén-bromiddal történő kapcsolása esetén az enzim primer és szekunder aminocsoportjai pKa-értékénél 1-2 pH-egységgel magasabb pufferolás szükséges. Aktivátorként cianur-klorid használata azonban lehetővé teszi sokkal alacsonyabb pH-jú pufferek alkalmazását (az optimális kapcsolás pH-ja 4-6).

Egy másik módszer glükoproteineknek, így batroxobinnak inért hordozóhoz való kapcsolására azok szénhidrátcsoportjait veszi igénybe. Ennél először oxidáljuk a cukorcsoportot formilcsoporttá, majd savas pHnál közvetlen kapcsolást hajtunk végre egy aminocsoporthoz, így például egy hidrazidhoz. A kapcsoláshoz a pufferek széles választékát használhatjuk. Ezt illetően lásd például a 2. táblázatot.

2. táblázat

Példák az enzimek szilikagélés agarózhordozókhoz történő immobilizációjánál használt kapcsolópufferekre

Hordozó	Aktiválási módszer	Kapcsolópuffer
Szilikagél	(gamma-glicid- oxi-propil)- trimetoxi-szilán	0,1 M nátriumhidrogén-karbonát (pH=8 9)+ + 10 mM HEPES-oldat (pH=7,0)
Szilikagél	(gamma-glicid- oxi-propil)- trimetoxi-szi- lán+ciano- gén-bromid	0,1 M nátrium- hidrogén-karbonát (pH=8-9)+10mM HEPES-oldat (pH=7,0)
Szilikagél	cianogén- bromid	víz (pH= 7,0)+0,1 M nátrium-hidrogénkarbonát (pH=7-9)+ +10 mM HEPES-oldat (pH=7,0)
Agaróz	monoklór- triazin	50 mM nátriumacetát/1 M nátriumklorid-oldat (pH=4,0)
Agaróz	diklór-triazin	0,1 M káliumfoszfát/1 M nátriumklorid (pH=8,0-9,0)
Agaróz	triazil-klorid	50 mM káliumfoszfát/0,5 M nátriumklorid (pH =7,7)
Agaróz	hidrazid	50 mM nátrium-acetát (pH=5,5)+10 mM nátrium-bór-hidrid
Agaróz	amin	50 mM nátrium-acetát (pH=5,5)+10 mM nátrium-bór-hidrid

HEPES=[4-(2-hidroxi-etil)-l-piperazinil]-etánszulfonsav-nátriumsó

Aktiválás után a hordozó több aktív hellyel rendelkezik, mint amennyi az enzim megkötéséhez szükséges. Ezek a helyek, ha azokat nem dezaktiváljuk, kovalensen megköthetnek szennyező fehérjéket, ami befolyásolhatja az immobilizált enzim biológiai funkcióját.

Ezeket a feleslegben lévő csoportokat dezaktiválhatjuk úgy, hogy kovalensen rájuk kötünk kis, nem zavaró aminokat, így amino-etanolt.

Ha hidrazid- vagy aminoaktivált hordozókat alkalmazunk, akkor az enzimkapcsolás utáni maradék reaktív csoportokat ecetsavanhidriddel blokkolhatjuk.

HU 218 898 Β

Az immobilizálás módjából és a hordozótól függően enziminaktiválódás is bekövetkezik az immobilizációs eljárás folyamán. Szilikagél-hordozót és a legkívánatosabb kémiai aktiválási eljárást (például a cianogén-bromidot) alkalmazva az enzim aktivitásának 80-90%-áig terjedő része vész el. Agarózhordozót és cianur-kloridos aktiválást alkalmazva azonban sokkal kisebb az enzim aktivitásának vesztesége.

A hordozón immobilizált enzim hatásosságának jellemzése céljából két módszert használhatunk a hordozón immobilizált aktív enzim mennyiségének megállapítására : a véralvadási idő mérését (Clot Time Assay) [lásd Clauss A., Acta Haematol., 17, 237 (1957)] és az S 2238 jelű vizsgálatot [lásd Axelsson G. és munkatársai, Thromb. Haemost., 36, 517 (1976)].

Az enzim hordozóról való lemosódásának megállapítására a következő vizsgálatot végezhetjük.

A lemosódást vizsgálhatjuk a trombinszerű enzimnek radioaktív izotóppal való jelzésével, például I¹²⁵ batroxobin alkalmazásával. Mielőtt azonban elvégeznénk a lemosódási vizsgálatot, el kell távolítani minden nem kötött radioaktívizotóp-jelzést. Ezt elérhetjük úgy, hogy a hordozót egymás után mossuk a következőkkel: 50 ml 50 mM nátrium-acetát-oldat (pH=5,5); 100 ml 50 mM glicin/1 M nátrium-klorid-oldat (pH=3,0); 100 ml 50 nátrium-karbonát/1 M nátriumklorid (pH=10,0); 100 ml 50 mM nátrium-foszfát/1 M nátrium-klorid (pH=7,0); 100 ml víz és 100 ml 50 mM nátrium-foszfát/1 M nátrium-klorid (pH=7,0). Egy ilyen mosási eljárás után nincs kimutatható radioaktív jelzés a mosófolyadékban akkor, ha a radioaktív izotóppal jelzett kiindulási enzimmennyiségnek legalább 50%-át megkötöttük a hordozón.

a) Az enzim szükséges mennyisége

60-150 ml teljes vérből nyert 30-70 ml plazma kezeléséhez megkívánt enzimmennyiség 30-200 egység, körülbelül 10-15 perces kezelés után.

Ha hordozómátrixként agarózt használunk, 30-200 egység batroxobin nem térhálós fibrint körülbelül 7-20 perc alatt képez. Ez a rendszer hidrazidaktiválást és 0,25-1,0 g száraz agarózt alkalmaz. Ebben az esetben nem szükséges a fennmaradó aktív csoportok blokkolása.

b) Az immobilizált enzim reakciója a plazmafibrinogénnel

Az immobilizált enzimnek a plazmafibrinogénnel való reakcióját általában a következő módon hajtjuk végre: körülbelül 30-70 ml plazmát adunk az immobilizált trombinszerű enzimet tartalmazó szárított hordozó ismert mennyiségéhez. A szuszpenziót enyhén keverjük (pörgetés spirális keverővei vagy kézi keverés) körülbelül 7-20 percig. Ezen idő alatt a plazmában lévő fibrinogént az immobilizált enzim hasítja, amikor is fibrinopeptid A és/vagy fibrinopeptid B szabadul fel, ami hidrogénhíd-kötésű fibrin I polimer, hidrogénhíd-kötésű dezBB fibrinpolimer vagy hidrogénhíd-kötésű fibrin II polimer képződését eredményezi, ahol mindegyik polimer az immobilizált enzimhez van kapcsolódva.

Miként a fentiekben leírtuk, a hidrogénhíd-kötésű fibrinpolimer gél alakban keletkezik, és kinyerhető például centrifügálással (3000 g-vel 10 percig) vagy szűréssel (1 -50 pm pórusméretű membránszűrőn át). Ez a kinyerés elválasztja a hidrogénhíd-kötésű fibrinpolimert a szérumtól, és ilyen módon koncentrálja a polimert.

Megjegyzendő, hogy ha olyan trombinszerű enzimet alkalmazunk a plazmával, amely a faktor XIII aktiválását eredményezi, akkor előnyös, ha a plazma összetételét módosítjuk arra az időre, amikor a trombinszerű enzimet felhasználjuk, hogy így megakadályozzuk, hogy a nem térhálós fibrin, például a nem térhálós fibrin I vagy II, térhálós fibrint, így térhálós fibrin I-et vagy Il-t képezzen. Természetesen nem feltétlenül szükséges a plazma összetételét módosítani, ha az ilyen készítményt fibrin sebragasztóként közvetlenül az után használjuk, hogy a fibrinogént nem térhálós fibrinné alakítottuk át.

A plazma összetételét a nem térhálós fibrin térhálósodásának megakadályozására bármely ismert vagy még kifejlesztendő technikával módosíthatjuk. Ezt a faktor XIII aktiválására képes endogén trombinnak például hirudinnal vagy trombininhibitorokkal történő blokkolásával vagy a már aktivált faktor XIII hatásának például nehézfémekkel (higany) tiomerozállal vagy inhibitorhatású antitestekkel történő blokkolásával hajthatjuk végre. A fibrin I vagy II térhálósodásához kalciumionok jelenléte szükséges. így ha a kalciumot eltávolítjuk a plazmakészítményből, ezzel meggátolhatjuk a fibrin I vagy II térhálósodását. Ezt illetően lásd Carr és munkatársai [J. Biochem., 239, 513 (1986)], Kaminski és munkatársai [J. Bioi. Chem., 258, 10 530 (1983)] és Kanaide és munkatársai 13, 229 (1982)] tanulmányát. A fibrin I vagy II térhálósodósának megakadályozására a készítményhez adhatunk a kalciummal kelátot képező anyagokat. Ezek a kelátképzők megkötik a kalciumot, és ezáltal megakadályozzák a térhálósodást. E célra felhasználható bármely, a kalciummal kelátot képező anyag. A kalcium-kelátot képező anyagoknak a találmány oltalmi körét semmiképpen sem korlátozó példáiként megemlítjük a citromsavat, szacharinsavat, etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA-t), nitrilo-triecetsavat (NTA-t), hidroxi-etilén-diamin-triecetsavat (HEEDTA-t), etilén-diamin-di(o-hidroxi-fenilecetsavat) (EDDHA-t), etilénglikol-bisz(2-amino-etiléter)-tetraecetsavat (EGTA-t), dietilén-triamin-pentaecetsavat (DTPA-t), 1,2-diamino-ciklohexán-tetraecetsavat (DCTA-t), N,N-bisz(hidroxi-etil-glicin)-t, 4-(2hidroxi-etil)-1 -piperazin-etánszulfonsavat (HEPES-t) és N-(hidroxi-etil-imino)-diecetsavat (HIMDA-t) és ezek sóit, amelyek közül előnyösek a citromsav sói.

