JP2017514908A - 核酸分子を利用する目の前部における障害の処置のための方法 - Google Patents

核酸分子を利用する目の前部における障害の処置のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明の側面は、目の前部に関連する眼の障害を処置するための方法に関し、該方法は、目の前部に関連する眼の障害を処置するのに有効な量で、治療用ＲＮＡ分子をそれが必要な対象の目に投与することを含む。

Description

関連出願
本願は、2014年5月1日に出願された米国仮出願第US 61/987,418号、表題「核酸分子を利用する目の前部における障害の処置のための方法」の35 U.S.C.§119(e)に基づく利益を主張し、この全開示は、その全体を参照して本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、目の前部における眼の障害の処置に関係する。
発明の背景
相補的なオリゴヌクレオチド配列は有望な治療剤であり、遺伝子の機能を解明する上での有用な研究用ツール(research tool)である。しかしながら、先行技術のオリゴヌクレオチド分子は、それらの臨床的開発を妨げる可能性があるいくつかの問題に悩まされており、これは、かかる組成物をin vivoで使用する遺伝子発現（タンパク質合成を含む）の意図した効率的な阻害の達成をしばしば困難にする。
主要な問題は、これらの化合物の、細胞および組織への送達であった。従来の二本鎖ＲＮＡｉ化合物は、１９〜２９塩基長であって、およそ１．５×（１０〜１５）ｎｍのサイズの高度に負に荷電した強固ならせんを形成する。このロッド型の分子は細胞膜を透過することができず、その結果として、in vitroおよびin vivoでの両方において極めて限定的な効力しか有さない。その結果として、従来の全てのＲＮＡｉ化合物は、それらの組織分配および細胞取り込みを促進するために、何らかの種類の送達ビヒクルを必要とする。これは、ＲＮＡｉ技術の主要な限定要因であると考えられる。
先には、それらの細胞取り込み特性を改善するために、オリゴヌクレオチドに化学修飾を適用する試みが存在している。１つのかかる修飾は、オリゴヌクレオチドへのコレステロール分子の付着であった。このアプローチについての最初の報告は、1989年のLetsingerらによるものであった。後に、ISIS Pharmaceuticals, Inc.（Carlsbad, CA）が、オリゴヌクレオチドへ、コレステロール分子を付着させる上でのより高度な技術を報告した（Manoharan, 1992）。
90年代後期におけるｓｉＲＮＡの発見に関して、それらの送達プロフィールを増強するために、同様の型の修飾がこれらの分子へ試みられた。僅かに修飾された（Soutschek, 2004）および重度に修飾された（Wolfrum, 2007）ｓｉＲＮＡへ抱合させたコレステロール分子が、文献に登場した。Yamadaら（2008）はまた、コレステロールを媒介したｓｉＲＮＡの取り込みをさらに改善する高度なリンカーの化学(linker chemistry)の使用について報告した。この努力にも拘わらず、これらの型の化合物の取り込みは、生体液の存在下において阻害され、これがin vivoでの遺伝子サイレンシングにおける効力を極めて限定させることになり、臨床の場でこれらの化合物の適用性を限定していると考えられる。
発明の概要
本明細書に記載されるのは、治療用ＲＮＡ分子の目への効率的なin vivo投与のための方法および組成物である。驚くべきことに、ＣＴＧＦを標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の硝子体内投与により、目の前部において有効な遺伝子サイレンシングが生じた。本明細書に記載される治療用ＲＮＡ分子は、目の前部に関連する障害または状態の処置のための広範な適用を有している。
本発明の側面は、目の前部に関連する眼の障害を処置するのに有効な量で、それが必要な対象の目に治療用ＲＮＡ分子を投与することを含む、目の前部に関連する眼の障害を処置するための方法に関する。
いくつかの態様において、目の前部に関連する眼の障害は、以下：角膜瘢痕、角膜穿孔、角膜ジストロフィー、角膜損傷および／または角膜外傷（熱傷を含む）、角膜炎症、角膜感染、新生児眼炎、多形性赤斑（スティーブンス・ジョンソン症候群）、眼球乾燥症（ドライアイ症候群）、トラコーマ、オンコセルカ症（河川盲目症）、ハンセン病の角膜合併症、角膜炎、持続性角膜上皮欠損(persistent corneal epithelial defects)、結膜炎、前部ブドウ膜炎、虹彩角膜内皮症候群、フックスジストロフィー、睫毛乱生症、眼単純ヘルペス、角膜のグラフティングまたは移植（手術に先立つグラフトまたは移植片のex vivo処置を含む）、角膜移植不全および／または拒絶からなる群から選択される。
いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、目の前部以外の目の領域に送達される。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、目の前部に送達される。
いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、以下：硝子体内、網膜下、眼周囲（結膜下、テノン嚢下、眼球後、眼球周囲および後方近強膜）、局所、点眼、角膜インプラント、生分解性インプラント、非生分解性インプラント、眼内挿入、薄膜、持続放出性処方物、ポリマーおよび徐放性ポリマー、イオントフォレーシス、ヒドロゲルコンタクトレンズ、リバース／熱ヒドロゲルおよび生分解性ペレットからなる群から選択される方法により投与される。
いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、以下：ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＭＡＰ４Ｋ４、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＳＤＦ−１、ＩＧＴＡ５、ＡＮＧ２、ＨＩＦ−１アルファ、ｍＴＯＲ、ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＳＰＰ１、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、補体因子３および５(complement factors 3 and 5)、ＰＤＧＦＲａ、ＰＰＩＢ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、Ｉｃａｍ−１、Ｔｉｅ １、Ｔｉｅ ２、ＡＮｇ １、Ａｎｇ ２およびｍｙｃ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に対して向けられる。
いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、ＣＴＧＦをコードする遺伝子に対して向けられる。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、ＶＥＧＦをコードする遺伝子に対して向けられる。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、Ｍａｐ４Ｋ４をコードする遺伝子に対して向けられる。
いくつかの態様において、２つ以上の異なるタンパク質をコードする遺伝子に対して向けられる２つ以上の異なる治療用ＲＮＡ分子が共に、対象の目に投与される。いくつかの態様において、同じタンパク質をコードする遺伝子に対して向けられる２つ以上の異なる治療用ＲＮＡ分子が共に、対象の目に投与される。
いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡである。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、表３〜８、１０または１１内の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号９４８または配列番号９６４の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号９４７または配列番号９６３の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号９４７を含み、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号９４８を含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３１７または配列番号１３５７の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１３１８または配列番号１３５８の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３１７を含み、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１３１８を含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３５７を含み、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１３５８を含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３７９を含み、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１３８０を含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３９７を含み、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１３９８を含む。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、疎水的に改変されている。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、１以上の疎水性抱合体に連結されている。
いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、ｒｘＲＮＡｏｒｉである。
本発明の側面は、表１１内の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む配列に対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡに関する。
本発明の態様は、表１１内の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含むｓｄ−ｒｘＲＮＡに関する。
本発明の態様は、治療用ＲＮＡ分子を目に投与する方法に関し、ここで、治療用ＲＮＡ分子は、易感染性および／または損傷している目に投与される。いくつかの態様において、角膜は、易感染性および／または損傷している。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、角膜に投与される。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、局所投与される。
本発明の限定の各々は、本発明の多様な態様を包含し得る。したがって、いずれか１の要素または要素の組み合わせを伴う本発明の限定の各々は、本発明の各側面に含まれ得ると考えられる。本発明はその適用において、以下の説明に記載されるまたは図面に例示される、解釈の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の態様も可能であり、多様なやり方において実践または実行されることが可能である。
図面の簡単な説明
添付の図面は、原寸で描画することを意図していない。図面において、多様な図において例示される各々同一またはほぼ同一の構成要素は、類似する数字で表わされる。明確化を目的として、全ての構成要素が全ての図面においてラベルされているわけではない。図面においては以下のとおりである：
図１は、ＰＢＳ注射した対照サルの角膜と比較した、ＣＴＧＦを標的化する治療用ＲＮＡ分子を硝子体内注射したサルの角膜におけるＣＴＧＦタンパク質レベルの顕著な減少を実証する。 図２は、ＲＸＩ−１０９であるｓｄ−ｒｘＲＮＡがＭａｔＴｅｋ ３Ｄ角膜上(epicorneal)組織モデルの全ての細胞層を透過することを実証する。細胞は、培地曝露(media exposure)によりｓｄ−ｒｘＲＮＡで処置した。
図３は、ＲＸＩ−１０９であるｓｄ−ｒｘＲＮＡが、ＭａｔＴｅｋ ３Ｄ角膜上組織モデルの全ての細胞層を透過することを実証する。細胞は、培地曝露または局所投与により処置した。培地曝露または局所投与を使用するｓｄ−ｒｘＲＮＡの取り込みを、角膜における創傷を模倣するスクラッチの存在下で比較した。ｓｄ−ｒｘＲＮＡの細胞内取り込みを、培地曝露（無傷またはスクラッチモデル）または局所投与（スクラッチモデル）後に観察した。 図４は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡが、角膜上３Ｄモデル（ヒト上皮細胞）における標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを顕著に減少させることを実証する。遺伝子特異的サイレンシングが、角膜上モデルにおけるＭａｐ４ｋ４標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与４８時間後に観察された。
詳細な説明
本発明の側面は、遺伝子サイレンシングに関与する方法および組成物に関する。本発明は、治療用ＲＮＡ分子の目への硝子体内投与により、目の前部における標的遺伝子の発現が減少するという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づく。したがって、本明細書に記載の方法は、目の前部に影響する眼の状態または障害の処置のための重要な可能性を提供する。
本明細書に使用される「治療用ＲＮＡ分子」は、標的遺伝子の発現を減少させ得るＲＮＡ分子を指す。治療用ＲＮＡ分子は、これらに限定されないが：ｓｄ−ｒｘＲＮＡ、ｒｘＲＮＡｏｒｉ、オリゴヌクレオチド、ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ＢＭＴ−１０１、ＲＸＩ−１０９、ＥＸＣ−００１、および一本鎖核酸分子を含む。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、化学修飾されたオリゴヌクレオチドなどの、化学修飾された核酸分子である。
本発明の態様は、目の前部における眼の障害の処置に関する。本明細書で使用される目の前部は、これらに限定されないが、水晶体、虹彩、角膜、瞳孔、強膜、毛様体および結膜を含む。
ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子
本発明の側面は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子に関する。本明細書に使用される「ｓｄ−ｒｘＲＮＡ」または「ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子」は、自己送達型ＲＮＡ分子、例えば2009年9月22日に出願されたPCT公開第WO2010/033247号（出願第PCT/US2009/005247号）、表題「低減されたサイズの自己送達型ＲＮＡｉ化合物」、および、2014年8月5日に特許交付され、US2012/0040459として2012年2月16日に公開された米国特許第8,796,443号、表題「低減されたサイズの自己送達型ＲＮＡｉ分子」に記載され、参照して組み込まれたものなど、を指す。簡単に述べると、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ（ｓｄ−ｒｘＲＮＡナノとも呼ばれる）は、最小長が１６ヌクレオチドのガイド鎖および８〜１８ヌクレオチド長のパッセンジャー鎖を含む、単離された非対称二本鎖核酸分子であって、ここで二本鎖核酸分子は二本鎖領域および一本鎖領域を有し、一本鎖領域は４〜１２ヌクレオチド長を有し、かつ、少なくとも３つのヌクレオチド主鎖修飾を有する。好ましい態様において、二本鎖核酸分子は、平滑である１末端を有するか、または、１つもしくは２つのヌクレオチド突出を含む。ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、化学修飾を通じて、いくつかの例において疎水性抱合体の付着を通じて、最適化され得る。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子を含み、ここで二本鎖である分子の領域は８〜１５ヌクレオチド長であり、ここでガイド鎖は４〜１２ヌクレオチド長の一本鎖領域を含有し、ここでガイド鎖の一本鎖領域は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のホスホロチオアート修飾を含有し、およびここで、二本鎖核酸のヌクレオチドの少なくとも４０％は修飾されている。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において、本発明の、単離された二本鎖またはデュプレックス核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ナノ分子、ナノＲＮＡ、ｓｄ−ｒｘＲＮＡナノ、ｓｄ−ｒｘＲＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。
ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、従来のｓｉＲＮＡと比較して、はるかに効果的に細胞によって取り込まれる。これらの分子は、標的遺伝子のサイレンシングにおいて高度に効率的であって、血清の存在下における高活性、効率的な自己送達、多様なリンカーとの適合性、および、毒性に関連する化学修飾の存在の減少または完全な欠如を含む、以前に記載されたＲＮＡｉ分子を凌駕する大きな利点を与える。
一本鎖ポリヌクレオチドとは対照的に、デュプレックスポリヌクレオチドは伝統的に細胞への送達が困難であったが、それは、これらが強固な構造および多数の負の電荷を有するために、その膜輸送が困難になっているからである。しかしながら、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、部分的に二本鎖であるにも拘わらず、in vivoで一本鎖として認識され、したがって、細胞膜を超えて効率的に送達されることが可能である。その結果、本発明のポリヌクレオチドは、多くの例において自己送達が可能である。よって、本発明のポリヌクレオチドは、従来のＲＮＡｉ剤と同様の様式において製剤化されても、あるいは、細胞または対象へ単独で（または非送達型キャリアとともに）送達されてもよく、自己送達を可能にする。本発明の一態様において、分子の一部分が従来のＲＮＡデュプレックスに類似し、分子の第２の部分が一本鎖である、自己送達型非対称二本鎖ＲＮＡ分子が提供される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの側面において、二本鎖領域と５ヌクレオチドまたはそれより長い一本鎖領域とを含む非対称構造と、具体的な化学修飾パターンとの組み合わせを有し、親油性または疎水性の分子に抱合される。このクラスのＲＮＡｉ様化合物は、in vitroおよびin vivoで優れた効力を有する。強固なデュプレックス領域のサイズの低減が、一本鎖領域へ適用されるホスホロチオアート修飾と組み合わせられると、観察される優れた効力に寄与すると考えられる。
本発明は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡが網膜下または硝子体内注射のいずれかを介して、目に効率的に送達され得るという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づく。マウス、ラットおよびウサギを含む、複数の異なる哺乳動物系において生じる結果に基づいて、そして、例のセクションにおいて提示されるように、従来のＲＮＡｉ化合物の投与後よりも、劇的に（数桁の規模）優れた眼内取り込みおよび分布が、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与後に観察される。
本発明の別の驚くべき側面は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子が、網膜色素上皮細胞層を含む、網膜中の全ての細胞層によって取り込まれることである。効率的なｓｄ−ｒｘＲＮＡ分布は、網膜下および硝子体内注射の両方を介して達成され、そして、両方の投与手段は、本発明の側面と適合性である。いくつかの態様において、硝子体内投与は、眼内薬物送達における技術的容易性および広範な使用に起因して好ましい。
本発明の別の驚くべき側面は、３Ｄ角膜上組織培養モデル系（ヒト角膜上皮細胞を利用する）において、細胞を、培地曝露または局所投与を介してｓｄ−ｒｘＲＮＡで処置する場合、細胞取り込みが観察された（図３）ということである。ｓｄ−ｒｘＲＮＡはまた、このモデル系において標的遺伝子の発現の顕著な減少を達成した（図４）。いくつかの態様において、角膜への局所投与などの局所投与が好ましい。
本明細書で使用される「眼の」は、筋肉、神経、血管、涙管、膜などを含む、任意および全ての目の細胞を含む、目並びに目およびその生理学的機能に関連する構造を指す。用語眼のおよび目は、この開示全体にわたって交換可能に使用される。目の範囲内の細胞型の非制限的な例としては、神経節細胞層（ＧＣＬ）、内網状層（ＩＰＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、外網状層（ＯＰＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）、杆体錐体の外節（ＯＳ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、杆体錐体の内節（ＩＳ）、結膜の上皮、虹彩、毛様体、角質、および眼の皮脂腺の上皮を含む。
好ましい態様において、本発明のＲＮＡｉ化合物は、デュプレックス領域（８〜１５塩基長が効率的なＲＩＳＣ侵入に必要とされる）および４〜１２ヌクレオチド長の一本鎖領域を含む非対称化合物を含む。いくつかの態様において、デュプレックス領域は、１３または１４ヌクレオチド長である。６または７ヌクレオチドの一本鎖領域が、いくつかの態様において好ましい。新しいＲＮＡｉ化合物の一本鎖領域はまた、２〜１２のホスホロチオアートのヌクレオチド間連結部（ホスホロチオアート修飾として言及される）をも含む。６〜８のホスホロチオアートヌクレオチド間連結部が、いくつかの態様において好ましい。加えて、本発明のＲＮＡｉ化合物はまた、ユニークな化学修飾パターンをも含み、これは安定性を提供し、ＲＩＳＣ侵入に適合する。これらの要因の組み合わせが、in vitroおよびin vivoでのＲＮＡｉ試薬の送達に高度に有用である、予想外の特性をもたらした。
安定性を提供し、かつ、ＲＩＳＣ侵入に適合する、化学修飾されたパターンは、センス鎖またはパッセンジャー鎖ならびにアンチセンス鎖またはガイド鎖への修飾を含む。例えば、パッセンジャー鎖は、安定性を確実にし、かつ、活性に干渉しない、いずれの化学的実体によっても、修飾され得る。かかる修飾は、２’リボ修飾（Ｏ−メチル、２’Ｆ、２デオキシ等）およびホスホロチオアート修飾のような主鎖修飾を含む。パッセンジャー鎖における好ましい化学修飾パターンは、パッセンジャー鎖内のＣおよびＵヌクレオチドのＯメチル修飾を含む。代わりに、パッセンジャー鎖は完全にＯメチル修飾されてもよい。
ガイド鎖はまた、例えば、ＲＩＳＣ侵入に干渉せずに、安定性を確実にするいずれの化学修飾によっても修飾されてもよい。ガイド鎖における好ましい化学修飾パターンは、ＣおよびＵヌクレオチドの大多数が２’Ｆ修飾され、かつ、５’末端がリン酸化されているものを含む。ガイド鎖における別の好ましい化学修飾パターンは、１位と１１〜１８位のＣ／Ｕとの２’Ｏメチル修飾および５’末端の化学的リン酸化を含む。ガイド鎖におけるさらに別の好ましい化学修飾パターンは、１位と１１〜１８位のＣ／Ｕとの２’Ｏメチル修飾および５’末端の化学的リン酸化ならびに２〜１０位におけるＣ／Ｕの２’Ｆ修飾を含む。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖は、少なくとも１つの５−メチルＣまたはＵ修飾を含有する。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ中のヌクレオチドのうち少なくとも３０％が修飾されている。例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ中のヌクレオチドのうち少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が修飾されている。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ中のヌクレオチドの１００％が修飾されている。
本発明のオリゴヌクレオチドの上記の化学修飾パターンは、良好な耐性を示し、非対称ＲＮＡｉ化合物の効力を実際に改善した。ＲＮＡｉへの修飾の組み合わせは、ポリヌクレオチドにおいてともに使用されるとき、ＲＮＡｉの受動的取り込みにおける最適な効力の達成をもたらすことが、本明細書に実験によっても実証されている。記載された構成要素（ガイド鎖の安定化、ホスホロチオアートの伸長、センス鎖の安定化および疎水性抱合体）のいずれかの排除、またはいくつかの例において、サイズの増加は、準最適な効力をもたらし、いくつかの例において、効力の完全な喪失をもたらす。要素の組み合わせは、ＨｅＬａ細胞などの細胞への受動的送達の後であっても十分に活性がある化合物の開発をもたらす。下に提示される例におけるデータは、本発明のオリゴヌクレオチドの、眼の投与の際のin vivoでの高い効力を実証する。
ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、いくつかの例において、新規の型の化学的性質(chemistries)を使用して化合物の疎水性を改善することにより、さらに改善され得る。例えば、１つの化学的性質は、疎水性塩基修飾の使用に関する。あらゆる位置におけるあらゆる塩基が、修飾が塩基の分配係数の増大をもたらす限りにおいて、修飾されてもよい。修飾の化学的性質のための好ましい位置は、ピリミジンの４位および５位である。これらの位置の主要な利点は、（ａ）合成の容易性、および、（ｂ）ＲＩＳＣ複合体のローディングおよび標的認識のために必須である、塩基対形成およびＡ型らせん(A form helix)形成への干渉がないこと、である。複数のデオキシウリジンが全体的な化合物の効力に干渉せずに存在するｓｄ−ｒｘＲＮＡ化合物のバージョンが使用された。加えて、組織分布および細胞取り込みにおける主要な改善は、疎水性抱合体の構造を最適化することにより得られ得る。好ましい態様のいくつかにおいて、ステロールの構造は、Ｃ１７に付着された鎖(C17 attached chain)を変える（増大する／減少する）ように修飾される。この型の修飾は、in vivoでの細胞取り込みの大きな増大を、および、組織取り込み成功率(prosperities)の改善をもたらす。
本発明に従って製剤化されたｄｓＲＮＡはまた、ｒｘＲＮＡｏｒｉも含む。ｒｘＲＮＡｏｒｉは、2009年2月11日に出願されたPCT公開第WO2009/102427号（出願第PCT/US2009/000852号）、表題「修飾されたＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびその使用」ならびに2011年2月17日に公開された米国特許公開第US 2011-0039914号、表題「修飾されたＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびその使用」に記載され、参照して組み込まれた、ＲＮＡ分子のクラスを指す。
いくつかの態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉ分子は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜３５ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトを含み、これは以下を含む：５’末端および３’末端を有するセンス鎖、ここでセンス鎖は２’修飾リボース糖により高度に修飾され、ここでセンス鎖の中心部分における３〜６個のヌクレオチドは２’修飾リボース糖により修飾されておらず、および、５’末端および３’末端を有するアンチセンス鎖、これはセンス鎖および標的遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズしており、ここでｄｓＲＮＡは標的遺伝子の発現を、配列に依存的な様式で阻害する。
ｒｘＲＮＡｏｒｉは、本明細書に記載のいずれの修飾も含有し得る。いくつかの態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉのヌクレオチドの少なくとも３０％は修飾されている。例えば、ｒｘＲＮＡｏｒｉのヌクレオチドの少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が修飾されている。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの１００％が修飾されている。いくつかの態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉのパッセンジャー鎖しか修飾を含有しない。
