DE68927381T2

DE68927381T2 - Reagenz zur verwendung im ld-1-testverfahren

Info

Publication number: DE68927381T2
Application number: DE68927381T
Authority: DE
Inventors: Zak Shihabi; Mark Simmons; Yih-Shiong Wu
Original assignee: Wake Forest University; Boehringer Mannheim Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp; Wake Forest University
Priority date: 1988-07-25
Filing date: 1989-07-25
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2009-07-26
Also published as: DE68927381D1; AU4050589A; ATE144555T1; WO1990001067A1; EP0430991B1; EP0430991A1; EP0430991A4

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft allgemein die Messung der Bestandteile des Blutserums und insbesondere die Messung von Serum-Lactatdehydrogenase.

Hintergrund der Erfindung

Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein Enzym, das im menschlichen Körper in Form fünf verschiedener Isoenzyme vorhanden ist, die aufgrund ihrer relativen elektrophoretischen Wanderung zu einer Anode als LD-1, LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 bezeichnet werden, wobei LD-1 das am stärksten anodische ist.
Bei diesen Enzymen handelt es sich um tetramere Proteine, die aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt sind: Typ "M" der in den Skelettmuskeln vorherrscht, und Typ "H", der im Herzen vorherrscht. Die jeweiligen Kombinationen der Untereinheiten von LD-1 bis LD-5 sind H(4), H(3)M, H(2)M(2, HM(3 und M(4).
Die fünf Isoenzyme katalysieren die gleiche chemische Reaktion, sind aber auf verschiedene Körperbereiche verteilt. Durch Schädigung von Zellen in irgendeinem bestimmten Körperbereich, wie sie beispielsweise bei einem Herzinfarkt auftreten kann, werden die in dem Bereich vorhandenen speziehen LDH-Isoenzyme in den Blutstrom abgegeben.
Durch Entnahme einer Probe aus dem Blutstrom können die im Blut vorhandenen LDH-Typen bestimmt werden, und der geschädigte körperbereich läßt sich dementsprechend identifizieren. Da gewöhnlich alle fünf LDH-Isoenzyme in wechselnden Mengen ständig im Blut vorhanden sind, weist eine ungewöhnliche Konzentrationserhöhung bei einem der LDH-Isoenzyme darauf hin, daß ein bestimmter Bereich des Körpers geschädigt wurde.
Da das Herz LD-1 und LD-2 enthält, läßt sich das Auftreten eines Herzinfarkts bestimmen, indem ein diagnostischer Test durchgeführt wird, um zu sehen, ob die Menge eines dieser Isoenzyme im Blutstrom erhöht ist oder nicht. LD-1 ist ein bevorzugter Indikator für einen Herzinfarkt, da die Erhöhung von LD-1 im Blut, gemessen innerhalb von 48 Stunden nach dem Einsetzen der Schmerzen im Brustraum, das Auftreten eines Herzanfalls mit großer Genauigkeit bestätigt. In neuerer Zeit ergaben sich aus Studien Hinweise dafür, daß Änderungen im Verhältnis der LD-1- zur Gesamt-LDH-Aktivität eine zuverlässige Angabe zur Schwere und dem Fortschreiten eines vor kurzem erlittenen Herzinfarkts liefern.
Eine bevorzugte Methode zum Messen der LD-1-Menge im Blutserum ist die kolorimetrische Methode, wobei LD-1 die Umsetzung zweier Substrate, Lactat und Nicotinamid-adenindinucleotid (NAD), zu Pyruvat und der reduzierten Form von NAD (NADH) katalysiert. Diese chemischen Veränderungen führen zu einer Farbveränderung in einer Lösung, die mit einem Kolorimeter gemessen werden kann. Falls gewünscht wird, für die Bestimmung der Konzentration von LD-1 oder für die Bestimmung von dessen Verhältnis zur Gesamt-LDH-Konzentration oder -Aktivität kolorimetrisch zu einem direkten Maß für die LD-1-Aktivität im Blutserum zu kommen, so müssen die LD-2 bis LD-5 zunächst inaktiviert werden, so daß nur LD-1 die Cosubstrate Lactat und NAD katalysiert.
