DE68919144T2 - Nachweis von LDH1. - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer LDH&sub1;-Fraktion in einer Probe.
- LDH (Lactat-Dehydrogenase) hat fünf Isoenzyme, und zwar LDH&sub1; bis LDH&sub5;. Jedes Organ hat seine eigene Zusammensetzung dieser Isoenzyme. LDH&sub1; zum Beispiel ist im Herzmuskel in größter Menge enthalten. Da während eines Myokardinfarkts LDH&sub1; aus dem Herzmuskel in das Blut ausströmt, kann die Zunahme des LDH&sub1;-Serumspiegels für die Diagnose einer solchen Krankheit verwendet werden. Ein LDH&sub1;-Isozym-Test ist deshalb klinisch signifikant.
- Beim gebräuchlichsten LDH-Isozym-Nachweis werden LDH&sub1;, LDH&sub2;, LDH&sub3;, LDH&sub4; und schließlich LDH&sub5; in der Reihenfolge der elektrophoretischen Mobilität fraktioniert. Ein immunologischer LDH-Test ist auch bekannt. In einem weiterem LDH-Test, offenbart in der japanischen Kokai-Patentveröffentlichung Nr. 6477/1983, wird ein Coenzym-Derivat benutzt. Zusätzlich werden LDH-Tests, in welchen eine Probe unter alkalischen Bedingungen behandelt wird, in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 28280/1985 und der japanischen Kokai-Patentveröffentlichung Nr. 278997/1987 beschrieben.
- Der oben angeführte elektrophoretische oder immunologische Test ist für eine klinische Autoanalyse wegen des komplizierten Verfahrens und der langen Laufzeit ungeeignet. Zusätzlich könnten die LDH-Isoenzyme durch die elektrophoretische Untersuchungsmethode ungenügend fraktioniert werden.
- Genaugenommen ist es unmöglich, die LDH-Isozym-Fraktionen mit dem Verfahren, bei dem das Coenzym-Derivat benutzt wird, auszuwerten, während das Verhältnis der H-Untereinheit zur M-Untereinheit im Enzym durch das Verfahren in geeigneter Weise bestimmt werden kann.
- In dem Verfahren, welches die alkalische Behandlung der Probe umfaßt, können mehr als 50% der LDH&sub1; während der Hemmung der anderen Isoenzyme inaktiviert werden. Zusätzlich ist das Verfahren schwierig und zeitaufwendig.
- Folglich sind die oben angeführten herkömmlichen LDH-Tests für die klinische Untersuchung und Diagnose unbefriedigend.
- Somit ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen LDH&sub1;-Test bereitzustellen, der für die einfache, schnelle und zuverlässige klinische Untersuchung oder Diagnose, einschließlich Autoanalyse, von Nutzen ist.
- Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer LDH&sub1;-Fraktion in einer Probe zur Verfügung, welches die Hemmung von LDH&sub2;, LDH&sub3;, LDH&sub4; und LDH&sub5; in der Probe mit einer Protease in Gegenwart eines Protein- denaturierenden Mittels und im Anschluß daran die Bestimmung der restlichen nicht-gehemmten LDH&sub1; umfaßt.
- Das vorliegende Verfahren ist für die Bestimmung der LDH&sub1;- Fraktion in einer klinischen Probe, wie zum Beispiel Serum oder Plasma, geeignet.
- Die Protease, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jede Protease sein, die für den Zweck der Erfindung geeignet ist. Es können zum Beispiel, α-Chymotrypsin, Trypsin, Thrombin, Elastase, Endoprotease, Subtilisin, Bromelain, Papain, Carboxypeptidase, Pronase, Pepsin oder Cathepsin verwendet werden. Die Proteasen, die in der japanischen Kokai- Patentveröffentlichung Nr. 149399/1985 offenbart wurden, können auch verwendet werden.
- Obwohl die Menge der Protease in der vorliegenden Erfindung nicht kritisch ist und mit anderen Testbedingungen variiert, kann zum Beispiel α-Chymotrypsin in einer Konzentration in Bereich von 10 bis 1.000 Einheiten/ml verwendet werden.
- In der vorliegenden Erfindung kann jedes Protein- denaturierende Mittel, welches eine für das Verfahren geeignete Aktivität hat, verwendet werden. Zum Beispiel werden vorzugsweise Cholsäure, Desoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurodesoxycholsäure, Guanidin (Hydrochlorid), Trichloressigäure, Harnstoff, Thioharnstoff oder Thiocyanat als das Protein-denaturierende Mittel allein oder in der Form eines Gemisches verwendet.
- Obwohl die Menge des Protein-denaturierenden Mittels nicht kritisch ist und mit anderen Testbedingungen variiert, kann zum Beispiel 0,05 bis 5 M Guanidin verwendet werden.