本発明は、その適用に関して、以下の説明において記載されるかまたは図面において例示される構成および構成要素の配置の詳細に限定されない。本発明は、他の態様および多様な方法において実施されるかまたは行われることが可能である。また、本明細書に使用される用語および専門用語は、説明を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。本明細書における「含む(including)」、「含む(comprising)」または「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」およびそれらの変化形の使用は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
よって、本発明の側面は、ガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖を含む、単離された二本鎖核酸分子に関する。本明細書に使用される用語「二本鎖」は、ヌクレオモノマーの少なくとも一部が相補的であり、二本鎖領域を形成するように水素結合されている、１以上の核酸分子を指す。いくつかの態様において、ガイド鎖の長さは、１６〜２９ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、ガイド鎖は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチド長である。ガイド鎖は標的遺伝子に対して相補性を有する。ガイド鎖と標的遺伝子との間の相補性は、ガイド鎖のいずれの部分にわたっても存在することができる。本明細書に使用される相補性は、ガイド鎖が標的に対してＲＮＡｉを媒介できるように十分に相補的である限りにおいて、完全な相補性であっても、より不完全な相補性であってもよい。いくつかの態様において、相補性とは、ガイド鎖と標的との間の、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満のミスマッチを指す。
完全な相補性とは、１００％の相補性を指す。よって、本発明は、遺伝子変異、系統多型、または、進化による分岐に起因して予測可能な配列の変化に耐性を示すことができるという利点を有する。例えば、標的配列と比較して挿入、欠失および単一の点変異を有するｓｉＲＮＡもまた、阻害について有効であることが見出されている。さらに、ｓｉＲＮＡの全ての部位が標的の認識について同等に寄与するわけではない。ｓｉＲＮＡの中心におけるミスマッチは最も重要であり、本質的に(essentially)標的ＲＮＡの切断を無効化する。アンチセンス鎖に関して、中心の上流または切断部位の上流におけるミスマッチは、耐性を示すが、標的ＲＮＡの切断を著しく低減する。アンチセンス鎖に関して、中心または切断部位の下流におけるミスマッチ、好ましくは３’末端の付近、例えばアンチセンス鎖の３’末端から１、２、３、４、５または６ヌクレオチドに位置するものは、耐性を示し、標的ＲＮＡの切断をごく僅かしか低減しない。
いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、いくつかの態様において、ガイド鎖は、少なくとも１６ヌクレオチドの長さであり、ＲＩＳＣ中でアルゴノートタンパク質をアンカーする。いくつかの態様において、ガイド鎖がＲＩＳＣ中へロードするとき、これは明確なシード領域を有し、標的ｍＲＮＡの切断は、ガイド鎖の１０〜１１位にわたって行われる。いくつかの態様において、ガイド鎖の５’末端は、リン酸化されているかまたはリン酸化されることができる。本明細書に記載される核酸分子は、最短トリガーＲＮＡ(minimum trigger RNA)として言及される場合もある。
いくつかの態様において、パッセンジャー鎖の長さは、８〜１５ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、パッセンジャー鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖に対して相補性を有する。パッセンジャー鎖とガイド鎖との間の相補性は、パッセンジャーまたはガイド鎖のいずれの部位にわたっても存在してもよい。いくつかの態様において、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間には、分子の二本鎖領域内に１００％の相補性が存在する。
本発明の側面は、最小二本鎖領域を有する二本鎖核酸分子に関する。いくつかの態様において、分子の二本鎖である領域は、８〜１５ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、分子の二本鎖である領域は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。ある態様において、二本鎖領域は、１３または１４ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１００％の相補性が存在してもよく、または、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１以上のミスマッチが存在してもよい。いくつかの態様において、二本鎖分子の一方の末端において、分子は、平滑末端であるかまたは１ヌクレオチドの突出を有する。分子の一本鎖領域は、いくつかの態様において、４〜１２ヌクレオチド長である。例えば、一本鎖領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド長であってよい。しかしながら、ある態様において、一本鎖領域はまた、４ヌクレオチド長未満であっても、または、１２ヌクレオチド長より長くてもよい。ある態様において、一本鎖領域は少なくとも６または７ヌクレオチド長である。
本発明に関連するＲＮＡｉコンストラクトは、−１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有することができる。いくつかの態様において、熱力学的安定性（ΔＧ）は、−２０ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満である。いくつかの態様において、（ΔＧ）が−２１ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満となったとき、効力の喪失が存在する。いくつかの態様において、−１３ｋｋａｌ／ｍｏｌより高い（ΔＧ）値は、本発明の側面に適合性である。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、いくつかの態様において、相対的に高い（ΔＧ）値を有する分子は、相対的に高い濃度において活性になる場合があり、一方、相対的に低い（ΔＧ）値を有する分子は、相対的に低い濃度において活性になる場合がある。いくつかの態様において、（ΔＧ）値は、−９ｋｋｃａｌ／ｍｏｌよりも高くてもよい。最小二本鎖領域を有する本発明に関連するＲＮＡｉコンストラクトにより媒介される遺伝子サイレンシング効果は予測できないが、それは、ほぼ同一の設計であるが熱力学的安定性がより低い分子は、不活性であることが示されているからである（Rana et al. 2004）。
いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本明細書に記載される結果は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡの８〜１０ｂｐの伸長が、ＲＩＳＣのタンパク質構成要素またはＲＩＳＣのコファクターにより構造的に認識されるであろうことを示唆する。さらに、タンパク質構成要素により感受され得るか、および／または、かかる構成要素と相互作用するために十分に安定であり得、その結果アルゴノートタンパク質中へロードされ得る、トリガー化合物(triggering compound)のためのフリーエネルギー要求が存在する。最適な熱力学が存在して、好ましくは少なくとも８ヌクレオチドである二本鎖部分が存在する場合、デュプレックスは認識され、ＲＮＡｉ機構中にロードされるであろう。
いくつかの態様において、熱力学的安定性は、ＬＮＡ塩基の使用を通して増大する。いくつかの態様において、追加の化学修飾が導入される。化学修飾の数個の非限定例は、５’ホスファート、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−フルオロ、リボチミジン、Ｃ−５プロピニル−ｄＣ（ｐｄＣ）およびＣ−５プロピニル−ｄＵ（ｐｄＵ）；Ｃ−５プロピニル−Ｃ（ｐＣ）およびＣ−５プロピニル−Ｕ（ｐＵ）；５−メチルＣ、５−メチルＵ、５−メチルｄＣ、５−メチルｄＵメトキシ、（２，６−ジアミノプリン）、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジンおよびＭＧＢ（副溝結合剤）を含む。同一分子内で１つより多くの化学修飾を組み合わせられ得ることが、理解されるべきである。
本発明に関連する分子は、効力の増大および／または毒性の低減のために、最適化される。例えば、ガイドおよび／またはパッセンジャー鎖のヌクレオチドの長さ、および／または、ガイドおよび／またはパッセンジャー鎖におけるホスホロチオアート修飾の数は、いくつかの側面においてＲＮＡ分子の効力に影響を及ぼし、一方、２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾を２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾により置き換えることは、いくつかの側面において分子の毒性に影響を及ぼす。具体的には、分子の２’Ｆ含有物の低減は、分子の毒性を低下させると予測される。例のセクションは、２’Ｆ修飾が排除された分子を提示し、先に記載のＲＮＡｉ化合物に対して、予測される毒性の低減に起因する利点を提供する。さらに、ＲＮＡ分子中のホスホロチオアート修飾の数は、細胞内への分子の取り込み、例えば細胞内への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。本明細書に記載される分子の好ましい態様は、２’Ｆ修飾を有さず、なお細胞取り込みおよび組織への浸透における同等の効力により特徴づけられる。かかる分子は、２’Ｆの大量使用により重度に修飾されたAccellおよびWolfrumにより記載される分子などの先行技術に対して、顕著な改善を表わす。
いくつかの態様において、ガイド鎖は、およそ１８〜１９ヌクレオチドの長さであり、およそ２〜１４のホスファート修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、ホスファート修飾された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１４より多くのヌクレオチドを含有し得る。ガイド鎖は、ＲＩＳＣ侵入に干渉せずに安定性を増大させる１以上の修飾を含有してもよい。ホスホロチオアート修飾ヌクレオチドなどのホスファート修飾ヌクレオチドは、３’末端にあっても、５’末端にあっても、または、ガイド鎖全体に広がっていてもよい。いくつかの態様において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のホスホロチオアート修飾ヌクレオチドを含有する。
ガイド鎖はまた、２’Ｆおよび／または２’ＯＭｅ修飾を含有し得るが、これは、分子全体を通して位置され得る。いくつかの態様において、ガイド鎖の１位のヌクレオチド（ガイド鎖の最も５’の位置におけるヌクレオチド）は、２’ＯＭｅ修飾されているか、および／または、リン酸化されている。ガイド鎖中のＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾され得る。例えば、１９ｎｔのガイド鎖の２〜１０位（または異なる長さの鎖における対応する位置）におけるＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾され得る。ガイド鎖中のＣおよびＵヌクレオチドもまた、２’ＯＭｅ修飾され得る。
例えば、１９ｎｔのガイド鎖の１１〜１８位（または異なる長さの鎖における対応する位置）におけるＣおよびＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾され得る。いくつかの態様において、ガイド鎖の最も３’末端におけるヌクレオチドは、未修飾である。ある態様において、ガイド鎖中のＣおよびＵの大部分は、２’Ｆ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の態様において、１位、および、１１〜１８位におけるＣまたはＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の態様において、１位、および、１１〜１８位におけるＣまたはＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されており、２〜１０位におけるＣまたはＵは２’Ｆ修飾されている。
いくつかの側面において、最適なパッセンジャー鎖は、およそ１１〜１４ヌクレオチドの長さである。パッセンジャー鎖は、安定性を増大させる修飾を含有してもよい。パッセンジャー鎖における１以上のヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾され得る。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖における１以上のＣおよび／またはＵヌクレオチドが２’ＯＭｅ修飾されているか、または、パッセンジャー鎖におけるＣおよびＵヌクレオチドの全てが２’ＯＭｅ修飾されている。ある態様において、パッセンジャー鎖における全てのヌクレオチドが２’ＯＭｅ修飾されている。パッセンジャー鎖上の１以上のヌクレオチドはまた、ホスホロチオアート修飾などのホスファート修飾もなされ得る。パッセンジャー鎖はまた、２’リボ、２’Ｆおよび２デオキシ修飾、または、上のいずれの組み合わせをも含有し得る。例において実証されるように、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との両方における化学修飾パターンは、良好な耐性を示し、化学修飾の組み合わせがＲＮＡ分子の効力および自己送達の増大をもたらすことが、本明細書に示される。
本発明の側面は、ＲＮＡｉについて先に使用されてきた分子と比較した場合、二本鎖領域に対して相対的に長い一本鎖領域を有するＲＮＡｉコンストラクトに関する。分子の一本鎖領域は、細胞取り込みまたは遺伝子サイレンシングを促進するために修飾されていてもよい。いくつかの態様において、一本鎖領域のホスホロチオアート修飾は、細胞取り込みおよび／または遺伝子サイレンシングに影響を及ぼす。ガイド鎖のホスホロチオアート修飾されている領域は、分子の一本鎖および二本鎖の両領域内にヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、一本鎖領域は、２〜１２のホスホロチオアート修飾を含む。例えば、一本鎖領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のホスホロチオアート修飾を含み得る。いくつかの例において、一本鎖領域は、６〜８のホスホロチオアート修飾を含む。
