SE447579B - Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition och anvendning av kompositionen vid bestemning av fibrinolysparametrar - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 447 579 2 Ingen av dessa metoder har dock kommit till någon mera vid- sträckt användning, vilket bekräftar att de inte är helt till- fredsstäflande. De beskrivna metoderna ger sålunda upphov till denaturçring av fibrinet, vilket yttrar sig i en tendens hos fibrinet.att, sedan det àterförts till fysiologiska betingelser, bilda fällning i stället för gel. Vidare tål de beskrivna pre- paraten av lösligt fibrin ej att frysas/tinas eller frystorkas/ rekonstitueras med bibehàllna egenskaper.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt föreliggande uppfinning har det överraskande visat sig, att tillsats av en lägmolekylär peptid innehållan- de den speciella aminosyrasekvensen -L-prolyl-L-arginyl- till ett speciellt fibrinderivat, nämligen desAA-fibrin, ger ett helt och hållet solubiliserbart preparat, och detta vid så låg koncentration av peptiden, att möjligheter till helt nya tillämpningar i samband med bestämning av fibrinolyskomponenter öppnas eller att noggrannheten och reproducerbarheten för i och för sig kända tillämpningar drastiskt förbättras, så att sådana till- lämpningar också kan komma till verklig nytta i praktiken.

Dessa resultat var ej förutsägbara för en fackman på omrâdet. Visserligen beskrev Laudano och Doolittle är 1979 i Proceedings of the National Academy of Science 75: 3085-3089 att vissa peptider, speciellt glycyl-L-prolyl-L-argínyl-L-prolin, har förmåga att kraftigt minska polymerisationshastigheten för fibrin, men baserat på detta kunde de utomordentliga resultat, som föreliggande uppfinning har visat sig ge, omöjligen förut- sägas. Sålunda har det t.ex. visat sig att desAA-fibrin solu- biliseras fullständigt i en komposition enligt uppfinningen vid koncentrationsniväer där samma peptid överhuvudtaget inte har någon påvisbar solubiliserande inverkan på desAABB-fibrin.

I detta sammanhang kan nämnas att desAA-fibrin skiljer sig från "normalt" desAABB-fibrin därigenom att endast det ena paret fibrinopeptider (A-peptiderna) har avspjälkats. DesAA- fibrin går vanligen under benämningen fibrin I, medan desAABB- fibrin benämnes fibrin Il, vilka benämningar för enkelhets skull också kommer att användas nedan.

UI 10 15 20 25 30 35 447 579 3 En annan väsentlig skillnad som har konstaterats mellan fibrin I och fibrin II är att de i närvaro av samma peptid skiljer sig väsentligen från varandra vad gäller förmågan att stimulera vävnadsaktivatorn vid aktivering av plasminogen. Så- lunda har*en komposition enligt uppfinningen innehållande fibrin I visat sig vara cirka 50 % effektivare än motsvarande komposition innehållande fibrin II.

Dessa och andra egenskaper kommer att belysas mera nedan i samband med definitionen av uppfinningen och i samband med de konkreta utföringsexemplen.

Föreliggande uppfinning avser närmare bestämt en solubi- liserbar, fibrinbaserad komposition, vilken utmärkes av att fibrinet är desAA-fibrin eller desAA-fibrin från vilket de C-terminala delarna av a-kedjorna har avlägsnats genom enzy- matisk digestion, och att den innefattar en solubiliserande mängd av peptiden glycyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolin.

Det i kompositionerna enligt uppfinningen använda desAA- -fibrinet framställes lämpligen genom selektivt avlägsnande av enbart fibrinopeptid A från fibrinogen medelst enzymer, t.ex. batroxobin utvunnet ur gift från ormar av släktet Bothrops.