J.H. Eckfeldt, M.J. Kershaw und L.A. Lewis, Clin. Chem. 30, 1821 (1984), schlagen einen automatisierten Assay zur Bestimmung der Lactatdehydrogenase LD-1 vor. Bei dieser Methode ist das Blutserum vorzugsweise 20 min lang in einer Lösung von Lactat und Cyclohexylaminopropansulfonsäure (CAPS) vorher zu inkubieren. Nach der Vorinkubation wird diese Lösung mit einer zweiten, NAD enthaltenden Lösung vermischt, und nach Ablauf von 2 Minuten wird die sich ergebende Reaktion kolorimetrisch gemessen.
Takizawa et al., Clin. Chem. 29 (1983), von Eckfeldt et al. - siehe oben - berücksichtigt und zitiert, schlagen die Inaktivierung der einzelnen LDH-Isoenzyme mit kürzeren oder keinen Vorinkubationszeiten vor. Takizawa befaßt sich allerdings mit einzelnen LDH-Isoenzymen und lehrt nicht, wie Blutserum-LD-1 in einem schnellen kolorimetrischen Assay durch gleichzeitiges Inaktivieren der LD-2 bis LD-5 zu messen ist.
Die japanische Patentanmeldung 86 122 193 von Iatron Laboratories (japanische Patentveröffentlichung JP 62 278 997, veröffentlicht am 3. Dezember 1987) beschreibt Reagenzien zur Messung von LDH-Isoenzymen. Bei dem Reagens handelt es sich um eine Kombination aus Alkalipuffern wie etwa CAPS und proteindenaturierenden Mitteln, etwa Harnstoff, Thioharnstoff, Guanidin, und Thiocyanat-Salzen von Trichloressigsäure. In der Iatron-Veröffentlichung wird die Verwerdung eines proteindenaturierenden Mittels und eines Thiocyanat-Anions in Kombination zur Hemmung der Aktivität der LD-2 bis LD-5 nicht aufgezeigt oder vorgeschlagen.
Die inaktivierende Wirkung auf die LD-2 bis LD-5 ist zum Beispiel aus L.M. Gubernieva, E.E. Safronova und V.N. Malakhov, Biochemistry, 39/6(II), 1020-1033 (1975); M.J. Mcqueen, Ann. Clin. Biochem. 11/3, 75-80 (1974); sowie A.Y. Foo, E. Nemesanszky und S.B. Rosalki, Ann. din. Biochem. 18(4), 232-235 (1981) bekannt. In keiner dieser früheren Veröffentlichungen wird die Verwendung eines proteindenaturierenden Mittels und eines Thiocyanat-Anions in Kombination zur Hemmung der Aktivität der LD-2 bis LD-5 aufgezeigt oder vorgeschlagen.
In US-Patent Nr. 4 224 406, ausgegeben am 23. September 1980 an Gomez und Wicks, wird die Verwendung von Antikörpern zur Beseitigung der LD-2 bis LD-5 vorgeschlagen. In der japanischen Patentveröffentlichung 53 046 090, veröffentlicht am 25. April 1978, wird die Verwendung eines reduzierten NAD-Typs zur Hemmung der LDH-Aktivität vorgeschlagen.
T.W. Thannhauser et al., Analytical Biochemistry 138, 181- 188 (1984), offenbaren die Verwendung von Guanidinthiocyanat in hohen Konzentrationen zur Denaturierung eines Proteins, um Disulfid-Bindungen für die quantitative Spaltung durch Na&sub2;SO&sub3; verfügbar zu machen. Nicht erwähnt ist ein Bestandteil, um LD-1 vor Hemmung zu schützen.
JP-A-62278997 lehrt einen optimalen pH von 10,15 für die Inaktivierung von LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 in Gegenwart eines Proteindenaturierungsmittels. Es wird beschrieben, daß die Inaktivierung bei Absenkung des pH schlechter wird, und das Reagens ist dann unbrauchbar. Tabelle 1 und Figur 3 zeigen, daß bei pH-Werten von unter 10,15 zumindest LD-2 mehr und mehr aktiv wird.
