DE3852714T2

DE3852714T2 - Oligodesoxynukleotide als Inhibitoren der Replikation von Retroviren und der Expression von Onkogenen.

Info

Publication number: DE3852714T2
Application number: DE3852714T
Authority: DE
Inventors: Jack S. Bethesda Maryland 20814 Cohen; Shee Loong Wheaton Maryland Loke; Makoto Rockville Maryland 20852 Matsukura; Leonard M. Bethesda Maryland 20816 Neckers; Kazuo Kazo City 347 Shinozuka; Cy Aaron Grithersborg Maryland 20878 Stein; Gerald San Carlos California 94070 Zon
Original assignee: US Department of Health and Human Services; US Department of Commerce
Current assignee: US Department of Health and Human Services; US Department of Commerce
Priority date: 1987-03-25
Filing date: 1988-03-24
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2008-03-25
Also published as: WO1988007544A1; ATE116857T1; IL85827A; DE3852714D1; JPH0559120B2; EP0288163B1; IL85827A0; CA1322723C; US5286717A; EP0288163A2; EP0288163A3; US5276019A; JPH01503302A; AU1571788A; AU619180B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Replikationsverhinderung von Retroviren und ist mehr im einzelnen auf Phosphorthioat-Oligodesoxyribonucleotid-Analoge gerichtet, die zur Verhinderung der Replikation fremder Nucleinsäuren in Anwesenheit normaler lebender Zellen sowie auch zur Verhinderung der Vermehrung neoplastischer Zellen verwendet werden können.

Hintergrund der Erfindung

Oligodesoxynucleotide, die komplementär zu gewissen Geninformationen bzw. viralen Sequenzen sind, werden als "Antisinn" Verbindungen bezeichnet. Diesen Verbindungen werden hemmende Wirkungen gegen das Rous-Sarkom-Virus und das Human-T-Zellenlymphotrope Virus Typ III (HTLV-III), das nun Human- Immundefektvirus (HIV) genannt wird, nachgesagt. Jedoch läßt die Empfindlichkeit der Phosphordiester-Bindung in normalen Oligodesoxynucleotiden gegen Abbau durch Nucleasen eine Verringerung ihrer Potenz und ihrer Beständigkeit als anivirale Agenzien im lebenden Organismus erwarten.
Methylphosphonat-Oligodesoxynucleotid-Analoge sind gegen Nucleasen resistent, und weil sie unbelastet sind, haben sie eine gesteigerte Hydrophobizität, die, wie berichtet wird, zu einer gesteigerten Zellmembrandurchlässigkeit für diese Verbindungen führt. Die Methylphosphonat-Oligodesoxynucleotide zeigen, wie sich-herausgestellt hat, antivirale Aktivität, aber diese Verbindungen können hohe Konzentrationen erfordern, typischerweise 100 bis 300 Mikromol, um starke antivirale Wirkungen zu erzeugen.
Eine Anzahl von Forschern haben die hemmenden Eigenschaften sowohl normaler Oligodesoxynucleotide als auch von Analogen von Oligodesoxynucleotiden untersucht. T'so und Mitarbeiter haben Ethylphosphortriester- und Methylphosphonat-Analoge von Oligodesoxynucleotiden als nichtionische Verbindungen bewertet, die Zellen durchdringen, und die verhältnismäßig resistent gegen einen Abbau durch Nucleasen sind (siehe US- Patent Nr. 4 469 863). Bei Ethylverbindungen hat sich jedoch herausgestellt, daß sie den Nachteil haben, einer zersetzenden Diethylierung in Zellen zu unterliegen. Die Methylphosphonate haben sich als stabiler und als antivirale Aktivität aufweisend erwiesen.
Dimethylphosphonat-Analoge, wie oben beschrieben, sind als dieexpression einiger Gene hemmend beschrieben worden. Jedoch haben diese Verbindungen eine Anzahl erheblicher Nachteile:
1) Solche Verbindungen sind sehr empfindlich gegen basenkatalysierte Hydrolyse, weshalb sie im Vergleich zu polyanionischen Oligodesoxynucleotiden verhältnismäßig schwierig routinemäßig zu synthetisieren sind;
2) die Verbindungen haben eine verhältnismäßig geringe Löslichkeit in wäßrigen Medien, weshalb ihre mögliche biologische/chemotherapeutische Verwendung im Vergleich zu polyanionischen Oligodesoxynucleotiden eingeschränkt ist;
3) zur Erzeugung aktiviraler Aktivität scheinen verhältnismäßig hohe Konzentrationen dieser Verbindungen notwendig zu sein, und
4) wegen der sterischen Wirkung der Methylgruppe findet nur eine dürftige Hybridisierung statt.
Diese Faktoren machen zusammengenommen eine Chemotherapie mit diesen Verbindungen bei Menschen impraktikabel.
Bei einer frühen Arbeit von Zamecnik und Mitarbeitern wurden normale unmodifizierte Oligodesoxynucleotide sowie 3'-end- inaktivierte (2', 3'-Didesoxyribosil)-Analoge von Oligodesoxynucleotiden zum Hemmen der Transformationsfähigkeit, der Replikation und der Translation des Rous-Sarkom- Virus in vitro verwendet. Dieser Ansatz wurde von Zamecnik u. a. in PNAS, USA, 83:4143 bis 4146 (1986), der die Hemmung des HIV-Virus in kultivierten menschlichen Zellen untersuchte, und Wickstrom u. a., in J. Biochem. Biophys. Methods, 13:97 bis 102 (1986) ausgeweitet, der die Hemmung der Translation von mRNA vom Bläschen-Stomatitis-Virus erforschte.
Verglichen zu den oben genannten Methylphosphonat-Analogen bieten die unmodifizierten bzw. "O-Oligodesoxynucleotide" die Vorteile der Kostengünstigkeit und der synthetischen Zugänglichkeit und scheinen darüber hinaus den zusätzlichen Vorteil niedrigerer wirksamer Dosierungen zu haben. Jedoch unterliegen diese unmodifizierten Oligodesoxynucleotide dem Abbau durch Nucleasen, selbst bei Einschluß eines 3'-Endeinaktivierenden Rests. Folglich ist die Verwendung dieser Verbindungen in vitro beträchtlich eingeschränkt, und es ist hochgradig unwahrscheinlich, daß sie im lebenden Organismus erfolgreich sein können.
Die Feststellung, daß das Human-T-Zellen-lymphotrope Virus Typ III (HTLV-III), nachstehend als Human-Immundefektvirus (HIV) bezeichnet, das ursächliche Agens des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) ist, erzeugte beträchtliches Interesse an der Entwicklung chemotherapeutischer Maßnahmen zur Behandlung von AIDS. Eine Vielfalt von Verbindungen sind als in-vitro-Aktivität gegen HIV aufweisend berichtet worden, obwohl von keiner dieser Verbindungen eine Hemmung der Expression des integrierten viralen Genoms bekannt ist.
Die Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotide von mehreren Sequenzen, einschließlich Sinn-, Antisinn-, Unsinn-, und Homo-Oligomeren haben sich als HIV hemmend erwiesen, so daß der Mechanismus der Hemmung unklar war. Die nachfolgende Arbeit hat gezeigt, daß die Hemmung durch Homo-Oligomere, die nicht komplementär zu irgendeiner bekannten Sequenz im HIV- Genom sind, aus der Wechselwirkung und Einflußnahme bei der Funktion der reversen Transkriptase von HIV bei niedrigen Konzentrationen, d.h. von weniger als 10 Mikromol, resultiert. Der anfänglich für eine Komplementärbasensequenzhemmung vermutete Mechanismus, der als "Translationsarrest" der korrespondierenden mRNA bekannt ist, ist anscheinend in dem Retrovirus nicht wirksam, bis viel höhere Konzentrationen der Phosphorthioat-Verbindungen erreicht sind, d.h. von mehr als 25 Mikromol. Dies erklärt daß für diesen Hemmungsvorgang beobachtete Fehlen einer Sequenzspezifizität.
Früher sind Versuche unternommen worden, die Vermehrung normaler Lymphozyten und HL60-Zellen unter Verwendung einer normalen Oligodesoxynucleotid-(ODN)-Sequenz zu hemmen, die komplementär zu einem Bereich nahe des Startcodons des c-myc- Gens ist. Obwohl diese Ergebnisse ermutigend waren, zeigten sie, daß normale Antisinn-c-myc-Oligodesoxynucleotide selbst bei Konzentrationen von 100 Mikromol für eine längere Hemmung einer c-myc-Proteinexpression in HL60-Zellen nicht geeignet sind, owbohl diese normalen Oligodesoxynucleotide in der Lage sind, eine normale Lymphozytenvermehrung und eine c-myc- Proteinexpression zu verhindern. Es scheint, daß diese Unzulänglichkeiten der normalen Oligodesoxynucleotide, nämlich Fehlen einer längeren Hemmungswirkung und erforderliche hohe Konzentrationen selbst für kurzzeitige Wirksamkeit, auf enzymatischer Hydrolyse im Verlauf des Experiments beruhen.
Heikkila u. a. beschreibt in Nature, 328, 30. Juli 1987, Seiten 445 bis 449, daß ein c-myc-Oligodesoxynucleotid bei der Lymphozyten-Mitogenese den Eintritt in die 5-Phase hemmt. Kleine Antisinn-Oligomere wurden zu Sammelzellkulturen zugegeben. Ein zum Startcodon und 4 stromabwärtigen Codonen menschlicher c-myc-RNA komplementäres Pentadekadesoxyribonucleotid hemmt eine Mitogen-induzierte c-myc-Proteinexpression in menschlichen T-Lymphozyten und verhindert den Eintritt in die 5-Phase.

