DE69031397T2 - Quantitativer Nachweis von Bilirubin und ein Reagenz dafür - Google Patents
Quantitativer Nachweis von Bilirubin und ein Reagenz dafürInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Gesamtmenge an Bilirubinen in Körperflüssigkeiten und ein Reagenz dafür.
- Bilirubine sind gelbe Farbstoffe, die zu den Tetrapyrrolen gehören und als unkonjugiertes Bilirubin und konjugierte Bilirubine in Körperflüssigkeiten vorhanden sind. Konjugierte Bilirubine sind solche, in denen Zucker (z.B. Glucuronsäure) an Propionsäuregruppen der Bilirubine gebunden sind, während das unkonjugierte Bilirubin Bilirubin ist, das nicht chemisch modifiziert ist.
- Im Falle einer Krankheit, wie hämolytischer Anämie oder hämolytischer Gelbsucht, nimmt die Menge des unkonjugierten Bilirubins zu. Im Falle einer Krankheit, wie obstruktiver Gelbsucht, nimmt die Menge an konjugierten Bilirubinen zu. Deshalb ist die Trennung und quantitative Bestimmung von Bilirubinen in der klinischen Diagnose sehr wichtig.
- Es sind viele Verfahren zur Trennung und quantitativen Bestimmung von Bilirubinen vorgeschlagen worden, wie ein Verfahren, das ein Diazoreagenz verwendet, ein Verfahren, das Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) verwendet, ein Verfahren, das ein oxidierendes Enzym, wie Bilirubinoxidase, verwendet, und so weiter.
- Das Verfahren, das ein Diazoreagenz verwendet, hat aufgrund der Art des Diazotierungsreaktionsbeschleunigers und des Unterschieds der quantitativen Messung der entstandenen Azobilirubine viele Variationen. Typische Beispiele für die Verfahren sind ein Reagenz von Malloy & Evelyn et al. (Journal of Biological Chemistry 119 (1937), 481) und so weiter.
- Das Verfahren, das Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) verwendet, schließt einige Variationen ein, wie das Lauff et al.-Verfahren, in dem verschiedene Bilirubine mit einem Gradienten aus einer Phosphatpufferlösung und Isopropanol unter Verwendung einer Reversed-Phase-HPLC-Säule eluiert und analysiert werden (Journal of Chromatographie 226 (1981), 391) und so weiter.
- Das Verfahren, das ein oxidierendes Enzym verwendet, ist ein Verfahren, in dem die Bilirubine durch ein oxidierendes Enzym oxidiert werden, um die Absorption um 450 nm der Bilirubine zu eliminieren, wodurch die Menge der Bilirubine aus der Absorptionsänderung vor und nach der Reaktion berechnet wird. In diesem Verfahren kann die Spezifität der Oxidation der Bilirubine durch Ändern der Reaktionsbedingungen variiert werden. Reagentien für dieses Verfahren schließen ein Reagenz ein, das Bilirubinoxidase enthält (Clinical Chemistry 20 (1974), 783), ein Reagenz, das ein anderes Oxidationsmittel, wie Laccase, Tyrosinase, Ascorbinsäureoxidase und so weiter, enthält (Japanische Kokai Veröffentlichung (nicht geprüft) 17999/1984), ein Reagenz für die quantitative Bestimmung aller Bilirubine, das ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (z.B. Cholsäure etc.) oder eine aromatische Carbonsäure als Reaktionsbeschleuniger verwendet (Japanische Kokai Veröffentlichung (nicht geprüft) 249060/1984 etc.), und ein Reagenz für die quantitative Bestimmung von konjugierten Bilirubinen, in dem Bilirubinoxidase durch pH-Kontrolle, eine Pufferlösung und ein oberflächenaktives Mittel nur mit konjugierten Bilirubinen reagiert. Beispiele für die Reagentien für konjugierte Bilirubine sind ein Reagenz, wodurch Bilirubinoxidase in einer Pufferlösung von pH 9 bis 11 verwendet wird (Japanische Kokai Veöffentlichung (nicht geprüft) 58999/1987), ein Reagenz, wodurch Bilirubinoxidase in einer Pufferlösung von pH 5 bis 6, die ein anionisches oberflächenaktives Mittel enthält, verwendet wird (Japanische Kokai Veröffentlichung (nicht geprüft) 152955/1985), ein Reagenz, wodurch Bilirubinoxidase in einer Pufferlösung von pH 3,5 bis 4,5 verwendet wird (Japanische Kokoku Veröffentlichung (geprüft) 44000/1986) und so weiter. Außerdem offenbart die Japanische Kokai Veröffentlichung (nicht geprüft) 154162/1985 ein Reagenz für unkonjugierte Bilirubine, worin das Verhältnis von Bilirubin in einer Probe und Bilirubinoxidase in einem festgelegten Bereich in einer Pufferlösung von pH 8,0, die ein anionisches oberflächenaktives Mittel enthält, eingeschränkt ist.