Den solubiliserande mängden av den lågmolekylära peptiden kan naturligtvis bestämmas av fackmannen på området från fall till fall med hjälp av rutinförsök. Vanligtvis gäller dock att den lägsta halten för praktisk användning av kompositíonen bör vara cirka 0,4 mg per ml bruksfärdig komposition eller bruks- färdigt preparat. Den övre gränsen är svårare att generalisera och påverkas av olika faktorer, såsom ekonomiska hänsynstagan- den och avsedd användning av kompositionen. Ekonomin kan så- lunda komma att avgöra lämplig övre gräns, då man av kostnads- skäl givetvis inte använder högre koncentration än vad som är erforderligt för avsett syfte. Vid tillämpningen som stimula- tor vid bestämning av vävnadsaktivatorn finns dock en övre gräns för användbar slutkoncentration av peptid. Denna är cirka 10 mg/ml och motiveras av att aktiveringsreaktionen häm- mas vid peptidkoncentrationer överstigande cirka 0,03 mg/ml och av att minst en trehundradelsvolym fibrinpreparat måste tillsättas vid reaktionens start (0,033 x 300 = 10). Generellt sett gäller därför att ett lämpligt intervall är 0,4 - 10 mg/ml bruksfärdigt preparat, varvid ett speciellt intressant inter- 10 15 25 '30 35 447 579 4 vall kan vara 0,6 - 4 mg per ml. Optimalt resultat kan i många fall uppnås vid en koncentration av cirka 2 mg/ml.

Kompssitionen enligt uppfinningen innefattande fibrín I solubilisprat med den angivna peptiden föreligger lämpligen i fysiologisk buffert, vilket exempelvis innebär att den utan olägenhet kan införas i cirkulationssystemet, t.ex. medelst intravenös injektion.

Framställningen av kompositionen enligt uppfinningen är ej förknippad med några speciella problem utan kan lämpligen ske genom att fibrinogenet först digereras med enzym och att den resulterande fibringelen upplöses genom tillsats av peptid.

Vid behov kan enzymet därefter avlägsnas t.ex. med matris- bundna antikroppar mot detsamma.

Såsom omtalades ovan hänför sig uppfinningen även till vissa speciella användningar av kompositionen, vilka har möj- liggjorts eller väsentligt förbättrats i förhållande till känd teknik genom de utomordentliga egenskaper hos det lösliga fi- brinpreparat som uppfinningen resulterar i. Dessa användningar kan hänföras till bestämning av viktiga fibrinolysparametrar, varvid som bakgrund gäller följande.

Fibrínavsättningar i cirkulationssystemet nedbrytes till lösliga komponenter av serinproteaset plasmin. Detta enzym bildas av plasmaproteinet plasminogen genom inverkan av plasminogenaktivatorer. De kända plasminogenaktivatorerna är serinproteaser, vilka spaltar en Arg-Val-peptidbindning i plasminogenmolekylen till bildning av det aktiva tvåkedje- enzymet plasmin.

Plasmin uppvisar viss substratspecificitet och spjälkar företrädesvis peptidbindningar i fibrinmatrisen och i fibrin- prekursorn fibrinogen. Denna specificitet är långt ifrån abso- lut, och plasminkänsliga bindningar finns i de flesta protei- nerna (många av de otaliga trypsinkänsliga bindningarna spjälkas också av plasmin). Plasmin bildat under fibrinolys kan därför skada plasmaproteiner och cellytproteiner. För att undvika detta har organismen utvecklat mekanismer som lokaliserar genereringen av plasmin och begränsar dess verkan. Två sådana mekanismer är allmänt erkända, nämligen: 10 15 20 25 30 447 579 1. Vävnadsplasminogenaktivatorn (t-PA), en viktig plasminogen- aktivator i blodet, är effektiv enbart i närvaro av fibrin.

I fråñvaro av fibrin är hastigheten för t-PA-katalyserad plasminogenaktivering låg, men i närvaro av fíbrin ökar reaktionshastigheten upp till 1000 gånger. Plasmingenere- ringen är sålunda lokaliserad till fibrin, somdändd nedbrytes.

När fibrinet väl har nedbrutits, återgår hastigheten för plasmingenereringen till låga värden. 2. Genererat plasmin som ej är involverat i fibrinnedbrytningen inhiberas snabbt av plasmíninhibitorn n2-antiplasmin. Effek- ten av genererat plasmin är sålunda begränsad till närheten av koagulatet.

' Normalt har fibrinkoagulat en användbar funktion, och de bör därför ej utsättas för alltför tidig lysis. Naturen har av denna anledning utvecklat mekanismer som gör att detta undvikes, och dessa mekanismer börjar f.n. bli mera förståeliga. Den nu upp- täckta snabbverkande ínhibitdrn gentemot plasminogenaktivatorer kan utgöra basen för en sådan mekanism. Förändringar,under fibrino- lys,av fibrinets stimulatoriska egenskaper kan utgöra en annan.

