CN1646702A - 用于治疗性寡核苷酸的蛋白质载体*** - Google Patents

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Abstract

用通过柔性接头分子相连的反应性化学基团修饰治疗性寡核苷酸，包括反义寡核苷酸和siRNA。经过修饰的寡核苷酸能够与移动蛋白特别是人血清清蛋白形成共价键。与末经修饰的寡核苷酸相比，由此生成的复合物在保留生物学活性的同时，还具有增强的细胞进入、显著增加的血清半衰期、和降低的免疫***刺激。经修饰寡核苷酸克服了与当前反义药物有关的许多问题。本发明的经修饰寡核苷酸作为治疗剂施用，并且与所针对的RNA分子内的互补序列杂交。

Description

用于治疗性寡核苷酸的蛋白质载体***
发明领域
本发明涉及在与移动蛋白形成共价键后展示增强的细胞进入和延长的治疗半衰期的经修饰治疗性寡核苷酸，包括反义寡核苷酸(下文称作“ASO”)、核酶、和小型干涉RNA(下文称作“siRNA”)。更具体的说，本发明涉及经过能够在体内或离体与人移动蛋白形成特异共价连接的化学反应性基团修饰的治疗性寡核苷酸。另外，本发明提供了将治疗性寡核苷酸导入细胞的方法，以及使用它们来治疗疾病状况的方法。
发明背景
治疗性寡核苷酸
治疗性寡核苷酸，诸如ASO和siRNA，是设计与靶DNA或RNA上特异序列杂交从而防止基因表达(特别是有助于疾病或紊乱发展的基因)的单链或双链DNA或RNA短片段(如长度为大约7个-大约45个序列特异碱基)。ASO有许多属性从治疗立场看是吸引人的，包括ASO的特异性、预先筛选ASO对非靶杂交的能力、以及ASO作为已知疾病的特异治疗处理的迅速开发(Tanaka等人，Respir Res.，2：5-9，2001)。由这种方法提供的简单性和特异性使得利用治疗性寡核苷酸诸如ASO成为治疗或预防疾病或紊乱的基于小分子或蛋白质的传统疗法的有吸引力的替代方法。具体而言，反义方法可能是利用大量可获得的来自人和病原体来源的基因组和cDNA序列数据来开发治疗剂的最快方式。
不过，在将ASO开发成可广泛应用的治疗剂的过程中遭遇到几个基本障碍。一个众所周知的问题是未经修饰的ASO被细胞和胞外核酸酶快速降解(Zelphati，O.等人，Res.Dev.，3：323-338，1993；Thierry，A.R.等人，在《Gene Regulation：Biology of Antisense RNAand DNA》(《基因调控：反义RNA和DNA的生物学》)中，Raven出版社，纽约，第147-161页，1992)。对磷酸二酯主链的修饰，例如将硫代磷酸酯连接引入DNA主链，降低了ASO对降解的敏感性并将血液半衰期由数分钟延长至数小时。然而，从治疗的观点看这样的半衰期仍然不能令人满意。
第二个问题是ASO到达靶mRNA的胞内投递效率低下。造成投递效率低下的因素包括：蛋白质结合，主要是和血清清蛋白；寡核苷酸的快速代谢；以及穿过细胞膜到达胞内和/或核内靶的能力有限。这些因素又主要归咎于ASO上的负电荷。
第三个问题是ASO对免疫***刺激，它可能导致治疗并发症。这种免疫***刺激可能与***毒性有关，诸如由补体介导的过敏症、改变的凝血特性、和血细胞减少症(Galbraith等人，Antisense Nucl.AcidDrug Des.，4：201-206，1994)。通常，由于ASO的快速清除和低效投递，为了获得功效需要大量且频繁的给药，而这进一步促进了免疫***刺激。
核酶是有潜力作为治疗剂的另一种形式的治疗性寡核苷酸。核酶是具有催化活性而能够特异切割其它RNA分子的核糖核酸。核酶在用于本文时不受大小限制，而且可以包括长度超过45个碱基的RNA序列。核酶在发挥功能时，通过Watson-Crick碱基配对而结合底物RNA序列，随后切割底物序列的磷酸二酯主链和失活(Bunnell，B.A.等人，Clin.Micro.Rev.，11：42-56，1998；Jen，K-Y.等人，Stem Cells，18：307-319，2000)。在核酶作为治疗剂时发现的一个限制是它们对RNA酶降解的易感性。因此，保护核酶免于RNA降解同时保留核酶生物学活性的方法对于疾病治疗是有用的(Bunnell，B.A.等人，Clin.Micro.Rev.，11：42-56，1998)。
载体蛋白缀合物
移动蛋白诸如血液蛋白作为治疗剂载体分子的使用在本领域是广为人知的。在许多研究中，用反应性基团修饰肽和小分子药物使之能够缀合蛋白质。本发明的移动蛋白包括但不限于血清清蛋白、球蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白、铁蛋白、诸如此类。与移动蛋白缀合的分子可以保留它们最初的治疗活性，同时展示显著延长的半衰期和改进的生物利用率。缀合可以是非特异的(如使用与移动蛋白中可利用氨基反应的N-羟基琥珀酰亚胺)或特异的(如使用与清蛋白中单一游离硫醇基反应的马来酰亚胺基(参阅例如美国专利号6,329,336))。已经在体内或离体实现了缀合，尽管体内缀合可能具有某些优点。这些缀合物的典型应用集中于胞外或细胞表面目标。因此，这些应用中的缀合治疗剂不必穿过细胞膜。尚不清楚这种方法能否用于胞内目标。
本领域需要易于穿过细胞膜并将活性治疗剂诸如ASO、siRNA、和核酶投递至胞内目标诸如RNA或DNA靶的治疗性化合物。本发明通过提供胞内投递活性治疗性寡核苷酸同时还保留延长的***半衰期的新型治疗性化合物而满足了本领域的这些和更多需要。本发明还提供了使用本发明的治疗性寡核苷酸化合物来治疗疾病和/或紊乱的方法。
发明概述
本发明包括合在一起使得能够使用治疗性寡核苷酸的新型化学反应性衍生物的化合物、手段和方法，所述治疗性寡核苷酸衍生物能够与移动蛋白(包括移动血液蛋白)上可利用的官能团反应而形成共价连接。本发明还提供了使用具有反应性基团的治疗性寡核苷酸衍生物增强细胞进入、抵抗核酸酶降解并改进体内半衰期、以及选择性阻断特定基因的表达的方法。在一个实施方案中，本发明涵盖包含通过接头分子与ASO缀合的化学反应性基团的ASO新型化学反应性衍生物。这些经修饰ASO能够与移动蛋白特别是人血清清蛋白上的氨基、羟基、或硫醇基反应而形成稳定的共价键。
在另一个实施方案中，本发明涵盖包含通过接头分子与siRNA缀合的化学反应性基团的siRNA新型化学反应性衍生物。这些经修饰siRNA能够与移动蛋白特别是人血清清蛋白上的氨基、羟基、或硫醇基反应而形成稳定的共价键。
在另一个实施方案中，本发明涵盖包含通过接头分子与核酶缀合的化学反应性基团的核酸新型化学反应性衍生物。这些经修饰核酶能够与移动蛋白特别是人血清清蛋白上的氨基、羟基、或硫醇基反应而形成稳定的共价键。
本发明提供了使用包含经修饰治疗性寡核苷酸的化合物来增强细胞进入和提高半衰期的方法，包括以下步骤：a)将化合物(在体内或离体)与含有内源血液或组织液或者重组移动蛋白的生物学样品混合；b)与生物学样品中存在的移动蛋白缀合；c)摄取缀合物进入细胞并使治疗性寡核苷酸结合胞内和核内目标；并d)选择性地阻断特定基因的表达。
本发明还提供了使用本发明的治疗性寡核苷酸及其衍生物来治疗疾病的方法，包括以下步骤：a)将化合物(在体内或离体)与含有内源血液或组织液或者重组移动蛋白的生物学样品混合；b)缀合生物学样品中存在的移动蛋白；c)摄取缀合物进入细胞并使治疗性寡核苷酸结合胞内和核内目标；并d)选择性地阻断特定基因的表达。
附图简述
图1显示了包含5′-(BMPS)(C6NH)接头和马来酰亚胺反应性部分的ASO的一般结构。BMPS指N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)琥珀酰亚胺酯。
图2显示了可用于缀合至siRNA双链体的N3_9S-MPA接头的结构。
实施方案详述
定义
在用于本文时，“寡核苷酸”指能够结合互补单链或双链RNA或DNA靶序列的单链或双链RNA或DNA，包括ASO和siRNA。作为本发明ASO或siRNA的治疗性寡核苷酸中的序列特异性片段包含长度为大约7个碱基-大约45个碱基的核苷酸序列。寡核苷酸中还可以包含非序列特异的额外碱基，诸如例如接头序列。“序列特异性的”指寡核苷酸中与靶RNA或DNA互补和/或指导对靶RNA或DNA的切割的部分。