Wesentliche Literaturstellen

Die japanische Patentveröffentlichung 61 12 215 (1983) bezieht sich auf ein Verfahren zur Hemmung des Tumorzellenwachstums unter Verwendung von Oligo-DNA.
Das US-Patent 3 687 898 für Merigan et al betrifft die Synthese von synthetischen Polynucleotiden einschließlich Thioaten.
5Das US-Patent 4 511 713 für Miller et al betrifft die Hemmung der Replikation fremder Nucleinsäuren mit einem Alkyl- oder Aryl-Oligonucleotid-Phosphonat, das komplementär zur angegebenen Sequenz der fremden Nucleinsäure ist.
Stec u. a., J. Org. Chem., 50 (20):3908-3913, 1985, behandelt die automatische Synthese von Phosphorthioaten.
Stec u. a., J. of Chromatography, 326:263-280, 1985, und LaPlanche u. a., Nuclei Acids Research, 14 (22):9081-9093, 1986, behandeln die bevorzugten vorliegenden Verbindungen. Stec behandelt Phosphorthioat-Analoge von Oligodesoxyribonucleotiden, und LaPlanche betrifft Phosphorthioat-modifizierte Oligodesoxyribonucleotide.
C. C. Smith u. a., PNAS, USA, 83:2787-2791 (Mai 1986), behandelt die antivirale Wirkung eines Oligo-(Nucleosid- Methylphosphonat)-Komplements zur Spleißverbindung des Herpes-Simplex-Virus Typ I.
Zamecnik u.a. PNAS, USA, 83:4143-4146 (Juni 1986), betrifft die Replikationshemmung von HTLV-III durch exogene synthetische normale Oligonucleotide, die komplementär zu viraler RNA sind.
Stec u.a. in J. Am. Chem. Soc. 106:6077, 1984, behandelt synthetische Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotid-Analoge.
Broder u.a., Proc. National Acad. Sci. USA 84:7706-7710, 1987.
Gemäß einen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgesehen, die ein in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegendes Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotid zur Verwendung bei der Verhinderung von durch Replikation fremder Nucleinsäuren in Anwesenheit normaler lebender Zellen verursachter Krankheit enthält.
Nach einem weiteren Aspekt beinhaltet die Erfindung eine pharmazeutische Verbindung zur Verhinderung von durch Replikation fremder Nucleinsäuren in Anwesenheit normaler lebender Zellen verursachter Krankheit mit der Formel (I):
wobei n eine ganze Zahl von 5 bis 30 ist, B aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymidin (T) ausgewählt ist, und X aus S und O ausgewählt ist, so daß die Verbindung der Formel I eine Antisinn-Sequenz darstellt.
Nach einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung zur Unterdrückung von HTLV-III der Formel II enthält:
wobei n eine ganze Zahl von 5 bis 30 ist, und B aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) oder Thymidin (T) ausgewählt ist.
Nach einem anderen Aspekt schließt die Erfindung die Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von durch Expression einer fremden Nucleinsäure wie beispielsweise eines Oncogens oder HTLV-III verursachter Krankheit ein, wobei das Medikament eine Zusammensetzung mit einer Verbindung der Formel I enthält:
wobei n eine ganze Zahl von 5 bis 30 ist, B aus Adenin < A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) ausgewählt ist, und X aus S und O ausgewählt ist, mit der Maßgabe, daß mindestens ein X in der Verbindung S ist, um eine spezifische "Antisinn"-Sequenz zu einem Teil der fremden Nucleinsäure herzustellen.
Nach einem noch weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung die Verwendung bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhinderung von durch Replikation fremder Nucleinsäuren in Anwesenheit normaler lebender Zellen verursachter Krankheit, die Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotid in einem pharmazeut isch annehmbaren Träger enthält.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zur Verhinderung der Replikation fremder Nucleinsäure in normalen lebenden Zellen in vitro, wobei die Zellen einer replikationshemmenden Menge eines aligodesoxynucleotids nach obiger Formel I ausgesetzt werden, wobei n eine ganze Zahl von 5 bis 30 ist, B aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymidin (T) ausgewählt ist, und X aus S und O ausgewählt ist, mit der Maßgabe, daß mindestens ein X in der Verbindung S ist, so daß die Verbindung nach Formel I eine Antisinn- Sequenz ist, und wobei das Oligodesoxynucleotid eine Basensequenz aufweist, die komplementär zur einer Basensequenz des Human-Immundefektvirus (HIV) ist.
Nach einem anderen Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung der Replikation und cytopathischer Wirkungen von fremder Nucleinsäure in Zellen in Vitro, wobei die Zellen einer replikationshemmenden Menge eines Oligodesoxynucleotids nach obiger Formel II ausgesetzt werden, wobei n eine ganze Zahl von 5 bis 30 ist, und B aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C), oder Thymidin (T) ausgewählt ist.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mängel im Stand der Technik zu überwinden, wie sie beispielsweise oben erwähnt sind.
Weiter ist es Aufgabe der Erfindung, Verbindungen zu schaffen, die wirksame antivirale Agenzien gegen Retroviren darstellen.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung von Verbindungen, die wirksame antivirale Agenzien gegen HIV in menschliche T-Zellen darstellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Hemmung der Expression eines Oncogenprodukts und das Bewirken des Aufhörens von Zellwachstum; und noch eine weitere Aufgabe ist die Schaffung von Verbindungen, die dieses Ergebnis herbeiführen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist das Unterdrücken der Vermehrung neoplastischer Zellen, und noch eine weitere Aufgabe ist die Schaffung von Verbindungen, die als spezifische Behandlungen zum Bewirken dieses Ergebnisses eingesetzt werden können.
Phosphorthioate sind Verbindungen, in denen eines der nicht brückenbildenden Sauerstoffatome im Phosphatteil des Nucleotids durch Schwefel ersetzt ist. Diese Phosphorthioate haben mehrere Eigenschaften, die sie zu möglicherweise vorteilhaften anti-retroviralen Analogen machen. Diese Verbindungen sind gegen Spaltung durch Nucleasen stabil und, weil sie die gleiche Ladungszahl wie normale Oligodesoxynucleotide haben, eine gute Wasserlöslichkeit aufweisen. Diese Verbindungen zeigen eine wirksamere Hybridisierung mit einer komplementären DNA-Sequenz als die entsprechenden Methylphosphonat- Analoge.
Es hat sich auch gezeigt, daß die Phosphorthioat-Desoxynucleotide mit normalen Desoxynucleotiden in der gleichen Weise wie ein Blockcopolymer kombiniert werden können, um die Vermehrung von Oncogenen zu hemmen. Alternativ können die Phosphorthioat-Desoxynucleotide mit normalen Desoxynucleotiden in zu Phropfpolymeren analogen Verbindungen kombiniert werden, in welchen die Phosphorthioat-Derivate an beiden Enden der Kette angeordnet sind und die normalen Desoxynucleotide innen in der Kette liegen.
Deshalb können, wenn R¹ die Phosphorthioad-Desoxynucleotidgruppe bezeichnet und R² die normale Desoxynucleotidgruppe bezeichnet, die Verbindungen beispielsweise folgende Formeln haben:
R¹-R² ... R²-R² ... R¹-R¹ ... R²-R² ... R¹-R¹ (III)
und
R¹-R²-R² ... R¹ (IV)
Es hat sich gezeigt, daß die Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung HIV und das HL-60-Zellenwachstum bei ziemlich niedrigen Konzentrationen, etwa 1 bis 20 Mikromol in vitro, hemmen. In vivo wird bevorzugt, eine Konzentration des aktiven Ingredienten von etwa 0,1 Mikromol bis etwa 100 Mikromol pro cl Blut zu verwenden. Diese Konzentration kann nach einer Vielfalt von Dosierungsmethoden erhalten werden, die nachstehend noch beschrieben werden.
Die Methode von Stec u. a. in J. Org. Chem. 50 (20): 3908- 3913 (1985) zur automatischen Synthese von Phosphorthioat- Oligodesoxynucleotiden stellt ein zweckmäßiges Verfahren zum synthetischen Herstellen der gewünschten Verbindungen dar. Alternativ beschreibt Merigan u. a. im US-Patent 3 687 808 ein anderes Verfahren zum Herstellen der Thioat-Ester. Jedoch ist keines dieser Verfahren effizient genug, um eine routinemäßige synthetische Herstellung ausreichender Mengen dieser Verbindungen für genetische Untersuchungen zu ermöglichen.
Die Oligidesoxynucleotide nach der vorliegenden Erfindung hemmen, wie sich gezeigt hat, die Expression der integrierten viralen Genome. Die Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotide nach der vorliegenden Erfindung haben geeignete chemische Eigenschaften, nämlich die Fähigkeit zum Hybridisieren mit komplementärer DNA/mRNA unter physiologischen Bedingungen, und bessere Löslichkeitseigenschaften mit Bezug auf Methylphosphonate. Darüber hinaus sind die Thioester in biologischen Medien genausogut möglich wie die Elternverbindungen. Bei der Beobachtung der ³¹P-NMR-Spektren der ODN-1-Sequenz, sowohl unmodifiziert als auch als Phosphorthioat-Analog, hat sich gezeigt, daß das unmodifizierte Oligodesoxynucleotid eine Halbwertszeit von etwa 17 Stunden hatte, während die Phosphorthioat-Bindungen sogar nach 10 Tagen noch intakt waren, im Rahmen der Genauigkeit der ³¹P-NMR-Messung (weniger als 5 % Zersetzung basierend auf der Gesamtintensität).