Föreliggande uppfinning hänför sig till vissa använd- ningar, vilka har samband med ovanstående. En första användning av kompositionen innebär närmare bestämt att denna utnyttjas i samband med påvisning eller kvantifiering av aktiviteten av en- zymet vävnads-plasminogenaktivator (t-PA), varvid fibrinet potentierar enzymets aktivitet gentemot det fysiologiska sub- stratet plasminogen eller något syntetiskt substrat.

Metoden i sig, dvs. analys med avseende på vävnads- plasminogenaktivatorn, finns tidigare beskriven av Rànby et al i Thrombosis Research (1982) 27: 743-749. Enligt uppfinningen har det dock visat sig, att fibrinkombositionen enligt uppfin- ningen är avsevärt mera effektiv än den komposition som beskrivs i publikationen vad gäller förmågan att stimulera vävnads- 10 15 20 25 30 35 447 579 g aktivatorn vid aktivering av plasminogen. Vidare gäller att vid utspädning av fibrin I solubiliserat med ifrågavarande pep- tid fibringel bildas långsammare än vid utspädning av fibrin I solubiliserat med karbamid. Detta är av avsevärd praktisk be- tydelse där solubiliserat fibrin I användes som "stimulator" vid bestämning av t-PA enligt ovannämnda metod. Effekterna av kompositiönen enligt uppfinningen i dessa sammanhang kommer att belysas mera nedan.

En alternativ användning enligt uppfinningen av komposi- tionen innebär att den utnyttjas för att påvisa spârmängder fibrin lösta i biologiska vätskor, t.ex. blodplasma, varvid kom- positionen användes som standard. Denna användning möjliggöres av bl.a. den gynnsamma gelbildningskinetik som uppvisas av fibrinkompositionen enligt uppfinningen, och kompositionen upp- finningen torde därmed bli av stor praktisk betydelse. Halten fibrin i blod eller i blodplasma förväntas nämligen bli en viktig diagnostisk parameter för bl.a. tillståndet DIC (disseminerad intravasal koagulation).

En andra alternativ användning enligt uppfinningen inne- bär användning av kompositionen för att mäta eller studera fibrinolytisk aktivitet in vitro eller in vivo genom tillsats av kompositionen och registrering av det däri ingående fibrinets nedbrytning. I samband med denna användning bör framhållas det unika att fibrinkompositionen enligt uppfinningen troligen är atoxisk och föreligger i fysiologisk buffert, så att komposi- tionen utan olägenhet kan införas i cirkulationssystemet, t.ex. medelst intravenös injektion. Fibrinet kommer, bl.a. på grund av sin gelbildningskinetik, att fördela sig i hela cirkulations- systemet, där det troligen ingår i komplex med fibrinogen. På grund av fibrinolytisk aktivitet i blodet och kärlbädden kommer detta fibrin att brytas ned och försvinna ur cirkulation. Has- tigheten varmed detta sker är ett mått på organismens totala fibrinolytiska kapacitet. Denna parameter, som även kan mätas in vitro, kan komma att få stor diagnostisk betydelse, varvid kompositionen enligt uppfinningen torde vara ett synnerligen värdefullt instrument vid en sådan diagnos. Kompositionen enligt uppfinningen är exempelvis ett synnerligen lämpligt lösligt fibrinpreparat för bruk in vivo, då det föreligger i fysiologisk 10 15 20 25 30 35 447 579 7 buffertmiljö och peptiden troligen är oförarglig för organismen.

För att underlätta analysen kan fibrinet märkas, t.ex. med ra- dioaktiv jod eller biotin.

BXEMPEL ' Uppfinningen kommer nu att belysas ytterligare genom några konkreta exempel, vilka enbart ges i illustrerande men ej be- gränsande syfte.

I exemplen används höggradigt renade preparationer av proteiner samt några mindre vanliga kemikalier. Nedan följer en beskrivning av dessa och var de kan erhållas. Komposition av använda buffertar är också angivna.

