JPH06104074B2 - アイソザイムの分別定量法 - Google Patents
アイソザイムの分別定量法Info
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- JPH06104074B2 JPH06104074B2 JP7549287A JP7549287A JPH06104074B2 JP H06104074 B2 JPH06104074 B2 JP H06104074B2 JP 7549287 A JP7549287 A JP 7549287A JP 7549287 A JP7549287 A JP 7549287A JP H06104074 B2 JPH06104074 B2 JP H06104074B2
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- isozyme
- protease
- isozymes
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アイソザイムの分別定量法に関し、主として
臨床検査の分野での利用を目的としたアイソザイムの分
別定量法に関する。
臨床検査の分野での利用を目的としたアイソザイムの分
別定量法に関する。
（従来の技術） 今日、酵素の研究においてアイソザイムの存在が知られ
ているもののうちのいくつかは、日常の臨床検査にも用
いられるようになってきた。その代表的な例としては、
グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（以下、
GOTという。）アイソザイムと乳酸脱水素酵素（以下、L
DHという。）アイソザイムがある。
ているもののうちのいくつかは、日常の臨床検査にも用
いられるようになってきた。その代表的な例としては、
グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（以下、
GOTという。）アイソザイムと乳酸脱水素酵素（以下、L
DHという。）アイソザイムがある。
GOTアイソザイムとしては、細胞内局在を異にしている
２種類のアイソザイム、すなわち細胞上清分画に存在す
るアイソザイム（Ｓ−GOTという。）と、ミトコンドリ
ア分画に存在するアイソザイム（ｍ−GOTという。）の
存在が知られている。これらを分別定量することによっ
て、臨床的には細胞障害の質的な差異としての病態解析
に有用であるとされている。またLDHアイソザイムに
は、LDH1〜LDH5の５つの分画からなるアイソザイムがあ
り、臓器により構成パターンが異なることから、臨床的
には血清LDHアイソザイムの分別定量によって臓器診断
の手がかりになるとされている。例えば、正常血清での
活性はLDH1＜LDH2であるが、心筋梗塞症患者血清ではLD
H1及びLDH2が増加すると共に、それらの活性はLDH1＞LD
H2と逆転することが知られている。
２種類のアイソザイム、すなわち細胞上清分画に存在す
るアイソザイム（Ｓ−GOTという。）と、ミトコンドリ
ア分画に存在するアイソザイム（ｍ−GOTという。）の
存在が知られている。これらを分別定量することによっ
て、臨床的には細胞障害の質的な差異としての病態解析
に有用であるとされている。またLDHアイソザイムに
は、LDH1〜LDH5の５つの分画からなるアイソザイムがあ
り、臓器により構成パターンが異なることから、臨床的
には血清LDHアイソザイムの分別定量によって臓器診断
の手がかりになるとされている。例えば、正常血清での
活性はLDH1＜LDH2であるが、心筋梗塞症患者血清ではLD
H1及びLDH2が増加すると共に、それらの活性はLDH1＞LD
H2と逆転することが知られている。
このようなアイソザイムの測定法としてよく知られてい
るのは電気泳動法である。例えばLDHアイソザイムの場
合は電気泳動法により易動度が早い順にLDH1〜LDH5が分
別される。電気泳動法のほかには、イオン交換法や免疫
化学的方法なども知られている。
るのは電気泳動法である。例えばLDHアイソザイムの場
合は電気泳動法により易動度が早い順にLDH1〜LDH5が分
別される。電気泳動法のほかには、イオン交換法や免疫
化学的方法なども知られている。
（発明が解決しようとする問題） しかしながら、このような電気泳動法、イオン交換法、
免疫化学的方法等の従来の方法では、測定のための走査
が煩雑である上、その操作に要する時間も長いため、臨
床検査で日常用いる自動分析装置には適用できないとい
う問題がある。更に、電気泳動法などの方法は、アイソ
ザイムの分別精度が低いということも指摘されており、
アイソザイムを分別定量する上で問題となっている。
免疫化学的方法等の従来の方法では、測定のための走査
が煩雑である上、その操作に要する時間も長いため、臨
