DE2548963C3 - Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB - Google Patents
Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MBInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Crcatinkinase-MB in
einer Probe einer Körperflüssigkeit.
Die Bestimmung der Aktivität der Creatinkinase (ATP: Creatin-Phosphotransferase, E. C. 2.7.3.2; Abkürzung: CK) im Serum gilt als empfindlichste Labormethode bei der Diagnostik von Erkrankungen der
Skelett- und Herzmuskulatur, speziell beim Myokardinfarkt. Die Unterscheidung von Traumatisierungen der
Skelett- und Herzmuskulalur, speziell bei der Differcntialdiagnosc des Myokardinfarkts, ist aber schwierig.
Durch die Bestimmung der CK-Gesamtaktivi(ät kann eine Differenzierung nicht mit Sicherheit erfolgen. Es ist
deshalb versucht worden, die differcntialdiagnostische Aussagekraft der Bestimmung der CK-Aklivität zu
erhohen, indem man die Aktivität weiterer Enzyme im Serum mißt und die Meßergebnisse miteinander
korrelierl. /.. B. durch Bildung des Quotienten CK/Glu
tamat-oxalaceint-transaminase. Quotienten dieser Art
erlauben jedoch eine Verwendung bei der Differenzierung zwischen I lcrz- und Lungeninfarki oder zwischen
Herzinfarkt und Schock-Folgen aus anderer Ursache ri nicht.
CK kommt im Körper in Form von drei Isocnzymcn vor, nämlich CK-MM, z_ B. im Muskel, CK-BB, z. B. im
Gehirn und als Hybrid CK-MB (bestehend aus einer Untereinheit M und einer Untereinheit B), z. B. im
in Herzmuskel. Die im Blut (Serum) auftretende CK-Aktivität ist normalerweise auf das Isoenzym CK-MM
zurückzuführen, da CK-BB nicht durch die Liquor-Blut-Schranke hindurchtritt und CK-MB auf bestimmte
Organe (z. B. den Herzmuskel) beschränkt ist. Bei
ii Schädigungen des Herzmuskels (z. B. beim Herzinfarkt)
wird CK-MB jedoch in das Blut (Serum) freigesetzt und läßt sich dort nachweisen.
Die quantitative Bestimmung dieses Isoenzyms neben
CK-MM im Serum gilt als empfindlichste und
ίο differentialdiagnostisch aussagekräftigste Labormethode zum Nachweis des Herzinfarkts. Neben dem
Herzmuskel enthalten zwar noch einige weitere Organe CK-MB (z.B. Pankreas, Zwerchfell, Aorta, Lunge und
Uterus), jedoch ist die Aktivität in diesen Organen um
den Faktor 100 geringer als im Herzmuskel, so daß
eventuell aus den genannten Organen freigesetzte CK-MB-Aktivitäien unterhalb der Nachweisgrenze
liegen.
jo CK-MB gingen im wesentlichen auf 3 Methoden zurück:
1. Elektrophorese auf verschiedenen Trägern. Die hiermit erhaltenen Ergebnisse sind bisweilen
widersprüchlich; oft treten mehr Banden auf, als
3> Isoenzyme vorhanden sind (Artefakte).
2. Chromatographie an verschiedenen Säulenmaterialien. Diese Methode ist langwierig (mehrere
Stunden effektiver Arbeitszeit) und nicht für Routineuntersuchungen geeignet. Die Ergebnisse
w verschiedener Untersuchter sind teilweise widersprüchlich.
3. Immunologische Bestimmung mit präzipitierenden
Antikörpern. Diese Methode wird in den deutschen Offenlegungsschriften DE-OS 2128 670 und
j5 22 58 822 beschrieben und liefert z.B. bei der
Quantifizierung von Isoenzymen der Aldolase und alkalischen Phosphatase gute Ergebnisse. Zur
Bestimmung von relativ geringen Aktivitäten von CK und insbesondere von CK-MB reicht die
in Empfindlichkeit der Methode jedoch nicht aus.
Aus Z. Klin. Chem. Clin. Biochem., 13. Jahrgang,
Seiten 85-88 (1975) ist ein Verfahren bekannt, bei dem zur Bestimmung von CK-MB in einer Serumprobe zwei
η präzipitierende Antiseren verwendet werden, die gegen
CK-MM und CK-BB gerichtet sind. Durch Errechnung der Differenz zwischen Gesamtaktivität der Probe und
der Summe der Aktivitäten von CK-MM und -BB ergibt sich die Aktivität von CK-MB. Dieses Verfahren erlaubt
Wi keine Direkibcsiimmung der CK-MB, es muß vielmehr
zunächst die CK-Gesamtaktivitäl der Probe vor Zusatz
der Antiscrcn bestimmt werden.
Alle diese Verfahren erfordern außerdem zur Durchführung einen größeren Zeitaufwand und sind
h', deshalb für die Verwendung bei der Schnclldiagnose des
I lerzinfarkls nicht geeignet.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein
einfaches, reproduzierbares und scnnell durchzuführen-
des Verfahren und cm Mittel /ur Bestimmung der
Aktivität von CK-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit zu entwickeln, die eine Direktbestimmung der
CK-MB möglich machen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs I angegebenen
Merkmale gelöst.
In Clin. Chim. Acla, Band 58, Seilen 223-232 (1975)
wurden auch bereits hemmende Antikörper gegen CK-Isoenzyme beschrieben. Diese Antikörper bewirken
neben einer IOO%igen Hemmung von CK-MM
auch eine 80%ige Hemmung von CK-MB. Über die M-Untereinheit von CK-MB hinaus wird also ein
wesentlicher Anteil der B-Untereinheit von den verwendeten Antikörpern gehemmt (Die Aktivitäten
der Untereinheit M und B in CK-MB verhalten sich zur Gesamtaklivilät dieses Isoenzyms jeweils wie etwa
50: 100). Selbst wenn die mit diesen Antikörpern gefundene Restaktiviiät von etwa 20% reproduzierbar
wäre, so wurden die erhaltenen Werte doch für eine präzise Messung von CK-MB zu niedrig liegen, um noch
sicher erfaßbar zu sein, da die CK-Gesamtaktivität im Serum an sich schon niedrig ist. Die in dieser
Literaturstellc beschriebenen hemmenden Antikörper wurden entsprechend auch nicht für eine Bestimmung
der CK-Isoenzyme nach dem Hemmungsprinzip angewendet. Nach dem Verfahren oer Erfindung bleiben
dagegen noch etwa 50% der CK-MB-Aktivität, d.h. etwa die gesamte Aktivität der Untereinheit B, für die
Messung zugänglich. Das bedeutet einen erheblichen Fortschritt.