- Im Verfahren, das ein Diazoreagenz verwendet, werden alle Bilirubine und konjugierten Bilirubine getrennt bestimmt, ob ein Reaktionsbeschleuniger der Diazotierungsreaktion im Reagenz enthalten ist, oder nicht. Die Trennfähigkeit ist allerdings im praktischen Gebrauch unzureichend und noch unzureichender bei einer Probe, die kein Albumin enthält, oder die Chemikalien, wie Salicylsäure, enthält. Es ist auch ein Problem dieses Verfahrens, daß Ungenauigkeit bei den gemessenen Ergebnissen auftritt, da die Azobilirubine, die durch Diazotierung von konjugierten Bilirubinen bzw. dem unkonjugierten Bilirubin hergestellt werden, unterschiedliche spektrochemische Eigenschaften besitzen. Außerdem unterscheidet sich Ditaurobilirubin, das als Standardmaterial für konjugierte Bilirubine verwendet wird, nach der Diazotierung in Reaktivität und spektrochemischen Eigenschaften von konjugierten Bilirubinen.
- Das Verfahren, das HPLC verwendet, hat ausreichende Selektivität, aber erfordert ein teures und besonderes Gerät. Außerdem erfordert es lange Meßzeiten. Und die Zahl der zu messenden Proben ist ebenfalls begrenzt.
- Bei dem Verfahren, das ein anderes oxidierendes Enzym verwendet, tritt das Problem auf, daß kein geeignetes Standardmaterial existiert, diese Situation ist vergleichbar mit der des Verfahrens, das ein Diazoreagenz verwendet. Da Ditaurobilirubin oder unkonjugierte Bilirubine sich von konjugierten Bilirubinen in Körperflüssigkeiten in den spektrochemischen Eigenschaften (z.B. Absorptionskoeffizient, Wellenlänge der maximalen Absorption etc.) oder in der Reaktivität mit einem Reagenz unterscheiden, kann bei den Meßergebnissen Ungenauigkeit auftreten. So werden Fehler verursacht, wenn Bilirubine in Körperflüssigkeiten unter Verwendung eines einzigen Standardmaterials getrennt bestimmt werden. Es wird auch vorgeschlagen, daß eine Kombination aus Ditaurobilirubin und unkonjugiertem Bilirubin als Standardmaterial verwendet wird, aber das Kombinationsverhältnis muß nach den Körperflüssigkeiten gewählt werden, weshalb seine Herstellung schwierig ist. Die Reagentien zur Bestimung konjugierter Bilirubine werden unter der Voraussetzung formuliert, daß Proteine, wie Albumin, in der Probe vorhanden sind. Deshalb ist es schwierig, eine Probe exakt zu messen, die ein hohes Verhältnis an Bilirubinen enthält, die frei von Proteinen sind, wie das Serum eines Neugeborenen oder ein Serum, das Salicylsäure enthält.
- Außerdem offenbart die Japanische Patentschrift (geprüft) 44000/1986 ein Reagenz zur quantitativen Bestimmung von konjugiertem Bilirubin, dessen pH-Bereich allerdings in bezug auf Stabilität und Aktivität für Bilirubinoxidase ungünstig ist.
- Das Verfahren, das das unkonjugierte Bilirubin mißt, wie in der Japanischen Kokai Veröffentlichung (nicht geprüft) 154162/1985 beschrieben, ist für eine Probe, die unkonjugiertes Bilirubin in unbekannter Konzentration enthält, nicht geeignet, da die Menge an Bilirubinoxidase in Abhängigkeit von der Menge an unkonjugiertem Bilirubin bemessen werden sollte. Außerdem ist das Ergebnis dieses Verfahrens fehlerhaft, da das für dieses Verfahren verwendete Reagenz nicht nur mit unkonjugiertem Bilirubin, sondern auch mit einigen konjugierten Bilirubinen funktioniert.
- EP-A-238 914 und WPIL Nr. 85-090153 offenbaren die Bestimmung des Gesamtbilirubins durch Umwandlung von Delta-Bilirubin unter Verwendung von Subtilisin oder Lipase und/oder Protease und anschließende Reaktion mit Bilirubinoxidase.
- JP-A-59-74997 betriift die Bestimmung des Gesamtbilirubins durch Umsetzung einer Probe mit Peroxid, einem oberflächenaktiven Mittel, einer aromatischen Carbonsäure, einer Protease und einer Peroxidase.
- Tohoku J. Exp. Med. 147 (1985), 281-293 offenbart, daß β-Glucuronidase auf Gallensäuren einwirkt und unter Verwendung eines Azofarbstoffs mit qualitativer DC- Analyse der verschiedenen Bilirubine verfolgt werden kann.
- Clin. Biochem. 20 (1987), 541-458 lehrt ein Verfahren zur Bestimmung aller Arten von Bilirubin durch Oxidation.
- Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Messung der Menge aller Bilirubine in einer Probe, umfassend die Dekonjugierung konjugierter Bilirubine mit einem Reagenz, das ein Enzym umfaßt, das zur Dekonjugierung fähig ist, um das unkonjugierte Bilirubin zu erzeugen, und die Bestimmung der Menge an unkonjugiertem Bilirubin in der Probe.
- Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Reagenz zur Messung der Menge aller Bilirubine, umfassend ein zur Dekonjugierung fähiges Enzym, das in einer Konzentration von 0,01 bis 100 Einheiten/ml verwendet wird, und ein Oxidationsmittel, das zur Oxidation von Bilirubinen fähig ist, oder eine diazotierende Komponente.
- Das Reagenz zur Messung der Menge aller Bilirubine der vorliegenden Erfindung besteht aus zwei Mitteln. Das erste Mittel enthält hauptsächlich ein Enzym, das zur Dekonjugierung von konjugierten Bilirubinen zu unkonjugierten Bilirubinen fähig ist, und das zweite Mittel enthält hauptsächlich ein Oxidationsmittel, um die Menge des unkonjugierten Bilirubins zu messen.
- Das Enzym des erten Mittels schließt eine Zuckeresterhydrolase, wie Glucuronidase, Glucosidase, Galactosidase etc.; Sulfatase oder Gemische davon ein. Im Falle, in dem die Probe eine Körperflüssigkeit des Menschen ist, ist Glucuronidase, die nicht mit anderen Enzymen kombiniert ist, bevorzugt. Das Enzym kann von irgendeinem Tier, einer Pflanze oder einem Mikroorganismus stammen, zum Beispiel Glucuronidase, die aus Rinderleber aus Schlangen oder Escherichia coli stammt; Glucosidase, die aus Hefe oder Mandeln stammt; Galactosidase, die aus Escherichia coli stammt, und Sulfatase, die aus Schlangen stammt. Das Enzym kann in einer Konzentration von 0,01 bis 100 Einheiten/ml, vorzugsweise 0,05 bis 50 Einheiten/ml verwendet werden. Bei Konzentrationen von weniger als 0,01 Einheiten/ml dauert es lange, bis die Dekonjugierungsreaktionen vollständig sind. Konzentrationen von mehr als 100 Einheiten/ml machen das Reagenz teuer und verzögern die Dejonjugierungsreaktionen aufgrund einer hohen Proteinkonzentration. Außerdem können konjugierte Bilirubine durch Verunreinigungen, die im Enzym enthalten sind, oxidiert werden.
- Das Oxidationsmittel, das zur Oxidation der Bilirubine fähig ist, schließt ein Enzym ein, das zur Oxidation von Bilirubinen fähig ist, wie Bilirubinoxidase oder Laccase, eine Kombination aus einer Oxidase zur Herstellung von Wasserstoffperoxid, wie Glucoseoxidase, Peroxidase und ein Substrat davon, ein Übergangsmetallion, das zur Oxidation der Bilirubine fähig ist, oder ein Salz davon, wie Kupfersulfat, Kupferchlorid, Eisen-(III)-sulfat und so weiter, und ein Peroxid, wie Kaliumpersulfat, Natriumperbenzoat und so weiter. Das Diazoreagenz des zweiten Mittels schließt eine Salzsäurelösung, die Sulfanilsäure und salpetrige Säure, ein Gemisch aus 2,4-Dichloranilin und Sulfanilsäure und so weiter, oder eine Kombination davon ein. Die Konzentration des Oxidationsmittels beträgt 0,01 bis 30 Einheiten/ml, vorzugsweise 0,05 bis 10 Einheiten/ml im Falle des Enzyms zur Oxidation von Bilirubinen, 0,01 bis 50 mM, vorzugsweise 0,05 bis 30 mM im Falle des Peroxids; 0,01 bis 20 mM, vorzugsweise 0,05 bis 5 mM im Falle des Übergangsmetallions oder eines Salzes davon; 0,05 bis 5 mM, vorzugsweise 0,1 bis 2 mM im Falle des Diazoreagenzes. Wenn die Konzentration außerhalb des vorstehenden Bereichs liegt, benötigt man eine lange Zeit, bis die Oxidationsreaktionen des unkonjugierten Bilirubins vollständig sind, oder die Verschlechterung des Reagenzes ist deutlich. Außerdem besteht die Möglichkeit, daß Niederschläge entstehen. Das oxidierende Enzym kann beliebigen Ursprungs sein. Zum Beispiel kann Laccase aus Lackbäumen oder Mikroorganismen (z.B. genus Polyporus) stammen, Bilirubinoxidase kann aus Mikroorganismen stammen (z.B. genus Myrothecium oder genus Trachyderma), oder Glucoseoxidase kann aus Mikroorganismen stammen (z.B. genus Aspergillus etc.).
