DE2548963C3

DE2548963C3 - Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB

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Publication number: DE2548963C3
Application number: DE2548963A
Authority: DE
Inventors: Erfinder Wird Nachtraeglich Benannt Der
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1975-11-03
Filing date: 1975-11-03
Publication date: 1982-03-11
Also published as: IL50803A0; GB1512328A; LU76112A1; JPS5257887A; FR2330010A1; SE7612175L; IE44183B1; NL190171C; CS200196B2; NL7612182A; FR2330010B1; BR7607257A; DK496476A; NL190171B; SE439380B; IE44183L; ZA766526B; IL50803A; DK151920C; AT359205B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Crcatinkinase-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit.

Die Bestimmung der Aktivität der Creatinkinase (ATP: Creatin-Phosphotransferase, E. C. 2.7.3.2; Abkürzung: CK) im Serum gilt als empfindlichste Labormethode bei der Diagnostik von Erkrankungen der Skelett- und Herzmuskulatur, speziell beim Myokardinfarkt. Die Unterscheidung von Traumatisierungen der Skelett- und Herzmuskulalur, speziell bei der Differcntialdiagnosc des Myokardinfarkts, ist aber schwierig. Durch die Bestimmung der CK-Gesamtaktivi(ät kann eine Differenzierung nicht mit Sicherheit erfolgen. Es ist deshalb versucht worden, die differcntialdiagnostische Aussagekraft der Bestimmung der CK-Aklivität zu erhohen, indem man die Aktivität weiterer Enzyme im Serum mißt und die Meßergebnisse miteinander korrelierl. /.. B. durch Bildung des Quotienten CK/Glu tamat-oxalaceint-transaminase. Quotienten dieser Art erlauben jedoch eine Verwendung bei der Differenzierung zwischen I lcrz- und Lungeninfarki oder zwischen Herzinfarkt und Schock-Folgen aus anderer Ursache ^ri nicht.

CK kommt im Körper in Form von drei Isocnzymcn vor, nämlich CK-MM, z_ B. im Muskel, CK-BB, z. B. im Gehirn und als Hybrid CK-MB (bestehend aus einer Untereinheit M und einer Untereinheit B), z. B. im

in Herzmuskel. Die im Blut (Serum) auftretende CK-Aktivität ist normalerweise auf das Isoenzym CK-MM zurückzuführen, da CK-BB nicht durch die Liquor-Blut-Schranke hindurchtritt und CK-MB auf bestimmte Organe (z. B. den Herzmuskel) beschränkt ist. Bei

ii Schädigungen des Herzmuskels (z. B. beim Herzinfarkt) wird CK-MB jedoch in das Blut (Serum) freigesetzt und läßt sich dort nachweisen.

Die quantitative Bestimmung dieses Isoenzyms neben CK-MM im Serum gilt als empfindlichste und

ίο differentialdiagnostisch aussagekräftigste Labormethode zum Nachweis des Herzinfarkts. Neben dem Herzmuskel enthalten zwar noch einige weitere Organe CK-MB (z.B. Pankreas, Zwerchfell, Aorta, Lunge und Uterus), jedoch ist die Aktivität in diesen Organen um den Faktor 100 geringer als im Herzmuskel, so daß eventuell aus den genannten Organen freigesetzte CK-MB-Aktivitäien unterhalb der Nachweisgrenze liegen.

Die bisher üblichen Aktivitätsbestimmungen von

jo CK-MB gingen im wesentlichen auf 3 Methoden zurück:

1. Elektrophorese auf verschiedenen Trägern. Die hiermit erhaltenen Ergebnisse sind bisweilen widersprüchlich; oft treten mehr Banden auf, als

3> Isoenzyme vorhanden sind (Artefakte).

2. Chromatographie an verschiedenen Säulenmaterialien. Diese Methode ist langwierig (mehrere Stunden effektiver Arbeitszeit) und nicht für Routineuntersuchungen geeignet. Die Ergebnisse

w verschiedener Untersuchter sind teilweise widersprüchlich.

3. Immunologische Bestimmung mit präzipitierenden Antikörpern. Diese Methode wird in den deutschen Offenlegungsschriften DE-OS 2128 670 und

j5 22 58 822 beschrieben und liefert z.B. bei der Quantifizierung von Isoenzymen der Aldolase und alkalischen Phosphatase gute Ergebnisse. Zur Bestimmung von relativ geringen Aktivitäten von CK und insbesondere von CK-MB reicht die

in Empfindlichkeit der Methode jedoch nicht aus.

Aus Z. Klin. Chem. Clin. Biochem., 13. Jahrgang, Seiten 85-88 (1975) ist ein Verfahren bekannt, bei dem zur Bestimmung von CK-MB in einer Serumprobe zwei

η präzipitierende Antiseren verwendet werden, die gegen CK-MM und CK-BB gerichtet sind. Durch Errechnung der Differenz zwischen Gesamtaktivität der Probe und der Summe der Aktivitäten von CK-MM und -BB ergibt sich die Aktivität von CK-MB. Dieses Verfahren erlaubt

Wi keine Direkibcsiimmung der CK-MB, es muß vielmehr zunächst die CK-Gesamtaktivitäl der Probe vor Zusatz der Antiscrcn bestimmt werden.

Alle diese Verfahren erfordern außerdem zur Durchführung einen größeren Zeitaufwand und sind

h', deshalb für die Verwendung bei der Schnclldiagnose des I lerzinfarkls nicht geeignet.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, reproduzierbares und scnnell durchzuführen-

des Verfahren und cm Mittel /ur Bestimmung der Aktivität von CK-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit zu entwickeln, die eine Direktbestimmung der CK-MB möglich machen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs I angegebenen Merkmale gelöst.