Das erfindungsgemäße Mittel -»ur Bestimmung der Aktivität von CK-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit
ist im Patentanspruch λ und bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens und des Mittels sind
in den Patentansprüchen 2 und 3 bzw. 5 — 7 beschrieben.
Als Körperflüssigkeit ist für das Verfahren der Erfindung in erster Linie Human-Serum geeignet. Man
kann jedoch auch andere Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Plasma, Harn, Sputum und Schweiß vom
Menschen, aber auch analoges Untersuchungsmaterial von Tieren zur Bestimmung heranziehen. CK-BB stör·,
die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und darf deshalb in den zu testenden Körperflüssigkeiten
nicht Vorhandensein.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Antikörper werden durch Impfung von Tieren mit
CK-MM-Antigenen gewonnen. Als Antigen wird dafür vorzugsweise menschliche CK-MM herangezogen. Es
ist aber auch möglich, CK-MM aus Tieren zu verwenden, wenn die damit hergestellten Antiseren die
enzymatische Aktivität der Untereinheit M in menschlicher CK-MM und CK-MB, gegebenenfalls auch in
Gegenwart von CK-Substraten, vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der
Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Tierische Spender von CK-MM-Antigenen sind in
erster Linie die verschiedenen Affenarten, vorzugsweise Rhesusaffen und Schimpansen, ferner Hausticrc wie
Schwein, Pferd, Rind, Kaninchen, Meerschweinchen und andere Tiere wie Ratten, Mäuse und Vögel wie Gänse,
unten, Hühner.
Das zur Herstellung der Antikörper verwendete CK-MM-Antigen soll frei sein von den Aktivitäten von
CK-MB und CK-BB. Ein empfindliches Kriterium für diese Reinheitsforderung ist die immunologische Analyse,
die vorteilhafterweisc mittels Diffusions- oder iilcklrophorcsctechnik durchgeführt wird. Daneben
hai
sind /„ B, die Methoden der analytische*« Disk-Elektrophorese
und der Po|yacrylamid-Gel-E\ckirofokussierung
nützlich- Bei Anwendung dieser Methoden hat der
Nachweis der Reinheit gegenüber CK-MßAund CK-BB
Vorrang. Dagegen ist die absolute Reinheit gegenüber anderen Proteinen, die z. B. durch die beißen zuletzt
genannten Methoden ermittelt werden kani\ weniger wichtig. Die Mikroheterogcnitäl von CK-Isoi-n/ymtypen,
die sich z. B. in geringen Unterschieden der Aminosäurezusammenseuung der einzelnen Isoütfizyme
äußern kann, spielt als Reinheitskriterium in der^egel
keine Rolle.
Für die Immunisierung werden solche Tiere hera
zogen, die nach Impfung mit aktivierter CK-Äniikörper bilden, welche die enzymatische Aktiviü der Untereinheit M in den Creatinkipasen'MM und'
vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymati sehe Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Vorzugsweise eignen sich hierfür Ziegen. Es kommen jedoch auch andere Tiere, insbesondere Wirbeltiere, als Antikörperspender in Frage, z. B. Affenarten, Pferd, Rind und rinderähnliche Tiere, Schaf, Hund, Schwein, Kaninchen, Vögel wie Hühner, Truthühner, Gänse und Enten, ferner Ratten, Mäuse, und Meerschweinchen. Ziegen werden insbesondere zur Induktion solcher Antikörper herangezogen, welche in Gegenwart von CK-Substraten vollständige Hemmungen der M-Untereinheit in CK-MB auszuüben vermögen.
zogen, die nach Impfung mit aktivierter CK-Äniikörper bilden, welche die enzymatische Aktiviü der Untereinheit M in den Creatinkipasen'MM und'
vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymati sehe Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Vorzugsweise eignen sich hierfür Ziegen. Es kommen jedoch auch andere Tiere, insbesondere Wirbeltiere, als Antikörperspender in Frage, z. B. Affenarten, Pferd, Rind und rinderähnliche Tiere, Schaf, Hund, Schwein, Kaninchen, Vögel wie Hühner, Truthühner, Gänse und Enten, ferner Ratten, Mäuse, und Meerschweinchen. Ziegen werden insbesondere zur Induktion solcher Antikörper herangezogen, welche in Gegenwart von CK-Substraten vollständige Hemmungen der M-Untereinheit in CK-MB auszuüben vermögen.
Die Immunisierung der Versuchstiere wird nach der Erfindung mit aktivierter menschlicher oder tierischer
CK-MM durchgeführt. Die Aktivierung der CK-MM kann durch bekannte SH-Gruppen-stabilisierende und
-aktivierende Reagenzien und/oder durch zweiwertige Metallionen, vorzugsweise durch eine Kombination der
genannten Reagenzien und der Metallionen, erfolgen. Als SH-Gruppen-stabilisierende und -aktivierende Reagenzien
werden vorzugsweise z. B. N-Acetylcystein,
Mercaptoälhaiiol und Dithioerytrit verwendet, ferner
Glutathion, Cystein, Dithiothreit, S-(2-Aminoäthyl)-isothiouroniumbromid-hydrobromid
(AET). und/oder Thioglykolsäure. Die zweiwertigen Metallionen entstammen entsprechenden wasserlöslichen Salzen (z. B.
den Chloriden oder Acetaten) vorzugsweise des Magnesiums, ferner des Mangans, Calciums und/oder
Kobalts. Derartige Aktivierungen sind grundsätzlich auf anderen Gebieten bekannt und dem Fachmann geläufig.