In der modernen medizinischen Industrie werden viele Tests mit Hilfe von automatisierten Analysegeräten durchgeführt, die gekennzeichnet sind durch die Verwendung relativ kleiner Mengen an Proben und Reagenzien sowie relativ kurzen Reaktionszeiten. Es besteht Bedarf an einem verbesserten Reagens für die Hemmung der Aktivität der LD-2 bis LD-5 welches mit hinreichender Geschwindigkeit und Einfachheit arbeitet, um mit automatisierten klinischen Analysegeräten kompatibel zu sein. Es besteht auch ein Bedarf an einem solchen Reagens, das bei neutralem oder alkalischem pH arbeiten kann, um so zu einer längeren Gebrauchsfähigkeitsdauer des Reagens im Handel zu kommen.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines wirksamen Mittels zur Hemmung der Aktivität der LD-2 bis LD-5 in neutraler bis alkalischer Umgebung.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Reagens für die Hemmung der LD-2 bis LD-5, welches mit hinreichender Geschwindigkeit und Einfachheit arbeitet, um in automatisierten klinischen Analysegeräten brauchbar zu sein.
Diese und andere Aufgaben werden mit Hilfe der vorliegenden Erfindung gelöst, die in einem Aspekt ein Reagens zur Inaktivierung der LD-2 bis LD-5 in neutraler bis alkalischer Umgebung betrifft, umfassend (1) das Reaktionsprodukt von (a) Guanidin und (b) einem Thiocyanat-Anion, wobei das Reaktionsprodukt in einer Konzentration von etwa 240 mM vorhanden ist, (2) Lactat und (3) einen Puffer zur Stabilisierung des pH auf 9,5 bis 9,6.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit zur Bestimmung der LD-1-Aktivität in einer Probe, die LD-1 bis LD-5 enthält, wobei der Kit das obige Reagens sowie auch ein zweites Reagens umfaßt, das mit LD-1 in meßbarer Weise reagieren kann.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der LD-1-Aktivität in einer Probe, die LD-1 bis LD-5 enthält, umfassend das Anwenden des obigen Reagens auf wenigstens einen Teil der Probe zur Hemmung der Aktivität der LD-2 bis LD-5 und das Anwenden eines zweiten Reagens auf wenigstens einen Teil der Probe, um in meßbarer Weise mit dem LD-1, welches aktiv bleibt, zu reagieren, und die Bestimmung der LD-1-Aktivität in der Probe als Funktion der meßbaren Reaktion des zweiten Reagens umfaßt.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der LD-1-Aktivität einer Probe, umfassend:
Trennen der Probe in einen ersten und zweiten Teil;
Anwenden des Reagens nach Anspruch 1 auf den ersten Teil, um die Aktivität von LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 zu hemmen;
Anwenden eines zweiten Reagens auf den ersten und zweiten Teil, um in meßbarer Weise auf die LD-Aktivität sowohl im ersten als auch im zweiten Teil zu reagieren; und
Bestimmen der LD-1-Aktivität in der Probe als Verhältnis der Gesamt-LD-Aktivität in der Probe als Funktion der meßbaren Reaktion des zweiten Reagens mit dem ersten und zweiten Teil.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit zur Bestimmung der LD-1-Aktivität als Verhältnis der Gesamt-LD-Aktivität in einer Probe, wobei der Kit das Reagens nach Anspruch 1 für die Inaktivierung von LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 in einem der beiden Teile der Probe und ein zweites Reagens umfaßt, das in meßbarer Weise mit LD-1, LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 in beiden Teilen der Probe reagieren kann, wodurch die LD-1-Aktivität als Verhältnis der Gesamt-LD-Aktivität in der Probe als Funktion der meßbaren Reaktion des zweiten Reagens mit beiden Teilen der Probe bestimmt werden kann.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