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt einen Vergleich der Anti-HIV-Aktivität in drei Abschnitten von Oligo-dc-S und Oligo-dA-S.
10 Fig. 2 zeigt die synergistische Verstärkung der antiviralen Aktivität der Kombination von 2',3'-Didesoxyadenosin und S- dC14.
Fig. 3 zeigt die Wirkung von 5-AS auf HL60-Zellenwachstum.
Fig. 4 zeigt die Wirkung von S-AS-Oligodesoxynucleotiden zur Hemmung der DNA-Synthese in HL60-Zellen.
Fig. 5 zeigt die DNA-Sequenz des kodierenden Exons des art/trs-Gens in HTLV-III-BH10 und die Sequenzen der getesteten Oligodesoxynucleotide.
Fig. 6 zeigt einen detaillierten Vergleich der Anti-HIV- Aktivität zwischen 14-mer und 28-mer von S-dCn.
Fig. 7 zeigt die Wirkung der N-Methylierung von Thymin auf die antivirale Aktivität von S-ODN-1.
Fig. 8 zeigt die Hemmung der de-novo-HIV-DNA-Synthese in dem Virus ausgesetzten ATH8-Zellen durch 28-mer von Oligodesoxycytidin-Phosphorthioat.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Die normalen Oligodesoxygonucleotide, Methylphosphonat-Oligodesoxynucleotide und Phosphorthioat-Oligodesoxynucleothide können entweder durch die Standardlösungsverfahren oder durch Modifizierung des Verfahrens nach Stec u. a. in J. Am. Chem. Soc. 106, 6077-6089 (1984) unter Verwendung eines automatisierten Synthetisierers synthetisch hergestellt werden, beispielsweise mit dem Modell 380-B von Applied Biosystems Inc. nach der Phosphoramidit-Methode.
Das Reinigen der Verbindungen erfolgte durch Umkehrphasen- Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Die Anwesenheit von P-S-Bindungen in den Phosphorthioaten wurde unter Verwendung von ³¹P-NMR-Spektroskopie gezeigt. N3-Methylthimidin wurde zubereitet und in die geschützte Phosphoramididform umgesetzt und in die Oligomersynthese eingebracht.
Die Phosphorthioate nach der vorliegenden Erfindung können in einem DNA-Synthetisierer Applied Biosystems 380-B in ähnlicher Weise wie bei dem Synthesezyklus für normale Phosphatoligonucleotide unter Verwendung von U-Methlyphosphoramidit synthetisch hergestellt werden. Der Hauptunterschied liegt in den während der Oxidationsstufe verwendeten Reagenzien.
Eine 5-%ige Schwefellösung. bestehend aus 7,5 g elementarem S&sub8;-Schwefel, der zuerst in 71 ml Kohlendisulfid zusammen mit 71 ml Pyridin und 7,5 ml Triethylamin aufgelöst wird, wird als oxidierendes Reagens verwendet. Dieses Reagens befindet sich in Flasche Nr. 13 im 380-B-Synthetisierer. Das gegebene Gesamtvolumen reicht für eine Dreisäulensynthese eines 30-mer aus.
Vor und nach dem Oxidationsschritt wird die Säule wiederholt mit einer 1:1-Lösung von Kohlendisulfid und Pyridin in Flasche Nr. 16 ausgewaschen, um restlichen Schwefel zu beseitigen, der in den Leitungen ausgefällt werden könnte. Für eine Dreisäulensynthese eines 30-mers müßte ein Gesamtvolumen von 380 ml dieser Lösung ausreichend sein.
Die verwendeten Lösungen müssen so wasserfrei wie möglich sein, und sollten für jede neue Synthese neu hergestellt werden.
Die Schwefeloxydation erfolgt nicht so schnell wie die Jodoxydation und benötigt dehalb einen Warteschritt von 450 Sekunden während des Synthesezyklus gegenüber 30 Sekunden Warteschritt für die Jodoxydation. Außerdem wird das Endverfahren geringfügig verändert, in dem der Rückfluß 5 Sekunden länger als normal während einer Gesamt zeit von 10 Sekunden gehalten wird, um die Entfernung irgenwelcher sich ergebender Salze sicherzustellen, die in Methanol aufgelöst sind, nachdem Thiophenol in die Säule zugeführt worden ist. Natürlich sind Veränderungen möglich und für den Durchschnittsfachmann ohne mehr als Routineversuche auch offensichtlich.
Oligodesoxynucleotide mit Phosphorthioatblöcken an den 3'- bzw. 51-Enden wurden durch automatisches Verändern des Oxidationszyklus an der notwendigen Stelle synthetisch hergestellt. Nach Abspalten von der Säule und Entblocken in wäßrigem Ammoniak (60ºC, 10 Stunden) wurden Phosphorthioat und Blockcopolimere durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gereinigt (PRP-1-Säule, 1 % Triethylammoniumacetatpuffer, pH 7, Acetonitril (20 %, Steigerung auf 40 % nach 20 Minuten)), und die Lösung wurde mit zwei gleichen Volumen von Ethylacetat, das in Trockeneis gefroren war, extrahiert und lyophilisiert. Die Feststoffe wurden in 0,3 ml 1-molarer NaCl-Lösung aufgelöst, und das Produkt wurde durch Zugabe von 3,5 Volumen von absolutem Ethanol ausgefällt. Die Acetatsalze einiger Phosphortioat-Oligomere, insbesondere des Homopolymers dC&sub2;&sub8;, sind in 1-molarer NaCl-Lösung extrem unlöslich. Das Einführen einer kleiner Menge von Ammoniakdampf, nicht-wäßrigem Amoniak, durch eine Pasteur-Pipette machte alle Feststoffe löslich. Die durch Extinktion bei Lambda max bestimmte Ausbeute betrug etwa 30 %.
Die Antisinn-Sequenz und die Kontrollsinn-Sequenz und die Nichtsinn-Sequenz (gleiche Zusammensetzung wie Antisinn- Sequenz, aber in zufälliger Folge) sind nachstehend dargestellt:
Anti-Sinn: 5'-AAC GTT GAG GGG CAT
Nicht-Sinn: 5'-CTG AAG TGG CAT GAG
Diese Verbindungen wurden unter Verwendung der Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie und Ausfällung durch Ethanol gereinigt.
Für die unten beschriebenen biologischen Tests wurde eine Sequenz (S-ODN-1), das Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotid, ausgewählt, die ein Antisinn-Gegenstück zu der Nucleotidsequenz ist, die in den tat-III und art/trs-Genen von HIV existiert, da diese Gene für die virale Replikation wesentlich sind. Dieses Antisinn-Oligodesoxynucleotid kann die Expression von tat-III- und art/trs-Genen blockieren. Eine Sequenz (S-ODN-2) wurde ausgewählt, die komplementär zu der Sequenz an der Initiationsstelle des tat-III ist. Zusätzliche "zufällige" Sequenzen (S-ODN-5, Oligo-dA, und Oligo-dC) waren ebenfalls von Interesse. S-ODN-5, das in HIV weder als Antisinn- noch als Sinn-Sequenz existiert, hat den gleichen Inhalt wie dA-, dG-dC- und dT-Reste und S-ODN-1, ist aber ansonsten mit Bezug auf S-ODN-1 irrelevant. Oligo-dA und Oligo- dC wurden mit 5-, 14-, und 28-Nucleotideinheiten eingesetzt, um die Wirkungen der Kettenlänge zu untersuchen.
Wie oben definiert, ist eine Antisinn-Basensequenz eine zur genetischen Target-Information komplementäre Sequenz, die zum selektiven Unterdrücken der Genexpression dienen kann.
Mit Bezug auf die Hemmung der Zellenvermehrung enthalten promyelocytische Leukämiezellen verstärkte Kopien des c-myc- Gens, also eines Gens, das für eine als Onkogene bekannte Klasse von Genen repräsentativ ist, d.h. für zelluläre Gene, deren Deregulierung bei der Tumorentstehung beteiligt ist.
Bei dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung hat sich gezeigt, daß Phosphorthioat-oligodesoxynucleotid-Analoge mit der gleichen Antisinn-Sequenz, wie zuvor beschrieben (d.h. komplementär zum Start-codon des c-myc-Gens) die Vermehrung von HL60-Zellen hemmen, siehe Figuren 3 und 4.
Es hat sich gezeigt, daß nur die Antisinn-Sequenz eine signifikante Hemmung der Zellenvermehrung erzeugte, wie durch Zellenzählung gemäß der Darstellung in Fig. 3, und durch 3H- Tymidin-Einbau gemäß Fig. 4, sowie durch Reduktion von c-myc- Protein gemessen wurde. Die Wirkungen dauerten bis zu 3 Tagen bei Verwendung von Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotid- Konzentrationen, die beträchtlich niedriger (d.h. weniger als 1 %) als diejenigen waren, die bei dem normalen Oligomer zum Erreichen einer realen Wirkung erforderlich waren.
Fig. 3 zeigt Antisinn- (obere Tafel) und Nichtsinn-Sequenzen (untere Tafel), die am Tag 0 der Zellkultur in Dreifachmulden einer 96-Mulden-Mikrotiterplatte zugegeben wurden, und Zellenzahlen, die täglich in allen Kulturen bestimmt worden sind. Antisinn-S-Oligosdesoxinucleotide hemmten das Wachstum bei Endkonzentrationen zwischen 0,5 und 10 Mikroliter. Während 0,1-mikromolare Konzentrationen von Coantisinn wirksam waren, konnten nicht alle Nichtsinn-S-ODN-Konzentrationen die Zellenvermehrung beeinträchtigen.
Um die in Fig. 4 gezeigten Ergebnisse zu erhalten, wurden Nichtsinn- oder Antisinn-S-Oligodesoxynucleotide mit einer Endkonzentration von 50-mikromolar am Tag 0 zu Zellen zugegeben, die mit 3 x 105/ml geimpft wurden. Die DNA-Synthese wurde am Tag 1 durch Inkubieren von Zellen mit 1 mikroCi-³H- Thymidin während 4 Stunden bestimmt, wonach 10-%ige Trichloressigsäure zugegeben wurde und säureausfällbare Radioaktivität auf Whatman-Glasfaserfiltern aufgefangen wurde. Die Filter wurden einer Flüssig-Scintillationszählung unterzogen, um die Radioaktivitätswerte zu bestimmen.
Der Effekt wurde dreimal reproduziert, und keine der verwendeten Kontrollen, nämlich der Nichtsinn-Sequenz, hat eine ähnliche Aktivität gezeigt. Infolgedessen ist die beobachtete Vermehrungshemmung einzigartig dem spezifischen Oligodesoxynucleotid-Analog der hier beschriebenen präzisen Basensequenz zugeordnet. Die Verwendung dieser Verbindung in vivo könnte im Aufhören des Wachstums eines Tumors resultieren, dessen Vermehrung von der Anwesenheit des c-myc-Gens abhängig ist. Durch Extrapolation hemmen die zu Sequenzen anderer Oncogene komplementären S-Oligodesoxynucleotide das Wachstum von Tumoren, in denen diese Oncogene exprimiert werden.
Tafel 1 enthält eine Liste der Verbindungen, die für die antiviralen Tests synthetisch hergestellt wurden. Jeder der Verbindungen wurde zweckmäßigkeitshalber für die Erörterung ein Trivialname gegeben, und jede Verbindung weist die durch die herkömmliche Nomenklatur für Polynucleotide angegebene Molekolarstruktur auf, mit der Ausnahme, daß jede durch ein tiefgestelltes bezeichnete Internucleotid-Verkettung ein Rp, Sp-Phosphorthioat ist, wobei der mittlere Schwefelgehalt größer als 95 % nach der ³¹P-NMR-Analyse ist.
Es hat sich gezeigt, daß längere Oligos potentere Wirkungen hatten, und daß Oligo-dC-Phosphorthioat eine größere Potenz als Oligo-dA-Phosphorthioat auf der Basis der Molarität der Verbindungen hatte. Daher führt die Bindung der Oligos an die relevante(n) Polynucleotidstelle(n) und/oder die HIV-Reverse- Transkriptase (als Primer) des Virus zum Schutz gegen die cytopathischen Wirkungen von HIV. Tafel 1 Repräsentative Testverbindungen Trivialname Sequenz (5'-3') von Phosphorthioat-Analogen von Oligodesoxyribonucleotiden Oligo-dC S-ODN (Phosphorthioat-Analog-d) = Oligodesoxynucleotide oder Phosphorthioate, wobei dA und dC Verbindungen der Formel I sind.
Fig. 1 zeigt einen Vergleich von Anti-HIV-Aktivität in drei Abschnitten von Oligo-dC-S und Oligo-dA-S. Es hat sich gezeigt, daß Oligo-dC-Phosphorthioat-28-mer virale Replikation hemmt und ATH8-Zellen bei einer Konzentration von 3 Mikromol zu 100 % schützt, vergleiche Fig. 1 und Tafel 1. Die Targetzellen (2 x 105 ATH8-Zellen) in jedem Röhrchen wurden mit der angegebenen Konzentration jedes Oligomers während 16 Stunden vorbehandelt und dann mit Polybren während 45 Minuten inkubiert. Nach Zentrifugieren wurde jede Gruppe von tablettierten Zellen HIV ausgesetzt (500 Virionen pro Zelle, was eine höhrere Dosis als die minimale cytopathische Dosis darstellt) und während einer Stunde inkubiert. Komplettmedium (2 ml RPM11640), ergänzt mit L-Glutamin (4 mM), 2-Mercaptoethanol (5 x 10-2M), Penicillin (50 Einheiten/ml), und Streptomycin (50 Mikrogramm/ml), und mit 15 % fötalem Kälberserum und IL-2 (15 % von herkömmlichem IL-2 von Advance Biotechnologies, Inc., Silver Spring, MD, Plus 20 Einheiten/ml von rekombinantem IL-2 von Amgen Biochemicals, Thousend Oaks, CA) wurde mit den verschiedenen Konzentrationen von Oligomeren zugegeben. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde in einem Hämozytometer unter Anwendung der Tripanblau-Ausschlußmethode für den Tag 7 nach dem Kontakt mit dem Virus gezählt. Ausgefüllte Säulen stellen dem Virus nicht ausgesetzte Zellen dar, und nicht ausgefüllte Säulen stellen dem Virus ausgesetzte Zellen dar. Die hemmenden Wirkungen von S-dCn sind größer und dauerhafter als diejenigen von S-dAn für 14-mer und 28-mer. Die längeren Sequenzen haben sich als wirksamer als die kürzeren erwiesen.
Es gibt mehrere mögliche Mechanismen der antiviralen Aktivität der Oligos, wie beispielsweise die Hemmung der reversen Transkriptase, oder direkte Wirkungen gegen virale Partikel. Experimente unter Verwendung eines Tests auf reverse-Transkriptase-Aktivität zeigten keine signifikante Hemmung der Enzymaktivität.
Die Phosphorthioate nach der vorliegenden Erfindung können mit irgendwelchen pharmazeutisch annehmbaren Trägern eingesetzt werden, wie beispielsweise mit Wasser, Kochsalzlösung, menschlichem Blut und anderen annehmbaren Trägern.