Die weitere Durchführung der Immunisierung und die Aufarbeitung zum Erhalt der Antiseren bzw. Antikörper
erfolgt in bekannter Weise. Auch die Verarbeitung und Aufbewahrung der Antiseren bzw. Antikörper erfolgt
nach in der Immunologie bekannten Methoden.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren zu verwendenden Antikörper sind vorzugsweise der IgG-Immunglobulinklasse
(bivalente Antikörper) zuzurechnen. Ihr Molekulargewicht liegt zwischen etwa 130 000 und
210 000, vorzugsweise bei etwa 160 000; ihre angenäherte
Sedimentationskonstante liegt zwischen 6 S und 8 S, vorzugsweise bei etwa 7 S; ihr Kohlenhydratanteil
beträgt etwa 3% ihres Gesamtgewichtes.
Die erfindungsgemäß angewandten Antikörper sollen
die Enzymaktivität der M-Untereinhcit der Creatinkinasc vollständig hemmen. Unter »vollständiger
Hemmung« wird hier eine Hemmung verstanden, bei der höchstens 5 U/l, vorzugsweise weniger als 3 U/l der
Enzymaktivität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB in einer Probe erhalten bleiben.
Die Antikörper sollen ferner die cn/vmntisrhp
Aktivität der B-Uniercinheii der CK-MB mehl beeinflussen.
Darunter soll hier verstanden sein, d;iß
höchstens IO U/l, vorzugsweise weniger als 5 U/1, Enzyinaktivität der Untereinheit B der CK-MB in einer
Probe gehemmt werden.
Zur Durchführung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die darin
besteht, daß die zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit und die Antikörper in Gegenwart von CK-Subsiraten
inkubiert werden, sollen die Antikörper ferner •die Eigenschaft haben, ihre hemmende Wirkung
gegenüber der enzymatischcn Aktivität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB auch in Gegenwart von
CK-Substraten vollständig entfalten zu können, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa
vorhandener CK-M B zu beeinflussen. Diese Eigenschaft ist z. B. bei Antikörpern, die aus Ziegen durch
Immunisierung mit vollaktivierter CK-MM gewonnen werden, zusätzlich zu den oben gekennzeichneten
Eigenschaften vorhanden. Sie ist für die normale Durchführung des erfindungsgemäPcn Verfahrens
(zuerst Inkubation mit den Antikörpern, dann Zusatz der CK-Substrate und phoiomcirische Messung) nicht
unbedingt erforderlich.
Als CK-Substrate können alle üblicherweise verwendeten Substrate bzw. Effektoren eingesetzt werden. Im
vorliegenden Zusammenhang sind in erster Linie Creatin, Creatinphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat
und Magnesiumionen von Bedeutung.
Die Bestimmung der Restaktivität der CK und ihrer Isoenzyme kann im Prinzip nach allen Verführen
erfolgen, die schnell und präzis arbeiten. Geeignet sind z. B. bekannte Verfahren, die es erlauben, die CK-Aktivität
nach Zusatz von CK-Substraten mittels einer an Hilfsreaktionen anschließenden photometrischen Bestimmung
zu messen. Hierfür lassen sich kinematische Methoden, bei denen die Enzymaktivität durch Messung
im UV bei 334. 340 oder 366 nm ermittelt werden,
heranziehen. Bevorzugt ist z. B. eine Standardmethode,
nach der CK unter Verwendung von Creatinphosphat vnd Adenosindiphosphat bestimmt wird (Z. KHn. Chem.
k';n. Biochem., Band 8, Seite 658 ff [1970] und Band 10,
Seiu, 182 [1972]). Testpackungen zur Bestimmung der CK-X>.^ivität nach dieser Methode sind im Handel.
Nach Vipern anderen bekannten Bestimmungsverfahren kann ΐ>Κ auch fluorometrisch bestimmt werden.
Durch CK IaRt sich aus Creatinphosphat Creatin freisetzen, welches nach dem von R.B. Conn (Clin.
Chem.. Band 6. Seite 537 f [1960p ausgearbeiteten Verfahren durch Reaktion mit Ninhydrin in stark
alks'ischer Lösung fluorometrisch gemessen werden kann (vgl. S a χ et al.. Clin. Chem., Band II, Seite 951 f
[1965]).
Ein typisches Ausführungsbeispiel des erfindungsgeinäßcn
Verfahrens wird im folgenden zur näheren Erläuterung der Erfindung beschrieben:
Die zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit, vorzugsweise eine Probe von Humanserum, wird mit
einer Menge von CK-MM-Antikörpern versetzt, welche ausreichl. bis zu 2500 U/l der Untereinheil M in CK-MM
und CK-MB, vorzugsweise etwa 1000 U/l, vollständig zu
hemmen. Bei Körperflüssigkeiten mit höheren Gcsamt-CK-Aktivitälcn
wird zweckmäßigerweise vor der eigentlichen Bestimmung eine Vorvcrdünnung auf etwa
1000 U/l vorgenommen. Diese Vorverdünnung ist bei der Berechnung /.u berücksichtigen. Man mischt und
inkubicrl während etwa 1 bis 30, vorzugsweise etwa 5
Minuten, bei Temperaturen zwischen +10 und +40"C.
vorzugsweise elwa bei Kaumicmpcmiur. speziell bei 25
oder 30r'C. Danach wird die restliche Enzymuktiviiäi
des Reaktionsgemisches mil Hilfe eines bekannten Verfahrens, vorzugsweise mit der oben beschriebenen
'. UV-Methodc, ermittelt. Man gibt die Serum-Antikörpcr-Mischung
zu einem bekannten Enzym-Coenzjin-Substrai-Gemisch,
das alle zur Durchführung der Methode erforderlichen Enzyme. Coenzyme und Substrate
enthält, und fügt anschließend eine ausreichende
κι Menge einer Pufferlösung (pH etwa 7) hinzu. Übliche Handelspräparate enthalten z. B. als Enzym/Coenzym-Gemisch
Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Adenosindiphosphat und Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
und als Substrate Crealinphosphat
π und Glucose.