FIG. 1 ist eine lineare Regressionskurve, welche die Korrelation zwischen der beobachteten LD-1-Aktivität und der erwarteten LD-1-Aktivität bei der Bewertung des Reagens der vorliegenden Erfindung durch Prüfen auf bekannte Aktivitätswerte zeigt.
FIG. 2 zeigt die Ergebnisse einer elektrophoretischen Analyse, welche die Spezifität des Reagens der vorliegenden Erfindung belegt.
FIG. 3a stellt die LDH-Profile von Blutproben aus Patienten mit anomalen LDH-Profilen dar.
FIG. 3b zeigt die gleichen wie in FIG. 3a gezeigten Proben nach Zugabe des Reagens der vorliegenden Erfindung und weist auf die Spezifität des Reagens der vorliegenden Erfindung hin.
FIG. 4 ist eine lineare Regressionskurve, wobei die Genauigkeit des Reagens der vorliegenden Erfindung mit einer Isomune-Meßmethode verglichen wird.

Ausführliche Beschreibung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die LD-2 bis LD-5 schnell und wirksam in einer LD-1 bis LD-5 enthaltenden Probe mit Hilfe eines Reagens inaktiviert werden können. Es wurde gezeigt, daß das proteindenaturierende Mittel von sich aus die LD-2 bis LD-5 beim gewünschten pH nicht inaktiviert. Gezeigt wurde auch, daß andere Thiocyanat-Salze nicht die gewünschten Ergebnisse in diesem pH-Bereich erbringen. Werden allerdings proteindenaturierendes Mittel und Thiocyanat-Anion kombiniert, so bildet das Reaktionsprodukt ein selektives und wirksames Reagens für die Inaktivierung der LD-2 bis LD-5.
Das Reagens, das so wirkt, daß es jede, ein "M"-Merkmal enthaltende LDH-Einheit inaktiviert, kann irgendein brauchbares proteindenaturierendes Mittel enthalten, das durch Aufbrechen von Wasserstoffbrücken arbeitet. Beispiele für solche geeignete Mittel sind Harnstoff, Guanidin, Thioharnstoff und Mischungen derselben. Guanidin hat sich aufgrund seiner Verfügbarkeit im Handel als das bevorzugte dieser Mittel erwiesen.
Das Thiocyanat-Anion wird normalerweise durch ein Thiocyanat-Salz wie etwa Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat oder Mischungen dieser beiden geliefert, doch ist jede Quelle für Thiocyanat-Anionen zur Verwendung bei dieser Erfindung geeignet.
Die Konzentration an Guanidinthiocyanat beträgt etwa 240 mM bei einem pH von 9,5.
Es wurde gefunden, daß Lactat das Isoenzym LD-1 vor einer Abnahme der Aktivität durch das Reagens schützt. Es wurde gefunden, daß das Reagens ohne Lactat die Aktivität der LD-2 bis LD-5 vollständig hemmt und die Aktivität von LD-1 leicht unterdrückt. Durch Zusatz von Lactat zum Reagers wird diese unterdrückende Wirkung jedoch vermieden.
Für das Arbeiten bei pH 9,5 wird eine Lactat-Konzentration von etwa 90 mM für die Verwendung in Kombination mit der Guanidinthiocyanat-Menge bevorzugt.
Es kann auch ein Puffer mit dem Reagens verwendet werden. Ein Puffer, der sich als brauchbar erwiesen hat, ist eine Kombination aus 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol (AMP) und Tris(hydroxymethyl)methylamin-hydrochlorid (Tris), obgleich jeder geeignete Puffer verwendet werden kann.
Bei Verwendung des AMP/Tris-Puffers kann der AMP-Anteil in Mengen bis zu etwa 300 mM vorhanden sein, und der Tris-Anteil kann in Mengen bis zu etwa 200 mM vorhanden sein. Arbeitet das Reagens bei pH 9,5, so umfaßt der Puffer etwa 200 mM AMP und etwa 77 mM Tris.
Beim Arbeiten wird das Reagens auf eine LDH-Isoenzyme enthaltende Probe angewandt und gerührt. Danach wird ein zweites Reagens zugesetzt, umfassend eine Kombination als Lactat und NAD, und es wird jegliche Farbveränderung des zweiten Reagens gemessen. Bei einer Anwendung dieser Erfindung wird die Farbveränderung, die das zweite Reagens durch die unbehandelte Probe erfährt, mit der Farbveränderung verglichen, die das zweite Reagens durch die behandelte Probe erfährt, so daß sich das Verhältnis von LD-1 zum Gesamt-LDH-Gehalt ermitteln läßt. Normalerweise wird dieses Verhältnis aus den Resultaten einer Spektrophotometer-Ablesung errechnet. Diese Arbeitsgänge können von Hand durchgeführt werden oder mit Hilfe von Maschinen, wie nachsteherd in Zusammenhang mit den Beispielen beschrieben ist.
Das Reagens kann durch den Handel als einzelne Komponente bereitgestellt werden, kann aber auch als Teil eines Kits bereitgestellt werden, das auch das zweite Reagens (Lactat und NAD) und möglicherweise Geräte wie etwa Pipetten, Ampullen etc. enthält.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird nun in Zusammenhang mit den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben, die erläutern und nicht einschränken sollen.