A találmány céljaira felhasználhatunk minden olyan sejttenyészetet, amely fibrinogén szekréciójára képes. A sejttenyészetben lévő fibrinogént átalakíthatjuk fibrinmonomerré vagy nem térhálós fibrinné ugyanazoknak a technikáknak a segítségével, amelyeket a plazmával kapcsolatban a fentiekben leírtunk. Az ilyen átalakítás előtt azonban előnyös a sejt maradványait eltávolítani.

Az eljárást a következő módon végezhetjük: HEPG2 sejteket tenyésztünk és tartunk fenn az emlőssejttenyészetekre leírt standard technikák szerint.

HU 218 898 Β

Erre vonatkozólag lásd még Liu és munkatársai közleményét [Cytotechnology, 5, 129-139 (1991)]. A sejteket átoltjuk 1:4 és 1:8 közötti átvágási arányban lombikokban lévő 10% borjúszérumot tartalmazó és 5% szén-dioxiddal pufferolt minimáltáptalajba.

°C-on vezetett 24-36 órai tenyésztés után a táptalajt eltávolítjuk, és helyettesítjük megfelelő proteázinhibitort és 2 nemzetközi egység/ml (2 IU/ml) heparint tartalmazó szérummentes táptalajjal. A tenyésztést folytatjuk további 24 órás időszakokig, három egymást követő szérummentes táptalajcserével.

A kondicionált táptalajt 3000 g-vel 10 percig centrifugáljuk, hogy így eltávolítsunk minden sejtmaradványt, majd a fibrinogént tartalmazó derített felülúszót 4-5 órán át enyhén keverjük valamilyen trombinszerű enzimmel. Előnyös, ha a trombinszerű enzim immobilizálva van. 500 ml táptalajra körülbelül 1,0 ml és körülbelül 50 ml közötti agaróz-trombinszerű enzim leülepedett térfogat megfelelő. Miként fent leírtuk, az agaróztól eltérő más hordozók is alkalmazhatók. A keletkező fibrinmonomer spontán polimerizálódik, és az immobil hordozó körül rakódik le.

A fibrinogént most már nem tartalmazó felülúszót a hordozó/fibrin gélről dekantáljuk, amely utóbbit azután mossuk 0,15 M vizes nátrium-klorid-oldat 1,0 ml eredeti állandó térfogathordozóra számolt körülbelül 10 ml és körülbelül 100 ml közötti négy változó térfogatával. Az így mosott gélt azután zsugorított üvegszűrőn vákuum segítségével félszárazra szívatjuk.

A fibrinogén szekréciójára képez sejttenyészetek használata különösen akkor előnyös, ha fibrinmonomert tartalmazó készítményt alkalmazunk. Ez azért van, mert úgy véljük, hogy az ilyen készítmény felhasználható fibrin sebragasztóként hasznos fibrinpolimer képzésére, tekintet nélkül arra, hogy a fibrinpolimer végül is térhálósodik-e. így, minthogy az ilyen sejttenyészet nem tartalmaz faktor XIII-at, ami lényeges a térhálósodóshoz, nem szükséges külső eredetű faktor XIII hozzáadása hatásos fibrin sebragasztó kialakításához.

A nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény előállítható rekombinás fibrinogénből is. Fibrinogént csupán újabban állítottak elő rekombináns DNS-technikával. Ezt illetően lásd S. Roy és munkatársai közleményét [The Journal of Biological Chemistry, 266,4758-4763 (1991)], amelynek tartalmát itt referenciaként megemlítjük. Úgy tűnik, hogy Roy és munkatársai alkotják azt az első csoportot, amelynek sikerült a fibrinogén mindhárom láncának expresszálása; szerintük a COS-sejtek expresszálják, összeállítják és szekretálják ezeket a láncokat, olyan formában, amely képes trombinindukált rögöt képezni. Az így kapott fibrinogénkészítmény azután felhasználható a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény előállítására, ugyanazokkal a technikákkal, amelyeket a fentiekben leírtunk a fibrinogént kiválasztó sejttenyészetekkel kapcsolatban. Előnyös azonban, hogy a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény előállítása előtt a sejttenyészetekkel kapcsolatban leírt technikák alkalmazásával eltávolítjuk a sejttörmelékeket. A sejtek maradványait eltávolíthatjuk centrifugálással vagy szűréssel.

A rekombináns fibrinogén alkalmazása különösen előnyös, ha fibrinmonomert tartalmazó készítményt használunk. Ez azért van, mert úgy véljük, hogy az ilyen készítmény felhasználható fibrin sebragasztóként hasznos fibrinpolimer képzésére, tekintet nélkül arra, hogy a fibrinpolimer végül is térhálósodik-e. Minthogy a rekombináns fibrinogén sejttenyészet nem tartalmaz faktor XIII-at, ami a térhálósodáshoz lényeges, nem szükséges külső eredetű faktor XIII hozzáadása hatásos fibrin sebragasztó kialakításához.

A fibrinogénnek nem térhálós fibrinné való átalakítása, például egy trombinszerű enzimmel, a fibrint hidrogénhíd-kötésű fibrinpolimer alakjában eredményez. Előnyös azonban, miként azt a fentiekben megtárgyaltuk, ha a nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény és - ez lényeges a fibrinmonomert tartalmazó készítmény szempontjából - oligomer- vagy monomerformában van. Ezt elérhetjük a nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény szolubilizálásával.

A szolubilizálás különösen előnyös, ha a nem térhálós fibrint hordozón immobilizált trombinszerű enzimmel képeztük. Ez azért van, mert a hordozón immobilizált trombinszerű enzim használata általában azt eredményezi, hogy a hidrogénkötésű nem térhálós fibrinpolimer kapcsolódik az ilyen immobilizált enzimhez, így, minthogy előnyös, ha a kapott készítmény nem tartalmazza a hordozót, a szolubilizálás lehetővé teszi, hogy a nem térhálós fibrint tartalmazó készítményből az immobilizált enzimmel együtt a hordozót is eltávolítsuk.

A szolubilizálás végrehajtható minden fibrinmonomert eredményező már ismert vagy még kifejlesztendő technikával. Elvégezhetjük a szolubilizálást úgy, hogy a nem térhálós fibrint tartalmazó készítményt érintkezésbe hozzuk megfelelő savas pufferoldattal, előnyösen körülbelül 5 alatti pH-jú, előnyösen körülbelül 1 és körülbelül 5 közötti pH-jú savas pufferrel. Az alkalmas savas puffereknek a találmány oltalmi körét semmiképpen sem korlátozó példáiként megemlítjük az ecetsavat, borostyánkősavat, glükuronsavat, ciszteint, krotonsavat, itakonsavat, glutaminsavat, hangyasavat, aszparaginsavat, adipinsavat és ezek sóit, amelyek közül előnyösek a borostyánkősav, aszparaginsav, adipinsav és az ecetsav sói, és a legelőnyösebb a nátrium-acetát. Megfigyeltük, hogy az előnyös savas pufferek sokkal hatásosabbak voltak, mint a többi vizsgált savas puffer.

A savas puffer előnyös koncentrációja körülbelül 0,02 M és körülbelül 1 M között, a legelőnyösebben körülbelül 0,1 M és körülbelül 0,3 M között van. Ez az előnyös koncentráció és készítmény ionerősségét biológiailag jobban elviselhetővé teszi.

Előnyös, ha a savas pufferből a lehető legkisebb olyan térfogatot használjuk, amely még szolubilizálja a nem térhálós fibrinmonomert tartalmazó vizes oldattá. Ez olyan fibrinmonomert tartalmazó vizes oldatot eredményez, amely fibrinmonomerre erősen koncentrált. 1 ml nem térhálós fibrint tartalmazó készítményhez általában körülbelül 1 ml és körülbelül 4 ml közötti mennyiségű savas puffer szükséges.

HU 218 898 Β

A savas puffért elegyítjük a nem térhálós fibrinnel, majd körülbelül 1 -2 percig erőteljesen keveijük, hogy a szolubilizálás biztosan teljessé váljék.

A szolubilizálást semleges pH-nál is végrehajthatjuk valamilyen kaotrop (chaotrop) ágens segítségével. Az alkalmas kaotrop ágensek közé tartozik a karbamid, nátrium-bromid, guanidin-hidroklorid, kálium-tiocianát, kálium-jodid és kálium-bromid. A kaotrop ágens előnyös koncentrációja körülbelül 0,2 M és körülbelül 6,0 M között, a legelőnyösebben körülbelül 3,5 M és körülbelül 5,0 M között van.

Miként a savas puffemél, előnyös a lehető legkevesebb kaotrop ágenst használni, amely még szolubilizálja a nem térhálós fibrint. 1 ml nem térhálós fibrint tartalmazó készítményhez általában körülbelül 1,0 ml és körülbelül 1,5 ml közötti mennyiségű kaotrop ágens szükséges.