本発明に関連する分子はまた、細胞取り込みのためにも最適化される。本明細書に記載されるＲＮＡ分子において、ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖は、抱合体に付着され得る。ある態様において、抱合体は疎水性である。疎水性の抱合体は、１０より高い分配係数を有する低分子であり得る。抱合体は、コレステロールなどのステロール型分子であっても、または、Ｃ１７に付着した長さが増大したポリ炭素鎖を有する分子であってもよく、抱合体の存在は、脂質トランスフェクション試薬の有無に関らずＲＮＡ分子が細胞に取り込まれる能力に影響を及ぼし得る。抱合体は、疎水性リンカーを通して、パッセンジャー鎖またはガイド鎖に付着され得る。
いくつかの態様において、疎水性リンカーは５〜１２Ｃの長さであり、および／または、ヒドロキシピロリジンをベースとする。いくつかの態様において、疎水性抱合体はパッセンジャー鎖に付着し、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖のいずれかのＣＵ残基は、修飾されている。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖のＣＵ残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、修飾されている。いくつかの側面において、本発明に関連する分子は、自己送達性（ｓｄ）である。本明細書において用いられる場合、「自己送達(self-delivery)」とは、分子が、トランスフェクション試薬などの追加の送達ビヒクルを必要とせずに細胞へ送達される能力を指す。
本発明の側面は、ＲＮＡｉにおける使用のために分子を選択することに関する。いくつかの態様において、８〜１５ヌクレオチドの二本鎖領域を有する分子は、ＲＮＡｉにおける使用のために選択され得る。いくつかの態様において、分子は、その熱力学的安定性（ΔＧ）に基づいて選択される。いくつかの態様において、−１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の（ΔＧ）を有する分子が選択されるであろう。例えば、（ΔＧ）値は、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２１、−２２または−２２ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満であってもよい。他の態様において、（ΔＧ）値は、−１３ｋｋａｌ／ｍｏｌより高くてもよい。例えば、（ΔＧ）値は、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７または−７ｋｋａｌ／ｍｏｌより高くてもよい。ΔＧは、当該技術分野において知られているいずれの方法をも使用して計算され得ることが理解されるべきである。いくつかの態様において、ΔＧは、Mfoldインターネットサイト（mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi）を通して利用可能なMfoldを使用して計算される。
ΔＧを計算するための方法は、以下の参考文献において記載され、それらから参照して組み込まれる：Zuker, M. (2003) Nucleic Acid Res., 31(13):3406-15；Mathews, D. H., Sabina, J., Zuker, M. and Turner, D. H. (1999) J. Mol. Biol. 288:911-940；Mathews, D. H., Disney, M. D., Childs, J. L., Schroeder, S. J., Zuker, M., and Turner, D. H. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:7287-7292；Duan, S., Mathews, D. H., and Turner, D. H. (2006) Biochemistry 45:9819-9832；Wuchty, S., Fontana, W., Hofacker, I. L., and Schuster, P. (1999) Biopolymers 49:145-165。
ある態様において、ポリヌクレオチドは、５’および／または３’末端の突出を含有する。ポリヌクレオチドの一端におけるヌクレオチド突出の数および／または配列は、ポリヌクレオチドの他端と同じであっても異なっていてもよい。ある態様において、突出ヌクレオチドの１以上は、ホスホロチオアートまたは２’−ＯＭｅ修飾などの化学修飾を含有してもよい。
ある態様において、ポリヌクレオチドは、未修飾である。他の態様において、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている。さらなる態様において、修飾は、ガイド配列の５’末端から２つ目のヌクレオチドにおいて、２’−Ｈまたは２’−修飾されたリボース糖を含む。「２つ目のヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの５’末端から２つ目のヌクレオチドとして定義される。
本明細書に使用される「２’修飾されたリボース糖」は、２’−ＯＨ基を有さないリボース糖を含む。「２’修飾されたリボース糖」は、（未修飾の基準のＤＮＡヌクレオチドにおいて見出される）２’−デオキシリボースを含まない。例えば、２’修飾されているリボース糖は、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドまたはこれらの組み合わせであってもよい。
ある態様において、２’修飾されているヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチド（例としてＣ／Ｕ）である。２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドの例は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−Ｏ−アリルヌクレオチドを含む。
ある態様において、上述の５’末端修飾を持つ本発明のｓｄ−ｒｘＲＮＡポリヌクレオチドは、特定された５’末端修飾がない類似のコンストラクトと比較したとき、有意に（例として、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれを超えて）より低い「オフ・ターゲット(off-target)」遺伝子サイレンシングを呈し、よって、ＲＮＡｉ試薬または治療の全体的な特異性を大きく改善する。
本明細書に使用される「オフ・ターゲット」遺伝子サイレンシングは、例えばアンチセンス（ガイド）配列と、意図しない標的ｍＲＮＡ配列との間の偽の配列相同性に起因する、意図しない遺伝子サイレンシングを指す。
本発明のこの側面に従うと、あるガイド鎖修飾は、ＲＮＡｉ活性を著しく低下させずに（またはＲＮＡｉ活性を全く低下させずに）、さらに、ヌクレアーゼ安定性を増大させ、および／または、インターフェロン誘導を低下させる。
いくつかの態様において、５’ステム配列は、ポリヌクレオチドの５’末端上の２番目のヌクレオチドにて、２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドなどの２’修飾されたリボース糖を含んでもよく、いくつかの態様においては、他の修飾ヌクレオチドを含まなくてもよい。かかる修飾を有するヘアピン構造は、該位置にて２’−Ｏ−メチル修飾がない類似のコンストラクトと比較して、標的特異性の増強またはオフ・ターゲットサイレンシングの低減を有してもよい。
特定の５’ステム配列の修飾と３’ステム配列の修飾とのある組み合わせは、標的遺伝子の発現を阻害する能力の増強、血清安定性の増強、および／または、標的特異性の増大などにより部分的に表わされる、さらなる予想外の利点をもたらしてもよい。
ある態様において、ガイド鎖は、ガイド鎖の５’末端における２番目のヌクレオチドにて、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、かつ、他の修飾ヌクレオチドを含まない。
他の側面において、本発明のｓｄ−ｒｘＲＮＡ構造は、マイクロＲＮＡ機構によって、配列依存的な遺伝子サイレンシングを媒介する。本明細書に使用される用語「マイクロＲＮＡ」（「ｍｉＲＮＡ」）はまた、当該技術分野において、「小分子ＲＮＡ(small temporal RNA)」（「ｓｔＲＮＡ」）としても言及され、遺伝子的に（例として、ウイルス、哺乳動物または植物ゲノムにより）コードされる小さい（１０〜５０ヌクレオチドの）ＲＮＡであって、ＲＮＡサイレンシングを指向または媒介することができるものを指す。「ｍｉＲＮＡ障害」は、ｍｉＲＮＡの異常な発現または活性により特徴づけられる疾患または障害を指すべきである。
マイクロＲＮＡは、マウス、昆虫および哺乳動物において、発生またはがんなどの重要な経路において標的遺伝子を下方調節することに関与する。マイクロＲＮＡ機構を通した遺伝子サイレンシングは、ｍｉＲＮＡとその標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）との特異的であるがなお不完全な塩基対形成により、達成される。標的ｍＲＮＡ発現のマイクロＲＮＡ媒介性の下方調節において、多様な機構が使用されてもよい。
ｍｉＲＮＡは、およそ２２ヌクレオチドの非コードＲＮＡであって、植物および動物の発生の間中、転写後または翻訳後のレベルにて、遺伝子発現を調節し得る。ｍｉＲＮＡの１つの共通の特徴は、それらがプレｍｉＲＮＡ(pre-miRNA)と称されるおよそ７０ヌクレオチドの前駆体ＲＮＡステムループから、恐らくはＲＮａｓｅＩＩＩ型酵素であるダイサーまたはそのホモログによって、切り取られることである。天然に存在するｍｉＲＮＡは、in vivoで内因性遺伝子により発現され、ヘアピンまたはステムループ前駆体（プレｍｉＲＮＡまたはプリｍｉＲＮＡ(pri-miRNA)）から、ダイサーまたは他のＲＮＡｓｅによりプロセッシングされる。ｍｉＲＮＡは、in vivoで二本鎖デュプレックス(double-stranded duplex)として一過性に存在し得るが、一方の鎖のみが遺伝子サイレンシングを指揮するためにＲＩＳＣ複合体に取り込まれる。
いくつかの態様において、細胞取り込みおよびｍｉＲＮＡ活性の阻害において有効なｓｄ−ｒｘＲＮＡ化合物のバージョンが記載される。化合物は本質的に、ＲＩＳＣ侵入性のバージョンに類似するが、大きな鎖の化学修飾パターンが、切断を遮断してＲＩＳＣ作用の効果的な阻害剤として作用するように、最適化されている。例えば、化合物は、先に記載のＰＳ含有物で完全にまたは殆どＯメチル修飾されていてもよい。これらの型の化合物について、５’リン酸化は必要でない。二本鎖領域の存在は、細胞取り込みおよび効率的なＲＩＳＣローディングを促進するので、好ましい。
低分子ＲＮＡを配列特異的調節剤として使用する別の経路は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路であり、これは、細胞における二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の存在に対する、進化的に保存された応答である。ｄｓＲＮＡは、ダイサーにより、〜２０塩基対（ｂｐ）デュプレックスの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと切断される。これらの低分子ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される多タンパク質エフェクター複合体へと集合させられる。ｓｉＲＮＡは次いで、完璧な相補性を持つ標的ｍＲＮＡの切断をガイドする。
バイオジェネシス、タンパク質複合体および機能のいくつかの側面は、ｓｉＲＮＡ経路とｍｉＲＮＡ経路との間で共有される。対象となる一本鎖ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ機構においてｄｓＲＮＡを模倣しても、または、ｍｉＲＮＡ機構においてマイクロＲＮＡを模倣してもよい。
ある態様において、修飾ＲＮＡｉコンストラクトは、同じ配列を有する未修飾ＲＮＡｉコンストラクトと比較して、改善された血清および／または脳脊髄液中の安定性を有してもよい。
ある態様において、ＲＮＡｉコンストラクトの構造は、ヒト、マウスおよび他のげっ歯類ならびに他の非ヒト哺乳動物からの初代細胞を含む哺乳動物の初代細胞などの初代細胞において、インターフェロン応答を誘導しない。ある態様において、ＲＮＡｉコンストラクトはまた、無脊椎生物において標的遺伝子の発現を阻害するためにも使用されてもよい。
対象となるコンストラクトのin vivoでの安定性をさらに増大させるために、ヘアピン構造の３’末端は、保護基（単数または複数）により遮断されてもよい。例えば反転(inverted)ヌクレオチド、反転脱塩基部分またはアミノ末端修飾ヌクレオチドなどの保護基が使用されてもよい。反転ヌクレオチドは、反転デオキシヌクレオチドを含んでもよい。反転脱塩基部分は、３’，３’連結または５’，５’連結されたデオキシ脱塩基部分などの、反転デオキシ脱塩基部分を含んでもよい。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、標的遺伝子（単数または複数）によりコードされるいずれの標的タンパク質の合成をも阻害することができる。本発明は、細胞において、in vitroまたはin vivoのいずれかで、標的遺伝子の発現を阻害する方法を含む。したがって、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、標的遺伝子の過剰発現により特徴づけられる疾患を持つ患者を処置するのに有用である。
標的遺伝子は、細胞にとって内因性であっても外因性（例として、ウイルスにより、または、組み換えＤＮＡ技術を使用して、細胞に導入されたもの）であってもよい。かかる方法は、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量でのＲＮＡの細胞内への導入を含んでもよい。例として、かかるＲＮＡ分子は、組成物が標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的なガイド鎖を有してもよい。
本発明はまた、本発明の核酸を発現するベクター、および、かかるベクターまたは核酸を含む細胞にも関する。細胞は、in vivoのまたは培養中の、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
本発明はさらに、対象となるＲＮＡｉコンストラクトと薬学的に許容し得るキャリアまたは希釈剤とを含む、組成物に関する。
