JP5523705B2 - Mir−122aをモジュレートする使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2005年8月29日に出願された米国仮出願番号第60/712,211号、2005年10月28日に出願された米国仮出願番号第60/731,377号および2006年2月7日に出願された米国仮出願番号第60/771,592号に対する優先権を主張し、その各々はその全部が出典明示により本明細書中の一部とされる。
本発明は、小さい非コードRNA、特にmiR−122aをモジュレートする方法を提供する。miR−122aのレベルまたは活性を阻害するアンチセンス化合物の投与を通じて、高血清総コレステロール、高血清LDLコレステロールまたは高血清トリグリセリドによって特徴づけられる心血管疾患または代謝性疾患の処置方法が、提供される。さらに、miR−122aのレベルまたは活性を阻害するアンチセンス化合物の投与を通じて、肝臓脂肪症または肝組織トリグリセリド蓄積を低下させる方法が、提供される。該方法は、miR−122aを含むもしくはコードする核酸分子とハイブリダイズするか、または立体的に干渉するアンチセンス化合物を用いる。そのようなアンチセンス化合物は該アンチセンス化合物の活性、安定性またはヌクレアーゼ抵抗性を改善し得る1つまたはそれ以上の修飾をそれ上に含んでもよい。これらの修飾されたアンチセンス化合物は、単一の化合物として、または、医薬組成物を含む組成物で、miR−122aを阻害するために用いられる。
本発明は、高トリグリセリドレベルを有する動物を選択すること、それから、該動物にmiR−122a核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量を投与することを含む、動物のトリグリセリドレベルを低下させる方法をさらに提供する。トリグリセリドレベルは、血清トリグリセリドレベルまたは肝組織トリグリセリドレベルであってよい。
本発明は、肝臓脂肪症を有する動物を選択すること、および該動物にmiR−122a核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量を投与することを含む、動物の肝臓脂肪症を軽減させる方法を提供する。肝臓脂肪症は、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎であってよい。
本発明は、動物にmiR−122a核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量を投与することを含む、動物の代謝経路をモジュレートする方法を提供する。代謝経路は、脂質生成、脂肪酸酸化、脂肪酸合成速度またはステロール合成から選択される。本方法は、脂質生成を低下させるか、脂肪酸合成速度を低下させるか、ステロール合成を低下させるか、または脂肪酸酸化を増加させることを提供する。
また、糖尿病、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、非アルコール性脂肪肝疾病、非アルコール性脂肪性肝炎または代謝症候群から選択される心血管疾患または代謝性疾患または障害を処置する方法が提供される。動物は、miR−122a核酸に本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量の投与を通じて処置される。
本発明は、さらに、糖尿病、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、非アルコール性脂肪肝疾病、非アルコール性脂肪性肝炎または代謝症候群から選択される疾病または障害を処置するための医薬の調製における、miR−122a核酸と本質的に完全に相補的なアンチセンス化合物の使用を提供する。
本発明は、高血清コレステロールレベル、高血清トリグリセリドレベルまたは高肝臓トリグリセリドレベルによって特徴づけられる疾病または健康状態の処置のための方法を提供する。これらの疾病または健康状態は、血漿アミノ基転移酵素の増加により測定されるような、損なわれた肝機能によってさらに特徴づけられ得る。
本明細書中で用いられる「miR−122aまたはその前駆体」は、miR−122a、pre−miR−122a、pri−miR−122a、またはmiR−122aあるいはその前駆体が誘導される一次RNA転写産物を含む。
本明細書中で用いられる「miR−122a標的核酸」は、pri−miR−122a、pre−miR−122aおよびmiR−122aを含む。
本明細書中で用いられる用語「miR−122aシード配列」は、miR−122a配列の5’末端からの2個〜8個のヌクレオシドを意味する。本発明の関係において、miR−122aシード配列は、5’−GGAGUGU−3’である
本発明は、1つまたはそれ以上の改変または構造要素またはその化合物をmiR-122aまたはその前駆体を模倣もしくは置換させ得るモチーフを含む「miR−122a模倣体」として知られている、アンチセンス化合物もまた提供する。
miR−122aを標的とするアンチセンス化合物およびその組成物の特異性と感受性は、治療的使用に当業者により利用され得る。様々な治療領域で、他の標的物に対するアンチセンス化合物を試験するための多くの臨床試験が現在行われている。
本明細書中で用いられる「予防上の有効量」は、ヒトに投与した場合に前記の疾病または健康状態の1つまたはそれ以上に対するヒトの罹病性を予防もしくは低下させる、miR−122a核酸を標的とするアンチセンス化合物の量である。前記の疾病または健康状態に対するヒトの罹病性の予防または低下は、高血清総コレステロール、高血清LDLコレステロール、高血清トリグリセリド、高肝臓トリグリセリド、肝臓脂肪症、異常な肝機能または脂肪酸酸化の低下を防ぐことによって達成され得る。
本明細書記載の実施形態は、心血管疾患リスクの血清指標を減少するための医薬の調製における、miR−122a核酸を標的とするアンチセンス化合物の使用を提供し、該血清指標は、高血清総コレステロール、高血清LDLコレステロールまたは高血清トリグリセリドから選択される。
miR−122a阻害の代替指標の好ましい変化は、減少の血清LDLコレステロールレベル、減少の血清トリグリセリドレベル、減少のリポ蛋白質レベルを含む。これらの前記変化は臨床上望ましく、本明細書中で開示される疾病および障害の予防、改善および/または処置に有用である。
肝臓脂肪症の検出方法は、当分野で周知であり、磁気共鳴映像法、コンピューター断層撮影および超音波検査が挙げられる。肝臓脂肪症の検出に用いられる方法は、本明細書中で開示される疾病および障害の予防、改善および/または処置をモニターするために用いることができる。
本発明のアンチセンス化合物および組成物は、さらなる研究と創薬のために利用され得る。
