DE2504994A1

DE2504994A1 - Verfahren zur kreatininbestimmung

Info

Publication number: DE2504994A1
Application number: DE19752504994
Authority: DE
Inventors: Alvar Edwin Jarvis
Original assignee: Coulter Diagnostics Inc
Current assignee: Beckman Coulter Diagnostics Inc
Priority date: 1974-03-04
Filing date: 1975-02-06
Publication date: 1975-09-11
Also published as: ES434127A1; AU7596374A; JPS50120897A; CH594245A5; BE824205A; NL7416476A; FR2263515A1; IL46338A0; GB1445954A; IL46338A; SE7501016L; US3894843A; ZA75224B

Description

Patentanwälte

Dip!.-Ing. E. Eder

Dlpl.-lng. K. Schieschke

8 München 40, ElisabelhstraBe34

COULTER DIAGNOSTICS, INCORPORATED Hialeah / Florida, U.S.A.

Verfahren zur Kreatininbestimmung

Die Erfindung bezieht sich auf die Analyse von Körperflüssigkeiten zum Zwecke der quantitativen Bestimmung des Kreatiningehaltes der untersuchten Flüssigkeit, z.B. Blutserum oder Urin.

Die quantitative Kreatininbestimmung biologischer Flüssigkeiten wie z.B. Blutserum und Urin, stellt eine wertvolle Hilfe für die Diagnose bestimmter Krankheiten dar. Kreatinin ist ein Stoff Wechselprodukt, das über die Nieren aus dem Blutkreislauf ausgeschieden wird. Da Kreatinin ausschließlich durch die Nieren ausgeschieden wird, läßt sich z.B. eine Nierenerkrankung anhand eines im Serum festgestellten erhöhten Kreatiningehaltes diagnostizieren. Die quantitative Kreatininbestimmung dient auch der Erkennung von Harnleiterverengung, Darmverengung und Nephritis, einer durch Infektion verursachten Nierenentzündung, sowie von Verfallserscheinungen bzw. Gefäßerkrankungen. Die Kriterien einer für eine exakte und wirksame Diagnostik erforderlichen, kritischen

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KreatininbeStimmung sowie viele Verfahren zur Kreatininbestimmung in biologischen Flüssigkeiten sind bekannt (US-PS 3,557,018, US-PS 3,705,013).

Die jüngsten Verfahren zur Bestimmung von Kreatinin im Serum oder Urin beruhen alle auf der Entwicklung einer orange-roten Färbung bei Reaktion von Alkalipikrat mit Kreatinin, die zuerst von M.Jaffe 1886 beschrieben und dann später 1904 von Otto Folin zur Bestimmung von Kreatinin im Urin angewandt wurde. Seit damals stellt diese sogenannte "Jaffe -Probe" das meist angewandte Verfahren zur Kreatininuntersuchung dar.

Allerdings gilt die Jaffe-Probe nicht als spezifisch in der Gegenwart von Protein, Glukose und einer Anzahl unbekannter Substanzen, wie sie normalerweise im menschlichen Blutserum enthalten sind. Verfahren, die zur Verbesserung der Spezifität entwickelt wurden, beruhen zum größten Teil auf der Verwendung protein-freier Filtrate. Abgesehen von der Verwendung protein-freier Filtrate hat man sogenannte "spezifische Verfahren" für Kreatinin eingeführt, wobei das Filtrat in Adsorption-Elution-Verfahren verwendet wird (Brod, J. und Kotatko, J., J.Cas.Lek.Ces.88,665 - Excerpta Medica, Amst.3,477 (195o); Hare, R.S., Proc.Soc.Exp.Biol. N.Y., 74,148 (1950); Haugen, H.N. und Biegen, E.M., Scand_o J.Clin.Invest.5,58 (1953); und Polar, E. und Metkoff, J., Clin.Chem.11,763 (1965)i. Die bisher meist angewandten Absorptionsmittel waren hierbei hydriertes Aluminiumsilikat und Ionenaustauschharz.

Die Adsorption-Elution-Verfahren waren aber insofern schwierig, als komplizierte Verfahren zur Bewirkung.der Adsorption und Elution erforderlich sind und zudem auch die Nicht-Spezifität immer noch nicht restlos ausgeschlossen ist.

