TW202134435A - 補體成分ｃ３ ｉｒｎａ組成物及其使用方法 - Google Patents

補體成分ｃ３ ｉｒｎａ組成物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明係有關一種靶向補體成分C3基因(C3)之RNAi劑，例如，雙股RNA(dsRNA)劑。本發明亦有關一種使用此等RNAi劑抑制C3基因表現之方法，及預防與治療C3-相關疾患之方法，例如，冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。

Description

補體成分C3 IRNA組成物及其使用方法 相關申請案
本申請案主張2019年10月22日申請之美國臨時申請案案號62/924,210之優先權益，其完整內容已以引用之方式併入本文中。
序列表
本申請案包含之序列表已呈ASCII格式電子檔交付，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。該於2020年10月16日製作之ASCII複本名稱為121301_10520_SL.txt，檔案大小為1,327,438bytes。
本發明係關於靶向補體成分C3基因之iRNA組成物及其使用方法。
最早在1890年代發現補體，當時發現可以藉由正常血清中所包含之熱失穩化抗體協助或「補充」殺死細菌(Walport,M.J.(2001)N Engl J Med.344：1058)。補體系統係由超過30種蛋白質組成，其係呈可溶性蛋白質存在於血液中或呈膜結合蛋白質存在。激活補體將產生一連串級聯酵素反應，已知為 補體活化途徑，結果將形成強力過敏毒素C3a與C5a，引發過多生理反應，範圍從化學趨性至細胞凋亡。最初認為補體在先天性免疫力中扮演重要角色，其會對抗入侵病原菌建立可靠及快速反應。然而，最近越來越多證據顯示補體亦在涉及T與B細胞之後天性免疫力中扮演重要角色，協助消除病原菌(Dunkelberger JR與Song WC.(2010)Cell Res.20：34；Molina H等人(1996)Proc Natl Acad Sci U S A.93：3357)，維持免疫記憶以預防病原菌再度入侵，及涉及許多人類病理狀態((Qu,H，等人(2009)Mol Immunol.47：185；Wagner,E.與Frank MM.(2010)Nat Rev Drug Discov.9：43)。
已知補體活化作用係透過三種不同途徑發生：旁路途徑、經典途徑與凝集蛋白途徑(圖1)，其所涉及之蛋白質主要呈無活性之酶原存在，以後再經過裂解及激活。
經典途徑經常受到抗體-抗原複合物或受到C-反應性蛋白質(CRP)激活，此二者均與補體成分C1q交互反應。此外，在沒有免疫複合物存在時，經典途徑可受到細胞凋亡體中存在之磷脂醯絲胺酸激活。
凝集蛋白途徑係由甘露糖結合性凝集蛋白(MBL)結合在病原體表面之複合碳水化合物殘基而啟動。激活經典途徑或凝集蛋白途徑造成(C4b2b)C3轉化酶活化。
旁路途徑係與標靶表面藉由C3水解而自發性產生之C3b結合而激活。此表面結合之C3b隨後被因子B辨識，形成複合物C3bB。C3bB複合物進而被因子D裂解，產生AP之活性型C3轉化酶(C3bBb)。兩種型態之C3轉化酶均裂解C3，形成C3b。C3b隨後係與更多因子B結合，透過AP(所謂的旁路或擴增環路)增強補體活化，或造成活性C5轉化酶(C3bBbC3b或 C4bC2bC3b)的形成，該C5轉化酶裂解C5，並啟動後來的過程，結果形成膜攻擊複合物(MAC)(C5b-9)。
補體系統之不當激活會造成許多不同疾病的擴大及/或引發，包括例如，陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、非典型溶血性***候群(aHUS)、視神經脊髓炎(NMO)、多灶性運動神經病變(MMN)、重症肌無力(MG)、C3腎小球腎炎、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、缺血-再灌流傷害、及神經退化性疾病。
可用於治療補體成分C3-相關疾病之療法有限，其等為高成本之耗時及侵入性投藥。因此，對患有補體成分C3-相關疾病之個體，相關技藝中需要替代的療法與組合療法。
本發明提供一種iRNA組成物，其影響RNA-誘發靜默複合物(RISC)所介導編碼補體成分C3之基因之RNA轉錄本的裂解。補體成分C3可在細胞內，例如，個體(如人類個體)之細胞內。
一項態樣中，本發明提供一種抑制細胞中補體成分C3表現之雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中該dsRNA劑包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：1之差異不超過0、1、2、或3個核苷酸，且該反義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：5之差異不超過1、2、或3個核苷酸。
另一態樣中，本發明提供一種抑制細胞中補體成分C3表現之雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含形成雙股區之正義股與反義股，其 中該反義股包含對編碼補體成分C3之mRNA之互補區，且其中該互補區包含至少15個連續核苷酸，其與表2-7、15、18、20-23、30、與31之任一表中之任一個反義核苷酸序列之差異不超過0、1、2、或3個核苷酸。
一項態樣中，本發明提供一種抑制細胞中補體成分C3表現之雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：1之核苷酸475-497、487-509、490-512、491-513、705-727、809-831、813-835、1147-1169、1437-1459、1439-1461、1447-1469、2596-2618、2634-2656、3012-3034、3334-3356、3611-3633、3614-3636、3622-3655、3809-3831、3846-3868、3847-3869、3920-3942、4047-4069、4061-4083、4156-4178、4157-4177、4162-4184、4178-4200、4226-4248、4369-4391、4392-4414、4521-4543、4522-4544、4523-4545、5012-5034中任一個核苷酸序列之差異不超過0、1、2、或3個核苷酸，及該反義股包含來自對應核苷酸序列SEQ ID NO：5之至少19個連續核苷酸。
一項具體例中，正義股包含至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NO：1之核苷酸705-727、809-831、或634-2656中任一個核苷酸序列之差異不超過0、1、2、或3個核苷酸。另一項具體例中，正義股包含至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NO：1之核苷酸634-2656之核苷酸序列之差異不超過0、1、2、或3個核苷酸。
一項具體例中，反義股包含至少15個連續核苷酸，其與選自下列各者所成群組之雙螺旋之任一反義股核苷酸序列之差異不超過0、1、2、或3個核苷酸：AD-565541.2、AD-564742、AD-567304、AD-568978、AD- 569164、AD-569272.2、AD-569765.2、AD-564730.2、AD-567315、AD-564745.2、AD-571715.2、AD-570714、AD-571826、AD-572041.2、AD-572039.2、AD-572387、AD-568586.2、AD-566837.2、AD-566444.2、AD-567700.2、AD-567814.2、AD-568003.2、AD-569164.2、AD-569763.2、AD-565281.2、AD-571539.2、AD-572389.2、AD-567315.2、AD-571752.2、AD-568026.2、AD-571298、AD-572110.2、AD-572062.2、AD-572388.2、AD-572040.2、AD-567713.2、AD-567521.2、AD-567066.2、AD-1181519、AD-569268、或AD-570714。
一項具體例中，反義股包含至少15個連續核苷酸，其與選自下列各者所成群組之雙螺旋之任一反義股核苷酸序列之差異不超過0、1、2、或3個核苷酸：AD-1181519、AD-569268、或AD-570714。另一項具體例中，反義股包含至少15個連續核苷酸，其與AD-570714之反義股核苷酸序列之差異不超過0、1、2、或3個核苷酸。
一項具體例中，dsRNA劑包含至少一個經修飾核苷酸。
一項具體例中，正義股之實質上所有核苷酸包含修飾；反義股之實質上所有核苷酸包含修飾；或正義股之實質上所有核苷酸與反義股之實質上所有核苷酸包含修飾。
一項具體例中，正義股之所有核苷酸包含修飾；反義股之所有核苷酸包含修飾；或正義股之所有核苷酸與反義股之所有核苷酸包含修飾。
一項具體例中，至少一個經修飾核苷酸係選自下列各者所成群組：去氧-核苷酸、3’-末端去氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核苷酸、非鎖核苷酸、構 形受限之核苷酸、限制乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基-修飾之核苷酸、2’-C-烷基-修飾之核苷酸、2’-羥基-修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基-修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、含非天然鹼基之核苷酸、四氫哌喃修飾之核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、含硫代磷酸酯基團之核苷酸、含甲基膦酸酯基團之核苷酸、含5’-磷酸酯之核苷酸、含5’-磷酸酯擬似物之核苷酸、熱失穩化核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)、及2-O-(N-甲基乙醯胺)修飾之核苷酸；與其組合。
一項具體例中，核苷酸之修飾係選自下列各者所成群組：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2’-羥基、與二醇；及其組合。
一項具體例中，至少一個經修飾核苷酸係選自下列各者所成群組：去氧-核苷酸、2'-O-甲基修飾核苷酸、2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧修飾核苷酸、二醇修飾核苷酸(GNA)，例如，Ggn、Cgn、Tgn、或Agn，及乙烯基-膦酸酯核苷酸；及其組合。
另一項具體例中，核苷酸之至少一個修飾為熱失穩化核苷酸修飾。
一項具體例中，熱失穩化核苷酸修飾係選自下列各者所成群組：無鹼基修飾；與雙螺旋中對向核苷酸之錯配；及失穩化糖修飾、2’-去氧修飾、無環核苷酸、非鎖核酸(UNA)、與甘油核酸(GNA)。
雙股區可為19-30對核苷酸之長度；19-25對核苷酸之長度；19-23對核苷酸之長度；23-27對核苷酸之長度；或21-23對核苷酸之長度。
一項具體例中，各股獨立地為不超過30個核苷酸之長度。
一項具體例中，正義股為21個核苷酸之長度，及反義股為23個核苷酸之長度。
互補區可為至少17個核苷酸之長度；19至23個之間之核苷酸長度；或19個核苷酸之長度。
一項具體例中，至少一股包含至少1個核苷酸之3’突出。另一項具體例中，至少一股包含至少2個核苷酸之3’突出。
一項具體例中，dsRNA劑進一步包含配體。
一項具體例中，配體係接合至dsRNA劑正義股之3’端。
一項具體例中，配體為N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
一項具體例中，配體為透過單價、二價、或三價之分支連接基附接之一或多個GalNAc衍生物。
一項具體例中，配體為
Figure 109136475-A0202-12-0007-1
一項具體例中，dsRNA劑係接合至如下方案所示之配體
Figure 109136475-A0202-12-0008-2
及其中X為O或S。
一項具體例中，X為O。
一項具體例中，dsRNA劑進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結。
一項具體例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結在一股(例如，反義股或正義股)之3’-末端。
另一項具體例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結在一股(例如，反義股或正義股)之5’-末端。
一項具體例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結在一股之5’-與3’-兩個末端。一項具體例中，該股為反義股。
一項具體例中，位在雙螺旋反義股5'-端1-位置之鹼基對為AU鹼基對。
本發明亦提供一種細胞，其包含任何本發明dsRNA劑及含有任何本發明dsRNA劑之醫藥組成物。
本發明醫藥組成物可包括在未緩衝溶液(例如，生理鹽水或水) 中之dsRNA劑，或本發明醫藥組成物可包括在緩衝溶液(例如，包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽或其任何組合之緩衝溶液；或磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS))中之dsRNA劑。
一項態樣中，本發明提供一種抑制細胞中之補體成分C3基因表現之方法。該方法包括由細胞與任何本發明dsRNA或任何本發明醫藥組成物接觸，藉以抑制細胞中之補體成分C3基因表現。
一項具體例中，細胞係在個體內，例如，人類個體，例如，患有補體成分C3-相關疾患之個體，如選自下列各者所成群組之補體成分C3-相關疾患：冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
一項具體例中，由細胞與dsRNA劑接觸，抑制補體成分C3表現至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%。
一項具體例中，抑制補體成分C3表現使個體血清中之補體成分C3蛋白質含量降低至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%。
一項態樣中，本發明提供一種治療患有因補體成分C3表現減低而受益之疾患之個體之方法。該方法包括對該個體投與醫療有效量之任何本發明dsRNA或任何本發明醫藥組成物，藉以治療患有因補體成分C3表現減低而受益之疾患之個體。
另一項態樣中，本發明提供一種為患有因補體成分C3表現減低而受益之疾患之個體預防至少一種症狀之方法。該方法包括對該個體投與預防有效量之任何本發明dsRNA或任何本發明醫藥組成物，藉以為患有因補體 成分C3表現減低而受益之疾患之個體預防至少一種症狀。
一項具體例中，該疾患為補體成分C3-相關疾患，例如，補體成分C3-相關疾患係選自下列各者所成群組：冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
一項具體例中，補體成分C3-相關疾患為冷凝集素症(CAD)。
一項具體例中，個體為人類。
一項具體例中，對個體投與製劑，引起降低的溶血及/或降低的C3蛋白質累積。
一項具體例中，dsRNA劑投與個體之劑量為約0.01mg/kg至約50mg/kg。
一項具體例中，dsRNA劑係經皮下投與個體。
一項具體例中，本發明方法進一步包括在來自個體之樣本中測定補體成分C3含量。
一項具體例中，個體樣本中之補體成分C3含量為血液或血清樣本中之補體成分C3蛋白質含量。
一項具體例中，本發明方法進一步包括對該個體投與治療溶血之額外醫療劑。
本發明亦提供一種套組，其包含本發明任何dsRNA或本發明任何醫藥組成物，及視需要之使用說明書。
圖1流程式說明三種補體途徑：旁路、經典與凝集蛋白。
圖2為出示小鼠(每組n=3)經皮下投與單劑2mg/kg劑量之指定dsRNA雙螺旋，於投藥後第14天之C3 mRNA含量之圖式。C3 mRNA含量係相對於PBS處理組所檢測對照含量來表示。
圖3為出示小鼠(每組n=3)經皮下投與單劑2mg/kg劑量之指定dsRNA雙螺旋，於投藥後第14天之C3 mRNA含量之圖式。C3 mRNA含量係相對於PBS處理組所檢測對照含量來表示。
圖4為出示小鼠(每組n=3)經皮下投與單劑2mg/kg劑量之指定dsRNA雙螺旋，於投藥後第14天之C3 mRNA含量之圖式。C3 mRNA含量係相對於PBS處理組所檢測對照含量來表示。
圖5為說明食蟹獼猴(Cynomolgus)經皮下投與單劑3mg/kg或25mg/kg劑量之指定dsRNA雙螺旋之處理組之列表。
圖6為出示皮下投與之單劑3mg/kg或25mg/kg劑量之指定dsRNA雙螺旋對食蟹獼猴血清中C3蛋白質含量殘留%之影響之圖式，其係相對於投藥前之平均C3蛋白質含量標準化。所有組的基線均調整至第一天投藥時。
圖7為說明食蟹獼猴經皮下投與單劑3mg/kg劑量之指定dsRNA雙螺旋之處理組之列表。
圖8為出示皮下投與單劑3mg/kg或25mg/kg劑量之指定dsRNA雙螺旋對食蟹獼猴血清中C3蛋白質含量殘留%之影響之圖式，其係相對於投藥前之平均C3蛋白質含量標準化。
圖9為說明食蟹獼猴經皮下投與單劑3mg/kg、9mg/kg、或25mg/kg劑量，或多重劑量之3mg/kg(3 x 3)之指定dsRNA雙螺旋之處理組及投藥時程及活體組織檢測。
圖10為出示皮下投與之單劑3mg/kg或25mg/kg劑量之指定dsRNA雙螺旋對食蟹獼猴血清中C3蛋白質含量殘留%之影響之圖式，其係相對於投藥前之平均C3蛋白質含量標準化。第2組，圖中第-6天係對應於第-27天，及第1天係指投與雙螺旋當天。
本發明提供一種iRNA組成物，其作用於補體成分C3基因之RNA轉錄本之RNA-誘發靜默複合物(RISC)介導之裂解。該基因可在細胞內，例如，在個體(如人類)內之細胞內。使用此等iRNA可以靶向哺乳動物中對應基因(補體成分C3基因)之mRNA降解。
本發明iRNA已設計用於靶向人類補體成分C3基因，包括保留在其他哺乳動物物種之補體成分C3直系同源基因之一部份。在不受理論限制下，咸信此等iRNA之上述性質與特定標靶位點或特定修飾之組合或次組合將賦予本發明iRNA改良之效力、安定性、藥效、持續性、與安全性。
因此，本發明提供一種治療及預防補體成分C3-相關疾患之方法，例如，冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變，其係使用iRNA組成物，作用於補體成分C3基因之RNA轉錄本之RNA-誘發靜默複合物(RISC)所介導之 裂解。
本發明iRNA包括具有區長度為至多約30個或更少核苷酸之RNA股(反義股)，例如，19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22個核苷酸之長度，該區係與補體成分C3基因之至少一部份mRNA轉錄本實質上互補。
某些具體例中，本發明雙股RNAi劑之一股或兩股為至多66個核苷酸之長度，例如，36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53個核苷酸之長度，其具有與補體成分C3基因之至少一部份mRNA轉錄本實質上互補之至少19個連續核苷酸的區。有些具體例中，此等具有較長反義股之iRNA劑較佳可包括20-60個核苷酸長度之第二RNA股(正義股)，其中正義股與反義股形成18-30個連續核苷酸之雙螺旋。
使用本發明iRNA可以靶向哺乳動物中對應基因(補體成分C3基因)之mRNA的降解。本發明者採用活體內與活體外分析法，證實靶向C3基因之iRNA可強力介導RNAi，造成C3基因表現的顯著抑制。因此，包括此等iRNA之方法及組成物適用於治療患有補體成分C3-相關疾患之個體，例如，冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
因此，本發明提供一種方法及組合療法，使用作用於C3基因之RNA轉錄本之RNA-誘發靜默複合物(RISC)所介導之裂解之iRNA組成物， 治療患有可因抑制或降低C3基因表現而受益之疾患之個體，例如，補體成分C3-相關疾病，如冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
本發明亦提供一種為患有可因抑制或降低C3基因表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀之方法，例如，冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
例如，在患有冷凝集素症(CAD)之個體中，本發明方法可以預防個體之至少一種症狀，包括例如，溶血、MAC沉積與組織傷害、發炎(例如，慢性發炎)；在患有溫型自體免疫性溶血性貧血之個體中，本發明方法可以預防個體之至少一種症狀，包括例如，溶血、發炎(例如，慢性發炎)、與MAC組織傷害；在患有陣發性夜間血紅素尿症(PNH)之個體中，本發明方法可以預防個體之至少一種症狀，包括例如，溶血、發炎(例如，慢性發炎)、血栓形成、及造血缺陷；在患有狼瘡腎炎(LN)之個體中，本發明方法可以預防個體之至少一種症狀，包括例如，發炎(例如，慢性發炎)、血尿、蛋白尿、水腫、高血壓、與腎衰竭；在患有大水泡性類天疱瘡之個體中，本發明方法可以預防個體之至少一種症狀，包括例如，水疱形成、發炎(例如，慢性發炎)、C3沉積、與MAC組織傷害；在患有天疱瘡，例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)之個體中，本發明方法可以預防個體之至少一種症狀，包括例如，水疱形成、發炎(例如，慢性發炎)、C3沉積、與MAC組織傷害；及在患有C3腎小球 病變之個體中，本發明方法可以預防個體之至少一種症狀，包括例如，發炎(例如，慢性發炎)、血尿、蛋白尿、水腫、高血壓、與腎衰竭。
下列詳細說明揭示如何製造及使用包含iRNA之組成物來抑制補體成分C3基因之表現，及揭示供治療可因抑制及/或降低補體成分C3基因表現而受益之個體，例如，疑似患有或診斷患有補體成分C3-相關疾患之個體之組成物、用途、與方法。
I.定義
為了更容易了解本發明，首先定義某些術語。此外應注意，不論何時出示之參數數值或數值範圍，其均指示該等所出示數值及之間之數值與範圍亦為本發明一部份。
本文所採用冠詞「一種」與「一個」係指該文法上主詞為一個(種)或超過一個(種)(亦即至少一個(種))。例如，「一個元素」係指一個元素或超過一個元素，例如，複數個元素。
本文所採用術語「包括」意指片語「包括但不限於」，並可與其交換使用。
本文所採用術語「或」意指「及/或」，並可與其交換使用，除非另有說明。例如，「正義股或反義股」咸了解為「正義股或反義股或正義股與反義股」。
本文所採用術語「約」係指在相關技藝典型之容許範圍內。例如，咸了解「約」可在平均值之約2個標準偏差範圍內。某些具體例中，約係指±10%。某些具體例中，約係指±5%。當「約」出現在一系列數字或範圍之前時，咸了解「約」可修飾該系列或範圍之各數字。
在數字或一系列數字之前的「至少」咸了解係包括與術語「至少」相鄰之數字，及從內文中即了解在邏輯上包括所有接續數字或整數。例如，核酸分子中之核苷酸數量必需為整數。例如，「21個核苷酸之核酸分子之至少19個核苷酸」意指該19、20、或21個核苷酸具有指示之性質。當「至少」出現在一系列數字或範圍之前時，咸了解「至少」可以修飾該系列或範圍之各數字。
本文所採用「不超過」或「少於」，從內文中即了解在邏輯上指與該片語相鄰之數值及邏輯上較低之數值或整數，直到零。例如，具有包含「不超過2個核苷酸」之突出之雙螺旋具有包含2、1、或0個核苷酸之突出。當「不超過」出現在一系列數字或範圍之前時，咸了解「不超過」可修飾該系列或範圍之各數字。本文所採用之「範圍」包括上限與下限二者。
若序列與轉錄本或其他序列之指示之位點之間有牴觸時，以本說明書中指定之核苷酸序列優先。
本文所採用「補體成分3」可與術語「C3」交換使用，其意指習知之基因與多肽，相關技藝上亦稱為ARMD9、C3a過敏毒素、ASP、補體成分C3a、C3a、補體成分C3b、C3b、prepro-C3、刺激醯化之蛋白質裂解產物、CPAMD1、補體C3、C3、及含類PZP之α-2-巨球蛋白功能域之蛋白質1、補體成分C3、與AHUS5。術語「C3」包括人類C3，其胺基酸與核苷酸序列可參見例如，GenBank登錄號No.NM_000064.3(GI：726965399；SEQ ID NO：1)；小鼠C3，其胺基酸與核苷酸序列可參見例如，GenBank登錄號No.NM_009778.3(GI：773669943；SEQ ID NO：2)；及大鼠C3，其胺基酸與核苷酸序列可參見例如，GenBank登錄號No.NM_016994.2(GI：158138560；SEQ ID NO：3)。
術語「C3」亦包括食蟹獼猴(Macaca fascicularis)C3，其胺基酸與核苷酸序列可參見例如，GenBank登錄號No.XM_005587719.2(GI：982312947；SEQ ID NO：4)，及針對基因ENSP00000245907(基因座=chr19：6921416：6963034)，可進入獼猴基因組計畫網站(the Macaca genome project web site)(http：//macaque.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)。
C3 mRNA序列之其他實例很容易利用例如，GenBank、UniProt、OMIM、及獼猴基因組計畫網站(the Macaca genome project web site)取得。
C3核苷酸序列實例亦可參見SEQ ID NO：1-8。SEQ ID NO：5-8分別為SEQ ID NO：1-4之反向補體序列。
C3之進一步資訊提供於例如，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/718之NCBI基因資料庫。
上述各GenBank登錄號與基因資料庫編號之完整內容已在本申請案申請日以引用之方式併入本文中。
本文所採用術語「補體成分C3」與「C3」亦指C3基因之天然DNA序列變異體。已經判別出C3基因內之許多序列變異，且可參見例如，NCBI dbSNP與UniProt，參見例如，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp？LinkName=gene_snp&from_uid=718，其完整內容已在本申請案申請日以引用之方式併入本文中。
本文所採用「標靶序列」係指在補體成分C3基因轉錄期間所形成mRNA分子之核苷酸序列中之連續部份，包括作為主要轉錄產物之RNA 處理產物之mRNA。序列之標靶部份之長度應為至少足以在或接近補體成分C3基因轉錄期間所形成mRNA分子之核苷酸序列部份之位置作為iRNA所主導之裂解之受質的長度。一項具體例中，標靶序列在補體成分C3之蛋白質編碼區內。
標靶序列之長度可為約19-36個核苷酸，例如，較佳為約19-30個核苷酸之長度。例如，標靶序列可為約19-30個核苷酸、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22個核苷酸之長度。上述範圍與長度之間之範圍與長度亦預料為本發明之一部份。
本文所採用術語「包含序列之股」係指包含核苷酸鏈之寡核苷酸，其係採用標準核苷酸命名法之序列說明。
「G」、「C」、「A」、「T」與「U」分別一般代表核苷酸，其分別包含鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷與尿嘧啶之鹼基。然而，咸了解，術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦指經修飾之核苷酸，如下文中進一步說明，或改用替代置換部份體(參見例如，表1)。習此相關技藝者咸了解，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤與尿嘧啶可在不實質上改變該包含帶有此等置換部份體之核苷酸之寡核苷酸鹼基配對性質下改用其他部份體置換。例如，但不限制，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之核苷酸形成鹼基對。因此，如本發明所說明特徵之dsRNA之核苷酸序列中含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可被含有例如，肌苷之核苷酸置換。另一項實例中，寡核苷酸中任意處之腺嘌呤與胞嘧啶可分別被鳥嘌呤與尿嘧啶置換，與標靶 mRNA形成G-U搖擺鹼基對。含有此等置換部份體之序列適合如本發明所說明特徵之組成物與方法。
本文所採用術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」、「RNA干擾劑」可在本文中交換使用，係指包含如本文術語定義之RNA之製劑，其可經由RNA誘發靜默複合物(RISC)途徑來介導RNA轉錄本的靶向裂解。iRNA透過已知為RNA干擾(RNAi)之過程來主導mRNA之序列特異性降解。該iRNA調控，例如，抑制細胞，例如，個體，如哺乳動物個體內細胞中之補體成分C3基因的表現。
一項具體例中，本發明RNAi劑包括與標靶RNA序列例如，補體成分C3標靶mRNA序列交互作用之單股RNA，以主導標靶RNA的裂解。在不希望受到理論之限制下，咸信經導入細胞中之長雙股RNA被稱為Dicer之第III型內切核酸酶分解成siRNA(Sharp等人(2001)Genes Dev.15：485)。Dicer係一種類似核糖核酸酶-III之酵素，其處理dsRNA成為19至23對鹼基之短型干擾RNA，其特徵在於含兩個鹼基之3'突出(Bernstein等人(2001)Nature 409：363)。該等siRNA隨即併入RNA誘發靜默複合物(RISC)中，其中一或多種解螺旋酶解開siRNA雙螺旋，讓互補反義股導引標靶辨識(Nykanen等人(2001)Cell 107：309)。當與適當標靶mRNA結合時，RISC內之一或多種內切核酸酶裂解標靶，誘發靜默(Elbashir等人(2001)Genes Dev.15：188)。因此本發明一項態樣係有關一種在細胞內產生之單股RNA(siRNA)且其促進RISC複合物的形成，以引起標靶基因(亦即補體成分C3基因)的靜默。因此，本文中亦採用術語「siRNA」意指如上述之iRNA。
某些具體例中，RNAi劑可為經導入細胞或生物體中抑制標靶 mRNA之單股siRNA(ssRNAi)。單股RNAi劑與RISC內切核酸酶(Argonaute 2)結合，然後裂解標靶mRNA。該單股siRNA通常為15至30個核苷酸，且經過化學修飾。單股siRNA之設計與試驗說明於美國專利案案號8,101,348與Lima等人(2012)Cell 150：883-894，其完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。本文說明之任何反義核苷酸序列均可作為本文說明之單股siRNA使用或可採用Lima等人(2012)Cell 150：883-894說明之方法進行化學修飾。
某些具體例中，本發明組成物、用途與方法所使用之「iRNA」係雙股RNA，本文中稱為「雙股RNA劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA劑」或「dsRNA」。術語「dsRNA」係指核糖核酸分子之複合物，其具有雙螺旋結構，包含兩個反向平行且實質上互補之核酸股，相對於標靶RNA(亦即補體成分C3基因)具有「正義」與「反義」取向。有些本發明具體例中，雙股RNA(dsRNA)透過轉錄後基因-靜默機轉(本文稱為RNA干擾或RNAi)啟動標靶RNA(例如，mRNA)之降解。
通常，dsRNA分子之各股核苷酸之大多數為核糖核苷酸，但如同本文之詳細說明，各股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸，例如，去氧核糖核苷酸或經修飾核苷酸。此外，如本說明書所採用，「iRNA」可能包括經化學修飾之核糖核苷酸；iRNA可能在多重核苷酸上包括實質修飾。本文所採用術語「經修飾核苷酸」係指核苷酸分別獨立具有經修飾糖部份體、經修飾之核苷酸間鏈結、或經修飾核鹼基、或其任何組合。因此，術語「經修飾核苷酸」包括對核苷間鏈結、糖部份體、或核鹼基的取代、添加或脫除例如，官能基或原子。適用於本發明製劑之修飾法包括本文所揭示或相關技藝上已知之所有修飾型態。針對本說明書與申請專利範圍目的，「iRNA」或「RNAi劑」包 括用於siRNA型分子之任何此等修飾。
雙螺旋區可為容許所需之標靶RNA透過RISC途徑進行特異性降解之任何長度，且可能在約19至36對鹼基之長度範圍，例如，約19至30對鹼基之長度，例如，約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36對鹼基之長度，如約19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22對鹼基之長度。上述範圍與長度之間之範圍與長度亦計畫為本發明之一部份。
形成雙螺旋結構之兩股可能為一個較大RNA分子之不同部份，或其可能為分開之RNA分子。若這兩股為一個較大RNA分子之一部份，且因此利用形成該雙螺旋結構之其中一股之3’-端與另一股之5’-端之間未中斷之核苷酸鏈連結時，該連結之RNA鏈稱為「髮夾環」。髮夾環可包含至少一個未配對之核苷酸。有些具體例中，髮夾環可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23個或更多個未配對核苷酸。有些具體例中，髮夾環可為10個或更少個核苷酸。有些具體例中，髮夾環可為8個或更少個未配對核苷酸。有些具體例中，髮夾環可為4-10個未配對核苷酸。有些具體例中，髮夾環可為4-8個核苷酸。
若dsRNA之兩個實質上互補股包含在分開之RNA分子時，彼等分子不一定需要，但可以共價連結。若這兩股利用其他除了形成該雙螺旋結構之其中一股之3’-端與另一股之5’-端之間未中斷之核苷酸鏈以外之方式共價 連結時，該連結結構稱為「連接基」。RNA股可能具有相同或不同數量之核苷酸。鹼基對之最高數量即為dsRNA中最短股之核苷酸數量減去雙螺旋中任何突出後之數量。除了雙螺旋結構外，RNAi亦可包含一個或多個核苷酸突出。
某些具體例中，本發明iRNA劑為各股包含19-23個核苷酸之dsRNA，其與標靶RNA序列(例如，補體成分C3基因)交互作用，主導裂解標靶RNA。
有些具體例中，本發明iRNA為24-30個核苷酸之dsRNA，其會與標靶RNA序列(例如，補體成分C3標靶mRNA序列)交互作用，主導裂解標靶RNA。
本文所採用術語「核苷酸突出」係指至少一個未配對之核苷酸從雙股iRNA之雙螺旋結構伸出。例如，當dsRNA中一股之3'-端超出另一股之5'-端，或反之亦然時，即有一個核苷酸突出。dsRNA可包含至少一個核苷酸之突出；或者，該突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多個。核苷酸突出可包含或其組成可為核苷酸/核苷類似物，包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於正義股、反義股或其任何組合。此外，突出之核苷酸(群)可出現在dsRNA之反義或正義股之5'-端、3'-端或兩端。