Es ist auch möglich, die Seruoi-Antikörper-Mischung
zu einem Gemisch aus Coenzym und Enzym zu geben (oder umgekehrt) und anschließend ein Puffer-Substratgemisch
hinzuzufügen. Als Puffer eignen sich für die
2» Umsetzung Neutralpuffer, wie / B. bevorzugt Triäthanolamin-
oder Imidazolacetatpuffer, ferner u.a. Morpholinpropansulfonsäure-
und Morpholinäthansulfonsäure-puffer. Man mischt, inkubiert etwt 1 bis 10.
vorzugsweise 5 Minuten, bei 15 — 40. vorzugsweise bei
>> 25 oder 300C, und ermittelt darauf etwa bei Raumtemperatur
die Änderung der Extinktion. Daraus wird anschließend die Aktivität der Untereinheit B in
CK-MB errechnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann dieses
jo Verfahren dahingehend abgewandelt werden, daß die
Probe der zu analysierenden Körperflüssigkeit mit den Antikörpern und den CK-Substraten in Gegenwart
eines Puffers und den für die Nachweisreaktion erforderlichen Substanzen zusammen inkubiert wird
i; (ohne Vorinkubation der Probe mit den Antikörpern).
Für diese Ausführungsform ist eine weitere Eigenschaft der Antikörper Voraussetzung: sie müssen die enzymatische
Aktivität der Untereinheit M von CK-MM und -MB auch in Gegenwart von CK-Substraten vollständig
■·<) hemmen. Diese Eigenschaft besitzen z. B. die Antikörper,
die mittels voll aktivierter CK-MM aus Ziegen gewonnen werden. Sie ermöglichen es. das Verfahren
der vorliegenden Erfindung in einfacher und schneller Art durchzuführen:
So kann man z. B. die Antikörper, die zuvor mit dem bekannten, für die Nachweisreaktion verwendeten
Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch in eine lyophilisierte Form gebracht wurden, in einer bestimmten Menge
einer Pufferlösung auflösen, die zu bestimmende
in Körperflüssigkeit (z. B. Serum) hinzugeben und die Aktivitätsbestimmung des B-Anteils von CK-MB
durchführen. In einer Variante dieses Verfahrens kann man die Antikörper auch mit einem Gemisch, bestehend
lediglich aus Coenzymen und Enzymen, in das
i: Lyophilisat einarbeiten und die Substiate der Pufferlösung
hinzufügen.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann eine Simultanbestimmung der CK-Gesamtaktivität
und der CK-MB-Aktivität unter Zuhilfenahme des
nc* soeben beschriebenen, bevorzugten Verfahrens der
Erfindung in einem einzigen Ansitz durchgeführt werden. Man kann z. B. so vorgehen, daß man .ruiiächst
die CK-Gcsamtaktivität der Probe nach einem bekannten photomefischen Verfahren bestimmt; anschließend
hi gibt man zu dem selben Ansatz ein in Wasser gelöstes
Lyophilisat, bestehend aus CK-MM-Antikörpcrn. Dann inkubiert mim etwa I bis 10, vorzugsweise 5 Minuicn
und bestimmt die Reslaklivitäi der Probe photoine-
irisch. Auch fur du-se Ausführuiigsform ist Voraussetzung,
dall die Antikörper gegen CK MM die enzymatisehe
Akliviliil der I Iniercinhcti M von (K MM und
MH auch in Ciegenwarl von CK-Substralen vollständig
zu hemmet) vermögen.
Man kann die Anlikorperkapaziläl der Anlisereii bei
diesen bevorzugten Atisfühningsformen des erfindtmgs
gemäßen Verfahrens so einstellen, dall sie bis /u 2r>()<) U/l. vorzugsweise ciwa ICKH) I l/l, der I Intcrcinheil
M in (K-MM und CKMH vollständig zu hemmen
vermögen, f'alls die CK Gesamtaktivitäten der zu bestimmenden Probe für diese Hemmkapazitäten der
Antikörper zu hoch sind, müssen auch hier Vorverdün ntingen vorgenommen werden, z. H. auf Aktivitäten der
Untereinheit M in CK-MM und MH von etwa 10(X) U/l
Das Verfahren der Erfindung hat gegenüber dem Siaini der Technik ijcitiicrniiciic Vorieiic. iJa/ii /iiiiien
die hohe Präzision der Ergebnisse und die Schnelligkeit sowie die [Einfachheit der Durchführung.
Die Präzision des Verfahrens der Erfindung ist darauf zurückzuführen, daß die verwendeten Antikörper
spezifisch auf die M-Uniereinhcit von CK-MM und CK-MB ansprechen und es deshalb erlauben, die
CK-MB-Aklivität in Körperflüssigkeiten, wie dem
Humanscrum. in einer Direktbestimmung zu ermitteln
Demgegenüber besitzen die erwähnten bekannten immunologischen Verfahren zur quantitativen Bestimmung
von Isoenzymen Nachteile. Nach diesen Verfah ren präzipitiert man die Isoenzyme der CK durch
isoenzymspezifische. präzipitierende Antikörper und ermittelt jeweils die im Überstand der Immunpiäzipitation
verbleibende Restaktivität. Abgesehen von dem Aufwand dieser Methode, die in der Regel die
Herstellung von mehreren spezifischen Antiseren erforderlich macht, müssen in jedem Falle mindesten«.
zwei verschiedene Testansätze durchgeführt werden, nämlich die Bestimmung der CK-Gcsamtaktivität und
die Bestimmung der CK-Restaktivität nach Präzipitation.
Die CK-MB-Aktivitiü kann also erst durch eine Differenzmessung ermittelt werden. Das Ergebnis ist
daher entsprechend den Regeln der F-ehlerrechnung mit
der Unsicherheit beider Messungen belastet. Nach der erfindungsgemäßen Methode wird die Fehleraddition
dagegen vermieden und eine Direktincssung durchgeführt.
Ein Nachteil des Präzipitationsverfahrens ist auch, daß die Immun-Präzipitation als Sekundärreaktion
verhältnismäßig viel Zeit (ca. 60 Minuten bis mehrere Stunden) beansprucht, so daß sich das Verfahren nicht
als Schnelltest eignet.
Die schnelle Durchführbarkeit ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das gilt
besonders für die bevorzugte Ausführungsform, nach der die Hemmung des M-Anteils von CK-MM und
CK-MB sowie die Bestimmung der Restaktivität gleichzeitig durchgeführt werden. Nach dieser Ausführungsform
kann in kürzester Zeit. z. B. innerhalb von 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise zwischen 5 und 15
Minuten, ein exaktes Testergebnis für die Diagnosestellung zur Verfugung stehen.