A kaotrop ágenst elegyítjük az ilyen készítménnyel, és azután körülbelül 1-2 percig erélyesen keveijük a szolubilizálás teljessé tételének biztosítása céljából.

így a szolubilizálás fibrin monomert tartalmazó készítményt szolgáltat, és különösen fibrinmonomert tartalmazó vizes oldatot. Előnyös, ha a fibrinmonomer koncentrációja a vizes oldatban 10 mg/ml-nél nem kisebb, előnyösebben, ha körülbelül 20 mg/ml és körülbelül 200 mg/ml között, sőt még előnyösebb, ha körülbelül 20 mg/ml és körülbelül 100 mg/ml között, a legelőnyösebb, ha körülbelül 25 mg/ml és körülbelül 50 mg/ml között van.

Ha hordozón immobilizált trombinszerű enzimet használunk, ami azt eredményezi, hogy a nem térhálós fibrint tartalmazó készítményben ilyen enzim jelen van, a szolubilizálás után az immobilizált enzim eltávolítható a fibrinmonomert tartalmazó készítményből. Ezt végrehajthatjuk például bármely olyan szűrőn át történő szűréssel, amely az enzimet el tudja választani. Az alkalmas szűrők közé tartoznak a Porex Inc. cég 20 pm pórusméretű zsugorított polipropilénszűrői, a Fluortechniques Inc. cég 20-70 pm pórusméretű teflonszűrői, vagy a Costar Inc. cég 22-46 pm pórusméretű nejlon 66 szűrői.

Egy másik módszer annak biztosítására, hogy a fibrin monomert tartalmazó készítményben ne legyen jelen trombinszerű enzim, például batroxobin, abból áll, hogy a rendszerben oldható trombinszerű enzimet használunk, és az enzimet a hidrogénhíd-kötésű fibrinpolimer szolubilizálása után eltávolítjuk. Az enzim eltávolítását végezhetjük valamilyen affinitásmátrix alkalmazásával, így inért hordozóhoz kötött olyan ligandum segítségével, amely speciális affinitást mutat a trombinszerű enzim iránt, vagy ioncserélő vagy hidrofób interakciós hordozó segítségével, vagy a leghatásosabban az avidin-biotin rendszer használatával. Az avidin-biotin interakció a természetben található legerősebb nem kovalens kötésű konstanssal (K_DIS=10¹⁵ M) rendelkezik. Ezt illetően lásd E. A. Bayer és M. Wilchek közleményét [Methods of Biochemical Analysis, 26, 1 (1980)].

Ennél az eljárásnál a biotin kovalensen van kötve például a batroxobinhoz és a biotin-batroxobin konjugátumot (amely oldható) közvetlenül reagáltatjuk a plazmával, például 10 batroxobinegység (BU)+50 ml plazma reagáltatva 37 °C-on 10 percig. A keletkezett fibrin I polimert centrifugálással vagy szűréssel kinyerjük, és 30 mM kalcium-kloridot tartalmazó körülbelül 4 ml 0,2 M nátrium-acetát- (pH=4,0) pufferrel újra oldatba visszük. A fibrin I oldathoz moláris feleslegben adagolunk inért hordozóba, így agarózhoz kötött avidint. Az agaróz-avidin-biotin-batroxobin komplexet azután centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk a fibrin I-től, így fibrinmonomert tartalmazó olyan készítményt kapunk, amely lényegében mentes a batroxobintól, és amelyet az alábbiakban leírtak szerint újra polimerizálhatunk fibrin sebragasztó képzése céljából.

E szerint a találmány egy megvalósításánál a fibrinmonomert tartalmazó készítmény lényegében mentes a trombinszerű enzimtől. A „lényegében mentes” alatt azt értjük, hogy a trombinszerű enzimnek vagy a teljes mennyiségét eltávolítottuk, vagy hogy a készítményben visszamaradó trombinszerű enzim olyan alacsony koncentrációkban van jelen, amelyek nem képesek bármiféle nemkívánatos farmakológiai hatást kiváltani, így a találmány szerinti „lényegében mentes”-nek kívánt készítmények a trombinszerű enzimet a fibrinmonomer-készítmény előállításánál használt eredeti trombinszerű enzim körülbelül 0% és 10% közötti, előnyösen körülbelül 0% és 2% közötti mennyiségében tartalmazzák.

Bár a találmánynak ezek a megvalósításai olyan készítményeket írnak le, amelyeknél a trombinszerű enzimet az oldható fibrinné történő kívánt átalakítást követően eltávolítottuk, az olyan készítményeket is hasznosnak tartjuk - és mint ilyenek, a találmány tárgyát képezik - amelyeknél a trombinszerű enzim legnagyobb része vagy teljes mennyisége is megmaradt a készítményben.

A fibrinmonomert tartalmazó készítmény így most már kész a fibrin sebragasztó komponenseként való használatra. Megfigyeltük, hogy ha ilyen készítményt teljes vérből állítunk elő, akkor az eredeti fibrinogénnek körülbelül 60% és körülbelül 80% közötti mennyisége jelen van a készítményben, de természetesen fibrinmonomer alakjában.

A fibrinmonomert tartalmazó készítményt előállítása után azonnal lehet használni. Különösen előnyös az ilyen készítményt közvetlenül elkészülte után használni, ha a készítmény autológ. Ha a készítményt előállítása után nem azonnal használjuk, úgy azt lehet tárolni. A készítmény tárolása azt kívánja meg, hogy azt konzerváljuk, például a készítmény fagyasztásával vagy liofilizálásával, vagy 4 °C-on való tárolásával. Úgy véljük, hogy a készítmény fagyasztott vagy liofilizált formában hónapokig stabilis. Ha a készítményt 4 °C-on tartjuk, akkor az várhatóan legalább napokig stabilis.

Ha a készítmény fagyasztott, akkor azt használathoz fel kell olvasztani. Ha a készítmény liofilizált, előnyös a használatkor a készítményt a szolubilizálási lépésnél alkalmazott savas puffer hozzáadásával, ha a sav illékony, például ecetsav, vagy ha a kaotrop ágenst használtunk, akkor desztillált víz hozzáadásával újra ol10

HU 218 898 Β datba vinni. Miként a szolubilizálási lépésnél, úgy itt az újra oldatba vitelnél is a lehető legkisebb mennyiségű savas pufferoldatot vagy desztillált vizet használjuk, amely mellett a fibrinmonomer még oldható. A fibrinmonomert tartalmazó liofilizált készítmény újra oldatba vitele olyan fibrinmonomert tartalmazó vizes oldatot eredményezhet, amelyben a monomer koncentrációja 200 mg/ml-ig terjedhet. A liofilizálás előtt valamilyen térfogatnövelő ágenst, így mannitot vagy laktózt adhatunk a készítményhez. Más módszer szerint a liofilizált készítmény liofilizált formában is használható. Az ilyen forma különösen akkor előnyös, ha adjuvánsokat, például antibiotikumokat is kívánunk adni a készítményhez.

A fibrinmonomert tartalmazó készítmény gyakorlatilag bármely formában, így oldat, szuszpenzió, emulzió vagy szilárd anyag formájában lehet, amelyek közül előnyös az oldat. így például az ilyen készítmény lehet folyadék, gél, paszta vagy kenőcs. A készítmény természetesen lehet „granulátum” alakban is, például a liofilizált fibrinmonomert lehet, de nem szükséges, úgy kezelni közvetlenül a felhasználás előtt, hogy oldatot, emulziót vagy szuszpenziót képezzen.

Az oldatképzéshez felhasználható bármely alkalmas oldószer, de természetesen előnyös, ha az oldószer nem toxikus. Az oldószereknek a találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó példáiként megemlítjük a vizet, etanolt, glicerint és propilénglikolt, amelyek közül előnyös a víz.

A szuszpenzióra példaként szolgál az, hogy a fibrinmonomert tartalmazó készítményt elegyíthetjük szerves oldószerekkel is, így etanollal, 3,0 M feleslegű végső etanolkoncentrációig, és azzal rázzuk. Erre a fibrinmonomer csapadék formájában kiválik, és centrifugálással kinyerhetjük. A csapadékot mossuk a szerves fázissal, hogy így a szolubilizálási lépésnél alkalmazott vizes oldatot eltávolítsuk. A fibrinmonomer etanolos szuszpenzióját ezután közvetlenül alkalmazhatjuk kötszerre vagy más hordozóra, vagy akár közvetlenül a sebre. A szerves fázist hagyjuk elpárologni. Kötszer vagy más hordozó esetében a szuszpenziót újra hidratálhatjuk úgy, hogy az alkalmazás helyével érintkezésbe hozzuk, vagy valamely más módon, és a fibrint hagyjuk polimerizálódni.

Más módszer szerint a fibrinmonomemek erősen illékony fázissal, így dietil-éterrel készített szerves szuszpenzióját porlaszthatjuk, és a szuszpenziót permet alakjában juttathatjuk a kívánt helyre. Előnyös, ha az illékony fázis nem gyúlékony. Lehetséges a fibrinmonomemek valamilyen szerves szuszpenzióját a fülbe, orrba, torokba vagy tüdőbe juttatni bepermetezéssel vagy belégzéssel, vagy vérző nyelőcsövi vagy gyomortáji sebre lenyeléssel juttatni.

