JPS62278997A - Ldhイソ酵素測定試薬 - Google Patents
Ldhイソ酵素測定試薬Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
3、発明の詳細な説明
「産業上の利用分野」
本発明は乳酸脱水素酵素(Lactate dehyd
oroge−nase、 EC1,1,1,27以下L
DHと略す)のイソ酵素のうちの心筋型LDHイソ酵素
活性を測定する3jE ffに関し、特に心筋に豊富に
存在するI]サブユニットのみから構成されるしDI+
イソ醇素(以下、114と略す)の活性を特異的に測定
する試薬に関する。
oroge−nase、 EC1,1,1,27以下L
DHと略す)のイソ酵素のうちの心筋型LDHイソ酵素
活性を測定する3jE ffに関し、特に心筋に豊富に
存在するI]サブユニットのみから構成されるしDI+
イソ醇素(以下、114と略す)の活性を特異的に測定
する試薬に関する。
「従来の技術」
LDliは次の反応を触媒する
L−乳酸+NAD’士==ピルヒ゛ン酸+11八〇+1
上記反応弐において、L−乳酸及びピルビン酸はLDH
の基質であり、NAD及びNADI+は111晶γ素で
ある。
上記反応弐において、L−乳酸及びピルビン酸はLDH
の基質であり、NAD及びNADI+は111晶γ素で
ある。
ヒトのLDIIの1分子は4個のサブユニットからなる
複合体として存在する。LDHを構成するサブユニット
は、心筋型サブユニット(1−1)と骨格筋型ナブユニ
ノト(M)の2種類が存在する。従って、それろのサブ
ユニットの組み合わせから、LDHには、114 、1
13 M 、 II□と2,1団38M4として示され
るような5種類のイソ酵素が存在する。
複合体として存在する。LDHを構成するサブユニット
は、心筋型サブユニット(1−1)と骨格筋型ナブユニ
ノト(M)の2種類が存在する。従って、それろのサブ
ユニットの組み合わせから、LDHには、114 、1
13 M 、 II□と2,1団38M4として示され
るような5種類のイソ酵素が存在する。
これらイソ酵素は、臓器によりそれらの分布が異なって
いることが知られている。第1図(エフポルプレスキー
等Progress iOCardiovascula
rDisease 6巻、 63p、 1963年)
に各臓器における各LDHイソ酵素の含有率を示す。
いることが知られている。第1図(エフポルプレスキー
等Progress iOCardiovascula
rDisease 6巻、 63p、 1963年)
に各臓器における各LDHイソ酵素の含有率を示す。
これらイソ酵素のうち、第1図によっても明らかなよう
に、心臓にはIIサブユニットのみから構成されるLD
Hイソ酵素が他の臓器よりも高い割合で含まれる。従っ
て、心筋梗塞のような疾病を被った際には、血流中に心
筋■熾から心筋型Ll)IIイソ酵素が逸脱し、血清中
の同イソ酵素活性測定値が増大する。この血・清中11
.の活性を測定すれば、心筋梗塞等の循環器疾患のしn
床診断、特に発病時や予後の判定などに重要な情報を与
えることができる。
に、心臓にはIIサブユニットのみから構成されるLD
Hイソ酵素が他の臓器よりも高い割合で含まれる。従っ
て、心筋梗塞のような疾病を被った際には、血流中に心
筋■熾から心筋型Ll)IIイソ酵素が逸脱し、血清中
の同イソ酵素活性測定値が増大する。この血・清中11
.の活性を測定すれば、心筋梗塞等の循環器疾患のしn
床診断、特に発病時や予後の判定などに重要な情報を与
えることができる。
そこで従来、LDHの各イソ酵素は尿素や塩酸グアニジ
ン添加による安定性に差がある性質を利用して、Eme
ry ら(CIin、 Chim、へcta19巻、1
59頁、 1698年)は、尿素存在下、LDHの活性
を測定する、H4や113Mのような心筋型LDHイソ
酵素群の測定法を提示している。しかし、尿素による阻
害(失活)だけでは、1(4や1!1のような心筋型L
DHイソ酵素群とM4を分別できたが114のみを分離
定量するには至らなかった。
ン添加による安定性に差がある性質を利用して、Eme
ry ら(CIin、 Chim、へcta19巻、1
59頁、 1698年)は、尿素存在下、LDHの活性
を測定する、H4や113Mのような心筋型LDHイソ
酵素群の測定法を提示している。しかし、尿素による阻
害(失活)だけでは、1(4や1!1のような心筋型L
DHイソ酵素群とM4を分別できたが114のみを分離
定量するには至らなかった。
これに対し、本発明者らは、すでに特公昭60−282
80に心筋型LDI!イソ酵素群が骨格筋型LDHイソ
酵素群よりもアルカリ性pHにおいて安定であり、この
性質を利用することにより)14を特異的にしかも簡便
に測定する方法を提案し、さらに、特開昭59−749
98に種々のアルカリ性ρ11の試薬中における各LD
Hイソ酵素の安定性の差を利用して、個々のイソ酵素活
性を個別に測定する方法を提案した。
80に心筋型LDI!イソ酵素群が骨格筋型LDHイソ
酵素群よりもアルカリ性pHにおいて安定であり、この
性質を利用することにより)14を特異的にしかも簡便
に測定する方法を提案し、さらに、特開昭59−749
98に種々のアルカリ性ρ11の試薬中における各LD
Hイソ酵素の安定性の差を利用して、個々のイソ酵素活
性を個別に測定する方法を提案した。
本発明者らが提案した特公昭60−28280等の概略
は、アルカリ性pHのもとてヒト血清を予加温すること
を特徴とするものであり、この方法によれば114に対
する特異的な活性測定が可能である。
は、アルカリ性pHのもとてヒト血清を予加温すること
を特徴とするものであり、この方法によれば114に対
する特異的な活性測定が可能である。
EchfeldLらの報告(C1inical Che