床検査で日常用いる自動分析装置には適用できないとい
う問題がある。更に、電気泳動法などの方法は、アイソ
ザイムの分別精度が低いということも指摘されており、
アイソザイムを分別定量する上で問題となっている。
本発明の目的は、このような問題を解決し、日常の臨床
検査で有用なものとして利用できるアイソザイムの分別
定量の方法として供することにある。
検査で有用なものとして利用できるアイソザイムの分別
定量の方法として供することにある。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような問題点を解決し、上述の目的
を達成するために鋭意研究をすすめた結果、蛋白質の存
在下でプロテアーゼの作用により特定分画のアイソザイ
ムを特異的に阻害する反応系を用いることにより、アイ
ソザイムが分別定量できることを見い出した。
を達成するために鋭意研究をすすめた結果、蛋白質の存
在下でプロテアーゼの作用により特定分画のアイソザイ
ムを特異的に阻害する反応系を用いることにより、アイ
ソザイムが分別定量できることを見い出した。
更に、プロテアーゼインヒビター作用により余剰のプロ
テアーゼを不活性化する反応系を用いることによって、
アイソザイムの分別定量が、より効果的に実施できるこ
とがわかり、本発明を完成するに至った。
テアーゼを不活性化する反応系を用いることによって、
アイソザイムの分別定量が、より効果的に実施できるこ
とがわかり、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は、試料、とりわけ臨床検査で
用いるような血清、血漿などの検体中に含まれているア
イソザイムを分別定量するにあたり、蛋白質の存在下で
プロテアーゼ作用によりそのアイソザイム群中の特定分
画のアイソザイムを特異的に阻害する反応系を用いるこ
とを特徴とするアイソザイムの分別定量法に存する。
用いるような血清、血漿などの検体中に含まれているア
イソザイムを分別定量するにあたり、蛋白質の存在下で
プロテアーゼ作用によりそのアイソザイム群中の特定分
画のアイソザイムを特異的に阻害する反応系を用いるこ
とを特徴とするアイソザイムの分別定量法に存する。
本発明におけるプロテアーゼ作用に係る反応系は、プロ
テアーゼ作用による特定分画のアイソザイムを特異的に
阻害する反応からなるが、このようなプロテアーゼとし
ては、本発明の作用を有するものならば公知のすべての
ものが使用できる。そのようなプロテアーゼの例とし
て、α−キモトリプシン（α−chymotrypsin）、トリプ
シン（try−psin）、トロンビン（thrombin）、エラス
ターゼ（elastase）、エンドプロテアーゼ（endoprotea
se）、ズブチリシン（subtilisin）、ブロメライン（br
omelain）、パパイン（papain）、カルボキシペプシタ
ーゼ（carboxy peptidase）などが挙げられる。
テアーゼ作用による特定分画のアイソザイムを特異的に
阻害する反応からなるが、このようなプロテアーゼとし
ては、本発明の作用を有するものならば公知のすべての
ものが使用できる。そのようなプロテアーゼの例とし
て、α−キモトリプシン（α−chymotrypsin）、トリプ
シン（try−psin）、トロンビン（thrombin）、エラス
ターゼ（elastase）、エンドプロテアーゼ（endoprotea
se）、ズブチリシン（subtilisin）、ブロメライン（br
omelain）、パパイン（papain）、カルボキシペプシタ
ーゼ（carboxy peptidase）などが挙げられる。
プロテアーゼ作用により特異的に阻害されるアイソザイ
ムの分画は、用いるブロテアーゼによって異なることが
あり、そのような場合はプロテアーゼの種類を適宜選択
することによって、本発明がより効果的に実施できる。
プロテアーゼ作用に係る反応系は、このようなプロテア
ーゼと蛋白質を含む反応液によって構成されている。こ
の反応液中のプロテアーゼの含量は、測定条件によって
変化させることができるが、例えばα−キモトリプシン
を用いる場合、Ｓ−GOT1単位を阻害させるには10〜1000
単位を含有させればよい。
ムの分画は、用いるブロテアーゼによって異なることが
あり、そのような場合はプロテアーゼの種類を適宜選択
することによって、本発明がより効果的に実施できる。
プロテアーゼ作用に係る反応系は、このようなプロテア
ーゼと蛋白質を含む反応液によって構成されている。こ
の反応液中のプロテアーゼの含量は、測定条件によって
変化させることができるが、例えばα−キモトリプシン
を用いる場合、Ｓ−GOT1単位を阻害させるには10〜1000
単位を含有させればよい。
本発明のプロテアーゼ作用に係る反応系では、蛋白質の