研究での使用について、本発明のアンチセンス化合物は、miR-122a標的核酸の通常の機能と干渉させるために用いられる。本発明の1つまたはそれ以上アンチセンス化合物または組成物で処置された細胞または組織中の発現パターンは、アンチセンス化合物または組成物で処置されていない対照細胞または組織と比較され、そして、それらは、例えば試験される遺伝子の疾病関連性、シグナル伝達経路、細胞局在、発現レベル、大きさ、構造または機能に関係するので、得られる発現パターンが核酸発現の様々なレベルについて分析される。これらの分析は、刺激されたまたは刺激されていない細胞において、そして発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の有無において実施され得る。例として、miR−122aを標的とするアンチセンス化合物は、miR−122a調節に影響される代謝経路を解明するために用いられた。
本発明の関係において、用語「オリゴマー化合物(群)」は、少なくともRNA分子のある領域にハイブリダイズできる重合体構築物を意味する。一般に、5’から3’方向に記載され、それが標的核酸の対応する領域の逆相補性を含む場合、オリゴマー化合物は標的核酸に対して「アンチセンス」である。そのようなオリゴマー化合物は、「アンチセンス化合物」として知られており、それには、限定するものではないが、オリゴヌクレオチド(すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド)、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体およびこれらの組み合わせが含まれる。一般に、アンチセンス化合物は、連結された単量体サブユニットの骨格(糖部分)を含み、そこで、各々連結された単量体サブユニットは、複素環式の塩基部分と直接または間接的に連結される。アンチセンス化合物に対する修飾は、ヌクレオシド内結合、糖部分または複素環式の塩基部分(例えば後述のもの)への置換または変化を包含する。本明細書中で用いられる用語「修飾」は、最初もしくは天然ヌクレオシドまたはヌクレオチドからの置換および/またはいずれかの変化を含む。修飾されたアンチセンス化合物は、所望の特性、例えば増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された結合性、ヌクレアーゼ存在下での増大した安定性または増大した阻害活性のため、しばしば天然型より好まれる。アンチセンス化合物は、標的とハイブリダイズした際に、標的遺伝子発現または標的遺伝子活性の低下を誘導するかもしくは誘発することが可能であるとのさらなる限定を含むものとして、当分野でしばしば定義される。1つの実施形態において、アンチセンス化合物は、miR−122a核酸標的のレベル、活性または発現の低下を誘発する。
本発明によるアンチセンス化合物は、15〜30のヌクレオシド長、すなわち、15個から30個の連結されたヌクレオシドを含む。当業者であれば、これが15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30ヌクレオシド長のアンチセンス化合物を例示することは認められよう。
1つの実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、本明細書中で例示されるように17〜25ヌクレオシド長である。
好ましい実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、19、20、21、22または、23ヌクレオシド長である。
本明細書中で用いられて、用語「約」は、以後可変部分の±5%を意味する。
miR−122a核酸を含む特定の核酸分子に対してアンチセンス化合物を「標的化する」ことは、この発明の関係では多段階過程であってもよい。通常、この過程は、モジュレートされるべき標的核酸のレベル、発現または機能の同定から始まる。本発明の関係において、標的核酸は、miR−122a標的核酸である。
本発明のアンチセンス化合物はまた、標的部位の部分に対して相補的と記載されてもよい。「部分」は、標的部位の少なくとも18個の連続ヌクレオシドと定義される。他の実施形態において、部分は標的部位の19個または20個の連続ヌクレオシドである。好ましい実施形態において、部分は標的部位の21個または22個の連続ヌクレオシドである。
ひとたび1個またはそれ以上の標的部分または標的部位が認められると、アンチセンス化合物は、標的部分または標的部位に十分相補的となるように、すなわち、十分によく特異的にハイブリダイズし所望の効果を与えるように、設計される。所望の効果には、限定するものではないが、miR−122a標的核酸のレベル、発現または活性のモジュレーションが含まれ得る。所望の効果は、表現型変化をさらに含む。
アンチセンス化合物とホスホラミダイトは、当業者に周知の方法によって作製される。修飾および非修飾ヌクレオシドのオリゴマー形成は、必要に応じて、DNA様化合物合成(Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press)および/またはRNA様化合物合成(Scaringe、Methods(2001)、23、206-217. Gaitら、Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Galloら、Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713)に関する文献手順によって実施される。RNAオリゴマーは、本明細書中で開示される方法により合成されてもよいし、様々なRNA合成会社、例えば、Dharmacon Research社(ラフィーエット、CO)から購入してもよい。
オリゴヌクレオチドの単離および分析法は、当分野で周知である。96ウエルプレート形式は、特にオリゴヌクレオチドの合成、単離および分析に有用である。
RNAの合成法は、当分野で周知である(Scaringe, S. A. Ph.D. Thesis, University of Colorado, 1996;Scaringe, S. Aら、J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 11820-11821;Matteucci, M. D.およびCaruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 3185-3191;Beaucage, S. L.およびCaruthers, M. H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862;Dahl, B. Jら、Acta Chem. Scand,. 1990, 44, 639-641;Reddy, M. Pら、Tetrahedrom Lett., 1994, 25, 4311-4314;Wincott, F.ら、Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684;Griffin, B. Eら、Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313;Griffin, B. Eら、Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331)。