Ein beachtenswerter Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist auch die einfache Durchführbarkeit Die
Testmethode kann in größeren Instituten bzw. Kliniken z. B. mit Hilfe von üblichen mechanisierten Geräten zur
Bestimmung von Enzymaktivitäten) durchgeführt werden. ist aber auch in kleineren Instituten bzw. im
Arztlabor mit Hilfe eines Photometers durchführbar.
Für Einzelbestimmungen eignen sich Testpackungen.
die alle zur Durchführung des erfindungsgcniidlcn
Verfahrens notwendigen Reagenzien enthalten, so z. H.
ein übliches Gemisch aus Coeuzym, Enzym und
Substrat.erfindungsgemäßen CK-MM-Anlikörpcrn und
. einer Puffer Losung. Eine Tcslpackiing dieser oder
ähnlicher Art ermöglicht die Bestimmung von CKMH mit geringslmöglichcm Aufwand.
Nach dem Stand der Technik war nicht zu erwarten. iliiU sich das Problem der CK MH-ßcstimmung mittels
ι (.'ines so einfachen und schnell arbeitenden Verfahrens
wie dem erfindungsgemäßen Verfahren lösen läßt. So war nicht vorauszusehen, daß spezifische Antiseren
hergestellt werden können, welche zwar die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in CK-MM und -MH
vollständig hemmen, aber die enzymatische Aktivität der Untereinheit B von CKMB nicht beeinflussen. Der
Einsatz von Antikörpern mit diesen bisher nicht bekannten Eigenschaften ermöglicht erst die erfindungsgemäße
Reaktion.
ι Überraschend ist auch, daß die nach der Erfindung
eingesetzten Antikörper auch in Gegenwart von Substraten ihre volle Hemmkrafl beibehalten. Das ist
nicht selbstverständlich. So wurden in der Literatur (Ann. N. Y. Acad. Sei., Band 103. Seiten 858-889 [1963])
Antikörper beschrieben, die in Gegenwart von CK-Substralen CK-M.Vs nicht mehr zu 100% inaktivierten.
Antikörper mit derartigen Eigenschaften wären für die bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens, nach denen Antikörperliemmung und Zusatz von CK-Substratcn gleichzeitig erfolgen, völlig
unbrauchbar. Die nicht gehemmten Anteile der MAktivitäten würden den Meßwert von CKMB
fälschlicherweise erhöhen (der Anteil von CK-MB an der CK-Gesamtaktivität beträgt nur in Ausnahmefällen
mehr als 20%). eventuell gar nicht vorhandene CK-MB-Aktivitäten vortäuschen und auf diese Weise
falsche Labordaten für die Diagnose liefern.
Die überraschende Eigenschaft der erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper, die enzymatische Aktivität der
Uniereinheii M von CK-MM und -MB vollständig zu hemmen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit
B von CK-MB zu beeinflussen und zugleich in Gegenwart von Substraten ihre volle Hemmkraft
gegenüber der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB zu entfalten, ermöglichen eine bisher mit immunologischen
Methoden unerreichbare Schnelligkeit und Präzision der CK-MB-Aktivitäts-Bestimmung. Dadurch
eröffnet sich für die Praxis ein Weg. die CK-MB-Aktiviiät
mit einem Schnelltest zu bestimmen.
Es wird möglich, den Laborbefund einer Erhöhung der CK-Aktivität beim Patienten dahingehend zu
differenzieren, ob eine Erkrankung bzw. Traumatisie- rung von Skelett- oder Herzmuskulatur vorliegt.
Dadurch erhält man wichtige zusätzliche Daten für die Differentialdiagnose des Herzinfarkts (z. B. vom Lungeninfarkt und/oder von Schockfolgen) und anderer
Erkrankungen bzw. Schädigungen des Herzens.
Darüber hinaus erhält man durch die spezifische und exakte Bestimmung der Aktivität von CK-M B Aussagen
über die Beteiligung bzw. Schädigung des Herzmuskels bei anderen Krankheitsprozessen (z. B. bei Vergiftungen), bei therapeutischen Eingriffen (z. B. bei der
Wiederbelebung) oder bei diagnostischen Eingriffen (z. B. bei Herzkatl-cterisierungen oder Coronar-Angiographien).
In den folgenden Beispielen bedeuten »M« (bzw. »mM«) die Konzentrationen in Mol (bzw. Millimol) pro
Liter.
Hemmung von CK MM. CK-M U und CK-IlH
dv/rch Anii-Human-CK-MM
/λι einem bezüglich seiner CK-Eigenaktivität inaktivierten
llumansertiin werden reine CK-MM, CK-MU
<κΙτ CK-HB gegeben, und die CK-Aklivitälen der
ciii/.Hnen Proben werden bestimmt. Anschließend wird
0,1 ml l'robe mit 0,1 ml Anti-CK-MM-Lösung [erhallen
nach Beispiel Ba)] versetzt, es wird gemischt und 5 Minuten bei 25°C inkubiert. Danach erfolgt eine
Bestimmung der CK-Restaktivität auf bekannte Art. Die Ergebnisse zeigt folgende Tabelle:
Restaktivitiiten von CK-Isocnzymen nach Inkubation
mit inhibierendem Anti-HumanCK-MM (Mittelwerte ± 1 s aus jeweils ifaeh-Bcstimmungen) (s = Standardahweichung)
Tabelle | Aktivität der zuge setzten Isoenzyme (U/l) |
Restaktivitat nach Inkubation mit Anti-CK-MM (U/l) |
Isoenzym | 98 + 1,9 1043 + 22 |
0.3 ±2.1
0,5 ± 2.5 |
CK-MM | 103 ±2.0 410±7.8 |
53 ±1.7 206 ±6.2 |
CK-MB | 197 ±3,8 | 199 ±4.! |
CK-BB | ||
Innerhalb der Meßgenauigkeit werden die Aktivitäten von CK-MM zu 100%. von CK-BB zu 0% und von
CK-MB (entsprechend dem Anteil von 50% M-Untereinheiten) zu 50% gehemmt. Die Ergebnisse sind über
einen weiten Aktiwtätsbereich der zugesetzten Isoen
zym-Aktivitäten konstant.