In Clin. Chim. Acla, Band 58, Seilen 223-232 (1975) wurden auch bereits hemmende Antikörper gegen CK-Isoenzyme beschrieben. Diese Antikörper bewirken neben einer IOO%igen Hemmung von CK-MM auch eine 80%ige Hemmung von CK-MB. Über die M-Untereinheit von CK-MB hinaus wird also ein wesentlicher Anteil der B-Untereinheit von den verwendeten Antikörpern gehemmt (Die Aktivitäten der Untereinheit M und B in CK-MB verhalten sich zur Gesamtaklivilät dieses Isoenzyms jeweils wie etwa 50: 100). Selbst wenn die mit diesen Antikörpern gefundene Restaktiviiät von etwa 20% reproduzierbar wäre, so wurden die erhaltenen Werte doch für eine präzise Messung von CK-MB zu niedrig liegen, um noch sicher erfaßbar zu sein, da die CK-Gesamtaktivität im Serum an sich schon niedrig ist. Die in dieser Literaturstellc beschriebenen hemmenden Antikörper wurden entsprechend auch nicht für eine Bestimmung der CK-Isoenzyme nach dem Hemmungsprinzip angewendet. Nach dem Verfahren oer Erfindung bleiben dagegen noch etwa 50% der CK-MB-Aktivität, d.h. etwa die gesamte Aktivität der Untereinheit B, für die Messung zugänglich. Das bedeutet einen erheblichen Fortschritt.

Das erfindungsgemäße Mittel -»ur Bestimmung der Aktivität von CK-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit ist im Patentanspruch λ und bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens und des Mittels sind in den Patentansprüchen 2 und 3 bzw. 5 — 7 beschrieben.

Als Körperflüssigkeit ist für das Verfahren der Erfindung in erster Linie Human-Serum geeignet. Man kann jedoch auch andere Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Plasma, Harn, Sputum und Schweiß vom Menschen, aber auch analoges Untersuchungsmaterial von Tieren zur Bestimmung heranziehen. CK-BB stör·, die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und darf deshalb in den zu testenden Körperflüssigkeiten nicht Vorhandensein.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Antikörper werden durch Impfung von Tieren mit CK-MM-Antigenen gewonnen. Als Antigen wird dafür vorzugsweise menschliche CK-MM herangezogen. Es ist aber auch möglich, CK-MM aus Tieren zu verwenden, wenn die damit hergestellten Antiseren die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in menschlicher CK-MM und CK-MB, gegebenenfalls auch in Gegenwart von CK-Substraten, vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Tierische Spender von CK-MM-Antigenen sind in erster Linie die verschiedenen Affenarten, vorzugsweise Rhesusaffen und Schimpansen, ferner Hausticrc wie Schwein, Pferd, Rind, Kaninchen, Meerschweinchen und andere Tiere wie Ratten, Mäuse und Vögel wie Gänse, unten, Hühner.

Das zur Herstellung der Antikörper verwendete CK-MM-Antigen soll frei sein von den Aktivitäten von CK-MB und CK-BB. Ein empfindliches Kriterium für diese Reinheitsforderung ist die immunologische Analyse, die vorteilhafterweisc mittels Diffusions- oder iilcklrophorcsctechnik durchgeführt wird. Daneben hai

sind /„ B, die Methoden der analytische*« Disk-Elektrophorese und der Po|yacrylamid-Gel-E\ckirofokussierung nützlich- Bei Anwendung dieser Methoden hat der Nachweis der Reinheit gegenüber CK-Mß_Aund CK-BB Vorrang. Dagegen ist die absolute Reinheit gegenüber anderen Proteinen, die z. B. durch die beißen zuletzt genannten Methoden ermittelt werden kani\ weniger wichtig. Die Mikroheterogcnitäl von CK-Isoi-n/ymtypen, die sich z. B. in geringen Unterschieden der Aminosäurezusammenseuung der einzelnen Isoütfizyme äußern kann, spielt als Reinheitskriterium in der^egel keine Rolle.

Für die Immunisierung werden solche Tiere hera
zogen, die nach Impfung mit aktivierter CK-Äniikörper bilden, welche die enzymatische Aktiviü der Untereinheit M in den Creatinkipasen'MM und'
vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymati sehe Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Vorzugsweise eignen sich hierfür Ziegen. Es kommen jedoch auch andere Tiere, insbesondere Wirbeltiere, als Antikörperspender in Frage, z. B. Affenarten, Pferd, Rind und rinderähnliche Tiere, Schaf, Hund, Schwein, Kaninchen, Vögel wie Hühner, Truthühner, Gänse und Enten, ferner Ratten, Mäuse, und Meerschweinchen. Ziegen werden insbesondere zur Induktion solcher Antikörper herangezogen, welche in Gegenwart von CK-Substraten vollständige Hemmungen der M-Untereinheit in CK-MB auszuüben vermögen.

Die Immunisierung der Versuchstiere wird nach der Erfindung mit aktivierter menschlicher oder tierischer CK-MM durchgeführt. Die Aktivierung der CK-MM kann durch bekannte SH-Gruppen-stabilisierende und -aktivierende Reagenzien und/oder durch zweiwertige Metallionen, vorzugsweise durch eine Kombination der genannten Reagenzien und der Metallionen, erfolgen. Als SH-Gruppen-stabilisierende und -aktivierende Reagenzien werden vorzugsweise z. B. N-Acetylcystein, Mercaptoälhaiiol und Dithioerytrit verwendet, ferner Glutathion, Cystein, Dithiothreit, S-(2-Aminoäthyl)-isothiouroniumbromid-hydrobromid (AET). und/oder Thioglykolsäure. Die zweiwertigen Metallionen entstammen entsprechenden wasserlöslichen Salzen (z. B. den Chloriden oder Acetaten) vorzugsweise des Magnesiums, ferner des Mangans, Calciums und/oder Kobalts. Derartige Aktivierungen sind grundsätzlich auf anderen Gebieten bekannt und dem Fachmann geläufig.