A találmány szerinti fibrin sebragasztót úgy használjuk, hogy a kívánt helyet érintkezésbe hozzuk a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítménnyel, és ezzel az érintkezésbe hozó lépéssel párhuzamosan a fibrinmonomert átalakítjuk fibrinpolimerré vagy a nem térhálós fibrint térhálós fibrinné, és így fibrinrögöt képezünk.

A találmány céljai szempontjából „kívánt hely” alatt azt a helyet értjük, ahol a fibrinrögöt képezni kívánjuk. Hogy mi a kívánt hely, vagy hol van, az a találmány szerinti fibrin sebragasztó alkalmazásától függ. Meg kell jegyezni azt is, hogy úgy véljük, a fibrin sebragasztó nemcsak embernél, hanem más emlősöknél is alkalmazható. Ha a fibrin sebragasztó fonása a vér, akkor előnyös, de nem feltétlenül szükséges, hogy a vér ugyanazon fajtól származzék, mint amelynél a fibrin sebragasztót majd felhasználjuk.

A találmány szerinti fibrin sebragasztó felhasználható minden, a fibrin sebragasztóra már ismert vagy még kidolgozandó alkalmazásra. A találmány szerinti módszerek, készletek vagy a fibrin sebragasztó felhasználható szövetek vagy szervek folytonossági hiányainak megszüntetésére, vérzés megállítására, sebek gyógyítására, műtéti sebek lezárására; az érrendszeri sebészetben való felhasználás körében tartozik a vérzéscsillapítás a disztális koszorúér anasztomózisa varratának vérzésénél, bal kamrai varratoknál, aortotomiánál és a kanülálási helyeken, a reoperációnál tapasztalható diffúz epimiokardiális vérzésnél, vénás vérző helyek, így pitvari, kávai vagy jobb kamrai járatok szivárgásainál. A találmány felhasználható az átültetés előtt a dakron artéria graft lezárásánál, szöveteknek a testen kívüli lezárásánál, sejttenyésztés céljaira fibrintömeg előállításához, károsult lép, máj és más parenchimás szervek vérzésének megállítására (ezáltal megmentve a szervet), tracheális és bronchiális anasztomózisok és légrések vagy tüdó-laceratiók lezárásánál; bronchiális csonkok, bronchiális fisztulák és nyelőcsövi fisztulák lezárásánál; intracerebrális AVM, máj AVM vaszkuláris radiológiájánál varratmentes hegesedés („Zipperi’-technika) és embolizáció céljából, vastagbél-angiodiszpláziánál, nyelőcsövi varixnál, gyomorfekélyt kísérő „pulzáló” gasztrointesztinális vérzéseknél stb. A találmány szerinti eljárás hasznos további vérzéscsillapítás céljára szaruhártya-transzplantációknál, orrvérzéseknél, mandulaműtétek után, a foghúzásoknál és más alkalmazásoknál. Ezt illetően lásd G. F. Gestring és R. Lermer közleményét (Vascular Surgery, 294-304, 1983, szeptember/október). A találmány szerinti fibrin sebragasztó különösen alkalmazható más véralvadási defektusokban szenvedő egyéneknél.

A fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmények adagolása a fibrin sebragasztó speciális felhasználásától függ, az adagolás azonban olyan legyen, hogy a készítmény szándékolt céljának eléréséhez szükséges hatásos mennyiséget tartalmazza. Fibrinmonomert vizes oldatban tartalmazó készítmény esetében körülbelül 3 ml és körülbelül 5 ml közötti készítményt általában elégségesnek tartunk hatásos fibrin sebragasztó céljaira. A készítmény felhasználásától függően azonban az adagolás körülbelül 0,05 ml és körülbelül 40 ml között lehet. Ha nem térhálós fibrint polimerformában tartalmazó készítményt használunk, vagy a készítmény szilárd alakban van, akkor a készítmény olyan mennyiségű fibrint tartalmazzon, amennyi az ilyen vizes oldatban van.

A találmány céljai szempontjából az említett érintkezésbe hozó lépéssel a fibrinmonomemek fibrinpoli11

HU 218 898 Β merre vagy a nem térhálós fibrinnek térhálós fibrinné „párhuzamosan történő” átalakítása azt jelenti, hogy az ilyen átalakítólépés és az ilyen érintkezésbe hozó lépés minden egyes lépés időperiódusán belül történik úgy, hogy a kívánt helyen fibrinrög képződjék. így „párhuzamosan” jelentheti azt, hogy a fibrinmonomert fibrin polimerré az érintkezésbe hozó lépés után alakítjuk át. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítményt, miután ezt a készítményt a kívánt helyre felvittük, olyan készítménynyel hozzuk érintkezésbe, amely képes a fibrinmonomert fibrinpolimerré vagy a nem térhálós fibrint térhálós fibrinné átalakítani. Az átalakítólépésnek általában az érintkezésbe hozási lépés után 0,5 percen belül meg kell történnie. Egyébként a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény, különösen akkor, ha a nem térhálós fibrin egy fibrinmonomer, elfolyhat a kívánt helyről.

A „párhuzamosan” azt is jelentheti, hogy az érintkezésbe hozó lépés és az átalakítólépés egyidejűleg megy végbe. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a kívánt helyet érintkezésbe hozzuk a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítménnyel ugyanakkor, amikor ezt a készítményt érintkezésbe hozzuk olyan készítménnyel, amely képes átalakítani a fibrinmonomert fibrinpolimerré vagy a nem térhálós fibrint térhálós fibrinné.

Végezetül és előnyösen a „párhuzamosan” azt is jelentheti, hogy az átalakítási lépés megkezdődhet már az érintkezésbe hozási lépés előtt, de nem oly sokkal az érintkezésbe hozó lépés előtt, hogy addig a fibrinmonomer teljes egészében átalakuljon fibrinpolimerré, vagy a nem térhálós fibrin teljes egészében átalakuljon térhálós fibrinné. Máskülönben az egész fibrinmonomer átalakul fibrinpolimerré, vagy a nem térhálós fibrin teljes egészében átalakul térhálós fibrinné már az érintkezésbe hozó lépés előtt, ami nagyon gyenge minőségű fibrin sebragasztót eredményez. A találmánynak ezt a megvalósítását úgy hajtjuk végre, hogy a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítményt még az érintkezésbe hozó lépés előtt elegyítjük egy olyan készítménnyel, amely a fibrinmonomert fibrinpolimerré vagy a nem térhálós fibrint térhálós fibrinné át tudja alakítani. Minthogy az átalakítási lépés teljessé válásához körülbelül 30 másodperc szükséges, ezért az átalakítási lépés ne kezdődjék többel mint körülbelül 30 másodperccel, előnyösen nem többel mint körülbelül 3 másodperccel az érintkezésbe hozási lépés előtt. Ez a megvalósítás előnyös, mert biztosítja azt, hogy a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény maximális mennyisége a kívánt helyen marad, és ugyanakkor kiváló fibrinrögöt képez.

A fibrinmonomemek fibrinpolimerré vagy a nem térhálós fibrinnek térhálós fibrinné való átalakítását végrehajthatjuk bármely már ismert vagy még kifejlesztendő technikával. Azonos az, hogy az átalakítást hogyan hajtjuk végre, függ a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény forrásától (teljes vér vagy rekombináns fibrinogén), a fibrinmonomer vagy nem térhálós fibrin formájától (fibrin I vagy dezBB fibrin) és kisebb mértékben attól, hogy az alkalmazás kívánt helye tartalmazza-e a beteg vérét vagy más testnedveit a fibrin sebragasztó alkalmazásának idejében.

Úgyszintén ha valamilyen külön készítményt, például alkalikus puffért alkalmazunk (ezt az alábbiakban megtárgyaljuk) az átalakítólépésnél, akkor a találmány szerinti módszer kivitelezhető például egy kéthengeres fecskendő segítségével. A kéthengeres fecskendő lehet

Y alakú, ezáltal lehetővé téve azt, hogy a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény és az átalakítási lépésnél alkalmazandó készítmény közvetlenül az érintkezésbe hozó lépés előtt keveredjék. Az

Y alakú kéthengeres fecskendő helyett még inkább használhatunk két nyílással ellátott kéthengeres fecskendőt. Ez lehetővé teszi, hogy a kívánt hellyel való érintkezés és a fibrinpolimerré vagy térhálós fibrinné történő átalakítás egyidejűleg menjen végbe. A kéthengeres fecskendő készítményeit permetezéssel is a kívánt helyre juttathatjuk. Lásd Η. B. Kram és munkatársai közleményét [The American Surgeon, 57, 381 (1991)].

Ha a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény forrása vér, akkor - mint a fentiekben megtárgyaltuk - véleményünk szerint a készítmény tartalmaz az ilyen fibrinmonomemek vagy nem térhálós fibrinnek térhálós fibrinné való átalakításához elegendő protrombint, faktor ΧΠΙ-at és más szükséges anyagot, például protrombinaktivátort. Ha a nem térhálós fibrin egy fibrinpolimer, vagyis a nem térhálós fibrint nem szolubilizáltuk, akkor a nem térhálós fibrint átalakíthatjuk a térhálós fibrinné az ilyen készítmény protrombinja és faktor ΧΙΙΙ-a aktiválóhatásával, hogy így térhálós fibrint kapjunk. Az ilyen aktiválást végrehajthatjuk úgy, hogy a készítményt kalciumion-forrással hozzuk érintkezésbe. A kalciumion-forrásoknak a találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó példájaként megemlítjük a kalcium-kloridot, előnyösen 30 mM koncentrációban. Más módszer szerint és kevésbé előnyösen, a kalciumionokat a vér is szolgáltathatja a kívánt helyen.