Glu-plasminogen från humanplasma; frystorkat preparat från BioPool, UMEÅ, som enligt specifikation innehåller mindre än 1% Lys-plasminogen, mindre än 10 ppm plasmin och mindre än 0,000l IU t-PA/mg. Vid användning rekonstituerades preparatet i steril PBS (se nedan), till en slutlig koncentration av 5 mg/ml samt centrifugerades 2 min vid 110 000 x g. Rekonsti- tuerat material förvarades vid +4°C dock högst i 48 timmar.

Vävnads-plasmínogenaktivator, (t-PA), i dess en-kedjiga form från humana melanomceller; frystorkat preparat utan bärar- substans från BioPool AB, UMEÅ. Enligt tillverkaren; specifik aktivitet 500 000 IU/mg, mer än 95% aktivt, innehållande mindre än 2% tvâ-kedjíg t-PA och mindre än 1% icke t-PA protein.

Preparatet rekonstituerades i 1 M KHC03 till en koncentration av S0 000 IU/ml och förvarades vid +4°C högst 48 timmar. Ytter- ligare spädning utfördes med Tris/Tween buffert, (se nedan). Som referens för t-PA aktivitet har använts WHO first international standard lot 83/S17 från NIBSAC, Holly Hill, LONDON.

Fibrinogen från humanplasma; frystorkat preparat från Imco Corporation Ltd AB, STOCKHOLM, enligt specifikation 97% koagulerbart och fritt från plasminogen. Preparatet rekonsti- tuerades med H20 till en koncentration av 20 mg/ml och förva- rades vid +4°C, dock högst i 4 timmar.

Batroxobin ur ormgiftet från Bothrops atrox maranhao; frystorkat preparat från Pentapharm AG, BASEL (Schweiz). Enligt specifikation minst 100 BU/mg. Preparatet rekonstituerades i PBS till en koncentration av 20 BU/ml och förvarades i portio- 10 15 20 25 30 35 447 579 s ner om 0,2 ml i flytande kväve (-196°C).

Trombin ur bovint plasma; steril lösning, Topostasin, från Hoffman-La Roche, BASEL (Schweiz).

GlZħro-Arg-Pro, (glycyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolin), som acetaisalt från BioPool AB, UMEÅ. Saltet löstes i H20 till en koncentration av 100 mg/ml och förvarades vid -20°C.

Plasminsubstrat Spectrozyme PL, (H-D-norleucyl-L-hexa- hydrotyrosyl-L-lysinyl-para-nitroanilid); frystorkat preparat från American Diagnostica Inc., Greenwich, CT, USA.

Buffertar: §§§, ("phosphate buffered saline"), med sam- mansättningen 0,1 M NaCl, 0,02 M natriumfosfatbuffert pH 7,3.

Tris/Tween har sammansättningen 0,1 M Tris/ättiksyra buffert pH 8,3 (vid 37°C), innehållande 0,1 g/l Tween 80.

Exemgel 1 Fibrinogen S mg/ml löst i PBS portionerades i portioner om 0,2 ml i 0 9 mm provrör av polystyren. Till dessa sattes antingen 0,01 ml bovint trombin, 20 NIH/ml, eller 0,01 ml batroxobin (fràn B A Maranhao), 20 BU/ml. Härvid bildades i samtliga provrör ett koagel inom S minuter.

Till dessa små fibrinkoagel sattes 0,02 ml glycyl-L-prolyl- L-arginyl-prolin, (Gly-Pro-Arg-Pro), med koncentration mellan 0 och 115 mg/ml. Slutkoncentrationen av peptid i koagelvolymen blev således mellan 0 och 10 mg/ml.

Rören skakades varsamt var 20:e minut, och efter 3 tim- mar noterades koagelets utseende. Försöket utfördes vid rums- temperatur, (ca 20°C]. Resultaten redovisas i nedanstående tabell 1.

TABELL 1 Solubiliserbarhet för fibrin I respektive fibrin II xøne. »ng/mi o 0,1 0,2 0,4 0,6 1.0 2,o 4,0 'mJu fibrin I (er- rigid lös lös svagt klar klar klar klar klar hållet medelst gel gel gel grumlig lös- "lös- lös- lös- lös- batroxobin) lösning ning ning ning ning ning fibrin II rigid rigid rigid rigid rigid rigid rigid rígid lös (erhållet gel gel gel gel gel gel opak opak gel medelst gel gel trombin) 10 15 20 25 30 35 447 579 Av ovanstående tabell 1 framgår att solubilisering av fibrin I erhölls redan vid en koncentration av 0,4 mg/ml och att fullständig solubilisering av ifrågavarande fíbrülerhölls vid en_pgptidkoncentratíon av 0,6 mg/ml eller högre. Däremot kunde ingen solubilisering av fibrin II åstadkommas inom det undersökta koncentrationsomrâdet. Dä 10 mg/ml kan utgöra övre användbar gräns för vissa tillämpningar, såsom antyddes ovan och såsom belyses mera nedan, ser man att endast kombinationen peptid och fibrin I är praktiskt användbar.