+n1stry 30/11+18211824、19
84)によれば、この方法を自動分析に応用し、ヒト血
清中の心筋型LDHイソ酵素を簡便に測定している。
+n1stry 30/11+18211824、19
84)によれば、この方法を自動分析に応用し、ヒト血
清中の心筋型LDHイソ酵素を簡便に測定している。
しかし、上記の方法は、原理的には優れたものであるが
、心筋型LDHイソ酵素H4を特異的に測定する為には
、pl+が10以上のアルカリ性ρIIでしかも高度に
管理されたpHの試薬を用いる必要があった。
、心筋型LDHイソ酵素H4を特異的に測定する為には
、pl+が10以上のアルカリ性ρIIでしかも高度に
管理されたpHの試薬を用いる必要があった。
というのは、憧沢ら(C1inical Chemis
むry 29巻、11号、 1941−1945頁、
1983年)の報告に基づき、タンパク質変性剤を含ま
ない、種々のpl+に調製された試薬を使用して、各L
DHイソ酵素を30°CでIO分間予加温した後の各り
叶イソ酵素のpHによる失活の状態を図示したものが第
2図であるが(図中−〇=−は114.−△−はII
3M 、−口−は11□M2゜−×−はIIM、、−・
−はM4を表す)、第2図に示したごと< 、114
(第2図における一〇−)を箭い活性に保持し、しかも
Mサブユニットを1個含むLDII (lhM) (以
下H3パと略す、第2図における一△−)を失活せしめ
るpl+領域を至適plH+I域とすれば、そのpl+
は30“c T: 10.6であることを示している。
むry 29巻、11号、 1941−1945頁、
1983年)の報告に基づき、タンパク質変性剤を含ま
ない、種々のpl+に調製された試薬を使用して、各L
DHイソ酵素を30°CでIO分間予加温した後の各り
叶イソ酵素のpHによる失活の状態を図示したものが第
2図であるが(図中−〇=−は114.−△−はII
3M 、−口−は11□M2゜−×−はIIM、、−・
−はM4を表す)、第2図に示したごと< 、114
(第2図における一〇−)を箭い活性に保持し、しかも
Mサブユニットを1個含むLDII (lhM) (以
下H3パと略す、第2図における一△−)を失活せしめ
るpl+領域を至適plH+I域とすれば、そのpl+
は30“c T: 10.6であることを示している。
その至適pH領域から酸性側に試薬のpHが外れるほど
Hlが指数関数的に残存し、また、逆に、アルカリ側に
外れると測定対象のIL自体が大きな失活を余儀なくさ
れる。すなわち、上記の様な原理にもとづいてアルカリ
性pl+のみの作用に依存した試薬で114を特異的に
精度よく測定しようとすれば、アリカル性pH自身の著
しく強力な失活作用が114にも及ぶ。従ってそれを避
けるためには、可能なかぎり狭いpH範囲に試薬を調製
し、維持管理しなければならないが、その点に改善の余
地があった。
Hlが指数関数的に残存し、また、逆に、アルカリ側に
外れると測定対象のIL自体が大きな失活を余儀なくさ
れる。すなわち、上記の様な原理にもとづいてアルカリ
性pl+のみの作用に依存した試薬で114を特異的に
精度よく測定しようとすれば、アリカル性pH自身の著
しく強力な失活作用が114にも及ぶ。従ってそれを避
けるためには、可能なかぎり狭いpH範囲に試薬を調製
し、維持管理しなければならないが、その点に改善の余
地があった。
「発明が解決しようとする問題点」
本発明者らは、以上のような、問題点を解決するために
種々検討した結果、タンパク質変性剤をアルカリ性の試
液に組み合わせて試薬を構成すれば、アルカリ性試液の
みによる処理の場合よりも、1(4を高活性に保持した
状態で1131その他のイソ酵素を効率よく失活せしめ
ることができ、より114′活性測定に対して特異的な
試薬を構成することを見出し本発明を完成するに至った
。
種々検討した結果、タンパク質変性剤をアルカリ性の試
液に組み合わせて試薬を構成すれば、アルカリ性試液の
みによる処理の場合よりも、1(4を高活性に保持した
状態で1131その他のイソ酵素を効率よく失活せしめ
ることができ、より114′活性測定に対して特異的な
試薬を構成することを見出し本発明を完成するに至った
。
「問題点を解決する為の手段」
すなわち、本発明は、
(イ)タンパク質変性剤を含有せるアルカリ性領域のp
H緩衝液である第1の試薬溶液 (ロ)少なくとも補酵素を含有せる第2の試薬溶液 上記(イ)及び(ロ)を具備してなるLDHイソ酵素測
定試薬である。
H緩衝液である第1の試薬溶液 (ロ)少なくとも補酵素を含有せる第2の試薬溶液 上記(イ)及び(ロ)を具備してなるLDHイソ酵素測
定試薬である。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明に用いられる第1の試薬溶液(イ)は、タンパク
質変性剤を含有せるアルカリ性領域のpl+緩衝液であ
り、検体中の114以外のLDHイソ酵素を失活させる
働きをするものである。また必要に応し基質である乳酸
又はピルビン酸を含む。
質変性剤を含有せるアルカリ性領域のpl+緩衝液であ
り、検体中の114以外のLDHイソ酵素を失活させる
働きをするものである。また必要に応し基質である乳酸
又はピルビン酸を含む。
アルカリ性piの緩衝液とは、p](7以上、14以下
の範囲の水素イオン活ffi ?H度を一定に保つため
に緩衝能を付与された水)容)佼であり、例えばアルカ
リ性領域のpl+標準液としても広く用いられているホ
ウ酸塩や炭酸塩の水溶液などは代表的である。
の範囲の水素イオン活ffi ?H度を一定に保つため
に緩衝能を付与された水)容)佼であり、例えばアルカ
リ性領域のpl+標準液としても広く用いられているホ
ウ酸塩や炭酸塩の水溶液などは代表的である。