在用于本文时，“ASO”指包含与靶DNA或RNA互补的序列的DNA或衍生化DNA(如硫代磷酸酯DNA)短片段(大约7个-大约45个序列特异核苷酸)。ASO中互补部分的范围典型地是寡核苷酸的大约30％-大约100％。
在用于本文时，“siRNA”指其中双链体的每条链都包含大约15个-大约30个碱基的长度且其中至少一条链与DNA或RNA靶共享至少大约90％、更优选高达大约100％同源性的RNA双链体。
在用于本文时，“核酶”指具有能够特异切割其它RNA分子的催化活性的核糖核酸。在用于本发明时，作为核酶的治疗性寡核苷酸不受大小限制。
在用于本文时，“移动蛋白”指蛋白质不会长时间停留于固定位点，通常不超过5分钟，或者更通常的是1分钟。“固定位点”不包括胞内定位。移动蛋白不是膜结合的，而且长时间全身分布。移动蛋白的实例包括但不限于循环中的清蛋白诸如人血清清蛋白、人转铁蛋白、球蛋白、免疫球蛋白诸如IgG、及其基本上具有相同物理或化学特征的变体。应当理解移动蛋白可以具有不同的功能，诸如结合不同靶的免疫球蛋白。还应当理解体内可以存在这些移动蛋白的变体和/或突变体形式。这些功能和/或化学变体和/或突变体也属于本发明的移动蛋白。
在用于本文时，“基因表达”指mRNA合成或mRNA翻译。
从最广义上讲，本发明的目标是如下实现的：用化学反应性基团修饰治疗性寡核苷酸，使得治疗性寡核苷酸缀合天然存在的移动蛋白，从而增强细胞进入和抵抗胞外核酸酶切割。在本发明的一个实施方案中，通过提供柔性程度的接头分子将化学反应性基团缀合至治疗性寡核苷酸。选择用化学反应性基团修饰治疗性寡核苷酸的位点使得它不会影响生物学活性。
在本发明的一个优选实施方案中，用化学反应性基团在寡核苷酸的5′或3′末端修饰治疗性寡核苷酸。将末端经修饰的治疗性寡核苷酸注射到血液或组织中，导致这些试剂与移动蛋白的快速共价连接。
现有技术显示，用化学反应性基团修饰有些试剂例如治疗性肽能够与移动蛋白形成共价键，从而增加由此生成的蛋白质缀合物的半衰期(参阅美国专利5,612,034；美国专利6,103,233；美国专利6,107,489；和美国专利6,329,336)。蛋白质缀合物和感兴趣的其它活性试剂的缀合物所建议的现有技术的靶标是胞外和血液相关目标。然而，不知道在这些缀合物中发现的属性是否必然延伸至本发明的治疗性寡核苷酸。例如，治疗性蛋白质和治疗性寡核苷酸在施用到体内后遇到了许多不同问题。例如，治疗性蛋白质可能引发比治疗性寡核苷酸更强的免疫应答。相反，治疗性寡核苷酸常常在如上所述施用后遭受核酸酶降解。类似的，治疗性寡核苷酸可能非特异结合内源化合物诸如蛋白质或其它核酸。
本发明人发现本发明的治疗性寡核苷酸通过缀合移动蛋白而受益于改进的体内半衰期。另外，还发现本发明的治疗性寡核苷酸在与移动蛋白缀合后保留了治疗功效。最重要的是，发现本发明治疗性寡核苷酸的细胞进入通过缀合移动蛋白而得到增强。
作为与现有技术的特别重要区别，将末端经修饰的治疗性寡核苷酸缀合移动蛋白显著增强治疗性寡核苷酸的细胞进入，同时保留对靶DNA或RNA的结合亲和力。这是特别重要的，因为本发明的目的就是将治疗性寡核苷酸导入胞内和/或核内目标。
将末端经修饰的治疗性寡核苷酸缀合移动蛋白还使得寡核苷酸显著抵抗核酸酶的胞内和胞外降解。认为这种特性主要归功于治疗性寡核苷酸与移动血液蛋白诸如血清清蛋白的缀合。
治疗性寡核苷酸与移动蛋白特别是人血清清蛋白的共价连接在许多情况中降低针对这些治疗性试剂的非期望免疫应答。本发明的治疗性寡核苷酸在共价连接移动蛋白后保留了功效，允许例如治疗性DNA寡核苷酸与互补RNA序列杂交，形成由RNA酶H识别并切割的底物。作为RNA酶H底物切割的结果，相应基因的表达得到选择性阻断。在许多治疗性应用中需要这种基因表达的选择性抑制。
核酸
本发明的治疗性寡核苷酸是能够结合靶RNA或DNA序列(包括内源调控序列)从而抑制基因表达的单链或双链RNA或DNA寡核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗性寡核苷酸是ASO。ASO涵盖与特异RNA序列的一部分或互补基因序列互补并降低或抑制基因表达的单链DNA或RNA。ASO的非限制性实例包括与mRNA转录本互补从而形成RNA双链体导致翻译水平降低的RNA序列。或者，ASO可以涵盖与mRNA转录本杂交和作为RNA酶H底物的与mRNA转录本互补的DNA序列。
反义寡核苷酸技术在本领域已经成为有希望的治疗剂来源。反义寡核苷酸依靠已知核酸序列与其反向互补序列之间的Watson-Crick碱基配对来抑制基因表达(Jen，K.等人，Stem Cells，18：307-319，2000)。反义寡核苷酸疗法可用于抗击广泛的疾病，例如参与疾病或紊乱的人类基因的表达，或者针对感染因子的复制(Tanaka，M.等人，Respir.Res.，2：5-9，2000；Bunnell，B.A.等人，Clin.Micro.Rev.，11：42-56，1998)。在设计反义寡核苷酸疗法时必须考虑的重要事项包括体内反义稳定性、反义寡核苷酸疗法的高效投递、和反义寡核苷酸的高效胞内定位(Jen，K.等人，Stem Cells，18：307-319，2000)。
众所周知，根据靶基因，与靶基因任何部分诸如编码区、内含子、5′非翻译区(5′UTR)、翻译起始位点、或3′UTR杂交的ASO可能具有治疗功效。因此，本文所列序列仅仅是本发明可以使用的可能治疗性寡核苷酸的例示，包括本领域已知的所有ASO。另外，本领域建议的所有候选核酸化学都可用于本发明，尽管效用程度可能不同。下文提供的题为“缀合化学和载体分子”的小节更加详细的讨论了适用于本发明治疗性寡核苷酸的化学。简而言之，本文所列化合物代表了可用于本发明的多种化学的一大类治疗性寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，本发明ASO和siRNA治疗性寡核苷酸的序列结合部分的长度为大约7个-大约45个碱基。在本发明的一个优选实施方案中，本发明ASO和siRNA治疗性寡核苷酸的序列结合部分的长度为大约10个-大约30个核苷酸。在本发明的一个特别优选实施方案中，本发明ASO和siRNA治疗性寡核苷酸的序列结合部分的长度为大约15个-大约25个核苷酸。可用于本发明的其它寡核苷酸包括本领域先前以游离形式证明有功效的寡核苷酸。本发明的核酶治疗性寡核苷酸不受大小限制。
本发明的治疗性寡核苷酸还涵盖siRNA。SiRNA衍生自RNA干涉，这是用于使某些基因转录沉默的天然细胞过程(Sharp，P.A.，Genes& Dev.，15：485-490，2001；Camichael，G.G.，Nature，418：379-380，2002)。siRNA与细胞蛋白质复合物结合，并指导那些蛋白质复合物对互补靶RNA的切割。
在本发明中，siRNA涵盖长度为大约15-30个碱基的双链体RNA，双链体RNA的一条链优选与RNA靶具有至少大约90％同源性，更优选与RNA靶具有高达大约100％同源性。或者，siRNA与RNA靶共享足够同源性以指导蛋白质复合物对互补靶RNA的切割。本领域普通技术人员使用基于搜索的电脑程序诸如BLAST或FASTA程序就可以测定两种核苷酸序列之间的同源性。或者，本领域普通技术人员可以使用序列比对程序诸如MegAlign(DNASTAR电脑程序组中所含)来测定序列同源性。
如下文所述用化学反应性基团修饰siRNA，从而可以与移动蛋白优选人血清清蛋白形成共价键。在本发明的一个优选实施方案中，通过添加化学反应性基团对siRNA双链体的修饰发生于末端。化学反应性基团对RNA双链体的化学修饰可以发生于RNA双链体的4个末端中的任何一个，可以是RNA双链体的两条RNA链任一链的5′或3′末端。
本发明的治疗性寡核苷酸还涵盖衍生化DNA。衍生化DNA包括但不限于具有经修饰主链的DNA，诸如通过用硫代磷酸酯连接取代磷酸二酯连接而合成的硫代磷酸酯化DNA。本发明的其它DNA衍生物涵盖甲基膦酸酯(Miller和Ts′o，Anticancer Drug Des.，2：117-128，1987)和肽连接(如PNA)(Bonham等人，Nucleic Acid Res.，23：1197-1203，1995)，以增强对核酸酶降解的抵抗力；以及对核苷碱基的修饰，诸如C5-丙炔基-dU、dC修饰寡核苷酸(Wagner等人，Science，260：1510-1512，1993)和“G钳”修饰脱氧胞嘧啶(Flaganan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：3513-3518，1999)，以改进mRNA结合亲和力。