某些具體例中，dsRNA之反義股可在3’-端或5’-端具有包含1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸之突出。某些具體例中，在正義股或反義股、或兩股之突出可包括超過10個核苷酸之延伸長度，例如，1-30個核苷酸、2-30個核苷酸、10-30個核苷酸、10-25個核苷酸、10-20個核苷酸、或10-15個核苷酸之長度。某些具體例中，延伸之突出 係在雙螺旋正義股。某些具體例中，延伸之突出係出現在雙螺旋正義股之3’端。某些具體例中，延伸之突出係出現在雙螺旋正義股之5’端。某些具體例中，延伸之突出係在雙螺旋反義股。某些具體例中，延伸之突出係出現在雙螺旋反義股之3’端。某些具體例中，延伸之突出係出現在雙螺旋反義股之5’端。某些具體例中，延伸突出中一個或多個核苷酸係被核苷硫代磷酸酯置換。某些具體例中，突出包括自我互補部分，因此該突出可以形成在生理條件下安定之髮夾結構。
「鈍」或「鈍端」意指雙股RNA劑之末端沒有未配對之核苷酸，亦即沒有核苷酸突出。「鈍端」之雙股RNA劑其整個長度均為雙股，亦即該分子之任一端均沒有核苷酸突出。本發明RNAi劑包括在一端沒有核苷酸突出之RNAi劑(亦即具有一個突出與一個鈍端之製劑)之RNAi劑或任一端均沒有核苷酸突出之RNAi劑。此等分子最常為其整個長度均為雙股。
術語「反義股」或「引導股」係指iRNA(例如，dsRNA)之該股包括一個與標靶序列(例如，補體成分C3 mRNA)實質上互補之區。
本文所採用術語「互補區」係指反義股之與序列(例如，標靶序列，例如，如本文定義之補體成分C3核苷酸序列)實質上互補之區。若互補區未與標靶序列完全互補時，可能在分子內部或末端區發生錯配。通常，最能忍受之錯配係在末端區內，例如，iRNA之5’-或3’-端之5、4、或3個核苷酸內。有些具體例中，本發明雙股RNA劑包括於反義股之核苷酸錯配。有些具體例中，本發明雙股RNA劑之反義股包括與標靶mRNA之不超過4個錯配，例如，反義股包括與標靶mRNA之4、3、2、1、或0個錯配。有些具體例中，本發明雙股RNA劑之反義股包括與正義股之不超過4個錯配，例如，反 義股包括與正義股之4、3、2、1、或0個錯配。有些具體例中，本發明雙股RNA劑包括於正義股之核苷酸錯配。有些具體例中，本發明雙股RNA劑之正義股包括與反義股之不超過4個錯配，例如，正義股包括與反義股之4、3、2、1、或0個錯配。有些具體例中，核苷酸錯配係在例如，離iRNA之3’-端5、4、3個核苷酸內。另一項具體例中，核苷酸錯配係在例如，iRNA劑之3’-末端核苷酸。有些具體例中，錯配不在種子區。
因此，本文說明之RNAi劑可含有與標靶序列之一或多個錯配。一項具體例中，本文說明之RNAi劑含有不超過3個錯配(亦即3、2、1、或0個錯配)。一項具體例中，本文說明之RNAi劑含有不超過2個錯配。一項具體例中，本文說明之RNAi劑含有不超過1個錯配。一項具體例中，本文說明之RNAi劑含有0個錯配。某些具體例中，若RNAi劑之反義股含有與標靶序列之錯配，該錯配可視需要限制在離互補區5’-或3’-端最後5個核苷酸內。例如，此等具體例中，對23個核苷酸之RNAi劑而言，與C3基因之區互補之該股通常不在中心13個核苷酸內含有任何錯配。可採用本文說明之方法或相關技藝上已知方法決定含有與標靶序列錯配之RNAi劑是否有效於抑制C3基因表現。具有錯配之RNAi劑於抑制C3基因表現上之效力考量很重要，尤其若在族群中已知C3基因中之特定互補區具有多形性序列變異時。
本文所採用術語「正義股」或「過客股」係指該iRNA之股包括與如本文所定義反義股區實質上互補之區。
本文所採用「實質上所有核苷酸係經修飾」係指大多數但非全部經修飾，且包括不超過5、4、3、2、或1個未經修飾核苷酸。
本文所採用術語「裂解區」係指位在緊鄰裂解位點之區。裂解 位點係在標靶發生裂解之位點。有些具體例中，裂解區在任一端且在緊鄰裂解位點包含三個鹼基。有些具體例中，裂解區在任一端且在緊鄰裂解位點包含兩個鹼基。有些具體例中，裂解位點明確位於與反義股之核苷酸10與11結合之位點，且裂解區包含核苷酸11、12與13。
除非另有說明，否則當本文採用術語「互補」說明第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之關係時，係指包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在習此相關技藝者咸了解之某些條件下，與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸雜交並形成雙螺旋結構之能力。此等條件可為例如，嚴苛條件，其中嚴苛條件包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃下12-16小時，然後洗滌(參見例如，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook，等人(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press」)。可採用其他條件，如生物體內部可能承受之生理相關條件。習此相關技藝者均可依據雜交核苷酸之最終用途，決定最適合測試兩個序列之互補性之條件。
iRNA(例如，本文說明之dsRNA)內之互補序列包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸沿著其中一或兩個核苷酸序列之整個長度之鹼基配對。此等序列可稱為其彼此「完全互補」。然而，若第一序列相對於本文第二序列稱為「實質上互補」時，則該等兩個序列可能完全互補，或當具有至多30對鹼基之雙螺旋在雜交時，其可能形成一或多對，但通常不會超過5、4、3或2對之錯配鹼基，同時在與其最終用途最相關之條件下(例如，經由RISC途徑抑制基因表現)仍保留雜交能力。然而，若兩個寡核苷酸之設計在於雜交時形成一個或多個單股突出 時，則此等突出不應在決定互補性時視為錯配。例如，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸與另一個長度為23個核苷酸之寡核苷酸之dsRNA中，包含一個與該較短寡核苷酸完全互補之21個核苷酸序列之較長寡核苷酸在本發明所說明目的下，仍可稱為「完全互補」。
本文所採用「互補」序列亦可包括非華生-克里克(non-Watson-Crick)鹼基對或由非天然與經修飾之核苷酸形成之鹼基對，或完全由其組成，只要符合上述雜交能力之要求即可。此等非華生-克里克鹼基對包括(但不限於)：G：U搖擺(Wobble)或胡斯坦(Hoogstein)鹼基配對。
本文中有關dsRNA之正義股與反義股之間或雙股RNA劑之反義股與標靶序列之間鹼基配對之內容所採用之術語「互補」、「完全互補」與「實質上互補」可由其使用內容中了解。
本文所採用與信使RNA(mRNA)「之至少一部份實質上互補」之多核苷酸係指該多核苷酸與感興趣mRNA(例如，編碼補體成分C3基因之mRNA)之連續部份實質上互補。例如，若該序列係與編碼補體成分C3基因之mRNA之非中斷部份實質上互補時，則該多核苷酸係與至少一部份補體成分C3 mRNA互補。
因此有些具體例中，本文所揭示反義多核苷酸係與標靶補體成分C3序列完全互補。其他具體例中，本文所揭示反義多核苷酸係與標靶補體成分C3序列實質上互補，且包含在其全長度係與任一SEQ ID NO：1-4之核苷酸序列或任一SEQ ID NO：1-4之片段之同等區至少80%互補，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補之連續核苷酸序列。
有些具體例中，本文所揭示反義多核苷酸係與標靶補體成分C3序列之片段實質上互補，且包含在其全長度係與SEQ ID NO：1之片段(選自SEQ ID NO：1之核苷酸475-497、487-509、490-512、491-513、705-727、809-831、813-835、1147-1169、1437-1459、1439-1461、1447-1469、2596-2618、2634-2656、3012-3034、3334-3356、3611-3633、3614-3636、3622-3655、3809-3831、3846-3868、3847-3869、3920-3942、4047-4069、4061-4083、4156-4178、4157-4177、4162-4184、4178-4200、4226-4248、4369-4391、4392-4414、4521-4543、4522-4544、4523-4545、5012-5034之群中)，至少80%互補，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補之連續核苷酸序列。
其他具體例中，本文所揭示反義多核苷酸係與標靶補體成分C3序列之片段實質上互補，且包含在其全長度係與SEQ ID NO：1之片段(選自SEQ ID NO：1之核苷酸705-727、809-831、或2634-2656之群中)至少80%互補，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補之連續核苷酸序列。一項具體例中，本文所揭示反義多核苷酸係與標靶補體成分C3序列之片段實質上互補，且包含在其全長度係與SEQ ID NO：1之核苷酸2634-2656片段至少80%互補，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補之連續核苷酸序列。
其他具體例中，本文所揭示反義多核苷酸係與標靶C3序列實質上互補，且包含在其全長度係與任一表2-7、15、18、20-23、30、與31中任一正義股核苷酸序列或任一表2-7、15、18、20-23、30、與31中任一正義股核 苷酸序列之片段至少約80%互補，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或100%互補之連續核苷酸序列。
一項具體例中，本發明RNAi劑包括與反義多核苷酸實質上互補之正義股，其進而係與標靶C3序列相同，且其中正義股多核苷酸包含在其全長度係與核苷酸序列SEQ ID NO：5-8之同等區或任一SEQ ID NO：5-8之片段至少約80%互補，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或100%互補之連續核苷酸序列。
有些具體例中，本發明iRNA包括與反義多核苷酸實質上互補之正義股，其進而與標靶補體成分C3序列互補，且其中正義股多核苷酸包含在其全長度係與任一表2-7、15、18、20-23、30、與31中任一反義股核苷酸序列或任一表2-7、15、18、20-23、30、與31中任一反義股核苷酸序列之片段至少約80%互補，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或100%互補之連續核苷酸序列。
某些具體例中，正義股與反義股係選自以下任一雙螺旋：AD-565541.2、AD-564742、AD-567304、AD-568978、AD-569164、AD-569272.2、AD-569765.2、AD-564730.2、AD-567315、AD-564745.2、AD-571715.2、AD-570714、AD-571826、AD-572041.2、AD-572039.2、AD-572387、AD-568586.2、AD-566837.2、AD-566444.2、AD-567700.2、AD-567814.2、AD-568003.2、AD-569164.2、AD-569763.2、AD-565281.2、AD-571539.2、AD-572389.2、AD-567315.2、AD-571752.2、AD-568026.2、AD-571298、AD- 572110.2、AD-572062.2、AD-572388.2、AD-572040.2、AD-567713.2、AD-567521.2、AD-567066.2、AD-1181519、AD-569268、或AD-570714。
有些具體例中，正義股與反義股係選自以下任一雙螺旋：AD-1181519、AD-569268、或AD-570714。一項具體例中，雙螺旋為AD-570714。
通常，「iRNA」包括經過化學修飾之核糖核苷酸。此等修飾可能包括本文所揭示或相關技藝上已知之所有修飾型態。基於本說明書與申請專利範圍之目的，「iRNA」包括任何用於dsRNA分子之此等修飾。
本發明一項態樣中，本發明方法與組成物所採用之製劑為經由反義抑制機轉來抑制標靶mRNA之單股反義寡核苷酸分子。該單股反義寡核苷酸分子係與標靶mRNA內之序列互補。單股反義寡核苷酸可依化學計量方式與mRNA進行鹼基配對，抑制轉譯，並以物理方式封阻轉譯機轉，參見Dias,N.等人(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。單股反義寡核苷酸分子之長度可為約14至約30個核苷酸，且具有與標靶序列互補之序列。例如，單股反義寡核苷酸分子可能包含選自本文所說明任一反義序列之至少約14、15、16、17、18、19、20、或更多個連續核苷酸之序列。
本文所採用片語「由細胞與iRNA接觸」，如dsRNA，包括採用任何可能方式接觸細胞。由細胞與iRNA接觸包括於活體外由細胞與iRNA接觸或於活體內由細胞與iRNA接觸。可能為直接或間接接觸。因此例如，iRNA可藉由個別執行之方法進行物理性接觸，或者，iRNA可處於容許或導致後續可接觸細胞之狀態。
於活體外接觸細胞可以例如，藉由細胞與iRNA培養。於活體內接觸細胞可以例如，將iRNA注射至細胞所在的組織或附近，或將iRNA注 射至另一個區域，例如，血流或皮下空間，以致該製劑得以到達所要接觸之細胞的所在組織位置。例如，iRNA可能含有或偶聯至配體，例如，GalNAc，其主導iRNA至所需位點，例如，肝臟。亦可能組合活體外與活體內接觸法。例如，細胞亦可能於活體外接觸iRNA，接著再移植入個體內。
某些具體例中，由細胞與iRNA接觸包括藉由促進或引發細胞攝入或吸收來「引進」或「傳遞iRNA進入細胞」。吸收或攝入iRNA可以透過無助力之擴散或主動細胞過程，或利用輔劑或裝置進行。可在活體外或活體內將iRNA引進細胞內。例如，在活體內引進時，可將iRNA注射至組織位點或全身投藥。於活體外引進細胞中則包括相關技藝習知之方法，如電穿孔與脂染法。其他方法將說明於下文中或係相關技藝習知者。
術語「脂質奈米粒子」或「LNP」係一種包含脂質層，其中囊封醫藥活性分子(如核酸分子，例如，iRNA或可轉錄iRNA之質體)之囊泡。LNP說明於例如，美國專利案案號6,858,225、6,815,432、8,158,601、與8,058,069，其等完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
本文所採用「個體」為可以表現內因性或異源性標靶基因之動物，如哺乳動物，包括靈長類(如人類、非人類靈長類，例如，猴子與黑猩猩)、非靈長類(如牛、豬、馬、山羊、兔子、綿羊、倉鼠、天竺鼠、貓、狗、大鼠、或小鼠)、或鳥類(例如，鴨或鵝)。一項具體例中，該個體為人類，如接受治療或評估如本文所說明可能因降低補體成分C3表現而受益之疾病或疾患之人類；處於罹患可能因降低C3表現而受益之疾病或疾患之風險之人類；罹患可能因降低補體成分C3表現而受益之疾病或疾患之人類；或正接受治療可能因降低補體成分C3表現而受益之疾或疾患之人類。有些具體例中，個體為 女性人類。其他具體例中，個體為男性人類。一項具體例中，個體為成年個體。另一項具體例中，個體小兒科個體。
本文所採用術語「治療」或「處理」係指如減少個體之補體成分C3-相關疾患之至少一種癥兆或症狀，例如，溶血之有利或所需結果。治療亦包括減少與不期望之補體成分C3表現有關之一或多種癥兆或症狀，例如，溶血；降低不期望之補體成分C3活化或穩定之程度；緩和或減緩不期望之補體成分C3活化或穩定。「治療」亦可意指比沒有接受治療時之預期存活性延長其存活性。
在個體或疾病標記物或症狀中之補體成分C3基因表現程度或補體成分C3蛋白質產生程度之相關內容中使用之術語「降低」係指統計上顯著降低此等程度。其可在相關細胞或組織，例如，肝細胞，或其他個體樣本，例如，其所衍生之血液或血清、或尿液中，降低例如，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%、或低於檢測方法之檢測程度。
本文所採用「預防」或「防止」係用在例如，因例如老化、遺傳因素、激素變化、膳食、及久坐的生活型態而容易罹患補體成分C3相關疾患之個體中，可因降低補體成分C3基因表現或補體成分C3蛋白質之產生而受益之疾病或疾患。某些具體例中，該疾病或疾患為例如，不期望之C3活化或穩定之症狀，如溶血。降低發展出例如，溶血之可能性，例如，當個體具有一個或多個溶血危險因子時，其將不發展出溶血或已發展之溶血之嚴重度將低於具有相同危險因子但未接受本文所說明治療之族群。不發展出補體成分C3-相關疾患(例如，溶血)或延緩數個月或數年才發展出溶血則視為有效之預防。預 防法可能需要投與超過一劑之iRNA劑。
本文所採用術語「補體成分C3-相關疾病」或「C3-相關疾病」為可因降低補體成分C3表現而受益之疾病或疾患。補體成分C3-相關疾病之無限制實例包括冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
「醫療有效量」或「預防有效量」亦包括RNAi劑在適用於任何治療之合理效益/風險比值產生某些所需效應時之量。本發明方法所採用iRNA可能投與足以產生適用於此等治療之合理效益/風險比值之量。
本文所採用片語「醫藥上可接受」係指彼等在完整之醫學判斷為適合與人類個體及動物個體組織接觸，且在合理之效益/風險比值不會有過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症之化合物、材料、組成物、或劑型。
本文所採用片語「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥上可接受之材料、組成物或媒劑，如液態或固態填料、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(例如，潤滑劑、滑石、硬脂酸鎂、-鈣或-鋅、或硬脂酸)、或溶劑能封材料，其涉及從一個器官或身體之一部份攜帶或轉運該主題化合物至另一個器官或身體之一部份。各載劑必需在與調配物中其他成分之相容性之意義上為「可接受」，且對接受治療之個體無害。此等載劑係相關技藝習知者。醫藥上可接受之載劑包括採用注射投藥之載劑。
本文所採用術語「樣本」包括從個體採集之類似流體、細胞或單離組織，及個體內之流體、細胞或組織。生物流體實例包括血液、血清與漿 液、血漿、腦脊髓液、眼內液、淋巴液、尿液、唾液等等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域之樣本。例如，樣本可能衍生自特定器官、器官之一部份、或彼等器官內之流體或細胞。某些具體例中，樣本可能衍生自肝臟(例如，全肝臟或肝臟之某些節段或肝臟中某些細胞型態，如例如，肝細胞)。有些具體例中，「衍生自個體之樣本」係指得自該個體之尿液。「衍生自個體之樣本」可指來自個體之血液或由血液衍生之血清或血漿。
II.本發明之iRNA
本發明提供一種抑制補體成分C3基因表現之iRNA。較佳具體例中，iRNA包括在細胞(如容易發展出補體成分C3相關疾患(例如，溶血)之個體，例如，哺乳動物，如人類中之細胞)中抑制補體成分C3基因表現之雙股核糖核酸(dsRNA)分子。該dsRNAi劑包括反義股，其具有可與補體成分C3基因表現所形成之mRNA之至少一部份互補之互補區。該互補區為約19-30個核苷酸之長度(例如，約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、或19個核苷酸之長度)。當接觸到表現補體成分C3基因之細胞時，由例如，PCR或基於分支DNA(bDNA)之方法、或基於蛋白質之方法，如免疫螢光分析法，使用例如，西方墨點或流式細胞計技術分析，該iRNA會抑制補體成分C3基因(例如，人類、靈長類、非靈長類、或大鼠補體成分C3基因)之表現至少約50%。較佳具體例中，於實例中，尤指實例2中，採用qPCR方法，在本文提供之適當有機生物體細胞株中，在10nM濃度之siRNA下，測定對表現之抑制。較佳具體例中，在表現人類基因之囓齒類，例如，表現人類標靶基因之小鼠或感染AAV之小鼠中，藉由減弱人類基因，於活體內測定對表現之抑制，例如，當投與單劑，例如，3mg/kg時，RNA表現最低。實例2中提供採用PCR法測定肝 中RNA表現。
dsRNA包括兩個RNA股，其可在dsRNA所採用之條件下互補並雜交形成雙螺旋結構。dsRNA之其中一股(反義股)包括與標靶序列實質上互補，且通常為完全互補之互補區。該標靶序列可衍生自補體成分C3基因之表現期間所形成mRNA之序列。另一股(正義股)包括與反義股互補之互補區，因此當在合適條件下組合時，這兩股可雜交並形成雙螺旋結構。如本文所說明且相關技藝上已知，亦可含有dsRNA之互補序列作為單一核酸分子之自我互補區，此點與出現在分開之寡核苷酸之方式相反。
通常，雙螺旋結構為19至30對鹼基之長度。同樣地，互補於標靶序列之區為19至30個核苷酸之長度。
有些具體例中，dsRNA為約19至約23個核苷酸之長度、或約25至約30個核苷酸之長度。通常，dsRNA之長度足以作為Dicer酵素之受質。例如，相關技藝上已知長度超過約21至23個核苷酸之dsRNA可以作為Dicer之受質。習此相關技藝者咸了解，作為裂解標靶之這一區RNA最常為較大RNA分子(經常為mRNA分子)之一部份。若相關時，mRNA標靶之「一部份」為mRNA標靶之連續序列，其長度應足以作為RNAi所主導裂解作用(亦即透過RISC途徑裂解)之受質。
習此相關技藝者亦咸了解，雙螺旋區為dsRNA之主要功能部份，例如，約19至30對鹼基之雙螺旋區，例如，約19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22對鹼基。因此一項具體 例中，為了可供處理成功能性雙螺旋(例如，15-30對鹼基)以靶向所需裂解之RNA，以具有超過30對鹼基之雙螺旋區之RNA分子或RNA分子之複合物作為dsRNA。因此習此相關技藝者咸了解，在一項具體例中，miRNA為dsRNA。另一項具體例中，dsRNA不為天然miRNA。另一項具體例中，適用於靶向補體成分C3基因表現之iRNA劑不會在標靶細胞中由較大dsRNA裂解產生。
本文所說明dsRNA可進一步包括一個或多個單股核苷酸突出，例如，1-4、2-4、1-3、2-3、1、2、3、或4個核苷酸。具有至少一個核苷酸突出之dsRNA具有比其鈍端之對應物更優異之抑制性質。核苷酸突出可包含或其組成為核苷酸/核苷類似物，包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於正義股、反義股或其任何組合。此外，突出之核苷酸(群)可出現在dsRNA之反義或正義股之5'-端、3'-端或兩端。
dsRNA可採用相關技藝上已知標準方法合成。本發明雙股RNAi化合物可採用兩個步驟製程製備。首先，分開製備雙股RNA分子之個別股。然後黏合組成分股。siRNA化合物之個別股可採用溶液相或固體相有機合成法或二者製備。有機合成法之優點在於容易製備包含非天然或經修飾之核苷酸之寡核苷酸股。同樣地，本發明單股寡核苷酸可採用溶液相或固體相有機合成法或二者製備。
一項態樣中，本發明dsRNA包括至少兩個核苷酸序列：正義序列與反義序列。正義股係選自表2-7、15、18、20-23、30、或31中任一個表所提供序列之群中，且該正義股之對應反義股係選自表2-7、15、18、20-23、30、或31中任一個表之序列之群中。此態樣中，兩個序列中之一個序列係與 該兩個序列中另一個序列互補，其中一個序列實質上互補於補體成分C3基因表現時所產生之mRNA序列。因此，此態樣中，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸為表2-7、15、18、20-23、30、或31中任一個表所說明之正義股，及第二個寡核苷酸為表2-7、15、18、20-23、30、或31中任一個表所說明正義股之對應反義股。某些具體例中，dsRNA之實質上互補序列係含在分開之寡核苷酸。其他具體例中，dsRNA之實質上互補序列係含在單一寡核苷酸。某些具體例中，正義股或反義股係選自以下任一雙螺旋之正義股或反義股：AD-565541.2、AD-564742、AD-567304、AD-568978、AD-569164、AD-569272.2、AD-569765.2、AD-564730.2、AD-567315、AD-564745.2、AD-571715.2、AD-570714、AD-571826、AD-572041.2、AD-572039.2、AD-572387、AD-568586.2、AD-566837.2、AD-566444.2、AD-567700.2、AD-567814.2、AD-568003.2、AD-569164.2、AD-569763.2、AD-565281.2、AD-571539.2、AD-572389.2、AD-567315.2、AD-571752.2、AD-568026.2、AD-571298、AD-572110.2、AD-572062.2、AD-572388.2、AD-572040.2、AD-567713.2、AD-567521.2、AD-567066.2、AD-1181519、AD-569268、或AD-570714。其他具體例中，正義股或反義股係選自以下任一雙螺旋之正義股或反義股：AD-1181519、AD-569268、或AD-570714。一項具體例中，雙螺旋為AD-570714。
咸了解，雖然表2、4、6、20、22、與30中之序列未說明為經修飾或接合序列，但本發明iRNA之RNA，例如，本發明dsRNA，可能包含表3、5、7、15、18、21、23、或31中任一個表所示之任一序列，其係未修飾、未接合、或經過不同於本文所說明方式修飾或接合。換言之，本發明涵括 表2-7、15、18、20-23、30、或31所示之dsRNA，其係未修飾、未接合、或經修飾或接合，如本文所說明。
習此相關技藝者咸了解，具有約20至23對鹼基，例如，21對鹼基之雙螺旋結構之dsRNA已聲稱可特別有效誘發RNA干擾(Elbashir等人，EMBO 2001,20：6877-6888)。然而，其他人已發現較短或較長RNA雙螺旋結構亦有效(Chu與Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim等人(2005)Nat Biotech 23：222-226)。上述具體例中，基於表2-7、15、18、20-23、30、或31中任一個表所提供之寡核苷酸序列之性質，本文說明之dsRNA可包括至少一個長度為至少21個核苷酸之股。合理認為，具有表2-7、15、18、20-23、30、或31中任一個表之任一序列之較短雙螺旋僅在其中一端或兩端減去幾個核苷酸時，仍與上述dsRNA具有類似有效性。因此，本發明範圍亦包括具有衍生自表2-7、15、18、20-23、30、或31中任一個表之任一序列之至少19、20個、或更多個連續核苷酸之序列之dsRNA，且其抑制補體成分C3基因表現之能力與包含完整序列之dsRNA之差異不超過約5、10、15、20、25、或30%抑制性。
此外，表2-7、15、18、20-23、30、或31所提供之RNA指出補體成分C3轉錄本中可以受到RISC所介導裂解之位點(群)。因此，本發明之進一步特徵在於靶向其中一個位點之iRNA。若iRNA促進在任何該特定位點內裂解轉錄本時，則稱本文所採用iRNA係靶向RNA轉錄本之特定位點內。此等iRNA通常包括來自表2-7、15、18、20-23、30、或31中任一個表所提供任一序列之至少約19個連續核苷酸與來自補體成分C3基因中所選定序列之鄰接區之其他核苷酸序列偶合。
III.本發明之經修飾iRNA
某些具體例中，本發明iRNA(例如，dsRNA)之RNA未經過修飾，且不包含例如，相關技藝上已知及本文說明之化學修飾或接合。其他具體例中，本發明iRNA(例如，dsRNA)之RNA係經過化學修飾，以加強安定性或其他有利特性。本發明某些具體例中，本發明iRNA之實質上所有核苷酸均經修飾。本發明其他具體例中，iRNA之所有核苷酸或iRNA之實質上所有核苷酸均經修飾，亦即iRNA之股中包含不超過5、4、3、2或1個未修飾之核苷酸。
如本發明所說明特徵之核酸可採用相關技藝已完整建立之方法合成或修飾，如彼等說明於「Current protocols in nucleic acid chemistry」，Beaucage,S.L.等人(編輯)，John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA，其揭示內容已以引用之方式併入本文中。修飾法包括例如，末端修飾，例如，5’-端修飾(磷酸化、接合、反向鏈結)或3’-端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等等)；鹼基修飾，例如，使用穩定化鹼基、失穩化鹼基、或會與對象之擴張區進行鹼基配對之鹼基置換、排除鹼基(無鹼基核苷酸)、或接合鹼基；糖修飾(例如，位於2’-位置或4’-位置)或置換糖；或主幹修飾，包括修飾或置換磷酸二酯鏈結。適用於本文所說明具體例之iRNA化合物之明確實例包括(但不限於)：包含經修飾主幹或沒有天然核苷間鏈結之RNA。具有經修飾主幹之RNA特別包括彼等主幹中沒有磷原子者。針對本說明書之目的及相關技藝上有時候提及者，其核苷間主幹中沒有磷原子之經修飾RNA亦可視為寡核苷。有些具體例中，經修飾之iRNA將在核苷間主幹中具有一個磷原子。
經修飾之RNA主幹包括例如，硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基與其他烷基之膦酸酯 (包括膦酸3'-伸烷基酯與對掌性膦酸酯)、次膦酸酯、胺基磷酸酯(包括3'-胺基胺基磷酸酯與胺基烷基胺基磷酸酯)、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、及具有正常3'-5'鏈結之硼代磷酸酯、其等之2'-5'-連接類似物、及彼等具有反向極性者，其中核苷單位之相鄰成對鹼基係依3'-5'連接5'-3'或2'-5'連接5'-2'。亦包括各種不同鹽類、混合鹽類與游離酸型。本發明有些具體例中，本發明dsRNA劑係呈游離型。本發明其他具體例中，本發明dsRNA劑係呈鹽型。一項具體例中，本發明dsRNA劑係呈鈉鹽型。某些具體例中，當本發明dsRNA劑呈鈉鹽型時，鈉離子係含在製劑中，作為存在於製劑中之實質上所有磷酸二酯及/或硫代磷酸二酯基團之抗衡離子。其中實質上所有磷酸二酯及/或硫代磷酸酯鏈結具有鈉抗衡離子之製劑中包括不超過5、4、3、2、或1個沒有鈉抗衡離子之磷酸二酯及/或硫代磷酸酯鏈結。有些具體例中，當本發明dsRNA劑呈鈉鹽型時，鈉離子係含在製劑中，作為存在於製劑中之所有磷酸二酯及/或硫代磷酸二酯基團之抗衡離子。
教示上述含磷鏈結製法之代表性美國專利案包括(但不限於)：美國專利案案號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；及美國專利案 RE39464，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
其中不包括磷原子之經修飾RNA主幹所具有之主幹係由短鏈烷基或環烷基核苷間鏈結、混合雜原子、及烷基或環烷基之核苷間鏈結、或一個或多個短鏈雜原子或雜環之核苷間鏈結所形成。此等包括彼等具有N-嗎啉基鏈結(一部份從核苷之糖部份體形成)；矽氧烷主幹；硫醚、亞碸與碸主幹；甲醯乙醯基(formacetyl)與硫甲醯乙醯基主幹；亞甲基甲醯乙醯基與硫甲醯乙醯基主幹；含烯烴主幹；胺磺酸根主幹；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主幹；磺酸根與磺醯胺主幹；醯胺主幹；及其他具有混合N、O、S與CH2組成分者。
教示上述寡核苷製法之代表性美國專利案包括(但不限於)：美國專利案案號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；及5,677,439，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
考慮以合適RNA擬似物用於本文提供之iRNA，其中核苷酸單位之糖與核苷間鏈結(亦即主幹)二者均被新穎基團置換。該等鹼基單位維持與適當核酸標靶化合物雜交。其中一種寡聚化合物為已顯示具有優異之雜交性質RNA擬似物，稱為肽核酸(PNA)。PNA化合物中，RNA之糖主幹被包含醯胺之主幹(特定言之胺基乙基甘胺酸主幹)置換。核鹼基則保留並直接或間接結合主幹之醯胺部份之氮雜態氮原子。教示PNA化合物製法之代表性美國專利案包括(但不限於)：美國專利案案號5,539,082；5,714,331；及5,719,262，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。適用於本發明iRNA之其他PNA 化合物說明於例如，Nielsen等人之Science,1991,254,1497-1500。
如本發明所說明特徵之有些具體例包括具有硫代磷酸酯主幹之RNA及具有雜原子主幹之寡核苷，特定言之上述美國專利案案號5,489,677之--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主幹]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--與--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯主幹係由--O--P--O--CH2--代表]，及上述美國專利案案號5,602,240之醯胺主幹。有些具體例中，如本文所說明特徵之RNA具有上述美國專利案案號5,034,506之N-嗎啉基主幹結構。
經修飾之RNA亦可含有一個或多個經取代之糖部份體。如本文所說明特徵之iRNA(例如，dsRNA)可在2'-位置包括下列其中一項：OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基與炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基與炔基。合適修飾實例包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、與O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n與m為1至約10。其他具體例中，dsRNA在2'-位置包括下列其中一項：C1至C10低碳數烷基、經取代之低碳數烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、報導子基團、嵌入劑、改善iRNA之藥物動力學之基團、或改善iRNA之藥效學性質之基團、及具有類似性質之取代基。有些具體例中，該修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta,1995,78：486- 504)，亦即烷氧-烷氧基。另一種修飾實例為2'-二甲基胺基氧乙氧基，亦即O(CH2)2ON(CH3)2基團(亦稱為2'-DMAOE，其說明於下文實例中)與2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(相關技藝上亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。其他修飾實例包括：5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’-去氧核苷酸、(這三個家族之R與S兩種異構物)；2’-烷氧基烷基；及2’-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)、與2'-氟(2'-F)。亦可在iRNA之RNA的其他位置進行類似修飾，特定言之在3'末端核苷酸或在2'-5'連接dsRNA中糖之3'位置與5'末端核苷酸之5'位置。iRNA亦可改具有糖擬似物(如環丁基部份體)替代呋喃戊糖基糖。教示此等經修飾糖結構製法之代表性美國專利案包括(但不限於)：美國專利案案號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；及5,700,920，其中某些專利案已成為本申請案共同擁有。其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