この第1の試薬溶液(イ)はアルカリ性領域のpHを使
用するが、特に+14以外のLDHイソ酵素失活の効果
の点からpHloからpH11の範囲のpHが好ましく
、このρII範囲に緩衝能を存する、換言すれば酸解離
定数のp関数値すなわちpKaを有する緩衝剤の酸型と
塩基型のlR合物の水溶液を使用する。
用するが、特に+14以外のLDHイソ酵素失活の効果
の点からpHloからpH11の範囲のpHが好ましく
、このρII範囲に緩衝能を存する、換言すれば酸解離
定数のp関数値すなわちpKaを有する緩衝剤の酸型と
塩基型のlR合物の水溶液を使用する。
本発明の第1の試薬溶液(イ)の要求するpH範囲の緩
衝剤としては、pKa値が1(5−11の範囲である薬
剤であれば任意に選択できるが、41衝剤としての安定
性などの点から、3−〔シクロヘキシルアミノコ−1−
プロパンスルフォン酸(以下CAPSと略す、pKa=
10.4 )が、好適である。
衝剤としては、pKa値が1(5−11の範囲である薬
剤であれば任意に選択できるが、41衝剤としての安定
性などの点から、3−〔シクロヘキシルアミノコ−1−
プロパンスルフォン酸(以下CAPSと略す、pKa=
10.4 )が、好適である。
上記緩衝液に含有されるタンパク質変性剤は、タンパク
質の一次構造には変(ヒを与えず、もっばら二次、三次
、四次構造などの立体+M Mに変化を与えるものであ
り、例えば、尿素、チオ尿素、グアニジン、チオシアン
酸塩、三塩化酢酸などの一般にカオトロピックイオンと
して知られている薬剤、及びドデシル硫酸塩などの界面
活性剤などである。本発明の第1試薬に含有するタンパ
ク質変性剤の作用に関しては、4個のサブユニット構造
を有するLDIIの高次構造を不可逆的に変性せしめ、
酵素活性を消失させるものと考えられる。
質の一次構造には変(ヒを与えず、もっばら二次、三次
、四次構造などの立体+M Mに変化を与えるものであ
り、例えば、尿素、チオ尿素、グアニジン、チオシアン
酸塩、三塩化酢酸などの一般にカオトロピックイオンと
して知られている薬剤、及びドデシル硫酸塩などの界面
活性剤などである。本発明の第1試薬に含有するタンパ
ク質変性剤の作用に関しては、4個のサブユニット構造
を有するLDIIの高次構造を不可逆的に変性せしめ、
酵素活性を消失させるものと考えられる。
上記に示したタンパク質変性剤のうち、尿素以外の薬剤
は比較的低い濃度で激しく作用するので、薬剤添加量の
管理の点からは、比較的穏和に作用する尿素が好ましく
用いられる。
は比較的低い濃度で激しく作用するので、薬剤添加量の
管理の点からは、比較的穏和に作用する尿素が好ましく
用いられる。
緩衝;夜中のタンパク質変性剤の1温度は、前記アルカ
リ性pl+と相俟って検体中の114以外のLDHイソ
酵素を失活させるに足る濃度であり、緩衝液のpHとも
関係するが、例えば尿素の場合pl+ 10.15(a
L37°C)で200 1000+nM、1ff1度で
ある。
リ性pl+と相俟って検体中の114以外のLDHイソ
酵素を失活させるに足る濃度であり、緩衝液のpHとも
関係するが、例えば尿素の場合pl+ 10.15(a
L37°C)で200 1000+nM、1ff1度で
ある。
本発明に用いられる第2の試薬溶液(ロ)は、少なくと
も補酵素を含有する水)容液、或いは緩衝液であり、検
体中のLDIIイソ酵素の第1の試薬溶液(イ)の作用
による失活反応を停止するとともに、酵素反応を開始さ
せる働きをするものである。
も補酵素を含有する水)容液、或いは緩衝液であり、検
体中のLDIIイソ酵素の第1の試薬溶液(イ)の作用
による失活反応を停止するとともに、酵素反応を開始さ
せる働きをするものである。
この第2の試薬)容液(ロ)中の補酵素はNAD又はN
AD11である。但し、第1の試m ?H液(イ)のよ
うなアルカリ性pH領域では、ピルビン酸を基質とし補
酵素をNAD11とした酵素反応は著しく進行しないの
で、この場合は第2の試薬溶液(ロ)を添加することに
より、第1の試薬;−1ン(W(イ)によってもたらさ
れたアルカリ性pHを中性付近の安定したpl+に移行
(中和)せしめるようにする。即ち、少なくともNAD
11を含有する第2の試薬溶液(ロ)には、第1の試薬
溶液のpH緩衝剤の含有量を上回る量の中性pl+の緩
衝剤を供給できるようにするが、或いは第2の試薬溶液
を添加するに先立って、検体を含む第1の試薬溶液を中
和する為の第3の試薬を添加する必要がある。
AD11である。但し、第1の試m ?H液(イ)のよ
うなアルカリ性pH領域では、ピルビン酸を基質とし補
酵素をNAD11とした酵素反応は著しく進行しないの
で、この場合は第2の試薬溶液(ロ)を添加することに
より、第1の試薬;−1ン(W(イ)によってもたらさ
れたアルカリ性pHを中性付近の安定したpl+に移行
(中和)せしめるようにする。即ち、少なくともNAD
11を含有する第2の試薬溶液(ロ)には、第1の試薬
溶液のpH緩衝剤の含有量を上回る量の中性pl+の緩
衝剤を供給できるようにするが、或いは第2の試薬溶液
を添加するに先立って、検体を含む第1の試薬溶液を中
和する為の第3の試薬を添加する必要がある。
いずれにせよ、ピルビン酸を基f1としNADを補酵素
とする場合は第2の試薬〆合液(ロ)或いは第3の試薬
等の添加により酵素反応系の組成が腹誰になり、調製及
び管理が容易ではな(なり、試液の分注操作なども困難
を伴う。従って、本発明の場合は、乳酸を基質としNA
Dを11111g素として1¥用するのが簡便であり推
奨されろ。
とする場合は第2の試薬〆合液(ロ)或いは第3の試薬
等の添加により酵素反応系の組成が腹誰になり、調製及
び管理が容易ではな(なり、試液の分注操作なども困難
を伴う。従って、本発明の場合は、乳酸を基質としNA
Dを11111g素として1¥用するのが簡便であり推