存在下で反応をすすめることによって阻害反応の特異性
を向上させることができ。ここで用いる蛋白質は、この
ような結果をもたらすことができるものならば公知のも
のすべてが使用できるが、とりわけアルブミン、グロブ
リン、ゼラチン等が好ましい。このような蛋白質の反応
液中の含量は測定条件によって変化させることができる
が、例えばアルブミンを用いる場合、0.1〜10.0％を含
有させればよい。
存在下で反応をすすめることによって阻害反応の特異性
を向上させることができ。ここで用いる蛋白質は、この
ような結果をもたらすことができるものならば公知のも
のすべてが使用できるが、とりわけアルブミン、グロブ
リン、ゼラチン等が好ましい。このような蛋白質の反応
液中の含量は測定条件によって変化させることができる
が、例えばアルブミンを用いる場合、0.1〜10.0％を含
有させればよい。
更に本発明は、前述のプロテアーゼ作用に係る反応系に
加えて、プロテアーゼインヒビター作用により余剰のプ
ロテアーゼを不活性化する反応系を加えるアイソザイム
の分別定量法を提供する。このように、プロテアーゼ作
用による反応系を作用させた後で余剰のプロテアーゼを
不活性化することにより、その後の反応でのプロテアー
ゼの影響を除去することができる。このプロテアーゼイ
ンヒビター作用に係る反応系はプロテアーゼインヒビタ
ーを含む反応液によって構成される。このようなプロテ
アーゼインヒビターとしては、本発明の作用を有するも
のならば公知のすべてのものが使用できるが、その例と
して、アプロチニン（aprotinin）、アンチトロンビンI
II（antithrombin III）、α1−アンチトリプシン（α1
−antitrypsin）、トリプシンインヒビター（trypsin i
nhibitor）、ロイペプチン（leupeptin）、α２−マク
ログロブリン（α２−macroglobulin）、ふっ化フェニ
ルメチルスルホニル（phenyl methyl sulfonyl fluorid
e）、（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフル
オライド塩酸塩［（ｐ−amidinophenyl）methane sulfo
nyl fluoride hydrochloride］及び一般名メシル酸ガベ
キサート｛［ethy1−４−（６−guanidino hexanoylox
y）benzoate］methane sulfonate｝などがあげられる。
加えて、プロテアーゼインヒビター作用により余剰のプ
ロテアーゼを不活性化する反応系を加えるアイソザイム
の分別定量法を提供する。このように、プロテアーゼ作
用による反応系を作用させた後で余剰のプロテアーゼを
不活性化することにより、その後の反応でのプロテアー
ゼの影響を除去することができる。このプロテアーゼイ
ンヒビター作用に係る反応系はプロテアーゼインヒビタ
ーを含む反応液によって構成される。このようなプロテ
アーゼインヒビターとしては、本発明の作用を有するも
のならば公知のすべてのものが使用できるが、その例と
して、アプロチニン（aprotinin）、アンチトロンビンI
II（antithrombin III）、α1−アンチトリプシン（α1
−antitrypsin）、トリプシンインヒビター（trypsin i
nhibitor）、ロイペプチン（leupeptin）、α２−マク
ログロブリン（α２−macroglobulin）、ふっ化フェニ
ルメチルスルホニル（phenyl methyl sulfonyl fluorid
e）、（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフル
オライド塩酸塩［（ｐ−amidinophenyl）methane sulfo
nyl fluoride hydrochloride］及び一般名メシル酸ガベ
キサート｛［ethy1−４−（６−guanidino hexanoylox
y）benzoate］methane sulfonate｝などがあげられる。
反応液中のプロテアーゼインヒビターの含量は、測定条
件によって変化させることができるが、例えばアプロチ
ニンを用いる場合、反応液中に100〜5000単位/mlを含有
させればよい。
件によって変化させることができるが、例えばアプロチ
ニンを用いる場合、反応液中に100〜5000単位/mlを含有
させればよい。
このように、本発明ではプロテアーゼ作用により特定分
画のアイソザイムが特異的に阻害され、更に余剰のプロ
テアーゼを不活性化することもできる。
画のアイソザイムが特異的に阻害され、更に余剰のプロ
テアーゼを不活性化することもできる。
本発明の方法によりアイソザイムを分別定量するにあた
り、阻害されずに残った他の分画のアイソザイムを定量
するには、公知の酵素活性の定量法が利用できる。それ
