JPS62278997A

JPS62278997A - Ｌｄｈイソ酵素測定試薬

Info

Publication number: JPS62278997A
Application number: JP61122293A
Authority: JP
Inventors: Yoshitaka Shirakawa; 白川　義貴; Norimasa Takizawa; 滝沢　徳正
Original assignee: YATORON KK; Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: YATORON KK; Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Priority date: 1986-05-29
Filing date: 1986-05-29
Publication date: 1987-12-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３、発明の詳細な説明「産業上の利用分野」本発明は乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄ
ｏｒｏｇｅ−ｎａｓｅ、　ＥＣ１，１，１，２７以下Ｌ
ＤＨと略す）のイソ酵素のうちの心筋型ＬＤＨイソ酵素
活性を測定する３ｊＥ　ｆｆに関し、特に心筋に豊富に
存在するＩ］サブユニットのみから構成されるしＤＩ＋
イソ醇素（以下、１１４と略す）の活性を特異的に測定
する試薬に関する。

「従来の技術」ＬＤｌｉは次の反応を触媒するＬ−乳酸＋ＮＡＤ’士＝＝ピルヒ゛ン酸＋１１八〇＋１
上記反応弐において、Ｌ−乳酸及びピルビン酸はＬＤＨ
の基質であり、ＮＡＤ及びＮＡＤＩ＋は１１１晶γ素で
ある。

ヒトのＬＤＩＩの１分子は４個のサブユニットからなる
複合体として存在する。ＬＤＨを構成するサブユニット
は、心筋型サブユニット（１−１）と骨格筋型ナブユニ
ノト（Ｍ）の２種類が存在する。従って、それろのサブ
ユニットの組み合わせから、ＬＤＨには、１１４　、１
１３　Ｍ　、　ＩＩ□と２，１団３８Ｍ４として示され
るような５種類のイソ酵素が存在する。

これらイソ酵素は、臓器によりそれらの分布が異なって
いることが知られている。第１図（エフポルプレスキー
等Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉＯＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａ
ｒＤｉｓｅａｓｅ　６巻、　　６３ｐ、　１９６３年）
に各臓器における各ＬＤＨイソ酵素の含有率を示す。

これらイソ酵素のうち、第１図によっても明らかなよう
に、心臓にはＩＩサブユニットのみから構成されるＬＤ
Ｈイソ酵素が他の臓器よりも高い割合で含まれる。従っ
て、心筋梗塞のような疾病を被った際には、血流中に心
筋■熾から心筋型Ｌｌ）ＩＩイソ酵素が逸脱し、血清中
の同イソ酵素活性測定値が増大する。この血・清中１１
．の活性を測定すれば、心筋梗塞等の循環器疾患のしｎ
床診断、特に発病時や予後の判定などに重要な情報を与
えることができる。

そこで従来、ＬＤＨの各イソ酵素は尿素や塩酸グアニジ
ン添加による安定性に差がある性質を利用して、Ｅｍｅ
ｒｙ　ら（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉｍ、へｃｔａ１９巻、１
５９頁、　１６９８年）は、尿素存在下、ＬＤＨの活性
を測定する、Ｈ４や１１３Ｍのような心筋型ＬＤＨイソ
酵素群の測定法を提示している。しかし、尿素による阻
害（失活）だけでは、１（４や１！１のような心筋型Ｌ
ＤＨイソ酵素群とＭ４を分別できたが１１４のみを分離
定量するには至らなかった。

これに対し、本発明者らは、すでに特公昭６０−２８２
８０に心筋型ＬＤＩ！イソ酵素群が骨格筋型ＬＤＨイソ
酵素群よりもアルカリ性ｐＨにおいて安定であり、この
性質を利用することにより）１４を特異的にしかも簡便
に測定する方法を提案し、さらに、特開昭５９−７４９
９８に種々のアルカリ性ρ１１の試薬中における各ＬＤ
Ｈイソ酵素の安定性の差を利用して、個々のイソ酵素活
性を個別に測定する方法を提案した。

本発明者らが提案した特公昭６０−２８２８０等の概略
は、アルカリ性ｐＨのもとてヒト血清を予加温すること
を特徴とするものであり、この方法によれば１１４に対
する特異的な活性測定が可能である。