HIV-Kultur mit Oligodesoxynucleotiden

Die Hemmung der cytopathischen Wirkung von HIV mit Oligodesoxynucleotiden wurde mit 18 Stunden Vorbehandlung von 2 x 10&sup5; Targetzellen (ATH8 Zellen) mit Oligos durchgeführt, bevor sie HTLV-IIIB ausgesetzt wurden. Nach dieser Vorbehandlung wurden die Targetzellen mit Polybren (2 Mikrogramm/ml) während einer Stunde vorbehandelt. Die Targetzellen wurden dann dem HTLV- IIIB-Virus (in dieser Versuchsreihe im allgemeinen 500 Virionen pro Zelle) während einer Stunde ausgesetzt. Die 2 x 10&sup5; Zellen wurden dann mit Komplettmedien, die IL-2 und verschiedene Konzentrationen von Oligos enthielten, auf 2 ml verdünnt.
Die Anzahl der lebenden Zellen wurde in einem Hämocytometer unter Verwendung der Tripanblau-Ausschlußmethode am Tag 7 nach der Berührung mit dem Virus gezählt. Jede Gruppe von Daten wurde von gleichzeitig durchgeführten Experimenten erhalten, um so einen genauen Vergleich unter den getesteten Agenzien zu erhalten.

Bestimmung der HIV-gag-Proteinexpression

Der Prozentsatz von p24-gag-Protein von HIV exprimierenden Zellen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz-Mikroskopie unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Anti-HIV-p24- Antikörpers bestimmt.

