DE3874611T2

DE3874611T2 - Verfahren und reagens zur bestimmung von ld-1-isoenzym.

Info

Publication number: DE3874611T2
Application number: DE8888107865T
Authority: DE
Inventors: William A Abbott; Rita Sue Byrne; David Anthony Yost
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1988-05-17
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2008-05-18
Also published as: AU611438B2; EP0292838B1; JPH0698031B2; ATE80665T1; ES2036234T3; EP0292838A1; JPS6463397A; DE3874611D1; CA1320418C; AU1659388A

Description

GRUNDLAGE DER ERFINDUNG

Laktat-Dehydrogenase (LDH) erscheint im Human-Plasma und -Serum als fünf Isoenzyme. Diese Enzyme sind tetramere Proteine, welche aus zwei Typen von Untereinheiten zusammengesetzt sind: 'M' (der im Skelettmuskel überwiegt) und 'H' (der im Herzen überwiegt). Die Isoenzyme wurden ursprünglich durch elektrophoretische Auftrennung identifiziert, und sie werden herkömmlicherweise auf der Basis ihrer relativen Wanderungsgeschwindigkeit in Richtung auf die Anode hin mit LD-1, LD-2, LD-3, LD-4 und LD-5 bezeichnet, wobei LD-1 das schnellste ist. Die ihnen entsprechenden Zusammensetzungen aus Untereinheiten sind H&sub4;, H&sub3;M, H&sub2;M&sub2;, HM&sub3; bzw. M&sub4;.
Die anteilsmäßige Menge von jedem Isoenzym variiert beträchtlich zwischen den einzelnen Organen, doch ist die innerhalb eines gegebenen Organs relative konstant, sodaß jedes Organ ein charakteristisches Isoenzymprofil aufweist. Beispielsweise weisen das Herz und die Erythrozyten hohe Mengenanteile von LD-1 und LD-2 auf, die Leber und die Skelettmuskulatur enthalten überwiegend LD-5, und die Lunge, die Nieren und das Gehirn enthalten Gemisch, in denen LD-2, LD-3 und LD-4 in unterschiedlichem Ausmaß überwiegen können. Das Auslaufen dieser Enzyme aus einem erkrankten oder beschäzdigten Organ führt zur Erhöhung der Gesamt-Serum-LDH, und eine weitere Kennzeichnung der Serum-Isoenzym-Zusammensetzung kann mithelfen, das für dieses Auslaufen verantvortliche Organ zu identifizieren. Somit sind Bestimmungen der Serum-LDH und deren Isoenzym-Zusammensetzung nützlich für die Diagnose einer Vielfalt von Krankheitszuständen. Eine Diagnose bei Verdacht auf Myokardinfakt ist die häufigste Anwendung von LDH-Isoenzym-Bestimmungen. In diesen Fällen ist eine Zunahme in dem LD-1-Isoenzym, bezogen auf die anderen Formen, spezifisch für einen Myokardschaden und bestätigt das Vorliegen eines solchen, weil das Herz den größten Anteil an dem LD-1-Enzym enthält.
Die Elektrophorese war das erste Verfahren, welches zum Auftrennen der LDH-Isoenzyme angewendet worden ist, und sie wird noch immer in großem Umfang zur Erzielung vollständiger Isoenzym-Profile angewendet. Dieses Verfahren hat insofern verschiedene Nachteile, als es mehrfache und langwierige Verfahrensschritte sowie eine teure Ausrüstung erfordert. Auftrennungen unter Verwendung von Ionenaustauschersäulen sind ebenfalls entwickelt worden, doch haben auch diese ihre Nachteile.