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Nach anderen "spezifischen" Verfahren hat man Reagenzien wie z.B. Cersulfat mit protein-freien Filtraten verwendet, um die "Zerstörung von Interferenz-Substanzen" zu erreichen (Kostir, J.V. und Rabek, V., Biochim.Biophys.Acta 5,210 (1950); Kostir, J.V. und Sonka, J., Biochim.Biophys.Acta 8,86 (1952) -Verwendung von "Kreatinin zerstörenden Bakterien" - Dubos,R. und Miller, V.F., J.Biol.Chem. 121,427 (1937) ). Bei letzterem Verfahren werden protein-freie Serumfiltrate in zwei gleiche Teile getrennt; ein Teil wird mit "Kreatinin zerstörenden Bakterien" behandelt, der andere Teil wird unbehandelt belassen. Anschließend, mit beiden Teilen durchgeführte Jaffe-Proben ergeben unterschiedliche Absorptionswerte. Bringt man den Wert des "bakterienbehandelten" Teils von dem Wert des "unbehandelten" Teils in Abzug, so soll sich der "tatsächliche Kreatininwert" ergeben. Spezifität wird allerdings auch bei diesem Verfahren nicht ausreichend nachgewiesen. '

In jüngerer Zeit hat man Versuche unternommen, auf der Grundlage der Jaffe-Probe Verfahren, unter Vermeidung einer Ent— eiweißung des Blutserums, zu entwickeln, wobei diese Verfahren in zwei Hauptkategorien fallens Nach der ersten verwendet man ein sog. "kinetisches Verfahren", wobei eine zeitlich exakt festgelegte Messung der Entwicklungsgeschwindigkeit der orange-roten JaffeFärbung erforderlich ist (Larsen, K., Clin.Chim.Acta 41,209 (1972) ). Hierzu sind verhältnismäßig komplizierte Spektrofotometer zur kinetischen Messung bei Anwendung extrem kurzer Farbent— Wicklungszeiten (30-120 see.) erforderlich; Intereferenzeffekte durch kreatinin-fremde, auf die Jaffe-Probe reagierende Chromogene können auch hierbei nicht völlig ausgeschlossen werden (Raabo, E. und Walloe-Hansen, P., Scan.J. Clin.Lab.Invest. 29,297 (1972) und Heinegard, D. und Tiderstrom, G., Clin.Chim.Acta 43,305 (1973) ). .

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Bei der zweiten Kategorie derartiger Verfahren werden kreatininfremde, Jaffe-positive Chromogene durch Veränderung des Reaktions-p„ oder durch die Beimengung von Reagenzien, die nachweislich eine Farbinterferenz durch kreatinin-fremde Substanzen unterdrücken, ausgeschaltet. All diesen Verfahrensmöglichkeiten sind Reagensblindproben oder Durchlauf der Seren bei zwei verschiedenen p„-Weften als wesentlicher Bestandteil gemeinsam, wie aus den beiden zuletzt zitierten Literaturstellen hervorgeht.

All diese Verfahren beruhen allein auf der Annahme, daß sich bei parallelen Durchlaufreaktionen mit ein und demselben Serum, wobei die eine bei einem höheren ρ als die andere erfolgt, nach Abzug des bei niedrigerem ρ erhaltenen Wertes von dem mit höherem.p„ erhaltenen Wert und nach anschließender Korrektur mit "Faktor 2„3" zur Berücksichtigung der Interferenz durch Proteine, der "wahre Kreatininwert" ergibt. Der Korrekturfaktor basiert auf einer großen Anzahl von Vergleichen mit einem früheren spezifischen Verfahren (Brod.J. und Sirota, J.H., J.Clin.Invest.27,645, (1948) ). Dieser statistisch ermittelte "Korrekturfaktor 2.3" sowie das restlose Vertrauen auf eine Spezifität, die sich auf die zwei bei unterschiedlichem p„ durchgeführten Reaktionen begründet, lassen Zweifel an der Genauigkeit offen.

Aufgabe der Erfindung ist die Beseitigung der mit bisher bekannten Verfahren verbundenen Schwierigkeiten.

Zur Lösung dieser Aufgabe sieht die Erfindung ein kolorimetrisches Verfahren zur KreatininbeStimmung in einer biologischen, proteinhaltigen Flüssigkeitsprobe vor. Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch Zusatz eines Reagens zur biologischen Flüssigkeit, welches eine farbige Verbindung ein-

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geht, die bei einer charakteristischen Wellenlänge maximale Lichtabsorption des in der zu untersuchenden Flüssigkeit enthaltenen Kreatinins bewirkt, wobei die Interferenz von Protein mit dem gewünschten Nachweis durch Bildung von Proteinkomplexen ausgeschaltet wird, welche die Entstehung von kreatinin-fremden Chromogenen verhindern; durch Messung des Absorptionsgrades im charakteristischen Wellenlängenbereich und durch Ermittlung der Kreatxninkonzentration in der Flüssigkeit durch Vergleich des gemessenen Absorptionsgrades mit Absorptionswerten wäßriger, das Reagens enthaltender Standardlösungen bekannter Kreatininkonzentrationen.