奨されろ。
本発明のLDHイソ酵素測定試薬によるヒト血(1′1
′中の11.LDl+イソ酵素活性の測定は、検体を本
発明の第1の試薬溶液(イ)、即ちタンパク質変性剤を
含むアルカリpl+の緩衝液中で、一定時間、例えば5
分間、一定温度、例えば)バ氏30度あるいは37度で
予加温した後、少なくとも補酵素を含む第2試薬を添加
混合し、公知のLDH測定法によって活性を測定する。
′中の11.LDl+イソ酵素活性の測定は、検体を本
発明の第1の試薬溶液(イ)、即ちタンパク質変性剤を
含むアルカリpl+の緩衝液中で、一定時間、例えば5
分間、一定温度、例えば)バ氏30度あるいは37度で
予加温した後、少なくとも補酵素を含む第2試薬を添加
混合し、公知のLDH測定法によって活性を測定する。
公知のLDH測定法とは、■生成、或いは消費されるN
AD11の340nmの吸光度の増減を追跡するVU法
、■生成するNAD11をジアホラーゼ等を介してテト
ラゾリウム塩等の色素を還元し発色させて、可視部の吸
光度増加(或いは減少)を追跡する比色法、などが代表
的な方法である。その他■生成するN A D IIの
340nmの光で励起される青色の螢光強度を追跡する
方法や、■生成する乳酸、或いはピルビン酸を酸素電極
法などの手法で測定してもよく、公知の様々な測定方法
によってLDIIの酵素活性が測定できる。
AD11の340nmの吸光度の増減を追跡するVU法
、■生成するNAD11をジアホラーゼ等を介してテト
ラゾリウム塩等の色素を還元し発色させて、可視部の吸
光度増加(或いは減少)を追跡する比色法、などが代表
的な方法である。その他■生成するN A D IIの
340nmの光で励起される青色の螢光強度を追跡する
方法や、■生成する乳酸、或いはピルビン酸を酸素電極
法などの手法で測定してもよく、公知の様々な測定方法
によってLDIIの酵素活性が測定できる。
例えば、本発明の実施例では基質として乳酸、補酵素を
NADとし、活性測定をUV法で行なっているが、この
場合の測定手順及び評価方法を要約すると以下のごとく
である。
NADとし、活性測定をUV法で行なっているが、この
場合の測定手順及び評価方法を要約すると以下のごとく
である。
検体が、第1の試薬溶液(イ)によって37°Cで5分
間予加温されたのち第2の試薬?8液(ロ)を添加する
と、NADが供給され、第1の試薬溶液の作用であるL
DHイソ酵素の失活作用が停止し、同時に残存したLD
Hイソ酵素の37°Cでの酵素反応が開始する(実施例
では、基質の乳酸は(イ)に添加)。酵素反応が開始す
るとピルビン酸とNAP)IIが生成し、340nmの
吸光度が経時的に増加する。この340nmの吸光度の
直線的に増加する部分を酵素反応速度として測定した後
、N A D 11の分子吸光係数(6200(M c
m−’))から1分間当たり生成するNAD11のμm
ole数を計算して、検体1リツター当たりの単位とし
て酵素活性値を計算する。
間予加温されたのち第2の試薬?8液(ロ)を添加する
と、NADが供給され、第1の試薬溶液の作用であるL
DHイソ酵素の失活作用が停止し、同時に残存したLD
Hイソ酵素の37°Cでの酵素反応が開始する(実施例
では、基質の乳酸は(イ)に添加)。酵素反応が開始す
るとピルビン酸とNAP)IIが生成し、340nmの
吸光度が経時的に増加する。この340nmの吸光度の
直線的に増加する部分を酵素反応速度として測定した後
、N A D 11の分子吸光係数(6200(M c
m−’))から1分間当たり生成するNAD11のμm
ole数を計算して、検体1リツター当たりの単位とし
て酵素活性値を計算する。
本発明の場合、検体中の114以外のLDHイソ酵素は
、前記第1の試薬溶液(イ)の作用により、5分間の予
加温のうちにことごとく失活しているので、NADを含
む第2の試薬溶液を添加した後、上述のごと< LD
H活性を測定することにより、LDHイソ酵素114の
活性が求められる。
、前記第1の試薬溶液(イ)の作用により、5分間の予
加温のうちにことごとく失活しているので、NADを含
む第2の試薬溶液を添加した後、上述のごと< LD
H活性を測定することにより、LDHイソ酵素114の
活性が求められる。
以下、実施例および参考例にもとづいて、本発明をさら
に詳細に説明する。
に詳細に説明する。
「参考例1」
■4およびIhM (ヒト血液より精製した標品、以
後の参考例および実施例におけるイソ酵素標品はこれを
用いた。)を一連の種々のpH9,9−10,4に調製
した緩衝液中で予加温したときの活性を測定した。詳し
くは、160mMのDL−乳酸リチウムを含む230
mM CAPS−NaOtl !、fit衝液(pH9
,9−10,4)1.0 mlにイソ酵素標品を50μ
l加え37°Cで、5分間予加温し、ただちに80.5
mMのMADを0.1m12添加した。
後の参考例および実施例におけるイソ酵素標品はこれを
用いた。)を一連の種々のpH9,9−10,4に調製
した緩衝液中で予加温したときの活性を測定した。詳し
くは、160mMのDL−乳酸リチウムを含む230
mM CAPS−NaOtl !、fit衝液(pH9
,9−10,4)1.0 mlにイソ酵素標品を50μ
l加え37°Cで、5分間予加温し、ただちに80.5
mMのMADを0.1m12添加した。
同温度(37°C)でNAD添加後、1分間後から60
秒間の340nmの吸光度の変化を測定し、活性を求め
た。対照として、L−乳酸およびNADを基質とし、p
H値8.7で測定する公知のニス・エヌ・プールらの方
法(C1inical ChemisLry 24巻1
828−831頁、 1978年)によって活性測定を
おこない、その測定値を100%としたときの相対活性
(以後、%単位、或いは%Uと表記する)を求めた。そ