Eine alternatives Verfahren der Analyse auf LDH-Isoenzyme hat darin bestanden, einige der Isoenzyme selektiv zu hemmen oder zu denaturieren, und so den relativen Mengenanteil jener zu quantifizieren, die sich der Behandlung widersetzen. Beispiele umfassen: Die Verwendung von Harnstoff, Wärme und einem hohen pH-Wert, um jene Isoenzyme fortschreitend zu inaktivieren, welche die meisten 'M'-Untereinheiten enthalten; die Verwendung von hohen Mengen an Substrat (Pyruvat oder Laktat), um die 'H'-Untereinheit selektiv zu hemmen; und die Verwendung von Alpha-Ketobuttersäure als spezifisches Substrat für die 'H'-Untereinheit.
In der US-PS 4 250 255 ist ein Verfahren beschrieben, bei welchem zuerst die Gesamt-LDH-Aktivität gemessen wird, und dann die Isoenzyme dadurch selektiv gehemmt werden, daß man die Probe mit einem ionischen, amphiphilen Mittel behandelt. Die behandelte Probe wird dann auf Enzym-Aktivität gemessen, und der so erhaltene Wert wird von dem bei der ersten Messung erzielten abgezogen. Der Unterschied ist die Aktivität des Isoenzyms.
In der DE-A-25 13 407 ist ein Verfahren für die spezifische Bestimmung des Herz-Isoenzyms LD-1 mit Hilfe der Hemmung des Leber-Isoenzyms LD-5 beschrieben, wobei die Hemmung durch Zugabe eines Schwermetallsalzes, insbesondere AgNO&sub3;, zu einer LDH-enthaltenden Serumprobe vorgenommen wird.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine Alternative zu den obigen Verfahren zur Verflügung gestellt, und zwar ist diese Alternative ein hochgradig spezifisches Verfahren für die Bestimmung des LD-1-Isoenzyms in biologischen Flüssigkeiten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein rasches und spezifisches Verfahren zum Quantifizieren des LD-1-Isoenzyms in einer biologischen Flüssigkeit durch Einverleiben eines chaotropen Mittels in ein LDH-Testsystem. Ein Verfahren zum Bestimmen der LD-1-Isoenzym-Aktivität biologischer Flüssigkeiten umfaßt die einzige Stufe der Herstellung eines Reaktionsgemisches aus der biologischen Flüssigkeit und dem LDH-Reagens in Gegenwart eines chaotropen Mittels. Die Aktivität der in dem Reaktionsgemsich vorhandenen LD-1-Aktivität kann dann bestimmt werden. Das chaotrope Mittel liegt generell in einer Menge vor, welche zur Bildung einer 0,1 M-Lösung bis zu einer 5 M-Lösung in dem Reaktionsgemisch, in höherem Maße bevorzugt einer 0,6 M-Lösung bis zu einer 1M-Lösung ausreicht. Ein besonders bevorzugtes chaotropes Mittel ist Natriumperchlorat. Das LDH-Reagens kann einen Puffer, Lactat und ein Chromogen, oder einen Puffer, Pyruvat und ein Chromogen umfassen.
Gemäß einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein LD-1-Test-Reagens, welches einen Puffer, ein Substrat, ein Chromogen und ein chaotropes Mittel enthält. Das Substrat kann aus Lactat, Pyruvat, NAD, NADH oder Analoga hievon bestehen. Das Chromogen kann auch NAD sein. Vorzugsweise ist das chaotrope Mittel Natriumperchlorat, welches in einer Menge vorliegt, die zur Bildung einer 0,1 M-Lösung bis zu einer 5 M-Lösung, vorzugsweise einer 0,6 M-Lösung bis zu einer 1M-Lösung ausreicht.
Mit diesem neuen Verfahren und System von Reagentien kann man selektiv auf LD-1 in einer biologischen Flüssigkeit testen, und man erzielt damit Verbesserungen in der Geschwindigkeit, bei der Handhabung und in der Genauigkeit bei allen Mengen von LD-1.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:

Die Fig. 1 zeigt die Korrelation zwischen den Ergebnissen eines LD-1-Tests, wobei dieser Test gemäß dem LD-1-Test des vorliegenden Verfahrens durchgeführt wurde, und jenen Ergebnissen, die nach einem mehrstufigen Standardverfahren auf der klinischen Abott-Vorrichtnng VP erhalten worden sind.
Die Fig. 2 zeigt die Korrelation zwischen den Ergebnissen eines LD-1-Tests, wobei dieser Test gemäß dem LD-1-Test des vorliegenden Verfahrens durchgeführt wurde, und jenen Ergebnissen, die nach einem mehrstufigen Standardverfahren auf der klinischen Abbott-Vorrichtung Spectrum erhalten worden sind.

EINGEHNDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagens, welches selektiv auf LD-1 in biologischen Flüssigkeiten prüft. Die biologischen Flüssigkeiten können Blut, Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit und Urin umfassen. In dem Reagens wird ein chaotropes Mittel, wie z.B. Natriumperchlorat, eingesetzt, um jene LDH- Isoenzyme selektiv zu denaturieren, welche eine oder mehrere Untereinheiten des 'M'-Typus enthalten, und so deren enzymatische Aktivität zu entfernen. Das Reagens enthält auch jene Chemikalien, welche für die gleichzeitige Bestimmung der restlichen LDH-Aktivität, nämlich jener, welche auf LD-1 zurückzuführen ist, notwendig sind. Es hat sich erwiesen, daß die Quantifizierung der LD-1 ebenso wie der Gesamt-LDH von Wert zum Diagnostizieren von Myokardinfarkt ist, und auch von Wert ist, um diese Krankheit von jenen Krankheiten zu unterscheiden, bei denen ein Auslaufen von LDH aus anderen Organen beteiligt ist.
Das Grundprinzip dieses Reagens besteht in der Fähigkeit chaotroper Mittel, die nomralen strukturellen Beziehungen gewisser Proteine, wie dieselben in wässeriger Lösung vorhanden sind, selektiv zu zerbrechen. Chaotrope Mittel sind im allgemeinen anorganische Ionen, welche einen großen Radius, eine negative Ladung und eine niedrige Ladungsdichte aufweisen; sie werden verwendet, um die Sekundär- und Tertiärstruktur von Proteinen zu verändern. Sie sind auch als die Hofmeisterschen oder lyotropen Reihen bekannt. Sie umfassen Anionen mit großen partiellen Molarionenvolumina (welche mit dem Symbol ... bezeichnet werden, und welche in Einheiten von ml/Mol ausgedrückt werden), insbesondere jene, deren Volumen größer als 30 ml/Mol ist. Beispiele sind TcO , ClO , ReO , BV , SeCN&supmin;, SO&sub3;F&supmin;, SCN&supmin; und I&supmin; (Wolff, J. und Maurey, J.R., Biochem Biophys Acta 69, 58-67 (1963)).
Generell wird das chaotrope Mittel in der biologischen Probe in einer Menge eingesetzt, welche zur Bildung einer 0,1 M-Lösung bis zu einer 5 M-Lösung in dem Gesamtreaktionsgemisch ausreicht, welches aus der biologischen Probe und dem Reagens besteht. Vorzugsweise liegt das chaotrope Mittel in einer Menge vor, welche zur Bildung einer 0,6 M-Lösung bis zu einer ¹M-Lösung ausreicht. Der Einschluß des chaotropen Mittels in der biologischen Flüssigkeit führt zur sofortigen Inaktivierung aller LDH-Isoenzyme, welche einer oder mehrere Untereinheiten des 'M'-Typus enthalten, nämlich von LD-2 bis LD-5. Das LD-1 bleibt stabil und kann gleichzeitig mit einem LDH-Testreagens gemessen werden.
Das bevorzugte chaotrope Mittel ist Natriumperchlorat (NaClO&sub4;). Das Natriumperchlorat kann die Affinität zwischen dem Substrat (Lactat oder Pyruvat) und dem LD-1 verringern. Die so entstandene Abnahme in der Reaktionsgeschwindigkeit kann durch Zugabe von mehr Substrat umgekehrt werden. Beispielsweise ergibt das Kombinatieren einer 0,6 M-Lösung bis zu einer 1,0 M-Lösung von Natriumperchlorat mit einer 0,05 M-Lösung bis zu einer 0,5 M-Lösung von Lactat ein spezifisches Reagens für LD-1, das eine schnelle und genaue Bestimmung von LD-1 ergibt.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verahren zum selektiven Etnfernen von Nicht-LD-1-Isoenzymen für Systeme von Reagentien, welche zum Testen auf LDH ausgelegt sind. Generell umfaßt das Verfahren die Zugabe eines chaotropen Mittels zu dem Reagens, wodurch die Isoenzyme LD-2 bis LD-4 inaktiviert werden, so daß das LD-1 quantifiziert werden kann. Typischerweise umfassen LDH-Test-Reagentien einen Puffer, Substrate (Lactat, Pyruvat, NAD, NADH oder Analoga hievon) und gegebenenfalls Chromogene oder Indikator- Farbstoffe. Die grundlegenden LDH-Test-Reagentien sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden daher hier nicht im einzelnen erörtert. Im Handel erhätliche LDH-Test-Reagentien, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen A-Gent LDH-L, Abbott Laboratories, Liquid-Stat LD-L-VV von Beckman, Fast Chem LDH-L von BMC, LDH-L-S V.R. von Calibiochem, C-Zyme LDH von Counter, Colorimetrix von Dow Chemical, LDH-L von Fisher, Ultrazyme von Harleco, HMA LDH-VV von Hycel, Spin Chem LDH-L von SKI, und LDH (L-P) von Worthington.