Bei diesem Verfahren wird ein Alkalipikrat-Reagens verwendet, welches das geläufigere Natriumhydroxyd oder Lithiumhydroxyd durch Natriumsulfat ersetzt. Gemäß einem weiteren Merkmal wird das Alkalipikrat-Reagens mit Harnstoff vermischt, und ein Aralkansulfat-Detergens auf Natrium-, Kalium- oder Lithium-Basis wie z.B. Natriumdodecylsulfat (Natriumlaurylsulfat) oder Natriumborat wird zugesetzt. Der Harnstoff und das Detergens reagieren gleichzeitig und sYiergetisch mit dem Serum oder Urin, und dabei wird Interferenz durch fremde Chromogene"im Höchstmaß verhindert, und die Serumblindprobe ( = serum blank) entfällt.

Man nimmt an, daß die Proteinmoleküle in der Gegenwart von Harnstoff eine Strukturveränderung und damit verbunden eine leichte Denaturierung erfahren. Durch diese Strukturveränderung erhöht sich die Bereitschaft des Proteinmoleküls, sich mit dem Natriumdodecylsulfat zu verbinden, wodurch sich eine Abnahme der Störwirkung (= blank activity) ergibt. Mit dem Verfahren nach der Erfindung durchgeführte Versuche haben Resultate ergeben, die sich durchaus mit Filtrate verwendenden Vergleichsverfahren und mit Adsorptionsmethoden messen können.

Nachfolgend wird das Verfahren nach der Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert.

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Abstimmungen des Reagens:

A: gesättigte Pikrinsäure-Lösung - ca. 15g werden mit warmen, destilliertem Wasser versetzt, bis keine Auflösung mehr stattfindet;

B: i) Natriumdodecylsulfatliösung - 4g/100ml;

ii) Natriumborat in sekundärer Natrium-oder Kaliumphosphat-Lösung - 0.05 M Borat zu 0.05 M Phosphat;

iii) Harnstofflösung - 40 g/100 ml.

Unter Verwendung dieser vorbereiteten Stammlösungen wird eine erste Arbeitslösung hergestellt, welche aus zwei Teilen der 40 %igen Harnstofflösung und zwei Teilen der 4 %igen Natriumdodecylsulfat-Lösung besteht„ Eine bevorzugte andere Arbeitslösung setzt sich zu einem Teil aus Harnstoff-Lösung und drei Teilen Natriumdodecylsulfat-Lösung zusammen.

Ein Teil der Natriumdodecylsulfat-Harnstoff-Lösung wird mit einem Teil Boratphosphat-Pufferlösung vermischt und bis auf einen ρ -Wert von ca. 12.4 unter Verwendung von Natriumhydroxyd gepuffert. Die zweite Arbeitslösung enthält die gesättigte Pikrinsäure-Lösung. Zur praktischen Verwendung werden vier Teile der ersten Arbeitslösung mit einem Teil der gesättigten Pikrinsäure-Lösung zu einem Alkalipikrat-Reagens.vermischt.

Bei dem Kreatininbestimmungsverfahren nach der Erfindung wurden 0.01 bis 2.0 ml der zu untersuchenden Probe mit 0.2 bis 25.0 ml des endgültigen Reagens verwendet; vorzugsweise verwendet man jedoch eine Menge von 0.1 bis 0.2 ml der Probe mit 4.0 ml des Endreagens. Bei diesem bevorzugten Verfahren werden 4.0 ml Alkalipikrat-Reagens in ein Reagensröhrchen eingebracht und bei 37°C für 3 bis 5 Minuten vor-inkubiert. Anschließend werden 0.1 oder 0.2 ml der Probe dem Reagens zugegeben, und für die Dauer von 10 bis 30 Minuten läßt

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man bei 37°C Inkubation erfolgen; vorzugsweise läßt man die Inkubation 15 Minuten dauern.

Die inkubierte Lösung wird dann in ein Kolorimeter oder ein Spektrofotometer gegen eine Blindprobe (blank) eingeführt, und die Lichtabsorption des entstandenen Kreatininpikrats wird bei 490 bis 535 nm abgelesen; vorzugsweise erfolgt die Ablesung bei 500 nm. Der Wert der Unbekannten zu einem primären wäßrigen oder sekundären Standarddurchlauf auf Proteinbasis läßt sich unter Verwendung folgender Formel errechnen:

Schicht der Prüf--

(1) Wert der Prüf lösung = Ü^2 * Wert der VerSchicht der Ver- glexchslosung gleichslösung

O.D. Unknown

(Value of Unknown = x value of standard)