Beispiel 1

Materialien und Methoden

A. Materialien:

1. Reagens I, enthält Lithium-L-lactat (90 mM), Guanidinthiocyanat (240 mM), Tris-Puffer (112,6 mM) bei pH 9,5.
2. Reagens II, enthält Na&sub2;SO&sub4; (40 mM) und NAD (53,76 mM).
Die Reaktionsmischung ist eine Kombination aus 2,0 ml R-1, 0,5 ml R-2 und hat einen End-pH von 8,9 bei der Reaktion.
3. LD-Isoenzyme. Die einzelnen reinen Isoenzyme LD-1, LD-2, LD-3 und LD-5 wurden von Aalto of Escondido, CA, bezogen. Serumproben von Patienten wurden von einem örtlichen Krankenhaus bezogen.

B. Verfahren unter Verwendung eines automatischen Analysegeräts

Die Tests wurden auf einem Boehringer Mannheim/Hitachi 705-Analysegerät durchgeführt. Das Analysegerät erhielt die folgenden Parameter:
Assay-Code: Rate - 20-26 (entspricht 84,62 s bis 198,70 s)
Probenvolumen: 12 µl
R1-Volumen: 400 µl
R2-Volumen: 100 µl
Wellenlänge 1: 376 nm
Wellenlänge 2: 340 nm
Temperatur: 37ºC
Faktor: -10470

C. Manuelles Verfahren

Instrument: Spektrophotometer
Temperatur: 37ºC
Wellenlänge: 340 nm
1. Das Spektrophotometer wird mit destilliertem oder deionisiertem Wasser (DI HOH) genullt.
2. Die folgenden Reagenzien werden in eine Küvette pipettiert:
3. Die Probe wird gemischt und auf 37ºC äquilibriert
4. 0,5 ml R2 werden abpipettiert und in ein Proben- Reagenzglas gegeben. Es wird gemischt, und die Ändderung der optischen Dichte bei 340 nm wird etwa 6 Minuten lang gemessen. Es wird A/min von 2 bis 4 Minuten berechnet. Dies ist A/min für die Probe.
5. Unter Verwendung von 0,060 ml DI HOH als Probe werden die Schritte 2 bis 4 für den Blindwert wiederholt. Dies ist A/min für den Blindwert.
6. Es wird E/1 berechnet (E/1 Einheiten LDH-Aktivität pro Liter).
E/1 = (A/min Probe - A/min Blindwert) 1000 2,56 6,22 Lichtweg 0,06

D. Vorschrift für die elektrophoretische Analyse

1. Für die elektrophoretische Analyse wurden etwa 630 bis 1000 µl-Proben der einzelnen LD-1, LD-2, LD-3, LD-4, LD-5 und des anomalen Patientenserums verwendet.
2. 12 µl Probe wurden zu 400 µl R1 gegeben und zur Hemmung der LD-2 bis LD-5 4 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, um eine inhibierte Probe zu ergeben.
3. Weitere 12 µl Probe wurden zu 400 µl Tris-Puffer (112,6 mM, pH 8,9-9,0) gegeben und 4 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, um eine Kontrollprobe zu ergeben.
4. Sowohl die inhibierte als auch die Kontrollprobe wurden auf das Beckman Paragon-Gel aufgetragen, und die Elektrophorese wurde unter Verwendung eines Beckman Paragon-Elektrophorese-Instruments von Beckman Instruments nach dem für das Gel angegebenen Verfahren von Beckman durchgeführt.