Der LDH-Test basiert auf der allgemeinen, nachstehend angeführten Reaktion:
Lactat + NAD Pyruvat + NADH + H&spplus;
Das Verfahren besteht aus einer umkehrbaren Reaktion, wobei das Lactat durch das Enzym - bei gleichzeitiger Reduktion von NAD (Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid) zu NADH (reduziertem NAD) - in Pyruvat umgewandelt wird. Somit ist die Geschwindigkeit der NADH-Bildung, oder der Oxidation desselben zu NAD, im Falle der umgekehrten Reaktion, gemessen durch die Geschwindigkeit der Zunahme in der dekadischen Extinktion bei 340 nm, der LDH-Aktivität in der Probe direkt proportional.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren sind sowohl die selektive Inaktivierung als auch das gleichzeitige Testen auf die LD-1-Aktivität vorgesehen. Die gesamte Verfahrensweise erfordert nur soviel Zeit, wir für einen typischen Gesamt- LDH-Test benötigt wird, nämlich 4 min auf dem Zweifarben-Analysator vom Typus Abbott VP und auf dem diagnostischen System vom Typus Abbott Spectrum Diagnostic System (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois). Automatisierte, klinische Analysatoren, bei welchen Zweifarbenfilter oder -detektoren bei 340/380 nm verwendet werden, wie z.B. die Geräte vom Typus Abbott VP und Abbott Spectrum Instruments, sind für die Durchführung des Tests mit diesem Reagens sehr gut geeignet. Typischerweise werden 10 bis 20 ul des Serums je 1 ml des Reagens bei 37ºC zugesetzt, und bei den Abbott-Geräten verwendet man 2,5 bis 5,0 ul des Serums und 0,25 ml des Reagens, so daß Serum- LDH- und -LDH-1-Aktivitäten in einem Bereich von 10 bis 1.000 Einheiten je Liter (E/l) genau bestimmt werden können.
Bei dem vorliegenden Verfahren ist keinerlei Manipulation der Probe vor dem Test erforderlich, abgesehen von dem Abtrennen des Serums und des Einbringens von aliquoten Anteilen desselben in die Probenbecher auf einem Gerät. Die Ergebnisse werden in den gleichen Einheiten wie das Gesamt-LDH angegeben und beziehen sich auf das unverdünnte Serum. Es sind keine weiteren Berechnungen erforderlich. Außerdem wird bei dem vorliegenden Verfahren, weil keinerlei Manipulation der Probe, wie z.B. ein Verdünnen derselben, vor dem Test erforderlicht ist, ein sehr hoher Grad von Genauigkeit und Exaktheit aufrechterhalten.
Zusätzlich zu dem Inaktivieren der Isoenzyme LD-2 bis LD-5 reduzieren die chaotropen Mittel auch die Affinität des LD-1 für Lactat, Pyruvat und deren Analoga. Demzufolge sind in Gegenwart chaotroper Mittel höhere Lactatkonzentrationen als bei deren Fehlen erforderlich, um mit der gleichen Menge von LD-1 die gleichen Reaktionsgeschwindigkeiten zu erhalten (wobei alles andere gleich ist, und wobei die Reaktionsrichtung Lactat T Pyruvat ist). Aus dem gleichen Grunde sind auch die durch das Pyruvat, Oxalat, und hohe Mengen von Lactat erzeugten Hemmwirkungen ebenfalls verringert. Somit wird man mit dem für LD-1 spezifischen vorliegenden Reagens, welches höhere Mengen von Substrat (nämlich Lactat oder Pyruvat) enthält, eine größere Linearität erzielen, weil während des gesamten Reaktions-Zeit-Rahmens eine höhere Konzentration von verfügbarem Substrat niedrigeres Ausmaß von Produkthemmung entsteht. Ein zusätzlicher Vorteil, der sich aus diesem Phänomen ergibt, besteht in dem Wegfall von Störungen in Proben, welche in Röhrchen mit gerinnungshemmendem Inhalt, mit einem Gehalt an Oxalatsalzen, gesammelt worden sind.
Ein zusätzlicher Vorteil des vorliegenden Reagens und Verfahrens besteht darin, daß dabei das für einen Test erforderliche Probenvolumen auf ein Mindestmaß herabgesetzt ist. Bei älteren immunologischen und chromatographischen Verfahren sind 200 bzw. 1.000 ul der Serumprobe erforderlich, die zur Gänze in dem Test verbraucht werden. Bei dem vorliegenden Verfahren sind maximal 100 ul für einen händisch durchgeführten Test erforderlich, unter der Annahme, daß eine 3,0 ml Küvette erforderlich ist, und typischerweise sind für einen automatisierten Test nur 2,5 bis 5,0 ml des Reagens erforderlich. Bei einem automatisierten Test kann es erforderlich sein, daß sich 50 bis 100 ul der Probe in dem Probenbecher befinden, doch steht die nicht-benützte Probe für andere Tests zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen weiter veranschaulicht, welche keine Beschränkungen der Erfindung darstellen.