Die weitere Durchführung der Immunisierung und die Aufarbeitung zum Erhalt der Antiseren bzw. Antikörper erfolgt in bekannter Weise. Auch die Verarbeitung und Aufbewahrung der Antiseren bzw. Antikörper erfolgt nach in der Immunologie bekannten Methoden.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren zu verwendenden Antikörper sind vorzugsweise der IgG-Immunglobulinklasse (bivalente Antikörper) zuzurechnen. Ihr Molekulargewicht liegt zwischen etwa 130 000 und 210 000, vorzugsweise bei etwa 160 000; ihre angenäherte Sedimentationskonstante liegt zwischen 6 S und 8 S, vorzugsweise bei etwa 7 S; ihr Kohlenhydratanteil beträgt etwa 3% ihres Gesamtgewichtes.

Die erfindungsgemäß angewandten Antikörper sollen die Enzymaktivität der M-Untereinhcit der Creatinkinasc vollständig hemmen. Unter »vollständiger Hemmung« wird hier eine Hemmung verstanden, bei der höchstens 5 U/l, vorzugsweise weniger als 3 U/l der Enzymaktivität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB in einer Probe erhalten bleiben.

Die Antikörper sollen ferner die cn/vmntisrhp

Aktivität der B-Uniercinheii der CK-MB mehl beeinflussen. Darunter soll hier verstanden sein, d;iß höchstens IO U/l, vorzugsweise weniger als 5 U/1, Enzyinaktivität der Untereinheit B der CK-MB in einer Probe gehemmt werden.

Zur Durchführung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die darin besteht, daß die zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit und die Antikörper in Gegenwart von CK-Subsiraten inkubiert werden, sollen die Antikörper ferner •die Eigenschaft haben, ihre hemmende Wirkung gegenüber der enzymatischcn Aktivität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB auch in Gegenwart von CK-Substraten vollständig entfalten zu können, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-M B zu beeinflussen. Diese Eigenschaft ist z. B. bei Antikörpern, die aus Ziegen durch Immunisierung mit vollaktivierter CK-MM gewonnen werden, zusätzlich zu den oben gekennzeichneten Eigenschaften vorhanden. Sie ist für die normale Durchführung des erfindungsgemäPcn Verfahrens (zuerst Inkubation mit den Antikörpern, dann Zusatz der CK-Substrate und phoiomcirische Messung) nicht unbedingt erforderlich.

Als CK-Substrate können alle üblicherweise verwendeten Substrate bzw. Effektoren eingesetzt werden. Im vorliegenden Zusammenhang sind in erster Linie Creatin, Creatinphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat und Magnesiumionen von Bedeutung.

Die Bestimmung der Restaktivität der CK und ihrer Isoenzyme kann im Prinzip nach allen Verführen erfolgen, die schnell und präzis arbeiten. Geeignet sind z. B. bekannte Verfahren, die es erlauben, die CK-Aktivität nach Zusatz von CK-Substraten mittels einer an Hilfsreaktionen anschließenden photometrischen Bestimmung zu messen. Hierfür lassen sich kinematische Methoden, bei denen die Enzymaktivität durch Messung im UV bei 334. 340 oder 366 nm ermittelt werden, heranziehen. Bevorzugt ist z. B. eine Standardmethode, nach der CK unter Verwendung von Creatinphosphat vnd Adenosindiphosphat bestimmt wird (Z. KHn. Chem. k'^;n. Biochem., Band 8, Seite 658 ff [1970] und Band 10, Seiu, 182 [1972]). Testpackungen zur Bestimmung der CK-X>.^ivität nach dieser Methode sind im Handel.

Nach Vipern anderen bekannten Bestimmungsverfahren kann ΐ>Κ auch fluorometrisch bestimmt werden. Durch CK IaRt sich aus Creatinphosphat Creatin freisetzen, welches nach dem von R.B. Conn (Clin. Chem.. Band 6. Seite 537 f [1960p ausgearbeiteten Verfahren durch Reaktion mit Ninhydrin in stark alks'ischer Lösung fluorometrisch gemessen werden kann (vgl. S a χ et al.. Clin. Chem., Band II, Seite 951 f [1965]).

Ein typisches Ausführungsbeispiel des erfindungsgeinäßcn Verfahrens wird im folgenden zur näheren Erläuterung der Erfindung beschrieben:

Die zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit, vorzugsweise eine Probe von Humanserum, wird mit einer Menge von CK-MM-Antikörpern versetzt, welche ausreichl. bis zu 2500 U/l der Untereinheil M in CK-MM und CK-MB, vorzugsweise etwa 1000 U/l, vollständig zu hemmen. Bei Körperflüssigkeiten mit höheren Gcsamt-CK-Aktivitälcn wird zweckmäßigerweise vor der eigentlichen Bestimmung eine Vorvcrdünnung auf etwa 1000 U/l vorgenommen. Diese Vorverdünnung ist bei der Berechnung /.u berücksichtigen. Man mischt und inkubicrl während etwa 1 bis 30, vorzugsweise etwa 5 Minuten, bei Temperaturen zwischen +10 und +40"C.

vorzugsweise elwa bei Kaumicmpcmiur. speziell bei 25 oder 30^r'C. Danach wird die restliche Enzymuktiviiäi des Reaktionsgemisches mil Hilfe eines bekannten Verfahrens, vorzugsweise mit der oben beschriebenen

'. UV-Methodc, ermittelt. Man gibt die Serum-Antikörpcr-Mischung zu einem bekannten Enzym-Coenzjin-Substrai-Gemisch, das alle zur Durchführung der Methode erforderlichen Enzyme. Coenzyme und Substrate enthält, und fügt anschließend eine ausreichende

κι Menge einer Pufferlösung (pH etwa 7) hinzu. Übliche Handelspräparate enthalten z. B. als Enzym/Coenzym-Gemisch Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Adenosindiphosphat und Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat und als Substrate Crealinphosphat

π und Glucose.