本明細書中で教示されるアンチセンス化合物のいずれも、限定するものではないが、改善された結合親和性、安定性、電荷、局在性または取込みを含む、アンチセンス化合物に所望の薬物動態学的および/または薬力学的特性を与える修飾を含んでいてよい。さらに、本発明の修飾合成アンチセンス化合物は、内因性低分子非コードRNAを模倣して設計されてもよい。
この発明で有用なアンチセンス化合物の特定の例としては、修飾された、すなわち非天然のヌクレオシド内結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。そのような非天然ヌクレオシド内結合は、所望の特性、例えば増加した細胞取込み、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的について増強された結合性およびヌクレアーゼ存在下での増大した安定性のため、天然型よりもしばしば選択される。
本発明のアンチセンス化合物は、1つまたはそれ以上の修飾されたヌクレオシド内結合を有してもよい。本明細書で定義されるように、修飾されたヌクレオシド内結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を有するヌクレオシド内結合と、リン原子を有しないヌクレオシド内結合がある。本明細書の目的に関し、また当分野で場合により言及されるように、ヌクレオシド内骨格にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオシド」と見做すことができる。
オリゴヌクレオチド模倣体の別の種類は、シクロヘキセニル核酸(CeNA)と称される。DNA/RNA分子中に通常存在するフラノース環が、シクロヘキセニル環で置換される。CeNA DMT保護ホスホラミダイト・モノマーが調製され、典型的なホスホラミダイト化学にならいアンチセンス化合物の合成に用いた。CeNAで修飾された特定の部位を有し、完全に修飾されたCeNAアンチセンス化合物およびオリゴヌクレオチドが調製されて、研究された(Wangら、J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602を参照のこと)。
本発明のアンチセンス化合物は、1つまたはそれ以上の修飾または置換された糖部分を含んでいてもよい。塩基部分(天然、修飾型またはその組み合わせ)は、適当な核酸標的とのハイブリダイゼーションを維持する。糖修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性またはいくつかの他の有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に与え得る。代表的な修飾された糖は、炭素環式もしくは非環式の糖、その2’、3’もしくは4’部位の1個またはそれ以上に置換基を有する糖、糖の1個またはそれ以上の水素原子の代わりに置換基を有する糖および糖中のいずれか2個の他の原子の間に連結を有する糖を含む。本発明で特定の使用におけるアンチセンス化合物は、OH;ハロ;O−、S−またはN−アルキル;O−、S−またはN−アルケニル;O−、S−またはN−アルキニル;または、O−アルキル−O−アルキル(ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換もしくは未置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルである)から選択される糖置換基を含んでもよい。特に適切なものは、O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2およびO(CH2)nON((CH2)nCH3)2であり、ここで、nおよびmは、0から約10までである。いくつかのオリゴヌクレオチドは、C1〜C10低アルキル、置換低アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O−アルカリルもしくはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター遺伝子、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および類似の特性を有する他の置換基、から選択される糖置換基を含む。
さらなる修飾は、2’−ジメチルアミノフェノール、すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2基、別名2’−DMAOE、および2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(また、当分野で2’−O−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは2’−DMAEOEとして知られる)、すなわち2’−O−CH2−O−CH2−N(CH3)2を含む。
代表的な環式置換基は、標題「RNA Targeted 2’Oligomeric compounds that are Conformationally Preorganized」の米国特許第6,271,358号で開示されており、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
代表的なグアニジノ置換基は、標題「Functionalized Oligomers」の米国特許第6,593,466号で開示されており、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
代表的なアセトアミド置換基は、米国特許第6,147,200号で開示されており、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、1999年8月6日に出願された標題「2’-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Oligomeric compounds」の国際特許出願PCT/US99/17895で開示されており、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