在本发明的一个实施方案中，DNA衍生物是具有硫代磷酸酯连接而抵抗核酸酶降解且容许RNA酶H切割靶mRNA的治疗性寡核苷酸。硫代磷酸酯化DNA在合成治疗性寡核苷酸的过程中采用硫代磷酸酯键而非磷酸二酯键。例如，可以使用自动化DNA合成仪来合成本发明的硫代磷酸酯化寡核苷酸。硫化试剂(thioating reagent)3H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3-酮-1，1-二氧化物常用于生成位于硫代磷酸酯连接内的硫醇键。整个治疗性寡核苷酸或治疗性寡核苷酸的一部分可以是硫代磷酸酯化的(参阅例如Gait，M.J.，《Oligonucleotide Synthesis，a practical approach》(《寡核苷酸合成，一种实用方法》)，牛津大学出版社，纽约，1984；Reddy，M.P.等人，Tetrahedron Lett.，35(25)：4311-4314，1994)。在本发明的一个具体实施方案中，治疗性寡核苷酸的未缀合末端(或对于寡核苷酸双链体，其多个未缀合末端)是硫代磷酸酯化的。
在本发明的另一个实施方案中，DNA衍生物是设计包含文献(Kurreck，J.等人，Nuc.Acid Res.，30：1911-1918，2002)中所描述的锁定核酸(locked nuceic acids)(下文称“LNA”)的治疗性寡核苷酸。除了其它属性，包含LNA的治疗性寡核苷酸可以具有改进的对互补序列的亲和力和提高的熔解温度(下文中称“Tm”)。
本发明的治疗性寡核苷酸可以衍生自任何数目的来源，包括基因组DNA、cDNA、mRNA、和合成寡核苷酸。治疗性寡核苷酸还包括包含核酸类似物的寡核苷酸诸如例如Stein等人(Science，261：1004-1011，1993)描述的硫代磷酸酯化反义寡核苷酸衍生物和美国专利号5,264,423和5,276,019(将其公开内容收入本文作为参考)中描述的衍生硫代磷酸酯化寡核苷酸。优选的是，包含核酸类似物的寡核苷酸具有至少一些下列有利属性，即抵抗核酸酶的切割、水稳定性好、和与互补DNA序列高效杂交。另外，在另一个实施方案中，本发明的治疗性寡核苷酸包含转录和翻译调控序列(包括启动子序列和增强子序列)或与之互补。
在本发明的一个特别优选实施方案中，可用于本发明的治疗性ASO序列(假定靶特异的)包括但不限于下列ASO序列(取向5′至3′)：
1)鼠ICAM-1(胞内粘附分子-1)(硫代磷酸酯)
TGCATCCCCCAGGCCACCAT          (SEQ ID NO：1)
2)鼠ICAM-1(磷酸二酯)
TGCATCCCCCAGGCCACCAT          (SEQ ID NO：1)
3)人ICAM-1(硫代磷酸酯)
GCCCAAGCTGGCATCCGTCA          (SEQ ID NO：2)
4)人erb-B-2基因(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
GGTGCTCACTGCGGC               (SEQ ID NO：3)
5)人c-myc基因(硫代磷酸酯)
AACCGTTGAGGGGCAT              (SEQ ID NO：4)
6)人c-myc基因(磷酸二酯)
AACGTTGAGGGGCAT               (SEQ ID NO：5)
7)人c-myc基因(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
TAACGTTGAGGGGCAT              (SEQ ID NO：6)
8)人c-myb基因(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
TATGCTGTGCCGGGGTCTTCGGGC      (SEQ ID NO：7)
9)人c-myb基因(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
GTGCCGGGGTCTTCGGGC            (SEQ ID NO：8)
10)人IGF-1R(胰岛素生长因子1-受体)
(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
GGACCCTCCTCCGGAGCC            (SEQ ID NO：9)
11)人IGF-1R(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
TCCTCCGGAGCCAGACTT            (SEQ ID NO：10)
12)人EGFR(表皮生长因子受体)
(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
CCGTGGTCATGCTCC               (SEQ ID NO：11)
13)人VEGF(血管内皮生长因子)基因
(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
CAGCCTGGCTCACCGCCTTGG         (SEQ ID NO：12)
14)鼠PKC-α(磷酸激酶C-α)基因
(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
CAGCCATGGTTCCCCCCAAC          (SEQ ID NO：13)
15)人PKC-α(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA          (SEQ ID NO：14)
16)人bcl-2基因
(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
TCTCCCAGCGTGCGCCAT            (SEQ ID NO：15)
17)人c-raf-1蛋白激酶
(磷酸二酯或硫代磷酸酯)
GTGCTCCATTGATGC               (SEQ ID NO：16)
18)人VEGFR-1(血管内皮生长因子受体1)核酶
GAGUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGUCUG
                              (SEQ ID NO：17)
19)P53致癌基因
CCCTGCTCCCCCCTGGCTCC          (SEQ ID NO：18)
20)人尿激酶受体
CGGCGGGTGACCCATGTC            (SEQ ID NO：19)
21)HIV-1(1型人免疫缺陷病毒)
TCTTCCTCTCTCTACCCACGCTCTC     (SEQ ID NO：20)
22)MB-003
AAAGTATCCCAGCCGCCGTT          (SEQ ID NO：21)
23)MB-006
TCCCGGTTGCTCTGAGACAT          (SEQ ID NO：22)
另外，为了提供与互补核酸的存在与否相关的临床诊断或者监测使用治疗性寡核苷酸进行的治疗，本发明的经修饰治疗性寡核苷酸可以包含一个或多个标记(如放射性标记、生物素、荧光标记、化学发光或比色标记)。