Es ist auch möglich, die Seruoi-Antikörper-Mischung zu einem Gemisch aus Coenzym und Enzym zu geben (oder umgekehrt) und anschließend ein Puffer-Substratgemisch hinzuzufügen. Als Puffer eignen sich für die

2» Umsetzung Neutralpuffer, wie / B. bevorzugt Triäthanolamin- oder Imidazolacetatpuffer, ferner u.a. Morpholinpropansulfonsäure- und Morpholinäthansulfonsäure-puffer. Man mischt, inkubiert etwt 1 bis 10. vorzugsweise 5 Minuten, bei 15 — 40. vorzugsweise bei

>> 25 oder 30⁰C, und ermittelt darauf etwa bei Raumtemperatur die Änderung der Extinktion. Daraus wird anschließend die Aktivität der Untereinheit B in CK-MB errechnet.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann dieses

jo Verfahren dahingehend abgewandelt werden, daß die Probe der zu analysierenden Körperflüssigkeit mit den Antikörpern und den CK-Substraten in Gegenwart eines Puffers und den für die Nachweisreaktion erforderlichen Substanzen zusammen inkubiert wird

i; (ohne Vorinkubation der Probe mit den Antikörpern). Für diese Ausführungsform ist eine weitere Eigenschaft der Antikörper Voraussetzung: sie müssen die enzymatische Aktivität der Untereinheit M von CK-MM und -MB auch in Gegenwart von CK-Substraten vollständig

■·<) hemmen. Diese Eigenschaft besitzen z. B. die Antikörper, die mittels voll aktivierter CK-MM aus Ziegen gewonnen werden. Sie ermöglichen es. das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einfacher und schneller Art durchzuführen:

So kann man z. B. die Antikörper, die zuvor mit dem bekannten, für die Nachweisreaktion verwendeten Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch in eine lyophilisierte Form gebracht wurden, in einer bestimmten Menge einer Pufferlösung auflösen, die zu bestimmende

in Körperflüssigkeit (z. B. Serum) hinzugeben und die Aktivitätsbestimmung des B-Anteils von CK-MB durchführen. In einer Variante dieses Verfahrens kann man die Antikörper auch mit einem Gemisch, bestehend lediglich aus Coenzymen und Enzymen, in das

i: Lyophilisat einarbeiten und die Substiate der Pufferlösung hinzufügen.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann eine Simultanbestimmung der CK-Gesamtaktivität und der CK-MB-Aktivität unter Zuhilfenahme des

nc* soeben beschriebenen, bevorzugten Verfahrens der Erfindung in einem einzigen Ansitz durchgeführt werden. Man kann z. B. so vorgehen, daß man .ruiiächst die CK-Gcsamtaktivität der Probe nach einem bekannten photomefischen Verfahren bestimmt; anschließend

hi gibt man zu dem selben Ansatz ein in Wasser gelöstes Lyophilisat, bestehend aus CK-MM-Antikörpcrn. Dann inkubiert mim etwa I bis 10, vorzugsweise 5 Minuicn und bestimmt die Reslaklivitäi der Probe photoine-

irisch. Auch fur du-se Ausführuiigsform ist Voraussetzung, dall die Antikörper gegen CK MM die enzymatisehe Akliviliil der I Iniercinhcti M von (K MM und MH auch in Ciegenwarl von CK-Substralen vollständig zu hemmet) vermögen.

Man kann die Anlikorperkapaziläl der Anlisereii bei diesen bevorzugten Atisfühningsformen des erfindtmgs gemäßen Verfahrens so einstellen, dall sie bis /u 2^r>()<) U/l. vorzugsweise ciwa ICKH) I l/l, der I Intcrcinheil M in (K-MM und CKMH vollständig zu hemmen vermögen, f'alls die CK Gesamtaktivitäten der zu bestimmenden Probe für diese Hemmkapazitäten der Antikörper zu hoch sind, müssen auch hier Vorverdün ntingen vorgenommen werden, z. H. auf Aktivitäten der Untereinheit M in CK-MM und MH von etwa 10(X) U/l

Das Verfahren der Erfindung hat gegenüber dem Siaini der Technik ijcitiicrniiciic Vorieiic. iJa/ii /iiiiien die hohe Präzision der Ergebnisse und die Schnelligkeit sowie die [Einfachheit der Durchführung.

Die Präzision des Verfahrens der Erfindung ist darauf zurückzuführen, daß die verwendeten Antikörper spezifisch auf die M-Uniereinhcit von CK-MM und CK-MB ansprechen und es deshalb erlauben, die CK-MB-Aklivität in Körperflüssigkeiten, wie dem Humanscrum. in einer Direktbestimmung zu ermitteln

Demgegenüber besitzen die erwähnten bekannten immunologischen Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Isoenzymen Nachteile. Nach diesen Verfah ren präzipitiert man die Isoenzyme der CK durch isoenzymspezifische. präzipitierende Antikörper und ermittelt jeweils die im Überstand der Immunpiäzipitation verbleibende Restaktivität. Abgesehen von dem Aufwand dieser Methode, die in der Regel die Herstellung von mehreren spezifischen Antiseren erforderlich macht, müssen in jedem Falle mindesten«. zwei verschiedene Testansätze durchgeführt werden, nämlich die Bestimmung der CK-Gcsamtaktivität und die Bestimmung der CK-Restaktivität nach Präzipitation. Die CK-MB-Aktivitiü kann also erst durch eine Differenzmessung ermittelt werden. Das Ergebnis ist daher entsprechend den Regeln der F-ehlerrechnung mit der Unsicherheit beider Messungen belastet. Nach der erfindungsgemäßen Methode wird die Fehleraddition dagegen vermieden und eine Direktincssung durchgeführt.

Ein Nachteil des Präzipitationsverfahrens ist auch, daß die Immun-Präzipitation als Sekundärreaktion verhältnismäßig viel Zeit (ca. 60 Minuten bis mehrere Stunden) beansprucht, so daß sich das Verfahren nicht als Schnelltest eignet.