オリゴヌクレオチド模倣体の別の種類は、ホスホノモノエステル核酸と称され、骨格にリン基を含む。この種類のオリゴヌクレオチド模倣体は、遺伝子発現を阻害する領域で有用な物理的および生物学的そして薬理学特性を有することが報告されている。
本発明のアンチセンス化合物は、天然もしくは合成の非修飾核酸塩基と、構造的に識別可能であるが、機能的に交換可能な1つまたはそれ以上核酸塩基(当分野では、しばしば単に「塩基」と称される)修飾または置換を含んでもよい。そのような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性またはいくつかの他の有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に与え得る。本明細書中で用いられる「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン(A)とグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)を含む。また、本明細書中で複素環式塩基部分と称される修飾された核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えば、5‐メチルシトシン(5−me−C)、5‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、6−メチルとアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、2−プロピルとアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、2‐チオウラシル、2−チオチミンと2−チオシトシン、5−ハロウラシルとシトシン、5−プロピニル(−C≡C−CH3)ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基、6−アゾウラシル、シトシンとチミンの他のアルキニル誘導体、5−ウラシル(シュードウラシル)、4‐チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよび他の8−置換アデニンとグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルとシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノ−アデニン、8‐アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニンおよび3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンを含む。
フェノキサジン誘導体の増強の結合親和性に加え、その配列特異性は、それらを、より強力なアンチセンスに基づく薬物開発の有益な核酸塩基類似体とする。実際に、フェノキサジン置換を含有するヘプタヌクレオチドが、RNaseHを活性化し、細胞取込みを増強し、そして増強されたアンチセンス活性を示し得ることを実際に示す有望なデータが、インビトロ実験から得られた(Lin, K-Y; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532)。この活性の増強は、単一の置換が20個のヌクレオシド、2’デオキシホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドのインビトロ効力の有意な改善を示すため、さらにGクランプとも称さる(Flanagan, W. M.;Wolf, J.J.;Olson, P.;Grant, D.;Lin, K.-Y.;Wagner, R. W.;Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3513-3518)。
本発明のアンチセンス化合物に付け加え得る1つの置換には、結果として生じるアンチセンス化合物の活性、細胞分布または細胞取込みを増強する1つまたはそれ以上の部分またはコンジュゲート結合が含まれる。1つの実施形態において、そのような修飾されたアンチセンス化合物は、コンジュゲート基を官能基(例えばヒドロキシルまたはアミノ基)に共有結合で結合させることにより調製される。本発明のコンジュゲート基は、インターカレータ、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール類、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、およびアンチセンス化合物の薬物動態学的特性を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基は、コレステロール部分と脂質部分を含む。さらなるコンジュゲート基は、炭水化物、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンと色素を含む。本発明の関係で薬力学的特性を増強する基は、アンチセンス化合物に、改善された取込み、分解に対する増強の抵抗性および/またはRNAとの増強のハイブリダイゼーションなどの特性を与える基を含む。この発明の関係で、薬物動態学的特性を増強する基には、アンチセンス化合物に、例えば改善された取込み、分布、代謝または排出などの特性を与える基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、1992年10月23日に出願された国際特許出願PCT/US92/09196に開示されており、その全開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
本発明のアンチセンス化合物は、化学的に修飾されたサブユニットが、そのアンチセンス化合物の阻害活性を増強するパターンにて配置されていてもよい。これらのパターンは、本明細書中「モチーフ」と記載され、それは均一に修飾されたモチーフ、位置的に修飾されたモチーフ、ギャップマー(gapmer)あるいはギャップした(gapped)モチーフ、交互(alternating)モチーフ、ヘミマー(hemimer)およびブロックマー(blockmer)モチーフを含む。
均一に、位置的に修飾された、交互の、ギャップマー、ヘミマーまたはブロックマーから選択されるモチーフを有する、本明細書記載のアンチセンス化合物のいずれも、本明細書に記載のようなヌクレオシド内結合修飾および/または核酸塩基修飾をさらに含んでいてもよい。