には発色性の色原体を用いたり、又は縮合反応による色
素の生成を用いたりすることによる可視部域での吸光度
を測定する方法と、補酵素NADHなどを用いて紫外部域で
の吸光度を測定する方法等に種別できる。これらの方法
は、臨床検査の分野でも現在広く使われており、それら
は操作上簡易でかつその反応時間も短く、また測定精
度、感度、正確度等、性能上でも優れてするものが多く
知られており、これらのうちから適切なものを選択して
本発明に適応することができる。
り、阻害されずに残った他の分画のアイソザイムを定量
するには、公知の酵素活性の定量法が利用できる。それ
には発色性の色原体を用いたり、又は縮合反応による色
素の生成を用いたりすることによる可視部域での吸光度
を測定する方法と、補酵素NADHなどを用いて紫外部域で
の吸光度を測定する方法等に種別できる。これらの方法
は、臨床検査の分野でも現在広く使われており、それら
は操作上簡易でかつその反応時間も短く、また測定精
度、感度、正確度等、性能上でも優れてするものが多く
知られており、これらのうちから適切なものを選択して
本発明に適応することができる。
（実施例） 以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。
はこれらに限定されるものではない。
実施例１ α−キモトリプシン（200単位/ml）を含む0.1Mリン酸緩
衝液（pH8.0）に牛血清アルブミン（1.0％）を添加した
反応液0.1mlに、精製した人由来のｍ−GOT（1000単位/
L）を0.02ml加え、37℃で５分間反応させた。反応後、
これに20mMアスパラギン酸、10mM2−オキソグルタル
酸、0.2mMNADH、リンゴ酸脱水素酵素（1000単位/l）を
含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）からなる酵素定量
用試薬を3.0ml加えて37℃に加温し、波長340nmにおける
１分間あたりの吸光度変化量を求めた。
衝液（pH8.0）に牛血清アルブミン（1.0％）を添加した
反応液0.1mlに、精製した人由来のｍ−GOT（1000単位/
L）を0.02ml加え、37℃で５分間反応させた。反応後、
これに20mMアスパラギン酸、10mM2−オキソグルタル
酸、0.2mMNADH、リンゴ酸脱水素酵素（1000単位/l）を
含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）からなる酵素定量
用試薬を3.0ml加えて37℃に加温し、波長340nmにおける
１分間あたりの吸光度変化量を求めた。
Ｓ−GOTについても同様に操作した。
対照として、プロテアーゼを反応液から除いた場合を同
様に操作し、これと比較してそれぞれの残存活性率を計
算した。また、反応液から牛血清アルブミンを除いた場
合についても同様に行った。
様に操作し、これと比較してそれぞれの残存活性率を計
算した。また、反応液から牛血清アルブミンを除いた場
合についても同様に行った。
この結果は第１表のようになり、本発明の方法に従って
蛋白質としてアルブミンの存在下でプロテアーゼとして
α−キモプシンの作用による反応系を用いることによっ
てＳ−GOTは阻害されるが、ｍ−GOTは阻害されず、分別
定量されることが示された。
蛋白質としてアルブミンの存在下でプロテアーゼとして
α−キモプシンの作用による反応系を用いることによっ
てＳ−GOTは阻害されるが、ｍ−GOTは阻害されず、分別
定量されることが示された。
実施例２ ズブチリシン（100単位/ml）を用いて実施例１と同様に
行ったところ、結果は第２表のようになった。本発明に
従って用いるプロテアーゼとしてズブチリシンを用いて
も同等の結果が得られることが示された。
行ったところ、結果は第２表のようになった。本発明に
従って用いるプロテアーゼとしてズブチリシンを用いて
も同等の結果が得られることが示された。
実施例３ 臨床検査で用いられる自動分析装置を使用して本発明の
方法に従ってプロテアーゼ作用による反応系を用いてGO
Tアイソザイムであるｍ−GOTを定量し、これと従来の方
法である免疫化学的方法と比較した。
方法に従ってプロテアーゼ作用による反応系を用いてGO
Tアイソザイムであるｍ−GOTを定量し、これと従来の方
法である免疫化学的方法と比較した。
検体として血清試料10例について各0.02mlとり、それぞ
れにα−キモトリプシン（200単位/ml）と牛血清アルブ
ミン（1.0％）を含む0.1Mりん酸緩衝液（pH8.0）の反応
液0.1mlを加え、37℃で５分間反応させた。反応後、実
施例１で用いた酵素定量試薬を0.35ml加えて１分間あた
りの吸光度変化量を求めた。これをあらかじめ活性既知
のｍ−GOTの検量線から活性に換算した。