Die schnelle Durchführbarkeit ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das gilt besonders für die bevorzugte Ausführungsform, nach der die Hemmung des M-Anteils von CK-MM und CK-MB sowie die Bestimmung der Restaktivität gleichzeitig durchgeführt werden. Nach dieser Ausführungsform kann in kürzester Zeit. z. B. innerhalb von 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise zwischen 5 und 15 Minuten, ein exaktes Testergebnis für die Diagnosestellung zur Verfugung stehen.

Ein beachtenswerter Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist auch die einfache Durchführbarkeit Die Testmethode kann in größeren Instituten bzw. Kliniken z. B. mit Hilfe von üblichen mechanisierten Geräten zur Bestimmung von Enzymaktivitäten) durchgeführt werden. ist aber auch in kleineren Instituten bzw. im Arztlabor mit Hilfe eines Photometers durchführbar.

Für Einzelbestimmungen eignen sich Testpackungen.

die alle zur Durchführung des erfindungsgcniidlcn Verfahrens notwendigen Reagenzien enthalten, so z. H. ein übliches Gemisch aus Coeuzym, Enzym und Substrat.erfindungsgemäßen CK-MM-Anlikörpcrn und

. einer Puffer Losung. Eine Tcslpackiing dieser oder ähnlicher Art ermöglicht die Bestimmung von CKMH mit geringslmöglichcm Aufwand.

Nach dem Stand der Technik war nicht zu erwarten. iliiU sich das Problem der CK MH-ßcstimmung mittels

ι (.'ines so einfachen und schnell arbeitenden Verfahrens wie dem erfindungsgemäßen Verfahren lösen läßt. So war nicht vorauszusehen, daß spezifische Antiseren hergestellt werden können, welche zwar die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in CK-MM und -MH vollständig hemmen, aber die enzymatische Aktivität der Untereinheit B von CKMB nicht beeinflussen. Der Einsatz von Antikörpern mit diesen bisher nicht bekannten Eigenschaften ermöglicht erst die erfindungsgemäße Reaktion.

ι Überraschend ist auch, daß die nach der Erfindung eingesetzten Antikörper auch in Gegenwart von Substraten ihre volle Hemmkrafl beibehalten. Das ist nicht selbstverständlich. So wurden in der Literatur (Ann. N. Y. Acad. Sei., Band 103. Seiten 858-889 [1963]) Antikörper beschrieben, die in Gegenwart von CK-Substralen CK-M.Vs nicht mehr zu 100% inaktivierten. Antikörper mit derartigen Eigenschaften wären für die bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, nach denen Antikörperliemmung und Zusatz von CK-Substratcn gleichzeitig erfolgen, völlig unbrauchbar. Die nicht gehemmten Anteile der MAktivitäten würden den Meßwert von CKMB fälschlicherweise erhöhen (der Anteil von CK-MB an der CK-Gesamtaktivität beträgt nur in Ausnahmefällen mehr als 20%). eventuell gar nicht vorhandene CK-MB-Aktivitäten vortäuschen und auf diese Weise falsche Labordaten für die Diagnose liefern.

Die überraschende Eigenschaft der erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper, die enzymatische Aktivität der Uniereinheii M von CK-MM und -MB vollständig zu hemmen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B von CK-MB zu beeinflussen und zugleich in Gegenwart von Substraten ihre volle Hemmkraft gegenüber der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB zu entfalten, ermöglichen eine bisher mit immunologischen Methoden unerreichbare Schnelligkeit und Präzision der CK-MB-Aktivitäts-Bestimmung. Dadurch eröffnet sich für die Praxis ein Weg. die CK-MB-Aktiviiät mit einem Schnelltest zu bestimmen.

Es wird möglich, den Laborbefund einer Erhöhung der CK-Aktivität beim Patienten dahingehend zu differenzieren, ob eine Erkrankung bzw. Traumatisie- rung von Skelett- oder Herzmuskulatur vorliegt. Dadurch erhält man wichtige zusätzliche Daten für die Differentialdiagnose des Herzinfarkts (z. B. vom Lungeninfarkt und/oder von Schockfolgen) und anderer Erkrankungen bzw. Schädigungen des Herzens.

Darüber hinaus erhält man durch die spezifische und exakte Bestimmung der Aktivität von CK-M B Aussagen über die Beteiligung bzw. Schädigung des Herzmuskels bei anderen Krankheitsprozessen (z. B. bei Vergiftungen), bei therapeutischen Eingriffen (z. B. bei der Wiederbelebung) oder bei diagnostischen Eingriffen (z. B. bei Herzkatl-cterisierungen oder Coronar-Angiographien).

In den folgenden Beispielen bedeuten »M« (bzw. »mM«) die Konzentrationen in Mol (bzw. Millimol) pro Liter.

Beispiel I

Hemmung von CK MM. CK-M U und CK-IlH dv/rch Anii-Human-CK-MM

/λι einem bezüglich seiner CK-Eigenaktivität inaktivierten llumansertiin werden reine CK-MM, CK-MU <κΙτ CK-HB gegeben, und die CK-Aklivitälen der ciii/.Hnen Proben werden bestimmt. Anschließend wird 0,1 ml l'robe mit 0,1 ml Anti-CK-MM-Lösung [erhallen nach Beispiel Ba)] versetzt, es wird gemischt und 5 Minuten bei 25°C inkubiert. Danach erfolgt eine Bestimmung der CK-Restaktivität auf bekannte Art. Die Ergebnisse zeigt folgende Tabelle:

Restaktivitiiten von CK-Isocnzymen nach Inkubation mit inhibierendem Anti-HumanCK-MM (Mittelwerte ± 1 s aus jeweils ifaeh-Bcstimmungen) (s = Standardahweichung)

Tabelle	Aktivität der zuge setzten Isoenzyme (U/l)	Restaktivitat nach Inkubation mit Anti-CK-MM (U/l)
Isoenzym	98 + 1,9 1043 + 22	0.3 ±2.1 0,5 ± 2.5
CK-MM	103 ±2.0 410±7.8	53 ±1.7 206 ±6.2
CK-MB	197 ±3,8	199 ±4.!
CK-BB

Innerhalb der Meßgenauigkeit werden die Aktivitäten von CK-MM zu 100%. von CK-BB zu 0% und von CK-MB (entsprechend dem Anteil von 50% M-Untereinheiten) zu 50% gehemmt. Die Ergebnisse sind über einen weiten Aktiwtätsbereich der zugesetzten Isoen zym-Aktivitäten konstant.