Exempel Z Framställning av peptidsolubiliserat fibrin I, (används í exempel 3, 4 och S). En volym 20 mg/ml fibrinogen späddes med 1 volym PBS. Till detta sattes en åttimukls volym 20 BU/ml batroxobin, (slutkoncentration 0,25 BU/ml), och inkuberades i rumstemperatur (18°C). En lös gel bildades inom 15 minuter.

Efter 90 min solubíliserades gelen genom tillsats av en fem- tiondels volym 100 mg/ml Gly-Pro-Arg-Pro (slutkoncentration i koagelvolymen2 mg/ml). Varsam skakning i 3 timmar.

Lösningen sterilfiltrerades (0,4S pm membranfilter, portionerades i portioner om 100 pl (1 mg fibrin I, 0,2 mg peptid). En del av dessa förvarades vid -20°C, (lot 12 A), och en del frystorkades och förvarades under kvävgasatmosfär via +4°c (re: 12 B).

Den t-PA stimulerande förmågan hos dessa preparationer undersöktes och jämfördes med en tidigare frystorkad prepara- tion (lot II B, se tabell 1). De frystorkade preparationer- na, (lot 11 B och lot 12 B), rekonstituterades genom tillsats av 100 ul Tris/Tween. Lot 12 B2d är rekonstituerat material som förvarats vid +4°C i 2 dygn.

Tabell 2. Alivkoter om 0,5 ml av 0,05 mg/ml Glu-plasminogen, 0,5 mM Spectrozyme och 0,2 IU/ml en-kedjig t-PA lösta i Tris/Tween dispenserades i 0 9 mm polystyren-rör. Till dessa sattes 1, 3, S eller 7 pl solubiliserat fibrin I-derivat, skakades omedelbart och placerades i ett 37°C vattenbad. Efter 1 h inkubation avbröts reaktionen genom tillsats av S0 pl 10% ättiksyra och absorbansen vid 405 nm mättes. Absorbans- ökningen beräknades genom att subtrahera absorbansen i lösning 10 15 20 ZS 30 35 447 579 10' där reaktionen avbröts omedelbart efter fibrintillsats. Denna absorbans var 0,083. I frånvaro av stimulator resulterade 4 timmarsiinkubation vid 37°C i en absorbansökning på 0,017.

Tabell 2 Absorbansökning vid 405 nm erhållet med Tillsats,mängd olika preparationer solubiliserat fibrin I fibrin I prep. m) 10: nß 10: 12A io: 123 ie: 12320 1 0,635 0,621 0,512 0,562 s 0,755 0,714 0,705 0,688 s 0,800 0,781 0,116 0,750 1 0,009 0,804 0,195 0,178 Resultaten i tabell 2 visar, att lösliga fibrinkompositío- ner, framställda enligt uppfinningen, kan framställas med re- producerbar t-PA-stimulerande förmåga. Vidare demonstreras att denna i stort är oförändrad av frystorkning med åtföljande re- konstituering.

Slutligen visas att rekonstituerade preparat har prak- tiskt godtagbar stabilitet (48 h). Taget tillsammans visar för- söket att lösligt fíbrín, framställt enligt uppfinningen, har egenskaper som gör det ytterst lämpat för bestämning av t-PA- aktivitet.

Exempel 3 För att fastställa i vad utsträckning peptiden Gly-Pro-Arg- Pro hämmar fibrinstimulerad t-PA-aktivering av plasminogen, utfördes följande försök. Alikvoter om 0,49 ml Tris/Tween, innehållande 0,025 mg Glu-plasminogen, 0,25 pmol Spectrozyme och 0,1 IU t-PA, försattes med 0,01 ml peptid, koncentrationen S, 2,5, 1,25, 0,63, 0,32 eller 0 mg/ml.