iRNA亦可包括核鹼基(相關技藝上通常簡稱「鹼基」)修飾或取代。本文所採用「未經修飾」或「天然」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)與鳥嘌呤(G)，及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與尿嘧啶(U)。經修飾之核鹼基包括其他合成性與天然核鹼基，如去氧-胸腺嘧啶(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤與鳥嘌呤之6-甲基與其他烷基衍生物、腺嘌呤與鳥嘌呤之2-丙基與其他烷基衍生物、2-硫尿 嘧啶、2-硫胸腺嘧啶與2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶與胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶與胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶與胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基與其他8-經取代之腺嘌呤與鳥嘌呤、5-鹵基(特定言之5-溴、5-三氟甲基)與其他5-經取代之尿嘧啶與胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤與7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤與8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤與7-去氮雜腺嘌呤及3-去氮雜鳥嘌呤與3-去氮雜腺嘌呤。其他核鹼基包括彼等揭示於美國專利案案號3,687,808、彼等揭示於Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn.P編輯，Wiley-VCH，2008；彼等揭示於The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，p.858-859,Kroschwitz,J.L.編輯，John Wiley & Sons,1990；彼等揭示於Englisch等人之Angewandte Chemie，國際版，1991,30,613；及彼等揭示於Sanghvi,YS.之dsRNA Research and Applications，第15章，p.289-302,Crooke,S.T.與Lebleu,B.編輯，CRC Press，1993。其中某些核鹼基特別適用於提高如本發明所說明特徵之寡聚化合物之結合親和性。此等包括5-經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6與O-6經取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶與5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示可使核酸雙螺旋安定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.與Lebleu,B.編輯之dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993，pp.276-278)，且成為鹼基取代實例，甚至更特別當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合時。
教示上述某些經修飾之核鹼基及其他經修飾之核鹼基製法之代表性美國專利案包括(但不限於)：上述美國專利案案號3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187； 5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；及7,495,088，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個鎖核酸(LNA)。鎖核酸為具有經修飾之核糖部份體之核苷酸，其中該核糖部份體包含連結2'與4'碳之額外橋基。此結構有效地「封鎖」呈3'-內接結構構形之核糖。添加鎖核酸至siRNA中時，已顯示可以提高血清中siRNA安定性，並降低脫靶效應(Elmen,J.等人(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.等人(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.等人(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
有些具體例中，iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個雙環糖部份體。「雙環糖」為藉由兩個原子之橋基修飾之呋喃糖基環。「雙環核苷」(「BNA」)為具有糖部份體之核苷，其包含連結糖環兩個碳原子之橋基，藉以形成雙環系。某些具體例中，該橋基連結糖環之4'-碳與2'-碳。因此，有些具體例中，本發明製劑可包括一個或多個鎖核酸(LNA)。鎖核酸為具有經修飾之核糖部份體之核苷酸，其中該核糖部份體包含連結2'與4'碳之額外橋基。換言之，LNA為包含雙環糖部份體之核苷酸，該雙環糖部份體則包含4'-CH2-O-2'橋基。此結構有效地「封鎖」呈3'-內接結構構形之核糖。添加鎖核酸至siRNA中時，已顯示可以提高血清中siRNA安定性，並降低脫靶效應(Elmen,J.等人(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.等人 (2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.等人(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用於本發明多核苷酸之雙環核苷實例包括(但不限於)包含4'與2'核糖基環原子之間橋基之核苷。某些具體例中，本發明反義多核苷酸劑包括一個或多個包含4'與2'之間橋基之雙環核苷。此等4'與2'之間橋連之雙環核苷實例包括(但不限於)：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(亦稱為「限制乙基」或「cEt」)與4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其類似物；參見例如，美國專利案案號7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其類似物；參見例如，美國專利案案號8,278,283)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利案案號8,278,425)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(參見例如，美國專利公開案案號2004/0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R為H、C1-C12烷基、或保護基(參見例如，美國專利案案號7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見例如，Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH2-C(=CH2)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利案案號8,278,426)。上述文獻之完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
教示鎖核酸核苷酸製法之其他代表性美國專利案及美國專利公開案包括(但不限於)下列：美國專利案案號6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US 2008/0039618；及US 2009/0012281，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
上述任何雙環核苷均可製成具有一個或多個立體化學糖組態， 其包括例如，α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見WO 99/14226)。
iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個限制乙基核苷酸。本文所採用「限制乙基核苷酸」或「cEt」為包含雙環糖部份體(其包含4'-CH(CH3)-O-2'橋基)之鎖核酸。一項具體例中，限制乙基核苷酸為S組態，本文中稱為「S-cEt」。
本發明iRNA亦可包括一個或多個「構形限制核苷酸」(「CRN」)。CRN為具有連結核糖之C2’與C4’碳或核糖之C3與-C5'碳之連接基之核苷酸類似物。CRN封鎖核糖環形成安定構型，並提高與mRNA之雜交親和性。連接基之長度足以讓氧置入針對安定性與親和性之最適當位置，以造成較低之核糖環折皺。
教示上述某些CRN製法之代表性公開案包括(但不限於)：美國專利公開案案號2013/0190383；及PCT公開案WO 2013/036868，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
有些具體例中，本發明iRNA包含一或多個為UNA(非鎖核酸)核苷酸之單體。UNA為非鎖無環核酸，其中已脫除糖之任何鍵結，形成非鎖「糖」殘基。一項實例中，UNA亦涵括已脫除C1'-C4'之間鍵結(亦即C1'與C4'碳之間之共價碳-氧-碳鍵)之單體。另一項實例中，已脫除糖之C2'-C3'鍵結(亦即C2'與C3'碳之間之共價碳-碳鍵)(參見Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)與Fluiter等人Mol.Biosyst.,2009,10,1039，其以引用之方式併入本文中)。
教示UNA製法之代表性美國公開案包括(但不限於)：美國專利案案號8,314,227；及美國專利公開案案號2013/0096289；2013/0011922；及 2011/0313020，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
RNA分子末端之可能安定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二碳烷醯基-尿苷-3"-磷酸酯、反向鹼基dT(idT)等等。此修飾之揭示內容可參見PCT公開案案號WO 2011/005861。
本發明iRNA之其他核苷酸修飾包括5’磷酸酯或5’磷酸酯擬似物，例如，在iRNA反義股之5’-末端磷酸酯或磷酸酯擬似物。合適磷酸酯擬似物已揭示於例如，美國專利公開案案號2012/0157511，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
A.包含本發明基序之經修飾iRNA
本發明某些態樣中，本發明雙股RNA劑包括具有如例如，WO2013/075035所揭示化學修飾之製劑，其完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。WO2013/075035提供在dsRNAi劑之正義股或反義股(特定言之在裂解位點或接近裂解位點處)引進在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序。有些具體例中，dsRNAi劑之正義股與反義股可能經完全修飾。引進此等基序會中斷正義或反義股上可能存在之修飾型態。dsRNAi劑可視需要例如，在正義股接合GalNAc衍生物配體。
更明確言之，當雙股RNA劑之正義股與反義股為完全經修飾而在dsRNAi劑之至少一股之裂解位點或接近裂解位點處具有一個或多個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序時，可觀察到dsRNAi劑之基因靜默活性。
因此，本發明提供一種可於活體內抑制標靶基因(亦即補體成分 C3基因)表現之雙股RNA劑。RNAi劑包含正義股與反義股。RNAi劑之各股可為例如，17-30個核苷酸之長度、25-30個核苷酸之長度、27-30個核苷酸之長度、19-25個核苷酸之長度、19-23個核苷酸之長度、19-21個核苷酸之長度、21-25個核苷酸之長度、或21-23個核苷酸之長度。
正義股與反義股通常形成雙螺旋雙股RNA(「dsRNA」)，本文亦稱為「dsRNAi劑」。dsRNAi劑之雙螺旋區可為例如，雙螺旋區可為27-30對核苷酸之長度、19-25對核苷酸之長度、19-23對核苷酸之長度、19-21對核苷酸之長度、21-25對核苷酸之長度、或21-23對核苷酸之長度。另一項實例中，雙螺旋區之長度係選自19、20、21、22、23、24、25、26、與27個核苷酸。
某些具體例中，dsRNAi劑可在一股或兩股之3’-端、5’-端、或兩端包含一個或多個突出區或封端基。該突出可分別獨立為1-6個核苷酸之長度，例如，2-6個核苷酸之長度、1-5個核苷酸之長度、2-5個核苷酸之長度、1-4個核苷酸之長度、2-4個核苷酸之長度、1-3個核苷酸之長度、2-3個核苷酸之長度、或1-2個核苷酸之長度。某些具體例中，該突出區可包括如上述提供之延伸突出區。突出可為其中一股比另一股長所造成之結果，或為相同長度的兩股錯開造成之結果。突出可與標靶mRNA形成錯配或其可與所靶向之基因序列互補或可為另一個序列。第一股與第二股亦可例如，利用額外鹼基結合形成髮夾，或利用其他非鹼基連接基結合。
某些具體例中，dsRNAi劑之突出區中之核苷酸可分別獨立為經修飾或未經修飾核苷酸，包括(但不限於)：2’-糖修飾，如2-F、2’-O-甲基、胸苷(T)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2`-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2`-O- 甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)、及其任何組合。例如，TT可為任一股之任一端之突出序列。突出可與標靶mRNA形成錯配，或其可互補於所靶向之基因序列或可為另一個序列。
dsRNAi劑之正義股、反義股或兩股之5’-或3’-突出可經過磷酸化。有些具體例中，突出區包含兩個核苷酸，其在這兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯，其中這兩個核苷酸可相同或不同。有些具體例中，突出出現在正義股、反義股或兩股之3’-端。有些具體例中，此3’-突出出現在反義股。有些具體例中，此3’-突出出現在正義股。
dsRNAi劑可能僅含有單一突出，其可強化RNAi之干擾活性，不會影響整體安定性。例如，單股突出可能位於正義股之3'-端，或者在反義股之3'-端。RNAi亦可能在反義股之5’-端(或正義股之3’-端)具有鈍端，或反之亦然。通常dsRNAi劑之反義股在3’-端具有核苷酸突出，且5’-端為鈍端。在不希望受到理論限制下，反義股5’-端之不對稱鈍端與反義股3’-端突出有利於該引導股進入RISC過程。
某些具體例中，dsRNAi劑為兩端均為19個核苷酸長度之鈍端，其中正義股含有至少一個在5’端起之位置7、8、9三個連續核苷酸有三個2’-F修飾之基序。反義股含有至少一個在5’端起之位置11、12、13三個連續核苷酸有三個2’-O-甲基修飾之基序。
其他具體例中，dsRNAi劑為兩端均為20個核苷酸長度之鈍端，其中正義股含有至少一個在5’端起之位置8、9、10三個連續核苷酸有三個2’-F修飾之基序。反義股含有至少一個在5’端起之位置11、12、13三個連續核苷酸有三個2’-O-甲基修飾之基序。
又其他具體例中，dsRNAi劑為兩個末端均為21個核苷酸長度之鈍端，其中正義股含有至少一個在5’端起之位置9、10、11三個連續核苷酸有三個2’-F修飾之基序。反義股含有至少一個在5’端起之位置11、12、13三個連續核苷酸有三個2’-O-甲基修飾之基序。
某些具體例中，dsRNAi劑包含包含21個核苷酸之正義股與23個核苷酸之反義股，其中正義股含有至少一個在5’端起之位置9、10、11三個連續核苷酸有三個2’-F修飾之基序；反義股含有至少一個在5’端起之位置11、12、13三個連續核苷酸有三個2’-O-甲基修飾之基序，其中RNAi劑之一端為鈍端，而另一端具有包含2個核苷酸之突出。較佳係該具有2個核苷酸之突出位在反義股之3’-端。
當該具有2個核苷酸之突出位在反義股之3’-端時，末端三個核苷酸之間有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中有兩個為突出核苷酸，第三個核苷酸為鄰接該突出核苷酸之配對核苷酸。一項具體例中，RNAi劑在正義股5’-端與反義股5’-端之兩個末端，在末端三個核苷酸之間另外具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結。某些具體例中，dsRNAi劑之正義股與反義股中每一個核苷酸(包括作為基序之一部份之核苷酸)均為經修飾之核苷酸。某些具體例中，各殘基係分別獨立經2’-O-甲基或3’-氟修飾，例如，在交替之基序。dsRNAi劑可視需要再包含配體(較佳為GalNAc3)。
某些具體例中，dsRNAi劑包含正義與反義股，其中正義股為25-30個核苷酸殘基之長度，其中從第一股之5'末端核苷酸(位置1)之位置1至23開始包含至少8個核糖核苷酸；反義股之長度為36-66個核苷酸殘基，從3'末端核苷酸開始，在與正義股之位置1-23配對形成雙螺旋之位置包含至少8 個核糖核苷酸；其中至少反義股之3'末端核苷酸未與正義股配對，且至多6個連續3'末端核苷酸未與正義股配對，藉以形成1-6個核苷酸之3'單股突出；其中反義股5'末端包含10-30個未與正義股配對之連續核苷酸，藉以形成具有10-30個核苷酸之單股5'突出；其中當正義股與反義股依最大互補性進行排列時，至少正義股5'末端及3'末端核苷酸與反義股之核苷酸形成鹼基對，藉以在正義股與反義股之間形成實質上雙螺旋區；且該反義股沿著反義股之至少19個核糖核苷酸長度充分互補於標靶RNA，當該雙股核酸引進哺乳動物細胞中時，會降低標靶基因表現；且其中正義股包含至少一個在三個連續核苷酸有三個2’-F修飾之基序，其中至少一個基序出現在裂解位點或接近裂解位點處。反義股在裂解位點或接近裂解位點處包含至少一個在三個連續核苷酸有三個2’-O-甲基修飾之基序。
某些具體例中，dsRNAi劑包含正義股與反義股，其中dsRNAi劑包含長度為至少25個及至多29個核苷酸之第一股及長度為至多30個核苷酸之第二股，其具有至少一個在5’末端起之位置11、12、13連續三個核苷酸有三個2’-O-甲基修飾之基序；其中第一股3’端與第二股5’端形成鈍端，且第二股之3’端比第一股長1至4個核苷酸，其中雙螺旋區之長度為至少25個核苷酸，且第二股沿著第二股至少19個核苷酸長度充份互補於標靶mRNA，當該RNAi劑引進哺乳動物細胞中時，可以降低標靶基因表現，且其中Dicer裂解dsRNAi劑較佳係產生包含第二股3’端之siRNA，藉以降低哺乳動物細胞中之標靶基因表現。該dsRNAi劑可視需要進一步包含配體。
某些具體例中，dsRNAi劑之正義股包含至少一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序，其中一個基序出現在正義股之裂解位點。
某些具體例中，dsRNAi劑之反義股亦可包含至少一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序，其中一個基序出現在或接近反義股中裂解位點。
對於dsRNAi劑具有長度為19至23個核苷酸之雙螺旋區，反義股之裂解位點通常約在自5’-端起之10、11與12位置。因此，三個相同修飾之基序可能出現在反義股之9、10、11位置；10、11、12位置；11、12、13位置；12、13、14位置；或13、14、15位置，其係從反義股5’-端起之第一個核苷酸開始計數，或從反義股5’-端之雙螺旋區內第一對核苷酸開始計數。反義股中之裂解位點亦可能隨dsRNAi劑從5’-端起之雙螺旋區長度變化。
dsRNAi劑之正義股可能在該股之裂解位點含有至少一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序；且反義股可能在該股之裂解位點或接近裂解位點處具有至少一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序。當正義股與反義股形成dsRNA雙螺旋時，正義股與反義股之排列可讓正義股之三個核苷酸之一個基序與反義股之三個核苷酸之一個基序具有至少一個核苷酸重疊，亦即正義股基序之三個核苷酸中至少一個與反義股基序之三個核苷酸中至少一個形成鹼基對。或者，可能至少兩個核苷酸重疊，或可能所有三個核苷酸重疊。
有些具體例中，dsRNAi劑之正義股可能含有超過一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序。該第一基序可能出現在該股之裂解位點或接近裂解位點，且其他基序可能為側翼修飾。本文中術語「側翼修飾」係指出現在該股之另一部份之基序，其與出現在相同股之裂解位點或接近裂解位點之基序分開。側翼修飾係與第一基序相鄰或分隔至少一個或更多個核苷酸。當彼等基序彼此緊鄰時，則該等基序之化學係彼此不同，且當基序之間分隔一個或多 個核苷酸時，則其化學可能相同或不同。可能存在兩個或更多個側翼修飾。例如，當存在兩個側翼修飾時，各側翼修飾可能出現在相對於該裂解位點或接近裂解位點之第一基序的一端或在其該前導基序之另一側。
如同正義股，dsRNAi劑之反義股可能含有超過一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序，其中至少一個基序出現在該股之裂解位點或接近裂解位點。此反義股亦可能包含一個或多個側翼修飾，其排列應類似可能存在於正義股之側翼修飾。
有些具體例中，dsRNAi劑之正義股或反義股之側翼修飾通常不包括該股之3’-端、5’-端或兩端之第一個或兩個末端核苷酸。
其他具體例中，dsRNAi劑之正義股或反義股之側翼修飾通常不包括該股之3’-端、5’-端或兩端之雙螺旋區內第一對或兩對核苷酸。
當dsRNAi劑之正義股與反義股各包含至少一個側翼修飾時，該側翼修飾可能落在雙螺旋區之同一端，且具有一、二或三個核苷酸重疊。
當dsRNAi劑之正義股與反義股各包含至少兩個側翼修飾時，正義股與反義股之排列可使各來自一股之兩個修飾落在雙螺旋區之一端，具有一、二或三個核苷酸重疊；各來自一股之兩個修飾落在雙螺旋區之另一端，具有一、二或三個核苷酸重疊；各來自一股之兩個修飾落在前導基序之每一側，且在雙螺旋區有一、二或三個核苷酸重疊。
有些具體例中，dsRNAi劑之正義股與反義股中每一個核苷酸(包括作為基序之一部份之核苷酸)可能經過修飾。各核苷酸可能經過相同或不同修飾法修飾，其可包括以下一或多種修改：修改一個或兩個非連接性磷酸酯態氧或一個或多個連接性磷酸酯態氧；修改核糖之組成，例如，核糖之2'-羥 基；以「去磷酸」連接基完全置換磷酸酯部份體；修飾或置換天然鹼基；及置換或修飾核糖-磷酸酯主幹。
由於核酸為亞單位之聚合物，因此許多修飾會出現在核酸內之重複位置，例如，鹼基或磷酸酯部份體或磷酸酯部份體之非連接性O之修飾。有些例子中，將在核酸之所有個別位置進行修飾，但許多例子中並未進行修飾。例如，可能僅在3’或5’末端位置進行修飾，可能僅在一個末端區進行，例如，在一股之末端核苷酸位置或在最後2、3、4、5或10個核苷酸。可能在雙股區、單股區或二者進行修飾。可能僅在RNA之雙股區或可能僅在RNA之單股區進行修飾，例如，在非連接性O位置之硫代磷酸酯修飾可能僅在一個或兩個末端進行，可能僅在末端區進行，例如，在一股之末端核苷酸位置或最後2、3、4、5、或10個核苷酸，或可能在雙股與單股區，特定言之末端進行。5’端或複數端可經磷酸化。
為了例如，加強安定性，可能在突出中包括特定鹼基，或在單股突出，例如，5’或3’突出或二者中，包括經修飾之核苷酸或核苷酸替代物。例如，希望在在突出中包括嘌呤核苷酸。有些具體例中，3’或5’突出中所有或有些鹼基可經修飾，例如，具有本文所說明之修飾。修飾法可包括例如，可採用相關技藝上已知之修飾法在核糖之2’位置進行修飾，例如，改用去氧核糖核苷酸、2’-去氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修飾替代核鹼基之核糖；及磷酸酯基團之修飾，例如，硫代磷酸酯修飾。突出不一定與標靶序列同源。
有些具體例中，正義股與反義股之各殘基分別獨立經LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2’-甲氧乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-去氧、2’-羥基、或2’-氟修飾。該股可包含超過一個修飾。一項 具體例中，正義股與反義股之各殘基分別獨立經2’-O-甲基或2’-氟修飾。
正義股與反義股通常存在至少兩種不同修飾。這兩種修飾可能為2’-O-甲基或2’-氟修飾，或其他。
某些具體例中，Na或Nb包含交替修飾型態。本文所採用語「交替基序」係指具有一或多種修飾之基序，各修飾係在一股之交替核苷酸進行。該交替核苷酸可能係指每隔一個核苷酸有一個修飾或每三個核苷酸有一個修飾，或類似型態。例如，若A、B與C分別代表核苷酸一種修飾時，則該交替基序可為「ABABABABABAB...」、「AABBAABBAABB...」、「AABAABAABAAB...」、「AAABAAABAAAB...」、「AAABBBAAABBB...」、或「ABCABCABCABC...」，等等。
交替基序中包含之修飾型態可能相同或不同。例如，若A、B、C、D分別代表核苷酸之一種修飾型態時，交替型態(亦即每隔一個核苷酸之修飾)可能相同，但各正義股或反義股之修飾可能選自交替基序中之數種修飾可能性，如「ABABAB...」、「ACACAC...」、「BDBDBD...」或「CDCDCD...」等等。
有些具體例中，本發明dsRNAi劑包含在正義股之交替基序之修飾型態相對於反義股之交替基序之修飾型態出現位移。該位移可使正義股核苷酸之經修飾基團對應於反義股核苷酸之經不同修飾之基團，且反之亦然。例如，當正義股與dsRNA雙螺旋中反義股配對時，雙螺旋區內之正義股之交替基序可能始於該股之5’-3’之「ABABAB」，而反義股之交替基序可能始於該股之5’-3’之「BABABA」。另一項實例中，雙螺旋區內之正義股之交替基序可能始於該股之5’-3’之「AABBAABB」，而反義股之交替基序可能始於該股之 5’-3’之「BBAABBAA」，因此正義股與反義股之間之修飾型態會出現完全或部份位移。
有些具體例中，dsRNAi劑原始包含在正義股2'-O-甲基修飾與2’-F修飾之交替基序型態，其相對於原始在反義股2'-O-甲基修飾與2’-F修飾之交替基序型態出現位移，亦即正義股之2'-O-甲基修飾之核苷酸與反義股上2'-F修飾之核苷酸形成鹼基配對，且反之亦然。正義股之1-位置可能以2'-F修飾開始，及反義股之1-位置可能以2'-O-甲基修飾開始。
在正義股或反義股引進一個或多個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序時，可中斷正義股或反義股之原始修飾型態。這種在正義或反義股中引進一個或多個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序而中斷正義股或反義股之修飾型態時，可加強該基因對抗標靶基因之靜默活性。
有些具體例中，當在任一股中引進在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序時，鄰接該基序之核苷酸之修飾為不同於修飾該基序之修飾。例如，包含該基序之序列部份為「...NaYYYNb...」，其中「Y」代表在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序之修飾，及「Na」與「Nb」代表鄰接基序「YYY」之核苷酸之修飾且不同於Y之修飾，且其中Na與Nb可為相同或不同修飾。或者，當存在側翼修飾時，Na或Nb可能存在或不存在。
iRNA可進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結修飾可能出現在正義股或反義股或兩股之股中任何位置之任何核苷酸。例如，核苷酸間鏈結修飾可能出現在正義股或反義股之每一個核苷酸；各核苷酸間鏈結修飾可能呈交替型態出現在正義股或反義股；或正義股或反義股可能包含呈交替型態之兩種核苷酸間 鏈結修飾。正義股之核苷酸間鏈結之交替修飾型態可能與反義股相同或不同，正義股之核苷酸間鏈結之交替修飾型態可能相對於反義股之核苷酸間鏈結之交替修飾型態出現位移。一項具體例中，雙股RNAi劑包含6至8個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結。有些具體例中，反義股在5’-端包含兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結及在3’-端包含兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結，正義股則在5’-端或3’-端包含至少兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結。
有些具體例中，dsRNAi劑在突出區包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結修飾。例如，突出區可能包含兩個核苷酸，其在兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結。亦可能進行核苷酸間鏈結修飾來連接突出核苷酸與雙螺旋區內末端之配對核苷酸。例如，至少2、3、4個或所有突出核苷酸可能利用硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結連接，且視需要可能有額外硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結連接該突出核苷酸與鄰接該突出核苷酸之配對核苷酸。例如，末端三個核苷酸之間可能有至少兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結，三個核苷酸中有兩個為突出核苷酸，第三個為鄰接該突出核苷酸之配對核苷酸。末端這三個核苷酸可能在反義股3’-端、正義股3’-端、反義股5’-端、或正義股5’-端。
有些具體例中，2-核苷酸突出係在反義股3’-端，且末端三個核苷酸之間有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結，這三個核苷酸中有兩個為突出核苷酸，第三個核苷酸為鄰接該突出核苷酸之配對核苷酸。該dsRNAi劑可視需要再於正義股5’-端與反義股5’-端兩端，於末端三個核苷酸之間再包含兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結。
一項具體例中，dsRNAi劑在雙螺旋內包含與標靶之錯配(群)， 或其組合。錯配可能發生於突出區或雙螺旋區。鹼基對可能依據其促進解離或熔解之傾向排序(例如，依據特定一對之結合或解離之自由能，最簡單之方法為檢視該一對核苷酸對另一對核苷酸，但亦可針對鄰接者，或採用類似分析法)。以促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；及I：C優於G：C(I=肌苷)。錯配，例如，非典型或典型以外之配對(如本文中其他說明)優於典型(A：T、A：U、G：C)配對；且包括通用鹼基之配對優於典型配對。
某些具體例中，dsRNAi劑包含雙螺旋區內反義股5’-端起前1、2、3、4、或5對鹼基中至少一對係分別獨立選自：A：U、G：U、I：C，及錯配對，例如，非典型或典型以外之配對或包括通用鹼基之配對，以促進雙螺旋反義股5’-端之解離。
某些具體例中，雙螺旋區中反義股5’-端起1-位置之核苷酸係選自下列各者所成群組：A、dA、dU、U、與dT。或者，雙螺旋區中反義股5’-端起前1、2或3對鹼基中至少一對為AU鹼基對。例如，雙螺旋區中反義股5’-端起第一對鹼基為AU鹼基對。
其他具體例中，正義股3’-端之核苷酸為去氧-胸腺嘧啶(dT)或反義股3’-端之核苷酸為去氧-胸腺嘧啶(dT)。例如，在正義股、反義股、或兩股之3’-端有去氧-胸腺嘧啶核苷酸的短序列，例如，兩個dT核苷酸。
某些具體例中，正義股序列可由式(I)代表：
5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' (I)
其中：
i與j分別獨立為0或1；
p與q分別獨立為0-6；
各Na獨立代表包含0-25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同修飾之核苷酸；
各Nb獨立代表包含0-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；
各np與nq獨立代表突出核苷酸；
其中Nb與Y沒有相同修飾；及
XXX、YYY、與ZZZ分別獨立代表一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序。較佳係YYY為均經2’-F修飾之核苷酸。
有些具體例中，Na或Nb包含交替修飾型態。
有些具體例中，YYY基序出現在或接近正義股之裂解位點。例如，當dsRNAi劑具有17至23個核苷酸長度之雙螺旋區時，YYY基序可出現在正義股之裂解位點或附近(例如，可出現在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12；或11、12、13)，從5’-端之第一個核苷酸開始計數；或可視需要，從5’-端雙螺旋區內第一對配對核苷酸開始計數。
一項具體例中，i為1及j為0、或i為0及j為1、或i與j均為1。因此正義股可由下式代表：
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib)；
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic)；或
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id)。