ＥｃｈｆｅｌｄＬらの報告（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ
＋ｎ１ｓｔｒｙ　３０／１１＋１８２１１８２４、１９
８４）によれば、この方法を自動分析に応用し、ヒト血
清中の心筋型ＬＤＨイソ酵素を簡便に測定している。

しかし、上記の方法は、原理的には優れたものであるが
、心筋型ＬＤＨイソ酵素Ｈ４を特異的に測定する為には
、ｐｌ＋が１０以上のアルカリ性ρＩＩでしかも高度に
管理されたｐＨの試薬を用いる必要があった。

というのは、憧沢ら（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓ
むｒｙ　２９巻、１１号、　１９４１−１９４５頁、　
１９８３年）の報告に基づき、タンパク質変性剤を含ま
ない、種々のｐｌ＋に調製された試薬を使用して、各Ｌ
ＤＨイソ酵素を３０°ＣでＩＯ分間予加温した後の各り
叶イソ酵素のｐＨによる失活の状態を図示したものが第
２図であるが（図中−〇＝−は１１４．−△−はＩＩ　
３Ｍ　、−口−は１１□Ｍ２゜−×−はＩＩＭ、、−・
−はＭ４を表す）、第２図に示したごと＜　、１１４　
（第２図における一〇−）を箭い活性に保持し、しかも
Ｍサブユニットを１個含むＬＤＩＩ　（ｌｈＭ）　（以
下Ｈ３パと略す、第２図における一△−）を失活せしめ
るｐｌ＋領域を至適ｐｌＨ＋Ｉ域とすれば、そのｐｌ＋
は３０“ｃ　Ｔ：　１０．６であることを示している。

その至適ｐＨ領域から酸性側に試薬のｐＨが外れるほど
Ｈｌが指数関数的に残存し、また、逆に、アルカリ側に
外れると測定対象のＩＬ自体が大きな失活を余儀なくさ
れる。すなわち、上記の様な原理にもとづいてアルカリ
性ｐｌ＋のみの作用に依存した試薬で１１４を特異的に
精度よく測定しようとすれば、アリカル性ｐＨ自身の著
しく強力な失活作用が１１４にも及ぶ。従ってそれを避
けるためには、可能なかぎり狭いｐＨ範囲に試薬を調製
し、維持管理しなければならないが、その点に改善の余
地があった。

「発明が解決しようとする問題点」本発明者らは、以上のような、問題点を解決するために
種々検討した結果、タンパク質変性剤をアルカリ性の試
液に組み合わせて試薬を構成すれば、アルカリ性試液の
みによる処理の場合よりも、１（４を高活性に保持した
状態で１１３１その他のイソ酵素を効率よく失活せしめ
ることができ、より１１４′活性測定に対して特異的な
試薬を構成することを見出し本発明を完成するに至った
。

「問題点を解決する為の手段」すなわち、本発明は、（イ）タンパク質変性剤を含有せるアルカリ性領域のｐ
Ｈ緩衝液である第１の試薬溶液（ロ）少なくとも補酵素を含有せる第２の試薬溶液上記（イ）及び（ロ）を具備してなるＬＤＨイソ酵素測
定試薬である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に用いられる第１の試薬溶液（イ）は、タンパク
質変性剤を含有せるアルカリ性領域のｐｌ＋緩衝液であ
り、検体中の１１４以外のＬＤＨイソ酵素を失活させる
働きをするものである。また必要に応し基質である乳酸
又はピルビン酸を含む。

アルカリ性ｐｉの緩衝液とは、ｐ］（７以上、１４以下
の範囲の水素イオン活ｆｆｉ　？Ｈ度を一定に保つため
に緩衝能を付与された水）容）佼であり、例えばアルカ
リ性領域のｐｌ＋標準液としても広く用いられているホ
ウ酸塩や炭酸塩の水溶液などは代表的である。

この第１の試薬溶液（イ）はアルカリ性領域のｐＨを使
用するが、特に＋１４以外のＬＤＨイソ酵素失活の効果
の点からｐＨｌｏからｐＨ１１の範囲のｐＨが好ましく
、このρＩＩ範囲に緩衝能を存する、換言すれば酸解離
定数のｐ関数値すなわちｐＫａを有する緩衝剤の酸型と
塩基型のｌＲ合物の水溶液を使用する。