Beispiel 2

Test I zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von CK-MB in Körperflüssigkeiten

a) Zusammensetzung der Testpackung

Die Testpackung ist ausreichend für 10 Aktivitätsbestimmungen. Die Packung enthält 1 Flasche Puffer für 10 Bestimmungen. 10 Flaschen Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch und 1 Flasche Anti-CK-MM, erhalten nach Beispiel Ba).

Die Flasche Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch enthält:

Creatinphosphat-Dinamumsalz.	27.24 mg
Hexahydrat	6,4 mg
Glutathion reduziert	3.4 mg)
(oder N-Acetyl-cystein
Adenosindiphosphat-Dinatriumsalz.	1.25 mg
Hexahydrat
Nicolinamid-adenin-dinucleotid-	1.7 mg
phosphat, Dinatriumsalz	8.47 mg
Adenosin-monophosphat, Dinatriumsalz	5U
Hexokinase	3U
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase	832 mg
Glucose	4.52 mg
Magnesiumacetat
Die Rasche Puffer-Lösung enthält:	105 m.M
Triäthanolamin-acetat (in Wasser)

Die lyophilisicrien Antikörper werden mit 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die entsprechende Antikörpcrlösting ist so eingestellt, daß bis zu 1000 U/l Crealinkinasc-MM total gehemmt werden. Bei Seren mit extrem hohen Gesamt-Crealinkinase-Aklivitätcn muß das Serum deshalb auf ca. 1000 U/l vorverdünnt werden. Die Antikörpcrlösting ist bei +4"C mindestens 7 Tage haltbar.

b) Ausführung der Aktivitätsbcstimmung der CK-M B

b I) Ausführung

In ein Reaktionsgefäß pipcttieren:

0,1 ml Serum
+ 0,1 ml Antikörperlösung

Gut mischen, 5 Minuten bei 25" inkubieren. Danach werden Ü,i mi dieses Reaktionsgemisciies >uwic 2,0 ml Puffer-Lösung in eine Flasche mit dem Gemisch von Coenzym, Enzym und Substrat gegeben.

Mirchen, 5 Minu'en bei 25"C inkubicren, danach in eine Küvette gießen, die Extinktion bei 25°C messen und anschließend die Extinktionsänderung pro Minute bestimmen. Wellenlänge: 334, 340 oder 366 mn;Schichtdicke: I cm.

b 2) Berechnung

Die ermittelte C'C-Aklivität der Probe muß

a) mit dem Verdünnungsfaktor 2 und

b) mitdemCK-MB-Hybridfaktor 2

(im Test werden nur die B-Untereinheiten von CK-MB gemessen) multipliziert werden.

Aus den Extinktionsdifferenzen pro Minute (,dfyMinute) wird der Mittelwert gebildet und in die entsprechende Berechnungsformel eingesetzt: Messung bei 334 nm: Volumenaktivität-CK-MB =

df/Minute χ 4 χ 3500 U/l Messung bei 340 nm: Volumenaktivität-CK-MB =

d£7Minute χ 4 χ 3376 U/l Messung bei 366 nm: Volumenaktivität-CK-MB = df/Minute χ 4 χ 6364 U/l

Beispiel 3

Test Il zur quantitativen Bestimmung der CK-MB-Aktivität in Körperflüssigkeiten

a) Zusammensetzung der Testpackung

Die Testpackung ist ausreichend für 30 Aktivitätsbestimmungen. Die Packung enthält 1 Flasche Puffer-Lösung für 30 Bestimmungen und 30 Raschen eines lyophilisierten Gemisches bestehend aus Coenzym. Enzym, Substrat und Anti-CK-MM nach Beispiel Ba).

Die in der Rasche Puffer-Lösung enthaltene Menge Triäthanolaminacetat entspricht der im Beispiel 2a) angegebenen Menge. Die einzelnen Raschen mit dem Gemisch aus Coenzym, Enzym, Substrat und Anti- CK-MM nach Beispiel Ba) entsprechen bezüglich der uerstgenanntep. Komponenten ebenfalls der in Beispiel 2a) angegebenen Zusammensetzung und enthalten zusätzlich Anti-CK-MM. das bis zu 1000 U/l CK-MM total hemmt

Il

b) Bestimmung ilcr Aktivii;ii von C'KMIl

b I) Ausführung

Zum Inhalt einer Flasrhe Coenzym/Enzym/Substriil/Anti-CK-MM-Gcmisch werden 2,0 ml Puffer-Lösung und 0.1 ml Serum pipettiert. Mischen, 5 Minuten t.-i 25°C inhibieren, dann in eine Küvette gießen und über 5 Minuten die Extinktionen bei 25°C messen. Wellenlänge: 334, 340 oder 366 mn; Schichtdicke: I cm.

b 2) Berechnung

Aus den F.xlinklionsdiffcren/.cn pro Minute (Aiii Minute) wird der Mittelwert gebildet und in die entsprechende ßerechnungsformcl eingesetzt: Messung bei 334 nm: Volumenaktivität CK-MB =

zlC/Miniitc χ 7000 U/l
M CSS¹JH" hei 340 Π HV VnIi »m ρ na k hvitat CKMB ■=

A»Minute χ 6752 U/l
Messung bei 366 nm: Volumenaktivität CKMB = /dß/Minute χ 12 728 U/l

Beispiel 5

Bestimmung von CK-MD-Aklivitäten bei Patienten
mit und ohne Herzinfarkt mit Testpackung nach
Beispiel 3

a) CK-Aktivitäten verschiedener Patientenkollcktive

Patienten mit erhöhten CK-Aktivitätcn
ohne Herzinfarkte

Patienten mit
Herzinfarkten

Fall/.ahl

Mittelwerte Gesamt-CK CKMI) (U/l) (U/l)

480 < 1,7

510

44

Die Tabelle zeigt, daß mil iiiife der criitukmgsgemii-
>ii Ilen Bestimmungsmethode schnell und eindeutig ein
Hinweis auf einen Herzinfarkt erhalten werden kann.