Ha a nem térhálós fibrin szolubilizálva van, vagyis fibrinmonomer, akkor az, hogy a fibrinmonomert hogyan alakítjuk át térhálós fibrinné, attól függ, hogy hogyan végeztük a szolubilizálást. Ha a nem térhálós fibrint savas pufferrel szolubilizáltuk, akkor térhálós fibrint úgy képezhetünk, hogy a fibrinmonomert tartalmazó készítmény pH-ját emeljük úgy, hogy a fibrinmonomer polimerizálódhat. Ezt úgy végezhetjük, hogy az ilyen készítményt érintkezésbe hozzuk bármely alkalmas lúgos pufferrel. Az alkalmas puffemek a találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó példái közül megemlítjük a HEPES-t, a nátrium-hidroxidot, káliumhidroxidot, kalcium-hidroxidot, hidrogén-karbonátpuffereket, így a nátrium-hidrogén-karbonátot, káliumhidrogén-karbonátot, a citromsav három fématommal képezett sóit, az ecetsav és kénsav sóit. Az előnyös lúgos pufferek közé tartozik a 0,5-0,75 M nátriumkarbonát/hidrogén-karbonát puffer (pH=10-10,5), a 0,5-0,75 M nátrium-hidrogén-karbonát/nátrium-hidroxid puffer (pH = 10,0), az 1,5 M glicin/nátrium-hid12

HU 218 898 Β roxid puffer (pH =10,0), a 0,5-1,0 M bisz(hidroxietil)-amino-etánszulfonsav (BES) (pH=7,5), az 1 M (hidroxi-etil)-piperazin-propánszulfonsav (EPPS) (pH = 8,5), a 0,5 M tricinpuffer (pH=8,5) az 1 M morfolino-propánszulfonsav (MOPS) (pH=8,0), az 1 M trisz(hidroxi-metil)-amino-etánszulfonsav (TES) (pH=8,0) és a 0,5 M ciklohexil-amino-etánszulfonsav (CHES) (pH =10,0), amelyek közül a legelőnyösebb a 0,5-0,75 M nátrium-karbonát/hidrogén-karbonát puffer (pH=10-10,5), 0,5-1,0 M bisz(hidroxi-etil)-amino-etánszulfonsav (BES) (pH=7,5), az 1 M (hidroxietil)-piperazin-propánszulfonsav (EPPS) (pH=8,5) és az 1 M trisz(hidroxi-metil)-amino-etánszulfonsav (TES) (pH=8,5).

Az alkalmazott lúgos puffer mennyiségének elegendőnek kell lennie a nem térhálós fibrin polimerizálásához. Előnyös, ha körülbelül tíz rész és körülbelül egy rész közötti mennyiségű fibrinmonomert tartalmazó készítményt elegyítünk körülbelül egy rész lúgos pufferrel. Sőt, még előnyösebb, ha ez az arány körülbelül 9:1. Megjegyzendő, hogy az előnyös arány függ a puffer megválasztásától és a fibrinpolimer kívánt „erősségétől”. A fibrinpolimer kívánt erőssége természetesen függ a fibrin sebragasztó végső felhasználásától.

Ha a szolubilázálást valamilyen kaotrop ágenssel hajtottuk végre, akkor a fibrinmonomert átalakíthatjuk térhálós fibrinné úgy, hogy a fibrinmonomert tartalmazó készítményt hígítjuk, például desztillált vízzel. A hígítást úgy kell végezni, hogy minimális mennyiségű hígítószert használunk. A kaotrop ágens hígítás után keletkező koncentrációja általában körülbelül 0,5 és körülbelül 0,1 mól között legyen.

A fibrinmonomert tartalmazó készítmény pH-jának emelésén vagy a kaotrop ágens hígításán kívül a térhálós fibrin képzéséhez előnyös, ha az ilyen készítmény protrombinját és faktor XIII-ját aktiváljuk. Az ilyen aktiválást végrehajthatjuk úgy, hogy a készítményt érintkezésbe hozzuk valamilyen kalciumion-forrással. A kalciumion-forrás részét képezheti a lúgos puffemek vagy a szolubilizációs lépésnél alkalmazott savas puffemek. A kalciumion-forrásoknak a találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó példái között szerepelhet a kalcium-klorid, előnyösen 30 mM koncentrációban. Más módszer szerint, és kevésbé előnyösen, a kalciumionokat a vér is szolgálhatja a kívánt helyen.

Megjegyzendő, hogy ha a lúgos puffer egy karbonát/hidrogén-karbonát puffer, akkor a kalciumionforrást a savas pufferhez kell adni a szolubilizációs lépés során. Ez azért van, mert a kalcium-klorid nem oldódik a karbonát/hidrogén-karbonát pufferben. Előnyös, ha a kalciumion-koncentráció a savas pufferoldatban körülbelül 5 mM és körülbelül 150 mM között, előnyösebben körülbelül 5 mM és körülbelül 50 mM között van.

Úgy véljük, hogy a keletkező fibrinrög térhálós fibrin II lesz, függetlenül attól, hogy a nem térhálós fibrinnek milyen formája, azaz fibrinmonomer vagy fibrinpolimer van jelen. Olyan esetben, ha a nem térhálós fibrin dezBB fibrin, akkor úgy véljük, hogy szükséges lehet a dezBB fibrinnek térhálós fibrinné való átalakításához még további trombinforrás is. Ilyen trombinforrás lehet például a beteg plazmája, amikor is ilyen plazmát adunk a nem térhálós fibrint tartalmazó készítményhez.

Ha a kívánt hely vért tartalmaz, és fibrinmonomert tartalmazó készítményt használunk, vagyis a nem térhálós fibrin szolubilzálva lett, akkor ez a vér felhasználható a kaotrop ágens hígítójaként vagy a fibrinmonomert tartalmazó készítmény pH-jának emelésére. így nem kell hígítószert vagy lúgos puffért használni. Ennél a megvalósításnál előnyös, ha a szolubilizációs lépésnél használt savas puffer vagy kaotrop ágens tartalmazza a kalciumion-forrást. Ennél a megvalósításnál a fibrinmonomert tartalmazó készítményt felvihetjük valamilyen szilárd hordozóra is, például pólyára, sebészeti varratra, protézisre vagy kötszerre, amely érintkezésbe kerül a kívánt hellyel. Az ilyen hordozót azután érintkezésbe hozzuk a kívánt hellyel, amíg például kialakul a fibrinrög.

Meg kell azonban jegyezni, hogy ha a fibrinmonomert tartalmazó készítmény nem tartalmaz a térhálós fibrin képzéshez elegendő, az eredetéből megmaradt protrombint és faktor XIII-at, az ilyen készítmény azért még felhasználható fibrin sebragasztóként, mert a fibrinmonomert polimerizálódása önmagában használható a fibrinrög képzéséhez. Továbbá az ilyen készítmény még felhasználható térhálós fibrin képzésére kalciumion-forrás és aktivált faktor XIII (vagy az aktivált faktor XIII prekurzorainak) és, adott esetben, trombinnak a hozzáadásával is. Az ilyen kalciumforrás, aktivált faktor XIII és trombin hozzáadható a fibrinmonomert tartalmazó készítményekhez. Az aktivált faktor XIII hozzáadható a fibrinmonomert tartalmazó készítményhez körülbelül 1,0 és 20 faktor XIII egység/ml nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény közötti végső koncentrációban. Más módszer szerint a faktor XIII-at szolgáltathatják a vér vagy más testnedve a kívánt helyen, vagy szolgáltathatja autológ plazmának a fibrinmonomert tartalmazó készítményhez való hozzáadása. A kalciumion-forrásoknak a találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó példái közül megemlítjük a kalcium-kloridot, előnyösen 30 mM koncentrációban. Más módszer szerint, és kevésbé előnyösen, a kalciumionokat szolgáltathatják a vér és más testnedvek a kívánt helyen. Körülbelül 4 és körülbelül 500 trombin egység/ml fibrinmonomert tartalmazó készítmény közötti mennyiségű trombint adagolhatunk, vagy a trombint szolgáltathatja maga a kívánt hely is.

Ha a nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény forrását fibrinogént vagy rekombináns fibrinogént kiválasztó sejtkultúrák képezik, vagyis a nem térhálós fibrin nem lett szolubilizálva, akkor kalciumion- és aktivált faktor XIII- (vagy aktivált faktor XIII prekurzor-) forrást kell alkalmazni a térhálós fibrin képzéséhez. Használni kell a faktor XIII-at, mert a nem térhálós fibrinnek ezek a forrásai faktor XIII-at egyáltalán nem tartalmaznak. Az aktivált faktor XIII a nem térhálós fibrint tartalmazó készítményhez körülbelül 1,0 és körülbelül 20 egység faktor XIII/ml nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény közötti mennyiségben adható. Más módszer szerint a faktor XIII-at szolgáltathatják a vér

HU 218 898 Β és más testnedvek a kívánt helyen, vagy szolgáltathat autológ plazma hozzáadása a nem térhálós fibrint tartalmazó készítményhez. A találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó kalciumforrások közül megemlítjük a kalcium-kloridot, előnyösen 30 mM koncentrációban. Más módszer szerint, és kevésbé előnyösen, a kalciumionokat szolgáltathatják a vér és vagy más testnedvek a kívánt helyen. Adott esetben trombin is adható az ilyen készítményhez annak biztosítására, hogy térhálós fibrin II képződjék. Körülbelül 4 és körülbelül 500 trombinegység/ml nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény közötti mennyiségben adagolható trombin, vagy azt szolgáltathatja maga a kívánt hely.

