DE69306969T2 - Therapeutisches anti-hiv oligonukleotid und arzneimittel - Google Patents
Therapeutisches anti-hiv oligonukleotid und arzneimittelInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft die Behandlung von HIV-1-Infektionen. Insbesondere betrifft die Erfindung chemotherapeutische Verbindungen, genannt Antisense-Oligonucleotide, und Arzneimittel, die solche Oligonucleotide enthalten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Inhibierung der HIV-Replikation und Behandlung von HIV-1-Infektionen mit solchen Antisense-Oligonucleotiden.
- Vom menschlichen lymphotropen T-Zell-Leukämievirus-Typ III (HTLV-III), jetzt allgemein bekannt als menschliches Immunschwächevirus-Typ-I (HIV-1), wird angenommen, daß es das ätiologische Agens des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) ist. Das Virus gehört der Refroviridae-Familie an, deren Mitglieder ein RNA-Genom und eine Reverse Transkriptaseaktivität besitzen. Während ihres Wachstumszyklus kopieren Retroviren ihre RNA in provirale DNA. Die provirale DNA kann in die chromosomale DNA der Wirtszelle integrieren, in der sie die Transkriptions- und Translationsmaschinerie des Wirtes benutzt, um virale RNA und Proteine zu expnnlleren. Viren verlassen die Zelle durch Abschnüren an der zytoplasmatischen Membran. Im Fall von HIV-1 hat die virale Replikation den Tod der Wirtszellen, und zwar der T-Helferzellen, zur Folge, was zur schweren Immunschwäche, zur Entwicklung von verschiedenen bösartigen Tumoren, opportunistischen Infektionen und schließlich zum Tod des infizierten Organismus führt.
- Das Auftreten von AIDS hat in vielen Ländern zu epidemieartigen Verhältnissen ohne Entwicklung von auflange Sicht erfolgreichen präventiven Behandlungen oder Therapien geführt. Die wenigen therapeutischen Verbindungen, die schrieben wurden, wie das Nucleosidanalogon 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT), Didesoxyiiiosin (ddI) und Didesoxycytosin (ddC) haben sich nur als eingeschränkt erfolgreich erwiesen. Dies liegt zum Teil an der Zytotoxizität dieser Verbindungen. Zusätzlich entkommen einige Viren aufgrund von Mutationen, die sie gegen solche Verbindungen unempfindlich machen. Ferner ist die antivirale Wirkung erschwert, weil das virale Genom in das Wirtsgenom integriert. Es besteht also eine großer Bedarf all effektiveren therapeutischen Verbindungen und praventiven Therapien gegen AIDS.
- Unlängst sind neue chemotherapeutische Verbindungen entwickelt worden, die zur Regulierung zellulärer wie fremder Genexpression in der Lage sind. Diese Verbindungen, Antisense-Oligonucleotide genannt, binden an ein Einzelstrang-Nucleinsäurezielmolekül entsprechend der Watson-Crick- oder der Hoogstein-Basenpaarungsregel. Dabei zerstören sie die Funktion der Zielstelle aufgrund eines von mehreren möglichen Mechanismen: Durch Verhindern der Bindung von Faktoren, die für eine normale Transiation oder Transkription benötigt werden; im Fall einer mRNA als Zielstelle wird die enzymatische Zerstörung der Botschaft mittels RNase H bewirkt; die Zielstelle kann auch durch reaktive Gruppen, die direkt an das Antisense-Oligonucleotid gekoppelt sind, zerstört werden.
- Antisense-Oligodesoxynucleotide sind entworfen worden, um die Expression von HIV-1 und anderen Viren spezifisch zu inhibieren; vergl. z.B. Agrawal (1992), Trends in Biotechnology, 10:152-158; Agrawal et al. (1992), Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA, Herausgeber: Erickson und Izant, Raven Press Ltd., New York, Seiten 273-283; Matsukura et al. (1992), Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, Wiley-Liss, Inc., Seiten 159-178; Agrawal (1991), Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy for Cancer and AIDS, Herausgeber: Wickstrom, Liss, New York, Seiten 145-148. Es ist zum Beispiel gezeigt worden, daß Antisense-Oligonucleotide mit unmodifizierten Phosphodiester- Internucleotidbindungen und Sequenzen komplementär zu Bereichen genomischer HIV-1- RNA die virale Replikation in frühinfzierten Zellen inhibieren; vergl. Zamecnik et al. (1986), Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 83:4143-4147; Goodchild et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5507-5511. Allerdings sind diese Moleküle weniger geeignet, die virale Replikation in chronisch intizierten Zellen zu inhibieren (Agrawal et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7790-7794) hauptsächlich aufgrund ihrer Nucleaseempfindlichkeit; vergl. Wickstrom (1986), J Biochem. Biophys. Meth., 13:97-102. Deshalb sind chemisch modifizierte, nucleaseresistente Analoga entwickelt worden, die die HIV-1-Replikation in Gewebekulturen wirksam inhibieren; vergl. Sarin et al. (1988), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 85:7448-7451; Agrawal et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7079-7083; Matsukura et al. (1988), Gene, 72:343-347. Diese Analoga umfassen Oligonucleotide mit nucleaseresistenten Phosphorthioatinternucleotidbindungen, von denen gezeigt ist, daß sie die HIV-1-Replikation sowohl bei akuten Infektionen (Agrawal et al. (1989), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86:7790- 7794) als auch in chronisch infizierten Zellinien inhibieren; vergl. Agrawal et al. (1991), Gene Regulation: Biology of Antisense RNA, Herausgeber: Erickson et al., Raven Press, New York, Seiten 273-284; Vickers et al. (1991), Nucleic Acids Res., 19:3359-3368; Matsukura et al. (1989), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86:4244-4248; Agrawal et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7079-7083. Es besteht jedoch weiterhin ein Bedarf an noch effektiveren Anti-HIV-Oligonucleotiden mit therapeutischen Effekten bei geringerer oder fehlender zellulärer Toxizität.