Southern-Blotting-Analyse

Targetzellen (1 x 10&sup7; ATH8-Zellen) wurden mit oder ohne S- dC28 mit verschiedenen Konzentrationen während 16 Stunden vorbehandelt, sodann mit Polybren behandelt, dem HIV ausgesetzt (500 Viruspartikel pro Zelle), wiedersuspendiert, und in Anwesenheit oder Abwesenheit von S-dC28 kultiviert. An den Tagen 4 und 7 nach der Berührung mit dem Virus wurde DNA mit hohem Molekulargewicht extrahiert, mit Asp718 (einem Kpn-I- Isoschizomer von Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) abgebaut, und, mit einem markierten Einsatz eines molekularen Klons der env-Region von HTLV-III (BH10), die ein 1,3-kb-Bgl-II-Fragment enthält, der Southern-Blotting-Analyse unterzogen.
Die Ergebnisse der antiviralen Wirkung und der Cytotoxizität von Oligodesoxynucleotiden sind in Tafel 2 dargestellt.
Die getesteten beiden n-Oligodesoxynucleotide und ein M- Oligodesoxynucleotid zeigten keine signifikanten Hemmwirkungen, während sämtliche S-Oligodesoxynucleotide eine signifikante Hemmung der cytopathischen Wirkung von HIV zeigten. Überraschenderweise erwies sich der 14-mer- Phosphorthioat-Homo-Oligomer von dC (S-dC14) als die potenteste antivirale Verbindung unter den getesteten Verbindungen in dieser Versuchsreihe. Da Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotide, die keine Antisinn-Sequenzen sind, sehr wirksame antivirale Agenzien zu sein scheinen, wurde ein Versuch unternommen, um die Natur der Basenzusammensetzungswirkung zu klären. Bei einem Vergleich der Wirkungen von 5 Mikromol jedes der getesteten 14-mer-Phosphorthioate hat sich gezeigt, daß die Hemmung der viralen cytopathischen Wirkung ungefähr linear mit Bezug auf den G+C-Gehalt des Analogs verlief (vergleiche Daten aus Tafel 2). Tafel 2 Verbindung Antivirale Wirkung % Cytotoxizität %

Vergleich der Anti-HIV-Aktivität in verschiedenen Längen von Oligo-dC- und Oligo-dA-Phosphorthioaten

Da es möglich ist, daß Schwankungen zwischen einzelnen Versuchen zu einem unzutreffenden Vergleich der antiviralen Aktivität unter den Agenzien führen können, wurden die Versuche alle gleichzeitig durchgeführt, um präzisere Vergleiche anstellen zu können.
Bei dem Vergleich nach Fig. 6 der Anti-HIV-Aktivität zwischen dem 14-mer und dem 28-mer (siehe Fig. 1) hat sich gezeigt, daß offensichtlich eine Längenwirkung vorhanden ist, selbst bei einer Steigerung von mehreren Nucleotidlängen, die nur drei Nucleotide kurz sind.
Wie in Fig. 1 dargestellt ist, sind die Hemmwirkungen von S-dCn größer und dauerhaf ter als diejenigen von S-dAn sowohl bei 14-mer als auch bei 28-mer, während 5'-Mere in beiden Kategorien die cytopathische Wirkung des Virus nicht signifikant hemmen konnten. Die Reihenfolge der Wirksamkeit der Homo-Oligomere war dC> dT dA≥für 14-mer. Es hat sich gezeigt, daß, je länger die Sequenzen waren, desto wirksamer diese als die kürzeren Sequenzen bei der gleichen molaren Konzentration von Nucleotideinheiten waren. Beispielsweise ergab, wie in Fig. 6 gezeigt ist, das 28-mer-S-dC28 bei Konzentrationen von nur 0,5 Mikromol (13,5 Mikromol Nucleotid-Äquivalente) einen vollständigen Schutz gegen das Virus, während das entsprechende 14-mer bei 5 Mikromol (65 Mikromol Äquivalente) nur eine mäßige Wirkung hatte. Das S-dC28 ergab die besten und dauerhaftesten antiviralen Wirkungen unter den bei diesen Experimenten verwendeten Bedingungen. Diese Daten lassen einen wirklichen Längeneffekt vermuten und sprechen gegen eine Metallion-Chelatverbindung oder Zersetzung zu reaktiven Monomeren.

Wirkung der N3-Methyl-Thymidin-Substitution in einem ODN-Analog auf die Anti-HIV-Aktivität

In Fig. 5 ist N-Me-ODN-1 eines N3-Methyl-Thymidin enthaltenden Antisinn-Oligodesoxynucleotids gezeigt, das ein methyliertes Thymidin an den Positionen 4 und 9 aufweist. Das Zufallssequenz-ODN-4 weist den gleichen Basengehalt wie das ODN-1 auf, hat aber weniger als 70% Homologie mit irgendeiner Sequenz in der HTLV-III-BH10-Genomsequenz als Antisinn- oder als Sinn-Sequenz. Die Homo-Oligomere von dC und dA wurden in drei Längen, wobei n 5, 14 und 28 betrug, synthetisch hergestellt.
Das N3-Methyl-Thymidin enthaltende S-ODN-1 zeigte keine Anti- HIV-Aktivität, während das S-ODN-1 durchweg eine wesentliche Aktivität gegen HIV zeigte, wie in Fig. 7 dargestellt ist. Da die N3-Substitution an der Pyrimidin-Base bekannt ist, um die Wasserstoffbindung an komplementäre Adenosin-Reste stark zu verringern, läßt die relative Inaktivität dieses N3-Methyl- Thymin enthaltenden Phosphorthioat-Analogs vermuten, daß die antivirale Aktivität durch Bindung mindestens eines Mechanismus an Nucleotidsequenzen zuwege gebracht werden könnte.

Hemmung der de-novo-Synthese von HIV-DNA in dem Virus ausgesetzten ATHA-Zellen durch das 28-mer von Oligodesoxycytidin-Phosphorthioat

Fig. 8 zeigt die Hemmwirkung des Phosphorthioat-Oligodesoxycytidin-Analogs (S-dC28) auf die de-novo-Synthese von HIV-DNA in Targetzellen. An den Tagen 4 und 7 nach der Berührung mit dem Virus wurde eine wesentliche Menge viraler DNA durch Southern-Blotting-Analyse ohne antivirale Agenzien nachgewiesen. S-dC28 sowie 2', 3'-Didesoxyadenosin als Positivkontrolle bewirkten eine beträchtliche Hemmung der de-novo-Synthese viraler DNA bei Konzentrationen von nur 1-mikromolar.
Am Tag 4, in den Bahnen A bis E dargestellt, und am Tag 7, in den Bahnen F bis J dargestellt, nach der Berührung mit dem Virus wurde DNA mit hohem Molekulargewicht extrahiert. Die Bahnen A und F enthalten DNA aus ATH8-Zellen, die dem Virus ausgesetzt und nicht durch S-dC28 geschützt waren. Die Bahnen D und G, C und H, D und I enthalten DNA aus ATH8-Zellen, die mit 1 Mikromol bzw. 5 Mikromol bzw. 7 Mikromol S-dC28 vorbehandelt und kultiviert wurden. Die Bahnen E und J enthalten DNA aus ATH8-Zellen, die mit 50 Mikromol 2',3'-Didesoxyadenosin behandelt wurden, und die Bahn K enthält DNA von ATH8- Zellen, die nicht dem Virus ausgesetzt waren. Das 2,7-kB-env enthaltende innere KPN-I-Fragment des Virusgenoms wurde nur in den Bahnen A und F nachgewiesen.

Keine Hemmung der Expression von viralem Protein durch 28-mer-Oligodesoxycytidin-Phosphorthioat (S-dC28) in chronisch HIV-infizierten Zellen

Wie in Tafel 3 dargestellt ist, konnte S-dC28 die gag-Protein-Positivität der Target zellen in chronisch HIV- infizierten H9-Zellen bei Konzentrationen selbst von 25 Mikromol während der Dauer des Experiments, 120 Stunden, nicht verringern, wie durch indirekte Immunfluoreszenzuntersuchung festgestellt wurde. Tafel 3 Prozentsatz von gag-positiven Zellen (Stunden in Kultur mit Verbindung) Mikromol

Synergistische Verstärkung der antiviralen Aktivität von 2',3'-Didesoxyadenosin durch 14-mer- Oligodesoxycytidin-Phosphorthioat