Ha a nem térhálós fibrin szolubilizálva van, vagyis ha fibrinmonomer formában van jelen, akkor az, hogy a fibrinmonomert hogyan alakítjuk át fibrinpolimerré, attól függ, hogy hogyan történt a szolubilizálás, például savas pufferrel vagy kaotrop ágenssel. A fibrinpolimer képzését a fentiekben leírtakkal azonos eljárásokkal hajthatjuk végre. Ezt a fibrinpolimert azután kívánt esetben átalakíthatjuk térhálós fibrinné kalciumion- és aktivált faktor XIII- (vagy aktivált faktor XIII prekurzor-) forrásnak és, adott esetben, trombinnak a fibrinmonomert tartalmazó készítményhez a fentiekben leírtak szerinti hozzáadásával. Az aktivált faktor XIII a nem térhálós fibrint tartalmazó készítményhez körülbelül 1,0 és körülbelül 20 egység faktor XIII/ml nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény közötti végső koncentrációban adható. Más módszer szerint a faktor XIII-at szolgáltathatják a vér vagy más testnedvek a kívánt helyen, vagy származhat autológ plazmának a nem térhálós fibrint tartalmazó készítményhez való adagolásából. A találmány oltalmi körét semmiképp sem korlátozó forrásként megemlítjük a kalcium-kloridot, előnyösen 30 mM koncentrációban. Más módszer szerint, és kevésbé előnyösen, a kalciumionokat szolgáltathatják a vér vagy más testnedvek a kívánt helyen. Körülbelül 4 és körülbelül 500 egység trombin/ml fibrinmonomert tartalmazó készítmény közötti koncentrációban adagolhatunk trombint, vagy azt szolgáltathatja maga a kívánt hely.

A találmány szerinti fibrin sebragasztók tartalmazhatnak adjuvánsokat is, így antibiotikumokat, például gentamicint, cefotaximot, nebacetint és sisomicint; hisztamin H₂-antagonistákat, például ranitidint; rákellenes szereket, például az OK-432 jelűt. Ezt úgy valósíthatjuk meg, hogy a fibrinmonomert vagy nem térhálós fibrint tartalmazó készítményhez a kívánt antibiotikumot adjuk. Lásd M. C. H. Gersdorff és T. A. J. Robillard [Laryngoscope, 95, 1278-80 (1985)]; A. Ederle és munkatársai [Ital. J. Gastroenterol., 23, 354-56 (1991)]; V. Ronfard és munkatársai [Burns, 17, 181-84 (1991)]; T. Sakurai és munkatársai [J. Control. Release, 18,39-43 (1992)]; T. Mondén és munkatársai [Cancer, 69, 636-42 (1992)]; F. Greco [J. of Biomedical Materials Research, 25, 39-51 (1991)] és Η. B. Kram és munkatársai [Journal of Surgical Research, 50, 175-178 (1991)] közleményét, amelyeket itt referenciaként tekintünk. Más adjuvánsokat is adhatunk a készítményhez, így fibronektint, fibrinolízisinhibitorokat, például aprotinint, alfa-2 antiplazmint, PAI-l-et, ΡΑΙ-2-t, 6-amino-hexánsavat, 4-(amino-metil)-ciklohexánasavat, kollagént vagy keratinocitokat. Úgy véljük, hogy az ilyen adjuvánsok adagja azonos a szokásos fibrin sebragasztókban alkalmazottakéval.

A találmány tárgyát képezik fibrinsebragasztó-készletek is. A készlet első komponensként tartalmazhat fibrinmonomert tartalmazó készítményt, második komponensként a fibrinmonomer polimerizálására képez lúgos puffért vagy desztillált vizet, attól függően, hogy hogyan hajtottuk végre a szolubilizálási lépést. A második komponens, adott esetben, kalciumion-forrást is tartalmazhat. Más módszer szerint az első komponens lehet nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény, a második komponens pedig lehet kalciumion-forrás. Ha a nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény előállításához felhasznált fibrinogénforrás fibrinogént kiválasztó sejttenyészet vagy rekombináns fibrinogén, akkor az első komponens lehet nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény, a második komponens pedig lehet kalciumionforrás és a harmadik komponens aktivált faktor XIII.

1. példa

Plazma előállítása teljes vérből

100 ml teljes vért felfogunk a kereskedelemben kapható valamilyen antikoagulánst, így citrátot/foszfátot/glükózt tartalmazó standard vérzacskóban. A vért ezután átvisszük centrifugálásra alkalmas tárolóedénybe, és szobahőmérsékleten 3000 g-vel 10 percig centrifugáljuk. A körülbelül 50 ml tiszta felülúszó plazmát dekantáljuk, az alakos (sejtes) komponenseket pedig eldobjuk.

A plazma teljes vérből történő előállításának egy másik módszere szűréssel történik. Ennél szintén 100 ml teljes vért gyűjtünk valamilyen megfelelő antikoagulánst, így citrátot/foszfátot/glükózt tartalmazó zacskóban. A vért ezután perisztikus szivattyú segítségével recirkuláltatjuk egy jó fehérjeáteresztő képességgel rendelkező szűrőn keresztül. A membránon keresztül létrejövő nyomásesés a plazmát átjuttatja, míg a sejtes komponensek visszamaradnak a recirkuláló vérben, így körülbelül 50 ml plazmát gyűjtünk további feldolgozásra.

2. példa

Batroxobin immobilizálása agarózgyöngyön

Az immobilizációs tanulmányoknál agarózgyöngyöt (Pharmacia) használunk. A felhasznált agaróz 4%-ban térhálós, és a részecskék 90%-ának mérete 45 pm és 165 pm közé esik. Ez az anyag hidratálva térfogatának ötszörösére duzzad. A batroxobint először 0,1 M nátrium-perjodát-oldattal, szobahőmérsékleten, befedett szcintillációs edényben 1 órán keresztül oxidáljuk. A batroxobint Sephadex PD-10 gélpermeációs oszlopon átvezetve tisztítjuk. Az oxidált batroxobint azután hidrazidaktivált agarózgélhez kötjük úgy, hogy 1,75 g nedves gélre számolt 30-200 egység batroxobint szobahőmérsékleten 50 mM nátrium-acetátot (pH=5,5) és 10 mM nátrium-bór-hidridet tartalmazó oldatban egy éjszakán át állni hagyjuk. A nem kötött

HU 218 898 Β batroxobint azután eltávolítjuk a gélről úgy, hogy mossuk egymás után a következőkkel: 50 ml 50 mM nátrium-acetát-oldattal (pH = 5,5), 100 ml 50 mM glicin/1 M nátrium-klorid vizes oldattal (pH = 3,0), 100 ml 50 mM nátrium-karbonát/1 M nátrium-klorid vizes oldattal (pH =10,0), 100 ml 50 mM nátriumfoszfát/1 M nátrium-klorid vizes oldattal (pH=7,0), 100 ml vízzel, 100 ml 50 mM nátrium-foszfát/1 M nátrium-klorid vizes oldattal (pH=7,0), 100 ml 50 mM nátrium-foszfát vizes oldattal (pH=7,0).

3. példa

Az immobilizált enzim reakciója a plazmafibrinogénnel nem térhálós fibrint tartalmazó készítményt képezve

350 mg immobilizált enzimet körülbelül 50 ml centrifugált vagy szűrt plazmához adunk, és óvatosan keverjük 7-20 percig, amíg nem térhálós fibrin I polimerrög képződik.

A fibrin I polimert a vele összekapcsolódott immobilizált enzimmel együtt kinyerjük vagy a) 3000 g-vel 10 percig centrifugálva, majd a felülúszó szérumdekantálással történő eltávolításával vagy b) megfelelő, fehérjét kevéssé megkötő szűrőn át szűrve, majd a megszűrt szérum eldobásával és a fibrin I polimer+immobilizált enzim további kezelésre való megtartásával. Ez a fibrin I polimer a nem térhálós fibrint tartalmazó készítmény egy példája.

4. példa

A fibrin I polimer szolubilizálása, fibrinmonomert tartalmazó készítmény képzése A fibrin I polimer szolubilizálását úgy hajtjuk végre, hogy a kinyert fibrin I polimer+immobilizált enzimhez 30 mM kalcium-klorid-puffert tartalmazó körülbelül 1-4 ml 0,2 M nátrium-acetát-oldatot (pH=4,0) adunk. Az elegyet ezután 2 percig erélyesen keveijük, például egy Vortex-keverővel. Az immobilizált enzimet ezután a fibrin I oldatnak 1-20 pm pórusméretű, fehérjét kevéssé megkötő szűrőn keresztül történő szűrésével távolítjuk el. Az agaróz-enzim komplexet a szűrő visszatartja, így lehetővé téve a rendszerből való eltávolítását. Az így kapott, fibrin I monomerkészítményt tartalmazó oldat más plazmafehéij ékkel együtt koncentrált savas fibrin I monomert tartalmaz. Körülbelül 100 ml teljes vérből általában körülbelül 4-5 ml fibrinmonomert tartalmazó készítményt kapunk, amelyben a fibrinmonomer koncentrációja körülbelül 25 mg/ml és körülbelül 35 mg/ml között van. Ez így most készen áll a betegnél való alkalmazásra vagy önmagában, vagy újrapolimerizáló pufferrel együtt extrudálva fibrin sebragasztó képzése céljából.