BEISPIEL I:

Es wurde ein für LD-1 spezifisches LDH-Test-Reagens hergestellt. Zuerst wurde ein Reagenspulver von solcher Art zusammengestellt, daß bei dessen Rekonstitution mit 30 ml Wasser je g Pulver die folgenden Konzentrationen jedes Wirkbestandteiles erhalten werden: Bestandteil: mMol/l des rekonstituierten Reagens L-Lactat NAD Tris(hydroxymethyl)aminoethan Glutaminsäure
Das L-Lactat und das NAD sind Substrate, und das Tris und die Glutaminsäure puffern die so entstandene Lösung auf einen pH-Wert von 8,7. Na&sub2;EDTA kann 1 % des Gesamtpulvergewichtes ausmachen, um die Stabilität des NAD in der Lösung zu strecken. Natriumchlorid kann als inertes Füllmittel verwendet werden, um das erforderliche Gesamtgewicht des Pulvers einzustellen.
Zweitens wurde eine "Verdünnungsmittel"-Lösung hergestellt, welche 0,825 M Natriumperchlorat und 0,165 M L-Lactat in Wasser enthielt, und welche durch Zugabe von Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt wurde.
Drittens wurde ein für Human-LD-1 spezifisches Reagens durch Auflösen von 1,0 g des obigen Pulvers in je 30 ml des Verdünnungsmittels, statt Wassers, hergestellt. Dieses rekonstituierte Reagens wurde mit der gleichen Testkonfiguration, den gleichen Proben und Geräten wie ein Gesamt-LDH-Test-Reagens eingesetzt, doch war die so entstandene, gemessene, enzymatische Aktivität jene, welche nur auf das LD-1-Isoenzym zurückzuführen ist. Außerdem sind die Aktivitätseinheiten zu jenen direkt proportional, welche gemessen würden, wenn die gleiche Menge von reinem LD-1 mit dem gleichen, aber mit Wasser rekonstituiertem, Pulver geprüft würde.