れにα−キモトリプシン（200単位/ml）と牛血清アルブ
ミン（1.0％）を含む0.1Mりん酸緩衝液（pH8.0）の反応
液0.1mlを加え、37℃で５分間反応させた。反応後、実
施例１で用いた酵素定量試薬を0.35ml加えて１分間あた
りの吸光度変化量を求めた。これをあらかじめ活性既知
のｍ−GOTの検量線から活性に換算した。
一方、市販の免疫化学的方法によるｍ−GOT活性測定キ
ット（会社名：栄研株式会社）を用いてこの血清試料10
例についてｍ−GOT活性を求めた。結果を第３表に示
す。
ット（会社名：栄研株式会社）を用いてこの血清試料10
例についてｍ−GOT活性を求めた。結果を第３表に示
す。
自動分析装置を使用した本発明の方法と従来の方法であ
る免疫化学的方法とは良好な相関関係にあることがわか
った。
る免疫化学的方法とは良好な相関関係にあることがわか
った。
実施例４ 本発明に用いるプロテアーゼの公知の酵素定量用試薬に
対する影響を調べるために、リンゴ酸脱水素酵素（MDH,
EC1.1.1.37）、乳酸脱水素酵素（LDH,EC1.1.1.28）、オ
キザロ酢酸脱炭素酵素（OAC,EC 4.1.1.3）、ピルビン酸
オキシダーゼ（POP,EC1.2.3.3）、ペルオキシターゼ（P
OD,EC1.11.1.7）の各酵素に対するプロテアーゼによる
活性阻害をみた。
対する影響を調べるために、リンゴ酸脱水素酵素（MDH,
EC1.1.1.37）、乳酸脱水素酵素（LDH,EC1.1.1.28）、オ
キザロ酢酸脱炭素酵素（OAC,EC 4.1.1.3）、ピルビン酸
オキシダーゼ（POP,EC1.2.3.3）、ペルオキシターゼ（P
OD,EC1.11.1.7）の各酵素に対するプロテアーゼによる
活性阻害をみた。
各酵素一定量を含む0.1Mリン酸緩衝液にα−キモトリプ
シン（200単位/ml）を加え、37℃で30分間加温後、各酵
素の残存活性を測定した。その結果は第４表に示すよう
になり、ここではOAC及びPOPが著しく阻害されることが
わかった。
シン（200単位/ml）を加え、37℃で30分間加温後、各酵
素の残存活性を測定した。その結果は第４表に示すよう
になり、ここではOAC及びPOPが著しく阻害されることが
わかった。
実施例５ 実施例４においてあらかじめアプロチニン（1000単位/m
l）を添加しておいたところ、同様に操作して求めた各
酵素の残存活性はいずれも100％を示した。従って本発
明に用いるプロテアーゼインヒビターとしてのアプロチ
ニンにより、α−キモトリプシンの影響が除かれること
がわかった。
l）を添加しておいたところ、同様に操作して求めた各
酵素の残存活性はいずれも100％を示した。従って本発
明に用いるプロテアーゼインヒビターとしてのアプロチ
ニンにより、α−キモトリプシンの影響が除かれること
がわかった。
実施例６ 本発明の方法に従ってプロテアーゼ作用による反応系と
プロテアーゼインヒビター作用による反応系を用いてGO
Tアイソザイムであるｍ−GOTを定量し、これと従来の方
法である免疫化学的方法と比較した。
プロテアーゼインヒビター作用による反応系を用いてGO
Tアイソザイムであるｍ−GOTを定量し、これと従来の方
法である免疫化学的方法と比較した。
検体として血清試料10例について各0.02mlとり、それぞ
れにα−キモトリプシン（200単位/ml）と牛血清アルブ
ミン（1.0％）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）の反応
液0.1mlを加え、37℃で５分間反応させ、更にアプロチ
ニン（2000単位/ml）の反応液を0.1ml加え、37℃で５分
間反応させた。反応後、300mMアスパラギン酸、10mM 2
−オキソグルタル酸、5mM FAD、1mM N−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン、1mM 4−アミノアンチピリン、1mMチアミンピロホ
スフェート、0.5mM MnCl2、POP（500単位/L）、OAC（30
0単位/L）、POD（500単位/L）を含む200mMリン酸緩衝液
（pH7.5）からなる酵素定量用試薬を1.0ml加えて37℃で
20分間加温後、0.1M EDTAを含む0.2Mクエン酸緩衝液（p
H5.0）2.0mlを加えて反応を停止させ、波長550nmにおけ
る吸光度を測定した。これをあらかじめ活性既知のｍ−
GOTを用いて同様に操作したものと対比してｍ−GOTの活
性値に換算した。
れにα−キモトリプシン（200単位/ml）と牛血清アルブ
ミン（1.0％）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）の反応
液0.1mlを加え、37℃で５分間反応させ、更にアプロチ
ニン（2000単位/ml）の反応液を0.1ml加え、37℃で５分