通常肠胃外施用经修饰治疗性寡核苷酸，诸如经静脉内(IV)、动脉内(IA)、肌肉内(IM)、皮下(SC)、诸如此类途径。还可以通过输液来进行施用。在有些情况中，当官能团的反应较慢时施用可以是通过口服、经鼻、直肠、经皮、或气雾剂进行，此时缀合物的性质容许转移至血管***。通常采用单次注射，但是如果需要也可以使用超过一次注射。可以通过方便的手段来施用经修饰治疗性寡核苷酸，包括注射器、套针、导管、诸如此类。具体的施用方式将根据施用浓度、单次大剂量或是连续施用、诸如此类而变化。优选的是，施用采用血管内，导入部位对本发明并不重要，优选血流快的部位(如静脉内，周围或中央静脉)。当施用偶联缓释技术或保护性基质时可以采用其它路径。目的是将治疗性寡核苷酸高效分布到血液中，从而能够与移动蛋白反应。经修饰寡核苷酸的施用浓度是变化的，范围通常为施用前大约1pg/ml-100mg/ml。血管内施用总量的范围通常为大约0.1mg-大约500mg，更优选大约1mg-大约250mg。
缀合化学和载体分子
本发明的治疗性寡核苷酸在体内或离体通过缀合至治疗性寡核苷酸的反应性基团与各种移动蛋白形成共价键。缀合至治疗性寡核苷酸的反应性基团靶向移动蛋白上存在的官能团并与其共价键合。任选的是，反应性基团通过接头基团的使用而缀合至寡核苷酸。
本发明的反应性基团是能够与移动蛋白上存在的官能团(functionality)形成共价键的化学基团。将反应性基团偶联或键合至治疗性寡核苷酸和相应类似物以形成经修饰寡核苷酸。反应性基团通常在水环境中是稳定的。移动蛋白上可用于共价键合本发明经修饰寡核苷酸及其类似物上化学反应性基团的反应性官能团主要是氨基、羧基、和硫醇基。在本发明的一个实施方案中，反应性基团包括但不限于反应性双键、羧基、磷酰基、或方便的酰基，或作为酯或作为混合酸酐，或imidate，从而能够与移动蛋白特别是血液蛋白上靶位点的官能团诸如氨基、羟基、或硫醇基形成共价键。反应性酯包括酚类化合物、硫醇酯、烷基酯、磷酸酯、诸如此类。在本发明的一个特别优选实施方案中，反应性基团由琥珀酰亚胺基团或马来酰亚胺基团组成。
本发明的官能团指移动蛋白上与经修饰寡核苷酸上反应性基团反应而形成共价键的化学基团。在本发明的另一个实施方案中，官能团包括但不限于用于键合酯反应性实体的羟基；用于键合马来酰亚胺和马来酰亚胺基、imidates、和硫酯基的硫醇基；用于键合羧基、磷酰基、或反应性实体上的酰基的氨基；以及用于键合氨基的羧基。这些移动蛋白包括血液蛋白，特别是人血清清蛋白。
在本发明的一个特别优选实施方案中，官能团是人血清清蛋白中的游离硫醇基。
本发明的连接基团是将反应性基团连接或缀合至治疗性寡核苷酸的化学部分。连接基团通常包含4-12个碳原子，或是饱和的或是不饱和的，且任选分支的。连接基团包括但不限于一个或多个烷基诸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、烷氧基、链烯基、炔基、或被烷基取代的氨基、环烷基、多环基(polycyclic groups)、芳基、多芳基(polyaryl groups)、取代的芳基、杂环基、和取代的杂环基。连接基团还包括聚乙氧基氨基酸诸如AEA((2-氨基)乙氧基乙酸)或优选的连接基团AEEA([2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸)。
在其它优选实施方案中，本发明的连接基团由下文实施例1和2中用于生成MB-003M和MB-006M反义寡核苷酸和siRNA缀合物的特定连接基团组成。这些实施方案分别在图1和2中描绘成5′C6氨基接头和3′-氨基-9原子间隔物(N3_9S-MPA接头)。
本发明的连接基团还可包括发挥连接基团功能的寡核苷酸。在本发明寡核苷酸连接基团的一个实施方案中，连接基团包含通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键而键合至治疗性寡核苷酸5′或3′末端的大约4个-大约20个碱基。可以使用DNA合成仪与治疗性寡核苷酸一起直接合成这种寡核苷酸连接基团。此实施方案的寡核苷酸连接基团可以在体内与靶RNA或DNA杂交。或者，此实施方案的寡核苷酸连接基团包含在体内与靶RNA或DNA不杂交的寡核苷酸。
在本发明寡核苷酸连接基团的一个实施方案中，连接基团包括包含在体外在严谨杂交条件下与本发明治疗性寡核苷酸的一部分杂交的至少大约15个碱基的不同寡核苷酸。除了与治疗性寡核苷酸序列杂交，寡核苷酸连接基团还可以包含与靶RNA或DNA杂交的至少大约15个碱基。或者，寡核苷酸连接基团可以包含在严谨杂交条件下与靶RNA或DNA不杂交的寡核苷酸。
寡核苷酸连接基团不受大小限制，但是大到足以容许治疗性寡核苷酸发挥功能而不受所键合的移动蛋白的干扰。本发明的连接用寡核苷酸能够在体外在严谨杂交条件下与至少部分治疗性寡核苷酸杂交，而且连接用寡核苷酸的任何部分都可用于与治疗性寡核苷酸的杂交使得治疗性寡核苷酸的生物学活性不受抑制。另外，将反应性基团(如马来酰亚胺基或琥珀酰亚胺基)缀合至连接基团的另一个部分。优选的是，以不干扰连接用寡核苷酸与治疗性寡核苷酸之间杂交的方式将反应性基团缀合至连接用寡核苷酸。
寡核苷酸连接基团与治疗性寡核苷酸之间的杂交在体外在严谨溶液杂交条件下特异发生。可以将由此生成的杂合体在体内或在体外缀合至移动蛋白。本领域技术人员理解，用于生成体外杂交体的严谨杂交条件可能因许多因素而变化，诸如例如连接用寡核苷酸与治疗性寡核苷酸之间的同源性百分比，以及相应寡核苷酸的长度。在非限制性实施例中，严谨杂交条件指在溶液中在高于37℃的Tm温度发生的杂交。本领域技术人员能够容易的使用方程来计算寡核苷酸序列的Tm，诸如例如使用如下方程来计算DNA-DNA杂交体的Tm：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/bp。类似的，本领域技术人员可以容易的使用如下方程来计算DNA-RNA杂交体的Tm：Tm＝79.8℃+18.5(logM)+0.58(％GC)+11.8(％GC)2-0.35(％甲酰胺)-820/L。同样的，本领域技术人员可以容易的使用如下方程来计算RNA-RNA杂交体的Tm：Tm＝79.8℃+18.5(logM)+0.58(％GC)+11.8(％GC)2-0.35(％甲酰胺)-820/L。在用于这些方程时，M指单价阳离子的摩尔浓度，L指以碱基对计的双链体长度，而％GC指DNA中G和C核苷酸所占百分比。本领域技术人员将理解可以根据杂交环境而修改这些条件。
在一个特别优选实施方案中，通过寡核苷酸接头的使用而大大简化了本发明治疗性寡核苷酸的生成。更具体的说，可以大量生成具有相同序列且包含反应性基团的寡核苷酸连接基团。因此，本领域技术人员只需要合成或获得具有在体内与靶RNA或DNA特异杂交的至少15个碱基和在体外在严谨杂交条件下与大量生成的寡核苷酸连接基团杂交的至少15个碱基的治疗性寡核苷酸。本发明经修饰治疗性寡核苷酸的装配包括在体外在严谨杂交条件下使当量浓度的治疗性寡核苷酸与寡核苷酸接头杂交并分离由此生成的杂交产物。
具有反应性基团的本发明治疗性寡核苷酸能够与移动蛋白形成共价键。与移动蛋白形成共价键具有许多优点，诸如例如增加的半衰期和延长的功效、降低的免疫***刺激、以及高效细胞进入。移动蛋白包括但不限于人血清清蛋白、人转铁蛋白、人铁蛋白、和人免疫球蛋白诸如IgM和IgG。在本发明的一个实施方案中，靶向半衰期为至少大约12小时的移动蛋白。移动蛋白可以以至少0.1μg/ml的最低浓度存在。
移动蛋白可以由在体内发现的内源移动蛋白组成。或者，移动蛋白还可以由重组产生的蛋白质构成。本领域技术人员知道用于体外生成重组移动蛋白的许多技术。
在本发明的一个实施方案中，通过对患者施用治疗性寡核苷酸及随后在键合至治疗性寡核苷酸的反应性基团与移动蛋白上存在的官能团之间形成共价键而在体内产生治疗性寡核苷酸-移动蛋白缀合物。
在本发明的另一个实施方案中，通过在键合至治疗性寡核苷酸的反应性基团与移动蛋白上存在的官能团之间形成共价键而离体生成治疗性寡核苷酸-移动蛋白缀合物。还可以如下实现离体缀合：首先分离、纯化、或制备重组形式的单个移动蛋白或有限数目的蛋白质，诸如血液蛋白、免疫球蛋白、人血清清蛋白、诸如此类，并离体混合蛋白质与化学反应性治疗性寡核苷酸，特别是ASO。然后将官能化血液或移动蛋白返回宿主从而在体内提供有效的治疗性寡核苷酸缀合物。在离体制备缀合物时，治疗性寡核苷酸与移动蛋白的比例将根据诸如是将全血还是其纯化成分用作治疗性寡核苷酸的键合位点等因素而广阔变化。