本発明の第１の試薬溶液（イ）の要求するｐＨ範囲の緩
衝剤としては、ｐＫａ値が１（５−１１の範囲である薬
剤であれば任意に選択できるが、４１衝剤としての安定
性などの点から、３−〔シクロヘキシルアミノコ−１−
プロパンスルフォン酸（以下ＣＡＰＳと略す、ｐＫａ＝
　１０．４　）が、好適である。

上記緩衝液に含有されるタンパク質変性剤は、タンパク
質の一次構造には変（ヒを与えず、もっばら二次、三次
、四次構造などの立体＋Ｍ　Ｍに変化を与えるものであ
り、例えば、尿素、チオ尿素、グアニジン、チオシアン
酸塩、三塩化酢酸などの一般にカオトロピックイオンと
して知られている薬剤、及びドデシル硫酸塩などの界面
活性剤などである。本発明の第１試薬に含有するタンパ
ク質変性剤の作用に関しては、４個のサブユニット構造
を有するＬＤＩＩの高次構造を不可逆的に変性せしめ、
酵素活性を消失させるものと考えられる。

上記に示したタンパク質変性剤のうち、尿素以外の薬剤
は比較的低い濃度で激しく作用するので、薬剤添加量の
管理の点からは、比較的穏和に作用する尿素が好ましく
用いられる。

緩衝；夜中のタンパク質変性剤の１温度は、前記アルカ
リ性ｐｌ＋と相俟って検体中の１１４以外のＬＤＨイソ
酵素を失活させるに足る濃度であり、緩衝液のｐＨとも
関係するが、例えば尿素の場合ｐｌ＋　１０．１５（ａ
Ｌ３７°Ｃ）で２００　１０００＋ｎＭ、１ｆｆ１度で
ある。

本発明に用いられる第２の試薬溶液（ロ）は、少なくと
も補酵素を含有する水）容液、或いは緩衝液であり、検
体中のＬＤＩＩイソ酵素の第１の試薬溶液（イ）の作用
による失活反応を停止するとともに、酵素反応を開始さ
せる働きをするものである。

この第２の試薬）容液（ロ）中の補酵素はＮＡＤ又はＮ
ＡＤ１１である。但し、第１の試ｍ　？Ｈ液（イ）のよ
うなアルカリ性ｐＨ領域では、ピルビン酸を基質とし補
酵素をＮＡＤ１１とした酵素反応は著しく進行しないの
で、この場合は第２の試薬溶液（ロ）を添加することに
より、第１の試薬；−１ン（Ｗ（イ）によってもたらさ
れたアルカリ性ｐＨを中性付近の安定したｐｌ＋に移行
（中和）せしめるようにする。即ち、少なくともＮＡＤ
１１を含有する第２の試薬溶液（ロ）には、第１の試薬
溶液のｐＨ緩衝剤の含有量を上回る量の中性ｐｌ＋の緩
衝剤を供給できるようにするが、或いは第２の試薬溶液
を添加するに先立って、検体を含む第１の試薬溶液を中
和する為の第３の試薬を添加する必要がある。

いずれにせよ、ピルビン酸を基ｆ１としＮＡＤを補酵素
とする場合は第２の試薬〆合液（ロ）或いは第３の試薬
等の添加により酵素反応系の組成が腹誰になり、調製及
び管理が容易ではな（なり、試液の分注操作なども困難
を伴う。従って、本発明の場合は、乳酸を基質としＮＡ
Ｄを１１１１１ｇ素として１￥用するのが簡便であり推
奨されろ。

本発明のＬＤＨイソ酵素測定試薬によるヒト血（１′１
′中の１１．ＬＤｌ＋イソ酵素活性の測定は、検体を本
発明の第１の試薬溶液（イ）、即ちタンパク質変性剤を
含むアルカリｐｌ＋の緩衝液中で、一定時間、例えば５
分間、一定温度、例えば）バ氏３０度あるいは３７度で
予加温した後、少なくとも補酵素を含む第２試薬を添加
混合し、公知のＬＤＨ測定法によって活性を測定する。