本発明の別の側面は、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、目の細胞を、対象となるＲＮＡｉコンストラクトのいずれかと接触させることを含む。
方法は、in vitroで、ex vivoで、または、in vivoで、例えば、培養中のヒト細胞などの培養中の哺乳動物細胞において行ってもよい。
標的細胞（例として哺乳動物細胞）は、脂質（例としてカチオン性脂質）またはリポソームなどの送達試薬の存在下において、接触させられてもよい。
本発明の別の側面は、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物細胞を、対象となるＲＮＡｉコンストラクトを発現するベクターと接触させることを含む。
本発明の一側面において、約１６〜約３０ヌクレオチドの範囲のサイズである第１のポリヌクレオチドと、約２６〜約４６ヌクレオチドの範囲のサイズである第２のポリヌクレオチドとを含む、より長いデュプレックスポリヌクレオチドが提供され、ここで、第１のポリヌクレオチド（アンチセンス鎖）は、第２のポリヌクレオチド（センス鎖）および標的遺伝子の両方に対して相補的であり、両方のポリヌクレオチドは、デュプレックスを形成し、ここで、第１のポリヌクレオチドは、長さが６塩基より長い一本鎖領域を含有し、別の化学修飾パターンにより修飾されており、および／または、細胞送達を容易にする抱合体部分を含む。この態様において、パッセンジャー鎖のヌクレオチドの約４０〜約９０％、ガイド鎖のヌクレオチドの約４０〜約９０％、第１のポリヌクレオチドの一本鎖領域のヌクレオチドの約４０〜約９０％が、化学修飾ヌクレオチドである。
一態様において、ポリヌクレオチドデュプレックス中の化学修飾ヌクレオチドは、上で詳細に議論されたものなどの、当該技術分野において知られているいずれの化学修飾ヌクレオチドであってもよい。特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、２’Ｆ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾されたものおよび２’デオキシヌクレオチドからなる群から選択される。別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の「疎水性修飾」から生じる。別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドはホスホロチオアートである。さらなる別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオアート、２’−Ｏ−メチル、２’デオキシ、疎水性修飾およびホスホロチオアートの組み合わせである。これらの群の修飾が、リボース環、主鎖およびヌクレオチドの修飾を指すなら、いくつかの修飾ヌクレオチドが、３つの修飾の型全ての組み合わせを持つことも実行可能である。
別の態様において、化学修飾は、デュプレックスの多様な領域にわたって同一ではない。特定の態様において、第１のポリヌクレオチド（パッセンジャー鎖）は、多数の多様な化学修飾を、多様な部位において有する。このポリヌクレオチドについて、ヌクレオチドの９０％までが化学修飾されていてもよく、および／または、導入されたミスマッチを有していてもよい。
別の態様において、第１のまたは第２のポリヌクレオチドの化学修飾は、これらに限定されないが、５’位のウリジンおよびシトシンの修飾（４−ピリジル、２−ピリジル、インドリル、フェニル（Ｃ６Ｈ５ＯＨ）；トリプトファニル（Ｃ８Ｈ６Ｎ）ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；ナフチルなど）を含み、ここで、化学修飾は、ヌクレオチドの塩基対形成能力を変化させる場合がある。ガイド鎖について、本発明のこの側面の重要な特徴は、アンチセンスの５’末端に対する化学修飾の位置および配列である。例えば、ガイド鎖の５’末端の化学的リン酸化は通常、効力のために有益である。センス鎖のシード領域（５’末端に対して２〜７位）におけるＯ−メチル修飾は、一般に良好な耐性を示さないが、一方、２’Ｆおよびデオキシは、良好な耐性を示す。ガイド鎖の中間部分およびガイド鎖の３’末端は、適用される化学修飾の型において、より許容的である。デオキシ修飾は、ガイド鎖の３’末端においては、耐性を示さない。
本発明のこの側面のユニークな特徴は、塩基に対する疎水性の修飾の使用を伴う。一態様において、疎水性修飾は好ましくは、ガイド鎖の５’末端付近に位置し、他の態様においては、それらはガイド鎖の中間に局在し、他の態様においては、それらはガイド鎖の３’末端に局在し、さらに別の態様において、それらは、ポリヌクレオチドの全長を通して分布する。同じ型のパターンが、デュプレックスのパッセンジャー鎖に適用可能である。
分子の他方の部分は、一本鎖領域である。一本鎖領域は、７から４０までのヌクレオチドの範囲であると予測される。
一態様において、第１のポリヌクレオチドの一本鎖領域は、４０％〜９０％の疎水性塩基修飾、４０％〜９０％のホスホロチオアート、４０％〜９０％のリボース部分の修飾、および、前述のもののあらゆる組み合わせからなる群から選択される修飾を含有する。
ガイド鎖（第１のポリヌクレオチド）のＲＩＳＣ複合体中へのローディングの効率は、重度に修飾されたポリヌクレオチドについて変わる場合があるので、一態様においては、効率的なガイド鎖のローディングを促進するために、デュプレックスポリヌクレオチドは、ガイド鎖（第１のポリヌクレオチド）上のヌクレオチド９、１１、１２、１３または１４と、センス鎖（第２のポリヌクレオチド）上の反対のヌクレオチドとの間のミスマッチを含む。
より詳細な本発明の側面は、以下のセクションにおいて記載される。
デュプレックスの特徴
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの別々の相補的な核酸鎖により形成されてもよい。デュプレックス形成は、標的遺伝子を含有する細胞の内側または外側のいずれかで生じ得る。
本明細書に使用される用語「デュプレックス(duplex)」は、相補的な配列に水素結合している二本鎖(double-stranded)核酸分子（単数または複数）の領域を含む。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子に対してセンスであるヌクレオチド配列、および、標的遺伝子に対してアンチセンスである相補配列を含んでもよい。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列に対応し、例として、標的遺伝子配列と同一であるかまたは標的遺伝子の阻害をもたらすために十分に同一（例として、ほぼ少なくとも約９８％同一、９６％同一、９４％、９０％同一、８５％同一または８０％同一）である。
ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端においても突出する一本鎖配列を有さない、すなわち、平滑末端である。他の態様において、個々の核酸分子は、異なる長さであってもよい。言い換えると、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖でない。例えば、２つの別々の核酸分子が使用されるとき、分子の一方、例えばアンチセンス配列を含む第１の分子は、それにハイブリダイズする第２の分子より長くてもよい（分子の一部を一本鎖とする）。同様に、単一の核酸分子が使用されるとき、分子のいずれかの末端の部分が一本鎖のままであり得る。
一態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチおよび／またはループまたはバルジを含有するが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％〜９５％にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％〜９８％にわたって二本鎖である。ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくともまたは最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個までのミスマッチを含有する。
修飾
本発明のヌクレオチドは、糖部分、ホスホジエステル連結部および／または塩基を含む、多様な位置において修飾されてもよい。
いくつかの態様において、ヌクレオシドの塩基部分は修飾されてもよい。例えば、ピリミジン塩基はピリミジン環の２、３、４、５、および／または６位において修飾されてもよい。いくつかの態様において、シトシンの環外アミンが修飾されてもよい。プリン塩基もまた修飾されてもよい。例えば、プリン塩基は、１、２、３、６、７または８位において修飾されてもよい。いくつかの態様において、アデニンの環外アミンが修飾されてもよい。いくつかのケースにおいて、塩基部分の環の窒素原子は、例えば炭素などの別の原子で置換されてもよい。塩基部分への修飾は、いずれの好適な修飾でもあってもよい。修飾の例は当業者に知られている。いくつかの態様において、塩基の修飾は、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または、その他のヘテロ環を含む。
いくつかの態様において、ピリミジンは５位において修飾されてもよい。例えばピリミジンの５位は、アルキル基、アルキニル基、アルケニル基、アシル基またはこれらの置換誘導体により修飾されてもよい。他の例において、ピリミジンの５位は、ヒドロキシル基またはアルコキシル基またはこれらの置換誘導体により修飾されてもよい。また、ピリミジンのＮ４位をアルキル化してもよい。さらに他の例において、ピリミジン５−６結合は飽和されていてもよく、ピリミジン環内の窒素原子は炭素原子により置換されてもよく、および／または、Ｏ２またはＯ４原子は、硫黄原子により置換されてもよい。他の修飾も可能であることが理解されるべきである。
他の例において、プリンのＮ７位および／またはＮ２および／またはＮ３位は、アルキル基またはその置換誘導体により修飾されてもよい。さらなる例において、第３環はプリン二環系に縮合されてもよく、および／または、プリン環系内の窒素原子は炭素原子で置換されてもよい。他の修飾も可能であることが理解されるべきである。
５位で修飾されたピリミジンの非限定的例は、米国特許第5591843号、米国特許第7,205,297号、米国特許第6,432,963号および米国特許第6,020,483号に開示されており；Ｎ４位で修飾されたピリミジンの非限定的例は、米国特許第5,580,731号に開示されており；８位で修飾されたプリンの非限定的例は、米国特許第6,355,787号および米国特許第5,580,972号に開示されており；Ｎ６位で修飾されたプリンの非限定的例は、米国特許第4,853,386号、米国特許第5,789,416号および米国特許第7,041,824号に開示されており；２位で修飾されたプリンの非限定的例は、米国特許第4,201,860号および米国特許第5,587,469号に開示されており；これらの全ては、参照して本明細書に組み込まれる。
修飾塩基の非限定的例は、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、７−デアザキサントシン、７−デアザグアノシン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、プソイドウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリンを含む。いくつかの態様において、塩基部分はプリンまたはピリミジン以外のヘテロ環式塩基であってもよい。ヘテロ環式塩基は任意に修飾および／または置換されてもよい。
糖部分は、天然の未修飾糖、例として単糖（ペントース、例としてリボース、デオキシリボース）、修飾糖および糖アナログを含む。一般に、可能なヌクレオモノマーの修飾、特に糖部分のものは、例えば、１以上のヒドロキシル基のハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基での置き換え、または、ヒドロキシル基の、エーテル、アミン、チオールなどとしての官能化を含む。
修飾ヌクレオモノマーの特に有用な一群は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。かかる２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、「メチル化されている」として言及されてもよく、対応するヌクレオチドは、非メチル化ヌクレオチドからアルキル化により、または直接的にメチル化ヌクレオチド試薬から、作られてもよい。修飾ヌクレオモノマーは、未修飾ヌクレオモノマーと組み合わせて使用されてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、メチル化および非メチル化ヌクレオモノマーの両方を含有してもよい。
いくつかの例示的な修飾ヌクレオモノマーは、糖または骨格(backbone)が修飾されたリボヌクレオチドを含む。修飾リボヌクレオチドは、５’位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例として５’−（２−アミノ）プロピルウリジンおよび５’−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例として８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例として７−デアザ−アデノシン；ならびにＮ−アルキル化ヌクレオチド、例としてＮ６−メチルアデノシンなどの、天然に存在しない塩基を（天然に存在する塩基の代わりに）含有してもよい。また、糖修飾リボヌクレオチドは、Ｈ、アルコキシ（もしくはＯＲ）、Ｒもしくはアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２など）またはＣＮ基で置き換えられた２’−ＯＨ基をも有していてもよく、ここで、Ｒは、低級アルキル、アルケニルまたはアルキニルである。
修飾リボヌクレオチドはまた、修飾基、例としてホスホロチオアート基により置き換えられた、隣接するリボヌクレオチドに繋げられたホスホジエステル基をも有してもよい。より一般的には、多様なヌクレオチド修飾が組み合わされてもよい。
アンチセンス（ガイド）鎖は、標的遺伝子（単数または複数）の少なくとも一部に対して実質的に同一であってもよいが、少なくとも塩基対形成特性に関連して、配列は、有用であるため、例として標的遺伝子の表現型の発現を阻害するために、完全に同一である必要はない。一般により高い相同性は、より短いアンチセンス遺伝子の使用を埋め合わせるために使用され得る。いくつかのケースにおいて、アンチセンス鎖は、一般に、標的遺伝子に対して（アンチセンス方向において）実質的に同一であろう。