在本发明的一个实施方案中，经修饰治疗性寡核苷酸设计成与移动血液蛋白上的硫醇基特异反应。在本发明的一个特别优选实施方案中，这些反应是通过具有反应性马来酰亚胺基的治疗性寡核苷酸与移动蛋白诸如人血清清蛋白或IgG上存在的硫醇官能团之间的共价键合而建立的。可以使用本领域已知方法由γ-马来酰亚胺基-丁酰基氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)和马来酰亚胺丙酸制备马来酰亚胺基。
本发明提供了治疗性化合物，以及用马来酰亚胺基特异标记的方法。与用诸如N-羟基琥珀酰亚胺(下文称“NHS”)或N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(下文称“sulfo-NHS”)等基团非特异标记移动蛋白相比，这些化合物提供了几个优点。硫醇基在体内的丰度低于内源血液蛋白上的氨基。因此，较少的本发明马来酰亚胺衍生物或经马来酰亚胺基标记的化合物将与蛋白质共价键合。作为非限制性实例，人血清清蛋白(最丰富的血液蛋白)只含有一个硫醇基。因此，用马来酰亚胺衍生化的治疗性寡核苷酸与清蛋白的缀合物将倾向于包含大约1∶1摩尔比的治疗性寡核苷酸与清蛋白。除了清蛋白以外，IgG分子(II型)也具有游离硫醇基。由于IgG分子和血清清蛋白构成血液中可溶性蛋白质的主体，因此它们同样构成血液蛋白上能够与含马来酰亚胺的治疗性寡核苷酸形成共价键的游离硫醇基的主体。
除了提供受控体内标记以外，本发明的含马来酰亚胺的治疗性寡核苷酸还提供了对人血清清蛋白和IgG的离体特异标记。这种离体标记包括向血液、血清、或含有血清清蛋白和/或IgG的盐水溶液中加入含马来酰亚胺的治疗性寡核苷酸。一旦受到含马来酰亚胺的治疗性寡核苷酸的离体修饰，可以将血液、血清、或盐水溶液重新施用于患者而进行体内治疗。
在本发明的一个特别优选实施方案中，用于生成治疗性寡核苷酸缀合物的移动蛋白是人血清清蛋白。术语“人血清清蛋白”、“人清蛋白”、和“清蛋白”在整个申请中使用时可以互换，除非文中另有指示。人血清清蛋白的前清蛋白原(preproalbumin)形式的氨基酸序列是：
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKA
LVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSL
HTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNP
NLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLF
FAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC
ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTEC
CHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIA
EVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYA
RRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL
VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVE
VSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV
SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT
LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCC
KADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO：23)
人血清清蛋白在肝脏以蛋白质的前清蛋白原形式合成。随后切除蛋白质的前清蛋白原形式的N端18个氨基酸残基(SEQ ID NO：23的氨基酸Met1至Ser18)，并由粗糙内质网释放蛋白质的清蛋白原(proalbumin)形式。随后在高尔基囊泡中切除蛋白质的清蛋白原形式的6个N端氨基酸(SEQ ID NO：23的氨基酸Arg19至Arg24)而生成清蛋白的分泌、成熟形式。
本发明的人血清清蛋白涵盖该蛋白质的前清蛋白原形式、该蛋白质的清蛋白原形式、和该蛋白质的成熟形式。在本发明的一个优选实施方案中，人血清清蛋白的成熟形式在体内或离体用于生成治疗性寡核苷酸缀合物。
本发明还涵盖蛋白质的前清蛋白原形式(SEQ ID NO：23)、蛋白质的清蛋白原形式、或清蛋白的成熟形式的突变体和/或片段的用途。可用于本发明的人血清清蛋白片段包括长度为50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、或550个氨基酸的SEQ ID NO：23片段，其还包含Cys34残基。优选的是，可用于本发明的人血清清蛋白片段展示延长的体内半衰期，最优选与内源成熟人血清清蛋白半衰期相当的半衰期。
可用于本发明的人血清清蛋白突变体包括该蛋白质的前清蛋白原形式(SEQ ID NO：23)、该蛋白质的清蛋白原形式、或清蛋白的成熟形式的突变体，以及上文所述任何片段的突变体。可用于本发明的人血清清蛋白突变体包含至少一个半胱氨酸残基，优选清蛋白成熟形式的Cys34。优选的是，人血清清蛋白突变体包含保守替代，使得整体特征(包括结构、免疫原性、和半衰期)没有发生显著变化。本领域技术人员能够容易地确定可以替代哪个氨基酸以生成突变体。例如，人血清清蛋白突变体中的保守替代包括用下列各组中的其它氨基酸替代相同组的氨基酸：酸性残基诸如Asp和Glu的替代；芳香族残基诸如Phe、Tyr、和Trp的替代；酰胺残基Asn和Gln的替代；碱性残基Lys、Arg、和His的替代；羟基残基Ser和Thr的替代；疏水性或脂肪族残基Ala、Val、Leu、和Ile的替代；或者小型氨基酸诸如Ala、Ser、Thr、Met、和Gly的替代。生成突变体蛋白质的策略对本领域技术人员是众所周知的。
重要的是，在含游离硫醇基的血液蛋白中，马来酰亚胺的特异标记导致ASO-马来酰亚胺-清蛋白缀合物的优先形成，这要归功于清蛋白自身的独特特征。在物种间高度保守的人血清清蛋白上的单一游离硫醇基是成熟清蛋白的第34位氨基酸残基(Cys34)(即SEQ ID NO：23的第58位氨基酸)。
最近已经证明成熟清蛋白的Cys34相对于其它含游离硫醇基的蛋白质上的游离硫醇基具有增强的反应性。这部分是由于成熟清蛋白Cys34残基的pKa值5.5很低。这一数值通常比其它蛋白质的半胱氨酸残基的pKa值(通常是大约8)低得多。由于这一低pKa，在正常生理学条件下，成熟清蛋白的Cys34主要处于离子化形式，显著增加其反应性(参阅美国专利号6,329,336)。
增强Cys34的反应性的另一个因素是它的位置，它处于接近清蛋白V区一个环的表面的裂缝中。这个位置使得Cys34易于与所有种类的配体反应，并强化了Cys34作为自由基陷阱和游离硫醇基清除剂的生物学作用。这些特性使得Cys34与马来酰亚胺部分有高度反应性，与马来酰亚胺和其它含游离硫醇基蛋白质的反应速率相比，将反应速率加快了多达1000倍。
与缀合了NHS的治疗性寡核苷酸相反，含马来酰亚胺的治疗性寡核苷酸通常在存在水溶液和存在游离胺时相当稳定。由于马来酰亚胺衍生物将只与游离硫醇基反应，因此通常没有必要有保护基团来防止含马来酰亚胺的治疗性寡核苷酸自我反应。另外，此试剂增加的稳定性容许使用进一步的纯化步骤诸如例如HPLC以制备适用于体内用途的高度纯化的产品。最后，增加的化学稳定性为产品提供了较长保存期。
通过与具有延长的血清半衰期的移动蛋白(特别是血液蛋白)诸如免疫球蛋白和人血清清蛋白的键合，产生了许多优点。一个优点是治疗性寡核苷酸的治疗功效由几小时延长至几周。最重要的是，与移动蛋白和血液蛋白的缀合显著增强治疗性寡核苷酸的细胞进入，同时保留对靶DNA或RNA的结合亲和力。