Es wird betont, daß die verschiedenen Didesoxynucleoside einschließlich Azidothymidin (AZT), Didesoxycytidin, und Didesoxyadenosin, eine anabolische Phosphorylierung innerhalb der Target zellen benötigen, um aktive anti-retrovirale Agenzien zu werden. Die Wirkungsmechanismen scheinen konkurrierende Hemmung der reversen Transkriptase und/oder Termination entstehender DNA-Kettenbildung zu sein.
Fig. 2 zeigt die Wirkung der Kombination von 2',3'-Didesoxyadenosin und S-dC14. Synergistische Wirkungen wurden mit 35 einer Kombination von S-dC28 oder S-dC14 und einem Didesoxynucleotid erhalten. Die Targetzellen (2 x 10&sup5; ATH8-Zellen pro Röhrchen) wurden mit den angegebenen Konzentration von S-dC14 während 24 Stunden vorinkubiert und mit 2 Mikrogramm/ml Polybren während 50 min vorbehandelt. Nach dem Zentrifugieren wurden pelletisierte Zellen dem HIV (1000 Virionen pro Zelle) während einer Stunde ausgesetzt. Die Zellen wurden in 2 ml Komplettmedium inkubiert, das IL-2 enthielt, und die lebensfähigen Zellen wurden am Tag 13 gezählt.
Die Oligomere nach der vorliegenden Erfindung wirken wahrscheinlich nach unterschiedlichen Mechanismen und würden nicht erwarten lassen, daß sie eine anabolische Phosphorylierung benötigen. Jedoch, wie in Fig. 2 gezeigt ist, ergab die Kombination von 2',3'-Didesoxyadenosin und 14-mer-Oligodesoxycytidin-Phosphorthioat eine ausgeprägte synergistische Verstärkung der antiviralen Aktivität. Zum Beispiel zeigten 2 Mikromol Didesoxyadenosin mit 5 Mikromol S-dC14 einen kompletten Schutz der Targetzellen gegen die virale cytopathische Wirkung, während jedes der beiden Agenzien allein nur marginale Schutzwirkungen in diesem Versuch zeigte.
Für die in Fig. 2 gezeigte Verstärkung der anitviralen Aktivität wurden die Target zellen mit verschiedenen Konzentrationen von S-dG14 während 16 Stunden vorbehandelt und dann mit 2 Mikrogramm/ml Polybren vorbehandelt, während einer Stunde 1000 Viruspartikeln pro Zelle ausgesetzt wieder in 2 ml Komplettmedium mit IL-2 mit oder ohne verschiedene Konzentrationen von 2',3'-Didesoxyadenosin resuspendiert. Am Tag 13 nach der Berührung mit dem Virus wurden lebensfähige Zellen durch die Trypanblau-Ausschlußmethode gezählt. Diese Experimente ergaben einen potenteren viralen Impfstoff für eine längere Dauer als bei den anderen hier beschriebenen Experimenten.
Wie in Tafel 2 gezeigt ist, zeigten nur Phosphorthioat- Analoge eine Anti-HIV-Aktivität. Daher wird vermutet, daß es hauptsächlich die relative Resistenz der Phosphorthioat-Analoge gegen Nucleasen ist, die sie gegenüber n-Oligodesoxynucleotiden beständig hält und ihnen ermöglicht, die Targetstelle zu erreichen und dort zu verbleiben. Dies wird in Bezug auf die im in-vitro-Testsystem verwendeten Medien durch Verfolgen de 31 NMR-Spektren der n-ODN-1- und S-ODN-1-Verbindungen als Funktion derzeit gestützt. Das Aufbrechen des normalen Oligodesoxynucleotids war aus dem Aufbau der terminalen Phosphatspitze ersichtlich, die eine Halbwertszeit von etwa 17 Stunden unter diesen Bedingungen anzeigt, während die 5-Analoge selbst nach einer Woche noch keine signifikante Zersetzung zeigten, wobei die Genauigkeit der Methode besser als 5 % Fehlermöglichkeit ist.
In ähnlicher Weise zeigten Proben einer Lösung von S-Oligodesoxynucleotiden, die aus dem cytopathischen in-vitro-Versuch entnommen und in menschlichem Serum bei 37ºC inkubiert worden sind, auch nach 7 Tagen keine Zersetzung. Die Inaktivität eines Methylphosphonat-Analogs (M-ODN-1) in dem cytopathischen Hemmungsversuch könnte wegen seiner schlechten Fähigkeit zum starken Hybridisieren zu der Targetsequenz begründet sein.
Die Potenz der Anti-HIV-Aktivität von S-dC28, eines der potentesten getesteten Analoge, ist nahezu vergleichbar mit derjenigen von 2',3'-Didesoxycytidin auf Molaritätsbasis, d.h. beide Agenzien zeigten vollständige antivirale Aktivität bei 0,5 Mikromol im vorliegenden Versuchssystem, sowie auch nach therapeutischem Index, nämlich dem Verhältnis von cytotoxischer Konzentration relativ zur wirksamen Konzentration. S-dC28 zeigt im allgemeinen einen vergleichbaren in-vitro- Index mit Bezug auf diejenigen von Didesoxycytidin und Didesoxyadenos in.
Im allgemeinen ist angenommen worden, daß Antisinn-Sequenzen die Expression verschiedener Gene durch Translationsunterdrückunghemmen, d.h. daß sie sich an mRNA binden und deren Translation blockieren. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde eine gag-Protein-Synthese in chronisch HIV-infizierten und HIV-produzierenden H9-Zellen durch indirekten Immunfluoreszenzversuch unter einem Mikroskop analysiert. S-dC28 hemmte die gag-Protein-Positivität in H9/HTLV-IIIb-Zellen bei Konzentrationen selbst von 25 Mikromol nicht, wie in Tafel 3 gezeigt ist. Obwohl die gag-Positivität von Zellen nur ein partieller quantitativer Parameter für die Proteinproduktion ist, läßt dieses Ergebnis den Schluß zu, daß die potente Anti-HIV-Aktivität von S-dC28 bei Konzentrationen von nur 0,5 Mikromol nicht auf einer Translationsblockierung an sich beruhen könnte. Alternativ könnte das Maß einer Translationsblockierung unter der Nachweisschwelle durch indirekten Immunfluoreszenzversuch unter einem Mikroskop gelegen haben. Im Gegensatz dazu zeigte eine Southern-Blotting-Analyse, die zur Erforschung einer de-novo-Synthese von HIV-DNA in Targetzellen eingesetzt wurde, eine vollständige Hemmung durch S-dC28 bei Konzentrationen bis herab zu 1 Mikromol. Daher könnte ein Mechanismus für die antivirale Wirkung auf dem Blockieren viraler Replikation vielleicht vor oder während der proviralen DNA-Synthese beruhen.
Die Möglichkeit, daß S-ODN-Analoge die HIV-Bindung an Targetzellen stören könnte, wurde untersucht. Das T4-Molekül auf der Zellenoberfläche ist bekanntermaßen der Hauptrezeptor für HIV in T4+ -Zellen. In den Experimenten unter Verwendung eines radiomarkierten Virus für die spezifische Bindung des markierten Virus an das T4-Molekül in T4-Zellen (H9-Zellen) wurde keine Hemmung durch S-dC28 beobachtet, was vermuten läßt, daß die Hemmung der viralen Bindung an die Zellenoberfläche für die Aktivität nicht verantwortlich ist. Des weiteren waren nach 16 Stunden Inkubation mit 1 Mikromol S-dC28 durch Fluoreszenz aktivierte cytofluorometrie keine Veränderungen in dem T4-, HLA-DR-, T8-, T3-, oder Tac-Antigen auf der Zellenoberfläche von ATH8-Zellen nachweisbar. Insgesamt lassen diese Feststellungen einschließlich der Basenzusammensetzung und eines Längeneffekts vermuten, daß die antivirale Aktivität durch Hemmung der proviralen HIV-DNA-Synthese vermittelt wird, vielleicht, zumindest teilweise, durch Bindung der S-Oligodesoxynucleotide an eine virale Nucleotidsequenz zustande gebracht wird.
Ein weiterer Mechanismus, der betrachtet werden sollte, ist die Induktion einer Interferonproduktion derart, wie sie für Phosphorthioat-Analoge von Poly-r(I-C) vorgeschlagen wurde. Im Überstand der Kultur mit S-dC14 wurde keine Induktion von Gama-Interferon beobachtet, und 1000 Einheiten von rekombinantem Alpha- oder Gamma-Interferon, die direkt in diese Kulturen zugegeben wurden, konnten die cytopathische Wirkung in den Versuchssystemen nicht hemmen. Da außerdem keine Daten vorhanden sind, die das Konzept stützen, das Phosphorthioat- Internucleotid-Verbindungen einen Thiol-Charakter haben und daher Disulfide bilden können, wäre der Wirkungsmechanismus wahrscheinlich verschieden von dem, der für antivirale Polynucleotide mit thiolierten Basen wie z.B. 5-Mercapto-Cytosin oder -Urasil angenommen wurde.
Phosphatase-resistentes ³&sup5;S-Phosphorthioat-endmarkiertes S-dC28 wurde zur Untersuchung der Permeabilität von Targetzellen verwendet. Innerhalb mehrerer Minuten wurde ein beträchtliche Steigerung der Radioaktivität in ATH8- und H9- Zellen beobachtet, was die Aufnahme dieser Verbindungen durch die Zellen stützt.
S-Oligodesoxynucleotide zeigten auch eine beträchtliche Hemmung die reverse-Transkriptase-Aktivität von gereinigtem HIV im in-vitro-Versuch unter Verwendung einer viralen DNA (3'- orf), die in einen M-13-Vektor als Matrize mit einem Universalprimer eingefügt wurde. Unter manchen Bedingungen hat sich gezeigt, daß Phosphorthioat-Analoge als wettbewerbsfähige Inhibitoren von Matrizenprimern dienen können, und das diese Klasse von Verbindungen einen mehrfachen Wirkungsmechanismus zu haben scheint. Der genaue Mechanismus einschließlich der Nichtsequenzspezifizität der anitviralen Aktivität, der direkten Hemmung der viralen DNA-Polymerase oder zusätzlicher Translationsblockierung bei hoher Konzentration für Komplementärsequenzen erfordert gegenwärtig noch weitere Erforschung.
Nach einer Anzahl von Tagen in Kultur, im allgemeinen nach 7 bis 10 Tagen, wurde entweder im wesentlichen der Zelltod aufgrund HIV-Infektion (HIV-cytopathische Wirkung) oder der Schutzeffekt der Oligos gegen die Cytopatizität von HIV beobachtet.
In anderen Experimenten schienen die Targetzellen (ATH8-Zellen) gegen HIV durch Phosphorthioat-Oligos (S-ODN-1,-2 und -4), nicht aber durch unmodifizierte Oligos geschützt zu sein, welche die gleichen Sequenzen haben. Darüber hinaus zeigten im gleichen Experiment "zufällige" Sequenzen von Phosphorthioat, wie beispielsweise das 14-mer-Oligo-dC und S-ODN-5, einen beträchtlichen Schutz gegen die HIV-cytopathische Wirkung. Die Schutzwirkungen der Phosphorthioat-Oligos, die durch Bindung an für Infektion und cytopathische Wirkungen des Virus relevante Polynucleotidstellen zustande gebracht wurden, wurden ebenfalls untersucht, ebenso auch verschiedene Längen von Oligo-dC- und Oligo-dA-Phosphorthioaten (5-, 14- und 28-mer) in der Untersuchung auf cytopathische Wirkung. Eine Biountersuchung ist in Mitsuya u. a. PNAS, 83: 1911 bis 1915 (1986) beschrieben.
Mit Bezug auf die Hemmung von Tumorwachstum sind die Wirkungen der All-Phosphor-Oligomere ganz unterschiedlich von den Wirkungen der All-Phosphorthioat-oligomeren. Zusätzlich können kombinierte Gemische von chemisch kombinierten copolimeren der Oligomere nach der vorliegenden Erfindung zur Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen eingesetzt werden.
Diese copolimere können eine Vielfalt von Konfigurationen annehmen, beispielsweise eines mit Endstrukturen versehenen Polymers mit zwei phosphorthionierten Oligomeren an jedem Ende eines 14-mer-Polymers. Alternativ können Blockcopolimere geschaffen werden, wie beispielsweise Polymere mit sich wiederholenden Blöcken wie beispielsweise 9 Phosphonatblöcke, 9 phosphorthionierte Blöcke und 9 phosphonierte Mere in einem 28-mer-Polymer, das 27 Internucleotid-Phosphatbindungen aufweist, oder einfach alternierende Copolimere. Viele dieser Copolimere haben dazwischenliegende Eigenschaften.