本明細書中で特に定義されない限り、ヘテロアルキルは、鎖の末端を含む鎖内に少なくとも1個、または約1個〜約3個のヘテロ原子を含む、C1−C12、C1−C8またはC1−C6の直鎖または(可能な場合には)分岐鎖脂肪族ヒドロカルビルを意味する。適切なヘテロ原子は、N、OおよびSを含む。
本明細書中で特に定義されない限り、アルケニルは、少なくとも1個の炭素−炭素二重結合を含む直鎖または(可能な場合には)分岐ヒドロカルビル部分であってよいC2−C12、C2−C8またはC2−C6アルケニルを意味する。
本明細書中で特に定義されない限り、アルキニルは、少なくとも1個の炭素−炭素三重結合を含む直鎖または(可能な場合には)分岐ヒドロカルビル部分であってよいC2−C12、C2−C8またはC2−C6アルキニルを意味する。
本明細書中で特に定義されない限り、ヘタリールは、炭素および非炭素原子からなる少なくとも1個の完全不飽和環を含む環部分を意味する。環系は、約1個〜約4個の環を含んでもよい。炭素原子数は、1個〜約12、1個〜約6まで変化してもよく、そして環メンバーの総数は3個〜約15個、または約3個〜約8個まで変化する。適切な環ヘテロ原子は、N、OおよびSである。適切な環ヘテロ原子は、N、OおよびSである。適切なヘタリール部分は、限定するものではないが、ピラゾリル、チオフェニル、ピリジル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、プリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチオフェニルなどを含む。
本明細書中で特に定義されない限り、電子吸引基は、電子電荷をそれが付随する炭素から引き離すシアノまたはイソシアナート基などの基である。重要な他の電子吸引基は、電気陰性が炭素のそれを上回るもの、例えば、ハロゲン、ニトロまたは1個またはそれ以上のシアノ、イソチオシアネート、ニトロもしくはハロ基でオルト位もしくはパラ位で置換されたフェニルを含む。
本明細書中で特に定義されない限り、用語ハロゲンおよびハロは、それらの通常の意味を有する。適切なハロ(ハロゲン)置換基は、F、Cl、BrおよびIである。
リン酸保護基は、米国特許第5,760,209号、米国特許第5,614,621号、米国特許第6,051,699号、米国特許第6,020,475号、米国特許第6,326,478号、米国特許第6,169,177号、米国特許第6,121,437号、米国特許第第6,465,628号(その各々は明らかにその全部が出典明示により本明細書の一部とされる)に記載のものが挙げられる。
miR−122a標的核酸の有効なモジュレーターを同定するためのスクリーニング法は、本発明によっても理解され、そして、miR−122a標的核酸またはその部分を1つまたはそれ以上の候補モジュレーターと接触させる工程、およびmiR−122a標的核酸のレベル、発現または機能を阻害する1つまたはそれ以上の候補モジュレーターを選択する工程も含む。本明細書中で記載されるように、候補モジュレーターは、pri−miRNA、またはそのいずれかの部分、成熟miRNA、Drosha認識領域、Drosha開裂領域、ヘアピンのステムまたはヘアピンのループを含む部分を標的とするアンチセンス化合物であってよい。候補モジュレーターは、miR−122a標的核酸、例えばpri−miR−122a内の構造領域の構造領域と結合する小分子化合物をさらに含む。候補モジュレーターまたはモジュレーターは、miR−122a標的核酸のレベル、発現または機能をモジュレートすることができる、好ましくは減少することができることが示されれば、そのモジュレーターはさらに調査研究に用いることができ、または、標的確認、研究、診断または本発明に従う治療薬としての使用のために用いることができる。
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物と組成物を含む医薬組成物と製剤を含む。組成物および医薬組成物の製剤法は、限定するものではないが、投与経路、疾病の範囲または投与される用量を含む多くの基準に依存する。このような考慮すべき問題は、当業者に十分理解される。
miR−122aにより調節されるmiR−122a標的核酸、蛋白質をコードするRNAのレベル、活性または発現におけるアンチセンス化合物の効果は、インビトロまたは様々な細胞型で試験することができる。そのような分析に用いられる細胞型は、商業ベンダーから入手可能であり(例えば、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、マナッサス、バージニア州;ゼン−バイオ社(Zen-Bio, Inc.)、リサーチトライアングルパーク、ニューカレドニア;クローンテック社(Clonetics Corporation)、ウォーカーズビル(Walkersville)、メリーランド州)、細胞は、市販の試薬(例えば、インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールズバッド、カリフォルニア州)を用い、ベンダーの指示に従って培養される。例示的な細胞型には、限定するものではないが、T−24細胞、A549細胞、正常ヒト***上皮細胞(HMEC)、MCF7細胞、T47D細胞、BJ細胞、B16−F10細胞、ヒト血管内皮細胞(HUVEC)、ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)細胞、ヒト胚性ケラチノサイト(HEK)、293T細胞、HepG2、ヒト前脂肪細胞、ヒト分化脂肪細胞(前脂肪細胞は、当分野で既知の方法に従って分化させた)、NT2細胞(別名NTERA−2 cl.D1)およびHeLa細胞を含む。
一般に、細胞が約60〜約80%の集密度に達した場合に、それらを本発明のアンチセンス化合物で処置する。
アンチセンス化合物を培養細胞に導入するために通常用いられる1つの試薬として、陽イオン脂質トランスフェクション試薬LIPOFECTIN(登録商標)(インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州)が含まれる。アンチセンス化合物の所望の終濃度およびを典型的に100nMのアンチセンス化合物につき2〜12μg/mLの範囲のLIPOFECTIN(登録商標)濃度にするため、アンチセンス化合物をOPTI−MEM(登録商標)1(インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州)中のLIPOFECTIN(登録商標)と混合した。
使用したアンチセンスの濃度は、細胞系から細胞系で異なる。特定の細胞系の最適のアンチセンス濃度を決定する方法は、当分野で周知である。アンチセンス化合物は、通常1nMから300nMの濃度範囲で用いられる。
RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAで行い得る。RNA単離法は、当分野で周知である。RNAは、製造業者の推奨されたプロトコルに従って、例えばTRIZOL(登録商標)試薬(インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州)を用い、当分野で周知の方法を用いて調製される。
miR−122a核酸のレベルまたは発現の阻害またはmiR−122a蛋白質をコードするRNA標的(例えばALDO A)のモジュレーションは、当分野で既知の様々な方法でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、例えばノーザンブロット解析、競争的ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)または定量リアルタイムPCRによって定量化できる。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAで行い得る。RNA単離法は当分野で周知である。ノーザンブロット解析も当分野では通常のものである。定量リアルタイムPCRは、PEアプライド・バイオシステム、フォスターシティー、カリフォルニア州、から入手可能な、市販のABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900のシークエンス・ディテクションシステムを用いて便利に達成でき、製造業者の指示に従って用いられる。
標的RNAレベルの定量化は、製造業者の指示に従ってABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900のシークエンス・ディテクションシステム(PEアプライド・バイオシステム、フォスターシティー、カリフォルニア州)を用い定量リアルタイムPCRによって達成される。定量リアルタイムPCRの方法は当分野で周知である。
リアルタイムPCRの前に、単離されたRNAは逆転写酵素(RT)反応にかけ、それによりリアルタイムPCR増幅の基質として用いられる相補DNA(cDNA)が産生される。RTとリアルタイムPCR反応は、同じ試料ウェルで順番に行われる。RTとリアルタイムPCR試薬は、インビトロジェン(カールズバッド、カリフォルニア州)から入手できる。RT、リアルタイムPCR反応は、当業者に周知の方法によって実施される。
または別々に実行し複合化させる、リアルタイムPCRによって定量される。全RNAは、RIBOGREEN(登録商標)RNA定量試薬(モレキュラープローブ社、ユージーン、オレゴン州)を用いて定量される。RIBOGREEN(登録商標)によるRNA定量化法は、Jones, L.J、ら(Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)にて示される。CYTOFLUOR(登録商標)4000機器(PEアプライドバイオシステム社)を用いて、RIBOGREEN(登録商標)蛍光を測定する。
プローブとプライマーは、miR−122aにより調節される蛋白質コードRNA(例えばALDO A)を含む標的配列にハイブリダイズするように設計される。リアルタイムPCRプローブとプライマーを設計する方法は、当分野で周知であり、ソフトウェア、例えばPRIMER EXPRESS(登録商標)ソフトウェア(アプライドバイオシステム、フォスターシティー、カリフォルニア州)の使用を含んでもよい。
ノーザンブロット解析は、当分野で既知の通常の手順によって行われる。より高い百分率のアクリルアミドゲル、例えば10〜15%アクリルアミドウレアゲルは、通常miRNAを分離するために用いられる。15〜20マイクログラムの全RNAを、TBE緩衝系を用いる10%アクリルアミドウレアゲル(インビトロジェン)を通じ、電気泳動により分離される。RNAは、Xcell SURELOCK(登録商標)ミニセル(インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州)で電気ブロットすることによって、ゲルからHYBOND(登録商標)−N+ナイロン膜(アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)に転写される。膜を、STRATALINKER(登録商標)UVクロスリンカー2400(ストラタジーン社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)を用いるUV架橋によって固定し、次いで、オリゴヌクレオチド・プローブに製造業者の推奨しているRAPID HYB(商標)緩衝液(アマシャム)を用いてプローブする。
miR−122aによってモジュレートされるか、または調節される下流の標的の蛋白質レベル(例えばALDO A)は、免疫沈降、ウェスタンブロット解析(免疫ブロット)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、定量的蛋白質アッセイ、蛋白質活性アッセイ(例えばカスパーゼ活性アッセイ)、免疫組織化学、免疫組織化学または蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)などの当分野で周知の様々な手段で、評価しまたは数量することができる。標的に対する抗体は、MSRSカタログの抗体(アエリー、バーミンガム、ミシガン州)など、様々な供給源から確認し入手することができるし、または当分野で周知の一般的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体産生法により調製することもできる。
本発明によれば、本発明のアンチセンス化合物は、正常マウス、痩せマウス、ob/obマウス、db/dbマウス、食餌性肥満マウス、ならびに極度の食餌性肥満マウスおよびラットモデルを含む、疾病の様々な動物モデルで試験される。
レプチンは、食欲を調節する脂肪細胞によって産生されるホルモンである。ヒトとヒト以外の動物の両方でこのホルモンの欠乏は、肥満を引き起こす。ob/obマウスは、レプチン遺伝子に変異を有し、その結果として肥満と高血糖となる。このように、これらのマウスは、肥満と糖尿病の研究に、およびこれらの病気を処置するために設計される処置の有用なモデルである。ob/obマウスは、高循環レベルのインスリンを示し、レプチン受容体に変異を有するdb/dbマウスよりも高血糖でない。db/dbマウスは、レプチン受容体遺伝子に変異を有し、その結果として肥満と高血糖となる。このように、これらのマウスは、肥満と糖尿病の研究に、およびこれらの病気の処置するために設計される処置の有用なモデルである。db/dbマウスは、低循環レベルのインスリンを示し、レプチン遺伝子に変異を有するob/obマウスよりさらに高血糖でり、II型糖尿病の齧歯類モデルとしてよく用いられる。