公知のＬＤＨ測定法とは、■生成、或いは消費されるＮ
ＡＤ１１の３４０ｎｍの吸光度の増減を追跡するＶＵ法
、■生成するＮＡＤ１１をジアホラーゼ等を介してテト
ラゾリウム塩等の色素を還元し発色させて、可視部の吸
光度増加（或いは減少）を追跡する比色法、などが代表
的な方法である。その他■生成するＮ　Ａ　Ｄ　ＩＩの
３４０ｎｍの光で励起される青色の螢光強度を追跡する
方法や、■生成する乳酸、或いはピルビン酸を酸素電極
法などの手法で測定してもよく、公知の様々な測定方法
によってＬＤＩＩの酵素活性が測定できる。

例えば、本発明の実施例では基質として乳酸、補酵素を
ＮＡＤとし、活性測定をＵＶ法で行なっているが、この
場合の測定手順及び評価方法を要約すると以下のごとく
である。

検体が、第１の試薬溶液（イ）によって３７°Ｃで５分
間予加温されたのち第２の試薬？８液（ロ）を添加する
と、ＮＡＤが供給され、第１の試薬溶液の作用であるＬ
ＤＨイソ酵素の失活作用が停止し、同時に残存したＬＤ
Ｈイソ酵素の３７°Ｃでの酵素反応が開始する（実施例
では、基質の乳酸は（イ）に添加）。酵素反応が開始す
るとピルビン酸とＮＡＰ）ＩＩが生成し、３４０ｎｍの
吸光度が経時的に増加する。この３４０ｎｍの吸光度の
直線的に増加する部分を酵素反応速度として測定した後
、Ｎ　Ａ　Ｄ　１１の分子吸光係数（６２００（Ｍ　ｃ
ｍ−’））から１分間当たり生成するＮＡＤ１１のμｍ
ｏｌｅ数を計算して、検体１リツター当たりの単位とし
て酵素活性値を計算する。

本発明の場合、検体中の１１４以外のＬＤＨイソ酵素は
、前記第１の試薬溶液（イ）の作用により、５分間の予
加温のうちにことごとく失活しているので、ＮＡＤを含
む第２の試薬溶液を添加した後、上述のごと＜　　ＬＤ
Ｈ活性を測定することにより、ＬＤＨイソ酵素１１４の
活性が求められる。

以下、実施例および参考例にもとづいて、本発明をさら
に詳細に説明する。

「参考例１」 ■４およびＩｈＭ　　（ヒト血液より精製した標品、以
後の参考例および実施例におけるイソ酵素標品はこれを
用いた。）を一連の種々のｐＨ９，９−１０，４に調製
した緩衝液中で予加温したときの活性を測定した。詳し
くは、１６０ｍＭのＤＬ−乳酸リチウムを含む２３０　
ｍＭ　ＣＡＰＳ−ＮａＯｔｌ　！、ｆｉｔ衝液（ｐＨ９
，９−１０，４）１．０　ｍｌにイソ酵素標品を５０μ
ｌ加え３７°Ｃで、５分間予加温し、ただちに８０．５
ｍＭのＭＡＤを０．１ｍ１２添加した。

同温度（３７°Ｃ）でＮＡＤ添加後、１分間後から６０
秒間の３４０ｎｍの吸光度の変化を測定し、活性を求め
た。対照として、Ｌ−乳酸およびＮＡＤを基質とし、ｐ
Ｈ値８．７で測定する公知のニス・エヌ・プールらの方
法（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　ＣｈｅｍｉｓＬｒｙ　２４巻１
８２８−８３１頁、　１９７８年）によって活性測定を
おこない、その測定値を１００％としたときの相対活性
（以後、％単位、或いは％Ｕと表記する）を求めた。そ
の結果を第３図に示す。図中、−〇−はＨ，、−△−は
１１１Ｍを表す。

「参考例２」予め試薬に尿素を５００ｍＭの濃度になるように添加し
た試薬を準備し参考例１と同様に一連の種種のｐＨに調
製した試薬、すなわち、タンパク質変性剤として尿素５
００ｍＦを含み、１６０ｍＭのＤＬ−乳酸リチウムを含
む２３０　ｍＭ　ＣＡｌ’５−Ｎａ０１ｌ　緩衝液（ｐ
Ｈ９，９−１０，４）　　１．０　ｍｌにイソ酵素標品
を５０μ２加え３７°Ｃで５分間予加温し、直ちに８０
、５　ｍＭ　ＮＡＤを０．１ｍＡ添加した。以下、参考
例１と同様に測定した結果を参考例１と比較対照するた
めに第３図に示した。図中、−・−は１１い−ム〜は１
１３Ｍを表す。