- Es wurden erfindungsgemäß neue chemotherapeutische Verbindungen entwickelt, die die HIV-1-Replikation inhibieren. Diese Verbindungen sind synthetische Oligonucleotide mit Nichtphosphodiester-Internucleotidbindungen und einer Nucleotidsequenz, die zu einem Bereich der konservierten gag-Region des HIV-1-Genoms komplementar ist. gag ist ein Bereich des Strukturgens von HIV-1, das in allen Retroviren vorkommt. Von Sequenzen, die um das gag-Startkodon liegen, ist bekannt, daß sie für die virale Verpackung benötigt werden. Das Antisense-Oligonucleotid wirkt durch Bindung an die Ziel-DNA oder -RNA, wobei es den Start der DNA-Replikation und DNA-Expression und die virale Verpackung durch Zerstören der DNA-Sekundärstruktur inhibiert.
- Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide sind spezifischer, weniger toxisch und besitzen eine größere Nucleaseresistenz als viele andere chemotherapeutische Verbindungen, die entwickelt wurden, um die HIV-1-Replikation zu inhibieren. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Nichtphosphodiester-Internucleotidbindungen resistenter gegenüber nucleolytischem Abbau als Verbindungen mit ausschließlich Phosphodiester- Internucleotidbindungen. Zusätzlich sind sie aktiver bei der Inhibierung der viraler Replikation als andere bekannte Antisense-Oligonucleotide mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer kürzeren HIV-1-gag-Sequenz als der von 324 bis 348 komplementär ist.
- In seinem breitesten Aspekt betrifft die Erfindung ein Antisense-Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz von 25 bis 30 Nucleotiden, die komplementar ist zu mindestens den Nucleotiden 324 bis 348 der gag-Region von HIV-1. Das Antisense-Oligonucleotid ist mit mindestens einer Nichtphosphodiester-Internucleotidbindung verbunden, wobei diese Bindung die Resistenz des Oligonucleotids gegenüber Nucleaseabbau verstärkt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besitzen die Oligonucleotide mindestens eine Phosphorthioat- Internucleotidbindung. Solche Phosphorthioatbindungen enthalten eine Substitution von Schwefel anstelle von Sauerstoff, wodurch das Oligonucleotid resistenter gegenüber nucleolytischem Abbau wird.
- Eine andere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet ein Oligonucleotid mit 25 Nucleotiden mit mindestens einer Phosphorthioat-Internucleotidbindung. Dieses Oligonucleotid wird nachstehend als 25-mer bezeichnet. Die Nucleotidsequenz dieses 25-mers ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr. 1 aufgeführt. Andere Ausführungsformen der Erfindung beinhalten Phosphorthioat-Oligonucleotide mit 26, 27, 28, 29 oder 30 Nucleotiden, wobei die Sequenzen zusätzlich zu anderen flankierenden Nucleotiden der Nucleotide 324 bis 348 von HIV-1-komplementär sind. Die Sequenzen von zwei bevorzugten 26-meren sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr. 2 und 3 aufgeführt. Die Sequenz eines bevorzugten 27-mers findet man in SEQ ID Nr. 4, die von bevorzugten 28-meren in SEQ ID Nr. 5 und 6, die eines bevorzugten 29-mers in SEQ ID Nr. 7 und die von bevorzugten 30-meren in SEQ ID Nr. 8 und 9.
- Die Erfindung stellt auch therapeutische Zusammensetzungen (Arzneimittel) zur Verfügung, beinhaltend ein vorstehend beschriebenes Oligonucleotid in einem physiologisch verträglichen Träger, sowie Verfahren zur Inhibierung der HIV-1-Proliferation und der Behandlung von HIV-1-Infektionen in Saugern nnttels dieser Zusammensetzungen.
- Die vorstehenden und anderen Ziele dieser Erfindung, ihre verschiedenen Merkmale wie auch die Erfindung selber, können aufgrund der folgenden Beschreibung besser verstanden werden, wenn sie zusammen mit den Zeichnungen gelesen werden.
- Fig. 1 zeigt schematisch die gag- Startregion des HIV-1-Genoms und die dazu komplementäre Sequenz von erfindungsgemäßen Antisense- Phosphorthioatnuckleotiden;
- Fig. 2 zeigt schematisch die gag- Startregion und das erfindungsgemäße 25-mer;
- Fig. 3 zeigt schematisch die gag-Startregion und das erfindungsgemäße 28-mer von Matsukura et al.;
- Fig. 4 zeigt schematisch die gag-Startregion und die Bereiche, die von den erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotiden dieser Erfindung erfaßt werden;
- Fig. 5 zeigt graphisch die in den Tabellen beschriebene HIV-1-Aktivität als prozentuale Inhibierung der p24-Expression;
- Fig. 6 zeigt graphisch die in den Tabellen beschriebene HIV-1-Aktivität als prozentuale CPE- Reduktion; und
- Fig. 7 zeigt graphisch ein Langzeitschutzexperiment, mit dem Nachweis der Wirksamkeit des 25-mers bei der hihibierung der p24-Expression bis zum Tag 17 und der Unwirksamkeit von ddC.