E. Vergleichsmethode

68 Patientenproben mit einer LD-1-Aktivität von 30 bis 800 E/1 wurden getestet, um die Selektivität von R1 mit der immunchemischen Trennmethode zu vergleichen. Für die immunchemische Trennung wurde das LD-1-Reagens Isomune von Roche verwendet.

F. Versuchsergebnisse

1. Die LD-Isoenzyme wurden unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens mit automatischem Analysegerät getestet. Der Zweck des Tests ist es, zu bestimmen, ob das Reagens der vorliegenden Erfindung die LD-2 bis LD-5 selektiv inaktiviert und LD-1 aktiv beläßt. Die nachstehend in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse belegen, daß das Reagens der vorliegenden Erfindung in dieser Weise selektiv ist. Das LD-1-Isoenzym wurde bei mehreren Konzentrationen getestet. Bei einigen Testergebnissen war eine Zunahme der LD-1-Aktivität festzustellen. Tabelle 1
FIG. 1 zeigt, daß bis wenigstens 1000 E/1 eine Linearität zwischen der beobachteten Aktivität von LD-1 und der erwarteten Aktivität von LD-1 besteht. FIG. 1 zeigt einen Korrelationskoeffizienten ("R") von 1,000 und eine Reststreuung ("SEE") von 3,312.
2. Die Versuchsergebnisse der elektrophoretischen Analyse belegen auch die Selektivität des Reagens der vorliegenden Erfindung. FIG. 2 zeigt die Testergebnisse mit dem Paragon-Gel von Beckman. Bei den Spalten 2 und 4 handelt es sich um die eigentlichen Patientenproben aus Patienten mit anomalen LDH-Profilen. Die Spalten 3 und 4 zeigen die gleichen Proben nach Hemmung mit dem Reagens der vorliegenden Erfindung. Die Spalten 6 und 8 zeigen die Profile von Mischungen aus LD-1 bis LD-3 und LD-5. Die Spalten 7 und 9 zeigen die gleichen Proben nach Behandlung mit dem Reagens der vorliegenden Erfindung. Die FIGN. 3a und 3b zeigen graphisch die Selektivität des Reagens der vorliegenden Erfindung. FIG. 3a zeigt das Profil der Proben 2 und 4 des Tests mit Beckman-Paragon-Gel von FIG. 2. FIG. 3b zeigt das Profil der Proben 3 und 5, woraus sich ergibt, daß das Reagens der vorliegenden Erfindung die Aktivität der LD-2 bis LD-5 selektiv hemmt.
3. Die Genauigkeit des Reagens der vorliegenden Erfindung zeigt sich weiterhin durch ein Experiment des Methodenvergleichs. 68 Patienten-Serumproben aus einem örtlichen Krankenhaus wurden unter Verwendung des Reagens der vorliegenden Erfindung mit Hilfe der Methode mit automatischem Analysegerät geprüft. Die Ergebnisse sind auf der Y-Achse von FIG. 4 gezeigt. An getrennten Aliquoten der gleichen Proben wurde das Isomune-LD-Trennsystem von Roche verwendet. Die Ergebnisse dieses Tests sind auf der X-Achse von FIG. 4 gezeigt. Die lineare Regressionsanalyse zeigte Y = 0,954x + 8,425 (R = 0,9987).
4. Die Genauigkeit des Reagens der vorliegenden Erfindung ergab sich aus einer kritischen Analyse, die nachstehend zusammengefaßt ist und einen niedrigen Variabilitätskoeffizienten (CV%)) zeigt. Unter Verwendung des Reagens der vorliegenden Erfindung wurden Blutproben von Normalpatienten und Patienten mit Herzproblemen (anomal) auf LD-1-Aktivität analysiert.