- Das verbleibende, nicht-gehemmte LDH&sub1;-Isozym kann gemäß einem Enzymtest bestimmt werden, welcher aus einer Anzahl konventioneller Tests ausgewählt wurde, die in klinischen Untersuchungen weit verbreitet sind. Ein solcher Test, der im vorliegenden Verfahren verwendet wird, sollte leicht innerhalb kurzer Zeit mit hoher Genauigkeit, Empfindlichkeit und Richtigkeit durchgeführt werden können.
- In einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird das LDH&sub1;-Isozym, das nicht-gehemmt verbleibt, durch einen Enzymtest bestimmt, der das katalytische Entwickeln eines Chromogens oder einer Farbstoffvorstufe mit dem Isozym und im Anschluß daran die Messung der Absorption im Bereich des sichtbaren Lichts umfaßt. Es ist auch möglich, die ultraviolette Absorption des Coenzyms NADH, das durch eine Katalysewirkung des LDH1-Isozyms reduziert wurde, zu messen.
- In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das LDH&sub1;- Isozym gemäß dem Wroblewski-Verfahren bestimmt, welches ein gutbekannter Enzymtest ist, der unter neutralen Bedingungen durchgeführt wird. Man hat gefunden, daß die Hemmung der Isoenzyme LDH&sub2;&submin;&sub5; gemäß der vorliegenden Erfindung in einem breiten pH-Bereich bewirkt werden kann (vgl. Beispiel 1). Wenn deshalb die Bestimmung des LDH&sub1;-Isozyms, welches nicht-gehemmt verbleibt, unter einer neutralen Bedingung durchgeführt wird, kann der vorliegende Test vorteilhaft unter den gleichen neutralen Bedingungen während des gesamten Tests durchgeführt werden, während beim obenerwähnten herkömmlichen Test eine komplizierte Korrektur des pH-Werts notwendig ist, der die alkalische Behandlung der Probe umfaßt.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
- Eine authentische Probe (0,04 ml) von jedem der Isoenzyme LDH&sub1;&submin;&sub5;, welche durch Reinigung von menschlichem Blut gewonnen wurde, wurde mit einem Puffer (0,2 ml), enthaltend α- Chymotrypsin (450 Einheiten/ml) und 0,65 M Guanidin, versetzt und bei 37 ºC 5 Minuten lang inkubiert. Die verwendeten Puffer und deren pH-Werte entsprachen der folgenden Tabelle 1.
- Nach dem Zusatz eines 0,1 M Tris-Puffers (2,5 ml), der 2 mM Natriumpyruvat und 0,2 mM NADH enthielt, wodurch der pH-Wert auf 7,8 eingestellt wurde, wurde dann die Änderungsrate der Absorption pro Minute bei 340 nm gemessen. Die Restaktivität jedes Isozyms wurde aus dem gemessenen Wert berechnet. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
- Es stellte sich heraus, daß durch den vorliegenden Test nur die LDH&sub1;-Fraktion unter den Isoenzymen LDH&sub1;&submin;&sub5; bestimmt werden konnte und daß das LDH&sub1;-Isozym bei jedem pH-Wert während der Hemmung der anderen Isoenzyme nicht-gehemmt verblieb.
- Deshalb kann, wenn das nicht-gehemmt verbleibende LDH&sub1;- Isozym unter neutralen Bedingungen bestimmt wird, der vorliegende Test vorteilhaft unter diesen neutralen Bedingungen während des gesamten Tests ohne komplizierte pH-Wert-Korrektur durchgeführt werden. Tabelle 1 pH (Puffer) Restaktivität (%)
- Der gleichen Probe (0,04 ml) wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde ein 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,8; 0,2 ml), welcher Subtilisin (5 Einheiten/ml) und Natriumdesoxycholat (1,5 %) enthielt, zugesetzt und bei 37 ºC für 5 Minuten inkubiert. Nach dem Zusatz eines 0,1 M Tris-Puffers (pH 7,8; 2,5 ml), der 2 mM Natriumpyruvat und 0,2 mM NADH enthielt, wurde dann die Restaktivität jedes Isozyms in gleicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
- Es wurde gefunden, daß der vorliegende LDH&sub1;-Test wirkungsvoll bei einem pH-Wert von 7,8 durchgeführt werden kann. Tabelle 2 Restaktivität (%)
- Als Probe wurden 15 menschliche Seren (je 0,04 ml) verwendet. Die Gesamt-LDH-Aktivität jeder Probe war bekannt, wie in der folgenden Tabelle 3 gezeigt.