5. példa

A fibrin I monomert tartalmazó készítmény újrapolimerizálása

Az újrapolimerizálást úgy valósítjuk meg, hogy a fibrin I monomert tartalmazó oldatból 9 részt összekeverünk valamilyen alkalmas újrapolimerizáló puffer, például 0,75 M nátrium-karbonát/nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldat (pH=10,0) egy részével. A keverési arány változtatható, azonban a 9:1 arány megtartja a fibrin magas koncentrációját a végtermékben. A koextrúziónál a fibrin I spontán módon újrapolimerizálódik, és átalakul fibrin ΙΙ-vé, amit a fibrin térhálósodása követ körülbelül 30 perc alatt.

A találmány oltalmi körét semmiképpen sem korlátozzák a leírt speciális megvalósítások, amelyeket a találmány sajátos szempontja egyedi szemléltetésének szántunk. A találmány különböző módosításai az itt bemutattakon és leírtakon kívül nyilvánvalókká lesznek a fenti leírások alapján a szakterületen járatosak előtt. Az ilyen módosítások a mellékelt igénypontok tárgykörén belül kell, hogy essenek.

6. példa

Az agaróz hidrazidaktiválása és az enzim kapcsolása a szénhidrátcsoporton keresztül A cukrot először oxidálni kell, hogy a batroxobin szénhidrazid-aktivált hordozóval, hogy szabad formilcsoportok keletkezzenek. Ezt a következő módon hajtjuk végre.

1-7 mg batroxobint oldunk 2 ml víz és 0,2 ml 0,1 M vizes nátrium-perjodát-oldat elegyében. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk, ezután Sephadex G-25 gélszűrő oszlopon áteresztve sómentesítjük. Az oxidált aktív batroxobint az oszlopról 0,9 tömeg/térfogat %-os nátrium-klorid-oldattal eluáljuk.

A kereskedelemben beszerezhető standard hidrazidaktivált agaróz (például a Bio-rad Laboratories Ltd.től, Egyesült Királyság) vagy bármely szabad terminális aminocsoporttal rendelkező hasonló készítmény felhasználható a szabad formilcsoportok közvetlen kapcsolására. Ha hidrazidaktivált agarózt használunk, a kapcsolás a következőképpen történik:

1-5 g hidrazidaktivált agarózgélt szuszpendálunk 4 ml 50 mM vizes nátrium-acetát-oldatban (pH=5,5). A szuszpenzióhoz 1 ml 10 mM nátrium-bór-hidrid-oldatót adunk együtt a kívánt mennyiségű (tipikusan 100-200 batroxobinegység/g nedves gél) oxidált batroxobinnal.

A reakcióelegyet szobahőmérsékleten egy éjszakán át keverjük, majd zsugorított üvegszűrőn mossuk egymás után a következő oldatokkal: 50 ml 50 mM vizes nátrium-acetát-oldat (pH=5,5); 100 ml 50 mM glicin/1 M nátrium-klorid-oldat (pH=3,0); 100 ml 50 mM nátrium-karbonát/1 M nátrium-klorid-oldat (pH =10,0); 100 ml 50 mM nátrium-foszfát/1 M nátrium-klorid-oldat (pH=7,0); 100 ml víz; 100 ml 50 mM nátrium-foszfát/1 M nátrium-klorid-oldat (pH=7,0); és végül 100 ml 50 mM nátrium-foszfát-oldat (pH=7,0).

Az immobilizált batroxobin plazmával történő reakcióját a következőképpen hajtjuk végre.

ml plazma pH-ját ecetsav hozzáadásával 5,5-re visszük le. Ehhez a plazmához (nedves géltömegre számolva) körülbelül 1,75 g agarózon immobilizált 100-200 batroxobinegységgel ekvivalens batroxobint adunk. A reakcióelegyet 37 °C-on 10-15 percig inkubáljuk, utána a pH-t nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásá15

HU 218 898 Β val 7,4-re emeljük. A fibrin I polimerizálása csaknem azonnal bekövetkezik. A fibrin I polimert 3500 percenkénti fordulattal 10 percig centrifugálva kinyeqük, és 30 mM kalcium-kloridot tartalmazó 3-4 ml 0,2 M vizes nátrium-acetát-oldatban (pH=4,0) újra feloldjuk. Az agaróz-enzim komplexet ezután a fibrin I-től centrifugálással vagy szűréssel elválaszthatjuk. A fibrin I-et ezután újrapolimerizáljuk úgy, hogy 9 rész fibrin I oldatot 1 rész 0,75 M vizes nátrium-karbonát/nátrium-hidrogén-karbonát oldathoz (pH = 10,0) adunk, hogy így fibrin sebragasztó képződjék.

7. példa

Az enzimbefogó (enzyme capture) rendszer biotin— avidin használatával

Az enzimbefogást úgy hajtjuk végre, hogy először biotinilezzük a batroxobint és a biotin-enzim komplexet befogjuk az immobilizált avidinnel (ami 6% térhálós agarózhoz kötött avidin).

Fehérjék biotinilezését számos reagens segítségével elvégezhetjük. Jelen esetben a vízben nem oldódó N-hidroxi-szukcinimid-biotint (NHS-biotint) használjuk (amely beszerezhető az Amersham cégtől). 50 ml NHS-biotint 1 mg batroxobinhoz adunk 8,6 pH-nál, és az oldatot szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk. A biotinilezőreagens feleslegét Sephadex G-25 oszlopon végzett gélszüréssel távolítjuk el, eluensként 0,1 M kálium-foszfát-oldatot (pH=7,5) használva.

ml plazmában 10 batroxobinegységgel ekvivalens biotin-batroxobin komplexet adunk, és az elegyet 37 °C-on 10 percig inkubáljuk. A fibrin I polimert 3500 percenkénti fordulatszámmal 10 percig tartó centrifugálással kinyerjük, és 30 mM kalcium-kloridot tartalmazó 3-4 ml 0,2 M nátrium-acetát-oldatban (pH=4,0) újra feloldjuk. A fibrin 1-hez avidin-agarózt (kereskedelmileg beszerezhető a Sigma Chemical Co.tól) adunk 0,2 g nedves gél/ml fibrin I mennyiségben. Az elegyet szobahőmérsékleten 10 percig inkubáljuk, majd 2000 percenkénti fordulatszámmal 10 percig centrifugáljuk. Az így előállított fibrin I lényegében mentes a batroxobintól. A fibrin sebragasztó képzéséhez a fibrin újrapolimerizálását a 6. példában leírt módon hajtjuk végre.

Claims (68)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás fibrinpolimert tartalmazó sebragasztó előállítására, azzal jellemezve, hogy

   a) előállítunk egy fibrinmonomert tartalmazó készítményt; és

   b) az előbbi készítményt egy, a fibrinmonomer fibrinpolimerré való átalakítására képes ágenst tartalmazó másik készítménnyel érintkeztetve fibrin sebragasztót képezünk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett fibrinmonomert a nem térhálós fibrin I-ből, dezBB fibrinből és nem térhálós fibrin II-ből álló csoportból választjuk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett fibrinmonomer a fibrin I.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett fibrinmonomer a fibrin II polimer.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett fibrinmonomer térhálós.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett készítmény fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzimtől mentes.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett készítményt vérből, fibrinogént kiválasztó sejttenyészetekből és rekombináns fibrinogénből álló csoportból választott fonásból állítjuk elő.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett fonás a vér.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett készítmény tartalmaz még protrombint, protrombinaktivátorokat és faktor XIII-at.
10. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett vér autológ vér.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett átalakításra képes ágenst valamilyen lúgos puffer vagy desztillált víz közül választjuk.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett lúgos pufferhez vagy desztillált vízhez még valamilyen kalciumion-fonást is adunk.
13. 13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett lúgos puffért a nátrium-hidroxid-, kálium-hidroxid-, kalcium-hidroxid-, hidrogén-karbonát-pufferek, a citromsav három fématommal képezett sói, ecetsavas sók és kénsavas sók közül választjuk.
14. 14. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett lúgos puffért 0,5-0,75 M nátriumkarbonát/-hidrogén-karbonát oldat (pH = 10-10,5), 0,5-0,75 M nátrium-hidrogén-karbonát/nátrium-hidroxid oldat (pH = 10,0), 1,5 M glicin/nátrium-hidroxid oldat (pH=10,0), 0,5-1,0 M bisz(hidroxi-etil)-aminoetánszulfonsav-oldat (BES) (pH=7,5), 1 M (hidroxietil)-piperazin-propánszulfonsav-oldat (EPPS) (pH=8,5), 0,5 M tricinpufferoldat (pH=8,5), 1 M morfolino-propánszulfonsav-oldat (MOPS) (pH=8,0), 1 M trisz (hidroxi-metil)-amino-etánszulfonsav-oldat (TES) (pH = 8,0) és 0,5 M ciklohexil-amino-etánszulfonsav-oldat (CHES) (pH = 10,0) közül választjuk.
15. 15. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett lúgos puffért 0,5-0,75 M nátriumkarbonát/-hidrogén-karbonát oldat (pH = 10-10,5), 0,5-1,0 M bisz(hidroxi-etil)-amino-etánszulfonsav-oldat (BES) (pH=7,5), 1 M (hidroxi-etil)-piperazin-propánszulfonsav-oldat (EPPS) (pH=8,5) és 1 M trisz(hidroxi-metil)-amino-etánszulfonsav-oldat (TES) (pH=8,0) közül választjuk.
16. 16. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sebragasztót két különálló hengert tartalmazó kéthengeres fecskendőből adagolva állítjuk elő, ahol az egyik hengerben van a fibrint tartalmazó készítmény, és a másik henger tartalmazza az említett puffért vagy desztillált vizet.
17. 17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizes készítményt állítunk elő, amelynek pH16