- Offenbart sind Antisense-Oligodesoxynucleotide mit Nichtphosphodiester Internucleotidbindungen, die bei der Inhibierung der HIV-1-Replikation besonders aktiv und gegenüber Nucleaseabbau resistenter sind als Oligonucleotide mit Phosphodiester- Internucleotidbindungen, und die weniger zytotoxisch als andere Anti-HIV- chemotherapeutische Verbindungen sind. Diese Oligonucleotide (SEQ II) Nr. 1 bis 9) zielen auf die Region um das gag-Startkodon des HIV-1-Genoms. Von Sequenzen, die in dieser Region liegen, ist gezeigt worden, daß sie für die virale Verpackung essentiell sind. Diese Sequenzen bilden eine stabile Sekundärstruktur; vergl. Harrison et al. (1991), RNA Tumor Viruses, Herausgeber: Coffin et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, Seite 235. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide sind entworfen worden, um an diese Region zu binden, wobei sie deren natürliche Stabilität unterbrechen und schließlich zu einer Inhibierung der viralen Verpackung und Transiation der gag-mRNA führen.
- Die Oligonucleotide sind mindestens zu der Sequenz von 324 bis 348 der gag-Region (SEQ ID Nr. 11) von HIV-1 (Fig. 2) komplementär; vergl. Muessing et al. (1985), Nature, 313:450- 458. Die Sequenz von 324 bis 348 ist in HIV-1-Stämmen hochkonserviert, wie nachstehend in Tabelle 1 gezeigt wird. TABELLE 1
- Das Zielen mit einem Antisense-Oligonucleotid auf eine konservierte Region, die ein aktives Gen enthält, erlaubt eine wirksame Innibierung der HIV-Proliferation ohne Bildung von "Ausreißmutanten". Ausreißmutanten entstehen, wenn eine Mutation in einer genomischen Region entsteht, die eine Zielstelle des Antisense-Oligonucleotids ist. Sie entstehen mit einer höheren Frequenz in nichtkodierenden Regionen (wie der SA-Region von HIV-1) als in Regionen, die ein Protein kodieren.
- Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen der Oligonucleotide sind mindestens jeweils zu den Nucleotiden 324 bis 348 des HIV-1-Genoms komplementär. Ein Aspekt der Erfindung ist ein Oligonucleotid, das im wesentlichen aus dieser Sequenz besteht und hier als 25-mer bezeichnet wird. Die Sequenz dieses 25-mer ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr. 1 beschrieben. Andere beanspruchte Oligonucleotide mit der Fähigkeit, die HIV-1-Replikation zu inhibieren, beinhalten die Sequenz des 25-mers, in 3'- und/oder 5'-Richtung von zusätzlichen Nucleotiden flankiert, die komplementär zu Nucleotiden neben der HIV-1-Region von 324 bis 348 liegen. Die Sequenz dieser Oligonucleotide ist nachstehend in Tabelle 2 und im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr. 2 bis 9 beschrieben. Als Vergleich ist auch die Sequenz eines 20-mers aufgeführt; vergl. Agrawal et al. (1992), Gene Regulation: Biology of Antisense DNA and RNA, Herausgeber: Erickson und Izant, Raven Press, Ltd., New York, Seiten 273-283 (SEQ ÄD Nr. 10). TABELLE 2
- Modifizierte Oligonucleotide dieser Erfindung sind ebenfalls nützliche Inhibitoren der HIV-1- Proliferation, einschließlich solcher mit künstlichen internucleotidischen Bindungen, die nicht Phosphorthioatbindungen sind. Andere bekannte künstliche Bindungen beinhalten Methylphosphonat-, Phosphoramidat-, Dithioat-, überbrückte Phosphorthioat-, überbrückte Phosphoramidat-, Sulfon-, Sulfat-, Keto-, Phosphatester-und Phosphorbutylamin-Gruppen; z.B. van der Krol et al. (1988), Biotech., 6:958-976; Uhlmann et al. (1990), Chem. Rev., 90:543-585. Zusätzlich sind Phosphorthioate und andere artifizielle Oligonucleotide mit zusätzlichen Strukturen, die Nucleaseresistenz bewirken, ebenfalls nützlich, wie gekappte 3m - und/oder 5'-Enden (vergl. z.B. EP-Anmeldung 92 91 2090.5; Letsinger et al. (1989), Biochem., 86:6553-6556; Reed et al. (1991), Bioconjugate Chem., 2:217-225) und chimsyre Oligonucleotide (vergl. U.S. Patent Nr. 5.149.797) sowie hybride Oligonucleotide, die RNA- und DNA-Bereiche besitzen. Andere Modifikationen, die den erfindungsgemäßen Oligonucleotiden Nucleaseresistenz verleihen, beinhalten 3'-terminale Sequenzen, die intern zueinander komplementär sind, so daß sie eine Doppelstrangschleife am Ende der Struktur bilden. Selbstverständlich können auch andere Modifikationen der Oligonucleotide ausgeführt werden, die die Nucleaseresistenz, die Spezifität und die Aktivität erhöhen und die Zytotoxizität veriingern.
- Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können nach verschiedenen bekannten Verfahren hergestellt werden, einschließlich der Phosphoramidit- oder H-Phosphonat- Festphasenmethode; vergl. z.B. Agrawal et al. (1992), Ann. New York Acad. Sci. USA, im Druck; Agrawal (1991), TIBTECH, 10:152-158. Diese Oligonucleotide können mittels der bekannten reversen Phase- oder Ionenaustausch-HPLC oder durch Hybridisierungs- Affinitätschromatographie-Methoden gereinigt werden; vergl. Metelev und Agrawal (1992), Anal. Biochem., 200:342-346.
- Untersuchungen zum Mechanismus und zur Efiizienz von Antisense-Oligonucleotiden bei der Inhibierung der viralen Replikation können in verschiedenen in vitro-Systemen wirksam durchgeführt werden. Ein System benutzt chronisch infizierte menschliche T-Lymphozyten wie CEM-Zellen. In solch einem System werden die infizierten Zellen ohne und mit verschiedenen Konzentrationen der erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotide mit unterschiedlicher Dauer kultiviert. Im Gegensatz zu den erfindungsgemäßen Oligonucleotiden inhibieren Nucleotidanaloga wie AZT, ddI, und ddC die HIV-Replikation in diesem System nicht.