BEISPIEL II:

Andere LD-1-Test-Reagentien können aus bereits vorhandenen, pulverförmigen oder flüssigen LDH-Test-Reagentien hergestellt werden. Die genauen Formeln für solche Verdünnungslösungen können durch Optimierungsuntersuchungen festgestellt werden, welche wie folgt durchgeführt werden. Es wird eine Population von Human-Serumproben, darunter solche mit erhöhtem LDH und LD-1, erhalten, und die LD-1-Mengen werden nach den etablierten immunologischen, elektrophoretischen oder chromatographischen Verfahren für die LD-1-Bestimmung (nämlich nach dem Bezugsverfahren) festgestellt. Die Daten werden mit jenen korreliert, welche durch Rekonstituieren eines bereits vorhandenen LDH-Reagens-Pulvers mit verschiedenen Verdünnungsmittellösungen, welche verschiedene Konzentrationen von L-Lactat und/oder Natriumperchlorat enthalten (nämlich unter den Versuchsbedingungen), erhalten worden sind.
Das Natriumperchlorat kann in einen Bereich von einer 0,1 M-Lösung bis zu einer etwa 5 M-Lösung, vorzugsweise von einer 0,5 M-Lösung bis zu einer etwa 1,5 M-Lösung fallen, und das L-Lactat kann in einen Bereich von etwa Null bis zu einer etwa 0,5 M-Lösung fallen. Die Ergebnisse des LD-1-Bezugsverfahrens werden mit jeder Versuchsbedingung unter Anwendung der Linear-Regressionsanalyse verglichen, um für jeden Vergleich die Werte für die Steigung, den Abschnitt und den Korrelationskoeffizienten zu erhalten. Aus solchen Analysen läßt sich ein optimiertes LD-1-Reagens dadurch ableiten, daß man diejenige Formulierung des Verdünnungsmittels auswählt, welche eine Steigung und einen Korrelationskoeffizienten ergibt, die sich jeweils der Einheit nähern, und welche einen Wert für den Abschnitt ergibt, der sich an Null annähert. Durch die obige Verfahrensweise wird es ermöglicht, eine bereits vorhandene, pulverförmige oder lyophilisierte Reagensformulierung für Gesamt-LDH leicht für den selektiven Test aus das LD-1-Isoenzym anzupassen. Die aus einer einzelnen Human-Probe erhaltenen Ergebnisse nach sowohl dem Test auf Gesamt-LDH als auch nach dem Test auf LD-1 können dann ohne weiteres miteinander kombiniert werden, um ein Verhältnis von LD-1:LDH zu erhalten, von welchem es sich erwiesen hat, daß es diagnostischen Wert hat. Dieses Verfahren zum Prüfen auf LD-1 kann auch mit Tests auf andere Human-LDH-Isoenzyme oder Zusammensetzungen aus Untereinheiten derart kombiniert werden, daß auch mehrere andere oder alle übrigen LDH-Isoenzyme gemessen werden. Die chaotropen Mittel können auch verwendet werden, um selektiv auf Isoenzyme von anderen, klinisch wichtigen Enzymen zu prüfen.

BEISPIEL III:

Das nachstehende Beispiel zeigt die ausgezeichnete Korrelation zwischen dem vorliegenden Reagens und dem vorliegenden Verfahren zum Prüfen auf LD-1 und einer Standardverfahrensweise zum Isolieren von Serum-LD-1 (Isomune-LD , Roche Diagnostic Systems, Nutley, New Jersey). Es wurden 102 Serumproben gesammelt, aliquote Anteile aus jeder Probe wurden nach der Isomune-LD -Verfahrensweise vorbehandelt, und doppelte Proben zu je 5 bzw. 10 ul wurden auf den klinischen Analysatoren vom Typus Abbott VP bzw. Abbott Spectrum unter Verwendung des Abbott-A-Gent -LDH-Reagens geprüft. Doppelte, aliquote Anteile der unbehandelten Proben wurden auch mit dem vorliegenden, gemäß Beispiel I hergestellten LD-1-Reagens auf den gleichen klinischen Analysatoren geprüft, wobei 2,5 bzw. 5,0 ul verwendet wurden.
Nach der Isomune-LD -Verfahrensweise wird LD-1 isoliert, und dabei wurde wie folgt vorgegangen. Zu den aliquoten Anteilen der Probe wurde jeweils Anti- LD-5-(M&sub4;)-Serum (Zeige) zugesetzt, damit vermischt, und während 5 min bei Umgebungstemperatur inkubiert. Als nächstes wurde zu den aliquoten Anteilen eine Suspension eines zweiten Antikörpers (Esel) zugegeben, damit vermischt, während weiterer 5 min bei Umgebungstemperatur inkubiert und dann zentrifugiert. Die Überstände wurden dann zur Bestimmung der LD-1-Isoenzym-Aktivität mit herkömmlichen Reagentien, in diesem Fall mit A-Gent LDH-L von Abbott, geprüft.
Das vorliegende Verfahren wurde angewendet, um die LD-1-Konzentration durch bloßes Zusammengeben des im Beispiel I hergestellten Reagens mit jedem unbehandeltem, aliquotem Anteil und Durchlaufenlassen durch den klinischen Analysator zu bestimmen. Etwa 250 ul des Reagens wurden verwendet, um 2,5 ul der Probe auf dem Abbott VP , und 5,0 ul der Probe auf dem Abbott-Spectrum - Analysator zu prüfen.
Mit einem Computerprogramm wurde die Korrelation zwischen den zwei Verfahrensweisen auf jedem klinischen Gerät bestimmt, und die Ergebnisse wurden graphisch dargestellt. Die graphischen Darstellungen erscheinen als Fig. 1 für die auf dem Abbott VP durchgeführten Tests, und als Fig. 2 für die auf dem Abbott Spectrum durchgeführten Tests. Die Ergebnisse des vorliegenden LD-1-Tests wurden auf der Y-Achse aufgetragen, während die Ergebnisse des mehrfachstufigen Standardtests auf der X-Achse aufgetragen wurden. Eine perfekte Korrelation würde die graphische Darstellung mit einem Null-Abschnitt und einer 1,0-Steigung halbieren. Die Korrelationsergebnisse waren die folgenden: ABBOTT-VP -Standard* gegen LD-1 Reagens** ABBOTT-SPECTRUM -Standard* gegen D-1 Reagens** Abschnitt Steigung Korrelation Anzahl der Proben *Nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung; LD-1-Test mit dem Isomune-LD -Reagens durchgeführt, um das LD-1 zu isolieren, und dann mit dem A-Gent -LDH-Reagens bestimmt. ** Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Ergebnisse zeigen eine ausgezeichnete Korrelation zwischen der mehrfachstufigen Verfahrensweise, bei welcher das LD-1 zuerst aus der Serumprobe isoliert wurde, und dann die LD-1-Aktivität gemessen wurde, und dem vorliegenden Reagens und Verfahren, bei welchem die LD-1-Aktivität zugleich isoliert und gemessen wird.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen der LD-1-Isoenzym-Aktivität in biologischen Flüssigkeiten, welches umfaßt:

Herstellen eines Reaktionsgemisches aus der biologischen Flüsigkeit und dem LDH-Reagens in Gegenwart eines chaotropen Mittels;

Bestimmen der Aktivität des in dem Reaktionsgemisch vorliegenden LD-1.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das chaotrope Mittel in einer Menge von einer 0,1 M-Lösung bis zu einer 5 M-Lösung vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das chaotrope Mittel in einer Menge vorliegt, welche zur Bildung einer 0,6 M-Lösung bis zu einer 1 M- Lösung in dem Reaktionsgemisch ausreicht.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das chaotrope Mittel Natriumperchlorat ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagens einen Puffer, Lactat und ein Chromogen umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagens einen Puffer, Pyruvat und ein Chromogen umfaßt.

7. Reagens für einen LD-1-Assay, zur Verwendung in dem Verfahren nach Anspruch 1, welches enthält: einen Puffer, eine Substrat, ein Chromogen und ein chaotropes Mittel.

8. Reagens für einen LD-1-Assay nach Anspruch 7, wobei das Substrat aus Lactat, Pyruvat,NAD, NADH oder Analoga hievon besteht.

9. Reagens für einen LD-1-Assey nach Anspruch 7, wobei das Chromogen NAD ist.

10. Reagens für einen LD-1-Assay nach Anspruch 7, wobei das chaotrope Mittel Natriumperchlorat ist.