レヴィン・モデル(Levin Model)は、高脂肪食を与えた場合に耐糖能異常、異脂肪血症とインスリン抵抗性と関連した食餌性肥満(DIO)を発病するよう選択的に繁殖させたラットの多遺伝子性モデルである(Levinら、 Am. J. Physiol、1997、273、R725-30)。このモデルは、肥満および関連する合併症(例えば耐糖能異常、異脂肪血症およびインスリン抵抗性)に影響を及ぼすそれらの能力について、本発明のアンチセンス化合物を研究する際に有用である。
本明細書中で記載される例に加えて、本発明のさまざまな変更は、前述の説明から当業者には明らかである。そのような変更もまた、添付の請求の範囲の範囲内に含まれることを意図する。本明細書にて引用される各報文(限定するものではないが、学術誌記事、米国と米国以外の特許、特許出願公報、国際特許出願公報、GENBANKR(登録商標)受入番号などを含む)は、その全部が引用により本明細書の一部とする。
実施例1:pri−miRNA配列
pri−miR−122a配列は、本発明の特定の実施形態で、例えばmiR−122a核酸を標的とするアンチセンス化合物の設計に用いられた。ヒトpri−miR−122aの配列は、GENBANK(登録商標)受入番号NT_033907.3を有する配列から抽出され、配列番号:5(UGGCUACAGAGUUUCCUUAGCAGAGCUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCUAAACUAUCAAACGCCAUUAUCACACUAAAUAGCUACUGCUAGGCAAUCCUUCCCU)として本明細書中の一部とされる。マウスpri−miR−122a配列は、配列番号:6(UUCCUUAGCAGAGCUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCCAAACCAUCAAACGCCAUUAUCACACUAAAUAGCUACUG)として本明細書中の一部とされる。ラットpri−miR−122a配列は、配列番号:7(UCCUUAGCAGAGCUCUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCCAAAACAUCAAACGCCAUCAUCACACUAAACAGCUACUG)として本明細書中の一部とされる。配列は、5’から3’方向に記載され、DNA型で表される。当業者には、標的配列中のチミジン(T)をウラシル(U)と置換することによって、標的配列をそのRNA型に転換するできることは理解される。
pri−miR−122a配列内に見出される成熟miRNAは、本発明の特定の実施形態で、例えば、miR−122a核酸を標的とするアンチセンス化合物の設計で用いられた。アンチセンス化合物は、miR−122aを模倣するが、模倣体の1つまたはそれ以上の特性を改変する特定の化学修飾を含み、それによって内因性のmiRNAより優れた特性を有する構築物を作り出せるよう設計され得る。
表1
本発明に関して、一連のアンチセンス化合物は、miR−122a核酸内の様々な部位を標的とするよう設計されて合成された。アンチセンス化合物は、上記のノーザンブロット法または定量リアルタイムPCRにより、miRNA、pre−miRNAまたはpri−miRNAレベルに関する効果について分析されるか、あるいはmiR−122aまたはmiR−122a下流標的の役割を調査するため、他のアッセイで用いることもできる。
表2:pri−miR−122aまたはmiR−122aを標的とするアンチセンス化合物の配列
・配列の塩基は、大文字で示される
・塩基修飾は、上付き小文字コード(数は部位を示し得る)で塩基残基の前に示され、任意である
・糖型は、下付き小文字コードで塩基残基の後に示される
・ヌクレオシド内結合型は、下付き小文字コードで糖(3’側)の後に示される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 328372、ISIS 328373およびISIS 327895のmiR−122aにおける効果は、アポトーシスアッセイ、脂肪細胞分化アッセイとインスリンシグナル伝達アッセイを含む、いくつかの表現型アッセイで試験された。これらのアッセイの実験の詳細および得られる結果は、米国特許公報第2005/0261218号で詳述され、その全部が出典明示により一部とされる。本明細書で記載されるように、ISIS 328372およびISIS 328373は、アポトーシスアッセイにおいてアポトーシスを誘導しなかった。ISIS 327895は、脂肪細胞の分化指標レベルを低下させ、インスリンシグナル伝達アッセイにおいてホリスタチンおよびPEPCKcのメッセンジャーRNA発現を減少させた。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたmiR−122aの阻害をモニターするため、いくつかの演算的に予測されるmiR−122a標的の調節をインビトロで試験した。
表7:ターゲットスキャン・アルゴリズムによって予測されるmiR−122a標的遺伝子
miR−122aの多様な修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた阻害をモニターするため、予測されたmiR−122a標的GYS1の調節を、本明細書中記載のリアルタイムPCR法を用いてマウス初代肝細胞で評価した。細胞を、15nM、44nM、133nMまたは400nM用量の、ISIS 327895、ISIS 365219、ISIS 386653、ISIS 386654、ISIS 345363または対照オリゴヌクレオチドISIS 342683で処置した。ISIS 342683の配列は、CCTTCCCTGAAGGTTCCTCCTT(配列番号:30)である;このオリゴマー化合物は、2’−MOEヌクレオシドから均一に成り、ホスホロチオエート骨格を有し、そして、全てのシトシンは5‐メチルシトシンである。GYS1の増加した発現によって明示されるように、ISIS 327895およびISIS 365219はmiR−122aを阻害するにあたって効果的であった。ISIS 386653およびISIS 386654は、より小さい範囲であるがGYS1 mRNAレベルを増加させた。ギャップマーISIS 345363は、GYS1 mRNAレベルを顕著に増加させなかった。