第３図より、タンパク質変性剤を含まない参考例（−〇
−１−へ−）の場合は３７℃におけるｐＨ値とし°ζｐ
ｌ＋　１０．２５が至適であり、タンパク質変性剤（尿
素）を含む参考例（−・−１−ム−）の場合のｐＨはｐ
ｉｆ　Ｉ　Ｏ，１５が至適である。即ち、それらのｐＨ
において１１３Ｍは前述の相対活性として１％単位以下
となり、かつ１１４は１３５％単位以上に保持される。

これらの至適ｐｌ＋から通常のｐｉ測測定管理幅である
±０．０５ｐｌ＋の幅を単位とじて、第３図からＨ４及
びＩｌ、Ｐの活性に及ぼす上述の試薬溶液のｐＨの影響
を第３図から読み取った結果を第１表に示す。

第３図及び第１表で明らかなように試薬溶液のｐＨが至
適ｐＨより高い場合は、尿素を添加してもしなくても、
１１３Ｍはほぼ完全に失活しており、また１１４も同様
の挙動をしめすが、ｐＨが至適ｐ＋＋より低い場合は、
尿素を含む試薬の方が、含んでいない試薬よりもｌｈＭ
を著しく失活させている。すなわち、タンパク質変性剤
として尿素を含む試薬は、それを含まないｐＨのみの作
用でｌｈＭを失活させる試薬よりも、ｐｌ＋が低い側に
多少変化しても活性測定結果に混入するｌＩ：１Ｍの残
存活性が小さいので１１４を十分正確に測定できる。

第　　　　１　　　　表「参考例３」ｐｔ＋を１０．１５（３７°Ｃ）に固定し、タンパクｄ
変性剤として５００ｍＭの尿素を含み１６０ｍＭのＤＬ
−乳酸リチウムを含む２３０　ｍＭ　ＣＡＰＳ−ＮａＯ
ＩＩ　　　　　　”緩衝ン反（３７℃におけるｐＨ（直
として１０．１５）　　　　　　　′１、ＯｍＪに検体
としてＩ＋４標品或いはＨ，Ｍ標品を５０μｌ加え３７
°Ｃで、種々の時間予加温し、たたちに８０．５　ｍＭ
　ＮＡＤを添加して、同温度（３７℃）でＮＡＤを添加
後、１分間後から６０秒間の３４０ｎｍの吸光度の変化
を測定し、活性を求めた。その結果を第４図に示す。図
中、−〇−は１１い−へ−は）（１、−・−は尿素含有
の場合の１１４、−ム−は尿素含有の場合のＩＩＩＭを
表す。

また、第４図には、タンパク質変性剤を含まない、上述
と同様のｐＨに調製した試薬を使用して同じサンプルの
活性を測定し対照とした。

（１４標品の活性低下は両試薬ともほぼ同様の過程を示
し、０分間から５分間の予加温で１４０％単位から１３
５％単位と僅かに失活するが、５００ｍＭの尿素を含む
試薬のほうが、１１３？標品に対する失活作用が著しく
大きく、５分間の予加温で１１．に標品を失活させてい
る。

すなわら、タンパク失変性剤として尿素を含む試薬を使
用すれば、検体中の１１４の失活が進行していない数分
間の予加温のうちに検体中の１１１Ｍを消失させるので
、短時間にしかもより正確に検体中の１１４活性がｍｌ
＋定できる。

「参考例４」３７°ＣにおけろｐｌＩ値としてｐｉを１０．１５に固
定し、タンパク質変性剤を全（含まない１６０ｍＭのＤ
Ｌ＝乳酸リチウムを含む２３０　ｍＭ　ＣＡＰＳ−Ｎａ
Ｏ１１緩衝液を組成とする試薬を使用し、試薬１　ｍｌ
に・″検体としてＩＬ標品、或いはｔｌＪ標品を５０μ
ｌ加□、′え３７°Ｃで５分間予加温し、ただちに８０
．５ｍＭ）’ＮＡＤを添加して、１分間後から６０秒間
の３４０ｎｍの吸光度の変化を測定し、活性を求めた。