- Da chronisch infizierte Zellen jedoch CD4&supmin; sind, kann eine Neuinfektion nicht auftreten. Solch eine in vitro-Kultur ist somit nicht mit den in vivo-Bedingungen vergleichbar, die in einem HIV-1 infizierten Patienten vorliegen, bei dem nur ein geringer Prozentsatz der CD4&spplus;-Zellen infiziert ist und Viren produziert. Ein Modellsystem zur Untersuchung von Arzneistoffen, das den in vivo-Bedingungen besser entspricht, ist eine Zellkultur mit einer akuten geringen Multiplizität der Infektion (Mol). In diesem System enthält nur eine Fraktion der Zellpopulation das Virus, während die anderen Zellen nicht inziert und CD4&spplus; sind. Menschliche T-Zellinien wie CEM oder H9 (ATCC HTB-176) werden mit HIV für eine bis mehrere Stunden infiziert und danach ohne oder mit dem Oligonucleotid in unterschiedlichen Konzentrationen unterschiedlich lang kultiviert.
- Die Fähigkeit der Oligonucleotide, die HIV-1-Replikation zu inhibieren, kann durch Bestimmung des HIV-Expressiongrades und des zytotoxischen Effekts der Oligonucleotide auf die inzierten Zellen gemessen werden. Die HW-Expression kann durch eine Anzahl von Parametern überwacht werden, einschließlich der Synzytienbildung, p24-Expression, p17- Expression und der Reversen Transkriptaseaktivität; vergl. z.B. Agrawal et al. (1991), Adv. Drug Delivery Rev., 6:251-270; Sarin et al. (1985), Biochem. Pharmacol., 34:4075-4079; Sarin et al. (1987), J. Natl. Cancer Inst., 78:663-666. Die Inhibierung des viralen zytopathischen Effekts (CPE) durch die Oligonucleotide kann mittels des MTT oder der Trypanblau-Ausschlußmethode untersucht werden.
- Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können zur Inhibierung der HIV-1-Proliferation in infizierten Zellen benutzt werden. Für dieses Verfahren wird eine therapeutische Formulierung, mit einem erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotid in einem physiologisch annehmbaren Trager emgesetzt. HIV-1-inzierte Zellen werden dann mit der therapeutischen Formulierung in einer Menge behandelt, die ausreichend ist, eine Bindung des Oligonucleotids an die gag- Region von proviraler DNA oder mRNA von HIV-1 in den inrierten Zellen zu ermöglichen. Auf diese Weise inhibiert die Bindung des Oligonucleotids an die HIV-1-DNA oder -mRNA die Expression und Replikation des Virus.
- Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können auch zur Behandlung von HIV-1-Infektionen in Säugern benutzt werden. Für dieses Verfahren wird eine therapeutische Formulierung mit einem erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotid in einem physiologisch annehmbaren Träger eingesetzt. Der Säuger wird mit der therapeutischen Formulierung in einer Menge behandelt, die ausreichend ist, eine Bindung des Oligonucleotids an die gag-Region der proviralen DNA und/oder mRNA von HIV-1 in inlizierten Zellen zu ermöglichen. Auf diese Weise inhibiert die Bindung des Oligonucleotids an die HIV-1-DNA die Expression und Replikation des Virus.
- Der Ausdruck "physiologisch akzeptabler Träger" umfaßt Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und gegen Pilze wirksame Mittel, isotonische und resorptionsverzögernde Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen bekannt. Die Verwendung jedes konventionellen Mediums oder Mittels ist in den therapeutischen Zusammensetzungen beabsichtigt, sofern es nicht mit dem aktiven Bestandteil unverträglich ist. Ergänzende aktive Bestandteile können ebenfalls in den Zusammensetzungen enthalten sein.
- Wirksame Dosierungen der Oligonucleotide und die Art ihrer Verabreichung zur Behandlung von AIDS können routinemäßig bestimmt werden. Die für Injektionen geeignete pharmazeutische Form beinhaltet sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und steriles Pulver für die Herstellung von sterilen Injektionslösungen oder -dispersionen. In allen Fällen muß die pharmazeutische Form steril sein. Sie muß bei den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein. Sie sollte vor Kontamination mit Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein. Der Schutz vor Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und gegen Pilze wirksame Mittel gewährleistet sein. Eine verlängerte Resorption der injizierbaren Arzneimittel kann durch Verwendung von Präparaten mit Resorptionsverzögerern erreicht werden.
- Das im Träger enthaltene Oligonucleotid kann intravenös oder intraperitoneal, intranasal, oral, transdermal oder subkutan verabreicht werden.
- Sterile injizierbare Lösungen werden durch Aufhehmen des Oligonucleotids in der gewünschten Menge eines geeigneten Lösungsmittels und Steriflitration hergestellt.
- HIV hat eine hohe Mutationsrate und deshalb können alle Arzneistoffe, die zur Behandlung von Virusinfektionen entwickelt wurden, einschließlich Antisense-Oligonucleotide, die Bildung von Ausreißmutanten induzieren. Um dieses Problem zu überwinden, wurde eine Kombinationschemotherapie zur Behandlung von HIV-inniierten Patienten vorgeschlagen. Diese Therapie beinhaltet die Applikation von mehr als einem gegen unterschiedliche Ziele gerichteten Arzneistoff wie Reverse Transkriptaseinhlbitoren, kombiniert mit Proteaseinhibitoren. Alternativ kann eine Antisense-Behandlung, die gegen verschiedene Sequenzen gerichtet ist, entweder in Kombination oder in aufeinanderfolgenden Behandlungsschemata durchgefüht werden, was zu einem unterschiedlichen Selektionsdruck auf das Virus mit wenig Zeit zur Entwicklung von Ausreißmutanten führt. Entsprechend bestehen die ersten Behandlungen aus der Verabreichung einer Mischung von erfindungsgemäßen Oligonucleotiden, gefolgt von aufeinanderfolgenden Verabreichungen von Oligonucleotiden, die gegen andere konservierte Regionen des HIV-1-Genoms gerichtet sind.
- Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele weiter erläutert.
- Phosphorthioat-modifizierte Oligodesoxynucleotide werden nach der H-Phosphonatmethode auf einer automatischen Synthesemaschine (Millipore 8700, Bedford, MA) in einem 5 bis 10 mM Maßstab hergestellt. Nach der Zusammenstellung der gewunschten Sequenz wird das CPG-gebundene Oligonucleotid-H-phosphonat mit Schwefel in Pyridin/Triethylamin/Schwefelkohlenstoff zum Phosphorthioat oxidiert. Die Abspaltung vom CPG wird in konzentriertem Ammoniak 48 Stunden bei 40ºC durchgeführt. Die Reinigung wird mittels präparativer reverser Phasenchromatographie gefolgt von Ionenaustauschchromatographie durchgeführt. Schließlich werden die gereinigten Oligonucleotide gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Oligonucleotidphosphorthioate werden mittels HPLC und PAGE auf ihre Reinheit überprüft; vergl. Agrawal et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7790-7794.
- Das Oligonucleotid, das als Vergleich in diesen Experimenten verwendet wird, ist das 20-mer Phosphorthioat, dessen Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 10) zu einem Bereich der gag-Region (Nucleotidnummern 327 bis 346) des HIV-1-Genoms (siehe SEQ ID Nr. 11) komplementär ist. Ebenso wie die erfindungsgemäßen Oligonucleotide besitzt das 20-mer Phosphorthioat- Internucleotidbindungen. Es besitzt jedoch weniger HIV-1-innibitorische Aktivität als die erfindungsgemäßen Oligonucleotide, wie die folgenden Beispiele zeigen.
- Zur Bestimmung der Spezifität der Antisense-Oligonucleotide kann ihr biologischer Effekt mit Oligonucleotiden gleicher Größe, die aber nicht komplementar zu irgendwelchen zellulären oder viralen Genen sind, verglichen werden. Es werden drei solcher nicht spezifischen Kontrolloligonucleotide ausgewählt, von denen eines mit einer "randomisierten" Sequenz theoretisch das Beste ist. Die randomisierte Sequenz wird als degeneriertes Oligonucleotid hergestellt mittels Koppeln einer Mischung von vier Nucleotiden in jeder Phase (theoretisch enthält es 428 = 7,2 x 10¹&sup6; Sequenzen), und mißt so das Ausmaß der unspezifischen Sequenzinhibition.
- Die folgenden Nachweise werden zur Messung der Fähigkeit der erfindungsgemäßen Oligonucleotide zur Ihbibierung der HIV-1-Replikation verwendet.
- Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Oligonucleotide zur Inhibierung der HIV-1-Replikation und somit der Synzytienbildung in Zellkultur wird in T-Zellkulturen nach der Methode von Agrawal und Sarin (1991, s.o.) getestet. Kurz gesagt, werden CEM-Zellen mit HIV-1- Virionen (0,01-0,1 TCID&sub5;&sub0;/Zelle) für eine Stunde bei 37ºC injiziert. Nach einer Stunde werden nicht absorbierte Virionen abgewaschen und die in:zierten Zellen auf die Vertiefüngen (wells) von 24-Wellplatten verteilt. Zu den infizierten Zellen wird eine geeignete Konzentration (aus der Stammlösung) des Oligonucleotids zugesetzt, um die gewünschte Konzentration in 2 ml Medium zu erhalten. Die Zellen werden dann für drei Tage kultiviert.
- Danach werden die infizierten Zellen visuell auf Synzytienbildung untersucht oder mit Trypanblau oder CTT zur Bestimmung des zytopathischen Effekts angefärbt.
- Die HIV-Expression kann durch Messen des Expressionsgrades des viralen p24-Proteins in CEM-Zellen nach Agrawal und Sarin (1991), Adv. Drug Deliverv Rev., 6:251-270 bestimmt werden. Die Zellen werden pelletiert und dann in Phosphatkochsalzlösung mit einer Konzentration von ungefähr 10&sup6;/ml resuspendiert. Die Zellen werden auf toxoplasmotische Objektträger aufgetropft, luftgetrocknet und für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) in Methanol/Aceton (1:1) fixiert. Die Objektträger werden dann mit 10% normalem Ziegenserum für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Anti-p24-monoklonaler Antikörper wird in jede Vertietung gegeben und die Objektträger werden in einer Feuchtekammer bei 37ºC inkubiert. Die Objektträger werden mit Ziege-Anti-Maus-IgG für 30 Minuten markiert und dann über Nacht in PBS gewaschen. Der Prozentsatz an fluoreszierenden Zellen in Oligonucleotid-behandelten und -unbehandelten Zellen wird verglichen.
- HIV-induzierter zytopathischer Effekt wird durch Messen der Verringerung der Anzahl an lebensfähigen Zellen nach der Infektion bestimmt. Die Zellen werden nach Zusatz von MTT oder Trypanblan gezählt und es wird bestimmt, wieviele Zellen (tote) den Farbstoff aufgenommen haben. Der Nachweis wird dreimal durchgeführt.