与清蛋白的复合有助于降低治疗性寡核苷酸的免疫刺激。另外，与清蛋白的复合有助于避免治疗性寡核苷酸与内源蛋白质诸如例如血浆蛋白酶的非特异结合。治疗性寡核苷酸与内源蛋白质特别是血浆蛋白的非特异结合可能使患者患病，诸如血小板减少。治疗性寡核苷酸与内源蛋白质的非特异结合还具有更明显的不利作用，即防止或降低到达其胞内目标的治疗性寡核苷酸的量。最重要的是，细胞将通过内吞或与清蛋白代谢相关的其它途径来摄取ASO-马来酰亚胺-清蛋白缀合物。在进入细胞后，无论清蛋白是否在溶酶体中降解，衍生化ASO将可以到达靶DNA或RNA并实现治疗目的。
在本发明的一个实施方案中，在治疗方案中只需要施用一次治疗性寡核苷酸(经过或未经缀合的)。在本发明的另一个实施方案中，在治疗方案中可能施用至少两次治疗性寡核苷酸(经过或未经缀合的)。本领域技术人员能够根据诸如治疗性寡核苷酸的浓度、经缀合治疗性寡核苷酸的半衰期、每份剂量的治疗有效性程度、以及其它变量等因素来确定优选给药方案。
本发明治疗性寡核苷酸的用途
本发明的寡核苷酸可用于治疗将受益于抑制特定基因的基因表达的疾病。这些疾病包括但不限于癌症、自身免疫疾病、病毒和细菌感染、内分泌***紊乱、神经紊乱包括中枢和周围神经***紊乱、心血管疾病、肺部疾病、和生殖***疾病。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的治疗性寡核苷酸可用于改善和/或治疗癌症和其它高增殖性疾病。癌细胞通常具有基因异常表达的特征。实验证据表明清蛋白优先在肿瘤中积累(Clorius等人，Eur.J.Nucl.Med.，22：989-996，1995；Wunder等人，Int.J.Oncol.，11：497-507，1997)。另外，与未缀合的清蛋白相比，与清蛋白缀合的氨甲蝶呤展示高肿瘤积累和相同分布模式(Stehle等人，Anticancer Drugs，8：677-685，1997；Stehle等人，Anticancer Drugs，8：835-844，1997)。与氨甲蝶呤缀合的清蛋白的I期试验在癌症患者中展示极佳的毒物学特性和肿瘤应答，理论上容许对门诊病人进行治疗和为所有癌症患者维持高品质生活(Hartung等人，ClinicalCancer Research，5：753-759，1999)。在本发明的一个具体实施方案中，将包含SEQ ID NO：1-22至少之一的经修饰治疗性寡核苷酸用于治疗人的恶性肿瘤，而且本发明可以利用通过清蛋白-氨甲蝶呤复合物证明的肿瘤积累。
本发明提供了疗法的癌症和其它高增殖性疾病包括但不限于与结缔和肌骨***组织有关的瘤，诸如纤维内瘤、横纹肌肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、和脂肪肉瘤；位于腹部、骨、脑、乳腺、结肠、消化***、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头部和颈部、肝、淋巴***、神经***(中枢和周围)、胰、骨盆、腹膜、皮肤、软组织、脾、胸腔、和泌尿生殖道中的瘤；白血病(包括急性早幼粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、原始粒细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、粒-单核细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病)、淋巴瘤(包括何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、结肠癌、***癌、肺癌、小细胞性肺癌、支气管癌、睾丸癌、***、卵巢癌、乳腺癌、血管肉瘤、***肉瘤、内皮肉瘤、***内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、胰癌、肾细胞癌、维尔姆斯瘤、肝肿瘤、胆管癌、腺癌、上皮癌、黑素瘤、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、emangioblastoma、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、menangioma、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、胚胎性癌、囊腺癌、髓样癌、绒毛膜癌、和***瘤。
依照本发明一个实施方案的治疗方法包括下列步骤：制备具有马来酰亚胺基和任选的接头的经修饰治疗性寡核苷酸；将治疗有效量的经修饰治疗性寡核苷酸施用于人类患者以形成清蛋白缀合物；清蛋白缀合物通过内吞或其它机制进入细胞；和治疗性寡核苷酸与异常表达的基因特异杂交，从而抑制基因表达。
在本发明的一个实施方案中，在检测到癌细胞的存在后立即进行施用，从而在血流中维持寡核苷酸。治疗性寡核苷酸还可以与手术联合使用，以堵塞迁移的窗口并防止经血液的进一步转移作用。本发明的寡核苷酸还可用于慢性或晚期癌症以降低任何癌症的进一步转移扩散。
在本发明的另一个实施方案中，将本发明的治疗性寡核苷酸以预防方式用于在展示易发展成疾病或紊乱的体质的个体中防止相同疾病或紊乱。
在生理学可接收介质(如去离子水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、盐水、含水乙醇或其它醇、血浆、蛋白质溶液、甘露醇、含水葡萄糖、植物油、诸如此类)中施用经修饰的治疗性寡核苷酸。还可以包括缓冲剂(特别是其中介质通常缓冲于pH范围大约5-10，缓冲剂的浓度范围通常是大约50-250mM)、盐(盐浓度的范围通常是大约5-500mM)、生理学可接收稳定剂、诸如此类。可以将化合物冷冻干燥以便于贮藏和运输。
可以对哺乳动物宿主的血液监测治疗性寡核苷酸的活性和/或经修饰治疗性寡核苷酸的存在。通过在不同时间由宿主采集一部分血样，可以测定治疗性寡核苷酸是否已经以有效治疗的足够浓度结合了长命移动蛋白及其后血液中的治疗性寡核苷酸水平。如果需要，还可以鉴定治疗性寡核苷酸所结合的具体移动蛋白。这在使用非特异治疗性寡核苷酸时是特别重要的。对于含马来酰亚胺的特异治疗性寡核苷酸，计算血清清蛋白和IgG的半衰期要简单得多。
实施例
实施例1：反义寡核苷酸合成
由Trilink生物技术公司(圣迭戈，加利福尼亚州)以硫代磷酸酯主链合成了特异反义寡核苷酸MB003和MB006。ASO MB003和MB006针对人bcl-xl基因的mRNA转录本(参阅Simoes-Wust等人，Int.J.Cancer，87：582-590，2000；美国专利号6,214,986)。已经发现人bcl-xl基因的过度表达与许多癌细胞有关。因此，使用对人bcl-xl基因特异的ASO进行治疗应当降低或消除多种癌细胞的增殖或生长。下文列出了MB003和MB006 ASO的序列：
MB-003：5’-AAAGTATCCCAGCCGCCGTT-3’    (SEQ ID NO：21)
MB-006：5’-TCCCGGTTGCTCTGAGACAT-3’    (SEQ ID NO：22)
另外，合成了如图1所示含有5′-(BMPS)(C6NH)接头和马来酰亚胺反应性基团的两种ASO。标为MB-003M和MB-006M的这两种ASO具有与Pierce的N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)反应性试剂缀合的5′六碳接头。因此，MB-003M和MB-006M的结构表述如下：
MB-003M：5’-(BMPS)(C6NH)AAAGTATCCCAGCCGCCGTT-3’(SEQ ID NO：21)
MB-006M：5’-(BMPS)(C6NH)TCCCGGTTGCTCTGAGACAT-3’(SEQ ID NO：22)
使用标准的phosphoramidite化学(Gait，M.J.，《OligonucleotideSynthesis，a practical approach》(《寡核苷酸合成，一种实用方法》)，牛津大学出版社，纽约，1984)在ABI Expedite 8909 DNA合成仪上合成了硫代磷酸酯寡核苷酸。用AMA脱保护后(Reddy，M.P.等人，Tetrahedron Lett.，35(25)：4311-4314，1994)，在Waters μBondapak C-18管上使用50mM醋酸三乙胺中的乙腈梯度，通过反相HPLC纯化寡聚物。