當正義股由式(Ib)代表時，Nb代表包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na可獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當正義股由式(Ic)代表時，Nb代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、 0-5、0-4、0-2、或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na可獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當正義股由式(Id)代表時，各Nb獨立代表包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。較佳係Nb為0、1、2、3、4、5、或6。各Na可獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
各X、Y與Z可彼此相同或相異。
其他具體例中，i為0及j為0，及正義股可由下式代表：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
當正義股由式(Ia)代表時，各Na可獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
一項具體例中，RNAi之反義股序列可由式(II)代表：
5' nq’-Na '-(Z’Z'Z')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(X'X'X')l-N' a-np ' 3' (II)
其中：
k與l分別獨立為0或1；
p’與q’分別獨立為0-6；
各Na '獨立代表包含0-25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同修飾之核苷酸；
各Nb '獨立代表包含0-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；
各np '與nq '獨立代表突出核苷酸；
其中Nb’與Y’沒有相同修飾；及
X'X'X'、Y'Y'Y'、與Z'Z'Z'分別獨立代表一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序。
有些具體例中，Na’或Nb’包含交替修飾型態。
Y'Y'Y'基序出現在或接近反義股之裂解位點。例如，當dsRNAi劑具有17-23個核苷酸長度之雙螺旋區時，該Y'Y'Y'基序可出現在反義股位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15，從5’-端第一個核苷酸開始計數；或可視需要從5’-端雙螺旋區內第一對配對核苷酸開始計數。較佳係該Y'Y'Y'基序出現在位置11、12、13。
某些具體例中，Y'Y'Y'基序為均經2’-OMe修飾之核苷酸。
某些具體例中，k為1及l為0、或k為0及l為1、或k與l均為1。
因此反義股可由下式代表：
5' nq’-Na '-Z'Z'Z'-Nb '-Y'Y'Y'-Na '-np’3' (IIb)；
5' nq’-Na '-Y'Y'Y'-Nb '-X'X'X'-np’3' (IIc)；或
5' nq’-Na '-Z'Z'Z'-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-X'X'X'-Na '-np’3' (IId)。
當反義股由式(IIb)代表時，Nb’代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na’獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當反義股由式(IIc)代表時，Nb’代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na’獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當反義股由式(IId)代表時，各Nb’獨立代表包含0-10、0-7、0- 10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na’獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。較佳係Nb為0、1、2、3、4、5、或6。
其他具體例中，k為0及l為0，及反義股可由下式代表：
5' np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3' (Ia)。
當反義股由式(IIa)代表時，各Na’獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
各X'、Y'與Z'可彼此相同或相異。
正義股與反義股之各核苷酸可能獨立經LNA、CRN、UNA、cEt、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羥基、或2’-氟修飾。例如，正義股與反義股之各核苷酸係獨立經2’-O-甲基或2’-氟修飾。特定言之，各X、Y、Z、X'、Y'與Z'可代表2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾。
有些具體例中，當dsRNAi劑之雙螺旋區為21個核苷酸時，其正義股可能包含出現在該股9、10與11位置之YYY基序，其係從5’-端第一個核苷酸開始計數，或可視需要從5’-端雙螺旋區內第一對配對核苷酸開始計數；及Y代表2’-F修飾。正義股可在雙螺旋區的相反端額外包含XXX基序或ZZZ基序作為側翼修飾；及XXX與ZZZ分別獨立代表2’-OMe修飾或2’-F修飾。
有些具體例中，反義股可能含有出現在該股位置11、12、13之Y'Y'Y'基序，其係從5’-端第一個核苷酸開始計數，或可視需要從5’-端雙螺旋區內第一對配對核苷酸開始計數；及Y'代表2’-O-甲基修飾。反義股可在雙螺旋區的相反端額外含有X'X'X'基序或Z'Z'Z'基序作為側翼修飾；及X'X'X'與 Z'Z'Z'各分別獨立代表2’-OMe修飾或2’-F修飾。
由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)、與(Id)中任一式代表之正義股分別與式(IIa)、(IIb)、(IIc)、與(IId)中任一式代表之反義股形成雙螺旋。
因此，本發明方法所使用之dsRNAi劑可包含正義股與反義股，各股具有14至30個核苷酸，該iRNA雙螺旋係由式(III)代表：
正義股：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' 反義股：3' np ’-Na ’-(X’X'X')k-Nb ’-Y'Y'Y'-Nb ’-(Z'Z'Z')l-Na ’-nq ’5 (III)
其中：
i、j、k、與l分別獨立為0或1；
p、p'、q、與q'分別獨立為0-6；
各Na與Na ’獨立代表包含0-25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同修飾之核苷酸；
各Nb與Nb ’獨立代表包含0-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；
其中各np’、np、nq’、與nq，各可能存在或可能不存在，獨立代表突出核苷酸；及
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、與Z'Z'Z'分別獨立代表一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序。
一項具體例中，i為0及j為0；或i為1及j為0；或i為0及j為1；或i與j均為0；或i與j均為1。另一項具體例中，k為0及l為0；或k為1及l為0；k為0及l為1；或k與1均為0；或k與l均為1。
形成iRNA雙螺旋之正義股與反義股組合實例包括下式：
5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3' 3' np ’-Na ’-Y'Y'Y'-Na ’nq ’5' (IIIa)
5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3' 3' np ’-Na ’-Y'Y'Y'-Nb ’-Z'Z'Z'-Na ’nq ’5' (IIIb)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3' 3' np ’-Na ’-X'X'X'-Nb ’-Y'Y'Y'-Na ’-nq ’5' (IIIc)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3' 3' np ’-Na ’-X'X'X'-Nb ’-Y'Y'Y'-Nb ’-Z'Z'Z'-Na-nq ’5' (IIId)
當dsRNAi劑由式(IIIa)代表時，各Na獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑由式(IIIb)代表時，各Nb獨立代表包含1-10、1-7、1-5、或1-4個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑由式(IIIc)代表時，各Nb、Nb’獨立代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑由式(IIId)代表時，各Nb、Nb’獨立代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na、Na ’獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序 列。各Na、Na’、Nb、與Nb ’獨立包含交替修飾型態。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、與(IIId)中各X、Y、與Z可彼此相同或相異。
當dsRNAi劑由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、與(IIId)代表時，至少一個Y核苷酸可與一個Y'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個Y核苷酸與對應之Y'核苷酸形成鹼基對；或所有三個Y核苷酸均與對應之Y'核苷酸形成鹼基對。
當dsRNAi劑由式(IIIb)或(IIId)代表時，至少一個Z核苷酸可與一個Z'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個Z核苷酸與對應之Z'核苷酸形成鹼基對；或所有三個Z核苷酸均與對應之Z'核苷酸形成鹼基對。
當dsRNAi劑由式(IIIc)或(IIId)代表時，至少一個X核苷酸可與一個X'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個X核苷酸與對應之X'核苷酸形成鹼基對；或所有三個X核苷酸均與對應之X'核苷酸形成鹼基對。
某些具體例中，Y核苷酸之修飾不同於Y’核苷酸之修飾，Z核苷酸之修飾不同於Z’核苷酸之修飾，或X核苷酸之修飾不同於X’核苷酸之修飾。
某些具體例中，當dsRNAi劑由式(IIId)代表時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾。其他具體例中，當RNAi劑由式(IIId)代表時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，及np '>0，及至少一個np '係透過硫代磷酸酯鏈結連接相鄰之核苷酸。又其他具體例中，當RNAi劑由式(IIId)代表時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np '>0，及至少一個np '係透過硫代磷酸酯鏈結連接相鄰之核苷酸，且正義股係透過二價或三價之分支連接基接合至附接之一或多個GalNAc 衍生物(於下文說明)。其他具體例中，當RNAi劑由式(IIId)代表時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np '>0，及至少一個np '係利用硫代磷酸酯鏈結連接相鄰之核苷酸，正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，且正義股係經由二價或三價之分支連接基接合至附接之一或多個GalNAc衍生物。
有些具體例中，當dsRNAi劑由式(IIIa)代表時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np '>0，及至少一個np '係透過硫代磷酸酯鏈結連接相鄰之核苷酸，正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，且正義股係經由二價或三價之分支連接基接合附接之一或多個GalNAc衍生物。
有些具體例中，dsRNAi劑為包含至少兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、與(IIId)代表之雙螺旋之多聚體，其中雙螺旋係利用連接基連結。連接基可以裂解或不可裂解。多聚體可視需要進一步包含配體。各雙螺旋可靶向相同基因或兩個不同基因；或各雙螺旋可靶向兩個不同標靶位點之相同基因。
有些具體例中，dsRNAi劑為包含三個、四個、五個、六個、或更多個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、與(IIId)代表之雙螺旋之多聚體，其中雙螺旋係利用連接基連結。連接基可以裂解或不可裂解。多聚體可視需要進一步包含配體。各雙螺旋可靶向相同基因或兩個不同基因；或各雙螺旋可靶向兩個不同標靶位點之相同基因。
一項具體例中，兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、與(IIId)中至少一式代表之dsRNAi劑係在5’端及其中一個或兩個3’端彼此連接，且可視需要接合配體。各製劑可靶向相同基因或兩個不同基因；或各製劑可靶向兩個不同標靶位點之相同基因。
某些具體例中，本發明RNAi劑可含有少數之含有2’-氟修飾之核苷酸，例如，10個或更少個具有2’-氟修飾之核苷酸。例如，RNAi劑可含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個具有2’-氟修飾之核苷酸。明確具體例中，本發明RNAi劑含有10個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，正義股中4個具有2’-氟修飾之核苷酸及反義股中6個具有2’-氟修飾之核苷酸。另一項明確具體例中，本發明RNAi劑含有6個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，正義股中4個具有2’-氟修飾之核苷酸及反義股中2個具有2’-氟修飾之核苷酸。
其他具體例中，本發明RNAi劑可含有超少數包含2’-氟修飾之核苷酸，例如，2個或更少個含有2’-氟修飾之核苷酸。例如，RNAi劑可含有2、1、或0個具有2’-氟修飾之核苷酸。明確具體例中，RNAi劑可含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，正義股中0個具有2’-氟修飾之核苷酸及反義股中2個具有2’-氟修飾之核苷酸。
有各種不同文獻說明本發明方法可使用之多聚體iRNA。此等公開文獻包括WO2007/091269、美國專利案案號7,858,769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887、及WO2011/031520，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
如下文中更詳細說明，包含一或多個碳水化合物部份體與iRNA之接合物之iRNA可以優化iRNA之一或多種性質。許多例子中，由碳水化合物部份體附接iRNA之經修飾亞單位。例如，iRNA之一個或多個核糖核苷酸亞單位之核糖可被另一個部份體置換，例如，附接碳水化合物配體之非碳水化合物(較佳為環狀)載劑。依此方式置換亞單位中核糖之核糖核苷酸亞單位在本文中稱為核糖置換修飾亞單位(RRMS)。環狀載劑可能為碳環狀環系(亦即 所有環原子均為碳原子)或雜環狀環系(亦即一個或多個環原子可能為雜原子，例如氮、氧、硫)。該環狀載劑可能為單環狀環系，或可能包含兩個或更多個環，例如稠合環。環狀載劑可能為完全飽和環系，或其可能包含一個或多個雙鍵。
配體可能透過載劑附接多核苷酸。載劑包括(i)至少一個「主幹附接點」，較佳為兩個「主幹附接點」與(ii)至少一個「繫鏈附接點」。本文所採用「主幹附接點」係指可用於且適於讓載劑進入核糖核酸之主幹(例如，磷酸酯、或經修飾磷酸酯(例如，含硫)主幹)中之官能基，例如，羥基，或通常為一個鍵。有些具體例中，「繫鏈附接點」(TAP)係指環狀載劑之組成環原子，例如，碳原子或雜原子(不同於提供主幹附接點之原子)，其連結所選定之部份體。該部份體可為例如，碳水化合物，例如，單糖、雙醣、參醣、肆醣、寡醣、與多醣。該選定之部份體可視需要利用穿插之繫鏈連接該環狀載劑。因此該環狀載劑經常包括適合引進或系鏈另一個化學部份體(例如，配體)至組成環之官能基，例如，胺基，或通常提供一個鍵。
iRNA可能透過載劑接合配體，其中該載劑可為環狀基團或無環基團；較佳為該環狀基團係選自吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧雜環戊烷、
Figure 109136475-A0202-12-0068-62
唑啶基、異
Figure 109136475-A0202-12-0068-63
唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹
Figure 109136475-A0202-12-0068-64
啉基、嗒嗪酮基、四氫呋喃基、與十氫萘；較佳係該無環基團係選自：絲胺醇主幹或二乙醇胺主幹。
本發明另一項具體例中，iRNA劑包含正義股與反義股，各股具有14至40個核苷酸。RNAi劑可由式(L)代表：
Figure 109136475-A0202-12-0069-3
 式(L)中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、及B4’各分別獨立為含有選自下列各者所成群組之修飾之核苷酸：2’-O-烷基、2’-取代之烷氧基、2’-取代之烷基、2’-鹵基、ENA、及BNA/LNA。一項具體例中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、及B4’各含有2’-OMe修飾。一項具體例中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、及B4’各含有2’-OMe或2’-F修飾。一項具體例中，至少一個B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、及B4’含有2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾。
C1為置於反義股種子區相反位點(亦即反義股5’-端位置2-8)之熱失穩化核苷酸。例如，C1位在正義股與反義股5’-端位置2-8之核苷酸配對之位置。一項實例中，C1位在正義股5’-端起之位置15。C1核苷酸帶有熱失穩化修飾，其可包括無鹼基修飾；與雙螺旋中相反核苷酸之錯配；及糖修飾，如2’-去氧修飾或無環核苷酸，例如，非鎖核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。一項具體例中，C1具有選自下列各者所成群組之熱失穩化修飾：i)與反義股中相反核苷酸之錯配；ii)選自下列各者所成群組之無鹼基修飾：
Figure 109136475-A0202-12-0069-4
 及iii)選自下列各者所成群組之糖修飾：
Figure 109136475-A0202-12-0070-5
 其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基，R1與R2獨立為H、鹵素、OR3、或烷基；及R3為H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖。一項具體例中，C1中之熱失穩化修飾為選自下列各者所成群組之錯配：G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T、及U：T；及錯配對中之至少一個核鹼基可視需要為2’-去氧核鹼基。一項實例中，C1中之熱失穩化修飾為GNA或
Figure 109136475-A0202-12-0070-6
T1、T1’、T2’、與T3’分別獨立代表包含修飾之核苷酸，其提供核苷酸之位阻效應小於或等於2’-OMe修飾之位阻效應。位阻效應係指修飾之立體效應總和。測定核苷酸修飾之立體效應之方法係習此相關技藝者習知。該修飾可在核苷酸之核糖之2’位置，或修飾成非核糖核苷酸、無環核苷酸，或讓核苷酸之主幹類似或等於核糖之糖之2’位置，並提供核苷酸之位阻效應小於或等於2’-OMe修飾之位阻效應。例如，T1、T1’、T2’、與T3’分別獨立選自： DNA、RNA、LNA、2’-F、與2’-F-5’-甲基。一項具體例中，T1為DNA。一項具體例中，T1’為DNA、RNA或LNA。一項具體例中，T2’為DNA或RNA。一項具體例中，T3’為DNA或RNA。
n1、n3、與q1獨立為4至15個核苷酸之長度。
n5、q3、與q7獨立為1-6個核苷酸之長度。
n4、q2、與q6獨立為1-3個核苷酸之長度；或者，n4為0。
q5獨立為0-10個核苷酸之長度。
n2與q4獨立為0-3個核苷酸之長度。
或者，n4為0-3個核苷酸之長度。
一項具體例中，n4可為0。一項實例中，n4為0，及q2與q6為1。另一項實例中，n4為0，及q2與q6為1，在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
一項具體例中，n4、q2、與q6各為1。
一項具體例中，n2、n4、q2、q4、與q6各為1。
一項具體例中，當正義股為19-22個核苷酸之長度及n4為1時，C1在正義股5’-端起之位置14-17。一項具體例中，C1在正義股5’-端起之位置15。
一項具體例中，T3’始於反義股5’端起之位置2。一項實例中，T3’位在反義股5’端起之位置2，及q6等於1。
一項具體例中，T1’始於反義股5’端起之位置14。一項實例 中，T1’位在反義股5’端起之位置14，及q2等於1。
一項例舉之具體例中，T3’始於反義股5’端起之位置2，及T1’始於反義股5’端起之位置14。一項實例中，T3’始於反義股5’端起之位置2，及q6等於1；及T1’始於反義股5’端起之位置14，及q2等於1。
一項具體例中，T1’與T3’分隔11個核苷酸之長度(亦即不計算T1’與T3’核苷酸)。
一項具體例中，T1’位在反義股5’端起之位置14。一項實例中，T1’位在反義股5’端起之位置14，及q2等於1，及該修飾在2’位置或在非核糖、無環或主幹提供位阻效應小於2’-OMe核糖之位置。
一項具體例中，T3’位在反義股5’端起之位置2。一項實例中，T3’位在反義股5’端起之位置2，及q6等於1，及該修飾在2’位置或在非核糖、無環或主幹提供位阻效應小於2’-OMe核糖之位置。
一項具體例中，T1為正義股之裂解位點。一項實例中，當正義股為19-22個核苷酸之長度及n2為1時，T1位在正義股5’端起之位置11。一項例舉之具體例中，當正義股為19-22個核苷酸之長度及n2為1時，T1位在正義股5’端起之位置11之正義股裂解位點。
一項具體例中，T2’始於反義股5’端起之位置6。一項實例中，T2’位在反義股5’端起之位置6-10，及q4為1。
一項例舉之具體例中，T1位在正義股之裂解位點，例如，當正義股為19-22個核苷酸之長度及n2為1時，在正義股5’端起之位置11；T1’位在反義股5’端起之位置14，及q2等於1，及T1’之修飾位在核糖之糖之2’位置或在非核糖、無環或主幹提供位阻效應小於2’-OMe核糖之位置；T2’位在反義 股5’端起之位置6-10，及q4為1；及T3’位在反義股5’端起之位置2，及q6等於1，及T3’之修飾在2’位置或在非核糖、無環或主幹提供位阻效應小於2’-OMe核糖之位置。
一項具體例中，T2’始於反義股5’端起之位置8。一項實例中，T2’始於反義股5’端起之位置8，及q4為2。
一項具體例中，T2’始於反義股5’端起之位置9。一項實例中，T2’位在反義股5’端起之位置9，及q4為1。
一項具體例中，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
一項具體例中，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或 2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為6，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為7，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為6，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為7，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結 修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為5，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；可視需要在反義股3’-端再額外具有至少2個TT。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe 或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為5，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；可視需要在反義股3’-端再額外具有至少2個TT；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。
RNAi劑可在正義股或反義股之5’-端包含含磷之基團。5’-端含磷之基團可為5’-端磷酸酯(5’-P)、5’-端硫代磷酸酯(5’-PS)、5’-端二硫代磷酸酯(5’-PS2)、5’-端乙烯基膦酸酯(5’-VP)、5’-端甲基膦酸酯(MePhos)、或5’-去氧- 5’-C-丙二醯基(
Figure 109136475-A0202-12-0078-7
)。當5’-端含磷之基團為5’-端乙烯基膦酸酯(5’-VP)時，5-VP可為5’-E-VP異構物(亦即反式-乙烯基磷酸酯，
Figure 109136475-A0202-12-0078-9
)、5’-Z-VP 異構物(亦即順式-乙烯基磷酸酯，
Figure 109136475-A0202-12-0078-10
)、或其混合物。
一項具體例中，RNAi劑在正義股5’-端包含含磷之基團。一項具體例中，RNAi劑在反義股5’-端包含含磷之基團。
一項具體例中，RNAi劑包含5’-P。一項具體例中，RNAi劑在反義股包含5’-P。
一項具體例中，RNAi劑包含5’-PS。一項具體例中，RNAi劑在反義股包含5’-PS。
一項具體例中，RNAi劑包含5’-VP。一項具體例中，RNAi劑在反義股包含5’-VP。一項具體例中，RNAi劑在反義股包含5’-E-VP。一項具體例中，RNAi劑在反義股包含5’-Z-VP。
一項具體例中，RNAi劑包含5’-PS2。一項具體例中，RNAi劑在反義股包含5’-PS2。
一項具體例中，RNAi劑包含5’-PS2。一項具體例中，RNAi劑在反義股包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2 為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或 2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為 2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。dsRNA劑亦包含5’-PS。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe 或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0， B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2 為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。dsRNAi RNA劑亦包含5’-PS2。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’- F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’- F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2 為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0， B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在 正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe 或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P與靶向配體。一項具體例中，5’-P位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS與靶向配體。一項具體例中，5’-PS位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結 修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合)、及靶向配體。
一項具體例中，5’-VP位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2與靶向配體。一項具體例中，5’-PS2位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基與靶向配體。一項具 體例中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P與靶向配體。一項具體例中，5’-P位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS與靶向配體。一項具體例中，5’-PS位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe 或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合)與靶向配體。一項具體例中，5’-VP位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2與靶向配體。一項具體例中，5’-PS2位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；在正義股位置1-5(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置 18-23(從5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基與靶向配體。一項具體例中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P與靶向配體。一項具體例中，5’-P位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS與靶向配體。一項具體例中，5’-PS位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2 為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合)與靶向配體。一項具體例中，5’-VP位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2與靶向配體。一項具體例中，5’-PS2位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’- F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基與靶向配體。一項具體例中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P與靶向配體。一項具體例中，5’-P位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。 RNAi劑亦包含5’-PS與靶向配體。一項具體例中，5’-PS位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合)與靶向配體。一項具體例中，5’-VP位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2與靶向配體。一項具體例中，5’-PS2位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe 或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；在正義股位置1-5(從正義股5’-端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在位置1與2有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾，及在反義股位置18-23(從反義股5’-端起計數)內有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基與靶向配體。一項具體例中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基位在反義股5’-端，及靶向配體位在正義股3’-端。
一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；及
(iii)在位置1、3、5、7、9至11、13、17、19、及21之2’-F修飾及在位置2、4、6、8、12、14至16、18、及20之2’-OMe修飾(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、3、5、9、11 to 13、15、17、19、21、與23之2’-OMe修飾，及在位置2、4、6至8、10、14、16、18、20、
與22之2’F修飾(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置21與22之間及在核苷酸位置22與23之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
其中dsRNA劑在反義股3’-端具有含兩個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