２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡの使用はまた、細胞ストレス応答を最少化することが望ましい状況においても有益であり得る。２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマーを有するＲＮＡは、未修飾ＲＮＡを認識すると考えられる細胞機構によって認識され得ない。２’−Ｏ−メチル化されたかまたは部分的に２’−Ｏ−メチル化されたＲＮＡは、標的ＲＮＡ阻害を維持しつつ、二本鎖核酸に対するインターフェロン応答を回避し得る。これは、例えば、インターフェロンまたは他の細胞ストレス応答を回避するために、インターフェロン応答を誘導する短いＲＮＡｉ（例としてｓｉＲＮＡ）配列、および、インターフェロン応答を誘導し得るより長いＲＮＡｉ配列の両方において、有用であり得る。
全体として、修飾糖は、Ｄ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチルを含む）、すなわち、２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、２’−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニルならびにシアノなどを含む。一態様において、糖部分は、記載されるように（Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992)）、ヘキソースであってもよく、オリゴヌクレオチド中に組み込まれてもよい。例示的なヌクレオモノマーは、例として米国特許第5,849,902号において見出され得、これは本明細書に参照して組み込まれる。
具体的な官能基の定義および化学用語は、以下にさらに詳細に記載される。本発明の目的のために、化学元素はCAS versionのHandbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.の内表紙の元素周期表に従って同定され、具体的な官能基はこれに記載のようにして一般的に定義される。さらに、有機化学の一般原理ならびに具体的な官能部分および反応性は、Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999に記載され、この内容の全体は参照して本明細書に組み込まれる。
本発明のある化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性形態で存在してもよい。本発明は全てのかかる化合物を考慮し、これにはｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−異性体、Ｒ−およびＳ−鏡像異性体、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、これらのラセミ混合物、および、これらのその他の混合物を、本発明の範囲内であるとして含む。追加の不斉炭素原子が、アルキル基などの置換基中に存在してよい。全てのかかる異性体およびこれらの混合物は、本発明に含むことが意図される。
種々の異性体比のいずれかを含有する異性体混合物は、本発明に従って利用されてもよい。例えば、２種の異性体のみが組み合わせられるとき、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、９９：１または１００：０の異性体比を含有する混合物は全て、本発明に考慮される。当業者は容易に、さらに複雑な異性体混合物について類似の比率が考慮されることを理解するであろう。
例えば本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望される場合、これは不斉合成により、または、キラル補助基による誘導体化により調製されてもよく、ここで得られたジアステレオマー混合物は分離され、補助基が切断されて、純粋な所望のエナンチオマーが提供される。代わりに、分子がアミノなどの塩基性官能基を含有する場合またはカルボキシルなどの酸性官能基を含有する場合、ジアステレオマー塩が、適切な光学活性酸または塩基により形成され、次いでこうして形成されたジアステレオマーが、当該技術分野において周知の分別結晶化またはクロマトグラフィー手段により分割され、続いて純粋なエナンチオマーが回収される。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’および５’終端(termini)を含む（環状オリゴヌクレオチドを除く）。一態様において、オリゴヌクレオチドの３’および５’終端は、例えば３’または５’結合を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護され得る（例として米国特許第5,849,902号およびWO 98/13526）。例えば、オリゴヌクレオチドは「ブロック基(blocking group)」を含めることにより抵抗性になされ得る。本明細書に使用される用語「ブロック基」は、合成のための保護基または結合基のどちらかとしてオリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに付着され得る、置換基（例としてＯＨ基以外のもの）を指す（例として、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ホスファート（ＰＯ３ ２−）、ホスホン酸水素またはホスホロアミダイト)。「ブロック基」はまた、「末端ブロック基」または「エキソヌクレアーゼブロック基」をも含み、これらは、修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ抵抗性構造を含む、オリゴヌクレオチドの、３’および５’終端を保護する。
例示の末端ブロック基は、キャップ構造（例として７−メチルグアノシンキャップ）、反転(inverted)ヌクレオモノマー、例として３’−３’または５’−５’末端反転を有するもの（例としてOrtiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev. 2:129を参照）、メチルホスホナート、ホスホロアミダイト、非ヌクレオチド基（例として、非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、抱合体）などを含む。３’末端ヌクレオモノマーは、修飾糖部分を含み得る。３’末端ヌクレオモノマーは、オリゴヌクレオチドの３’−エキソヌクレアーゼ分解を防ぐブロック基により任意に置換され得る３’−Ｏを含む。例えば、３’−ヒドロキシルは、３’→３’ヌクレオチド間連結物を介してヌクレオチドにエステル化され得る。例えば、アルキルオキシラジカルは、メトキシ、エトキシまたはイソプロポキシであり得、好ましくはエトキシである。任意に、３’末端における３’→３’結合ヌクレオチドは、代替連結により連結され得る。ヌクレアーゼ分解を低減するために、最も５’の３’→５’連結部は、修飾連結部、例としてホスホロチオアートまたはＰ−アルキルオキシホスホトリエステル連結部であることができる。好ましくは、２つの最も５’の３’→５’連結物は、修飾連結部である。任意に、５’末端ヒドロキシ部分は、リン含有部分、例として、ホスファート、ホスホロチオアートまたはＰ−エトキシホスファートで、エステル化され得る。
合成方法が、本明細書に記載のとおり、種々の保護基を利用することを、当業者は理解するであろう。本明細書で使用される用語「保護基」は、特定の官能部分、例としてＯ、ＳまたはＮを一時的に遮断して、多官能性化合物における別の反応部位にて反応が選択的に行われ得ることを意味する。ある態様において、保護基は良好な収率で選択的に反応して、計画された反応に対して安定である、保護された基質を与える；保護基は、容易に利用可能で好ましくは非毒性の、他の官能基を攻撃しない試薬により、良好な収率で選択的に除去可能であるべきである；保護基は、容易に分離可能な誘導体を（より好ましくは、新しい立体中心の生成なしに）形成する；および、保護基は、さらなる反応部位を回避するために最小数の付加的な官能性を有する。
本明細書に詳述されるとおり、酸素、硫黄、窒素および炭素の保護基が利用されてもよい。ヒドロキシル保護基は以下を含む：メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−ＡＯＭ）、グアイアコルメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、
１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、
４，４’，４’’−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イル）ビス（４’，４’’−ジメトキシフェニル）メチル、１，１− ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル(dimethylthexylsilyl)、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルマート、ベンゾイルホルマート、アセタート、クロロアセタート、ジクロロアセタート、トリクロロアセタート、トリフルオロアセタート、
メトキシアセタート、トリフェニルメトキシアセタート、フェノキシアセタート、ｐ−クロロフェノキシアセタート、３−フェニルプロピオナート、４−オキソペンタノアート（レブリナート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノアート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロアート、アダマントアート、クロトナート、４−メトキシクロトナート、ベンゾアート、ｐ−フェニルベンゾアート、２，４，６−トリメチルベンゾアート（メシトアート）、アルキルメチルカーボナート、９−フルオレニルメチルカーボナート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカーボナート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカーボナート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボナート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボナート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボナート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカーボナート、アルキルビニルカーボナート、アルキルアリルカーボナート、アルキルｐ−ニトロフェニルカーボナート、アルキルベンジルカーボナート、アルキルｐ−メトキシベンジルカーボナート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカーボナート、アルキルｏ−ニトロベンジルカーボナート、
アルキルｐ−ニトロベンジルカーボナート、アルキルＳ−ベンジルチオカーボナート、４−エトキシ−１−ナフチルカーボナート、メチルジチオカーボナート、２−ヨードベンゾアート、４−アジドブチラート、４−ニトロ−４−メチルペンタノアート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾアート、２−フォルミルベンゼンスルホナート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチラート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾアート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセタート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセタート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセタート、クロロジフェニルアセタート、イソブチラート、モノスクシノアート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノアート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾアート、α−ナフトアート、ニトラート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダート、アルキルＮ−フェニルカルバマート、ボラート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェナート(dinitrophenylsulfenate)、スルファート、メタンスルホナート（メシラート）、ベンジルスルホナートおよびトシラート（Ｔｓ）。
１，２−または１，３−ジオールを保護するためには、保護基は以下を含む：メチレンアセタール、エチリデンアセタール、１−ｔ−ブチルエチリデンケタール、１−フェニルエチリデンケタール、（４−メトキシフェニル）エチリデンアセタール、２，２，２−トリクロロエチリデンアセタール、アセトニド、シクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、ｐ−メトキシベンジリデンアセタール、２，４− ジメトキシベンジリデンケタール、３，４−ジメトキシベンジリデンアセタール、２−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルトエステル、１−メトキシエチリデンオルトエステル、１−エトキシエチリデンオルトエステル、１，２−ジメトキシエチリデンオルトエステル、α−メトキシベンジリデンオルトエステル、１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチリデン誘導体、α−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）ベンジリデン誘導体、
２−オキサシクロペンチリデンオルトエステル、ジ−ｔ−ブチルシリレン基（ＤＴＢＳ）、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）誘導体（ＴＩＰＤＳ）、テトラ−ｔ−ブトキシジシロキサン−１，３−ジイリデン誘導体（ＴＢＤＳ）、環状カーボナート、環状ボロナート、エチルボロナートおよびフェニルボロナート。アミノ保護基は、以下を含む：メチルカルバマート、エチルカルバマート、９−フルオレニルメチルカルバマート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチル(fluoroenylmethyl)カルバマート、９−（２，７−ジブロモ）フルオレニルメチルカルバマート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバマート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバマート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバマート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバマート（Ｔｅｏｃ）、