の結果を第3図に示す。図中、−〇−はH,、−△−は
111Mを表す。
秒間の340nmの吸光度の変化を測定し、活性を求め
た。対照として、L−乳酸およびNADを基質とし、p
H値8.7で測定する公知のニス・エヌ・プールらの方
法(C1inical ChemisLry 24巻1
828−831頁、 1978年)によって活性測定を
おこない、その測定値を100%としたときの相対活性
(以後、%単位、或いは%Uと表記する)を求めた。そ
の結果を第3図に示す。図中、−〇−はH,、−△−は
111Mを表す。
「参考例2」
予め試薬に尿素を500mMの濃度になるように添加し
た試薬を準備し参考例1と同様に一連の種種のpHに調
製した試薬、すなわち、タンパク質変性剤として尿素5
00mFを含み、160mMのDL−乳酸リチウムを含
む230 mM CAl’5−Na01l 緩衝液(p
H9,9−10,4) 1.0 mlにイソ酵素標品
を50μ2加え37°Cで5分間予加温し、直ちに80
、5 mM NADを0.1mA添加した。以下、参考
例1と同様に測定した結果を参考例1と比較対照するた
めに第3図に示した。図中、−・−は11い−ム〜は1
13Mを表す。
た試薬を準備し参考例1と同様に一連の種種のpHに調
製した試薬、すなわち、タンパク質変性剤として尿素5
00mFを含み、160mMのDL−乳酸リチウムを含
む230 mM CAl’5−Na01l 緩衝液(p
H9,9−10,4) 1.0 mlにイソ酵素標品
を50μ2加え37°Cで5分間予加温し、直ちに80
、5 mM NADを0.1mA添加した。以下、参考
例1と同様に測定した結果を参考例1と比較対照するた
めに第3図に示した。図中、−・−は11い−ム〜は1
13Mを表す。
第3図より、タンパク質変性剤を含まない参考例(−〇
−1−へ−)の場合は37℃におけるpH値とし°ζp
l+ 10.25が至適であり、タンパク質変性剤(尿
素)を含む参考例(−・−1−ム−)の場合のpHはp
if I O,15が至適である。即ち、それらのpH
において113Mは前述の相対活性として1%単位以下
となり、かつ114は135%単位以上に保持される。
−1−へ−)の場合は37℃におけるpH値とし°ζp
l+ 10.25が至適であり、タンパク質変性剤(尿
素)を含む参考例(−・−1−ム−)の場合のpHはp
if I O,15が至適である。即ち、それらのpH
において113Mは前述の相対活性として1%単位以下
となり、かつ114は135%単位以上に保持される。
これらの至適pl+から通常のpi測測定管理幅である
±0.05pl+の幅を単位とじて、第3図からH4及
びIl、Pの活性に及ぼす上述の試薬溶液のpHの影響
を第3図から読み取った結果を第1表に示す。
±0.05pl+の幅を単位とじて、第3図からH4及
びIl、Pの活性に及ぼす上述の試薬溶液のpHの影響
を第3図から読み取った結果を第1表に示す。
第3図及び第1表で明らかなように試薬溶液のpHが至
適pHより高い場合は、尿素を添加してもしなくても、
113Mはほぼ完全に失活しており、また114も同様
の挙動をしめすが、pHが至適p++より低い場合は、
尿素を含む試薬の方が、含んでいない試薬よりもlhM
を著しく失活させている。すなわち、タンパク質変性剤
として尿素を含む試薬は、それを含まないpHのみの作
用でlhMを失活させる試薬よりも、pl+が低い側に
多少変化しても活性測定結果に混入するlI:1Mの残
存活性が小さいので114を十分正確に測定できる。
適pHより高い場合は、尿素を添加してもしなくても、
113Mはほぼ完全に失活しており、また114も同様
の挙動をしめすが、pHが至適p++より低い場合は、
尿素を含む試薬の方が、含んでいない試薬よりもlhM
を著しく失活させている。すなわち、タンパク質変性剤
として尿素を含む試薬は、それを含まないpHのみの作
用でlhMを失活させる試薬よりも、pl+が低い側に
多少変化しても活性測定結果に混入するlI:1Mの残
存活性が小さいので114を十分正確に測定できる。
第 1 表
「参考例3」
pt+を10.15(37°C)に固定し、タンパクd
変性剤として500mMの尿素を含み160mMのDL
−乳酸リチウムを含む230 mM CAPS−NaO
II ”緩衝ン反(37℃におけるpH(直
として10.15) ′1、OmJに検体
としてI+4標品或いはH,M標品を50μl加え37
°Cで、種々の時間予加温し、たたちに80.5 mM
NADを添加して、同温度(37℃)でNADを添加
後、1分間後から60秒間の340nmの吸光度の変化
を測定し、活性を求めた。その結果を第4図に示す。図
中、−〇−は11い−へ−は)(1、−・−は尿素含有
の場合の114、−ム−は尿素含有の場合のIIIMを
表す。
変性剤として500mMの尿素を含み160mMのDL
−乳酸リチウムを含む230 mM CAPS−NaO
II ”緩衝ン反(37℃におけるpH(直
として10.15) ′1、OmJに検体
としてI+4標品或いはH,M標品を50μl加え37
°Cで、種々の時間予加温し、たたちに80.5 mM
NADを添加して、同温度(37℃)でNADを添加
後、1分間後から60秒間の340nmの吸光度の変化
を測定し、活性を求めた。その結果を第4図に示す。図
中、−〇−は11い−へ−は)(1、−・−は尿素含有
の場合の114、−ム−は尿素含有の場合のIIIMを
表す。
また、第4図には、タンパク質変性剤を含まない、上述
と同様のpHに調製した試薬を使用して同じサンプルの
活性を測定し対照とした。
と同様のpHに調製した試薬を使用して同じサンプルの
活性を測定し対照とした。
(14標品の活性低下は両試薬ともほぼ同様の過程を示
し、0分間から5分間の予加温で140%単位から13
5%単位と僅かに失活するが、500mMの尿素を含む