- Dieser Nachweis wird nach Agrawal et al. (1991), Adv. Drug Deliverv Rev., 6:251-270 durchgeführt. Die Uberstände von Virus-infizierten Kulturen mit oder ohne Oligonucleotid werden gesammelt und die Viruspartikel mit Polyethylenglykol ausgefällt. Das Viruspellet wird in 300 µl Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 5 mM Dithiothreit (DTT), 250 mM KCl und 25% Triton X-100 suspendiert. Die Reverse Transkriptaseaktivität im aufgenommenen Pellet wird in einer 50 µl Reaktionsmischung enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 5 mM DTT, 100 mM KCl, 0,01% Triton X-100, 5 µg (dT)&sub1;&sub5;(rA)n als Matrizenprimer, 10 mM MgCl&sub2;, 15 µM [³H]dTTP (15 Ci/mmol) und 10 µl der zerstörten Virussuspension nachgewiesen. Nach einer Stunde Inkubation bei 37ºC und anschließender Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA wird die Aufnahme der radioaktiven Nucleotide in der in kalter Trichloressigsäure unlöslichen DNA-Fraktion mittels eines β-Szintillationszählers nachgewiesen.
- Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotide, die HIV-1-Infektion in einer Anzahl von etablierten Zellinien zu inhlbieren, kann mit den nachfolgend beschriebenen Kurzzeit- (akute Infektion) und Langzeitnachweisen gezeigt werden.
- 1. In CEM-Zellen:
- CEM-Zellen (5 x 10&sup4; Zellen/ml) werden mit HIV-1 (HTLV-IIIB-Stamm) 4 Stunden bei 37ºC infiziert. Infizierte und nicht infizierte Zellen werden dann mit und ohne Oligonucleotid, wie dem 25-mer oder einem Kontrolloligonucleotid, das keine Aktivität besitzt (wie ein 20-mer der SEQ ID Nr. 10), bis zu 6 Tage bei 37ºC (in dreifacher Ausfijiiruhg) kultiviert. Die Konzentrationen, bei denen das 25-mer getestet wird, sind 0,32 µg/ml (0,04 µM), 1,0 µg/ml (0,125 µM), 3,2 µg/ml (0,4 µM), 10 µg/ml (1,25 µM), 32 µg/ml (4 µM) und 100 µg/ml (12,5 µM). Die effektive Konzentration, bei der die Virusreplikation zu 50% inhibiert wird (EC&sub5;&sub0;), wird graphisch dargestellt. Nach dem Experiment wird der HIV-1-Expressionsgrad durch den Synzytiumbildungsnachweis (Tabelle 3A) und den p24-Expressionsnachweis (Tabelle 38) gemessen. Die Zytotoxizitat wird colorimetrisch nach der Zugabe von MTT in die Vertiefungen, wie vorstehend beschrieben, gemessen (Tabelle 3C). TABELLE 3A Synzytien-Inhibitions-Nachweis
- * Durchschnittliche Anzahl der in der Kantrolle gebildeten Synzytien (infizierte, aber unbehandelte Zellen) betrug 153.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid, und zwar das 25-mer, die Synzytienbildung bei niedrigerer Konzentration (1,0 µg/ml) stärker üihibiert (30%) als das 20- mer. Zusätzlich war die effektive Konzentration des 25-mers für eine 50%ige Inhibition der Virusreplikation (EC&sub5;&sub0;) geringer als die des 20-mers, was eme größere Aktivtät des 25-mers zeigt. TABELLE 3B HIV-p24 Antigen-Nachweis
- Das 25-mer war in der Lage, die p24-Expression mit fast 50% bei einer geringeren Konzentration als das 20-mer zu unterdrücken. Weiterhin war das 25-mer bei hohen Konzentrationen (100 µg/ml) fast zweimal so effektiv bei der Verminderung der p24- Expression als das 20-mer. Dies zeigt, daß das 25-mer eine hohe Aktivität bei der Inlubierung der HIV-1-Expression besitzt. TABELLE 3C HIV-Zytopathie-Nachweis TABELLE 3C
- Die EC&sub5;&sub0; des 25-mers war deutlich geringer als die des 20-mers in jedem der drei durchgeführten Experimente. Dies zeigt, daß das 25-mer eine geringere Zytotoxizität als das 20-mer besitzt.
- H9-Zellen werden mit HIV-1 (HTLV-IIIB- oder HTLV-IIIMN- Stamm) mit 0,01-0,1 TCID&sub5;&sub0;/Zelle eine Stunde bei 37ºC injiziert. Die TCID&sub5;&sub0; wird mittels Infektion von H9-Zellen mit begrenzten Virusverdünnungen und anschließender zweiwöchiger Kultivierung bestimmt. Die Kulturen werden in vierfacher Ausfertigung bei lofacher Verdünnung von HIV-1 präpariert. Nach der Infektion werden nicht absorbierte Virionen durch Waschen entfernt. infizierte Zeilen werden mit Oligonucleotidkonzentrationen (0,005, 0,02, 0,13 und 0,6 µM) 3 bis 4 Tage bei 37ºC kultiviert. Der HIV-1-Expressionsgrad wird durch Messen von p24 im Überstand mit einem auf monoklonalem Antikörper basierenden p24-Antigen-Einfangtest (DuPont) überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Die Zytotoxizität wird durch drei- bis viertägiges Kultivieren nicht infizierter Zellen mit dem 25-mer und Zählen der Zellen in einem Zellzählautomaten (Coulter-Counter) bestimmt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 4 und in Fig. 5 gezeigt. TABELLE 4 HIV-p24 -Antigen-Nachweis
- Diese Ergebnisse zeigen, daß das 25-mer bei geilngeren Konzentrationen bei der Inhibierung der p24-Expression und somit der HIV-1-Replikation effektiver ist als AZT.