- In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde die Änderungsrate der Absorption pro Minute gemessen. Dann wurde die LDH&sub1;-Aktivität, die in Tabelle 3 gezeigt ist, unter Verwendung einer Eichkurve bestimmt.
- Die Seren wurden einzeln einem herkömmlichen immunologischen Test für das LDH&sub1;-Isozym unterworfen (unter Verwendung von Isomune-LD; Rosh). Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 3 ersichtlich.
- Die Ergebnisse des vorliegenden Verfahrens stimmten gut mit denjenigen des herkömmlichen immunologischen Tests überein. Tabelle 3 Probe gesamte LDH-Aktivität (Einh./l) LDH&sub1;-Aktivität das vorliegende Verfahren (Einh./l), bestimmt durch den konventionellen immunologischen Test
- Zur gleichen Probe (10 ul) wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde ein 50 mM MES-Puffer (pH 6,0; 75ul), der 0,5 M Guanidinhydrochlorid, 2 % Triton X-405 und eine Protease enthielt, zugesetzt, wie in der folgenden Tabelle 4 gezeigt wird.
- Nach 5 Minuten Inkubation bei 37 0C wurde ein 0,1 M Tris- Puffer (pH 8,0; 400 ul), der 2 mM Natriumpyruvat und 0,2 mM NADH enthielt, zugesetzt. Dann wurde die Restaktivität eines jeden Isozyms in gleicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
- Es wurde gefunden daß die LDH&sub1;-Fraktion mit jeder Protease bestimmt werden konnte, vorzugsweise mit Carboxypeptidase Y, Cathepsin C oder α-Chymotrypsin. Tabelle 4 Restaktivität (%) Pepsin Carboxypeptidase Cathepsin α-Chymotrypsin
- Zur gleichen Probe (0,04 ml) wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde ein Tris-Puffer (pH 8,0; 0,2 ml), entweder α-Chymotrypsin (450 Einheiten/ml) oder 0,65 M Guanidin enthaltend, zugesetzt und es wurde bei 37 ºC 5 Minuten inkubiert. Nach dem Zusatz eines 0,1 M Tris-Puffers (2,5 ml), welcher 2 mM Natriumpyruvat und 0,2 mM NADH enthielt, wodurch der pH-Wert auf 7,8 eingestellt wurde, wurde dann die Restaktivität eines jeden Isozyms in gleicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
- Es wurde gefunden daß die LDH&sub2;&submin;&sub5;-Fraktionen ungenügend inaktiviert wurden. Es ist daher wesentlich, im vorliegenden Test eine Protease in Gegenwart eines Protein-denaturierenden Mittels zu verwenden. Tabelle 5 Restaktivität (%) wenn Guanidin ohne α-Chymotrypsin zugesetzt wurde wenn α-Chymotrypsin ohne Guanidin zugesetzt wurde
Claims (8)
1. Verfahren zur Bestimmung einer LDH&sub1; Fraktion in einer
Probe, umfassend die Hemmung von LDH&sub2;, LDH&sub3;, LDH&sub4; und
LDH&sub5; in der Probe mit einer Protease in Gegenwart eines
protein-denaturierenden Mittels und im Anschluß daran die
Bestimmung des restlichen nicht-gehemmten LDH&sub1;.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine klinische
Serum- oder Plasmaprobe ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Protease α-
Chymotrypsin, Trypsin, Thrombin, Elastase, Endoprotease,
Subtilisin, Bromelain, Papain, Carboxypeptidase, Pronase,
Pepsin oder Cathepsin ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei als Protease
α-Chymotrypsin in einem Konzentrationsbereich von 10 bis 1000
Einheiten/ml verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das
Protein-denaturierende Mittel Cholsäure, Desoxycholsäure,
Taurocholsäure, Taurodesoxycholsäure, Guanidin
(Hydrochlorid), Trichloressigsäure, Harnstoff, Thioharnstoff
oder Rhodanid oder ein Gemisch davon ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei als Protein-
denaturierendes Mittel 0,05 bis 5 M Guanidin verwendet
wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das
restliche nicht-gehemmte LDH&sub1;-Isoenzym nach einem
Enzymtest bestimmt wird, umfassend das katalytische Entwickeln
eines Chromogens oder einer Farbstoffvorstufe mit dem
Isoenzym und im Anschluß daran die Messung der Absorption
im Bereich des sichtbaren Lichts oder umfassend die
Messung der ultravioletten Absorption des durch die
katalytische Aktivität des Isoenzyms reduzierten Coenzyms
NADH.
8. Verfahren nach Anspruch 7, das während des gesamten Tests
unter neutralen Bedingungen ohne Korrektur des pH-Werts
durchgeführt wird.
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