以相似方式合成经接头修饰的寡核苷酸，不同的是使用MMT-C-6氨基接头phosphoramidite将C-6氨基接头加到寡核苷酸的5′末端(Trilink生物技术公司，圣迭戈，加利福尼亚州)。纯化并从胺除去保护基团后，使用制造商推荐的条件将寡核苷酸缀合至N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)(Pierce，密尔沃基，成斯康星州)。使用10ml床体积的大小排阻层析柱(LH-20，Pharmacia，皮斯卡塔韦，新泽西州)除去过量的BMPS。
HSA-缀合物制备
合成MB-003M和MB-006M修饰ASO后，在人血清清蛋白(HSA)与MB-003M和MB-006M ASO之间形成蛋白质缀合物。更具体的说，分开且分别加入MB-003M和MB-006M与HSA反应，并于37℃保温以促进缀合物的形成。通过SDS-PAGE和HPLC确认HSA-缀合物的合成以测定缀合程度。凝胶或HPLC图谱与未反应HSA相比的变化证明了MB-003M和MB-006M ASO与HSA之间缀合物的成功形成。
体外稳定性评估
测试了MB-003M和MB-006M HSA缀合物对于核酸酶降解的体外稳定性。具体而言，将HSA-缀合物与内切核酸酶一起于特定反应参数下保温一定时间。保温后，使用SDS-PAGE和HPLC分析样品，并与未接受核酸酶活性处理的样品进行比较。
体外活性评估
按如下在体外测试了MB-003M和MB-006M HSA缀合物的特异活性：将选择的癌细胞系分别与MB-003M和MB-006M HSA缀合物一起保温，并测定与未处理对照细胞相比的缀合物活性的效果。人bcl-xl基因过度表达的降低和/或抑制指示了MB-003M和/或MB-006M HSA缀合物在缀合形式中具有有效的ASO活性。
实施例2：本发明的siRNA缀合物
合成了由具有反应性基团的经修饰siRNA构成的本发明治疗性寡核苷酸。首先，使用已知技术合成双链体RNA的“有义”链。在3′末端添加N3_9S-MPA接头(图2)而合成“有义”链。回收并纯化具有接头的合成链。使用已知技术合成、回收、并纯化与有义链互补的另一条RNA链。
纯化后，将“有义”RNA链与互补RNA链一起退火而生成siRNA双链体分子。退火后，进行认为必要的任何其它纯化步骤。
除了上文描述和实施例中的具体描述，显然可以以其它方式实现本发明。根据上文传授可以对本发明进行许多修改和变化，并因而属于所附权利要求的范围内。
将发明背景、详述、和实施例中引用的每份文件(包括专利、专利申请、杂志论文、摘要、实验室指南、书、或其它公开物)的完整公开内容收入本文作为参考。另外，将本文提交的序列表的硬拷贝和相应的计算机可读格式(CRF)都完整收入本文作为参考。
2002年2月13日提交的美国临时专利申请序列号60/356,053公开了本发明的某些治疗性寡核苷酸以及使用这些治疗性寡核苷酸的治疗方法，将该文件完整收入本文作为参考。

Claims (131)

1.通过对有需要的患者施用治疗性寡核苷酸来治疗疾病的方法，包括对患者施用包含反应性基团的治疗性寡核苷酸，反应性基团通过与移动蛋白的反应而形成共价键，以此将所述移动蛋白与所述治疗性寡核苷酸缀合。
2.权利要求1的方法，其中所述反应性基团通过连接基团与寡核苷酸键合。
3.权利要求2的方法，其中所述连接基团选自下组：(a)烷基；(b)烷氧基；(c)烯基；(d)炔基；(e)被烷基取代的氨基；(f)环烷基；(g)多环基；(h)被取代的杂环基；(i)聚乙氧基氨基酸；(i)肽核酸；(k)5′C6氨基接头；和(l)3′氨基-9原子接头。
4.权利要求3的方法，其中连接基团包含4-12个碳原子。
5.权利要求3的方法，其中连接基团包含聚乙氧基氨基酸。
6.权利要求2或3的方法，其中所述连接基团包含与DNA或RNA靶中至少15个碱基的部分杂交的寡核苷酸。
7.权利要求2或3的方法，其中所述连接基团包含在严谨杂交条件下与治疗性寡核苷酸中至少15个碱基的部分杂交的寡核苷酸。
8.权利要求2或3的方法，其中所述连接基团包含不与DNA或RNA靶杂交的寡核苷酸。
9.权利要求1或2的方法，其中反应性基团选自下组：(a)琥珀酰亚胺基；(b)马来酰亚胺基；(c)肼基；和(d)羰基。
10.权利要求9的方法，其中反应性基团是马来酰亚胺基。
11.权利要求1的方法，其中移动蛋白是血液蛋白。
12.权利要求11的方法，其中血液蛋白选自下组：(a)人血清清蛋白；(b)人转铁蛋白；(c)人铁蛋白；和(d)人免疫球蛋白。
13.权利要求12的方法，其中血液蛋白是人血清清蛋白。
14.权利要求1的方法，其中疾病是高增殖性疾病。
15.权利要求1的方法，其中疾病是自身免疫性疾病。
16.权利要求1的方法，其中疾病是病毒感染。
17.权利要求1的方法，其中疾病是细菌感染。
18.权利要求1的方法，其中疾病是内分泌紊乱。
19.权利要求1的方法，其中疾病是神经紊乱。
20.权利要求1的方法，其中疾病是心血管疾病。
21.权利要求1的方法，其中疾病是肺部疾病。
22.权利要求1的方法，其中疾病是生殖***疾病。
23.权利要求1的方法，其中反应性基团能够在体内与移动蛋白形成共价键。
24.权利要求1的方法，其中反应性基团能够离体与移动蛋白形成共价键。
25.权利要求1-24任一项的方法，包括施用包含所述治疗性寡核苷酸和制药学可接受载体的组合物。
26.权利要求12或13的方法，其中人血清清蛋白是天然存在的人血清清蛋白。
27.权利要求12或13的方法，其中人血清清蛋白是重组人血清清蛋白。
28.权利要求12或13的方法，其中人血清清蛋白是SEQ ID NO：23的片段。
29.权利要求12或13的方法，其中人血清清蛋白是SEQ ID NO：23的变体。
30.通过对有需要的患者施用治疗性寡核苷酸来治疗疾病的方法，包括对患者施用通过共价键与移动蛋白缀合的治疗性寡核苷酸。
31.权利要求30的方法，其中所述反应性基团通过连接基团与寡核苷酸键合。
32.权利要求31的方法，其中所述连接基团选自下组：(a)烷基；(b)烷氧基；(c)烯基；(d)炔基；(e)被烷基取代的氨基；(f)环烷基；(g)多环基；(h)被取代的杂环基；(i)聚乙氧基氨基酸；(j)肽核酸；(k)5′C6氨基接头；和(l)3′氨基-9原子接头。
33.权利要求32的方法，其中连接基团包含4-12个碳原子。
34.权利要求32的方法，其中连接基团包含聚乙氧基氨基酸。
35.权利要求31或32的方法，其中所述连接基团包含与DNA或RNA靶中至少16个碱基的部分杂交的寡核苷酸。
36.权利要求31或32的方法，其中所述连接基团包含在严谨杂交条件下与治疗性寡核苷酸中至少16个碱基的部分杂交的寡核苷酸。
37.权利要求31或32的方法，其中所述连接基团包含不与DNA或RNA靶杂交的寡核苷酸。
38.权利要求30或31的方法，其中反应性基团选自下组：(a)琥珀酰亚胺基；(b)马来酰亚胺基；(c)肼基；和(d)羰基。
39.权利要求38的方法，其中反应性基团是马来酰亚胺基。
40.权利要求30的方法，其中移动蛋白是血液蛋白。
41.权利要求40的方法，其中血液蛋白选自下组：(a)人血清清蛋白；(b)人转铁蛋白；(c)人铁蛋白；和(d)人免疫球蛋白。
42.权利要求41的方法，其中血液蛋白是人血清清蛋白。
43.权利要求30的方法，其中疾病是高增殖性疾病。
44.权利要求30的方法，其中疾病是自身免疫性疾病。
45.权利要求30的方法，其中疾病是病毒感染。
46.权利要求30的方法，其中疾病是细菌感染。
47.权利要求30的方法，其中疾病是内分泌紊乱。
48.权利要求30的方法，其中疾病是神经紊乱。
49.权利要求30的方法，其中疾病是心血管疾病。
50.权利要求30的方法，其中疾病是肺部疾病。
51.权利要求30的方法，其中疾病是生殖***疾病。
52.权利要求30的方法，其中反应性基团能够在体内与移动蛋白形成共价键。
53.权利要求30的方法，其中反应性基团能够离体与移动蛋白形成共价键。