- Zusätzlich zu den vorstehend aufgeführten Komponenten können das erste oder zweite Mittel außerdem einen Reaktionsbeschleuniger (z.B. eine aromatische Carbonsäure), ein oberflächenaktives Mittel, einen Puffer, ein Chelatisierungsmittel, aktivierende Mittel oder Salze enthalten. Beispiele für die aromatischen Carbonsäuren sind p-Toluolsulfonsäure, Benzoesäure und so weiter. Die aromatische Carbonsäure kann in dem Mittel in einer Konzentration von 5 bis 7 mM, vorzugsweise 10 bis 50 mM, vorhanden sein. Wenn die Konzentration außerhalb des vorstehenden Bereichs liegt, dauert es lange, bis die Reaktionen vollständig sind, oder es können Niederschläge auftreten. Das oberflächenaktive Mittel kann anionisch, nichtionisch, kationisch oder ampholytisch sein, zum Beispiel Natriumdodecylsulfat, Cholsäure, Polyoxyethylenglykol, Triton X-100 (erhältlich bei Nakarai Chemical Co., Ltd.), Tween 80 (erhältlich bei Wako Pure Chemical Industries), Laurylpyridiniumchlorid, Lauryltrimethylammoniumchlorid, N-Lauryl-myristyl-β- aminopropionsäure, N-Lauryl-β-iminodipropionsäure und so weiter. Das oberflächenaktive Mittel kann in dem Mittel in einer Konzentration von 0,01 bis 10 Gewichts-%, vorzugsweise 0,05 bis 2 Gewichts-% vorhanden sein. Konzentrationen von mehr als 10 Gewichts-% können Niederschläge erzeugen und die Fließfähigkeit herabsetzen und es dadurch schwierig machen, einen automatischen Analysator einzusetzen.
- Die Pufferlösung für das erste Mittel ist vorzugsweise eine, die einen pH-Bereich nahe am optimalen pH-Bereich des zur Dekonjugierung fähigen Enzyms besitzt, und die Pufferlösung für das zweite Mittel ist vorzugsweise eine, die einen pH-Bereich nahe am optimalen pH-Bereich des Oxidationsmittels besitzt. Beispiele für die Pufferlösungen für das erste Mittel sind ein Phthalsäure-Natriumhydroxid-Puffer (pH 5), ein Bernsteinsäurepuffer (pH 5), Säure-Natriumhydroxid-Puffer (pH 5) und so weiter, wenn es β-Glucuronidase aus Rinderleber verwendet. Beispiele für die Pufferlösungen für das zweite Mittel sind ein Phosphorsäurepuffer (pH 7,0), ein HEPES-Puffer (pH 7,0) und so weiter, wenn das Oxidationsmittel Bilirubinoxidase ist. Die Pufferlösung kann in einer Konzentration von 20 bis 500 mM, vorzugsweise 30 bis 200 mM, verwendet werden. Wenn sie weniger als 20 mM betragt, kann sich der pH-Wert des Mittels ändern, wenn eine Probe zu dem Mittel gegeben wird. Wenn sie größer als 500 mM ist, braucht es eine lange Zeit, um zu reagieren und im Mittel kann ein Niederschlag auftreten.
- Das Chelatisierungsmittel schließt eine Polyaminocarbonsäure, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), oder eine Oxycarbonsäure, wie Citronensäure, ein. Das Chelatisierungsmittel kann im Mittel ja einer Konzentration von 0,01 bis 100 mM, vorzugsweise 0,05 bis 50 mM, vorhanden sein.
- Die Füllstoffe schließen Polyethylenglykol, Albumin, Zucker und so weiter ein. Polyethylenglykol kann in einer Konzentration von 0,01 bis 10%, vorzugsweise 0,05 bis 2% verwendet werden, Albumin in einer Konzentration von 0,01 bis 50 mM, vorzugsweise 0,05 bis 10 mM, sein und Zucker in einer Konzentration von 1 bis 100 mM, vorzugsweise 5 bis 50 mM.
- Salze schließen Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Kaliumsulfat und so weiter ein. Sie können in einer Konzentration von 1 bis 500 mM, vorzugsweise 5 bis 100 mM, verwendet werden.
- Das Reagenz zur Messung der Menge aller Bilirubine der vorliegenden Erfindung enthält im allgemeinen unkonjugiertes Bilirubin als ein Standardmaterial in einer bekannten Konzentration innerhalb von 0,1 bis 80 mg/dl, vorzugsweise 0,5 bis 60 mg/dl. Das unkonjugierte Bilirubin kann das sein, das bei Daiichi Kagaku Yakuhin Co., Ltd. oder Shigma Chemical Co., erhältlich ist oder das, das aus der Gallenblase von Schweinen, Pferden oder dem Menschen erhalten wird. Das unkonjugierte Bilirubin wird intakt oder in einer Kombination mit einem Stabilisierungsmittel (z.B. Polyethylenglykol, Albumin, Zuckern, Chelatisierungsmitteln, Salzen) oder einem Füllmittel verwendet. Die Menge an Polyethylenglykol liegt innerhalb des Bereichs von 0,01 Gewichts-% bis 30 Gewichts-%, die Menge an Albumin beträgt 0,01 bis 50 mM, die an Zucker 1 bis 300 mM, die an Chelatisierungsmitteln 0,01 bis 100 mM und die an Salzen 1 bis 500 mM. Ein hochkonzentriertes Bilirubin-Kontrollstandardserum, das im Handel erhältlich ist, kann verwendet werden, aber es ist wünschenswert, daß das Standardserum nur das unkonjugierte Bilirubin in einer genauen Menge enthält.