    HU 218 898 Β ja 1 és 5 között van, vagy tartalmaz valamilyen kaotrop ágenst.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett készítményhez adunk még egy, az ecetsav, borostyánkősav, glükuronsav, cisztein, krotonsav, itakonsav, glutaminsav, hangyasav, aszparaginsav, adipinsav és ezek sóinak oldatai közül választott savpuffert.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy savpufferként a borostyánkősav, aszparaginsav, adipinsav vagy az ecetsav sóinak oldatát alkalmazzuk.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy savpuffer nátrium-acetát-oldatot alkalmazunk.
21. 21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,02 M és 1 M közötti koncentrációjú savpuffert alkalmazunk.
22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,1 M és 0,3 M közötti koncentrációjú savpuffert alkalmazunk.
23. 23. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kaotrop ágensként karbamidot, nátrium-bromidot, guanidin-hidrokloridot, kálium-tiocianátot, kálium-jodidot vagy kálium-bromidot alkalmazunk.
24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kaotrop ágenst 0,2 M és 6,0 M közötti koncentrációban alkalmazzuk.
25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kaotrop ágenst 3,5 M és 5,0 M közötti koncentrációban alkalmazzuk.
26. 26. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrinmonomer koncentrációja az említett vizes oldatban 10 mg/ml és 200 mg/ml között van.
27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a koncentráció 20 mg/ml és 100 mg/ml között van.
28. 28. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy még valamilyen kalciumion-forrást is adunk a készítményhez.
29. 29. Eljárás fibrinogénből származó, a fibrinogén és egy fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzim érintkezésekor képződő nem térhálós fibrinmonomert tartalmazó sebragasztó készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a fibrinogén maradékától elkülönített nem térhálós fibrinpolimert szolubilizálva fibrinmonomert tartalmazó sebragasztó készítménnyé formázzuk.
30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzim valamilyen hordozón immobilizálva van, és az említett érintkezésbe hozó lépés azt eredményezi, hogy a fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzim kapcsolódik az említett nem térhálós fibrinpolimerhez, és a fibrinmonomert tartalmazó sebragasztó készítménytől elkülönül.
31. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hordozó cellulóz, polidextrán, agaróz, polisztirol, szilikagél, poliakrilsav, poliakrilamid, poli(vinil-alkohol), üveggyöngy, polikarbonát, kollagén, cellulózszármazék, poli(tetrafluor-etilén) vagy ezek keveréke.
32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hordozó agaróz vagy szilikagél.
33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzim valamilyen szűrőn van immobilizálva, vagy a fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzim olyan hordozón van immobilizálva, amely egy szűrő egyik oldalán van, és az említett érintkezésbe hozó lépés után a keletkező fibrinmonomer áteresztődik a szűrőn.
34. 34. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szolubilizálást egy 5-nél alacsonyabb pH-jú savas pufferoldat vagy valamilyen kaotrop ágens segítségével hajtjuk végre.
35. 35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy savas pufferoldatként ecetsav, borostyánkősav, glükuronsav, cisztein, krotonsav, itakonsav, glutaminsav, hangyasav, aszparaginsav, adipinsav és ezek sóinak oldatát alkalmazzuk.
36. 36. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a savas pufferoldathoz vagy kaotrop ágenshez még kalciumion-forrást is adunk.
37. 37. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztólépést szűréssel hajtjuk végre.
38. 38. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzimként fibrinogén fibrin I-gyé való átalakítására képes enzimet alkalmazunk.
39. 39. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzimként az ankrodot vagy a batroxobint alkalmazzuk.
40. 40. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló említett exogén enzimet a fibrinmonomert tartalmazó sebragasztó készítményből úgy távolítjuk el, hogy a fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzimet biotinilezzük, és a fibrinmonomert tartalmazó sebragasztó készítményt immobilizált avidinnel érintkezésbe hozva a fibrin fibrinogénből való képződését katalizáló exogén enzim eltávolítása után a fibrinmonomert tartalmazó sebragasztó készítmény marad vissza.
41. 41. Eljárás térhálós fibrint tartalmazó sebragasztó előállítására, azzal jellemezve, hogy

    a) előállítunk egy nem térhálós fibrinmonomert tartalmazó készítményt; és

    b) az előbbi készítményt egy, a nem térhálós fibrinmonomert térhálós fibrinné való átalakítására képes ágenst tartalmazó készítménnyel érintkeztetve fibrin sebragasztót képezünk.
42. 42. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nem térhálós fibrint nem térhálós fibrin I, dezBB fibrin és nem térhálós fibrin II közül választjuk.
43. 43. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nem térhálós fibrin a fibrin I.
44. 44. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt vérből, fibrinogént kiválasztó sejttenyészetekből vagy rekombináns fibrinogénből készítjük.

    HU 218 898 Β
45. 45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt autológ vérből készítjük.
46. 46. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nem térhálós fibrinmonomert térhálós fibrinné való átalakítására képes ágensként valamilyen kalciumforrást alkalmazunk.
47. 47. Nem térhálós fibrinmonomert tartalmazó vizes sebragasztó készítmény, amelyben a fibrinmonomer koncentrációja 10 mg/ml és 200 mg/ml között van, és a készítmény 1-5 közötti pH-jú.
48. 48. A 47. igénypont szerinti vizes sebragasztó készítmény, amelyben a fibrinmonomer koncentrációja 20 mg/ml és 100 mg/ml között van.
49. 49. A 47. igénypont szerinti vizes sebragasztó készítmény, amelyben a fibrinmonomer fibrin I, dezBB fibrin vagy fibrin II.
50. 50. A 49. igénypont szerinti vizes sebragasztó készítmény, amelyben a fibrinmonomer fibrin I.
51. 51. Fibrinmonomert tartalmazó vizes sebragasztó készítmény, amelyben a fibrinmonomer koncentrációja 20 mg/ml és 200 mg/ml között van.
52. 52. Az 51. igénypont szerinti vizes sebragasztó készítmény, amelyben a fibrinmonomer koncentrációja 20 mg/ml és 100 mg/ml között van.
53. 53. Az 51. igénypont szerinti vizes sebragasztó készítmény, amelyben a fibrinmonomer fibrin I, dezBB fibrin vagy fibrin II.
54. 54. Az 53. igénypont szerinti vizes sebragasztó készítmény, amelyben a fibrinmonomer fibrin I.
55. 55. Vizes sebragasztó készítmény, amely

    a) fibrinmonomert és

    b) kalciumion-forrást tartalmaz, amelyben a kalciumionok koncentrációja 5 mM és 200 mM között van.
56. 56. Fibrinmonomert tartalmazó sebragasztó készítmény, amely készítmény szilárd formában van.
57. 57. Az 56. igénypont szerinti sebragasztó készítmény, amely vizes oldat liofilizálásával készült.
58. 58. Sebragasztó készítmény, amely fibrinmonomert és antibiotikumok, hisztamin H₂-antagonista, egy rákellenes gyógyszerhatóanyag, fibronektin és valamilyen fibrinolízisinhibitor által alkotott csoportból választott vegyületet tartalmaz.
59. 59. Sebragasztó készlet, amely

    a) egy fibrinmonomert tartalmazó készítményből; és

    b) egy lúgos puffért vagy desztillált vizet tartalmazó készítményből áll.
60. 60. Az 59. igénypont szerinti sebragasztó készlet, amelyben a lúgos puffer vagy a desztillált víz még kalciumion-forrást is tartalmaz.
61. 61. Sebragasztó készlet, amely

    a) egy nem térhálós fibrint tartalmazó készítményből; és

    b) egy kalciumion-forrást tartalmazó készítményből áll.
62. 62. A 61. igénypont szerinti sebragasztó készlet, amely tartalmaz még aktivált faktor XIII-at is.
63. 63. Szilárd hordozó, amelynek felületén fibrinmonomert tartalmazó sebragasztó készítmény van.
64. 64. A 63. igénypont szerinti szilárd hordozó, amely sebpólya, sebészeti varrat, protézis vagy kötszer.
65. 65. A 63. igénypont szerinti szilárd hordozó, amelyen a monomer fibrin I, dezBB fibrin vagy fibrin II.
66. 66. A 65. igénypont szerinti szilárd hordozó, amelyen a monomer fibrin I.
67. 67. A 63. igénypont szerinti szilárd hordozó, amelyen a sebragasztó készítmény szilárd formában van.
68. 68. A 67. igénypont szerinti szilárd hordozó, amelyre a sebragasztó készítményt fibrinmonomert tartalmazó vizes oldat liofilizálásával vittük fel.