Reaktionen startades genom tillsats av S pl lösligt fibrin enligt uppfinningen (se exempel 2) och då fibrinprepa- rationen innehåller 2 mg/ml av peptiden blev slutkoncentra- tionen av peptid 0,12, 0,07, 0,045, 0,032S, 0,0263 och 0,2 mg/ml. 60 minuter vid 37°C efter fíbrintillsatsen avbröts reaktionen genom tillsats av 50 ul 10% ättiksyra och absorbansen vid 10 15 20 ZS 30 35 11 * 447 579 405 nm mättes. 4 experiment utfördes vid varje peptidkoncen- tration och medelvärde av absorbansökning samt dess standard- avvikelse redovisas i figur 1. I frånvaro av fibrin var absor- bansökning cirka 0,006 vid samtliga undersökta peptidkoncen- trationef.

Av försöket framgår att en slutkoncentration av 0,033 mg/ml peptid rešulterar i en signifikant minskning av t-PA medierad aktivering av Glu-plasminogen. Detta ger sålunda en övre gräns för användbar :lutkoncentration av peptid i preparation av lös- ligt fibrin enligt uppfinningen. Denna är 10 mg/ml och motive- ras av att aktiveringsreaktionen hämmas vid peptidkoncentratio- ner överstigande 0,033 mg/ml och av att minst en trehundradels volym fibrinpreparat måste tillsättas vid reaktionens start (0,033 X 300 = 10).

Exempel 4 Mätning av t-PA-aktivitet under utnyttjande av lösligt fibrin enligt uppfinningen kan tillgå på följande sätt: S00 pl TAR (tissue plasminogen activator reagent) bestående av 0,05 mg/ml av Glu-plasminogen och 0,5 mM Spectrozyme PL löst i Tris/Tween portioneras i 0 9 mm polystyrenrör. Till dessa sätts 50 ul prov bestående av WHO:s t-PA standard spätt i Tris/Tween (t-PA-halter mellan 0 och 3 IU ml). Till detta sättes (omedel- bar omblandning) 5 ul lösligt fibrin I, så som det beskrivs i exempel 2. Efter 60 minuter vid 37°C avbryts reaktionen med 50 pl 10% åttiksyra. Absorbansökningen vid 405 nm bestäms som i exempel 2 och avsätts mot t-PA-halten i provet, figur 2.

För att demonstrera mätning av t-PA i plasmaprover sat- tes 10 pl t-PA löst i Tris/Tween till 200 pl t-PA-fattig plasma så att slutkoncentrationen t-PA blev 0 till 20 IU/ml. För att förstöra plasmans innehåll av plasminhämmare tillsattes 200 pl IM acetatbuffert pH 3,9, åtföljt av 15 minuters inkuba- tion vid 37°C. Sedan tillfördes 200 ml Tris/Tween, varigenom t-PA-halten blev 0-2,5 IU/ml. Prover om 50 pl av detta analy- serades för t-PA-aktivitet såsom beskrivs ovan. Resultatet redovisas i figur 2. n Av figur 2 framgår att lösligt fibrin enligt uppfin- ningen är utomordentligt användbart vid-bestämning av aktivitet 10 15 20 25 30 35 447 579 12 med tillämpning i biologiska prover. Halten hämmare mot t-PA fastställs genom att känd mängd t-PA tillförs provet, varefter kvarvarande överskott t-PA bestäms. Fibrinpreparat enligt upp- finningeñ är alltså mycket användbara även för bestämning av halten t-ÉÄ-hämmare i t.ex. blod eller blodplasma.

Vid t-PA-mätning i exempel 2 och 3 användes lösning inne- hållande 0,05 mg/ml plasmogen. Under mätningen aktiveras mindre än 1 % av detta. Den höga halten av plasminogen motiveras alltså inte av förbrukning utan av att hög aktiveringshastig- het, därmed känslighet, kräver sådana halter.

Emellertid framkom under uppfinningens utvecklande att partiellt nedbrutet fibrin (fibrin med avspjälkande C-terminala delar av a-kedjorna) kan stimulera t-PA till att aktivera plas- mínogen effektivt vid plasminogen-halter av 0,005 mg/ml. Lösligt fibrin enligt uppfinningen, men där C-terminala delarna av a-kedjorna avlägsnats från fibrinet genom enzymatisk digestion, t.ex. med matrisbundet plasmin, skulle tillåta t-PA-mätning med betydligt lägre åtgång av plasminogen. Plasminogen av nödvän- digt hög kvalité är en dyr komponent i t-PA-mätning, varför möjlighet till haltreduktion är av stor praktisk betydelse.