另一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)在位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19、與21之2’-F修飾，及在位置2、4、6、8、12、14、16、18、與20之2’-OMe修飾(從5’端起計數)；及
(iv)在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19、與21至23之2’-OMe修飾，及在位置2、4、6、8、10、14、16、18、與20之2’F修飾(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；其中RNAi劑在反義股3’-端具有含兩個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
另一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、10、與12至21之2’-OMe修飾、在位置7與9之2’-F修飾、及在位置11之去氧-核苷酸(例如，dT)(從5’端起計數)；及
(iv)在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、3、7、9、11、13、15、17、與19至23之2’-OMe修飾，及在位置2、4至6、8、10、12、14、16、與18之2’-F修飾(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；其中RNAi劑在反義股3’-端具有含兩個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
另一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、10、12、14、與16至21之2’-OMe修飾，及在位置7、9、11、13、與15之2’-F修飾；及
(iv)在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、5、7、9、11、13、15、17、19、與21至23之2’-OMe修飾，及在位置2至4、6、8、10、12、14、16、18、與20之2’-F修飾(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；其中RNAi劑在反義股3’-端具有含兩個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
另一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至9、及12至21之2’-OMe修飾，及在位置10與11之2’-F修飾；及
(iv)在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19、與21至23之2’-OMe修飾，及在位置2、4、6、8、10、14、16、18、與20之2’-F修飾(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；其中RNAi劑在反義股3’-端具有含兩個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
另一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)在位置1、3、5、7、9至11、與13之2’-F修飾，及在位置2、4、6、8、12、與14至21之2’-OMe修飾；及
(iv)在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19、與21至23之2’-OMe修飾，及在位置2、4、8、10、14、16、與20之2’-F修飾(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；其中RNAi劑在反義股3’-端具有含兩個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
另一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17、與19至21之2’-OMe修飾，及在位置3、5、7、9至11、13、16、與18之2’-F修飾；及
(iv)在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)25個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、4、6、7、9、11至13、15、17、與19至23之2’-OMe修飾、在位置2、3、5、8、10、14、16、與18之2’-F修飾、及在位置24與25之去氧-核苷酸(例如，dT)(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；其中RNAi劑在反義股3’-端具有含四個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
另一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、與12至21之2’-OMe修飾，及在位置7、與9至11之2’-F修飾；及
(iv)在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、3至5、7、8、10至13、15、與17至23之2’-OMe修飾，及在位置2、6、9、14、與16之2’-F修飾(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、與核苷酸位置22與23之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；其中RNAi劑在反義股3’-端具有含兩個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
另一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、與12至21之2’-OMe修飾，及在位置7、與9至11之2’-F修飾；及
(iv)在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、3至5、7、10至13、15、與17至23之2’-OMe修飾，及在位置2、6、8、9、14、與16之2’-F修飾(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；其中RNAi劑在反義股3’-端具有含兩個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
另一項特定具體例中，本發明RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)19個核苷酸之長度；
(ii)附接3’-端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價之分支連接基附接之三個GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至4、6、與10至19之2’-OMe修飾，及在位置5、與7至9之2’-F修飾；及
(iv)在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；
及
(b)反義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)在位置1、3至5、7、10至13、15、與17至21之2’-OMe修飾，及在位置2、6、8、9、14、與16之2’-F修飾(從5’端起計數)；及
(iii)在核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置19與20之間、及核苷酸位置20與21之硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結(從5’端起計數)；其中RNAi劑在反義股3’-端具有含兩個核苷酸之突出，及在反義股5’-端具有鈍端。
某些具體例中，本發明方法所使用之iRNA為選自表2-7、15、18、20-23、30、與31中任一個表所列之製劑。此等製劑可進一步包含配體。
III.與配體接合之iRNA
本發明iRNA中RNA之另一種修飾涉及化學連接iRNA與一個或多個可加強例如，iRNA在細胞中之活性、細胞分佈或細胞吸收之配體、部份體或接合物。此等部份體包括(但不限於)：脂質部份體，如膽固醇部份體(Letsinger等人，Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556)。一項具體例中，配體為膽酸(Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053- 1060)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)、硫膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538)、脂系鏈，例如，十二碳烷二醇或十一碳烷基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75：49-54)、磷脂，例如，二-十六烷基-消旋性-甘油或1,2-二-O-十六碳烷基-消旋性-甘油基-3-膦酸三乙基銨鹽(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)、多元胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nuclosides & Nuclotides,1995,14：969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚基部份體(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)、或十八烷基胺或己基胺基-羰基氧膽固醇部份體(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
某些具體例中，iRNA劑引進配體後改變其分佈、靶向或壽命。較佳具體例中，相較於例如，沒有此等配體之物種，該等配體可加強對所選定標靶(例如，對分子、細胞或細胞型態、腔室(例如，細胞或器官腔室)、組織、器官或身體區域)之親和性。較佳配體不參與雙螺旋核酸中之雙螺旋配對。
配體可包括天然物質，如蛋白質(例如，人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、普藍多醣(pullulan)、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精、N-乙醯基葡糖胺、N-乙醯基半乳糖胺或玻尿酸)；或脂質。配體亦可為重組或合成性分子，如合成性聚合物，例如，合成性聚胺基酸。聚胺基酸實例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺 酸、聚L-麩胺酸等聚胺基酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯基醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯基醯胺聚合物、或聚磷腈。多元胺實例包括：聚乙烯亞胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精脒、多元胺、偽肽-多元胺、肽擬似性多元胺、樹枝狀多元胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子性脂質、陽離子性紫質、多元胺之四級鹽、或α螺旋肽。
配體亦可包括靶向基團，例如，靶向細胞或組織之製劑，例如，凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，例如，結合特定細胞型態(如腎臟細胞)之抗體。靶向基團可為促甲狀腺激素、促黑激素、凝集素、醣蛋白、表面活性蛋白質A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡萄糖胺、多價甘露糖、多價岩藻糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、雙膦酸酯、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸鹽、維生素B12、維生素A、生物素、或RGD肽或RGD肽擬似物。某些具體例中，配體為多價半乳糖，例如，N-乙醯基-半乳糖胺。
其他配體實例包括染劑、螯合劑(例如，吖啶類)、交鏈劑(例如，補骨脂內酯、絲裂黴素C)、紫質(TPPC4、德卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多環狀芳香烴(例如，吩嗪、二氫吩嗪)、人造內切核酸酶(例如，EDTA)、親脂性分子，例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、雙氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉草基氧己基、十六烷基甘油、龍腦、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油基)石膽酸、O3-(油基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩嗪)與肽接合物(例如，觸足肽 (antennopedia)、Tat肽)、烷化劑、磷酸鹽、胺基、氫硫基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、標記放射性之標記物、酵素、半抗原(例如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿斯匹靈、維生素E、葉酸)、合成性核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇集物、吖啶-咪唑接合物、四氮雜大環之Eu3+複合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配體可為蛋白質(例如，醣蛋白)、或肽(例如，對輔配體具有特異親和性之分子)、或抗體(例如，結合特異化細胞型態(如肝細胞)之抗體)。配體亦可包括激素與激素受體。其亦可包括非肽物質，如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡萄糖胺、多價甘露糖、或多價岩藻糖。配體可為例如，脂多醣、p38 MAP激酶之活化劑、或NF-κB之活化劑。
配體可為如可藉由例如，破壞細胞之細胞骨架，例如，破壞細胞之微小管、微絲、與/或中間絲而促進細胞吸收iRNA劑之藥物物質。該藥物可為例如，紫杉醇(taxol)、長春新鹼、長春花鹼、細胞鬆弛素(cytochalasin)、諾考達唑(nocodazole)、促進微絲聚合劑(japlakinolide)、微絲解聚劑(latrunculin A)、毒傘素(phalloidin)、紅海海綿抗菌素(swinholide A)、茚酮衍生物(indanocine)、或邁爾素(myoservin)。
有些具體例中，附接本文所說明iRNA之配體之作用為藥物動力學調控劑(PK調控劑)。PK調控劑包括：親脂物、膽汁酸、類固醇、磷脂類似物、肽類、蛋白質結合劑、PEG、維生素，等等。PK調控劑實例包括(但不限於)：膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂類、鞘脂類、納普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、維生素E、生物素，等 等。亦已知包含許多硫代磷酸酯鏈結之寡核苷酸結合血清蛋白質，因此在主幹中包含許多硫代磷酸酯鏈結之短寡核苷酸，例如，約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸亦適用為本發明之配體(例如，作為PK調控配體)。此外，在本文說明之具體例中，結合血清組份(例如，血清蛋白質)之適體亦適用為PK調控配體。
本發明接合配體之iRNA可利用帶有側接反應性官能基之寡核苷酸合成，如由連接分子附接在寡核苷酸上所衍生者(如下文說明)。此反應性寡核苷酸可能直接與自商品取得之配體、經由合成而帶有任何各種不同保護基之配體、或已附接連接性部份體之配體反應。
本發明接合物所使用之寡核苷酸可能適宜且照例採用習知之固相合成技術製造。此等合成法之儀器係由數個供應商提供，包括例如，Applied Biosystems(Foster City,Calif.)。亦可額外使用或改用相關技藝上已知任何其他方式進行此等合成法。亦已知使用類似技術來製備其他寡核苷酸，如硫代磷酸酯與烷基化衍生物。
本發明接合配體之iRNA及帶有配體分子之序列特異性連接核苷中，可能在合適之DNA合成儀，利用標準核苷酸或核苷前體、或已經帶有連接性部份體之核苷酸或核苷接合物前體、已經帶有配體分子之配體-核苷酸或核苷-接合物前體、或帶有非核苷配體之構成嵌段組裝成寡核苷酸與寡核苷。
當使用已經帶有連接性部份體之核苷酸-接合物前體時，通常先完成與序列特異性連接之核苷之合成法，然後由與配體分子與連接性部份體反應，形成接合配體之寡核苷酸。有些具體例中，本發明寡核苷酸或連接之核苷係採用自動化合成儀，除了使用可自商品購得常用於合成寡核苷酸之標準亞胺 基磷酸酯與非標準亞胺基磷酸酯外，尚可使用衍生自配體-核苷接合物之亞胺基磷酸酯合成。
A.脂質接合物
某些具體例中，配體或接合物為脂質或基於脂質之分子。此等脂質或基於脂質之分子較佳係與血清蛋白質，例如，人類血清白蛋白(HSA)結合。HSA結合性配體可以讓接合物分佈在標靶組織，例如，身體之非腎臟標靶組織。例如，該標靶組織可為肝臟，包括肝之實質細胞。其他可結合HAS之分子亦可作為配體使用。例如，可使用納普生(naproxen)或阿斯匹靈。脂質或基於脂質配體可以(a)提高接合物對降解之抗性，(b)提高靶向或轉運至標靶細胞或細胞膜，或(c)可用於調整與血清蛋白質(例如，HAS)之結合性。
基於脂質之配體可用於抑制(例如，控制)接合物與標靶組織之結合性。例如，脂質或基於脂質之配體與HAS之結合性越強時，越不容易靶向腎臟，因此越不容易從身體清除。與HAS之結合性較低之脂質或基於脂質配體可用於讓該接合物靶向腎臟。
某些具體例中，基於脂質之配體結合HAS。較佳係其與HAS具有充份親和性，以使該接合物較佳係分佈至非腎臟組織。然而，該親和性較佳不太強以致於無法逆轉HSA-配體結合性。
其他具體例中，基於脂質之配體與HAS之親和性弱或完全沒有親和性，使得該接合物將會優先分佈至腎臟。除了基於脂質之配體外，亦可改用或額外使用其他靶向腎臟細胞之部份體。
另一項態樣中，配體為例如，維生素之部份體，其可被標靶細 胞(例如，增生細胞)吸收。其等特別適用於治療特徵在於不期望之細胞增生之病變，例如，惡性或非惡性型，例如，癌細胞。維生素實例包括維生素A、E、與K。其他可被標靶細胞(如肝細胞)吸收之維生素實例包括維生素B，例如，葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛或其他維生素，或營養素。亦包括HSA與低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
另一項態樣中，配體為細胞滲透劑，較佳為螺旋細胞滲透劑。該製劑較佳為兩親性。該製劑實例為肽，如tat或觸足肽。若該製劑為肽時，其可經修飾，包括肽基擬似物、反轉異構體、非肽或偽肽鏈結，及使用D-胺基酸。該螺旋劑較佳為α-螺旋劑，其較佳具有親脂相與疏脂相。
配體可為可為肽或肽擬似物。肽擬似物(本文亦稱為寡肽擬似物)為可以折疊成類似天然肽之限定三度空間結構之分子。在iRNA劑附接肽及肽擬似物時，可以藉由如加強細胞辨識與吸收來影響iRNA之藥物動力學分佈性。該肽或肽擬似部份體之長度可為約5至50個胺基酸，例如，長度約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。
肽或肽擬似物可為例如，細胞滲透肽、陽離子性肽、兩親性肽、或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe組成)。肽部份體可為樹枝狀肽、限定構象肽或交鏈肽。或者，肽部份體可包括疏水性跨膜序列(MTS)。含疏水性MTS之肽實例為具有下列胺基酸序列之RFGF：AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：9)。包含疏水性MTS之RFGF類似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：10))亦可作為靶向部份體。該 肽部份體可為「傳遞」肽，其可攜帶大型極性分子(包括肽、寡核苷酸與蛋白質)穿越細胞膜。已發現例如，來自HIV Tat蛋白質(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：11)與果蠅觸足肽(Drosophila Antennapedia)蛋白質(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：12)之序列具有作為傳遞肽之功能。肽或肽擬似物可由DNA之隨機序列編碼，如從噬菌體展示庫或一珠粒一種化合物(one-bead-one-compound(OBOC))組合庫(Lam等人，Nature,354：82-84,1991)判別之肽。為了靶向細胞目的而藉由引進之單體單位與dsRNA劑系鏈之肽或肽擬似物實例為精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)-肽、或RGD擬似物。肽部份體之長度範圍可為約5個胺基酸至約40個胺基酸。該肽部份體可具有如可提高安定性或主導構型性質之結構修飾。可採用下文說明之任何結構修飾。
本發明組成物與方法所使用之RGD肽可為線性或環狀，且可經過修飾，例如，糖基化或甲基化，以促進靶向特定組織(群)。包含RGD之肽與肽擬似物可包括D-胺基酸及合成性RGD擬似物。除了RGD外，尚可使用靶向整合素配體之其他部份體。此配體之較佳接合物係靶向PECAM-1或VEGF。
「細胞通透性肽」可以通透細胞，例如，微生物細胞，如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞，如人類細胞。可通透微生物細胞之肽可為例如，α-螺旋線性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、包含二硫鍵之肽(例如，α-防禦素(defensin)、β-防禦素或制菌肽(bactenecin))，或僅包含一個或兩個主要胺基酸之肽(例如，PR-39或吲哚抗生肽(indolicidin))。細胞通透性肽亦可包括核定位訊號(NLS)。例如，細胞通透性肽可為二部組合之兩親性肽，如MPG，其係衍生自HIV-1 gp41與SV40大型T抗原之NLS之稠合肽功能域(Simeoni等人 Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳水化合物接合物
本發明組成物與方法之有些具體例中，iRNA進一步包含碳水化合物。接合iRNA之碳水化合物之優點在於活體內傳遞核酸，且其組成物適合活體內之醫療用途，如本文所說明。本文所採用「碳水化合物」係指其本身即為由一個或多個具有至少6個碳原子(其可為線性、分支或環狀)且在各碳原子鍵結氧、氮或硫原子之單糖單位所組成碳水化合物之化合物；或具有由一個或多個各具有至少6個碳原子(其可為線性、分支或環狀)且在各碳原子鍵結氧、氮或硫原子之單糖單位所組成之碳水化合物作為其中一部份之化合物。代表性碳水化合物包括糖類(單糖、雙醣、三醣與包含約4、5、6、7、8、或9個該單糖單位之寡醣類)，與多醣類，如澱粉、肝醣、纖維素與多醣膠質。明確之單糖包括C5與更多碳(例如，C5、C6、C7、或C8)之糖類；雙醣與三醣包括具有兩個或三個該單糖單位之醣類(例如，C5、C6、C7、或C8)。
某些具體例中，本發明組成物與方法所使用之碳水化合物接合物為單糖。
一項具體例中，本發明組成物與方法所使用之碳水化合物接合物係選自下列各者所成群組：
Figure 109136475-A0202-12-0116-11
Figure 109136475-A0202-12-0116-12
Figure 109136475-A0202-12-0116-13
Figure 109136475-A0202-12-0116-14
Figure 109136475-A0202-12-0116-15
Figure 109136475-A0202-12-0117-16
Figure 109136475-A0202-12-0117-17
Figure 109136475-A0202-12-0117-18
Figure 109136475-A0202-12-0117-19
Figure 109136475-A0202-12-0118-20
Figure 109136475-A0202-12-0118-21
Figure 109136475-A0202-12-0118-22
Figure 109136475-A0202-12-0118-25
Figure 109136475-A0202-12-0118-26
Figure 109136475-A0202-12-0119-27
Figure 109136475-A0202-12-0119-28
Figure 109136475-A0202-12-0119-29
Figure 109136475-A0202-12-0119-30
Figure 109136475-A0202-12-0119-32
Figure 109136475-A0202-12-0119-33
Figure 109136475-A0202-12-0120-34
Figure 109136475-A0202-12-0120-35
Figure 109136475-A0202-12-0120-36
，其中Y為O或S，及n為3-6(式XXIV)；
Figure 109136475-A0202-12-0120-38
，其中Y為O或S，及n為3-6(式XXV)；
Figure 109136475-A0202-12-0120-39
Figure 109136475-A0202-12-0121-40
，其中X為O或S(式XXVII)；
Figure 109136475-A0202-12-0121-41
Figure 109136475-A0202-12-0122-42
Figure 109136475-A0202-12-0122-44
Figure 109136475-A0202-12-0123-45
另一項具體例中，本發明組成物與方法所使用之碳水化合物接合物為單糖。一項具體例中，該單糖為N-乙醯基半乳糖胺，如：
Figure 109136475-A0202-12-0123-46
本文所說明具體例可使用之另一種代表性碳水化合物接合物包括(但不限於)：
Figure 109136475-A0202-12-0124-47
 (式XXXVI)，當X或Y中之一為寡核苷酸時，另一個為氫。
本發明某些具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物係透過單價連接基附接本發明iRNA劑。有些具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物係透過二價連接基附接本發明iRNA劑。又另一項本發明具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物係透過三價連接基附接本發明iRNA劑。
一項具體例中，本發明雙股RNAi劑包含一或多個GalNAc或GalNAc衍生物附接iRNA劑。GalNAc可利用正義股或反義股之連接基附接任何核苷酸。GalNac可附接正義股5’-端、正義股3’端、反義股5’-端、或反義股3’端。一項具體例中，GalNAc係例如，透過三價連接基附接正義股3’端。
其他具體例中，本發明雙股RNAi劑包含複數個(例如，2、3、4、5、或6個)GalNAc或GalNAc衍生物，各分別獨立經由複數個連接基，例如，單價連接基，附接雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
有些具體例中，例如，當本發明iRNA劑之兩股為一個較大分子之一部份，其藉由一股之3’-端與另一股之5’-端之間無中斷核苷酸鏈連結形成包含複數個未配對核苷酸之髮夾環時，髮夾環內各未配對核苷酸可分別獨立包含透過單價連接基附接之GalNAc或GalNAc衍生物。
有些具體例中，碳水化合物接合物進一步包含一個或多個如上述之額外配體，如但不限於，PK調控劑或細胞通透性肽。
適用於本發明之其他額外碳水化合物接合物與連接基包括彼等說明於PCT公開案案號WO 2014/179620與WO 2014/179627中者，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
D.連接基
有些具體例中，本文說明之接合物或配體可利用各種不同可以裂解或不可裂解之連接基附接iRNA寡核苷酸。
術語「連接基」或「連接基團」意指連結化合物之兩個部份之有機部份體，例如，共價附接化合物之兩個部份。該連接基通常包含一個直接鍵結或原子(如氧或硫)、單位(如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子鏈)，如但不限於，經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其中一個或多個亞甲基可穿插或末端為 O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環；其中R8為氫、醯基、脂系或經取代之脂系。一項具體例中，連接基為約1-24個原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18、7-17、8-17、6-16、7-17、或8-16個原子。
可裂解之連接基團為在細胞外具有充份安定性，但當進入標靶細胞內時即裂解而釋出連接基所共同固定之兩個部份之基團。較佳具體例中，可裂解之連接基團在標靶細胞中或在第一參考條件(其可為例如，選擇模擬或代表細胞內條件)之裂解速度比在個體血液中或在第二參考條件(其可為例如，選擇模擬或代表血液或血清中之條件)至少快約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多倍，或至少100倍。
可裂解性連接基團可感受裂解劑之作用，例如，pH、氧化還原電位、降解性分子之存在。通常，裂解劑於細胞內部之存在或含量或活性高於其在血清或血液中。此等降解劑實例包括：針對特定受質選擇或沒有受質特異性之氧化還原劑，包括例如，存在於細胞中之氧化性或還原性酵素或還原劑，如氫硫醇，其可利用還原作用降解可經氧化還原性裂解之連接基團；酯酶；核內體或可產生酸性環境之製劑，例如，彼等造成pH 5或更低之製劑；可水解或降解酸可裂解性連接基團之酵素，其作用為一般酸類、肽酶(其可為受質特異性)與磷酸酶。
可裂解性連接基團(如二硫鍵)對pH敏感。人類血清之pH為7.4，而細胞內平均pH稍低，在約7.1-7.3之範圍內。核內體具有較酸之pH，在5.5-6.0之範圍內，溶小體之pH甚至更酸，約5.0。有些連接基具有可在較佳pH裂解之可裂解性連接基團，藉以在細胞內從配體釋放陽離子性脂質，或 進入所需之細胞腔室內。
連接基可包括可被特定酵素裂解之可裂解性連接基團。引進連接基中之可裂解性連接基團型態依所靶向之細胞而定。例如，靶向肝之配體可經由包括酯基之連接基連接陽離子性脂質。肝細胞富含酯酶，因此該連接基在肝細胞中之裂解效率高於在沒有富含酯酶之細胞型態中之效率。其他富含酯酶之細胞型態包括肺、腎皮質與睪丸之細胞。
當靶向富含肽酶之細胞型態(如肝細胞與滑液膜細胞)時，可使用含有肽鍵之連接基。
通常，測試降解劑裂解候選連接基團之能力(或條件)，以分析該候選之可裂解性連接基團之合適性。亦需要亦測試候選之可裂解性連接基團於血液中或當與其他非標靶組織接觸時阻抗裂解之能力。因此，可以決定第一與第二條件之間對裂解作用之相對敏感性，其中所選擇之第一條件係其於標靶細胞中之裂解指標，所選擇之第二條件係其於其他組織或生物液體(例如，血液或血清)中之裂解指標。該分析法可於無細胞系統、細胞、細胞培養物、器官或組織培養物、或在完整動物體中進行。其適用於在無細胞或培養條件下進行初次分析，並進一步在完整動物體內確認。較佳具體例中，適用之候選化合物在細胞(或在選擇擬似細胞內條件之活體外條件下)之裂解速度比在血液或血清(或在選擇擬似細胞外條件之活體外條件下)至少快約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或約100倍。
i.可經氧化還原裂解之連接基團
某些具體例中，可裂解性連接基團為可經氧化還原裂解之連接 基團，亦即可在還原或氧化時裂解。可經還原性裂解之連接基團實例為二硫連接基團(-S-S-)。可參見本文說明之方法來決定該候選之可裂解性連接基團是否為合適之「可經還原性裂解之連接基團」，或例如，是否適用於帶有特定iRNA部份體與特定靶向劑。例如，可藉由與二硫蘇糖醇(DTT)或其他還原劑培養，使用相關技藝上已知擬似細胞(例如，標靶細胞)中所觀察到之裂解速率之試劑來分析候選物。該等候選物亦可在選擇擬似血液或血清之條件下分析。其中一種候選化合物在血液中至多裂解約10%。其他具體例中，適用之候選化合物在細胞(或在選擇擬似細胞內條件之活體外條件下)之裂解速度比在血液(或在選擇擬似細胞外條件之活體外條件下)至少快約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或約100倍。候選化合物之裂解速度可採用標準酵素動力學分析法，在選擇擬似細胞內基質條件下分析，並與選擇擬似細胞外基質之條件下之結果比較。
ii.基於磷酸酯之可裂解性連接基團
其他具體例中，可裂解性連接基包含基於磷酸酯之可裂解性連接基團。基於磷酸酯之可裂解性連接基團係被可降解或水解磷酸酯基團之製劑裂解。該於細胞中裂解磷酸酯基團之製劑實例為如細胞中之磷酸酶之酵素。基於磷酸酯之連接基團實例為-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。較佳具體例為-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S- P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、與-O-P(S)(H)-S-。較佳具體例為-O-P(O)(OH)-O-。此等候選物可採用類似上述彼等方法分析。
iii.酸可裂解之連接基團
其他具體例中，該可裂解性連接基包含酸可裂解之連接基團。酸可裂解之連接基團為可在酸性條件下裂解之連接基團。較佳具體例中，酸可裂解之連接基團為在pH約6.5或更低(例如，約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)之酸性環境下裂解，或被如同一般酸之作用之製劑(如酵素)裂解之基團。在細胞中，明確之低pH細胞器(如內體與溶小體)可為該酸可裂解之連接基團提供裂解環境。該酸可裂解之連接基團實例包括(但不限於)：腙類、酯類、及胺基酸之酯類。酸可裂解之基團具有通式-C=NN-、C(O)O，或-OC(O)。較佳具體例為當附接酯之氧(烷氧基)之碳為芳基、經取代之烷基、或三級烷基(如二甲基戊基或第三丁基)時。此等候選物可採用類似彼等上述方法分析。