- Das erste und zweite Mittel und das Standardmaterial können jede Form, wie gefriergetrocknete Lösungen annehmen, solange sie bei der Verwendung Lösungen sind. Die vorstehenden Formen können mit auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden.
- Hier wird eine bevorzugte Zusammmensetzung nach der vorliegenden Erfindung beschrieben.
- Das erste Mittel enthält β-Glucuronidase aus Rinderleber in einer Konzentration von 0,05 bis 10 Einheiten/ml, p-Toluolsulfonsäure in einer Konzentration von 5 bis 75 mM, EDTA in einer Konzentration von 0,01 bis 20 mM und einen Bernsteinsäure- Natriumhydroxid-Puffer von pH 4 bis 6 in einer Konzentration von 20 bis 500 mM. Das zweite Mittel enthält Bilirubinoxidase in einer Konzentration von 0,05 bis 10 Einheiten/ml, p-Toluolsulfonsäure in einer Konzentration von 10 bis 50 mM, EDTA in einer Konzentration von 0,05 bis 50 mM und einen Phosphorsäurepuffer von pH 5 bis 8 in einer Konzentration von 20 bis 500 mM.
- Das zweite Mittel enthält Bilirubinoxidase in einer Konzentration von 0,05 bis 10 Einheiten/ml, p-Toluolsulfonsäure in einer Konzentration von 10 bis 50 mM, EDTA in einer Konzentration von 0,05 bis 50 mM und Phosphorsäurepuffer von pH 5 bis 8 in einer Konzentration von 20 bis 500 mM.
- Das Verfahren zur Messung der Gesamtmenge an Bilirubinen kann durch Überführen der konjugierten Bilirbine in einer Probe in das unkonjugierte Bilirubin mit einem Reagenz, das das zur Dekonjugierung fähige Enzym enthält, und direkte Bestimmung durch HPLC oder Bestimmung der Absorptionsänderung, wenn die unkonjugierten Bilirubine mit einem Oxidationsmittel oder Diazoreagenz zu oxidierten bzw. azotierten unkonjugierten Bilirubinen umgesetzt werden, durchgeführt werden. Im vorstehend aufgeführten Verfahren kann nur das unkonjugierte Bilirubin als Standardmaterial verwendet werden, da die konjugierten Bilirubin in der Probe alle in das unkonjugierte Bilirubin überführt werden.
- Im Verfahren zur Messung der Gesamtmenge an Bilirubinen werden 0,6 ml des ersten Mittels in einer Meßzelle in einem Spektrometer vorerhitzt, dazu wird eine Probe in einer geeigneten Menge (z.B. Serum), die verschiedene Bilirubine enthält, gegeben und 1 bis 10 Minuten umgesetzt, um alle konjugierten Bilirubine in das unkonjugierte Bilirubin zu überführen, wodurch eine Absorptionsänderung bei 460 nm gemessen wird. Als nächstes werden 0,15 ml des zweiten Mittels dazu gegeben und 1 bis 10 Minuten umgesetzt, um alles unkonjugierte Bilirubin zu oxidieren, wodurch eine Absorption bei 460 nm gemessen wird. Dann wird eine Absorptionsänderung (A) aus der letzteren Absorption und der ersteren Absorption berechnet, die in Form eines Volumenanteils korrigiert wird. Getrennt davon wird ein Standardmaterial, das das unkonjugierte Bilirubin in einer bekannten Konzentration enthält, wie vorstehend beschrieben gemessen, um eine Absorptionsänderung (B) zu erhalten. Der Gesamtbilirubingehalt wird nach der folgenden Formel berechnet:
- Gesamtgehalt (mg/dl) an Bilirubin in der Probe = A/B x Gehalt (mg/dl) des unkonjugierten Bilirubins im Standardmaterial
- Die Temperatur zum Vorheizen und fur die Reaktionen beträgt vorzugsweise 25 bis 37ºC und die Menge der Probe beträgt vorzugsweise 0,005 bis 0,1 ml. Die Wellenlänge zur Bestimmung kann innerhalb des Bereichs von 400 bis 480 nm ausgewählt werden. Die Mengen des ersten und zweiten Mittels und der Probe können variiert werden.
- Wenn die Probe nur konjugierte Bilirubine enthält, entspricht die Absorptionsänderung nicht nur der Menge der konjugierten Bilirubine, sondern auch der Menge aller Bilirubine in der Probe.