O.D. Standard

Das vorstehende besondere Beispiel läßt sich innerhalb der Parameter nach der Erfindung in mancher Hinsicht abwandeln. Das Alkalipikrat-Reagens kann bis auf einen ρ -Bereich von 11.0 bis 13.5 gepuffert werden durch entsprechend gewählte Mischung der Pufferlösung, d.h. des Natriumborats in der Sulfatlösung, wie beschrieben. Die Messung der Lichtdurchlässigkeit kann innerhalb des angegebenen Wellenlängenbereiches erfolgen. Abgesehen davon kann der Fachmann hinsichtlich der besonderen Abstimmung Abwandlungen unter Verwendung der wesentlichen Lehren der Erfindung vornehmen; z.B. lassen sich auch andere Detergenzien verwenden wie z.B.: Natriumoctylsulfat, Natriumtetradecylsulfat, Natriumheptadecylsulfat, Natriumcetylsulfat, Natriummyristylsulfat, Natriumoctadecylsulfat, Natriumoleylsulfat, Natriumtridecylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, und Dodecylbenzolsulfat.

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Ebenso lassen sich auch die analogen Kalium- oder Lithiumsalze verwenden. Allgemein ausgedrückt ist das Detergens ein Aralkansulfat auf Natrium-, Kalium- oder Lithiumbasis.

Patentanwälte

Dipl.-mg. E. Eder

Dipl.-Ing. K. Schieschke

8München4Q,EIisabethstraße34

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Claims

Patentanwälte _ 9 _

Dip!.-Ing. E. Eder Dipl.-Ing. K. Schieschke

8Münciien40, EliJ£.b3lhstraSe34

P a t e η t a η s ρ r ü c h e

Kolorimetrisches Verfahren zur Kreatininbestimmung in einer biologischen, proteinhaltigen Flüssigkeitsprobe, gekennzeichnet durch Zusatz eines Reagens zur biologischen Flüssigkeit, welches eine farbige Verbindung, eingeht, die bei einer charakteristischen Wellenlänge maximale Lichtabsorption des in der zu untersuchenden Flüssigkeit enthaltenen Kreatinins bewirkt, wobei die Interferenz von Protein mit dem gewünschten Nachweis durch Bildung von Protein-Komplexen ausgeschaltet wird, welche die Entstehung kreatinin-fremder Chromogene verhindern, durch Messung des Absorptionsgrades im charakteri*- strischen Wellenlängenbereich und durch Ermittlung der Kreatininkonzentration in der Flüssigkeit durch Vergleich des gemessenen Absorptionsgrades mit Absorptionswerten wäßriger, das Reagens enthaltender Standardlösungen bekannter Kreatininkonzentrationen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Probe vor Durchführung der kolorimetrischen Bestimmungen Harnstoff in einer zur Bildung von Proteinkomplexen ausreichenden Menge zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem Harnstoff ein Detergens zugesetzt und die sich ergebende Verbindung dann der Probe zugegeben wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Natriumocty!sulfat als Detergens.

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5. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Natriumtetradecylsulfat als Detergens.
6. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Natriumheptadecylsulfat als Detergens.
7. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Natriumcetylsulfat als Detergens.
8. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Natriumdodecylsulfat als Detergens.
9. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Natriuinmyristylsulfat als Detergens.
10.Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Natriumoctadecylsulfat als Detergens.
11.Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Natriumoleylsulfat als Detergens.
12.Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Natriumtridecylsulfat als Detergens.
13.Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung von Dodecylbenzolsulfat als Detergens.
14.Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens eine Aralkansulfat-Lösung auf Natrium-,Kaliumöder Lithiumbasis ist.
15.Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verwendung einer Prüfmenge der Probe von 0.01 bis 2.0 ml.
16. Verfahren nach Anspruch 3-, gekennzeichnet durch Verwendung eines Reagensvolumens von 0.2 bis 25.0 ml.

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17.Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß während der Kolorim
13.5 gehalten wird.

während der Kolorimetrie der ρ -Wert zwischen 11.0 bis
18. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reagens ein Puffer zugesetzt wird, um während der Kolorimetrie den ρ -Wert zwischen 11.0 und 13.5 zu halten.
19.Reagens zur Verwendung für die Kreatininbestimmung nach dem Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Zusammensetzung aus einer gesättigten Pikrinsäure-Lösung A und einer Harnstofflösung B mit einer auf einen p„ zwischen 11.0 bis 13.5 gepufferten Lösung aus Natriumborat in einem Natrium- oder Kaliumsulfatsalz und einer Aralkansulfatlösung als Detergens.
20.Reagens nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung A mit der Lösung B zu einem Alkalipikrat-Reagens zur Verwendung in der Kreatininbestimmung gemischt wird.
21.Reagens nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalipikrat-Reagens bei 37°C vor-inkubiert wird und nach anschließender Einbringung der Probe in das Reagens bei 37°C für 10 bis 30 Minuten inkubiert wird.

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DIpl.-Ing. E. Ecfer

Dipl.-Ing. K. Schieschke

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