iv.基於酯之連接基團
其他具體例中，可裂解性連接基包含基於酯之可裂解性連接基團。該基於酯之可裂解性連接基團可被細胞中如酯酶與醯胺酶之酵素裂解。基於酯之可裂解性連接基團實例包括(但不限於)：伸烷基、伸烯基與伸炔基之酯類。可裂解之酯連接基團具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等候選物可採用類似彼等上述方法分析。
v.基於肽之裂解基團
再另一項具體例中，該可裂解之連接基包含基於肽之可裂解性連接基團。該基於肽之可裂解性連接基團可被細胞中如肽酶與蛋白酶之酵素裂解。該基於肽之可裂解性連接基團係在胺基酸之間為了產生寡肽(例如，二肽、三肽等等)與多肽所形成之肽鍵。該基於肽之可裂解基團不包括醯胺基(-C(O)NH-)。醯胺基可在任何伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵係在胺基酸之間為了產生肽與蛋白質所形成之一種特別型態之醯胺鍵。該基於肽之裂解基團通常限於在胺基酸之間為了產生肽與蛋白質所形成之肽鍵(亦即醯胺鍵)，且不包括整個醯胺官能基。該基於肽之可裂解性連接基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA與RB為兩個相鄰胺基酸之R基團。此等候選物可採用彼等類似上述之方法分析。
有些具體例中，本發明iRNA係經由連接基接合碳水化合物。使用本發明組成物與方法之連接基之iRNA碳水化合物接合物之無限制實例包括(但不限於)：
Figure 109136475-A0202-12-0130-48
Figure 109136475-A0202-12-0131-49
Figure 109136475-A0202-12-0131-50
Figure 109136475-A0202-12-0131-51
Figure 109136475-A0202-12-0131-52
Figure 109136475-A0202-12-0132-53
Figure 109136475-A0202-12-0132-54
Figure 109136475-A0202-12-0132-55
 當X或Y中之一為寡核苷酸時，另一個為氫。
本發明組成物與方法之某些具體例中，配體係經由二價或三價之分支連接基附接之一或多個「GalNAc」(N-乙醯基半乳糖胺)衍生物。
一項具體例中，本發明dsRNA係接合至二價或三價之分支連接基，其係選自式(XLV)-(XLVI)中任一式所示結構之群中：
式XXXXV
Figure 109136475-A0202-12-0133-56
Figure 109136475-A0202-12-0133-57
Figure 109136475-A0202-12-0133-58
Figure 109136475-A0202-12-0133-59
 其中：q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B與q5C每次出現時獨立代表0-20，及其中重複單位可相同或相異； P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C每次出現時獨立為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C每次出現時獨立為不存在、伸烷基、經取代之伸烷基，其中一或多個亞甲基可穿插或末端為一或多個O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)；R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出現時獨立為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
Figure 109136475-A0202-12-0134-60
 或雜環基；L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B與L5C代表配體；亦即每次出現時獨立為單糖(如GalNAc)、雙醣、參醣、肆醣、寡醣或多醣；及Ra為H或胺基酸側鏈。RNAi劑特別適合使用三價接合GalNAc衍生物來抑制標靶基因表現，如彼等如式(XLIX)：
Figure 109136475-A0202-12-0134-61
 其中L5A、L5B與L5C代表單糖，如GalNAc衍生物。
接合GalNAc衍生物之合適二價與三價分支連接基團實例包括(但不限於)：如上述式II、VII、XI、X、與XIII之結構。
教示RNA接合物製法之代表性美國專利案包括(但不限於)：美國專利案案號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717, 5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241, 5,391,723；5,416,203, 5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；與8,106,022，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
所指定化合物不一定所有位置均經一致修飾，事實上可在單一化合物中或甚至在iRNA中之單一核苷上引進超過一個上述修飾。本發明亦包括呈嵌合化合物之iRNA化合物。
本發明內容中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合體」為包含兩個或更多個化學上獨立區之iRNA化合物，較佳為dsRNAi劑，該各區分別由至少一個單體單位組成，亦即以dsRNA化合物為例，為由核苷酸組成。此等iRNA通常包含至少一個區，其中RNA係經修飾，以致提高iRNA對核酸酶降 解之抗性，提高細胞吸收性，或提高對標靶核酸之結合親和性。iRNA之另一區可作為可以裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜交體之酵素之受質。例如，RNase H為細胞內切核酸酶，其裂解RNA：DNA雙螺旋之RNA股。因此活化RNase H之結果會裂解RNA標靶，藉以大幅加強iRNA抑制基因表現之效力。結果，當採用嵌合性dsRNA時，經常可以採用較短之iRNA得到類似硫代磷酸酯去氧dsRNA與相同標靶區雜交後得到之結果。RNA標靶之裂解作用照例可採用凝膠電泳分析法檢測，且若必要時，可聯合採用相關技藝上已知之核酸雜交技術。
某些例子中，iRNA之RNA可經過非配體基團修飾。許多種非配體分子已與iRNA接合，以加強iRNA之活性、細胞分佈性或細胞吸收性，且進行此等接合法之程序可從科學文獻中取得。此等非配體部份體包括脂質部份體，如膽固醇(Kubo,T.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂系鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J,1991,10：1111；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75：49)、磷脂，例如，二-十六烷基-消旋性-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋性-甘油基-3-膦酸三乙基銨鹽(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、多元胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nuclosides & Nuclotides,1995,14：969)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、棕櫚基部份體(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)、或十八烷基胺或己基胺基-羰基氧膽固醇部份體(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教示此等RNA接合物製法之代表性美國專利案已如上述。典型接合法程序涉及合成在序列之一個或多個位置帶有胺基連接基之RNA。該胺基再與準備接合之分子採用適當偶合或活化試劑反應。該接合反應可在RNA仍結合在固態擔體時進行或可在裂解RNA後，在液相中進行。通常採用HPLC法純化RNA接合物，產生純接合物。
IV.本發明iRNA之傳遞法
可採用許多不同方式傳遞本發明iRNA至細胞中，例如，個體，如人類個體(例如，有此需要之個體，如容易罹患或經診斷患有補體成分C3-相關疾患，例如，溶血之個體)內之細胞。例如，可能由細胞與本發明iRNA於活體外或活體內接觸，進行傳遞。亦可直接投與包含iRNA之組成物(例如，dsRNA)給個體，進行活體內傳遞。或者，可能間接投與編碼並主導iRNA表現之一或多種載體，進行活體內傳遞。此等替代法更進一步於下文中討論。
通常，本發明iRNA可採用任何傳遞核酸分子之方法(活體外或活體內)(參見例如，Akhtar S.與Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144與WO94/02595，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中)。用於活體內傳遞時，要傳遞iRNA分子之考量因素包括例如，所傳遞分子之生物安定性、預防所傳遞分子在標靶組織中之非特異性效應及累積。RNA干擾法亦已顯示可藉 由直接注射法成功局部傳遞至CNS(Dorn,G.，等人(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.等人(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.等人(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.等人(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.等人(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)。修飾RNA或醫藥載劑亦可讓iRNA靶向標靶組織，並避免不期望之脫靶效應。iRNA分子可採用化學法接合親脂性基團(如膽固醇)進行修飾，以加強細胞吸收並預防降解。例如，由主導對抗ApoB之iRNA與親脂性膽固醇部份體之接合物全身注射至小鼠，結果擊弱肝與空腸中之apoB mRNA(Soutschek,J.等人(2004)Nature 432：173-178)。
另一項具體例，可使用藥物傳遞系統(如奈米粒子、樹枝狀物、聚合物、脂質體或陽離子性傳遞系統)傳遞iRNA。帶正電價之陽離子性傳遞系統可促進iRNA分子(帶負電價)之結合性，亦加強在帶負電價之細胞膜上之交互作用，讓細胞有效吸收iRNA。陽離子性脂質、樹枝狀物、或聚合物可與iRNA結合，或誘發形成囊封iRNA之囊泡或膠束(參見例如，Kim SH.等人(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。形成囊泡或膠束可在全身投藥時進一步預防iRNA降解。製造及投與陽離子性-iRNA複合物之方法係習此相關技藝者之能力範圍內(參見例如，Sorensen,DR.等人(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.等人(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS等人(2007)J.Hypertens.25：197-205，其等完整揭示內容已以引用之方式併入本文中)。適用於全身性傳遞iRNA之藥物傳遞系統之有些無限制性實例包括DOTAP(Sorensen,DR.等人(2003)，如上述文獻；Verma,UN.等人(2003)，如上 述文獻)、「固態核酸脂質粒子」(Zimmermann,TS.等人(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(cardiolipin)(Chien,PY.等人(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.等人(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙二亞胺(Bonnet ME.等人(2008)Pharm.Res.8月16日電子書(Epub ahead of print)；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽類(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)、與聚醯胺基胺類(Tomalia,DA.等人(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.等人(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。有些具體例中，iRNA與環糊精形成複合物，供全身性投藥。iRNA與環糊精之投藥方法及醫藥組成物可參見美國專利案案號7,427,605，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
A.編碼本發明iRNA之載體
靶向補體成分C3基因之iRNA可由嵌入DNA或RNA載體中之轉錄單位表現(參見例如，Couture,A等人TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A.等人之國際PCT公開案案號WO 00/22113、Conrad之國際PCT公開案案號WO 00/22114、與Conrad之美國專利案案號6,054,299)。該表現可為過渡性(數小時至數週)或持續性(數週至數個月或更久)，依所採用之特定構築體及標靶組織或細胞型態而定。此等轉殖基因可呈線性構築體、環狀質體、或病毒載體引進，其可為整合或非整合載體。亦可構築該轉殖基因，使其得以呈染色體外質體遺傳(Gassmann，等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
本文所說明方法與組成物可利用之病毒載體系統包括(但不限於)：(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括(但不限於)：慢病毒(lentivirus) 載體、莫洛尼氏白血病病毒(moloney murine leukemia virus)等等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)SV 40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳突病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，如正痘(orthopox)，例如，牛痘病毒載體或鳥痘，例如，金絲雀痘或禽痘；與(j)輔助病毒依賴性或無腸腺病毒。複製缺陷病毒亦有利。細胞基因組中不一定會引進不同載體。若需要時，該構築體可包括用於轉錄之病毒序列。或者，該構築體可引至可以進行附加體型複製之載體中，例如，EPV與EBV載體。用於iRNA之重組表現之構築體通常需要調節元素，例如，啟動子、加強子等等，以確保iRNA於標靶細胞中之表現。下文將進一步說明有關載體與構築體之其他態樣。
V.本發明醫藥組成物
本發明亦包括一種含有本文所說明iRNA之醫藥組成物與調配物。一項具體例中，本文提供含有本文所說明iRNA與醫藥上可接受之載體之醫藥組成物。含有該iRNA之醫藥組成物適用於預防或治療與補體成分C3-相關疾患，例如，溶血。此等醫藥組成物係依據傳遞模式調配。其中一項實例為一種調配成以非經腸式傳遞而全身性投藥之組成物，例如，經皮下(SC)、肌內(IM)、或經靜脈內(IV)傳遞。本發明醫藥組成物可投與足以抑制補體成分C3基因表現之劑量。
有些具體例中，本發明醫藥組成物為無菌。另一項具體例中，本發明醫藥組成物沒有致熱原。
本發明醫藥組成物可投與足以抑制補體成分C3基因表現之劑量。通常，本發明iRNA之合適劑量在每天每公斤體重約0.001至約200.0毫克 之範圍內，通常在每天每公斤體重約1至50mg之範圍內。典型之本發明iRNA之合適劑量為約0.1mg/kg至約5.0mg/kg之範圍內，較佳為約0.3mg/kg至約3.0mg/kg。重複劑量療程可包括依規律方式投與醫療有效量之iRNA，如每個月、每3-6個月一次、或一年一次。某些具體例中，iRNA係約每個月投藥一次至約每6個投藥一次。
經過初始治療療程後，該治療法可減少投藥頻率。可依據疾病嚴重度決定持續治療時間。
其他具體例中，醫藥組成物之單一劑量可以為長效性，因此可在不超過1、2、3或4個月之間隔內投藥。本發明有些具體例中，本發明醫藥組成物之單一劑量係約每個月投藥一次。本發明其他具體例中，本發明醫藥組成物之單一劑量係每季(亦即約每3個月)投藥一次。本發明其他具體例中，本發明醫藥組成物之單一劑量係一年投藥兩次(亦即約每6個月一次)。
習此相關技藝者咸了解，某些因素會影響有效治療個體時所需之劑量與投藥時程，包括(但不限於)：個體中出現之突變、過去之治療、個體之一般健康或年齡、及其他現有疾病。此外，適當時，以預防或醫療有效量之組成物治療個體時，可包括單次治療或一系列治療。
iRNA可依靶向特定組織(例如，肝細胞)之方式傳遞。
本發明醫藥組成物包括(但不限於)：溶液、乳液、及包含脂質體之調配物。此等組成物可由各種不同組份產生，包括(但不限於)：預成型液體、自行乳化之固體、及自行乳化之半固體。調配物包括彼等靶向肝之調配物。
宜呈單位劑型之本發明醫藥調配物可依據醫藥業習知技術製 備。此等技術包括組合活性成分與醫藥載劑(群)或賦形劑(群)之步驟。通常，調配物之製法為均勻且密切組合活性成分與液態載劑。
A.其他調配物
i.乳液
本發明組成物可製造並調配成乳液。乳液為其中一種液體呈直徑通常不超過0.1μm之液滴型態勻散在另一種液體中之典型不均相系統(參見例如，Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199；Rosoff述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.245；Block述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第2冊，p.335；Higuchi等人述於Remington’s Parmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常為雙相系統，其包含兩個彼此密切混合與分散之不可混溶之液相。通常，乳液可為油包水(w/o)型或水包油(o/w)型。當水相呈小液滴均勻分佈且分散在大體積之油相中時，所得組成物稱為油包水性(w/o)乳液。或者，當油相呈小液滴均勻分佈且分散在大體積之水相中時，所得組成物稱為水包油性(o/w)乳液。乳液中除了分散相外，可再包含其他組份，且活性藥物可呈溶液存在於水相、油相或本身另呈一相。需要時，乳液中亦可包含醫藥賦形劑，如乳化劑、安定劑、染劑、與抗 氧化劑。醫藥乳液亦可為由超過兩相組成之多相乳液，如例如，以油包水包油性(o/w/o)與水包油包水性(w/o/w)乳液為例。此等複合調配物經常提供單純二元乳液沒有之優點。其中o/w乳液之個別油滴包埋小水滴之多相乳液即構成w/o/w乳液。同樣地，由油滴包埋在於油連續相中安定化之水球中，提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於很低或沒有熱力學安定性。通常，乳液之分散相或不連續相均勻分佈在外相或連續相內，並利用乳化劑或調配物之黏度維持此型式。其他安定乳液方式可以使用乳化劑，引進乳液之任一相中。乳化劑可廣義分為四類：合成性界面活性劑、天然乳化劑、吸收基質、與均勻分散之固體(參見例如，Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199)。
合成性界面活性劑亦已知為表面活性劑，已廣泛用於乳液之調配物，且已於文獻中說明(參見例如，Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.285；Idson述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第一冊，p.199)。界面活性劑通常為兩親性，其包含親水性與疏水性部份。界面活性劑之親水性對疏水性性質之比值稱為親水性/親脂性平衡值(HLB)，係在製備調配物 時用於分類及選擇界面活性劑之有利工具。界面活性劑可依據親水性基團性質分成不同類型：非離子性、陰離子性、陽離子性、與兩親性(參見例如，Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.285)。
乳液調配物中亦可包括許多種不同之非乳化材料，其可賦與乳液性質。此等物質包括脂肪、油類、蠟類、脂肪酸、脂肪醇類、脂肪酯類、保濕劑、親水性膠體、防腐劑與抗氧化劑(Block述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.335；Idson述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199)。
乳液調配物經由皮膚、口、與非經腸式途徑之用途與其製造方法已有文獻說明(參見例如，Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199)。
ii.微乳液
本發明一項具體例中，iRNA與核酸之組成物係調配成微乳 液。微乳液之定義為由水、油與兩親物形成單一之光學上各向同性且熱力學上安定之液體溶液之系統(參見例如，Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff述於Parmaceutical Dosage Forms，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.245)。典型微乳液為先讓油分散在水性界面活性劑溶液中，然後添加足量之第四組份所形成之系統，通常添加中鏈長度之醇類，以形成透明系統。因此，微乳液亦稱為兩種不混溶液體之熱動力學上安定之各向同性透明分散液，其係利用表面活性分子之界面膜安定化(Leung與Shah述於：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate System，Rosoff,M，編輯，1989,VCH Publishers,New York,p.185-215)。
iii.微粒
本發明iRNA可以併至粒子，例如，微粒中。微粒可由噴霧乾燥法產生，但亦可採用其他方法製造，包括冷凍乾燥、蒸發、流化床乾燥法、真空乾燥、或此等技術之組合。
iv.滲透加強劑
一項具體例中，本發明使用各種不同滲透加強劑，讓核酸(特定言之iRNA)有效傳遞至動物皮膚。大多數藥物在溶液中係呈離子化與非離子化兩種型式。然而，通常僅有脂質可溶性或親脂性藥物容易穿越細胞膜。已發現，若膜經過滲透加強劑處理時，即使非親脂性藥物亦可穿越細胞膜。除了協 助非親脂性藥物擴散通過細胞膜，滲透加強劑亦可加強親脂性藥物之通透性。
滲透加強劑可分成1至5大類，亦即界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽類、螯合劑、與非螯合性非界面活性劑(參見例如，Malmsten,M.之Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人之Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述各類滲透加強劑與其用於製造醫藥及其傳遞藥劑之用途係相關技藝習知者。
v.賦形劑
與載劑化合物相反，「醫藥載劑」或「賦形劑」為供傳遞一或多種核酸至動物體之醫藥上可接受之溶劑、懸浮劑或任何其他醫藥惰性媒劑。賦形劑可呈液態或固態，並依計畫之投藥方式選擇，以在與核酸及指定之醫藥組成物中其他組份組合時提供所需之填充體積、堅實度等等。此等製劑係相關技藝習知者。
vi.其他組份
本發明組成物可再包含醫藥組成物中常用且相關技藝上已建立用量之其他輔助組份。因此例如，組成物可再包含其他可相容之醫藥活性材料，如例如，止癢劑、收斂劑、局部***或消炎劑，或可包含其他適用於物理性調配本發明組成物各種不同劑型之材料，如染劑、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、不透明劑、增稠劑與安定劑。然而，當添加此等材料時，不應不當干擾本發明組成物中組份之生物活性。調配物可經過殺菌，且若需要時，可與不與 調配物之核酸(群)出現不良交互作用之輔劑混合，例如，潤滑劑、防腐劑、安定劑、濕化劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、調味劑與/或芳香物質等等。
水性懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、或葡聚糖。該懸浮液亦可含有安定劑。
有些具體例中，如本發明所說明特徵之醫藥組成物包括(a)一或多種iRNA化合物與(b)一或多種其功能為非iRNA機轉且適用於治療補體成分C3-相關疾患(例如，溶血)之製劑。
此等化合物之毒性與預防效力可採用標準醫藥程序，於細胞培養中或實驗動物中測定，例如，測定LD50(造成50%族群死亡時之劑量)與ED50(有效預防50%族群時之劑量)。毒性與醫療效應之間之劑量比值即為醫療指數，以LD50/ED50比值表示。以醫療指數高之化合物較佳。
可採用由細胞培養分析法與動物研究得到之數據來調配用於人類之劑量範圍。如本發明所說明特徵之組成物之劑量通常落在包括極低或無毒性之ED50(較佳為ED80或ED90)之循環濃度範圍內。劑量可依所採用劑型及所利用之投藥途徑，在此範圍內變化。用於如本發明所說明特徵之方法所使用之任何化合物之預防有效劑量可先從細胞培養分析法估測。可在動物模式中調配劑量，以使該化合物或若適當時使標靶序列之多肽產物之循環血漿濃度達到(例如，降低多肽濃度達到)包括細胞培養物所決定IC50(亦即試驗化合物使症狀達到一半最大抑制性時之濃度)或更高抑制程度之範圍。此等資訊可用於更精確決定適用於人類之劑量。可藉由例如，高效液相層析法測定血漿中濃度。
除了如上述投藥法外，如本發明所說明特徵之iRNA可與其他 已知可有效預防或治療補體成分C3-相關疾患(例如，溶血)之製劑組合投藥。任何情況下，投藥之醫師均可依據採用相關技藝上已知或本文所說明標準效力測定法所觀察到之結果來調整iRNA之投藥量與投藥時程。
VI.抑制補體成分C3表現之方法
本發明亦提供一種抑制細胞中C3基因表現之方法。該方法包括由細胞與可有效抑制細胞中補體成分C3表現之用量之RNAi劑(例如，雙股RNA劑)接觸，藉以抑制細胞中補體成分C3表現。
細胞可於活體外或活體內與iRNA(例如，雙股RNA劑)接觸。由活體內細胞與iRNA之接觸法包括由個體(例如，人類個體)內之細胞或細胞群與iRNA接觸。亦可能組合於活體外及於活體內接觸細胞之方法。如上文曾討論，可能直接或間接接觸細胞。此外，可能利用靶向配體(包括本文說明或相關技藝上已知之任何配體)接觸到細胞。較佳具體例中，靶向配體為碳水化合物部份體，例如，GalNAc3配體、或任何其他可以主導RNAi劑到達所需部位(例如，個體之肝臟)之配體。
本文所採用術語「抑制」可與「降低」、「靜默」、「下調」、「壓制」及其他類似術語交換使用，且包括任何程度之抑制作用。
片語「抑制補體成分C3表現」意指抑制任何補體成分C3基因(如例如，小鼠補體成分C3基因、大鼠補體成分C3基因、猴補體成分C3基因、或人類補體成分C3基因)及補體成分C3基因之變異體或突變體之表現。因此，在遺傳操作細胞、細胞群或生物體中，補體成分C3基因可為野生型補體成分C3基因、突變體補體成分C3基因、或轉殖基因之補體成分C3基因。
「抑制補體成分C3基因表現」包括補體成分C3基因之任何抑制程度，例如，至少部份壓制補體成分C3基因表現。補體成分C3基因表現可依據與補體成分C3基因表現有關之任何變數之程度或程度變化來分析，例如，補體成分C3 mRNA含量或補體成分C3蛋白質含量。此含量可在個別細胞中或在細胞群中(包括例如，源自個體之樣本)中分析。咸了解，補體成分C3主要表現在肝臟，但亦會表現在腦、膽囊、心臟、與腎臟，及存在於循環中。
可由與補體成分C3表現相關之一或多種變數與對照組含量比較其絕對或相對下降程度，來分析抑制性。對照組含量可能為相關技藝上採用之任何型態之對照組含量，例如，投藥前之基線值或由未處理或接受對照物處理(如例如，僅含緩衝劑之對照物或含無活性劑之對照物)之類似個體、細胞或樣本所測得之含量。
有些本發明方法之具體例中，補體成分C3基因表現係受到抑制至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%、或達分析法之檢測程度以下。較佳具體例中，補體成分C3基因之表現係受到抑制至少70%。進一步了解，希望可在例如，肝臟之某些組織中抑制補體成分C3表現，但不會在例如，腦部之其他組織中顯著抑制其表現。較佳具體例中，採用實例2提供之分析法，使用10nM siRNA濃度，在適當匹配物種之細胞株中測定表現程度。
某些具體例中，活體內之表現抑制性係在表現人類基因之囓齒類(例如，表現人類標靶基因(亦即補體成分C3)之感染AAV之小鼠)內，測定擊弱之人類基因，例如，當投與單劑，例如，3mg/kg時，RNA表現最低。亦可在模式動物系統中測定擊弱之內因性基因表現，例如，投與單劑例如，3mg/kg 後，RNA表現最低。此等系統適用於人類基因核酸序列與模式動物基因充分接近時，以致人類iRNA得以提供有效擊弱模式動物基因。採用實例2所提供PCR方法來測定肝臟中之RNA表現。
對補體成分C3基因表現之抑制性可由其中補體成分C3基因已轉錄且已接受處理(例如，由細胞或細胞群與本發明iRNA接觸，或對含有該細胞或細胞群之個體投與本發明iRNA)之第一細胞或細胞群(此等細胞可能存在於例如，源自個體之樣本)之mRNA表現量下降來表示，因此當與實質上與該第一細胞或細胞群相同，但未曾接受處理(未經過iRNA或未經過靶向所需基因之iRNA處理之對照組細胞(群))之第二細胞或細胞群比較時，補體成分C3基因表現已受到抑制。較佳具體例中，採用實例2提供之方法，於物種匹配之細胞株中，使用10nM siRNA濃度分析抑制性，並採用下列公式，由處理組細胞中之mRNA表現量相對於對照組細胞中mRNA量級之百分比表示：
(對照組細胞之mRNA)-(處理組細胞之mRNA) x100%
(對照組細胞之mRNA)
其他具體例中，對補體成分C3基因表現之抑制性可藉由功能上與補體成分C3基因表現相關之參數之下降程度來分析，例如，來自個體之血液或血清中補體成分C3蛋白質量級。可於任何表現補體成分C3之細胞中(不論內因性或來自表現構築體之異源性)，採用相關技藝上已知任何分析法測定補體成分C3基因靜默。
對補體成分C3蛋白質表現之抑制性可由細胞或細胞群所表現之補體成分C3蛋白質含量或個體樣本中之補體成分C3蛋白質含量(例如，源自個體之血液樣本中之蛋白質量級)之下降程度來分析。如上文mRNA抑制性 分析法之說明，處理組細胞或細胞群之蛋白質表現量級之抑制性同樣可由相對於對照組細胞或細胞群之蛋白質量級之百分比表示，或由個體樣本，例如，來自個體之血液或血清中之蛋白質量級變化來表示。
可用於分析補體成分C3基因表現之抑制性之對照組細胞、細胞群或個體樣本包括未曾與本發明RNAi劑接觸之細胞、細胞群或個體樣本。例如，對照組細胞、細胞群、或個體樣本可能源於接受RNAi劑治療前之個體(例如，人類或動物個體)或適當之匹配對照族群。
細胞或細胞群之補體成分C3 mRNA表現程度可採用相關技藝上已知用於分析mRNA表現之任何方法測定。一項具體例中，測定樣本中之補體成分C3表現程度時，係檢測轉錄之多核苷酸或其一部份，例如，補體成分C3基因之mRNA。可能採用RNA萃取技術，包括例如，使用酸苯酚/胍異硫氰酸酯萃取法(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA製備套組(Qiagen®)或PAXgeneTM(PreAnalytixTM，瑞士)，從細胞中萃取RNA。利用核糖核酸雜交法之典型分析法包括核連綴分析法、RT-PCR、RNase保護分析法、北方墨點法、原位雜交法、與微陣列分析法。
有些具體例中，使用核酸探針測定補體成分C3表現程度。本文所採用術語「探針」係指可以選擇性結合特異性補體成分C3之任何分子。探針可由習此相關技藝者合成，或衍生自適當之生物製劑。探針可能特別設計帶有標記物。可用為探針之分子實例包括(但不限於)：RNA、DNA、蛋白質、抗體、與有機分子。
單離之mRNA可用於雜交或擴增分析法，其包括(但不限於)：南方或北方分析法、聚合酶鏈反應(PCR)分析法、與探針陣列法。其中一種測 定mRNA含量之方法涉及由單離之mRNA與可與補體成分C3 mRNA雜交之核酸分子(探針)接觸。一項具體例中，mRNA係固定在固態表面，並與探針接觸，例如，讓單離之mRNA流經瓊脂凝膠，讓mRNA從凝膠轉移至膜(如硝基纖維素)。另一項具體例中，由探針(群)固定在固態表面，讓mRNA與探針(群)接觸，例如，使用Affymetrix®基因晶片陣列。習此相關技藝者很容易擷用已知之mRNA檢測法來測定補體成分C3 mRNA含量。
另一種測定樣本中補體成分C3表現程度之方法涉及例如，樣本中mRNA之核酸擴增過程或逆轉錄酶(製備cDNA)，例如，RT-PCR(述於Mullis之1987年美國專利案案號4,683,202之實驗具體例)、連接酶鏈反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自主序列複製(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環式複製(Lizardi等人，美國專利案案號5,854,033)或任何其他核酸擴增方法，然後採用習此相關技藝者習知之方法檢測擴增之分子。若核酸分子含量極低時，此等檢測程序特別適用於檢測此等核酸分子。本發明特別態樣中，由定量式產螢光式RT-PCR(亦即TaqManTM系統)測定C3表現程度。較佳具體例中，採用實例2提供之分析法，使用例如，10nM siRNA濃度，在匹配物種之細胞株中測定表現程度。
可使用膜墨點(如用於雜交分析法，如北方、南方、斑點等等)，或微孔、樣本試管、凝膠、珠粒或纖維(或任何包含已結合核酸之固態擔體)追蹤補體成分C3 mRNA之表現程度。參見美國專利案案號5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195與5,445,934，其等揭示內容已以引用之方式 併入本文中。亦包括於溶液中使用核酸探針測定補體成分C3表現程度。
較佳具體例中，採用分支之DNA(bDNA)分析法或實時PCR(qPCR)分析mRNA表現量級。此等方法之用法舉例說明於本文所出示之實例中。較佳具體例中，採用實例2提供之分析法，使用10nM siRNA濃度，在匹配物種之細胞株中測定表現程度。
可採用相關技藝上已知用於測定蛋白質量級之任何方法測定C3蛋白質表現量級。此等方法包括例如，電泳法、毛細管電泳法、高效液相層析法(HPLC)、薄層層析法(TLC)、高擴散性層析法、液相或凝膠沉澱反應、吸光光譜分析計、比色分析法、光譜光度分析法、流式細胞計、免疫擴散法(單向或雙向)、免疫電泳、西方墨點、放射免疫分析法(RIA)、酵素-聯結免疫吸附分析法(ELISA)、免疫螢光分析法、電化學發光分析法等等。