Test I zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von CK-MB in Körperflüssigkeiten
a) Zusammensetzung der Testpackung
Die Testpackung ist ausreichend für 10 Aktivitätsbestimmungen. Die Packung enthält 1 Flasche Puffer für
10 Bestimmungen. 10 Flaschen Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch und 1 Flasche Anti-CK-MM, erhalten
nach Beispiel Ba).
Die Flasche Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch enthält:
Creatinphosphat-Dinamumsalz. | 27.24 mg |
Hexahydrat | 6,4 mg |
Glutathion reduziert | 3.4 mg) |
(oder N-Acetyl-cystein | |
Adenosindiphosphat-Dinatriumsalz. | 1.25 mg |
Hexahydrat | |
Nicolinamid-adenin-dinucleotid- | 1.7 mg |
phosphat, Dinatriumsalz | 8.47 mg |
Adenosin-monophosphat, Dinatriumsalz | 5U |
Hexokinase | 3U |
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase | 832 mg |
Glucose | 4.52 mg |
Magnesiumacetat | |
Die Rasche Puffer-Lösung enthält: | 105 m.M |
Triäthanolamin-acetat (in Wasser) | |
Die lyophilisicrien Antikörper werden mit 2 ml
destilliertem Wasser aufgelöst. Die entsprechende Antikörpcrlösting ist so eingestellt, daß bis zu 1000 U/l
Crealinkinasc-MM total gehemmt werden. Bei Seren mit extrem hohen Gesamt-Crealinkinase-Aklivitätcn
muß das Serum deshalb auf ca. 1000 U/l vorverdünnt werden. Die Antikörpcrlösting ist bei +4"C mindestens
7 Tage haltbar.
b) Ausführung der Aktivitätsbcstimmung
der CK-M B
b I) Ausführung
In ein Reaktionsgefäß pipcttieren:
0,1 ml Serum
+ 0,1 ml Antikörperlösung
+ 0,1 ml Antikörperlösung
Gut mischen, 5 Minuten bei 25" inkubieren. Danach werden Ü,i mi dieses Reaktionsgemisciies >uwic
2,0 ml Puffer-Lösung in eine Flasche mit dem
Gemisch von Coenzym, Enzym und Substrat gegeben.
Mirchen, 5 Minu'en bei 25"C inkubicren, danach in
eine Küvette gießen, die Extinktion bei 25°C messen und anschließend die Extinktionsänderung
pro Minute bestimmen. Wellenlänge: 334, 340 oder 366 mn;Schichtdicke: I cm.
b 2) Berechnung
Die ermittelte C'C-Aklivität der Probe muß
a) mit dem Verdünnungsfaktor 2 und
b) mitdemCK-MB-Hybridfaktor 2
(im Test werden nur die B-Untereinheiten von CK-MB gemessen) multipliziert werden.
Aus den Extinktionsdifferenzen pro Minute (,dfyMinute) wird der Mittelwert gebildet und in
die entsprechende Berechnungsformel eingesetzt: Messung bei 334 nm: Volumenaktivität-CK-MB =
df/Minute χ 4 χ 3500 U/l
Messung bei 340 nm: Volumenaktivität-CK-MB =
d£7Minute χ 4 χ 3376 U/l Messung bei 366 nm: Volumenaktivität-CK-MB =
df/Minute χ 4 χ 6364 U/l
Test Il zur quantitativen Bestimmung der CK-MB-Aktivität in Körperflüssigkeiten
a) Zusammensetzung der Testpackung
Die Testpackung ist ausreichend für 30 Aktivitätsbestimmungen. Die Packung enthält 1 Flasche Puffer-Lösung für 30 Bestimmungen und 30 Raschen eines
lyophilisierten Gemisches bestehend aus Coenzym. Enzym, Substrat und Anti-CK-MM nach Beispiel Ba).
Die in der Rasche Puffer-Lösung enthaltene Menge Triäthanolaminacetat entspricht der im Beispiel 2a)
angegebenen Menge. Die einzelnen Raschen mit dem Gemisch aus Coenzym, Enzym, Substrat und Anti-
CK-MM nach Beispiel Ba) entsprechen bezüglich der uerstgenanntep. Komponenten ebenfalls der in
Beispiel 2a) angegebenen Zusammensetzung und enthalten zusätzlich Anti-CK-MM. das bis zu 1000 U/l
CK-MM total hemmt
Il
b) Bestimmung ilcr Aktivii;ii von C'KMIl
b I) Ausführung
Zum Inhalt einer Flasrhe Coenzym/Enzym/Substriil/Anti-CK-MM-Gcmisch werden 2,0 ml Puffer-Lösung und 0.1 ml Serum pipettiert. Mischen, 5
Minuten t.-i 25°C inhibieren, dann in eine Küvette
gießen und über 5 Minuten die Extinktionen bei 25°C messen. Wellenlänge: 334, 340 oder 366 mn;
Schichtdicke: I cm.
b 2) Berechnung
Aus den F.xlinklionsdiffcren/.cn pro Minute (Aiii
Minute) wird der Mittelwert gebildet und in die entsprechende ßerechnungsformcl eingesetzt:
Messung bei 334 nm: Volumenaktivität CK-MB =
zlC/Miniitc χ 7000 U/l
M CSS1JH" hei 340 Π HV VnIi »m ρ na k hvitat CKMB ■=
M CSS1JH" hei 340 Π HV VnIi »m ρ na k hvitat CKMB ■=
A»Minute χ 6752 U/l
Messung bei 366 nm: Volumenaktivität CKMB = /dß/Minute χ 12 728 U/l
Messung bei 366 nm: Volumenaktivität CKMB = /dß/Minute χ 12 728 U/l
Bestimmung von CK-MD-Aklivitäten bei Patienten
mit und ohne Herzinfarkt mit Testpackung nach
Beispiel 3
mit und ohne Herzinfarkt mit Testpackung nach
Beispiel 3
a) CK-Aktivitäten verschiedener Patientenkollcktive
Patienten mit erhöhten CK-Aktivitätcn
ohne Herzinfarkte
ohne Herzinfarkte
Patienten mit
Herzinfarkten
Herzinfarkten
Fall/.ahl
Mittelwerte
Gesamt-CK CKMI)
(U/l) (U/l)
480 < 1,7
510
44
Die Tabelle zeigt, daß mil iiiife der criitukmgsgemii-
>ii Ilen Bestimmungsmethode schnell und eindeutig ein
Hinweis auf einen Herzinfarkt erhalten werden kann.