試薬のほうが、113?標品に対する失活作用が著しく
大きく、5分間の予加温で11.に標品を失活させてい
る。
し、0分間から5分間の予加温で140%単位から13
5%単位と僅かに失活するが、500mMの尿素を含む
試薬のほうが、113?標品に対する失活作用が著しく
大きく、5分間の予加温で11.に標品を失活させてい
る。
すなわら、タンパク失変性剤として尿素を含む試薬を使
用すれば、検体中の114の失活が進行していない数分
間の予加温のうちに検体中の111Mを消失させるので
、短時間にしかもより正確に検体中の114活性がml
+定できる。
用すれば、検体中の114の失活が進行していない数分
間の予加温のうちに検体中の111Mを消失させるので
、短時間にしかもより正確に検体中の114活性がml
+定できる。
「参考例4」
37°CにおけろplI値としてpiを10.15に固
定し、タンパク質変性剤を全(含まない160mMのD
L=乳酸リチウムを含む230 mM CAPS−Na
O11緩衝液を組成とする試薬を使用し、試薬1 ml
に・″検体としてIL標品、或いはtlJ標品を50μ
l加□、′え37°Cで5分間予加温し、ただちに80
.5mM)’NADを添加して、1分間後から60秒間
の340nmの吸光度の変化を測定し、活性を求めた。
定し、タンパク質変性剤を全(含まない160mMのD
L=乳酸リチウムを含む230 mM CAPS−Na
O11緩衝液を組成とする試薬を使用し、試薬1 ml
に・″検体としてIL標品、或いはtlJ標品を50μ
l加□、′え37°Cで5分間予加温し、ただちに80
.5mM)’NADを添加して、1分間後から60秒間
の340nmの吸光度の変化を測定し、活性を求めた。
その結果、H4の相対活性は130%U残存しH:+M
は41%U残存した。
は41%U残存した。
「実施例1」
500mMの4辰に尿素を含む以外には参考例と同じp
l+及び組成を有する試薬を使用し、参考例4 ′と同
様に114及びII″3Mの残存活性を測定した。その
結果、114の相対活性は128%U残存し、Ihl’
は2%U以下に失、活した。
l+及び組成を有する試薬を使用し、参考例4 ′と同
様に114及びII″3Mの残存活性を測定した。その
結果、114の相対活性は128%U残存し、Ihl’
は2%U以下に失、活した。
「実施例2」
6001の濃度にチオ尿素を含む以外には参考例と同じ
pl+及び組成を有する試薬を使用し、参考例4と同様
に114及び113との残存活性を測定した。
pl+及び組成を有する試薬を使用し、参考例4と同様
に114及び113との残存活性を測定した。
その結果、)14の相対゛活性は118%U残存し、l
hMは4%U以下に失活した。
hMは4%U以下に失活した。
「実施例3」
60mMの4度にチオシアン酸ナトリウムを含む以外に
は参考例と同じpH及び組成を有する試薬を使用し、参
考例4と同様に114及びH3Mの残存活性を測定した
。その結果、11.の相対活性は128%U残存し、+
+3?lは4%U以下に失活した。
は参考例と同じpH及び組成を有する試薬を使用し、参
考例4と同様に114及びH3Mの残存活性を測定した
。その結果、11.の相対活性は128%U残存し、+
+3?lは4%U以下に失活した。
「実施例4」
60mMの′濃度に塩酸グアニジンを含む以外には参考
例と同じpH及び組成を有する試薬を使用し、参考例4
と同様に114及び111の残存活性を11111定し
た。その結果、ILの相対活性は121%U残存し、1
11Mは8%U以下に失活した。
例と同じpH及び組成を有する試薬を使用し、参考例4
と同様に114及び111の残存活性を11111定し
た。その結果、ILの相対活性は121%U残存し、1
11Mは8%U以下に失活した。
「実施例5」
400mMの濃度の尿素と30+nFIの濃度のNa5
CNの二つのタンパク質変性剤を含む以外には参考例と
同じpH及び組成を有する試薬を使用し、参考例4と同
様に114及び111Mの残存活性を測定した。その結
果、114の相対活性は129%U残存し、113Mは
1%U以下に失活した。
CNの二つのタンパク質変性剤を含む以外には参考例と
同じpH及び組成を有する試薬を使用し、参考例4と同
様に114及び111Mの残存活性を測定した。その結
果、114の相対活性は129%U残存し、113Mは
1%U以下に失活した。
「実施例6」
300mMの濃度の尿素と75mMの濃度の三塩化酢酸
の二種のタンパク質変性剤を含む以外には参考例と同し
pH及び組成を有する試薬を使用し、参考例4と同様に
114及び111Mの残存活性を測定した。
の二種のタンパク質変性剤を含む以外には参考例と同し
pH及び組成を有する試薬を使用し、参考例4と同様に
114及び111Mの残存活性を測定した。
その結果、H4の相対活性は121%U残存し、113
門は11%U以下に失活した。
門は11%U以下に失活した。
以上の実施例及び参考例4の結果をまとめたものを第2
表に示す。第2表より明らかなようにタンパクM変性剤
を含まないpH10,15の試薬では、37 ’C5分
間の予加温では1h11にはまだ大きな活性が残存して
いるのに対し、1種以上のタンパク質変性剤を含む実施
例1−6の試薬は、同じρ11で著しくLMを失活せし
めている。
表に示す。第2表より明らかなようにタンパクM変性剤
を含まないpH10,15の試薬では、37 ’C5分
間の予加温では1h11にはまだ大きな活性が残存して
いるのに対し、1種以上のタンパク質変性剤を含む実施
例1−6の試薬は、同じρ11で著しくLMを失活せし
めている。
第 2 表
従って、実施例1−6に示したように、一般にタンパク
質の変性剤として良くしられている物質を、アルカリ性
pl+の試薬に添加することにより、H4にたいしてよ