- Im Falle, wo das zweite Mittel ein Diazoreagenz enthält, kann die Bestimmung durch Herstellung von Azofarbstoffen anstelle der Oxidation von Bilirubinen durchgeführt werden. Es ist auch möglich, daB die hergestellten konjugierten Bilirubine nach der Umsetzung des ersten Mittels mit der Probe direkt einer quantitativen Analyse unter Verwendung von HPLC unterzogen werden.
- Abbildung 1 ist ein HPLC-Analysenmuster von Beispiel 1.
- Abbildung 3 ist ein HPLC-Analysenmuster, das in Beispiel 4 durchgeführt wird.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die allerdings so zu deuten sind, daß sie nicht die Erfindung auf ihre Einzelheiten beschränken.
- Bilirubinglucuronide, eine Art der konjugierten Bilirubine, wurden aus Schweinegalle isoliert, wie in Bunseki Kagaku 31 (1982), E 63 beschrieben. Bilirubinglucuronide und das unkonjugierte Bilirubin wurden duch Modifizierung des Lauff et al.-Verfahrens (Journal of Chromatographie 226 (1981), 391 analysiert. Die Analyse wurde unter Verwendung einer Lichrosorb RP-8 (Teilchengröße von 10 Mikrometer) Chromatographiesäule mit einer Gradientenelution mit einer Phosphorsäurepufferlösung (pH 2,0), die 5% Methylcellosolve und Acetonitril enthielt, durchgeführt.
- Ein Reagenz zur Messung der Menge aller Bilirubine wurde wie folgt hergestellt.
- Das erste Mittel wurde aus 0,2 Einheiten/ml β-Glucuronidase (erhältlich bei Shigma Chemical Co., Ltd. als G0251), 30 mM p-Toluolsulfonsäure, 1 mM EDTA, 0,03 Gewichts-% Triton X-100 und einer 100 mM Phthalsäurepufferlösung (pH 5,0) hergestellt. Das zweite Mittel wurde aus 4 Einheiten/ml Bilirubinoxidase (erhältlich bei Shigma Chemical Co., Ltd. als B1515), 30 mM p-Toluolsulfonsäure, 1 mM EDTA, 0,03 Gewichts-% Triton X-100 und einer 200 mM Phosphorsäurepufferlösung hergestellt. Das zweite Mittel wurde auf pH 10,0 eingestellt. 1 ml des ersten Mittels wurde 2 Minuten auf 37ºC vorerhitzt, dazu wurden 0,05 ml Bilirubinglucuronid, das in Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, gegeben und 3 Minuten bei 37 ºC umgesetzt. Bei 37 ºC wurden 0,25 ml des zweiten Mittels zugegeben und 3 Minuten umgesetzt. Das Reaktionsgemisch (a) wurde nach der Zugabe des ersten Mittels und das Reaktionsgemisch (b) nach der Zugabe des zweiten Mittels mit HPLC analysiert und das Ergebnis ist in Fig. 1 gezeigt. Ein Reaktionsgemisch (c) wurde durch Umsetzen der Bilirubinglucuronidprobe mit dem ersten Mittel, das β- Glucuronidase ausschloß, erhalten und mit HPLC analysiert. Das Ergebnis ist ebenfalls in Fig. 1 gezeigt.
- In Fig. 1 handelt es sich bei dem Peak, der nach etwa 11 Minuten eluiert wurde, um Bilirubinglucuronide und der Peak bei etwa 18 Minuten ist das unkonjugierte Bilirubin. Die Linie (c) in Fig. 1 zeigt Bedingungen der Probe vor der Reaktion mit β-Glucuronidase, die ein dekonjugierendes Enzym ist. In Fig. 1 ist durch Vergleich Voll (a) mit (c) deutlich, daß die Bilirubinglucuronide vollständig in das unkonjugierte Bilirubin überführt wurden. Es ist außerdem durch Vergleich von (b) mit (c) deutlich, daß alles unkonjugierte Bilirubin vom zweiten Mittel oxidiert und eliminiert wurde.
- Einige verdünnte Lösungen, die in Referenzbeispiel 1 isolierte Bilirubinglucuronide in verschiedenen Konzentrationen enthalten, wurden hergestellt und unter Verwendung des Reagenzes zur Messung der Menge aller Bilirubine, das in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde eine Beziehung zwischen dem Bilirubinglucuronidgehalt und der Absorptionsänderung untersucht. 1 ml des ersten Mittels wurde 2 Minuten auf 37ºC vorerhitzt, dazu wurden 0,05 ml Bilirubinglucuronidlösungen mit verschiedenen Konzentrationen gegeben und 3 Minuten bei 37 ºC umgesetzt und die Absorption bei 460 nm wurde gemessen. Es wurde eine lineare Beziehung zwischen dem Verdünnungsverhältuis der Probe und der Absorptionsänderung erhalten.