Beispiel 4

Simultanbestimmung der CK-Gesamtaktivitäl und derCK-MB-Aklivität

a) Zusammensetzung der Testpackung

Die Zusammensetzung der Testpackung entspricht derjenigen von Beispiel 2a).

b) Bestimmung der CK-Gesamtaktivität und derCK-MB-Aktivität von CK-MB

b I) Ausführung

In die Flasche Coenzym-Enzym-Substrat-Gemiseh werden 2.0 ml Puffer-Lösung und 0,1 ml Serum bzw. Scrumverdünnung pipettiert. Mischen, 5. Minuten bei 25"C inkubieren, danach in eine Küvette gießen und über 2 Minuten die Extinktionsänderung (ΔEl\) bei 25°C bestimmen. Anschließend wird 0,1 ml Antikörperlösung zugefügt, sofort gemischt und nach 3 Minuten erneut die Extinktionsänderung (Δ E2) bei 25°C bestimmt. Wellenlänge: 334, 340 oder 366 nm; Schichtdicke: 1 cm.

b 2) Berechnung

Die CK-Gesamlaktivität errechnet sich wie folgt: Messung bei 334 nm: Volumenaktivität CK-Gesamt =

AE l/Minute χ 3500 U/I

Messung bei 340 nm: Volumenaktivität CK-Gesamt =

Δ Ε l/Minute χ 3376 U/l

Messung bei 366 nm: Volumenaktivität CK-Gesamt =

Δ E1/Minute χ 6364 U/l

Die CK-M B-Aktivität ergibt sich nach folgenden Berechnungsformeln: Messung bei 334 nm: Volumenaktivität CK-M B =

4E2/Minute χ 7350 U/l Messung bei 340 nm: Voiumenaktivitat CK-M B =

d£2/Minute χ 7090 U/l Messung bei 366 nm: Volumenaktivität CK-MB = /1E2/Minute χ 13 364 U/l

b) Verlauf der CK-M B-Aktivitäten
bei einem Patienten mit Herzinfarkt

Stunden nach	CK-MB
Infarkteimritt	U/l
3,5	<5
4,5	<5
5,5	6
7,5	22
8,5	23
9.5	29
10,5	50
11,5	46
13,5	56
15.5	55
17.5	64
21.5	62
25,5	50
29,5	42
33,5	25
43,5	18
53,5	<5
61,5	<5

Die Zahlenwerte zeigen den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmten Anstieg und Wiederabfall der CK-MB-Aktivität bei einem Herzinfarkt-Patienten.

Herstellung der Ausgangsmaterialien

Beispiel A Herstellung von CK-MM

a) \2 kg tiefgefrorener, menschlicher Skelettmuskel

werden bei Raumtemperatur aufgetaut und maschinell zerkleinert Das Gewebe wird in 2^1 kaltem 0.05 m

Tris/HCl-Puffer pH 8,0 [Tris-{hydroxymethyl)-amino-

methau-HCI-Pufferl, der 0,01 M KO, I mM EDTA

.JÄthylendiamintetraessigsäure] und 1 mM Dithioery-

thrit enthält, suspendiert und mit einem Mixer homogenisiert. Das Homogenat wird unter Eiskühlung

i>5 45 Minuten gerührt and anschließend 60 Minuten bei

12 000 g zentrifugiert. Der klare Überstand (2,6801)

wird einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung bei pH 8,0 in den Grenzen 40-75% Sättigung unterworfen. Der

O./^r) s Niederschlag wird in 0,04 M Iris/l It'l-P'ilfer r)ll K₁O aufgenommen und gegen den gleichen l'uffci dialysicri. Zur Adsorption von Myoglobin und sauren liallastprotcinen werden 500 g feuchter basischer Ionenaustauscher auf Itiisis eines vcrncl/lc.i Dexlrans, ac|iiilibricri gegen den gleichen l'tiffcr, zugesetzt. Nach JO Minuten wird der Austauscher abgesaugt und zweimal mit je 400 ml 0,04 M Tris/HCI-PuFfer pH 8.0, enthaltend 0,02 M NaCI, ausgewaschen. Filtrat und Waschwasscr werden vereinigt und mit Ammoniumsiilfal auf 0,75 s gebracht. Der Niederschlag wird abze-ilrifugicrl, in 100 ml 0,04 M Tris/MCI-Puffcr pll 8.0 gelöst und gegen den selben Puffer dialysieri, bis kein Ammoniumsulfat mehr nachweisbar ist. Das klare Dialysai vird auf einer Säule mit einem basischen Ionenaustauscher auf Basis eines vernetzten Dextrans (6 χ 60 cm) mit dem gleichen Puffer äquilibriert. Die Säule wird mit .Startpuffer so lange gewaschen, bis das Kluat proteinfrei ist. Danach wird das Knzym mit 0.04 M Tris/HCI"uifer pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCI, I mM KDTA ti *d 1 mM Dithioeryihrit. von der Säule eluiert. Fraktionen mit einem F.nzymgehalt von mindestens 20 U/ml werden vereinigt, mit Ammoniumsulfat auf 80% gesättigt, und das präzipiticrte Knzym wird abzeiiirifugiert. Zur Endrcinigung wird es nochmals einer Chromatographie im selben System unterworfen, jedoch unter Verwendung eines kleineren Säulenvolumens. Aus den vereinigten aktiven Fraktionen wird das Knzym mit 0.8 s Ammoniumsulfat gefällt, in 50 ml 0,04 M Tris/HCI-Puffer pH 8.0. enthaltend 0,02 M NaCI, I mM KDTA und I mM Dithioerythrit, konzentriert gelöst, steril-filtricrt und wieder mit Ammoniumsulfat auf 0,8 s gebrach',. Man erhält so eine bei 4° C stabile Knzymsuspcnsion von CK-MM mit einer spezifischen Aktivität von 26 —30 U/mg, gemessen mit Creatin als Substrat bei 25'C.