Es hat sich gezeigt, daß die normalen Oligomere in Serum nach etwa 17 Stunden gespalten werden, aber daß in der Zelle die Halbwertszeit dieser Verbindungen sogar mehrere Tage betragen kann. Die Verwendung der phosphorthionierten Derivate verlängert die Lebensdauer der aktiven Verbindungen, was diesen Verbindungen mehr Zeit gibt, die Expression der Oncogene zu hemmen.
Anfängliche physikalisch-chemische Untersuchungen zeigen, daß die mit Endstrukturen versehenen Verbindungen recht beständig gegen Nucleasen sind, nämlich mit einem Faktor von etwa 100, aber fast sogut wie die normalen phosphonierten Verbindungen hybridisieren, wie durch ihre Schmelztemperaturen angezeigt wird, die unten in Tafel 4 dargestellt sind. Tafel 4 Schmelztemperaturen von Oligomeren* Mit Poly-rA Homo-Duplexe S-Sinn+S-Antisinn S-Sinn+O-Antisinn O-Sinn+O-Antisinn *Bestimmt durch UV-Schmelzen bei 260 nm.
Bemerkung: S-dA/T Tms sind recht niedrig, aber S-dC/G sind verhältnismäßig hoch.
Es wurden mehrere oligodesoxynucleotide im Hinblick auf DNase-Empfindlichkeit untersucht, vergleiche Tafel 5. Diese umfassen Cytidin-Homopolymere, ODN-4 (eine Anti-Information 28-mer komplementär zur 3'-Region der art/trs-Region des HIV- BH10-Klons), und myc-1 (ein 15-merkomplementär zur Start- codon-Region des C-myc-Oncogens). Die verwendeten DNasen waren vorwiegend Endonuclease 51, die Exo- und Endonuclease P1, und Schlangengift (SV)-Phosphodiesterase. Die Konzentration der S1-Nuclease war 10-fach höher (100 Mikromol/ml) für Reaktionen von Oligo-dC, da sowohl das normale wie auch das PS-Analog durch dieses Enzym extrem langsam zersetzt wurde. Der Abbau durch S1- und P1-Nuclease ging bei den S- oligodesoxynucleotiden 2 bis 45 mal langsamer vonstatten als bei den normalen Oligomeren, wobei das 150-mer etwas leichter abgebaut wurde als das 28-mer. Die mit 2S-Endstrukturen versehene myc-1-Spezies verhielt sich ähnlich wie die All-PS- Verbindungen.
Die S-Oligodesoxynucleotide sind für alles undurchlässig außer für die Wirkungen der SV-Phosphodiesterase, und in diesem Fall sind die Unterschiede gegenüber normalen Oligos aber recht dramatisch. Für die Homopolymere wurde eine Halbwertszeit von mehr als 10&sup5; Sekunden bestimmt, was gegenüber dem normalen Oligomer eine dreifach logarithmische Abnahme der Geschwindigkeit bedeutet. Ähnliche Ergebnisse wurden mit myc-1 und ODN-4 gefunden. Die Zersetzung von 2S-Endstruktur- myc-1 durch SV-Phosphodiesterase war ebenfalls verlangsamt, wie in Tafel 5 gezeigt ist, aber nicht so markant wie bei einigen der anderen Spezies. Jedoch ist die Halbwertszeit von 3', 5'-2S-Endstruktur-myc-1 im 50 %igem menschlichem Serum, gemessen durch ³¹T-NMR, größer als ein Monat gegenüber nur 2 bis 3 Tage für normales myc-1. Tafel 5 Nucleaseempfindlichkeiten von Oligomeren, t1/2 (s)¹ ¹Verhältnis = t 1/2 PS-oligo/t1/2PO-oligo ODN-4 = d-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCA myc-1 = d-AACGTTGAGGGGCAT
Wie oben beschrieben, ist die bevorzugte Dosierung der Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung diejenige, die notwendig ist, um im Blut eine Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 100 Mikromol/cl zu erreichen. Diese Konzentration kann auf vielfältige Weise erreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen im Bereich der vorliegenden Erfindung enthalten Zusammensetzungen, in denen der aktive Bestandteil in einer wirksamen Menge enthalten ist, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Ein bevorzugter Bereich wurde oben beschrieben, und die Bestimmung der wirksamsten Mengen für die Behandlung jeder Art von Tumor oder Virus liegt im Können des Fachmanns.
Zusätzlich zu den phosphorthionierten Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete Trägerstoffe und Hilfsstoffe enthalten, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu pharmazeutisch anwendbaren Zubereitungen erleichtern. Vorzugsweise enthalten die Zubereitungen, insbesondere oral verabreichbare und für die bevorzugte Verabreichungsart in Form von Tabletten, Dragees, und Kapseln verwendbare Zubereitungen, und rektal verabreichbare Zubereitungen wie beispielsweise Suppositorien, sowie geeignete Lösungen zur parenteralen oder oralen Verabreichung, und Zusammensetzungen, die buccal oder sublingual verabreicht werden können, Einschlußverbindungen, die etwa 0,1 bis 99 Gewichtsprozent aktive Ingredienzien zusammen mit dem Trägerstoff enthalten.
Die pharmazeutischen Zubereitungen nach der vorliegenden Erfindung werden in einer Weise hergestellt, die an sich bekannt ist. Beispielsweise werden die pharmazeutischen Zubereitungen mittels herkömmlicher Misch-, Granulier-, Drageeherstellungs-, Auflösungs- oder Lyophilisierungsverfahren hergestellt. Das anzuwendende Verfahren hängt letztlich von den physikalischen Eigenschaften des verwendeten aktiven Bestandteils ab.
Geeignete Trägerstoffe sind insbesondere Füller wie beispielsweise Zucker, beispielsweise Lactose oder Sucrose, Mannitol oder Sorbitol, Zellulosezubereitungen und/oder Kalziumphosphate, beispielsweise Trikalziumphosphat oder Kalziumhydrogenphosphat, sowie Bindemittel wie beispielsweise Stärke, Paste, beispielsweise unter Verwendung von Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Natriumkarboxylmethylzellulose, und/oder Polyvenil-Pyrrolidon. Gewünschtenfalls können desintegrierende Agenzien zugegeben werden, beispielsweise die oben erwähnten Stärken, sowie Karboxymethyl-Stärke, quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar-Agar oder Alginsäure oder ein Salz hiervon, wie beispielsweise Natriumalginat. Hilfsstoffe sind strömungsregulierende Agenzien und Schmiermittel, beispielsweise Silica, Kalk, Stearinsäure oder Salze hiervon, wie beispielsweise Magnesiumstearat oder Kalziumstearat, und/oder Polyethylenglycol. Drageekerne können mit geeigneten Überzügen versehen sein, die gewünschtenfalls gegen Magensäfte resistent sind. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die ggf. Gummiarabikum, Kalk, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol und/oder Titandioxyd, Lacklösungen oder geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Zur Erzeugen von gegen Magensäfte resistenten Überzügen werden Lösungen von geeigneten Zellulosezubereitungen wie beispielsweise Acetylzellulose-Phthalat oder Hydroxypropylmethylzellulosephthalat verwendet. Es können Farbstoffe und Pigmente zu den Tabletten oder Drageeüberzügen zugegeben werden, beispielsweise zur Identifikation oder um unterschiedliche Kombinationen aktiver Verbindungsdosen zu kennzeichnen.
Andere pharmazeutische Zubereitungen, die oral eingesetzt werden können, umfassen auch aus Gelatine hergestellte Schiebesitzkapseln sowie auch weiche, geschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Plastifizierer wie beispielsweise Glycerol oder Sorbitol. Die Schiebesitzkapseln können die aktiven Verbindungen in Form von Körnchen enthalten, die mit Füllstoffen wie beispielsweise Lactose, Bindemittlen wie beispielsweise Stärken, und/oder Schmiermitteln wie beispielsweise Kalk oder Magnesiumstearat, und ggf. Stabilisatoren vermischt sein können. In weichen Kapseln sind die aktiven Verbindungen vorzugsweise in geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert, beispielsweise in fetten Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen. Zusätzlich können Stabilisatoren zugegeben werden.
Mögliche pharmazeutische Zubereitungen, die rectal eingesetzt werden können, umfassen beispielsweise Suppositorien, die aus einer Kombination der aktiven Verbindungen mit einer Suppositoriengrundlage bestehen können. Geeignete Suppositoriengrundlagen sind beispielsweise natürliche oder synthetische Triglyceride, Paraffinkohlenwasserstoffe, Polyethylenglycole, oder höhere Alkanole. Des weiteren ist es auch möglich, Rectalkapseln aus Gelatine zu verwenden, die aus einer Kombination der aktiven Verbindungen mit einer Grundlage bestehen.
Mögliche Grundlagenmaterialien umfassen beispielsweise flüssige Triglyceride, Polyethylenglycole oder Paraffinkohlenwasserstoffe.
Geeignete Formulierungen für eine parenterale Verabreichung umfassen wäßrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher oder wasserdispergierbarer Form. Des weiteren können Suspentionen der aktiven Verbindungen in Form geeigneter öliger Injektionssuspensionen verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen fettige Öle, beispielsweise Sesamöl, oder synthetische fettige Säureester, beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride. Wäßrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, beispielsweise Natriumkarboxymethylzellulose, Sorbitol und/oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension außerdem Stabilisatoren enthalten.
Zusätzlich können die Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung auch in Liposomen gekapselt verabreicht werden, wobei es sich um pharmazeutische Zusammensetzungen handelt, in denen der aktive Bestandteil entweder dispergiert oder in verschiedener Weise in Korpuskeln enthalten ist, die aus an Lipidschichten anhaftenden wäßrigen konzentrischen Schichten stehen. Der aktive Bestandteil, je nach seiner Löslichkeit, kann sowohl in der wäßrigen Schicht als auch in der Lipidschicht oder in dem vorhanden sein, was allgemein als liposome Suspension bezeichnet wird. Die hydrophobe Schicht besteht im allgemeinen, aber nicht ausschließlich, aus Phosphorlipiden wie beispielsweise Lecitin und Sphwingomycelin, Steroiden wie beispielsweise Cholesterin, mehr oder weniger ionischen Tensiden wie beispielsweise Dicetylphosphat, Stearylamin oder Phosphatidsäure, und/oder aus anderen Materialien hydrophober Natur. Die Durchmesser der Liposome liegen etwa im Bereich von 15 nm bis etwa 5 Mikrometer.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegendes Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotid enthält, zur Verwendung bei der Verhinderung von durch Replikation fremder Nukleinsäuren in Anwesenheit normaler lebender Zellen verursachter Krankheit.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Krankheit durch HTLV-III verursacht wird.