その結果、Ｈ４の相対活性は１３０％Ｕ残存しＨ：＋Ｍ
は４１％Ｕ残存した。

「実施例１」５００ｍＭの４辰に尿素を含む以外には参考例と同じｐ
ｌ＋及び組成を有する試薬を使用し、参考例４　′と同
様に１１４及びＩＩ″３Ｍの残存活性を測定した。その
結果、１１４の相対活性は１２８％Ｕ残存し、Ｉｈｌ’
は２％Ｕ以下に失、活した。

「実施例２」６００１の濃度にチオ尿素を含む以外には参考例と同じ
ｐｌ＋及び組成を有する試薬を使用し、参考例４と同様
に１１４及び１１３との残存活性を測定した。

その結果、）１４の相対゛活性は１１８％Ｕ残存し、ｌ
ｈＭは４％Ｕ以下に失活した。

「実施例３」６０ｍＭの４度にチオシアン酸ナトリウムを含む以外に
は参考例と同じｐＨ及び組成を有する試薬を使用し、参
考例４と同様に１１４及びＨ３Ｍの残存活性を測定した
。その結果、１１．の相対活性は１２８％Ｕ残存し、＋
＋３？ｌは４％Ｕ以下に失活した。

「実施例４」６０ｍＭの′濃度に塩酸グアニジンを含む以外には参考
例と同じｐＨ及び組成を有する試薬を使用し、参考例４
と同様に１１４及び１１１の残存活性を１１１１１定し
た。その結果、ＩＬの相対活性は１２１％Ｕ残存し、１
１１Ｍは８％Ｕ以下に失活した。

「実施例５」４００ｍＭの濃度の尿素と３０＋ｎＦＩの濃度のＮａ５
ＣＮの二つのタンパク質変性剤を含む以外には参考例と
同じｐＨ及び組成を有する試薬を使用し、参考例４と同
様に１１４及び１１１Ｍの残存活性を測定した。その結
果、１１４の相対活性は１２９％Ｕ残存し、１１３Ｍは
１％Ｕ以下に失活した。

「実施例６」３００ｍＭの濃度の尿素と７５ｍＭの濃度の三塩化酢酸
の二種のタンパク質変性剤を含む以外には参考例と同し
ｐＨ及び組成を有する試薬を使用し、参考例４と同様に
１１４及び１１１Ｍの残存活性を測定した。

その結果、Ｈ４の相対活性は１２１％Ｕ残存し、１１３
門は１１％Ｕ以下に失活した。

以上の実施例及び参考例４の結果をまとめたものを第２
表に示す。第２表より明らかなようにタンパクＭ変性剤
を含まないｐＨ１０，１５の試薬では、３７　’Ｃ５分
間の予加温では１ｈ１１にはまだ大きな活性が残存して
いるのに対し、１種以上のタンパク質変性剤を含む実施
例１−６の試薬は、同じρ１１で著しくＬＭを失活せし
めている。

第　　　　２　　　　表従って、実施例１−６に示したように、一般にタンパク
質の変性剤として良くしられている物質を、アルカリ性
ｐｌ＋の試薬に添加することにより、Ｈ４にたいしてよ
りも１１３Ｈに対する失活作用がより著しく向上し、こ
の発明の口約を達成することができる。また、上記以外
のタンパク質の変性剤も同はの作用を有することは、容
易にＨｈ察可能である。

本発明において、予加温処理のアルカＩＪ　Ｉ’１Ｅｐ
Ｈおよびタンパク質変性剤の種類およびその濃度は特に
限定されるものではなく、また、予加温の温度および時
間も上述の値に限定されるものではない。

実施例５−６に示したように、タンパク質の変性剤とし
て知られる薬剤を複数組み合わせても良好に作用する。

従って、予加温の温度および時間と、試薬と検体の量比
など測定における外部条件を満たすようにして、Ｉ＋、
と他のイソ酵素との安定性の差が最大となるｐＨ及び１
種以上のタンパク質変性剤の組み合わせを選択すること
が望ましい。