間反応させた。反応後、300mMアスパラギン酸、10mM 2
−オキソグルタル酸、5mM FAD、1mM N−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン、1mM 4−アミノアンチピリン、1mMチアミンピロホ
スフェート、0.5mM MnCl2、POP（500単位/L）、OAC（30
0単位/L）、POD（500単位/L）を含む200mMリン酸緩衝液
（pH7.5）からなる酵素定量用試薬を1.0ml加えて37℃で
20分間加温後、0.1M EDTAを含む0.2Mクエン酸緩衝液（p
H5.0）2.0mlを加えて反応を停止させ、波長550nmにおけ
る吸光度を測定した。これをあらかじめ活性既知のｍ−
GOTを用いて同様に操作したものと対比してｍ−GOTの活
性値に換算した。
一方、市販の免疫化学的方法によるｍ−GOT活性測定キ
ットを用いてこの血清試料10例についてｍ−GOT活性を
求めた。結果を第５表に示す。本発明の方法と従来の方
法である免疫化学的方法とは良好な相関関係を示し、本
発明の方法によってプロテアーゼの影響を受けることな
くｍ−GOTが定量できることが確認できた。
ットを用いてこの血清試料10例についてｍ−GOT活性を
求めた。結果を第５表に示す。本発明の方法と従来の方
法である免疫化学的方法とは良好な相関関係を示し、本
発明の方法によってプロテアーゼの影響を受けることな
くｍ−GOTが定量できることが確認できた。
実施例７ LDHアイソザイムについて、前述のように心筋梗塞症患
者血清で意義のあるLDH1及びLDH2の分別定量を行った。
者血清で意義のあるLDH1及びLDH2の分別定量を行った。
検体として血清試料８例について各0.05mlとり、それぞ
れにα−キモトリプシン（200単位/ml）と牛血清アルブ
ミン（１％）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）の反応
液0.05mlを加え、37℃で５分間反応させた。反応後、16
mMピルビン酸ナトリウム及び0.18mM NADHを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（pH7.8）からなる酵素定量用試薬を3.0ml加
えて波長340nmにおける１分間あたりの吸光度変化量を
求めた。これをあらかじめ活性既知のLDHの検量線から
活性に換算した。
れにα−キモトリプシン（200単位/ml）と牛血清アルブ
ミン（１％）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）の反応
液0.05mlを加え、37℃で５分間反応させた。反応後、16
mMピルビン酸ナトリウム及び0.18mM NADHを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（pH7.8）からなる酵素定量用試薬を3.0ml加
えて波長340nmにおける１分間あたりの吸光度変化量を
求めた。これをあらかじめ活性既知のLDHの検量線から
活性に換算した。
一方、公知の方法である電気泳動法てこの血清試料につ
いて分析し、LDH1及びLDH2の総和の活性を求めた。この
両者を比較したところ、相関関数0.995となり良好な相
関関数にあることがわかった。この結果、本発明の方法
としてプロテアーゼにα−キモトリプシンを用いた場
合、LDH1及びLDH2の総和が分別定量できることがわかっ
た。
いて分析し、LDH1及びLDH2の総和の活性を求めた。この
両者を比較したところ、相関関数0.995となり良好な相
関関数にあることがわかった。この結果、本発明の方法
としてプロテアーゼにα−キモトリプシンを用いた場
合、LDH1及びLDH2の総和が分別定量できることがわかっ
た。
実施例８ α−キモトリプシンの代わりにズブチリシン（100単位/
ml）を用いて実施例７と同様に操作して求めた活性と、
電気泳動法で分析したLDH1の活性について両者を比較し
たところ、相関関数0.991となり良好な相関関数にある
ことが分かった。この結果、本発明の方法としてプロテ
アーゼにズブチリシンを用いた場合、LDH1が分別定量で
きることがわかった。
ml）を用いて実施例７と同様に操作して求めた活性と、
電気泳動法で分析したLDH1の活性について両者を比較し
たところ、相関関数0.991となり良好な相関関数にある
ことが分かった。この結果、本発明の方法としてプロテ
アーゼにズブチリシンを用いた場合、LDH1が分別定量で
きることがわかった。
（発明の効果） 本発明の方法であるプロテアーゼ作用に係る反応系とプ
ロテアーゼインヒビター作用に係る反応系はそれ自体操
作が簡易でかつ短時間で行うことができる。また阻害反
応における特異性が極めて高いため、アイソザイムの分