3. Pharmazeutische Verbindung zur Verhinderung von durch Replikation fremder Nukleinsäuren in Anwesenheit normaler lebender Zellen verursachter Krankheit, mit der Formel (I):

wobei n eine ganze Zahl von 5 bis 30 ist, B aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymidin (T) ausgewählt ist, und X aus S und O ausgewählt ist, mit der Maßgabe, daß mindestens ein X in der Verbindung S ist, so daß die Verbindung der Formel I eine Antisinn-Folge darstellt.

4. Pharmazeutische Verbindung nach Anspruch 3, wobei die Krankheit durch HILV-III verursacht wird.

5. Verbindung nach Anspruch 3 oder 4, wobei entweder in zwei Monomeren X jeweils S und in den übrigen Monomeren X jeweils O ist, oder wobei der Polymer Endstrukturen in Form von Monomeren hat, bei welchen X als S vorliegt und wobei in den übrigen Monomeren X als O vorliegt, oder wobei die Monomere, bei denen X jeweils S ist, und die Monomere, bei denen X jeweils O ist, in gleichen Mengen vorhanden sind.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei n im Bereich von 14 bis 30 einschließlich liegt.

7. Verbindung nach Anspruch 3 oder 4, wobei mehr als 95% von X als S vorliegen.

8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei X jeweils S ist.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung zur Unterdrückung von HTLV-III der Formel II enthält:

wobei n eine ganze Zahl von 5 bis 30 ist, und B aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) oder Thymidin (D) ausgewählt ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Oligodesoxyribonucleotid ein Oligo-dC-Phosphorthioat mit etwa 5 bis 30 Meren ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Oligodesoxynucleotid ein Oligo-dA-Phosphorthioat mit etwa 5 bis 30 Meren ist.

512. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Cligodesoxynucleotid ein Oligo-dA-Phosphorthioat mit etwa 28 Meren ist.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei der Träger aus physiologischer Kochsalzlösung, einem organischen Träger oder Blut ausgewählt ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Didesoxynucleotid ein 2',3'-Didesoxyadenosin ist.

15. Verfahren zur Verhinderung der Replikation und zytopathischer Effekte fremder Nukleinsäure in Zellen in Vitro, wobei die Zellen einer replikationsunterdrückenden Menge eines Oligodesoxynucleotids der Formel 11 nach Anspruch 9 ausgesetzt werden.

16. Verfahren zur Verhinderung der Replikation fremder Nucleinsäure in normalen lebenden Zellen in Vitro, wobei die Zellen einer replikationsunterdrückenden Menge eines Oligodesoxinucleotids der Formel I nach Anspruch 3 ausgesetzt werden, wobei das Oligodesoxinucleotid eine zu einer Basensequenz des Humanimmundefektvirus (HIV) komplementäre Basensequenz hat.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I nach Anspruch 3 und ein Didesoxynucleotid enthält.

18. Verwendung bei der Herstellung eines Nedikaments zur Behandlung von durch Expression einer fremden Nukleinsäure wie beispielsweise eines Onkogens oder HTLV-III verursachter Krankheit, wobei das Medikament eine Zusammensetzung mit einer Verbindung der Formel I enthält:

wobei n eine ganze Zahl von 5 bis 30 ist, B aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) ist, und X aus S und O ausgewählt ist, mit der Maßgabe, daß mindestens ein X in der Verbindung S ist, um eine spezifische "Antisin"-Sequenz zu einem Teil der fremden Nucleinsäure zu schaffen.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Krankheit durch HTLV-III verursacht wird.

20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei in zwei Monomeren X jeweils S ist und in den übrigen Monomeren x jeweils O ist.

21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Polymer als Endstrukturen Monomere aufweist, bei denen X jeweils S ist, und wobei in den übrigen Monomeren X jeweils O ist.

22. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Monomere, bei denen X jeweils S ist, und die Monomere, bei denen X jeweils O ist, in gleichen Mengen vorhanden sind.

23. Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Onkogen ein C-Myc- Gen ist.

24. Verwendung bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhinderung von durch Replikation fremder Nukleinsäuren in Anwesenheit normaler lebender Zellen verursachter Krankheit, die Phosphorthioat-Oligodesoxynucleotid in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Krankheit durch HILV-III verursacht wird.

26. Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Phosphorthiohat-Oligodesoxynucleotid die Formel II hat:

30 wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 30 ist und B aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) ausgewählt ist.

27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei das Oligodesoxynucleotid ein Oligo-dC-Phosphorthioat mit etwa 5 bis 30 Meren ist.

28. Verwendung nach Anspruch 26, wobei das Oligodesoxynucleotid ein Oligo-dA-Phosphorthioat mit etwa 5 bis 30 Meren ist.

29. Verwendung nach Anspruch 26, wobei das Oligodesoxynucleotid ein Oligo-dA-Phosphorthioat mit etwa 28 Meren ist.

30. Verwendung nach Anspruch 26, wobei der pharmazeutisch annehmbare Träger aus physiologischer Kochsalzlösung, einem organischen Träger oder Blut ausgewählt ist.

31. Verwendung nach Anspruch 26, wobei das Didesoxynucleotid ein 2',3'-Didesoxyadenosin ist.