雄C57BL/6マウスは、ジャクソン(Jackson)研究所から得た。マウスを治療群に分け、4週間、週二回、12.5mg/kg〜75mg/kg範囲のISIS 327895用量で、または75mg/kgの対照オリゴヌクレオチドISIS 342683で腹膜内処置した。さらに、食塩水だけで処置したマウスを対照として取り扱った。マウスは、正常範囲の血漿ASTとALTレベルを有し、体重または食物摂取低下もなく、処置終了後も健常で正常に見えた。肝臓部の組織学的分析は、形態学的な外見上の変化を示さなかった。(肝臓の組織学的分析は、当分野で既知の通常の手順で行われた。簡潔には、肝臓を10%緩衝ホルマリンに固定し、パラフィンろうに封埋した。4mmの切片に切り、スライドガラス上に乗せた。脱水後、切片をヘマトキシリン−エオシン染色した)。
雄のC57bl/6マウス(6〜7週齢)は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる処置を開始する前に、19週間、高脂肪食(脂肪の60%kcal)を与えられた。マウスは自由に食事をした。開始のインスリン・レベルは約15ng/dLであり、身体組成は約20%が脂肪であった。合計11回の全量について、マウスは、12.5mg/kgで週2回皮下に投薬された(すなわち25mg/週)。各治療群は、5匹のマウスから成った。
GLUC=グルコース;ALT=アラニンアミノ基転移酵素;AST=アスパラギン酸アミノ基転移酵素;chol=コレステロール;trigs=トリグリセリド;HDL=HDLコレステロール;LDL=LDLコレステロール;NEFA=離脂肪酸
1つの実施形態において、miR−122aのアンチセンス阻害に続く肝臓遺伝子発現の変化は、マイクロアレイ分析によって評価した。肝臓RNAは、週二回50mg/kgのISIS 327895で処置された正常なマウスから、および食塩水単独で処置された動物から単離し、そしてマイクロアレイ分析を実施した。GE CODELINK(登録商標)Mouse Whole Genome Bioarraysは、製造業者のプロトコルに従って用いられた。ジーン・オントロジー(Gene Ontology)カテゴリーによるモジュレートされた遺伝子の分析は、脂質代謝と炭水化物代謝の調節に関与する多くの遺伝子が、ISIS 327895処置されたマウスで影響を受けたことを示した。脂肪酸合成経路、コレステロール生合成経路、アセチルCoA輸送経路および解糖経路の重要な酵素が阻害された。ホスホメバロネートキナーゼ(PMVK)mRNAの下方調節は、統計学的に有意だった。HMGCRおよびPMVKを含む、コレステロール代謝に関連するいくつかの他の遺伝子も低下した。ACC1、ACC2、ACLY、SCD1およびFASNを含む、脂肪酸合成と脂肪酸酸化を調節することが知られているいくつかの重要な遺伝子は、マイクロアレイ実験で有意に下方調節され、そして、この5個の遺伝子の下方調節はリアルタイムPCRによって確認された。
脂肪酸酸化は、ATP産生異化経路である。中心的な代謝センサーAMPKは、脂肪酸酸化のようなATP生成経路を促進させるために作用し、そして脂肪酸合成のようなエネルギー貯蔵経路を阻害する重要な調節酵素である。
8週齢のob/obマウスに、4.5週間、週2回、食塩水に25mg/kg用量で溶解させたISIS 327895または対照オリゴヌクレオチドを腹腔内注射で与えた。血液を、通常の臨床分析器(例えば、オリンパスAU400e自動臨床解剖学分析器、メルヴィル、ニューヨーク州)を用いて採取し、分析した。ISIS 327895による処置は、対照オリゴヌクレオチドによる処置(約237mg/dL)または塩類単独での処置(約241mg/dL)と比較して、血漿コレステロールレベルの有意な低下(約168mg/dL)を引き起こした。
本発明の別の実施形態は、miR−122aを阻害することによってコレステロールおよび脂質代謝を調節する方法である。
本発明のアンチセンス化合物は、それらが標的とされる低分子非コードRNAの活性または機能をモジュレートする。この実施例では、miR−122aを標的とするアンチセンス化合物を例示する;しかしながら、本発明のアンチセンス化合物の修飾は、miR−122aをモジュレートするアンチセンス化合物に限定されない。
Claims (15)
- 動物における血清コレステロールレベルを低下させるのに用いるためのあるいは血清コレステロールレベルの上昇を阻害するのに用いるための、医薬の調製のための配列番号:3または配列番号:4で示される成熟miR−122aに対し少なくとも90%の配列相補性からなるところの、アンチセンス化合物の使用であって、該アンチセンス化合物が、15〜30ヌクレオシド長である、使用。
- 血清コレステロールがLDL−コレステロールであるところの、請求項1記載の使用。
- 血清コレステロールが血清総コレステロールであるところの、請求項1記載の使用。
- 高コレステロール血症を治療するための医薬の調製における配列番号:3または配列番号:4で示される成熟miR−122aに対し少なくとも90%の配列相補性からなるところの、アンチセンス化合物の使用であって、該アンチセンス化合物が、15〜30ヌクレオシド長である、使用。
- アンチセンス化合物が、17〜25ヌクレオシド長であるか、またはアンチセンス化合物が、21〜23ヌクレオチド長であるところの、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用。
- アンチセンス化合物が、成熟miR−122aと完全に相補的であるところの、請求項5記載の使用。
- アンチセンス化合物が、複数の2’−糖修飾ヌクレオシドを含むところの、請求項5または6記載の使用。
- アンチセンス化合物が、少なくとも1個の二環式糖修飾ヌクレオシドをさらに含むところの、請求項5〜7のいずれか一項記載の使用。
- アンチセンス化合物が、配列番号:1記載の核酸塩基配列を含むところの、請求項5〜8のいずれか一項記載の使用。
- アンチセンス化合物が、配列番号:1記載の核酸塩基配列からなるか、または配列番号:2記載の核酸塩基配列からなるところの、請求項5〜9のいずれか一項記載の使用。
- アンチセンス化合物が、2’−MOE糖修飾ヌクレオシドを均一に含むところの、請求項5〜10のいずれか一項記載の使用。
- アンチセンス化合物が、少なくとも1つのホスホロチオエート・ヌクレオシド内結合を含むところの、請求項5〜11のいずれか一項記載の使用。
- アンチセンス化合物が、少なくとも1個の5−メチルシトシンを含むところの、請求項5〜12のいずれか一項記載の使用。
- 各ヌクレオシドが、2’−O−メトキシエチルヌクレオシドであり、各結合が、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンが5−メチルシトシンであるところの、請求項9または10記載の使用。
- 各ヌクレオシド内結合が、ホスホロチオエート・ヌクレオシド内結合である、請求項5〜14のいずれか一項記載の使用。
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