りも113Hに対する失活作用がより著しく向上し、こ
の発明の口約を達成することができる。また、上記以外
のタンパク質の変性剤も同はの作用を有することは、容
易にHh察可能である。
質の変性剤として良くしられている物質を、アルカリ性
pl+の試薬に添加することにより、H4にたいしてよ
りも113Hに対する失活作用がより著しく向上し、こ
の発明の口約を達成することができる。また、上記以外
のタンパク質の変性剤も同はの作用を有することは、容
易にHh察可能である。
本発明において、予加温処理のアルカIJ I’1Ep
Hおよびタンパク質変性剤の種類およびその濃度は特に
限定されるものではなく、また、予加温の温度および時
間も上述の値に限定されるものではない。
Hおよびタンパク質変性剤の種類およびその濃度は特に
限定されるものではなく、また、予加温の温度および時
間も上述の値に限定されるものではない。
実施例5−6に示したように、タンパク質の変性剤とし
て知られる薬剤を複数組み合わせても良好に作用する。
て知られる薬剤を複数組み合わせても良好に作用する。
従って、予加温の温度および時間と、試薬と検体の量比
など測定における外部条件を満たすようにして、I+、
と他のイソ酵素との安定性の差が最大となるpH及び1
種以上のタンパク質変性剤の組み合わせを選択すること
が望ましい。
など測定における外部条件を満たすようにして、I+、
と他のイソ酵素との安定性の差が最大となるpH及び1
種以上のタンパク質変性剤の組み合わせを選択すること
が望ましい。
また、上記実施例には、第1の試薬溶液中に基質として
DL−乳酸を含有させ使用したが、これは第2の試薬ン
容液中に補酵素NADと共に含有させてもよい、さらに
は、第1の試薬溶液のpHを第2の試T!溶液の添加に
より、中性から酸性側に多行できるよう十分な′f′f
t衝能を有した緩衝)色にて第2のΔ工(薬を(1η成
すれば、基質としてピルビン酸を、補酵素としてN A
D 11を採用することも可能である。
DL−乳酸を含有させ使用したが、これは第2の試薬ン
容液中に補酵素NADと共に含有させてもよい、さらに
は、第1の試薬溶液のpHを第2の試T!溶液の添加に
より、中性から酸性側に多行できるよう十分な′f′f
t衝能を有した緩衝)色にて第2のΔ工(薬を(1η成
すれば、基質としてピルビン酸を、補酵素としてN A
D 11を採用することも可能である。
本発明者らが既に特開昭59−74998に開示し、て
いたヒト血清LDIIイソ酵素の測定法は、ヒト血清を
アルカリ処理をするという極めて簡単な操作および試薬
で、ヒト血清に共存するLDHの分別測定を可能にした
。しかし、測定条件を厳密に限定しなくてはならないと
いう点に改善の余地があった。
いたヒト血清LDIIイソ酵素の測定法は、ヒト血清を
アルカリ処理をするという極めて簡単な操作および試薬
で、ヒト血清に共存するLDHの分別測定を可能にした
。しかし、測定条件を厳密に限定しなくてはならないと
いう点に改善の余地があった。
本発明によるLDHイソ酵素(++4)測定試薬は、従
来、電気永動などの分離分析、あるいは免疫学的方法な
ど、煩雑であったLDHイソ酵素の分析を多くの機種の
自動分析機への応用を可能ならしめたばかりでなく、測
定精度および正確度の優れた経済的な測定試薬を供給で
きるので、LDHイソ酵素の分析手段として、日常臨床
検査に極めて有用である。
来、電気永動などの分離分析、あるいは免疫学的方法な
ど、煩雑であったLDHイソ酵素の分析を多くの機種の
自動分析機への応用を可能ならしめたばかりでなく、測
定精度および正確度の優れた経済的な測定試薬を供給で
きるので、LDHイソ酵素の分析手段として、日常臨床
検査に極めて有用である。
「発明の効果」
以上のように、アルカリ性piによる失活作用と、タン
パク質の変性剤の作用を組み合わせた、本発明のヒト血
清中のL叶イソ酵素の測定試薬は、アルカリ性p++の
みの場合の試薬製造上の問題点を解決し、添加するタン
パク質の変性剤の作用を更に効果的に発揮させることに
より、従来にない優れたヒト血清中のLDIIイソ酵素
の測定試薬を提供することができる。
パク質の変性剤の作用を組み合わせた、本発明のヒト血
清中のL叶イソ酵素の測定試薬は、アルカリ性p++の
みの場合の試薬製造上の問題点を解決し、添加するタン
パク質の変性剤の作用を更に効果的に発揮させることに
より、従来にない優れたヒト血清中のLDIIイソ酵素
の測定試薬を提供することができる。
第1図は、各臓器におけろ各LDHイソ酵素の含有率を
示すグラフ図である。 第2図は、タンパク質の変性剤を含まない、種種のpH
に調製された試薬を使用して、各1.D I+イソ酵素
を予加温した後の各LDIIイソ酵素のpH値による失
活の状態を図示したグラフ図である。 第3図は、第2図と同様のことを37°c、 5分間
実施し、タンパク質の変性剤として尿素を500mM添
加し、種々のpHに調製した試薬により114(−〇−
1−・−)、及び)13門(−へ−2−ム一)標品の活
性を測定して変性剤を添加しまたもの(−・−1−ム−
)と、添加しなかったもの(−〇−9−△−)とを比較
したグラフ図である。 第4図は、試薬のpH値を固定し、予加’/L時間を変
えて、H4(0,−・−)、及び1134(−△−1−
ム−)標品の残存活性を測定し、タンパク質の変性剤と
して尿素を添加しfこもの(−・−3−ム−)と、添加
しなかったもの(−〇−1−へ−)との1(3旧こ対す
る失活作用を比較したグラフ図である。 第1図
示すグラフ図である。 第2図は、タンパク質の変性剤を含まない、種種のpH
に調製された試薬を使用して、各1.D I+イソ酵素
を予加温した後の各LDIIイソ酵素のpH値による失
活の状態を図示したグラフ図である。 第3図は、第2図と同様のことを37°c、 5分間