Beispiel 2

A. Materialien:

1. Reagens I, enthält Lithium-L-lactat (90 mM), Guanidin-HCl (240 mM), Natriumthiocyanat (240 mM), Tris- Puffer (119 mM) und Na&sub2;CO&sub3; (12,5 mM) bei pH 9,6.
2. Reagens II, enthält Na&sub2;SO&sub4; (40 mM) und NAD (53,76 mM).
Die Reaktionsmischung ist eine Kombination aus 2,0 ml R-1, 0,5 ml R-2 und hat einen End-pH von 8,9 bei der Reaktion.
3. LD-Isoenzyme: Die gleichen wie in Beispiel 1 beschriebenen.

B. Verfahren unter Verwendung eines automatischen Analysegeräts

Die gleichen wie in Beispiel 1 beschriebenen.

C. Manuelles Verfahren

Das gleiche wie in Beispiel 1 beschriebene.

D. Funktionseigenschaften

Wie in Tabelle 2 gezeigt, sind die Reagenzien in Beispiel 2 für das Isoenzym LD-1 der humanen Lactatdehydrogenase spezifisch, da bei verschiedenen Konzentrationen volle Aktivität erhalten wurde, mit Linearität bis wenigstens 1000 E/1. Dagegen weisen alle übrigen vier Isoenzyme verbleibende Aktivitäten gleich oder weniger als 2,2% auf, die klinisch nicht signifikant sind. Dieses Ergebnis zeigt, daß das Reagens der vorliegenden Erfindung das Reaktionsprodukt eines proteindenaturierenden Mittels und Thiocyanat-Anionen sein kann. Tabelle 2 Spezifität für die reinen einzelnen humanen LD-Isoenzyme als Proben, unter Verwendung einer Mischung aus Guanidin-HCl und NaSCN
* Diese Probe enthält die Isoenzyme LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5, mit 43% LD-4.

Vergleichsbeispiel 3

A. Materialien:

1. Reagens I, enthält Lithium-L-lactat (90 mM), Guanidin-HCl, Na&sub2;CO&sub3; (12,5 InM), Tris-Puffer (119 mM) bei pH 9,6.
2. Reagens II, enthält Na&sub2;SO&sub4; (40 mM) und NAD (53,76 mM).
Die Reaktionsmischung ist eine Kombination aus 2,0 ml R-1, 0,5 ml R-2 und hat einen End-pH von 8,9 bei der Reaktion.
3. LD-Isoenzyme: Die einzelnen reinen Isoenzyme LD-1, LD-2, LD-3 und LD-5 wurden von Aalto of Escondido, CA, bezogen. Serumproben von Patienten wurden von einem örtlichen Krankenhaus bezogen.

B. Verfahren unter Verwendung eines automatischen Analysegeräts

Das gleiche wie in Beispiel 1 beschrieben.

C. Manuelles Verfahren

Das gleiche wie in Beispiel 1 beschrieben.

D. Funktionseigenschaften

Dieses Vergleichsbeispiel zeigt, daß ein proteindenaturierendes Mittel allein nicht als Reagens der vorliegenden Erfindung funktionieren wird. Tabelle Spezifität für die reinen einzelnen humanen LD-Isoenzyme als Proben, unter Verwendung von Guanidin-HCl
* Diese Probe enthält die Isoenzyme LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5, mit 43% LD-4.

Vergleichsbeispiel 4

A. Materialien:

1. Reagens I, enthält Lithium-L-lactat (90 mM), NaSCN (240 mM), Na&sub2;CO&sub3; (12,5 mM), Tris-Puffer (119 mM) bei pH 9,6.
2. Reagens II, enthält Na&sub2;SO&sub4; (40 mM) und NAD (53,76 mM).
Die Reaktionsmischung ist eine Kombination aus 2,0 ml R-1, 0,5 ml R-2 und hat einen End-pH von 8,9 bei der Reaktion.
3. LD-Isoenzyme: Die einzelnen reinen Isoenzyme LD-1, LD-2, LD-3 und LD-5 wurden von Aalto of Escondido, CA, bezogen. Serumproben von Patienten wurden von einem örtlichen Krankenhaus bezogen.