>ii Ilen Bestimmungsmethode schnell und eindeutig ein
Hinweis auf einen Herzinfarkt erhalten werden kann.
Simultanbestimmung der CK-Gesamtaktivitäl und
derCK-MB-Aklivität
a) Zusammensetzung der Testpackung
Die Zusammensetzung der Testpackung entspricht derjenigen von Beispiel 2a).
b) Bestimmung der CK-Gesamtaktivität und derCK-MB-Aktivität von CK-MB
b I) Ausführung
In die Flasche Coenzym-Enzym-Substrat-Gemiseh werden 2.0 ml Puffer-Lösung und 0,1 ml Serum
bzw. Scrumverdünnung pipettiert. Mischen, 5. Minuten bei 25"C inkubieren, danach in eine
Küvette gießen und über 2 Minuten die Extinktionsänderung (ΔEl\) bei 25°C bestimmen. Anschließend
wird 0,1 ml Antikörperlösung zugefügt, sofort gemischt und nach 3 Minuten erneut die
Extinktionsänderung (Δ E2) bei 25°C bestimmt.
Wellenlänge: 334, 340 oder 366 nm; Schichtdicke: 1 cm.
b 2) Berechnung
Die CK-Gesamlaktivität errechnet sich wie folgt: Messung bei 334 nm: Volumenaktivität CK-Gesamt =
Messung bei 340 nm: Volumenaktivität CK-Gesamt =
Δ Ε l/Minute χ 3376 U/l
Messung bei 366 nm: Volumenaktivität CK-Gesamt =
Δ E1/Minute χ 6364 U/l
Die CK-M B-Aktivität ergibt sich nach folgenden Berechnungsformeln:
Messung bei 334 nm: Volumenaktivität CK-M B =
4E2/Minute χ 7350 U/l
Messung bei 340 nm: Voiumenaktivitat CK-M B =
d£2/Minute χ 7090 U/l
Messung bei 366 nm: Volumenaktivität CK-MB = /1E2/Minute χ 13 364 U/l
b) Verlauf der CK-M B-Aktivitäten
bei einem Patienten mit Herzinfarkt
bei einem Patienten mit Herzinfarkt
Stunden nach | CK-MB |
Infarkteimritt | U/l |
3,5 | <5 |
4,5 | <5 |
5,5 | 6 |
7,5 | 22 |
8,5 | 23 |
9.5 | 29 |
10,5 | 50 |
11,5 | 46 |
13,5 | 56 |
15.5 | 55 |
17.5 | 64 |
21.5 | 62 |
25,5 | 50 |
29,5 | 42 |
33,5 | 25 |
43,5 | 18 |
53,5 | <5 |
61,5 | <5 |
Die Zahlenwerte zeigen den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmten Anstieg und Wiederabfall
der CK-MB-Aktivität bei einem Herzinfarkt-Patienten.
Beispiel A
Herstellung von CK-MM
a) \2 kg tiefgefrorener, menschlicher Skelettmuskel
werden bei Raumtemperatur aufgetaut und maschinell zerkleinert Das Gewebe wird in 2^1 kaltem 0.05 m
methau-HCI-Pufferl, der 0,01 M KO, I mM EDTA
.JÄthylendiamintetraessigsäure] und 1 mM Dithioery-
thrit enthält, suspendiert und mit einem Mixer
homogenisiert. Das Homogenat wird unter Eiskühlung
i>5 45 Minuten gerührt and anschließend 60 Minuten bei
12 000 g zentrifugiert. Der klare Überstand (2,6801)
wird einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung bei pH 8,0
in den Grenzen 40-75% Sättigung unterworfen. Der
O./r) s Niederschlag wird in 0,04 M Iris/l It'l-P'ilfer r)ll
K1O aufgenommen und gegen den gleichen l'uffci
dialysicri. Zur Adsorption von Myoglobin und sauren
liallastprotcinen werden 500 g feuchter basischer Ionenaustauscher auf Itiisis eines vcrncl/lc.i Dexlrans,
ac|iiilibricri gegen den gleichen l'tiffcr, zugesetzt. Nach
JO Minuten wird der Austauscher abgesaugt und zweimal mit je 400 ml 0,04 M Tris/HCI-PuFfer pH 8.0,
enthaltend 0,02 M NaCI, ausgewaschen. Filtrat und Waschwasscr werden vereinigt und mit Ammoniumsiilfal
auf 0,75 s gebracht. Der Niederschlag wird abze-ilrifugicrl, in 100 ml 0,04 M Tris/MCI-Puffcr pll 8.0
gelöst und gegen den selben Puffer dialysieri, bis kein Ammoniumsulfat mehr nachweisbar ist. Das klare
Dialysai vird auf einer Säule mit einem basischen Ionenaustauscher auf Basis eines vernetzten Dextrans
(6 χ 60 cm) mit dem gleichen Puffer äquilibriert. Die
Säule wird mit .Startpuffer so lange gewaschen, bis das
Kluat proteinfrei ist. Danach wird das Knzym mit 0.04 M
Tris/HCI"uifer pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCI, I mM
KDTA ti *d 1 mM Dithioeryihrit. von der Säule eluiert.
Fraktionen mit einem F.nzymgehalt von mindestens 20 U/ml werden vereinigt, mit Ammoniumsulfat auf
80% gesättigt, und das präzipiticrte Knzym wird abzeiiirifugiert. Zur Endrcinigung wird es nochmals
einer Chromatographie im selben System unterworfen, jedoch unter Verwendung eines kleineren Säulenvolumens.
Aus den vereinigten aktiven Fraktionen wird das Knzym mit 0.8 s Ammoniumsulfat gefällt, in 50 ml 0,04 M
Tris/HCI-Puffer pH 8.0. enthaltend 0,02 M NaCI, I mM
KDTA und I mM Dithioerythrit, konzentriert gelöst, steril-filtricrt und wieder mit Ammoniumsulfat auf 0,8 s
gebrach',. Man erhält so eine bei 4° C stabile Knzymsuspcnsion von CK-MM mit einer spezifischen
Aktivität von 26 —30 U/mg, gemessen mit Creatin als
Substrat bei 25'C.