２−フェニルエチルカルバマート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバマート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバマート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバマート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバマート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニルイル）エチルカルバマート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバマート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバマート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバマート、ｔ−ブチルカルバマート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバマート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバマート（Ｖｏｃ）、アリルカルバマート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバマート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバマート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバマート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバマート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバマート、アルキルジチオカルバマート、ベンジルカルバマート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバマート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジルカルバマート、ｐ−ブロモベンジルカルバマート、ｐ−クロロベンジルカルバマート、
２，４−ジクロロベンジルカルバマート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバマート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバマート、ジフェニルメチルカルバマート、２−メチルチオエチルカルバマート、２−メチルスルホニルエチルカルバマート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバマート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバマート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバマート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバマート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバマート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバマート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバマート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバマート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバマート、５−ベンズイソキサゾリルメチルカルバマート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバマート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバマート、３，５−ジメトキシベンジルカルバマート、ｏ−ニトロベンジルカルバマート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバマート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバマート、フェノチアジニル−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、ｔ−アミルカルバマート、Ｓ−ベンジルチオカルバマート、ｐ−シアノベンジルカルバマート、シクロブチルカルバマート、シクロヘキシルカルバマート、
シクロペンチルカルバマート、シクロプロピルメチルカルバマート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバマート、２，２−ジメトキシカルボニルビニルカルバマート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバマート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバマート、１，１−ジメチルプロピニルカルバマート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバマート、２−フラニルメチルカルバマート、２−ヨードエチルカルバマート、イソボルニルカルバマート、イソブチルカルバマート、イソニコチニルカルバマート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバマート、１−メチルシクロブチルカルバマート、１−メチルシクロヘキシルカルバマート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバマート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバマート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバマート、
１−メチル−１−フェニルエチルカルバマート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバマート、フェニルカルバマート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバマート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバマート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバマート、２，４，６−トリメチルベンジルカルバマート、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、
４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミド、ｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミド、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、 Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン−３−イル）アミン、第四級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、
Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリシリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリシリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ぺンタカルボニルクロム−またはタングステン）カルボニル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、
ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミダート、ジベンジルホスホルアミダート、ジフェニルホスホルアミダート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、
２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミドおよびフェナシルスルホンアミド。例示の保護基は本明細書に詳述される。しかしながら本発明は、これらの保護基に限定されることを意図せず、むしろ、種々の追加の等価な保護基が上の基準を使用して容易に同定され、本発明の方法において利用され得ることが理解される。加えて、種々の保護基についてはProtective Groups in Organic Synthesis, Third Ed. Greene, T.W. and Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999に記載されており、この内容の全体は本明細書に参照して組み込まれる。
本明細書に記載のとおり、化合物は、あらゆる数の置換基または官能部分により置換されてよいことが理解される。一般に、用語「任意に」が先行するかどうかに関わらず、用語「置換された」およびこの発明の式中に含まれる置換基は、所与の構造中の水素ラジカルの、特定置換基のラジカルによる置き換えを指す。任意の所与の構造中の１つより多くの位置が、特定群から選択された１より多くの置換基により置換されてもよい場合、置換基は各位置において同一であっても異なっていてもよい。本明細書に使用される用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容し得る置換基を含むと考えられる。広い見地からは、許容し得る置換基は、有機化合物の、非環式および環式、分枝および非分枝、炭素環式およびヘテロ環式、芳香族および非芳香族置換基を含む。
窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の原子価を満たす、本明細書に記載の有機化合物のいずれの許容し得る置換基を有してよい。その上、本発明は、いかなる様式においても、有機化合物の許容し得る置換基によって限定されることを意図しない。本発明により想定される置換基および変数の組み合わせは、好ましくは、例えば感染症または増殖性疾患などの処置に有用な安定な化合物の形成をもたらすものである。用語「安定な」とは、好ましくは、本明細書において、製造を可能とするのに十分な安定性を有し、検出されるのに十分な時間の間化合物の完全性を維持し、好ましくは本明細書に詳述される目的のために十分な時間有用であるような、化合物を指す。
本明細書に使用される用語「脂肪族」は、飽和および不飽和両方の、直鎖（すなわち非分枝）、分枝、非環式、環式または多環式の脂肪族炭化水素であって、任意に１以上の官能基により置換されているものを含む。当業者に理解されるとおり、本明細書において「脂肪族」は、これらに限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびシクロアルキニル部分を含むことを意図する。よって、本明細書に使用される用語「アルキル」は、直鎖、分枝および環式アルキル基を含む。類似の慣例がその他の一般的用語、例えば「アルケニル」、「アルキニル」などにも適用される。その上、本明細書に使用される用語「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」などは、置換および非置換基の両方を包含する。ある態様において、本明細書で使用される場合「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基（環式、非環式、置換、非置換、分枝または非分枝）を示すために使用される。
ある態様において、本発明に採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、１〜２０個の脂肪族炭素原子を含有する。ある態様において、本発明で採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、１〜１０個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の態様において、本発明で採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、１〜８個の脂肪族炭素原子を含有する。さらなる他の態様において、本発明で採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、１〜６個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の態様において、本発明で採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、１〜４個の脂肪族炭素原子を含有する。よって例示の脂肪族基は、これらに限定されないが、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、−ＣＨ２−シクロプロピル、ビニル、アリル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、−ＣＨ２−シクロブチル、ｎ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、シクロペンチル、−ＣＨ２−シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、シクロヘキシル、−ＣＨ２−シクロヘキシル部分等を含み、これは重ねて、１以上の置換基を有してもよい。アルケニル基は、これらに限定されないが、例えばエテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどを含む。代表的なアルキニル基は、これらに限定されないが、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−プロピニルなどを含む。