B. Verfahren unter Verwendung eines automatischen Analysegeräts

Die gleichen wie in Beispiel 1 beschriebenen.

C. Manuelles Verfahren

Das gleiche wie in Beispiel 1 beschriebene.

D. Funktionseigenschaften

Dieses Vergleichsbeispiel zeigt, daß ein proteindenaturierendes Mittel allein nicht als Reagens der vorliegenden Erfindung arbeiten wird. Tabelle Spezifität für die reinen einzelnen humanen LD-Isoenzyme als Proben, unter Verwendung von NaSCN
* Diese Probe enthält die Isoenzyme LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5, mit 43% LD-4.

Claims

1. Reagens zur Inaktivierung von LD-2, LD-3, LD-4 und LDS in neutraler bis alkalischer Umgebung, umfassend

(1) das Reaktionsprodukt von

(a) Guanidin, und

(b) einem Thiocyanat-Anion,

wobei das Reaktionsprodukt in einer Konzentration von etwa 240 mM vorhanden ist,

(2) Lactat, und

(3) einen Puffer zur Stabilisierung des pH auf 9,5 bis 9,6.

2. Reagens nach Anspruch 1, worin das Lactat in Konzentrationen von etwa 30 mM bis etwa 120 mM vorhanden ist.

3. Kit zur Bestimmung der LD-1-Aktivität in einer Probe, die LD-1, LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 enthält, wobei der Kit das Reagens nach Anspruch 1 zur Inaktivierung von LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 sowie ein zweites Reagens umfaßt, das mit dem LD-1, das in der Probe aktiv bleibt, in meßbarer Weise reagieren kann.

4. Kit nach Anspruch 3, wobei das zweite Reagens Lactat und NAD umfaßt.

5. Verfahren zur Bestimmung der LD-1-Aktivität in einer LD-1, LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 enthaltenden Probe, umfassend:

Anwenden des Reagens nach Anspruch 1 auf die Probe, um die Aktivität von LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 zu hemmen;

Anwenden eines zweiten Reagens auf die Probe, um in meßbarer Weise mit der verbleibenden LD-Aktivität zu reagieren;

Bestimmen der LD-1-Aktivität in der Probe als Funktion der meßbaren Reaktion des zweiten Reagens.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das zweite Reagens Lactat und NAD umfaßt.

7. Verfahren zur Bestimmung der LD-1-Aktivität einer Probe als Verhältnis der Gesamt-LD-Aktivität in der Probe, umfassend:

Trennen der Probe in einen ersten und zweiten Teil;

Anwenden des Reagens nach Anspruch 1 auf den ersten Teil, um die Aktivität von LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 zu hemmen;

Anwenden eines zweiten Reagens auf den ersten und zweiten Teil, um in meßbarer Weise auf die LD-Aktivität sowohl im ersten als auch im zweiten Teil zu reagieren; und

Bestimmen der LD-1-Aktivität in der Probe als Verhältnis der Gesamt-LD-Aktivität in der Probe als Funktion der meßbaren Reaktion des zweiten Reagens mit dem ersten und zweiten Teil.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das zweite Reagens Lactat und NAD umfaßt.

9. Kit zur Bestimmung der LD-1-Aktivität als Verhältnis der Gesamt-LD-Aktivität in einer Probe, wobei der Kit das Reagens nach Anspruch 1 für die Inaktivierung von LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 in einem von zwei Teilen der Probe und ein zweites Reagens umfaßt, das in meßbarer Weise mit LD-1, LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 in beiden Teilen der Probe reagieren kann, wodurch die LD-1-Aktivität als Verhältnis der Gesamt-LD-Aktivität tn der Probe als Funktion der meßbaren Reakrion des zweiten Reagens mit beiden Teilen der Probe bestimmt werden kann.

10. Kit nach Anspruch 9, wobei das zweite Reagens Lactat und NAD umfaßt.