また、上記実施例には、第１の試薬溶液中に基質として
ＤＬ−乳酸を含有させ使用したが、これは第２の試薬ン
容液中に補酵素ＮＡＤと共に含有させてもよい、さらに
は、第１の試薬溶液のｐＨを第２の試Ｔ！溶液の添加に
より、中性から酸性側に多行できるよう十分な′ｆ′ｆ
ｔ衝能を有した緩衝）色にて第２のΔ工（薬を（１η成
すれば、基質としてピルビン酸を、補酵素としてＮ　Ａ
　Ｄ　１１を採用することも可能である。

本発明者らが既に特開昭５９−７４９９８に開示し、て
いたヒト血清ＬＤＩＩイソ酵素の測定法は、ヒト血清を
アルカリ処理をするという極めて簡単な操作および試薬
で、ヒト血清に共存するＬＤＨの分別測定を可能にした
。しかし、測定条件を厳密に限定しなくてはならないと
いう点に改善の余地があった。

本発明によるＬＤＨイソ酵素（＋＋４）測定試薬は、従
来、電気永動などの分離分析、あるいは免疫学的方法な
ど、煩雑であったＬＤＨイソ酵素の分析を多くの機種の
自動分析機への応用を可能ならしめたばかりでなく、測
定精度および正確度の優れた経済的な測定試薬を供給で
きるので、ＬＤＨイソ酵素の分析手段として、日常臨床
検査に極めて有用である。

「発明の効果」以上のように、アルカリ性ｐｉによる失活作用と、タン
パク質の変性剤の作用を組み合わせた、本発明のヒト血
清中のＬ叶イソ酵素の測定試薬は、アルカリ性ｐ＋＋の
みの場合の試薬製造上の問題点を解決し、添加するタン
パク質の変性剤の作用を更に効果的に発揮させることに
より、従来にない優れたヒト血清中のＬＤＩＩイソ酵素
の測定試薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各臓器におけろ各ＬＤＨイソ酵素の含有率を
示すグラフ図である。第２図は、タンパク質の変性剤を含まない、種種のｐＨ
に調製された試薬を使用して、各１．Ｄ　Ｉ＋イソ酵素
を予加温した後の各ＬＤＩＩイソ酵素のｐＨ値による失
活の状態を図示したグラフ図である。第３図は、第２図と同様のことを３７°ｃ、　　５分間
実施し、タンパク質の変性剤として尿素を５００ｍＭ添
加し、種々のｐＨに調製した試薬により１１４（−〇−
１−・−）、及び）１３門（−へ−２−ム一）標品の活
性を測定して変性剤を添加しまたもの（−・−１−ム−
）と、添加しなかったもの（−〇−９−△−）とを比較
したグラフ図である。第４図は、試薬のｐＨ値を固定し、予加’／Ｌ時間を変
えて、Ｈ４（０，−・−）、及び１１３４（−△−１−
ム−）標品の残存活性を測定し、タンパク質の変性剤と
して尿素を添加しｆこもの（−・−３−ム−）と、添加
しなかったもの（−〇−１−へ−）との１（３旧こ対す
る失活作用を比較したグラフ図である。第１図

Claims

【特許請求の範囲】１（イ）タンパク質変性剤を含有せるアルカリ性領域の
ｐＨ緩衝液である第１の試薬溶液（ロ）少なくとも補酵素を含有せる第２の試薬溶液上記（イ）及び（ロ）を具備してなるＬＤＨイソ酵素測
定試薬。２　上記第１の試薬溶液に含有せるタンパク質変性剤が
、尿素、チオ尿素、チオシアン酸塩、グアニジン及び三
塩化酢酸からなるグループから選ばれる一種類以上であ
る特許請求の範囲第１項記載のＬＤＨイソ酵素測定試薬
。３　上記第１の試薬溶液のｐＨがｐＨ１０からｐＨ１１
の範囲である特許請求の範囲第１項記載のＬＤＨイソ酵
素測定試薬。４　上記第１の試薬溶液、或いは第２の試薬溶液のいず
れかにＬＤＨの基質を含有せる特許請求の範囲第１項記
載のＬＤＨイソ酵素測定試薬。