- Dieses Beispiel zeigt Einflüsse von Zusätzen in einer Probe auf die Messung.
- Die Zusätze, d.h. Human-Albumin (erhältlich bei Shigma Chemical Co., Ltd. als A 3782), Salicylsäure, EDTA und Hämoglobin, wurden jeweils in einer Menge, die in Tabelle 1 aufgeführt ist, zu der in Referenzbeispiel 1 isolierten Bilirubinglucuronidlösung gegeben und eine quantitative Bestimmung wurde durchgeführt, wie allgemein in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 beschrieben. 5 mg/dl unkonjugiertes Bilirubin in 100 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 8,0) wurde als Standardmaterial verwendet. Tabelle 1
- Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, wird die Bestimmung aller Bilirubine durch die Zusätze überhaupt nicht beeinträchtigt. Bei herkömmlichen Verfahren wirken die Einflüsse solcher, in der Probe vorhandener chemischer Materialien sehr störend auf den gemessenen Wert der Bilirubine, aber die vorliegende Erfindung hat keine solchen Probleme.
- Es wurde eine Probe hergestellt, die Bilirubinglucuronide, die in Referenzbeispiel 1 isoliert wurden, und das unkonjugierte Bilirubin enthielt. Das Reaktionsgemisch (a) wurde nach der Zugabe des ersten Mittels und das Reaktionsgemisch (b) nach der Zugabe des zweiten Mittels mit HPLC analysiert und das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt. Ein Reaktionsgemisch (c) wurde durch Unssetzen der Bilirubinglucuronidprobe mit dem ersten Mittel, das Bilirubinoxidase und Kupfersulfat ausschloß, erhalten und mit HPLC analysiert. Das Ergebnis ist ebenfalls in Fig. 2 gezeigt. In Fig. 2 handelt es sich bei dem Peak, der nach etwa 11 Minuten eluiert wurde, um Bilirubinglucuronide und der Peak bei etwa 18 Minuten ist das unkonjugierte Bilirubin.
- Fig. 2 zeigt, daß das erste Mittel zur Messung der unkonjugierten Bilirubine nur die konjugierten Bilirubine oxidieren und eliminieren kann und das verbleibende unkonjugierte Bilirubin kann durch Zugabe des zweiten Mittels quantitativ bestimmt werden.
- Es wurde ein Standardmaterial A hergestellt, das 10 mg/dl an unkonjugiertem Bilirubin, 10 mg/dl Ditaurobilirubin und 26,8 g/l Human-Albumin enthielt. Außerdem wurde durch Mischen von 10 ml eines 10 mg/dl unkonjugierten Bilirubins mit 1 ml der Bilirubinglucuronidprobe aus Referenzbeispiel 1 eine Probe A hergestellt.
- Das Standardmaterial wurde mit dem Reagenz für alle Bilirubine aus Beispiel 1 umgesetzt und die resultierende Absorptionsänderung wurde gemessen. Getrennt davon wurde die Probe A mit dem Reagenz für alle Bilirubine umgesetzt und die Absorptionsänderung wurde gemessen. Die Menge an konjugierten Bilirubinen, unkonjugiertem Bilirubin und aller Bilirubine in der Probe A wurde aus den Absorptionsänderungen erhalten und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
- Die Probe A und das Standardmaterial A aus Beispiel 5 wurden mit dem HPLC- Verfahren von Referenzbeispiel 1 analysiert. Die Menge des unkonjugierten Bilirubins in der Probe A wurde aus dem Verhältnis der Peakfläche des unkonjugierten Bilirubins in der Probe A und der Peakfläche des unkonjugierten Bilirubins im Standardmaterial berechnet. Außerdem wurde die Menge an konjugierten Bilirubinen in der Probe A aus dem Verhältnis der Peakfläche der Bilirubinglucuronide in der Probe A und der Peakfläche des Ditaurobilirubins des Standardmaterials A berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
- Im Vergleichsbeispiel wird die Menge aller Bilirubine und der konjugierten Bilirubine in die Menge des unkonjugierten Bilirubins überführt unter der Maßgabe, daß Bilirubinglucuronide als Bilirubindiglucuronid betrachtet werden, und dann aus dem Molekulargewicht von Ditaurobilirubin und dem Molekulargewicht des unkonjugierten Bilirubins berechnet.
- Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß die Ergebnisse für die Reagentien der vorliegenden Erfindung sehr nahe an denen aus dem HPLC-Verfahren liegen. Insbesondere die Menge des unkonjugierten Bilirubins ist in beiden Verfahren identisch und daher ist ersichtlich, daß die Reagentien der vorliegenden Erfindung in Auftrennfähigkeiten überlegen sind.