Volumen: 86 ml; Aktivität: 316 U/ml: Protein:
11.8 mg/ml.
Ausbeute: ca. 30% (bezogen auf den Organextrakt).
Ausbeute: ca. 30% (bezogen auf den Organextrakt).
b) Analog Heispiel Aa) wird CK-MM aus Muskelgewebe
folgender Tiere Isoliert: Rhesusaffe, Schwein. Rind.
Beispiel B
Herstellung von Anti-CK-MM
Herstellung von Anti-CK-MM
a) CK-MM aus Humanmuskel wird gegen eine mit 0.07 M Triethanolamin gepufferte, physiologische NaCI-Lösung
pH 7.0. die 10 mM Mercaptoäthanol und 10 mM MgCL2 enihält. dialysiert. Die Enzymlösung wird durch
Ultrazentrifugation von Aggregaten befreit und der Proteingehalt mit dem genannten Diaiysepuffer auf
2 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem Freundschen Adjuvans (Wasser-Mineralölsuspension,
die zusätzlich noch 2 mg abgetötete M-Tuberculosebazillen enthält) emulgiert. Diese Emul-Moil
wird einer Ziege intramuskulär injiziert. Nach i Injektionen gleicher An im Absland von 3 Wochen und
i weiteren Honstcrinjcktioncn jeweils im Absland von
16 Wochen wird dem Tier 21 lage nach der letzten
ln;cklion Ulm entnommen. Das nach bekannten
Methoden gewonnene Serum wird mit einer Mischung. enthaltend 3% Schai-Scrumalbiimm und 0.1% Natrium
azid in einem 0,1 M Uoralpuffcr. auf pH 8,4 eingestellt
und stcrilfillriert. Die erhaltene Lösung, enthalte .·.' Anli-Humanmuskel-CKMM, wird in 0,5-ml-I'orlionen
in braune Glasflaschen abgefüllt und gefriergetrocknet. Die Antikörper besitzen ein Molekulargewicht von
etwa 160 000 bis 180 000.
b) Die nach Beispiel Aa) erhaltene CK-MM aus Humanmuske! wird gegen eine mit 0,1 M Imidazol
gepufferte, physiologische NaCl-Lösung pH 6.K. die 7.5 mM N-Acetylcystein und 25 mM Magnesiumacetai
enthält, dialysiert. Anschließend wird die Enzymlösung durch Ultrazentrifugation von Aggregaten befreit und
der Proteingehalt mit dem genannten üialysepuffcr auf
0.2 mg/ml eingestellt. I ml dieser Lösung wird mit I ml komplettem Freundschen Adjuvans cmulgiert. Diese
Emulsion wird einem Hammel intradermal injiziert. Nach 3 und 6 Wochen folgen 2 intramuskuläre
Injektionen und 3 weitere Boosierinjektionen, jeweils im Abstand von 14 Wochen. 19 Tage nach der letzten
Injektion wird Blut entnommen. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-HumaniiHiskcl-CK-MM
in gefriergetrockneter Form. Moleku largewichtder Antikörper etwa 160 000 bis 180 000.
c) CK MM aus Rhesusaffenmuskel wird gründlich gegen eine mit 0,15 M Imidazol gepufferte, physiologische
NaCl-Lösung pH 6,8, die 25 mM Dithioerythrit und l5mM Mangan(ll)-chlorid enthält, dialysiert. Nach
F.ntfernung der Aggregate durch Ultrazentrifugation wird der Proteingehalt mit dem genannten Dialysepuffer
auf 5 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem Freundschen Adjuvans emulgiert.
Injektionen. Blutentnahme und Aufarbeitung erfolgen analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-Rhesusaffenmuskel-CK-MM
in gefriergetrockneter Form. Sedimentationskonstante der Antikörper etwa 7 S.
d) CK-MM aus Schweincmuskel wird analog Beispiel Bb) aktiviert und die Antigen-Emulsion mit komplettem
Freundschen Adjuvans Kaninchen injiziert. Nach 3 Wochen erfolgt eine weitere subcutane A.ntigeninjektion.
Die Injektion wird nach weiteren 3 Wochen wiederholt, 19 Tage danach wird Blut entnommen. Die
Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-Schweinemuskel-CK-MM in gefriergetrockneter
Form. Molekulargewicht der Antikörper etwa 160 000 bis 180 000.
In völlig analoger Weise wird aus Rindermuskcl Anti-Rindermuskel-CK-MM gewonnen (Molekulargewicht
etwa 160 000 bis 180 000).
Claims (7)
1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit, dadurch gekenn zeich π et, daß man
die Probe mit Antikörpern inkubiert, die die cnzymatische Aktivität der Untereinheit M in den
Creatinkinasc-Isocnzymen-MM und -MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische
Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener Crcatinkinase-MB zu inaktivieren, und die Aktivität
der Creatinkinase-Untercinheit B in bekannter Weise photometrisch bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch' 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe der Körperflüssigkeit
und die Antikörper in Gegenwart von Creatinkinase-Substratcn inkubiert.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Inkubation der Probe mit den Antikörpern in der gleichen
Probe zusätzlich die CK-Gesamtaktivität bestimmt.
4. Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß es neben
bekannten Reagenzien zur enzymatischen Bestimmung der Creatinkinase-Aktivität Antikörper enthält, die die enzymatische Aktivität der Untereinheit
M in den Creatinkinasen-MM und -MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische
Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener Creatinkinase-MB zu inaktivieren.
5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es Antikörper enthält, die auch in
Gegenwart von Creatinkinase-Substraten eine vollständige Hemmung zu entfalten vermögen.
6. Mittel nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Ziegen gewonnene
Antikörper enthält.
7. Mittel nach den Ansprüchen 4—6, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper in einer Menge
enthalten sind, die ausreicht, um in der Probe bis zu 2500 U/l der Untereinheit M in den Creatinkinasen-MM und -MB vollständig zu hemmen.
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