別精度などの性能においても優れている。そして前述の
ように阻害されずに残った他の分画のアイソザイムを定
量する方法として公知の方法から適切に選択して本発明
に適応させることにより、本発明はアイソザイムの分別
定量としての一連の操作が簡易で短時間に行うことがで
き、かつ優れた性能を有する方法として供することがで
きる。従って本発明によりアイソザイムを分別定量する
方法は臨床検査の分野で利用するとき自動分析装置へも
応用できる。特に近年は臨床検査は自動化がすすみ自動
分析装置の使用頻度が高まっているため、本発明の日常
の臨床検査で有用なものとしての効果が大きい。
ロテアーゼインヒビター作用に係る反応系はそれ自体操
作が簡易でかつ短時間で行うことができる。また阻害反
応における特異性が極めて高いため、アイソザイムの分
別精度などの性能においても優れている。そして前述の
ように阻害されずに残った他の分画のアイソザイムを定
量する方法として公知の方法から適切に選択して本発明
に適応させることにより、本発明はアイソザイムの分別
定量としての一連の操作が簡易で短時間に行うことがで
き、かつ優れた性能を有する方法として供することがで
きる。従って本発明によりアイソザイムを分別定量する
方法は臨床検査の分野で利用するとき自動分析装置へも
応用できる。特に近年は臨床検査は自動化がすすみ自動
分析装置の使用頻度が高まっているため、本発明の日常
の臨床検査で有用なものとしての効果が大きい。
Claims (6)
- 【請求項１】蛋白質の存在下でプロテアーゼ作用により
特定分画のアイソザイムを特異的に阻害する反応系を用
いて該アイソザイムを阻害し、阻害されずに残った他の
アイソザイムを定量することを特徴とするアイソザイム
の分別定量法。 - 【請求項２】蛋白質が、アルブミン、グロブリン又はゼ
ラチンである特許請求の範囲第１項記載のアイソザイム
の分別定量法。 - 【請求項３】特定分画のアイソザイム阻害に際し、プロ
テアーゼインヒビター作用によりプロテアーゼを不活性
化する反応系を系に加える特許請求の範囲第１項又は第
２項記載のアイソザイムの分別定量法。 - 【請求項４】プロテアーゼインヒビターが、アプロチニ
ンである特許請求の範囲第３項記載のアイソザイムの分
別定量法。 - 【請求項５】アイソザイムが、グルタミン酸オキザロ酢
酸トランスアミナーゼアイソザイムである特許請求の範
囲第１〜４項のいずれかに記載のアイソザイムの分別定
量法。 - 【請求項６】アイソザイムが、乳酸脱水素酵素アイソザ
イムである特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載
のアイソザイムの分別定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7549287A JPH06104074B2 (ja) | 1987-03-25 | 1987-03-25 | アイソザイムの分別定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7549287A JPH06104074B2 (ja) | 1987-03-25 | 1987-03-25 | アイソザイムの分別定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63237797A JPS63237797A (ja) | 1988-10-04 |
| JPH06104074B2 true JPH06104074B2 (ja) | 1994-12-21 |
Family
ID=13577831
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7549287A Expired - Lifetime JPH06104074B2 (ja) | 1987-03-25 | 1987-03-25 | アイソザイムの分別定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06104074B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0775556B2 (ja) * | 1988-07-15 | 1995-08-16 | 国際試薬株式会社 | Ｌｄｈアイソザイムのｌｄｈ▲下１▼の分別定量法 |
-
1987
- 1987-03-25 JP JP7549287A patent/JPH06104074B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63237797A (ja) | 1988-10-04 |
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