- Nach der vorliegenden Erfindung kann eine quantitative Bestimmung verschiedener Bilirubine mit einem einfachen Verfahren ohne Beeinflussung durch das Vorhandensein von Albumin und anderer Chemikalien in einer Probe exakt durchgeführt werden. In der vorliegenden Erfindung wird das unkonjugierte Bilirubin, das leicht erhältlich ist, als einziges Standardmaterial verwendet und löst deshalb die Probleme der herkömmlichen Verfahren, wie Ungenauigkeit und so weiter. Außerdem ist die Leistung des Reagenzes erhöht, da die vorliegende Erfindung ein Enzym unter guten Bedingungen für die enzymatische Reaktion verwendet. Die Reagentien und Verfahren der vorliegenden Erfindung haben viele Vorteile, insbesondere bei klinischen Untersuchungen.
Claims (13)
1. Verfahren zur Messung der Gesamtmenge aller Bilirubine in einer Probe,
umfassend:
die Dekonjugierung konjugierter Bilirubine mit einem Reagenz, das ein Enzym
umfaßt, das zur Dekonjugierung fähig ist, um unkonjugiertes Bilirubin zu erzeugen und
Bestimmung der Menge an unkonjugiertem Bilirubin in der Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge an unkonjugiertem Bilirubin durch
ein HPLC-Verfahren direkt bestimmt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge an unkonjugiertem Bilirubin über
eine Absorptionsänderung bestimmt wird, die sich durch die Umsetzung des unkonjugierten
Bilirubins mit einem Oxidationsmittel oder einem Diazoreagenz ergibt.
4. Reagenz zur Messung der Menge aller Bilirubine, umfassend:
ein zur Dekonjugierung fähiges Enzym, das in einer Konzentration von 0,01 - 100
Einheiten/ml verwendet wird, und
ein Oxidationsmittel, das zur Oxidation von Bilirubinen fähig ist, oder eine
Diazokomponente.
5. Reagenz nach Anspruch 4, in Form eines kombinierten Präparates aus zwei
Zusammensetzungen für getrennte, aufeinanderfolgende Verwendung bei der Messung der
Menge aller Bilirubine, von denen die erste Zusammmensetzung das zur Dekonjugierung
fähige Enzym umfaßt und die zweite Zusammensetzung das zur Oxidation von Bilirubinen
fähige Oxidationsmittel oder die Diazokomponente umfaßt.
6. Reagenz nach Anspruch 4, wobei das zur Dekonjugierung fähige Enzym
Zuckeresterhydrolase, Sulfatase oder ein Gemisch davon ist.
7. Reagenz nach Anspruch 4, wobei das zur Oxidation von Bilirubinen fähige
Oxidationsmittel ein Enzym, eine Oxidase, die Wasserstoffperoxid bildet, ein
Übergangsmetallion oder ein Peroxid ist.
8. Reagenz nach Anspruch 4, wobei das zur Oxidation von Bilirubinen fähige
Oxidationsmittel Bilirubinoxidase, Laccase, Glucoseoxidase, Kupfersulfat, Kupferchlorid,
Eisen-(III)-sulfat, Kaliumpersulfat oder Natriumperbenzoat ist.
9. Reagenz nach Anspruch 4, wobei die Diazokomponente ein Salzsäuregemisch von
Sulfanilsäure und salpetriger Säure oder ein Gemisch aus 2,4-Dichloranilin und
Sulfanilsäure ist.
10. Reagenz nach Auspruch 7, wobei das Oxidationsmittel im Reagenz in einer
Konzentration von 0,01 bis 30 Einheiten/ml im Falle des Enzyms, 0,01 bis 50 mM im Falle
des Peroxids und 0,01 bis 5 mM im Falle des Übergangsmetallions vorhanden ist.
11. Reagenz nach Anspruch 4, wobei die Diazokomponente im Reagenz in einer
Konzentration von 0,05 bis 5 mM vorhanden ist.
12. Reagenz nach Anspruch 4, weiterhin umfassend einen Reaktionsbeschleuniger, ein
oberflächenaktives Mittel, einen Puffer, ein Chelatisierungsmittel, Füllstoffe und Salze.
13. Reagenz nach Anspruch 5, wobei die erste Zusammensetzung β-Glucuronidase
aus Rinderleber in einer Konzentration von 0,05 bis 10 Einheiten/ml, p-Toluolsulfonsäure
in einer Konzentration von 5 bis 75 mM, Ethylendiamintetraessigsäure in einer
Konzentration von 0,01 bis 20 mM und einen Bernsteinsäure-Natriumhydroxid-Puffer von
pH 4 bis 6 in einer Konzentration von 20 bis 500 mM umfaßt, und die zweite
Zusammensetzung Bilirubinoxidase in einer Konzentration von 0,05 bis 10 Einheiten/ml,
p-Toluolsulfonsäure in einer Konzentration von 10 bis 50 mM,
Ethylendiamintetraessigsäure in einer Konzentration von 0,05 bis 50 mM und eine
Phosphorsäurepufferlösung von pH 5 bis 8 in einer Konzentration von 20 bis 500 mM
enthält.
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