実施し、タンパク質の変性剤として尿素を500mM添
加し、種々のpHに調製した試薬により114(−〇−
1−・−)、及び)13門(−へ−2−ム一)標品の活
性を測定して変性剤を添加しまたもの(−・−1−ム−
)と、添加しなかったもの(−〇−9−△−)とを比較
したグラフ図である。 第4図は、試薬のpH値を固定し、予加’/L時間を変
えて、H4(0,−・−)、及び1134(−△−1−
ム−)標品の残存活性を測定し、タンパク質の変性剤と
して尿素を添加しfこもの(−・−3−ム−)と、添加
しなかったもの(−〇−1−へ−)との1(3旧こ対す
る失活作用を比較したグラフ図である。 第1図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1(イ)タンパク質変性剤を含有せるアルカリ性領域の
pH緩衝液である第1の試薬溶液 (ロ)少なくとも補酵素を含有せる第2の試薬溶液 上記(イ)及び(ロ)を具備してなるLDHイソ酵素測
定試薬。 2 上記第1の試薬溶液に含有せるタンパク質変性剤が
、尿素、チオ尿素、チオシアン酸塩、グアニジン及び三
塩化酢酸からなるグループから選ばれる一種類以上であ
る特許請求の範囲第1項記載のLDHイソ酵素測定試薬
。 3 上記第1の試薬溶液のpHがpH10からpH11
の範囲である特許請求の範囲第1項記載のLDHイソ酵
素測定試薬。 4 上記第1の試薬溶液、或いは第2の試薬溶液のいず
れかにLDHの基質を含有せる特許請求の範囲第1項記
載のLDHイソ酵素測定試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61122293A JPS62278997A (ja) | 1986-05-29 | 1986-05-29 | Ldhイソ酵素測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61122293A JPS62278997A (ja) | 1986-05-29 | 1986-05-29 | Ldhイソ酵素測定試薬 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62278997A true JPS62278997A (ja) | 1987-12-03 |
Family
ID=14832369
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61122293A Pending JPS62278997A (ja) | 1986-05-29 | 1986-05-29 | Ldhイソ酵素測定試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62278997A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0352547A2 (en) * | 1988-07-15 | 1990-01-31 | International Reagents Corporation | LDH1 assay |
WO1990001067A1 (en) * | 1988-07-25 | 1990-02-08 | Boehringer Mannheim Corporation | Reagent for use in ld-1 assay |
WO1995029255A1 (en) * | 1994-04-21 | 1995-11-02 | Medilite Diagnostika | Luminescence-based diagnostics |
US7300769B2 (en) * | 2000-01-15 | 2007-11-27 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Stabilized coenzyme solutions for determining dehydrogenase activity |
-
1986
- 1986-05-29 JP JP61122293A patent/JPS62278997A/ja active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0352547A2 (en) * | 1988-07-15 | 1990-01-31 | International Reagents Corporation | LDH1 assay |
WO1990001067A1 (en) * | 1988-07-25 | 1990-02-08 | Boehringer Mannheim Corporation | Reagent for use in ld-1 assay |
WO1995029255A1 (en) * | 1994-04-21 | 1995-11-02 | Medilite Diagnostika | Luminescence-based diagnostics |
US5624813A (en) * | 1994-04-21 | 1997-04-29 | Mahant; Vijay K. | NAD(P)+ /NAD(P)H based chemiluminescent diagnostics |
US7300769B2 (en) * | 2000-01-15 | 2007-11-27 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Stabilized coenzyme solutions for determining dehydrogenase activity |
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