54.权利要求30-53任一项的方法，包括施用包含所述治疗性寡核苷酸和制药学可接受载体的组合物。
55.权利要求31或32的方法，其中人血清清蛋白是天然存在的人血清清蛋白。
56.权利要求31或32的方法，其中人血清清蛋白是重组人血清清蛋白。
57.权利要求41或42的方法，其中人血清清蛋白是SEQ ID NO：23的片段。
58.权利要求41或42的方法，其中人血清清蛋白是SEQ ID NO：23的变体。
59.治疗疾病的方法，包括对有需要的患者施用包含反应性基团的双链RNA双链体，反应性基团通过与移动蛋白的反应而形成共价键，以此将所述移动蛋白与所述双链RNA双链体缀合。
60.权利要求59的方法，其中双链RNA双链体的每条链的长度是15-30个碱基。
61.权利要求59的方法，其中RNA双链体的一条链的序列与RNA或DNA靶中15-30个碱基的部分共享至少90％同源性。
62.权利要求59的方法，其中RNA双链体的一条链的序列与RNA或DNA靶中15-30个碱基的部分共享100％同源性。
63.权利要求59的方法，其中RNA双链体指导对靶RNA的核酸酶切割。
64.权利要求59的方法，其中RNA双链体的至少一个3′末端包含1-3个碱基的突出序列。
65.权利要求59的方法，其中RNA双链体的两个3′末端都包含1-3个碱基的突出序列。
66.权利要求64或65的方法，其中RNA双链体的3′末端由2个突出碱基组成。
67.权利要求59的方法，其中所述反应性基团在双链体四个末端中的任一个与双链RNA双链体键合。
68.权利要求59的方法，其中所述反应性基团通过连接基团与寡核苷酸键合。
69.权利要求68的方法，其中所述连接基团选自下组：(a)烷基；(b)烷氧基；(c)烯基；(d)炔基；(e)被烷基取代的氨基；(f)环烷基；(g)多环基；(h)被取代的杂环基；(i)聚乙氧基氨基酸；(j)肽核酸；(k)5′C6氨基接头；和(l)3′氨基-9原子接头。
70.权利要求69的方法，其中连接基团包含4-12个碳原子。
71.权利要求69的方法，其中连接基团包含聚乙氧基氨基酸。
72.权利要求59或68的方法，其中反应性基团选自下组：(a)琥珀酰亚胺基；(b)马来酰亚胺基；(c)肼基；和(d)羰基。
73.权利要求72的方法，其中反应性基团是马来酰亚胺基。
74.权利要求59的方法，其中移动蛋白是血液蛋白。
75.权利要求74的方法，其中血液蛋白选自下组：(a)人血清清蛋白；(b)人转铁蛋白；(c)人铁蛋白；和(d)人免疫球蛋白。
76.权利要求75的方法，其中血液蛋白是人血清清蛋白。
77.权利要求59的方法，其中疾病是高增殖性疾病。
78.权利要求59的方法，其中疾病是自身免疫性疾病。
79.权利要求59的方法，其中疾病是病毒感染。
80.权利要求59的方法，其中疾病是细菌感染。
81.权利要求59的方法，其中疾病是内分泌紊乱。
82.权利要求59的方法，其中疾病是神经紊乱。
83.权利要求59的方法，其中疾病是心血管疾病。
84.权利要求59的方法，其中疾病是肺部疾病。
85.权利要求59的方法，其中疾病是生殖***疾病。
86.权利要求59的方法，其中反应性基团能够在体内与移动蛋白形成共价键。
87.权利要求59的方法，其中反应性基团能够离体与移动蛋白形成共价键。
88.权利要求59-87任一项的方法，包括施用包含所述治疗性寡核苷酸和制药学可接受载体的组合物。
89.权利要求75或76的方法，其中人血清清蛋白是天然存在的人血清清蛋白。
90.权利要求75或76的方法，其中人血清清蛋白是重组人血清清蛋白。
91.权利要求75或76的方法，其中人血清清蛋白是SEQ ID NO：23的片段。
92.权利要求75或76的方法，其中人血清清蛋白是SEQ ID NO：23的变体。
93.治疗疾病的方法，包括对有需要的患者施用通过共价键与移动蛋白缀合的双链RNA双链体。
94.权利要求93的方法，其中双链RNA双链体的每条链的长度是15-30个碱基。
95.权利要求93的方法，其中RNA双链体的一条链的序列与RNA或DNA靶中15-30个碱基的部分共享至少90％同源性。
96.权利要求93的方法，其中RNA双链体的一条链的序列与RNA或DNA靶中15-30个碱基的部分共享100％同源性。
97.权利要求93的方法，其中RNA双链体指导对靶RNA的核酸酶切割。
98.权利要求93的方法，其中RNA双链体的至少一个3′末端包含1-3个碱基的突出序列。
99.权利要求93的方法，其中RNA双链体的两个3′末端都包含1-3个碱基的突出序列。
100.权利要求98或99的方法，其中RNA双链体的3′末端由2个突出碱基组成。
101.权利要求93的方法，其中所述反应性基团在双链体四个末端中的任一个与双链RNA双链体键合。
102.权利要求93的方法，其中所述反应性基团通过连接基团与寡核苷酸键合。
103.权利要求102的方法，其中所述连接基团选自下组：(a)烷基；(b)烷氧基；(c)烯基；(d)炔基；(e)被烷基取代的氨基；(f)环烷基；(g)多环基；(h)被取代的杂环基；(i)聚乙氧基氨基酸；(j)肽核酸；(k)5′C6氨基接头；和(l)3′氨基-9原子接头。
104.权利要求103的方法，其中连接基团包含4-12个碳原子。
105.权利要求103的方法，其中连接基团包含聚乙氧基氨基酸。
106.权利要求93或102的方法，其中反应性基团选自下组：(a)琥珀酰亚胺基；(b)马来酰亚胺基；(c)肼基；和(d)羰基。
107.权利要求106的方法，其中反应性基团是马来酰亚胺基。
108.权利要求93的方法，其中移动蛋白是血液蛋白。
109.权利要求108的方法，其中血液蛋白选自下组：(a)人血清清蛋白；(b)人转铁蛋白；(c)人铁蛋白；和(d)人免疫球蛋白。
110.权利要求109的方法，其中血液蛋白是人血清清蛋白。
111.权利要求93的方法，其中疾病是高增殖性疾病。
112.权利要求93的方法，其中疾病是自身免疫性疾病。
113.权利要求93的方法，其中疾病是病毒感染。
114.权利要求93的方法，其中疾病是细菌感染。
115.权利要求93的方法，其中疾病是内分泌紊乱。
116.权利要求93的方法，其中疾病是神经紊乱。
117.权利要求93的方法，其中疾病是心血管疾病。
118.权利要求93的方法，其中疾病是肺部疾病。
119.权利要求93的方法，其中疾病是生殖***疾病。
120.权利要求93的方法，其中反应性基团能够在体内与移动蛋白形成共价键。
121.权利要求93的方法，其中反应性基团能够离体与移动蛋白形成共价键。
122.权利要求93-121任一项的方法，包括施用包含所述治疗性寡核苷酸和制药学可接受载体的组合物。
123.权利要求109或110的方法，其中人血清清蛋白是天然存在的人血清清蛋白。
124.权利要求109或110的方法，其中人血清清蛋白是重组人血清清蛋白。
125.权利要求109或110的方法，其中人血清清蛋白是SEQ IDNO：23的片段。
126.权利要求109或110的方法，其中人血清清蛋白是SEQ IDNO：23的变体。
127.长度为15-30个碱基的治疗性寡核苷酸，包含结合RNA或DNA靶的部分，还包含与该寡核苷酸键合的反应性基团，反应性基团通过与移动蛋白的反应而形成共价键，以此将所述移动蛋白缀合至所述治疗性寡核苷酸。
128.长度为15-30个碱基、包含反应性基团的治疗性寡核苷酸，反应性基团通过与移动蛋白的反应而与所述移动蛋白形成共价键，其中所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：1-22。
129.长度为15-30个碱基、包含结合RNA或DNA靶的部分的治疗性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸通过共价键与移动蛋白缀合。
130.包含含有反应性基团的双链RNA双链体的治疗性寡核苷酸，反应性基团通过与移动蛋白的反应而形成共价键，以此将所述移动蛋白与所述双链RNA双链体缀合。
131.包含通过共价键与移动蛋白缀合的双链RNA双链体的治疗性寡核苷酸。
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