- Chronisch infizierte CEM-Zellen werden mit dem 25-mer bei Konzentrationen von 200, 64 30 und 20 µg/ml bei 37ºC kultiviert. Nach 24 und 43 stündiger Behandlung werden die Überstände von den behandelten Zellen entfernt und der Reverse Transkriptaseaktivitätsgrad (vergl. Sarin et al. (1987), J. Natl. Cancer Inst., 78:663-666) wird bestimmt. Die Werte werden mit den Reverse Transkriptasewerten von unbehandelten infizierten Kontrollzellen verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. TABELLE 5 Anti-HIV-Aktivität des 25mers in chronisch infizierten Zellen
- Das 25-mer war in der Lage, die RT-Aktivität in diesem in vivo-System, sogar nach 2 Tagen, zu inhibieren, im Gegensatz zu den Nucleotidanaloga, die anscheinend keinen Effekt in chronisch infizierten Zellen haben.
- H9-Zellen werden mit HIV-1 (HTLV-IIIB) mit 0,01-0,1 TCID&sub5;&sub0;/Zelle für 2 Stunden infziert. Die nicht absorbierten Virionen werden durch Waschen entfernt, die Zellen zu 2 x 10&sup5; Zellen/ml verdünnt und bei 37ºC kuitmert. Alle 3 bis 4 Tage werden die Zellen zu 2 x 10&sup5;/ml verdünnt und dann in frischem Medium mit 5 µg/ml (0,7 µM) des 25-mers oder ddC kultiviert. Bei der routinemäßigen Zellverdünnung wird der Überstand entfernt und der p24-Expressionsgrad mit dem Antigeneinfangnachweis (DuPont) gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt und in Tabelle 6 zusammengefaßt. TABELLE 6 Inhibition der HIV-1-Replikation des 25mers in Langzeitkulturen
- * p24-Inhibition, verglichen mit der Kontrolle
- Diese Ergebnisse zeigen, daß das 25-mer die p24-Expression und somit die HIV-1-Replikation mit einer größeren Effizienz als ddC inhibieren kann und somit wesentlich aktiver als ddC im Langzeitnachweis (mehr als 10 Tage) ist. Das kann daran liegen, daß Nucleotidanaloga emplindlicher gegen Nucleaseabbau sind als Oligonucleotide mit Phosphorthioatbindungen.
- Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide sind also spezifischer, weniger toxisch und besitzen eine größere Nucleaseresistenz als viele andere bekannte chemotherapeutische Verbindungen für die Inhibierung der HIV-1-Replikation. Zusätzlich sind sie aktiver bei der Inhibierung der viralen Replikation als andere bekannte Antisense-Oligonucleotide, die eine kürzere Sequenz als die HIV-1-gag-Sequenz von 324 bis 348 besitzen. Zum Beispiel ist das im Sequenzprotokoll mit SEQ ID Nr. 10 aufgeführte 20-mer weniger aktiv als das erfindungsgemäße 25-mer. Zusätzlich ist ein 28-mer (vergl. Maktsukura et al. (1991), Prospekts for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS Wiley-Liss, Inc., Seiten 159-178), das zu einem Bereich der gag-Region komplementär ist, die den Bereich von 324 bis 348 überlappt (FIG. 3), ebenfalls deutlich weniger aktiv. Das kann daran liegen, daß die Ribosomenbindungsstelle (AUG) und die flankierenden Regionen von den erfindungsgemäßen Oligonucleotiden, die mindestens 25 Nucleotide lang sind, sicher abgedeckt wird. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Oligonucleotide nach der Hybridisierung nicht mehr so leicht durch das Ribosom verdrängt werden und so die HIV-1nfektion verhindern. Weiterhin ergibt die Konservierung dieser gag-Region, daß Ausreißmutanten vermieden werden. Dieser Effekt kann weiter mittels erfindungsgemäßen Oligonucleotiden in Verbindung mit anderen Anti- HIV-Oligonucleotiden oder Anti-HIV-Arzneistoffen verstärkt werden.
- (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
- (i) ANMELDER: HYBRIDON, INC.
- (ii) BEZEICHUUNG DER ERFINDUNG: Therapeutisches Anti-HIV Oligonucleotid und Arzneimittel
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 11
- (iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
- (A) ADRESSE: Allgretti & Witcow, Ltd.
- (B) STRASSE: 10 S. Wacker Drive, Suite 3000
- (C) STADT: Chicago
- (D) BUNDESLAND: Illinois
- (E) LAND: U.S.A.
- (F) POSTLEITZAHL: 60606
- (v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
- (A) DATENTRÄGER: Diskette
- (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0 Version# 1.25
- (vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
- (A) ANMELDENUMMER: EP 93 92 4289.7-2105
- (B) ANMELDETAG:
- (C) KLASSIFICATION:
- (viii) VERTRETER:
- (A) NAME: Kerner, Ann-Louise
- (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33,523
- (C) REFERENZNUMMER: 92,623
- (ix) TELEKOMMUNIKATION:
- (A) TELEFON: 001-617-345-9100
- (B) TELEFAX: 001-617-345-9111
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzeistrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENSE: ja
- (ix) MERKMAL:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: GEM 90
- (B) LAGE: zu den Basenpaaren 324-348 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LANGE: 26 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: ja
- (ix) MERKMAL:
- (B) LAGE: zudenbasenpaaren 323-348 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
- CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTA 26
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LANGE: 26 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: ja
- (ix) MERKMAL:
- (B) LAGE: zu den Basenpaaren 324-349 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
- GCTCTCGCAC CCATCTCTCT CCTTCT 26
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 27 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKULTYP: cDNA
- (i) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: ja
- (ix) MERKMAL:
- (B) LAGE: zu den Basenpaaren 323-349 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
- GCTCTCGCAC CCATCTCTCT CCTTCTA 27
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 28 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzeistrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKULTYP: cDNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: ja
- (ix) MERKMAL:
- (B) LAGE: zu den Basenpaaren 322-349 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
- GCTCTCGCAC CCATCTCTCT CCTTCTAG 28