Exempel 5 Fibrin kan finnas i cirkulerande blod, där det troligen föreligger i form av komplex med andra plasmaproteíner. Närvaro av dylikt fibrin indikerar pågående koagulationsprocesser och kvantifiering av cirkulerande fibrin har troligen stort kli- niskt intresse.

Vävnadsplasminogenaktivatorns förmåga att aktivera plas- minogen potentieras kraftigt av fibrin såsom beskrivet ovan.

Om halten fibrin är låg, är aktiveringshastigheten direkt be- roende av denna, såsom visats av Rånby M 1982, Biochimica et Biophysica Acta 704: 461-469. I samband med arbete på förelig- gande uppfinning uppmärksammades att även fibrin i plasma stimulerade förmågan hos t-PA att aktivera plasminogen och att detta kunde utgöra en princip, varpå analytiska metoder för firbrinbestämning kunde byggas. Vid sådana metoder kommer dock att uppstå behov av en standard och lösligt fibrin enligt upp- 10 15 447 579 13. finningen demonstreras här vara en bra, kanske den enda prak- tiskt möjliga, standard för detta ändamål. _ Till 1 ml humanblodplasma sattes 10 pl lösligt fibrin enligt uppfinningen (se exempel 2). Denna plasma (innehållande 0,09 mg/ml tillsatt fíbrin) späddes med plasma, varvid plasma- prover innehållande 0,09, 0,045, 0,023, 0,011 och 0,0056 mg/ml kom att iordningställas. Av dessa prover blandades 50 pl med S00 pl, 0,05 mg/ml plasminogen, 0,5 mM Spectrozyme och S0 IU/ml t-PA. Efter 25 minuter vid 37°C stoppades reaktionerna genom tillsats av S0 ul 10 $ ättiksyra. Absorbansökníngen vid 405 nm bestämdes och avsattes som funktion av koncentrationen tillsatt fibrin, figur 3.

Här redovisade resultat demonstrerar att lösligt fibrin enligt uppfinningen lämpar sig väl som standard vid analyser syftande att bestämma halten fibrin i cirkulerande blod eller blodplasma.

Claims (7)

447 579 14 2¿TEflI§&fiV. lå. Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition, k ä n n 3 t e o k n a d av att fibrinet är desAA-fibrin eller desAA-fibrin, fran vilket de C-terminala delarna av
1. G-kedjorna har avlägsnats genom enzymatisk digestion, och att den innefattar en solubiliserande mängd av peptiden glycyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolin, och företrädesvis även en fysiologisk buffert.
2. 2. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d av att desAA-fibrinst är erhallet genom selektivt avlägsnande av fibrinopeptid A fran fibrinogen medelst ett enzym, företrädesvis batroxobin.
3. 3. Komposition enligt nagot av de föregående kraven, k ä n n e t e o k n a d av att peptidhalten är minst 0,4, företrädesvis 0,4 - 10, mg per ml bruksfärdigt preparat.
4. 4. Komposition enligt krav 3, k ä n n e t e o k - nia d av att peptidhalten är 0,6 - 4, företrädesvis ca 2, mg per ml bruksfärdigt preparat.
5. 5. Användning av en komposition enligt nagot av kraven 1 - 4 i samband med pavisning eller kvantifiering av aktiviteten hos enzymet vävnadsplasminogenaktivator, varvid fibrinet potsntierar enzymets aktivitet gentemot det fysiologiska substratet plasminogen eller nagot syn- tetiskt substrat.
6. S. Användning av en komposition enligt nagot av kraven 1 - 4 för att pavisa lösligt fibrin i biologiska vätskor, t.ex. blodplasma, varvid kompositionen använ- des som standard.
7. 7. Användning sv en komposition enligt nagot av kraven 1 - 4 för att mäta eller studera fibrinolytisk aktivitet in vitro eller in vivo genom tillsats av kom- positionen och registrering av det däri ingående fibri- nsts nedbrytning. w