有些具體例中，由(例如，肝臟活體組織中)C3 mRNA或蛋白質量級之下降來分析本發明方法之效力。
有些本發明方法之具體例中，對個體投與iRNA，使iRNA傳遞至個體內之特定部位。可在衍生自該個體內特定部位(例如，肝臟或血液)之流體或組織之樣本中測定補體成分C3 mRNA或補體成分C3蛋白質量級或量級變化，來分析補體成分C3表現之抑制性。
本文所採用術語「檢測」或「測定」分析物量級，咸了解係指執行測定是否含有例如，蛋白質、RNA等材料之步驟。本文所採用之檢測或測定方法包括檢測或測定低於所採用方法之檢測程度之分析物量級。
VII.本發明預防與治療方法
本發明亦提供一種使用本發明iRNA或包含本發明iRNA之組成物來抑制補體成分C3表現之方法，藉以預防或治療補體成分C3-相關疾患，例如，冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
本發明方法中，可由細胞於活體外或活體內與siRNA接觸，亦即細胞可在個體內。
適合使用本發明方法處理之細胞可為任何表現補體成分C3基因之細胞，例如，肝臟細胞、腦細胞、膽囊細胞、心臟細胞、或腎臟細胞，但較佳為肝臟細胞。適合使用本發明方法處理之細胞可為哺乳動物細胞，例如，靈長類細胞(如人類細胞，包括嵌合性非人類動物中之人類細胞，或非人類靈長類細胞，例如，猴細胞、或黑猩猩細胞)、或非靈長類細胞。某些具體例中，細胞為人類細胞，例如，人類肝臟細胞。本發明方法中，細胞中之補體成分C3表現係受到抑制至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、或95、或達分析法之檢測量級以下。
本發明之活體內方法可包括對個體投與包含iRNA之組成物，其中該iRNA所包括之核苷酸序列可與接受投與RNAi劑之哺乳動物之補體成分C3基因之RNA轉錄本之至少一部份互補。組成物可採用相關技藝上已知之任何方式投藥，包括(但不限於)：經口、經腹膜內、或非經腸式途徑，包括經顱內(例如，腦室內、實質內與鞘內)、經靜脈內、經肌內、皮下、穿皮式、呼吸道(氣霧劑)、經鼻、直腸與局部(包括頰與舌下)投藥。某些具體例中，組成物係經靜脈內輸注或注射投藥。某些具體例中，組成物係經皮下注射投藥。某些 具體例中，組成物係經肌內注射投藥。
一項態樣中，本發明亦提供一種抑制哺乳動物(例如，人類)之補體成分C3基因表現之方法。該方法包括對哺乳動物投與包含靶向哺乳動物細胞中之補體成分C3基因之dsRNA之組成物，並維持該哺乳動物一段足以達到降解補體成分C3基因之mRNA轉錄本之時間，藉以抑制細胞中之補體成分C3基因表現。可採用相關技藝上已知之任何方法及採用本文說明之方法，例如，實例2中之例如，qRT-PCR，來分析基因表現之降低。可採用相關技藝上已知之任何方法，例如，ELISA，分析蛋白質產物之降低。某些具體例中，可採用肝穿刺活體組織檢測樣本作為組織材料，來追蹤補體成分C3基因或蛋白質表現之降低。其他具體例中，以血液樣本作為個體樣本，來追蹤補體成分C3蛋白質表現之降低。
本發明進一步提供一種為有需要之個體治療之方法，例如，經診斷患有補體成分C3-相關疾患之個體，如冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、或C3腎小球病變。
本發明進一步提供一種為有需要之個體預防之方法。本發明治療方法包括以本發明iRNA投與個體，例如，可因降低補體成分C3表現而受益之個體，其係投與預防有效量之靶向補體成分C3基因之iRNA或包含靶向補體成分C3基因之iRNA之醫藥組成物。
一項具體例中，補體成分C3-相關疾病係選自下列各者所成群組：冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿 症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、與C3腎小球病變。
一項具體例中，補體成分C3-相關疾病為冷凝集素症(CAD)。CAD為一種自體免疫補體成分C3-誘發之溶血性貧血，其中曝露到低溫會在身體的冷的部份引發與紅血球細胞(RBC)凝集相關之臨床症狀(例如，網狀青斑或手足發紺)及溶血性貧血。冷凝集素為IgM抗體，其在低於正常核心體溫的溫度下會辨識紅血球細胞(RBC)上之抗原。其等會導致RBC凝集、補體活化、及血管外溶血，造成貧血，通常不會出現血紅素尿症。CAD可為原發性CAD(亦稱為特發性CAD)或繼發性CAD。在患有原發性CAD之個體中，在沒有原發疾病下，冷凝集素導致RBC凝集及血管外溶血。患有繼發性CAD(亦稱為冷凝集素症候群，或CAS)之個體中，冷凝集素隨著原有疾患(如病毒感染、自體免疫性疾患、或淋巴惡性疾病)上升(參見例如，Berentsen(2015)Transfus Med Hemother 42：303-310)。
一項具體例中，補體成分C3-相關疾病為溫型自體免疫性溶血性貧血。溫型自體免疫性溶血性貧血為一種自體免疫性補體成分C3-誘發之溶血性貧血，其中紅血球(RBC)凝集在身體溫度等於或高於正常體溫之身體部份中，並因IgG抗體導向對抗血型抗原，激活補體系統，造成溶血性貧血。溫型自體免疫性溶血性貧血為最常見之自體免疫性溶血性貧血型態，佔所有成人病例~70%至80%，及佔小兒病例~50%。約一半溫型自體免疫性溶血性貧血病例無法找到特定的主要病因，而其餘則視為淋巴增生性症候群之繼發症；惡性疾病包括慢性淋巴母细胞性白血病(CLL)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、及實體腫瘤；風濕性疾病，尤指全身性紅斑狼瘡；感染(主要指病 毒性)；藥物；經常使用頭孢菌素與哌拉西林(piperacillin)；或過去曾輸血或移植(參見例如，Berentsen(2015)Transfus Med Hemother 42：303-310)。
一項具體例中，補體成分C3-相關疾病為陣發性夜間血紅素尿症(PNH)。PNH可為典型PNH或出現在另一種骨髓衰竭症候群及/或骨髓增生不良症候群(MDS)(例如，血球減少)中之PNH。PNH為後天自體免疫性疾患，其造成血液細胞早熟死亡及損害其製造，其特徵在於補體介導之溶血性貧血、易形成血栓、及骨髓衰竭(參見例如，Risitano(2013)Adv Exp Med Biol 735：155)。
一項具體例中，補體成分C3-相關疾病為狼瘡腎炎(LN)，亦即I型-VI型中任一種狼瘡腎炎)。LN為一種由全身性紅斑狼瘡(SLE)引起之腎小球腎炎。狼瘡腎炎之發生歸因於免疫複合物沉積在任何或所有腎腔室中，包括腎小球、腎小管、與間質。IgG為最常見之抗體，但亦可發現IgM與IgA。此等自體抗體造成典型及旁路兩種補體途徑活化，因此可在活體組織檢測中看到C1、C3與備解素(properdin)。
一項具體例中，補體成分C3-相關疾病為大水泡性類天疱瘡。大水泡性類天疱瘡為一種自體免疫性起疱性疾病，係由自體抗體對抗XVII型膠原蛋白(COL17)所誘發，其激活補體，接著在皮膚/表皮接合處募集發炎細胞。大水泡性類天疱瘡為最常見之自體免疫性起疱性疾患，其特徵在於繃緊的水疱，伴隨發癢的蕁麻疹紅斑與斑塊，遍佈全身。
一項具體例中，補體成分C3-相關疾病為天疱瘡，例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)。天疱瘡為一群罕見的慢性起疱性疾病，其特徵在於IgG-自體抗體主導對抗多種不同胞橋小體跨膜醣蛋白及沉積在細胞間 之IgG與C3c。罹患尋常型天疱瘡之患者通常出現口腔黏膜病灶，隨後涉及到皮膚，且自體抗體係導向對抗上皮黏附蛋白質橋粒芯醣蛋白(desmoglein)3及/或橋粒芯醣蛋白1。在落葉性天疱瘡中，病灶位在皮膚，未涉及黏膜，且自體抗體導向對抗橋粒芯醣蛋白1。一項具體例中，天疱瘡為尋常型天疱瘡(PV)。另一項具體例中，天疱瘡為落葉性天疱瘡(PF)。
一項具體例中，補體成分C3-相關疾病為C3腎小球病變。C3腎小球病變之特徵在於激活旁路補體級聯反應及補體成分C3沉積，但腎臟的腎小球沒有任何免疫球蛋白沉積。
本發明iRNA可呈「游離iRNA」投藥。游離iRNA係在沒有醫藥組成物之存在下投藥。裸iRNA可含於合適緩衝溶液中。緩衝溶液可能包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任何組合。一項具體例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)。可以調整包含iRNA之緩衝溶液之pH與滲透壓，以便適合投與個體。
或者，本發明iRNA可呈醫藥組成物投藥，如dsRNA脂質體調配物。
可能因抑制補體成分C3基因表現而受益之個體為彼等容易罹患或經診斷罹患補體成分C3-相關疾患之個體，如冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、與C3腎小球病變。
一項具體例中，該方法包括投與本文說明特徵之組成物，以使標靶補體成分C3基因表現下降，如約1、2、3、4、5、6、1-6、1-3、或3-6個 月一劑。某些具體例中，組成物係每3-6個月投與一次。
較佳係由適用於本文所說明特徵之方法與組成物之iRNA特異性靶向標靶補體成分C3基因之RNA(原生或已加工)。使用iRNA抑制此等基因表現之組成物及方法可依本文之說明製備及執行。
根據本發明方法投與iRNA之結果可以預防或治療補體成分C3-相關疾患，例如，冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如，尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
可向個體投與醫療量之iRNA，如約0.01mg/kg至約200mg/kg。
iRNA較佳係經皮下投藥，亦即皮下注射。可採用一或多次注射來傳遞所需劑量之iRNA給個體。可以在一段時間內重複注射。
可依規律方式重複投藥。某些具體例中，在初始治療療程後，可依減少頻率之方式投藥治療。重複劑量之療程可包括依規律方式投與醫療量之iRNA，如每個月一次至一年一次。某些具體例中，iRNA係約每個月投藥一次至約每三個月一次、或約每三個月一次至約每六個月一次。
本發明進一步提供一種以iRNA劑或其醫藥組成物於治療可因降低及/或抑制C3基因表現而受益之個體，例如，患有C3-相關疾病之個體之方法與用途，其與其他藥劑及/或其他醫療法組合，例如，組合已知藥劑及/或已知醫療法，如例如，彼等目前用於治療此等疾患者。
因此，有些本發明態樣中，包括單一本發明iRNA劑之方法中，進一步包括對個體投與一或多種額外醫療劑。
iRNA劑與額外醫療劑及/或治療法可以同時投藥及/或呈相同組合投藥，例如，非經腸式，或該額外醫療劑可作為分開之組成物之一部份投藥或分開時間投藥及/或採用相關技藝習知或本文說明之另一種方法投藥。
例如，適合治療可因降低C3表現而受益之個體，例如，患有補體成分C3-相關疾病之個體之額外醫療劑與醫療方法包括血漿分離術、溶血栓療法(例如，鏈激酶)、抗血小板劑、葉酸、皮質類固醇；免疫壓制劑；***、甲胺蝶呤(methotrexate)、6-MP、硫唑嘌呤(azathioprine)、磺銨匹林(sulphasalazine)、美沙拉嗪(mesalazine)、奥沙拉嗪(olsalazine)、氯奎寧(chloroquinine)/羥氯奎(hydroxychloroquine)、青黴胺(pencillamine)、硫代蘋果酸鹽(aurothiomalate)(經肌內與經口)、硫唑嘌呤(azathioprine)、秋水仙素(cochicine)、皮質類固醇(經口、吸入與局部注射)、β-2腎上腺素受體促效劑(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeteral))、黃嘌呤類(茶鹼、胺茶鹼)、色甘酸鹽(cromoglycate)、奈多羅米(nedocromil)、酮替芬(ketotifen)、異丙溴銨(ipratropium)與氧托溴銨(oxitropium)、環孢素、FK506、雷帕黴素(rapamycin)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)、來氟米特(leflunomide)、NSAID(例如，布洛芬(ibuprofen))、皮質類固醇(如潑尼松龍(prednisolone))、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷(adensosine)促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素致效劑、干擾促炎細胞激素(如TNF-α或IL-1)訊號傳導之製劑(例如，IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1β轉化酵素抑制劑、TNFα轉化酵素(TACE)抑制劑、T-細胞訊號傳導抑制劑(如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、6-氫硫基嘌呤、血管收縮素轉化酵素抑制劑、可溶性細胞激素受體與其衍生物(例如， 可溶性p55或p75 TNF受體與衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM與p55TNFRIgG(Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、與sIL-6R)、消炎性細胞激素(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13與TGF)、塞來昔布(celecoxib)、葉酸、硫酸羥氯喹(hydroxychloroquine sulfate)、羅非昔布(rofecoxib)、依那昔普(etanercept)、尹菲單株抗體(infliximonoclonal antibody)、納普生(naproxen)、伐地昔布(valdecoxib)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、甲基潑尼松龍(methyl prednisolone)、美洛昔康(meloxicam)、甲基潑尼松龍乙酸鹽、硫代蘋果酸金鈉(gold sodium thiomalate)、阿斯匹靈、去炎松縮酮(triamcinolone acetonide)、萘磺酸丙氧芬(propoxyphene napsylate/apap)、葉酸鹽、萘丁美酮(nabumetone)、雙氯芬酸(diclofenac)、羅昔康(piroxicam)、依托度酸(etodolac)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、奥沙普秦(oxaprozin)、鹽酸羥考酮(oxycodone hydrochloride)、重酒石酸二氫可待因酮(hydrocodone bitartrate/apap)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)/米索前列醇(misoprostol)、吩坦尼(fentanyl)、阿那白滯素(anakinra)(人類重組體)、鹽酸曲馬多(tramadol hydrochloride)、雙水楊酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、氰鈷銨素(cyanocobalamin)/葉酸/吡哆醇(pyridoxine)、乙醯胺酚(acetaminophen)、亞卓膦酸鈉(alendronate sodium)、潑尼松龍(prednisolone)、硫酸嗎啡、鹽酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)、吲哚美辛(indomethacin)、硫酸葡糖胺/軟骨素、鹽酸阿米替林(amitriptyline hydrochloride)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、羥考酮鹽酸(oxycodone hydrochloride)/乙醯胺酚、鹽酸奥洛帕定(olopatadine hydrochloride)、米索前列醇(misoprostol)、納普生鈉(naproxen sodium)、奥美拉唑(omeprazole)、環磷醯胺、利特希單株抗體(rituximonoclonal antibody)、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗-IL-18、抗-IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、 AMG-548、VX-740、羅氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801、美索普蘭(mesopram)、環孢素、細胞激素抑制性消炎藥(群)(CSAID)；CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗-TNFα抗體；Celltech/Bayer)；cA2/尹菲單株抗體(infliximonoclonal antibody)(嵌合抗-TNFα抗體；Centocor)；75kdTNFR-IgG/依那昔普(etanercept)(75kD TNF受體-IgG融合蛋白質；Immunex；參見例如，(1994)Arthr.Rheum.37：S295；(1996)J.Invest.Med.44：235A)；55kdTNF-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白質；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE9.1/SB 210396(未刪除靈長類源化抗-CD4抗體；IDEC/SmithKline；參見例如，(1995)Arthr.Rheum.38：S185)；DAB 486-IL-2與/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白質；Seragen；參見例如，(1993)Arthrit.Rheum.36：1223)；抗-Tac(人源化抗-IL-2Rα；Protein Design Labs/Roche)；IL-4(消炎細胞激素；DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重組IL-10，消炎細胞激素；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10與/或IL-4促效劑(例如，促效劑抗體)；IL-1RA(IL-1受體拮抗劑；Synergen/Amgen)；阿那白滯素(anakinra)(Kineret®/Amgen)；TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF結合性蛋白質；參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本))：S284；(1995)Amer.J.Physiol.-Heart and Circ.Physiol.268：37-42)；R973401(磷酸二酯酶第IV型抑制劑；參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S282)；MK-966(COX-2抑制劑；參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S81)；伊洛前列素(Iloprost)(參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S82)；甲胺蝶呤(methotrexate)；沙利竇邁(thalidomide)(參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S282)及沙利竇邁相關藥物(例如，Celgen)；來氟米特(leflunomide)(消炎與細胞激素抑制劑；參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補 充本)：S131；(1996)Inflamm.Res.45：103-107)；傳明酸(胞漿素原活化作用之抑制劑；參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S284)；T-614(細胞激素抑制劑；參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S282)；***素E1(參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S282)；替尼達普(Tenidap)(非類固醇消炎藥；參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S280)；納普生(Naproxen)(非類固醇消炎藥；參見例如，(1996)Neuro.Report 7：1209-1213)；美洛昔康(Meloxicam)(非類固醇消炎藥)；布洛芬(Ibuprofen)(非類固醇消炎藥)；羅昔康(Piroxicam)(非類固醇消炎藥)；雙氯芬酸(Diclofenac)(非類固醇消炎藥)；吲哚美辛(Indomethacin)(非類固醇消炎藥)；柳氮磺吡啶(Sulfasalazine)(參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S281)；硫唑嘌呤(Azathioprine)(參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S281)；ICE抑制劑(酵素間白素-1β轉化酵素之抑制劑)；zap-70與/或lck抑制劑(酪胺酸激酶zap-70或lck之抑制劑)；VEGF抑制劑與/或VEGF-R抑制劑(血管內皮細胞生長因子或血管內皮細胞生長因子受體之抑制劑；血管新生作用抑制劑)；皮質類固醇消炎藥物(例如，SB203580)；TNF-轉化酶抑制劑；抗-IL-12抗體；抗-IL-18抗體；間白素-11(參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S296)；間白素-13(參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S308)；間白素-17抑制劑(參見例如，(1996)Arthr.Rheum.39(9(補充本)：S120)；金；青黴素；氯奎寧(chloroquine)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；羥氯奎(hydroxychloroquine)；環孢素；環磷醯胺；大範圍淋巴組織放射治療；抗-胸腺細胞球蛋白；抗-CD4抗體；CD5-毒素；經口投藥之肽與膠原蛋白；氯苯紮利二鈉(lobenzarit disodium)；細胞激素調節劑(CRA)HP228與HP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.)；ICAM-1反義硫代磷酸寡去氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals,Inc.)；可溶性補體受體1(TP10；T Cell Sciences,Inc.)；潑尼松(prednisone)；奥古蛋白(orgotein)；醣胺聚醣聚硫酸鹽；美諾四環素(minocycline)；抗-IL2R抗體；海洋與植物脂質(魚與植物種子脂肪酸；參見例如，DeLuca等人(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21：759-777)；金諾芬(auranofin)；苯丁吡唑酮(phenylbutazone)；甲氯芬那酸(meclofenamic acid)；氯芬那酸(flufenamic acid)；經靜脈內投藥之免疫球蛋白；齊留通(zileuton)；阿扎立平(azaribine)；黴酚酸(RS-61443)；他克莫司(tacrolimus)(FK-506)；希利莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))；氨普立糖(amiprilose)(鹽酸氨普立糖(therafectin))；克拉屈濱(cladribine)(2-氯去氧腺苷)；甲胺蝶呤(methotrexate)；bcl-2抑制劑(參見Bruncko,M.等人(2007)J.Med.Chem.50(4)：641-662)；抗病毒與免疫調控劑、KDR之小分子抑制劑、Tie-2之小分子抑制劑；甲胺蝶呤(methotrexate)；潑尼松(prednisone)；塞來昔布(celecoxib)；葉酸；硫酸羥氯喹(hydroxychloroquine sulfate)；羅非昔布(rofecoxib)；依那昔普(etanercept)；尹菲(inflixi)單株抗體；來氟米特(leflunomide)；納普生(naproxen)；伐地昔布(valdecoxib)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；甲基潑尼松龍(methyl prednisolone)；布洛芬(ibuprofen)；美洛昔康(meloxicam)；甲基潑尼松龍(methyl prednisolone)乙酸鹽；硫代蘋果酸金鈉(gold sodium thiomalate)；阿斯匹靈；硫唑嘌呤(azathioprine)；去炎松縮酮(triamcinolone acetonide)；萘磺酸丙氧芬(propoxyphene napsylate/apap)；葉酸鹽；萘丁美酮(nabumetone)；雙氯芬酸(diclofenac)；羅昔康(piroxicam)；依託度酸(etodolac)；雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)；奧沙普秦(oxaprozin)；鹽酸羥考酮(oxycodone hcl)；重酒石酸二氫可待因酮(hydrocodone bitartrate/apap)；雙氯 芬酸鈉(diclofenac sodium)/米索前列醇(misoprostol)；吩坦尼(fentanyl)；阿那白滯素(anakinra)，人類重組體；鹽酸曲馬多(tramadol hcl)；雙水楊酯(salsalate)；舒林酸(sulindac)；氰鈷銨素(cyanocobalamin)/fa/吡哆醇(pyridoxine)；乙醯胺酚；亞卓膦酸鈉(alendronate sodium)；潑尼松龍(prednisolone)；硫酸嗎啡；鹽酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)；吲哚美辛(indomethacin)；硫酸葡糖胺/軟骨素；環孢素；鹽酸阿米替林(amitriptyline hydrochloride)；磺胺嘧啶(sulfadiazine)；鹽酸羥考酮(oxycodone hcl)/乙醯胺酚；鹽酸奧洛帕定(olopatadine hcl)；米索前列醇(misoprostol)；納普生鈉(naproxen sodium)；奧美拉唑(omeprazole)；黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)；環磷醯胺；利特希(rituxi)單株抗體；IL-1 TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18 BP；IL-12/23；抗-IL 18；抗-IL 15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；羅氟司特(Roflumilast)；IC-485；CDC-801；美索普蘭(mesopram)、沙丁胺醇(albuterol)、沙美特羅(salmeterol)/氟替卡松(fluticasone)、孟魯司特鈉(montelukast sodium)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、布***(budesonide)、潑尼松(prednisone)、羥萘酸沙美特羅(salmeterol xinafoate)、鹽酸左旋沙丁胺醇(levalbuterol hcl)、硫酸沙丁胺醇(albuterol sulfate)/異丙溴銨(ipratropium)、潑尼松龍(prednisolone)磷酸鈉鹽、去炎松縮酮(triamcinolone acetonide)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、異丙溴銨(ipratropium bromide)、阿奇黴素(azithromycin)、乙酸吡布特羅(pirbuterol acetate)、潑尼松龍(prednisolone)、無水茶鹼、甲基潑尼松龍(methyl prednisolone)琥珀酸鈉鹽、克拉黴素(clarithromycin)、安可來(zafirlukast)、富馬酸福莫特羅(formoterol fumarate)、流感病毒疫苗、甲基潑尼松龍(methyl prednisolone)、阿莫西林三水合物 (amoxicillin trihydrate)、氟尼縮松(flunisolide)、過敏注射劑、色甘酸鈉(cromolyn sodium)、鹽酸非索非那定(fexofenadine hydrochloride)、氟尼縮松(flunisolide)/薄荷醇、阿莫西林(amoxicillin)/棒酸鹽(clavulanate)、左氧氟沙星(levofloxacin)、吸入器輔助裝置、癒瘡甘油醚(guaifenesin)、***(dexamethasone)磷酸鈉、鹽酸莫西沙星(moxifloxacin hcl)、鹽酸多西環素(doxycycline hyclate)、癒瘡甘油醚(guaifenesin)/右旋美沙芬(d-methorphan)、偽麻黃素(p-ephedrine)/cod/氯苯那敏(chlorphenir)、加替沙星(gatifloxacin)、鹽酸西替利嗪(cetirizine hydrochloride)、糠酸莫米松(mometasone furoate)、羥萘酸沙美特羅(salmeterol xinafoate)、苯佐那酯(benzonatate)、頭孢氨苄(cephalexin)、pe/氫可酮(hydrocodone)/氯苯那敏(chlorphenir)、鹽酸西替利嗪(cetirizine hcl)/偽麻黃素(pseudoephed)、苯福林(phenylephrine)/cod/異丙嗪(promethazine)、可待因(codeine)/異丙嗪(promethazine)、頭孢丙烯(cefprozil)、***(dexamethasone)、癒瘡甘油醚(guaifenesin)/偽麻黄素(pseudoephedrine)、氯苯那敏胺(chlorpheniramine)/氫可酮(hydrocodone)、奈多羅米鈉(nedocromil sodium)、硫酸特布他林(terbutaline sulfate)、腎上腺素(epinephrine)、甲基潑尼松龍(methyl prednisolone)、硫酸間羥異丙腎上腺素(metaproterenol sulfate)、阿斯匹靈、硝基甘油、酒石酸美托洛爾(metoprolol tartrate)、依諾肝素鈉(enoxaparin sodium)、肝素鈉、硫酸氫氯吡格雷(clopidogrel bisulfate)、卡維地洛(carvedilol)、阿廷諾(atenolol)、硫酸嗎啡、琥珀酸美托洛爾(metoprolol succinate)、苄丙酮香豆素鈉(warfarin sodium)、利欣諾普(lisinopril)、異山梨醇單硝酸酯(isosorbide mononitrate)、毛地黃(digoxin)、呋塞米(furosemide)、辛伐他汀(simvastatin)、雷米普利(ramipril)、替奈替普酶(tenecteplase)、馬來酸依那普利(enalapril maleate)、托拉塞米(torsemide)、瑞替普酶(retavase)、氯沙坦鉀(losartan potassium)、鹽酸喹那普利(quinapril hcl)/mag carb、布美他尼(bumetanide)、阿替普酶(alteplase)、依那普利拉(enalaprilat)、鹽酸胺碘酮(amiodarone hydrochloride)、鹽酸替羅非班單水合物(tirofiban hcl m-hydrate)、鹽酸迪太贊(diltiazem hydrochloride)、卡托普利(captopril)、厄貝沙坦(irbesartan)、纈沙坦(valsartan)、鹽酸普萘洛爾(propranolol hydrochloride)、福辛普利钠(fosinopril sodium)、鹽酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)、埃替非巴肽(eptifibatide)、頭孢菌素鈉(cefazolin sodium)、硫酸阿托品(atropine sulfate)、胺基己酸、螺內酯(spironolactone)、干擾素、鹽酸索他洛爾(sotalol hydrochloride)、氯化鉀、琥珀酸辛酯磺酸鈉(docusate sodium)、鹽酸多保他命(dobutamine hcl)、阿普唑侖(alprazolam)、普伐他汀鈉(pravastatin sodium)、阿伐他汀鈣(atorvastatin calcium)、鹽酸咪達唑侖(midazolam hydrochloride)、鹽酸呱替啶(meperidine hydrochloride)、二硝酸異山梨酯(isosorbide dinitrate)、腎上腺素(epinephrine)、鹽酸多巴胺、比伐盧定(bivalirudin)、羅蘇伐他汀(rosuvastatin)、依折麥布(ezetimibe)/辛伐他汀(simvastatin)、阿伐麥布(avasimibe)與卡立泊來德(cariporide)。
有些態樣中，該額外醫療劑為靶向C5基因之iRNA劑，如說明於美國專利案案號9,249,415、美國臨時專利申請案案號62/174,933(2015年6月12日申請)、62/263,066(2015年12月4日申請)，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
其他態樣中，該額外醫療劑為抗補體成分C5抗體、或其抗原結合片段(例如，艾庫組單抗(eculizumab))。艾庫組單抗為人源化單株IgG2/4， κ輕鏈抗體，其以高親和性特異性結合補體成分C5並抑制C5裂解成C5a與C5b，藉以抑制產生末端補體複合物C5b-9。艾庫組單抗說明於美國專利案案號6,355,245，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
又其他態樣中，該額外醫療劑為C3肽抑制劑或其類似物。-項具體例中，C3肽抑制劑為坎普他汀(compstatin)。坎普他汀為一種環狀十三肽，具有強力及選擇性C3抑制活性。坎普他汀與其類似物說明於美國專利案案號7,888,323、7,989,589、與8,442,776，美國專利公開案案號2012/0178694與2013/0053302，及PCT公開案案號WO 2012/174055、WO 2012/2178083、WO 2013/036778，其等完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
VIII.套組