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LANGE: 28 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKULTYP: cDNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: ja
- (ix) MERKMAL:
- (B) LAGE: zu den Basenpaaren 323-350 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
- CGCTCTCGCA CCCATCTCTC TCCTTCTA 28
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKULTYP: cDNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: ja
- (ix) MERKMAL:
- (B) LAGE: zu den Basenpaaren 322-350 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
- CGCTATCGCA CCCATCTCTC TCCTTCTAG 29
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKULTYP: cDNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: ja
- (ix) MERKMAL:
- (B) LAGE: zu den Basenpaaren 321-350 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
- CGCTCTCGCA CCCATCTCTC TCCTTCTAGC 30
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzeistrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKULTYP: cDNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: ja
- (ix) MERKMAL:
- (B) LAGE: zu den Basenpaaren 322-351 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
- ACGCTCTCGC ACCCATCTCT CTCCTTCTAG 30
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LANGE: 20 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKULTYP: cDNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: ja
- (ix) MERKMAL:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: GEM 90
- (B) LAGE: zu den Basenpaaren 327-346 der HIV-1-DNA komplementär
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
- CTCGCACCCA TCTCTCTCCT
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LANGE: 70 Basenpaare
- (B) ART: Nucleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA von genomischer RNA
- (iii) HYPOTHETISCH: nein
- (iv) ANTISENS: nein
- (vi) URSPRUNGLICHE HERKUNFT: HIV-1
- (viii) POSITION IM GENOM: 311-380
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
- ACTAGCGGAG GCTAGAAGGA GAGAGATGGG TGCGAGAGCG 40
- TCAGTATTAA GCGGGGGAGA ATTAGATCGA 70
Claims (24)
1. Ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die mindestens komplementär ist zu
den Nucleotiden 324 bis 348 der konservierten gag-Region des HIV-1-Genoms, wobei das
Oligonucleotid 25 bis 30 Nueleotiden umfaßt, die durch mindestens eine
Nichtphosphodiester-Internucleotidbindung verbunden sind, wobei die Bindung die
Oligonucleotidresistenz gegenüber Nucleaseabbau verstärkt.
2. Das Oligonucleotid nach Anspruch 1, in dem mindestens eine der
Nichtphosphodiester-Internucleotidbindungen eine Phosphorthioatbindung ist.
3. Das Oligonucleotid nach Anspruch 2, in dem das Oligonucleotid mindestens 25
Nucleotide hat.
4. Das Oligonucleotid nach Anspruch 3 mit der im Sequensprotokoll als SEQ ID NO: 1
aufgeführten Nucleotidsequenz.
5. Das Oligonucleotid nach Anspruch 2, in dem das Oligonucleotid mindestens 26
Nucleotide hat.
6. Das Oligonucleotid nach Anspruch 5 mit der im Sequenrprotokoll als SEQ ID NO:2
aufgeführten Nucleotidsequenz.
7. Das Oligonucleotid nach Anspruch 5 mit der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:3
aufgeführten Nucleotidsequenz.
8. Das Oligonucleotid nach Anspruch 2, in dem das Oligonucleotid mindestens 27
Nucleotide hat.
9. Das Oligonucleotid nach Anspruch 8 mit der ün Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:4
aufgeführten Nucleotidsequenz.
10. Das Oligonucleotid nach Anspruch 2, in dem das Oligonucleotid mindestens 28
Nucleotide hat.
11. Das Oligonucleotid nach Anspruch 10 mit der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:5
aufgeführten Nucleotidsequenz.
12. Das Oligonucleotid nach Anspruch 10 mit der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:6
aufgeführten Nucleotidsequenz.
13. Das Oligonucleotid nach Anspruch 2, in dem das Oligonucleotid mindestens 29
Nucleotide hat.
14. Das Oligonucleotid nach Anspruch 13 mit der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:7
aufgeführten Nucleotidsequenz.
15. Das Oligonucleotid nach Anspruch 2, in dem das Oligonucleotid mindestens 30
Nucleotide hat.
16. Das Oligonucleotid nach Anspruch 15 mit der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:8
aufgeführten Nucleotidsequenz.
17. Das Oligonucleotid nach Anspruch 15 mit der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:9
aufgeführten Nucleotidsequenz.
18. Eine therapeutische Formulierung, umfassend das Oligonucleotid nach Anspruch 1 in
einem physiologisch verträglichen Träger.
19. Eine therapeutische Formulierung, umfassend das Oligonucleotid nach Anspruch 4 in
einem physiologisch verträglichen Träger.
20. Eine therapeutische Formulierung, umfassend ein erstes und zweites Anti-HIV-1-
Antisense-Oligonucleotid, wobei das erste Oligonucleotid das Oligonucleotid nach
Anspruch 1 ist.
21. Ein Verfahren zur lilhibierung der HIV-1-Proliferation, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer therapeutischen Formulierung, umfassend das Oligonucleotid
nach Anspruch 1 in einem physiologisch verträglichen Träger; und
(b) Behandeln von HIV-1 infizierten Zellen in vitro mit der therapeutischen
Formulierung in einer Menge, die ausreichend ist, um die Bindung des
Oligonucleotids an die gag-Region jeder proviralen HIV-1-DNA oder mRNA in
infizierten Zellen zu errnöglichen, wobei die Bindung des Oligonucleotids an die HIV-
1-DNA oder mRNA die Proliferation von HIV-1 inhibiert.
22. Das Verfahren nach Anspruch 21, in dem der Bereitstellungsschritt das Bereitstellen
eines Oligonucleotids mit 25 Nucleotiden, verbunden durch mindestens eine
Phosphorthioatbindung umfaßt, und die Sequenz des Oligonucleotids im Sequenzprotokoll
unter SEQ ID NO: 1 aufgefut ist.
23. Ein Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Verwendung als ein
therapeutisches Mittel.
24. Die Verwendung eines Oligonucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur
Herstellung einer pharmazeutischen Forrnulierung zur Inhibierung der HIV-1-Proliferation.
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