Volumen: 86 ml; Aktivität: 316 U/ml: Protein: 11.8 mg/ml.
Ausbeute: ca. 30% (bezogen auf den Organextrakt).

b) Analog Heispiel Aa) wird CK-MM aus Muskelgewebe folgender Tiere Isoliert: Rhesusaffe, Schwein. Rind.

Beispiel B
Herstellung von Anti-CK-MM

a) CK-MM aus Humanmuskel wird gegen eine mit 0.07 M Triethanolamin gepufferte, physiologische NaCI-Lösung pH 7.0. die 10 mM Mercaptoäthanol und 10 mM MgCL₂ enihält. dialysiert. Die Enzymlösung wird durch Ultrazentrifugation von Aggregaten befreit und der Proteingehalt mit dem genannten Diaiysepuffer auf 2 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem Freundschen Adjuvans (Wasser-Mineralölsuspension, die zusätzlich noch 2 mg abgetötete M-Tuberculosebazillen enthält) emulgiert. Diese Emul-Moil wird einer Ziege intramuskulär injiziert. Nach i Injektionen gleicher An im Absland von 3 Wochen und i weiteren Honstcrinjcktioncn jeweils im Absland von 16 Wochen wird dem Tier 21 lage nach der letzten ln;cklion Ulm entnommen. Das nach bekannten Methoden gewonnene Serum wird mit einer Mischung. enthaltend 3% Schai-Scrumalbiimm und 0.1% Natrium azid in einem 0,1 M Uoralpuffcr. auf pH 8,4 eingestellt und stcrilfillriert. Die erhaltene Lösung, enthalte .·.' Anli-Humanmuskel-CKMM, wird in 0,5-ml-I'orlionen in braune Glasflaschen abgefüllt und gefriergetrocknet. Die Antikörper besitzen ein Molekulargewicht von etwa 160 000 bis 180 000.

b) Die nach Beispiel Aa) erhaltene CK-MM aus Humanmuske! wird gegen eine mit 0,1 M Imidazol gepufferte, physiologische NaCl-Lösung pH 6.K. die 7.5 mM N-Acetylcystein und 25 mM Magnesiumacetai enthält, dialysiert. Anschließend wird die Enzymlösung durch Ultrazentrifugation von Aggregaten befreit und der Proteingehalt mit dem genannten üialysepuffcr auf 0.2 mg/ml eingestellt. I ml dieser Lösung wird mit I ml komplettem Freundschen Adjuvans cmulgiert. Diese Emulsion wird einem Hammel intradermal injiziert. Nach 3 und 6 Wochen folgen 2 intramuskuläre Injektionen und 3 weitere Boosierinjektionen, jeweils im Abstand von 14 Wochen. 19 Tage nach der letzten Injektion wird Blut entnommen. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-HumaniiHiskcl-CK-MM in gefriergetrockneter Form. Moleku largewichtder Antikörper etwa 160 000 bis 180 000.

c) CK MM aus Rhesusaffenmuskel wird gründlich gegen eine mit 0,15 M Imidazol gepufferte, physiologische NaCl-Lösung pH 6,8, die 25 mM Dithioerythrit und l5mM Mangan(ll)-chlorid enthält, dialysiert. Nach F.ntfernung der Aggregate durch Ultrazentrifugation wird der Proteingehalt mit dem genannten Dialysepuffer auf 5 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem Freundschen Adjuvans emulgiert. Injektionen. Blutentnahme und Aufarbeitung erfolgen analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-Rhesusaffenmuskel-CK-MM in gefriergetrockneter Form. Sedimentationskonstante der Antikörper etwa 7 S.

d) CK-MM aus Schweincmuskel wird analog Beispiel Bb) aktiviert und die Antigen-Emulsion mit komplettem Freundschen Adjuvans Kaninchen injiziert. Nach 3 Wochen erfolgt eine weitere subcutane A.ntigeninjektion. Die Injektion wird nach weiteren 3 Wochen wiederholt, 19 Tage danach wird Blut entnommen. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-Schweinemuskel-CK-MM in gefriergetrockneter Form. Molekulargewicht der Antikörper etwa 160 000 bis 180 000.

In völlig analoger Weise wird aus Rindermuskcl Anti-Rindermuskel-CK-MM gewonnen (Molekulargewicht etwa 160 000 bis 180 000).

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit, dadurch gekenn zeich π et, daß man die Probe mit Antikörpern inkubiert, die die cnzymatische Aktivität der Untereinheit M in den Creatinkinasc-Isocnzymen-MM und -MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener Crcatinkinase-MB zu inaktivieren, und die Aktivität der Creatinkinase-Untercinheit B in bekannter Weise photometrisch bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch' 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe der Körperflüssigkeit und die Antikörper in Gegenwart von Creatinkinase-Substratcn inkubiert.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Inkubation der Probe mit den Antikörpern in der gleichen Probe zusätzlich die CK-Gesamtaktivität bestimmt.

4. Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß es neben bekannten Reagenzien zur enzymatischen Bestimmung der Creatinkinase-Aktivität Antikörper enthält, die die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in den Creatinkinasen-MM und -MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener Creatinkinase-MB zu inaktivieren.

5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es Antikörper enthält, die auch in Gegenwart von Creatinkinase-Substraten eine vollständige Hemmung zu entfalten vermögen.

6. Mittel nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Ziegen gewonnene Antikörper enthält.

7. Mittel nach den Ansprüchen 4—6, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper in einer Menge enthalten sind, die ausreicht, um in der Probe bis zu 2500 U/l der Untereinheit M in den Creatinkinasen-MM und -MB vollständig zu hemmen.