本發明亦提供一種執行任何本發明方法之套組。此等套組包括一或多種dsRNA劑及使用說明書，例如指示投與預防或醫療有效量之dsRNA劑。dsRNA劑可在小瓶中或預填充之針筒中。套組可視需要進一步包含投與dsRNA劑之方式(例如，注射裝置，如預填充之針筒)，或用於量測C3之抑制性之方式(例如，用於量測C3 mRNA、C3蛋白質、及/或C3活性之抑制性之方式)。此等量測C3之抑制性之方式可包含從個體取得樣本如，例如，血漿樣本之方式。本發明套組可視需要進一步包含決定醫療有效量或預防有效量之方式。
本發明進一步利用下列不應構成限制之實例說明。本申請案所摘錄之所有參考文獻、專利案、及公開專利申請案之完整內容及非正式序列表與圖示已分別以引用之方式併入本文中。
實例
實例1. iRNA合成法
試劑來源
若本文中未明確說明試劑來源時，則此等試劑可得自任何分子生物學試劑供應商，依分子生物學用途之品質/純度標準。
siRNA設計
靶向人類補體成分C3(C3)基因(人類：NCBI refseqID NM_000064.3；NCBI GeneID：718)之siRNA係採用訂製之R and Python程式語言設計。人類NM_000064.3 REFSEQ mRNA之長度為5148個鹼基。
未修飾之補體成分正義股與反義股核苷酸序列之詳細列表示於表2、4、與6。經修飾補體成分C3正義股與反義股核苷酸序列之詳細列表示於表3、5、與7。
咸了解，本申請書全文中，沒有小數點的雙螺旋名稱等同有小數點的雙螺旋名稱，小數點僅供指名雙螺旋之批號。例如，AD-564727等同AD-564727.1。
siRNA合成法
siRNA係採用相關技藝已知之例行方法合成及黏合。
簡言之，siRNA序列係以1μmol規模，於Mermade 192合成儀(BioAutomation)，使用固態擔體媒介之亞胺基磷酸酯化學合成。固態擔體為已加載訂製GalNAc配體之控制孔玻璃(500A)或通用固態擔體(AM biochemical)。 輔助合成試劑：2’-F與2’-O-甲基RNA與去氧亞胺基磷酸酯係得自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)與Hongene(China)。2’F、2’-O-甲基、GNA(二醇核酸)、5’磷酸酯、及其他修飾係利用對應之亞胺基磷酸酯引入。接合3’GalNAc之單股之合成法係在GalNAc修飾之CPG擔體上進行。採用訂製之CPG通用固態擔體來合成反義單股。所有亞胺基磷酸酯(100mM乙腈溶液)使用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作為活化劑(0.6M乙腈溶液)之偶聯時間為5min。使用50mM之3-((二甲基胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，得自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))之無水乙腈/吡啶(1：1 v/v)溶液產生硫代磷酸酯鏈結。氧化時間為3分鐘。所有合成之序列最終將脫除DMT基團(「脫除DMT」)。
當完成固相合成法時，從固態擔體裂解寡核糖核苷酸，於密封之96深孔盤中，使用200μL甲基胺水溶液試劑，於60℃進行20分鐘以脫除保護基。針對含有受到第三丁基二甲基矽烷基(TBDMS)保護之2’核糖殘基(2’-OH)之序列，則使用TEA.3HF(三乙基胺三氫氟化物)試劑進行第二次脫除保護基步驟。在甲基胺脫除保護基溶液中，添加200uL二甲亞碸(DMSO)與300ul TEA.3HF試劑，溶液再於60℃培養20min。裂解及脫除保護步驟結束時，讓合成盤回到室溫，添加1mL乙腈：乙醇混合物(9：1)造成沉澱。分析盤於-80℃冷卻2小時，藉助於多管式吸管小心傾析出上清液。寡核苷酸集結塊再度懸浮於20mM NaOAc緩衝液中，使用5mL HiTrap分子篩析管柱(GE Healthcare)，於加裝A905自動取樣器及Frac 950溶出液收集器之AKTA Purifier System脫鹽。於96-孔盤收集脫鹽後之樣本。來自各序列之樣本經過LC-MS分析，以確認身份，採用UV(260nm)定量，及所選出之樣本組則利用IEX層析法測定純度。
單股之黏合係於Tecan自動移液分注器(liquid handling robot)上進行。合併等莫耳濃度之正義與反義單股之混合物，於96孔盤中降溫黏合。合併互補單股後，96-孔盤緊密包封，於100℃烘箱中加熱10分鐘，然後歷經2-3小時，慢慢回到室溫。各雙螺旋之濃度於1X PBS中標準化成10μM，然後進行活體外篩選分析法。
實例2. 活體外篩選法
細胞培養與384孔轉染法
讓Hep3B細胞(ATCC,Manassas,VA)於37℃與5% CO2蒙氣下，於補充10% FBS(ATCC)之伊格氏最基礎培養基(Eagle's Minimum Essential Medium)(Gibco)中生長至接近匯合後，使用胰蛋白酶處理，從培養盤釋出細胞。針對小鼠交叉反應性雙螺旋，在轉染前1小時內，新鮮單離初代小鼠肝細胞(PMH)，於初代肝細胞培養基中生長。針對Hep3B與PMH二者，進行轉染時係在96-孔盤中，每孔添加14.8μl Opti-MEM加0.2μl脂染胺(Lipofectamine RNAiMax)(Invitrogen,Carlsbad CA.目錄編號13778-150)至5μl各siRNA雙螺旋中。混合物於室溫下培養15分鐘。然後添加不含抗生素但包含~2 x104個Hep3B細胞或PMH之80μl完全生長培養基至siRNA混合物中。細胞培養24小時後，進行RNA純化。單劑實驗係在10nM與0.1nM最終雙螺旋濃度進行，劑量效應實驗則採用8x 5-倍連續稀釋至10nM至128pM之範圍進行。
使用DYNABEADS mRNA單離套組(Invitrogen TM ，部件編號：610-12)單離總RNA
於每孔包含75μl溶胞/結合緩衝液(含3μL小珠)中溶解細胞，於靜電式振盪器上混合10分鐘。於Biotek EL406，使用磁板座進行自動化洗滌步驟。小珠(於90μL中)於緩衝液A中洗滌一次，於緩衝液B中一次，及於緩衝液E中兩次，其間則進行抽吸步驟。最後一次抽吸後，取全部10μL RT混合物加至各孔中，如下文說明。
使用ABI高容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA，目錄編號4368813)合成cDNA
在每孔中添加每個反應之母混合液：1μl 10X緩衝液、0.4μl 25X dNTP、1μl隨機引子、0.5μl逆轉錄酶、0.5μl RNase抑制劑與6.6μl H2O。分析盤密封，於靜電式振盪器攪拌10分鐘後，於37度C培養2小時。然後，分析盤於80度C攪拌8分鐘。
實時PCR
在384孔盤(Roche，目錄編號04887301001)中，每孔添加2微升(μl)cDNA至包含0.5μl人類GAPDH TaqMan探針(4326317E)、0.5μl人類C3、2μl無核酸酶之水、及5μl Lightcycler 480探針母混合液(Roche，目錄編號04887301001)之母混合液中。於LightCycler480 Real Time PCR system(Roche)之實時PCR系統中進行實時PCR。
計算相對倍數變化時，係採用△△Ct方法分析數據，並使用經過10nM AD-1955轉染之細胞或偽轉染之細胞進行分析法標準化。採用4參數擬合模式，使用XLFit計算IC50並相對於經過AD-1955轉染之細胞或偽轉染之 細胞進行標準化。AD-1955之正義股與反義股序列為：
正義股：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO：13)與
反義股：UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO：14)。
表2與3所列dsRNA劑於Hep3B細胞中之篩選結果示於表8。表2與3所列dsRNA劑於PMH細胞中之篩選結果示於表9。表4與5所列dsRNA劑於Hep3B細胞中之篩選結果示於表10。表4與5所列dsRNA劑於PMH細胞之篩選結果示於表11。表6與7所列dsRNA劑於Hep3B細胞中之篩選結果示於表12。表6與7所列dsRNA劑於PMH細胞中之篩選結果示於表13。
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實例3. 於小鼠中進行活體內篩選dsRNA雙螺旋
於活體內評估上述活體外試驗中已判別且示於表15之所需雙螺旋。特定言之，在投藥前第-14天，對野生型小鼠(C57BL/6)經靜脈內投與2 x 1011個病毒粒子之編碼人類補體成分C3之腺相關病毒8(AAV8)載體進行轉導。特定言之，對小鼠投與編碼一部份人類補體成分C3 mRNA，跨越NM_000064.3之核苷酸93-2893之AAV8，包括鄰近5’UTR之部份(本文稱為AAV8.HsC3_p1)，或編碼一部份人類補體成分C3 mRNA，跨越NM_000064.3之核苷酸2293-4531之AAV8，其包括一部份3’UTR(本文稱為AAV8.HsC3_p2)。
第0天，對一組三隻小鼠經皮下投與單劑2mg/kg劑量之所需製劑或PBS對照物。表14提供處理組，及表15提供所需雙螺旋之正義股與反義股之經修飾核苷酸序列。投藥後第14天，殺死動物，收集肝臟樣本，於液態氮中急速冷凍。抽取組織mRNA，利用RT-QPCR法分析。
由人類C3 mRNA含量與管家基因GAPDH比較。該等數值相對於PBS媒劑對照組之平均值標準化。數據係以基線值百分比表示，並出示平均值加標準偏差。列於表16及示於圖2之結果證實，所測試之雙螺旋劑實例於活體內有效降低人類C3信使RNA量級。
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亦於活體內評估於上述活體外試驗中判別且示於表18之其他所需雙螺旋。特定言之，在投藥前第-14天，對野生型小鼠(C57BL/6)經靜脈內投與2 x 1011個病毒粒子之編碼人類補體成分C3之腺相關病毒8(AAV8)載體，進行轉導。
第0天，對一組三隻小鼠經皮下投與單劑2mg/kg劑量之所需製劑或PBS對照物。表17提供處理組，及表18提供所需雙螺旋之正義股與反義股之經修飾核苷酸序列。投藥後第14天，殺死動物，收集肝臟樣本，於液態氮中急速冷凍。萃取組織mRNA，利用RT-QPCR法分析。
由人類C3 mRNA含量與管家基因GAPDH比較。該等數值相對於PBS媒劑對照組之平均值標準化。數據係以基線值百分比表示，並出示平均值加標準偏差。列於表19及示於圖3之結果證實，所測試之雙螺旋劑實例於活體內有效降低人類C3信使RNA量級。
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實例4. 其他靶向人類C3之雙螺旋
靶向人類補體成分C3(C3)基因(人類：NCBI refseqID NM_000064.3；NCBI GeneID：718)之其他製劑係採用訂製之R and Python程式語言設計，並如上述合成。
未修飾之補體成分C3正義股與反義股核苷酸序列之詳細列表示於表20與22。經修飾補體成分C3正義股與反義股核苷酸序列之詳細列表示於表21與23。
採用游離吸收及轉染法進行其他製劑之單劑篩選。
進行游離吸收實驗時，在96孔盤中，每孔添加2.5μl含siRNA雙 螺旋之PBS。然後添加含有1.5 x 104個初代食蟹獼猴肝細胞(PCH)之完全生長培養基(47.5μl)至siRNA中。細胞培養48小時後，進行RNA純化及RT-qPCR。於500nM、100nM、與10nM最終雙螺旋濃度下進行單劑量實驗。
轉染時，在384孔盤中，每孔添加7.5μl Opti-MEM加0.1μl脂染胺(Lipofectamine RNAiMax)(Invitrogen,Carlsbad CA.，目錄編號13778-150)至各孔中2.5μl各siRNA雙螺旋中。混合物於室溫培養15分鐘。然後添加40μl不含抗生素但包含~1.5 x104個初代食蟹獼猴肝細胞(PCH)之完全生長培養基至siRNA混合物中。細胞培養24小時後，進行RNA純化。於50nM、10nM、1nM、及0.1nM最終雙螺旋濃度進行單劑量實驗。
總RNA單離法係採用DYNABEADS進行。簡言之，於每孔包含10μl溶胞/結合緩衝液(含3μL小珠)中溶解細胞，於靜電式振盪器上混合10分鐘。於Biotek EL406上，使用磁板座進行自動化洗滌步驟。小珠(於3μL中)於緩衝液A中洗滌一次，於緩衝液B中一次，及於緩衝液E中兩次，其間則進行抽吸步驟。最後一次抽吸後，取全部12μL RT混合物加至各孔中，如下文說明。
cDNA合成法中，每孔添加每個反應含1.5μl 10X緩衝液、0.6μl 10X dNTP、1.5μl隨機引子、0.75μl逆轉錄酶、0.75μl RNase抑制劑、與9.9μl H2O之母混合液。分析盤密封，於靜電式振盪器攪拌10分鐘後，於37度C培養2小時。然後，分析盤於80度C攪拌8分鐘。
如上述進行RT-qPCR，並如上述說明計算相對倍數變化。
表20與21之dsRNA劑於PCH中之游離吸收實驗(FU)與轉染實驗(TX)結果示於表24-26。表22與23之dsRNA劑於PCH中之游離吸收實驗(FU)與轉染實驗(TX)結果示於表27-29。
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實例5. 結構-活性相關性分析
依據實例4之活體外分析法，進行結構-活性相關性(SAR)分析。特定言之，設計、合成、及於活體外分析其他雙螺旋。
採用相關技藝已知及上述說明之例行方法合成及黏合siRNA。
未修飾之補體成分C3正義股與反義股核苷酸序列之詳細列表示於表30。經修飾之補體成分C3正義股與反義股核苷酸序列之詳細列表示於表31。
如上述說明，於初代食蟹獼猴肝細胞(PCH)中進行游離吸收實驗及轉染實驗。
單劑游離吸收實驗係在500nM、100nM、10nM、與1nM最終雙螺旋濃度進行。
單劑轉染實驗係在50nM、10nM、1nM、與0.1nM最終雙螺旋濃度進行。
游離吸收實驗結果示於表32，及轉染實驗結果示於表33。
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實例6. 小鼠中dsRNA雙螺旋之活體內篩選
於活體內評估上述活體外試驗中已判別之感興趣的雙螺旋。特定言之，在投藥前第-14天，對野生型小鼠組(C57BL/6)(n=3)經靜脈內投與2 x 1010個病毒粒子之編碼人類補體成分C3之腺相關病毒8(AAV8)載體進行轉導。特定言之，對小鼠投與編碼一部份人類補體成分C3 mRNA，NM_000064.3之淘選核苷酸94-2892之AAV8。
第0天，對一組三隻小鼠經皮下投與單劑10mg/kg劑量之感興趣製劑或PBS對照物。投藥後第14天，犧牲動物，收集肝臟樣本，於液態氮中急速冷凍。抽取組織mRNA，利用RT-QPCR法分析。
人類C3 mRNA量級與管家基因GAPDH比較。該等數值相對於PBS媒劑對照組之平均值標準化。數據係以基線值百分比表示，並出示平均值加標準偏差。示於圖4之結果證實，所測試之例示性雙螺旋劑於活體內有效降低人類C3信使RNA量級。
實例7. 非人類靈長類中感興趣雙螺旋之活體內分析
於活體內評估上述活體外試驗與活體內試驗中已判別之感興趣雙螺旋。特定言之，對雌性食蟹獼猴經皮下投與單劑所需製劑。圖5提供處理組及感興趣雙螺旋。每週收集血清，直到實驗結束，並利用ELISA分析法測定C3蛋白質含量(C3人類ELISA：Hycult HK366)。簡言之，此人類C3 ELISA分析法已先經過驗證其與食蟹獼猴之交叉反應性，並依據套組所提供之說明書，但其中可能呈高靜默之樣本改稀釋成1：50,000或1：20,000，以保持OD在標準曲線內。ELISA分析法係在中期時間點進行，任何再現2次之數據均取平均值，以μg/ml表示，然後再相對於投藥前平均值標準化。
圖6所示之結果證實，所測試之雙螺旋劑實例於活體內強力且持續地降低食蟹獼猴C3蛋白質含量。
亦於活體內評估上述活體外試驗與活體內試驗中已判別之其他所需雙螺旋。特定言之，對9組雌性食蟹獼猴經皮下投與單劑所需製劑(第1-5組及7-10組)，及一組雌性食蟹獼猴於第1天及第55天經皮下投與兩劑所需雙螺旋。圖7提供處理組及所需雙螺旋。每週收集血清，直到實驗結束，並利用ELISA分析法測定C3蛋白質含量(C3人類ELISA：Hycult HK366)。簡言之，此人類C3 ELISA分析法已先經過驗證其與食蟹獼猴之交叉反應性，並依據套組所提供之說明書，但其中可能呈高靜默之樣本改稀釋成1：50,000或1：15,000，以保持OD在標準曲線內。ELISA分析法係在中期時間點進行，任何再現2次之數據均取平均值，以μg/ml表示，然後再相對於投藥前平均值標準化。
圖8所示之結果證實，所測試之雙螺旋劑實例於活體內強力且 持續地降低食蟹獼猴C3蛋白質含量。
另一項試驗中，於活體內評估上述活體外試驗與活體內試驗中已判別之其他所需雙螺旋。特定言之，由三組雌性食蟹獼猴經皮下投與單劑3mg/kg劑量之AD-1181519、AD-569268、或AD-570714(第1、4、與7組)，三組雌性食蟹獼猴經皮下投與單劑9mg/kg劑量之AD-1181519、AD-569268、或AD-570714(第2、5、與8組)，一組雌性食蟹獼猴經皮下投與單劑25mg/kg劑量之AD-570714(第10組)，及三組雌性食蟹獼猴於第1、29、及57天，經皮下投與三劑3mg/kg劑量之AD-1181519、AD-569268、或AD-570714(第3、6、與9組；3 x 3mg/kg)(參見圖8)。每週收集血清，直到實驗結束，並利用ELISA分析法測定C3蛋白質含量(C3人類ELISA：Hycult HK366)並分析溶血活性，以測定旁路途徑之功能活性，例如，旁路溶血分析法Wieslsab補體旁路途徑(CAP)分析法。C3 ELISA分析法中，該分析法已先經過驗證其與食蟹獼猴之交叉反應性，並依據套組所提供之說明書，但樣本改稀釋成1：39,067。ELISA分析法係在中期時間點進行，任何再現2次之數據均取平均值，以μg/ml表示，然後再相對於投藥前平均值標準化。此外，肝活體組織檢測係於在第-21天及第29天接受投與25mg/kg之AD-570714之3隻動物上進行(參見圖9)。
圖10所示之結果證實所測試之雙螺旋劑實例於活體內強力且持續地降低食蟹獼猴C3蛋白質含量。
等效物
習此相關技藝者咸了解或僅藉由例行實驗即可確認本文所說明 明確具體例與方法之許多等效物。此等等效物均計畫涵括在下列申請專利範圍內。

Claims (74)

  1. 一種抑制細胞中補體成分C3表現之雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中該dsRNA劑包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：1之差異不超過3個核苷酸，及該反義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：5之差異不超過3個核苷酸。
  2. 一種抑制細胞中補體成分C3表現之雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該反義股包含與編碼補體成分C3之mRNA之互補區，及其中互補區包含至少15個連續核苷酸，其與表2-7、15、18、20-23、30、與31中任一個表中任一個反義核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸。
  3. 一種抑制細胞中補體成分C3表現之雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：1中核苷酸475-497、487-509、490-512、491-513、705-727、809-831、813-835、1147-1169、1437-1459、1439-1461、1447-1469、2596-2618、2634-2656、3012-3034、3334-3356、3611-3633、3614-3636、3622-3655、3809-3831、3846-3868、3847-3869、3920-3942、4047-4069、4061-4083、4156-4178、4157-4177、4162-4184、4178-4200、4226-4248、4369-4391、4392-4414、4521-4543、4522-4544、4523-4545、5012-5034之任一個核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，及該反義股包含來自對應核苷酸序列SEQ ID NO：5之至少19個連續核苷酸。
  4. 如請求項3所述之dsRNA劑，其中該正義股包含至少15個 連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：1中核苷酸705-727、809-831、或2634-2656之任一個核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，及該反義股包含來自對應核苷酸序列SEQ ID NO：5之至少19個連續核苷酸。
  5. 如請求項4所述之dsRNA劑，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：1中核苷酸2634-2656之核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，及該反義股包含來自對應核苷酸序列SEQ ID NO：5之至少19個連續核苷酸。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含至少15個連續核苷酸，其與選自下列各者所成群組之雙螺旋之任一個反義股核苷酸序列之差異為三個或不超過三個核苷酸：AD-565541.2、AD-564742、AD-567304、AD-568978、AD-569164、AD-569272.2、AD-569765.2、AD-564730.2、AD-567315、AD-564745.2、AD-571715.2、AD-570714、AD-571826、AD-572041.2、AD-572039.2、AD-572387、AD-568586.2、AD-566837.2、AD-566444.2、AD-567700.2、AD-567814.2、AD-568003.2、AD-569164.2、AD-569763.2、AD-565281.2、AD-571539.2、AD-572389.2、AD-567315.2、AD-571752.2、AD-568026.2、AD-571298、AD-572110.2、AD-572062.2、AD-572388.2、AD-572040.2、AD-567713.2、AD-567521.2、AD-567066.2、AD-1181519、AD-569268、或AD-570714。
  7. 如請求項6所述之dsRNA劑，其中該反義股包含至少15個連續核苷酸，其與選自AD-1181519、AD-569268、或AD-570714所成群組之雙螺旋之任一反義股核苷酸序列之差異為三個或不超過三個核苷酸。
  8. 如請求項7所述之dsRNA劑，其中該反義股包含至少15個 連續核苷酸，其與選自AD-570714所成群組之雙螺旋之反義股核苷酸序列之差異為三個或不超過三個核苷酸。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含至少一個經修飾核苷酸。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股之實質上所有核苷酸；該反義股之實質上所有核苷酸包含修飾；或該正義股之實質上所有核苷酸與反義股之實質上所有核苷酸包含修飾。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股之所有核苷酸包含修飾；該反義股之所有核苷酸包含修飾；或該正義股之所有核苷酸與該反義股之所有核苷酸包含修飾。
  12. 如請求項9至11中任一項所述之dsRNA劑，其中至少一個經修飾核苷酸係選自下列各者所成群組：去氧-核苷酸、3’-末端去氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾核苷酸、2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、非鎖核苷酸、構形受限之核苷酸、限制乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾核苷酸、2’-O-烯丙基-修飾核苷酸、2’-C-烷基-修飾核苷酸、2’-羥基-修飾核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾核苷酸、2’-O-烷基-修飾核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫哌喃修飾核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾核苷酸、環己烯基修飾核苷酸、包含硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5’-磷酸酯之核苷酸、包含5’-磷酸酯擬似物之核苷酸、熱失穩化核苷酸、二醇修飾核苷酸(GNA)、及2-O-(N-甲基乙醯胺)修飾核苷酸；及其組合。
  13. 如請求項9至11中任一項所述之dsRNA劑，其中該核苷酸 之修飾係選自下列各者所成群組：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2’-羥基、與二醇；及其組合。
  14. 如請求項9至11中任一項所述之dsRNA，其中至少一個經修飾核苷酸係選自下列各者所成群組：去氧-核苷酸、2'-O-甲基修飾核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾核苷酸、二醇修飾核苷酸(GNA)、與乙烯基-膦酸酯核苷酸；及其組合。
  15. 如請求項9至11中任一項所述之dsRNA，其中該核苷酸至少一個修飾為熱失穩化核苷酸修飾。
  16. 如請求項15所述之dsRNA，其中該熱失穩化核苷酸修飾係選自下列各者所成群組：無鹼基修飾；與雙螺旋中相反核苷酸之錯配；及失穩化糖修飾、2’-去氧修飾、無環核苷酸、非鎖核酸(UNA)、與甘油核酸(GNA)。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之dsRNA劑，其中該雙股區為19-30對核苷酸之長度。
  18. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中該雙股區為19-25對核苷酸之長度。
  19. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中該雙股區為19-23對核苷酸之長度。
  20. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中該雙股區為23-27對核苷酸之長度。
  21. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中該雙股區為21-23對核苷酸之長度。
  22. 如請求項1至21中任一項所述之dsRNA劑，其中各股係獨立為不超過30個核苷酸之長度。
  23. 如請求項1至22中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股為21個核苷酸之長度，及該反義股為23個核苷酸之長度。
  24. 如請求項1至23中任一項所述之dsRNA劑，其中該互補區為至少17個核苷酸之長度。
  25. 如請求項1至23中任一項所述之dsRNA劑，其中該互補區為19至23個核苷酸之間之長度。
  26. 如請求項1至23中任一項所述之dsRNA劑，其中該互補區為19個核苷酸之長度。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之dsRNA劑，其中至少一股包含具有至少1個核苷酸之3’突出。
  28. 如請求項1至26中任一項所述之dsRNA劑，其中至少一股包含具有至少2個核苷酸之3’突出。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之dsRNA劑，其進一步包含配體。
  30. 如請求項29所述之dsRNA劑，其中該配體係接合至dsRNA劑正義股之3’端。
  31. 如請求項29或30所述之dsRNA劑，其中該配體為N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
  32. 如請求項29至31中任一項所述之dsRNA劑，其中該配體為經由單價、二價、或三價之分支連接基附接之一或多個GalNAc衍生物。
  33. 如請求項31或32所述之dsRNA劑，其中該配體為
    Figure 109136475-A0202-13-0006-338
  34. 如請求項33所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑係接合至如下方案之配體：
    Figure 109136475-A0202-13-0006-339
    及其中X為O或S。
  35. 如請求項34所述之dsRNA劑，其中X為O。
  36. 如請求項1至35中任一項所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結。
  37. 如請求項36所述之dsRNA劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結係在一股之3’-末端。
  38. 如請求項37所述之dsRNA劑，其中該股為反義股。
  39. 如請求項37所述之dsRNA劑，其中該股為正義股。
  40. 如請求項36所述之dsRNA劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結係在一股之5’-末端。
  41. 如請求項40所述之dsRNA劑，其中該股為反義股。
  42. 如請求項40所述之dsRNA劑，其中該股為正義股。
  43. 如請求項36所述之dsRNA劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結位在一股之5’-與3’-兩個末端。
  44. 如請求項43所述之dsRNA劑，其中該股為反義股。
  45. 如請求項1至44中任一項所述之dsRNA劑，其中在該雙螺旋反義股5'-端1位置之鹼基對為AU鹼基對。
  46. 一種細胞，其包含如請求項1至45中任一項所述之dsRNA劑。
  47. 一種抑制編碼補體成分C3之基因表現之醫藥組成物，其包含如請求項1至45中任一項之所述dsRNA劑。
  48. 如請求項47所述之醫藥組成物，其中該dsRNA劑係含在未緩衝溶液中。
  49. 如請求項48所述之醫藥組成物，其中該未緩衝溶液為生理鹽水或水。
  50. 如請求項47所述之醫藥組成物，其中該dsRNA劑係含在緩衝溶液中。
  51. 如請求項50所述之醫藥組成物，其中該緩衝溶液包含乙酸 鹽、檸檬蘇鹽、醇溶穀蛋白(prolamine)、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任何組合。
  52. 如請求項51所述之醫藥組成物，其中該緩衝溶液為磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)。
  53. 一種抑制細胞中補體成分C3基因表現之方法，該方法包括由細胞與如請求項1至45中任一項所述之dsRNA劑、或如請求項47至52中任一項所述之醫藥組成物接觸，藉以抑制細胞中之補體成分C3基因表現。
  54. 如請求項53所述之方法，其中該細胞在個體內。
  55. 如請求項54所述之方法，其中該個體為人類。
  56. 如請求項55所述之方法，其中該個體患有補體成分C3-相關疾患。
  57. 如請求項56所述之方法，其中該補體成分C3-相關疾患係選自下列各者所成群組：冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡例如尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
  58. 如請求項53至57中任一項所述之方法，其中由細胞與dsRNA劑接觸可以抑制補體成分C3表現至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%。
  59. 如請求項54至58中任一項所述之方法，其中抑制補體成分C3表現使得個體血清中之補體成分C3蛋白質量級降低至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%。
  60. 一種治療患有可因降低補體成分C3表現而受益之疾患之個體之方法，其包括對該個體投與醫療有效量之如請求項1至45中任一項所述之 dsRNA劑、或如請求項47至52中任一項所述之醫藥組成物，藉以治療該患有可因降低補體成分C3表現而受益之疾患之個體。
  61. 一種為患有可因降低補體成分C3表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀之方法，其包括對該個體投與預防有效量之如請求項1至45中任一項所述之dsRNA劑、或如請求項47至52中任一項所述之醫藥組成物，藉以為患有可因降低補體成分C3表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀。
  62. 如請求項60或61所述之方法，其中該疾患為補體成分C3-相關疾患。
  63. 如請求項62所述之方法，其中該補體成分C3-相關疾患係選自下列各者所成群組：冷凝集素症(CAD)、溫型自體免疫性溶血性貧血、與陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、狼瘡腎炎(LN)、大水泡性類天疱瘡、天疱瘡、尋常型天疱瘡(PV)與落葉性天疱瘡(PF)、及C3腎小球病變。
  64. 如請求項62所述之方法，其中該補體成分C3-相關疾患為冷凝集素症(CAD)。
  65. 如請求項62所述之方法，其中該個體為人類。
  66. 如請求項60或61所述之方法，其中對個體投與製劑可以降低溶血及/或降低C3蛋白質累積。
  67. 如請求項60至66中任一項所述之方法，其中該dsRNA劑投與個體之劑量為約0.01mg/kg至約50mg/kg。
  68. 如請求項60至67中任一項所述之方法，其中該dsRNA劑係經皮下投與個體。
  69. 如請求項60至68中任一項所述之方法，其進一步包括在來 自個體之樣本中測定補體成分C3含量。
  70. 如請求項69所述之方法，其中該個體樣本中之補體成分C3量級為血液或血清樣本中之補體成分C3蛋白質量級。
  71. 如請求項60至70中任一項所述之方法，其進一步包括對該個體投與治療溶血之額外醫療劑。
  72. 一種套組，其包含如請求項1至45中任一項所述之dsRNA劑或如請求項47至52中任一項所述之醫藥組成物。
  73. 一種小瓶，其包含如請求項1至45中任一項所述之dsRNA劑或如請求項47至52中任一項所述之醫藥組成物。
  74. 一種針筒，其包含如請求項1至45中任一項所述之dsRNA劑或如請求項47至52中任一項所述之醫藥組成物。
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