本発明の化合物の、上記の脂肪族（およびその他の）部分の置換基のいくつかの例は、これらに限定されないが以下を含む：脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘ；ここでＲｘの出現の各々は独立して、これらに限定されないが、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルを含み、ここで、上記および本明細書に記載の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル置換基のいずれもが、置換または非置換、分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、およびここで、上記および本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれもが、置換または非置換であってよい。一般に適用可能な置換基の追加の例は、本明細書に記載の具体的態様により説明される。
本明細書に使用される用語「ヘテロ脂肪族」は、例えば炭素原子の代わりに、１以上の酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素原子を含む脂肪族部分を指す。ヘテロ脂肪族部分は分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、モルホリノ、ピロリジニルなどの飽和および不飽和のヘテロ環を含んでもよい。ある態様において、ヘテロ脂肪族部分は、その上にある１以上の水素原子の、下記を含むがこれらに限定はされない１以上の部分による独立した置き換えによって置換される：脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘ；ここでＲｘの出現の各々は独立して、これらに限定されないが、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルを含み、ここで、上記および本明細書に記載の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル置換基のいずれもが、置換または非置換、分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、およびここで、上記および本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれもが、置換または非置換であってよい。一般に適用可能な置換基の追加の例は、本明細書に記載の具体的態様により説明される。
本明細書に使用される用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される原子を指す。
用語「アルキル」は、飽和脂肪族基を含み、これは、直鎖アルキル基（例としてメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキルは、６個以下（例として直鎖についてはＣ１〜Ｃ６、分枝鎖についてはＣ３〜Ｃ６）、より好ましくは４個以下の炭素原子をその骨格中に有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、３〜８個の炭素原子をその環構造中に有し、より好ましくは５または６個の炭素を環構造中に有する。用語Ｃ１〜Ｃ６は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を含有する。
その上、他に特定されない限りにおいて、用語アルキルは、「非置換のアルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の１以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有する、アルキル部分を指す。かかる置換基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルファート類、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。シクロアルキルは、例として上記の置換基により、さらに置換されてもよい。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部分は、アリールで置換されたアルキル（例としてフェニルメチル（ベンジル））である。用語「アルキル」はまた、天然または非天然のアミノ酸の側鎖をも含む。用語「ｎ−アルキル」は、直鎖（すなわち、非分枝）の非置換のアルキル基を意味する。
用語「アルケニル」は、上記のアルキルと長さが類似し、これと置換が可能な不飽和脂肪族基であるが、少なくとも１つの二重結合を含むものを含む。例えば、用語「アルケニル」は、直鎖アルケニル基（例としてエチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルケニル基は、６個以下の炭素原子をその骨格中に有する（例として直鎖についてはＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。同様に、シクロアルケニル基は、その環構造中に３〜８個の炭素原子、より好ましくは環構造中に５または６個の炭素を有してもよい。用語Ｃ２〜Ｃ６は、２〜６個の炭素原子を含むアルケニル基を含有する。
その上、他に特定されない限りにおいて、用語アルケニルは、「非置換のアルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の１以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有する、アルケニル部分を指す。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルファート類、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。
用語「アルキニル」は、上記のアルキルと長さが類似し、これと置換が可能な不飽和脂肪族基であるが、少なくとも１つの三重結合を含むものを含む。例えば、用語「アルキニル」は、直鎖アルキニル基（例としてエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分枝鎖アルキニル基およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキニル基は、６個以下の炭素原子をその骨格中に有する（例として直鎖についてはＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。用語Ｃ２〜Ｃ６は、２〜６個の炭素原子を含むアルキニル基を含有する。
その上、他に特定されない限りにおいて、用語アルキニルは、「非置換のアルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の１以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有するアルキニル部分を指す。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルファート類、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。
炭素の数が他に特定されない限りにおいて、「低級アルキル」は、本明細書に使用されるとおり、上で定義されるが、１〜５個の炭素原子をその骨格構造中に有するアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば２〜５個の炭素原子の鎖長を有する。
用語「アルコキシ」は、酸素原子に共有結合している置換および非置換のアルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシ基を含む。置換アルコキシ基の例は、ハロゲン化アルコキシ基を含む。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフフィドリル(sulffydryl)、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルファート類、アルキルスルフミル(slkylsulfmyl)、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの、独立して選択される基により置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例は、これらに限定されないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどを含む。
用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外のあらゆる元素の原子を含む。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄およびリンである。
用語「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、（適切なカウンターイオンとともに）−ＯＨまたは−Ｏ−を持つ基を含む。
用語「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などを含む。用語「過ハロゲン化」は一般に、全ての水素がハロゲン原子により置き換えられている部分を指す。
用語「置換される」は、当該部分に配置され得、当該分子がその意図する機能を行うことを可能にする、独立して選択される置換基を含む。置換基の例は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｃ（ハロゲン）３、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨ（ハロゲン）２、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｓ（Ｏ）１〜２ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｓ（Ｏ）０〜２Ｒ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯ２Ｒ’、または（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＯＲ’基；ここで各Ｒ’およびＲ’’は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニルもしくはアリール基であるか、または、Ｒ’およびＲ’’は、一緒になって、ベンジリデン基もしくは−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２−基である、を含む。
用語「アミン」または「アミノ」は、窒素原子が少なくとも１個の炭素またはヘテロ原子に共有結合している化合物または部分を含む。用語「アルキルアミノ」は、窒素が少なくとも１つのさらなるアルキル基に結合している基および化合物を含む。用語「ジアルキルアミノ」は、窒素原子が、少なくとも２つの追加のアルキル基に結合している基を含む。
用語「エーテル」は、２個の異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合した酸素を含有する化合物または部分を含む。例えば、この用語は、「アルコキシアルキル」を含み、これは、別のアルキル基に共有結合した酸素原子に共有結合しているアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」および「オリゴヌクレオチド」は、２以上のヌクレオチドのポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの誘導体もしくは修飾バージョンであり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格において修飾され得、例えば分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータなどが改善される。ポリヌクレオチドは、限定することなく以下を含む群から選択される修飾塩基部分を含んでもよい：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン(galactosylqueosine)、イノシン、
Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６−ジアミノプリン。
ポリヌクレオチドは、修飾糖部分（例として２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノースおよびヘキソース）および／または修飾リン酸部分（例としてホスホロチオアートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）を含んでもよい。ヌクレオチド配列は典型的には、タンパク質および酵素を作るために細胞機構によって使用される情報を含む、遺伝情報を持つ。これらの用語は、二本鎖または一本鎖のゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、あらゆる合成のおよび遺伝子操作のポリヌクレオチド、および、センスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方を含む。これは、一本鎖および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびに、アミノ酸骨格に塩基を抱合させることにより形成された「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）を含む。
用語「塩基」は、知られているプリンおよびピリミジンヘテロ環式塩基、デアザプリンならびにそのアナログ（ヘテロ環置換アナログ、例としてアミノエトキシフェノキサジンを含む）、誘導体（例として１−アルキル−、１−アルケニル−、ヘテロ芳香族−および１−アルキニル誘導体）および互変異性体を含む。プリンの例は、アデニン、グアニン、イノシン、ジアミノプリンおよびキサンチンならびにそのアナログ（例として８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニンまたは７−ジアザキサンチン）および誘導体を含む。ピリミジンは、例えばチミン、ウラシルおよびシトシンならびにそれらのアナログ（例として５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシンおよび４，４−エタノシトシン）を含む。好適な塩基の他の例は、２−アミノピリジンおよびトリアジン類などの非プリニルおよび非ピリミジニル塩基を含む。
好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、ＲＮＡヌクレオチドである。別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。よって、オリゴヌクレオチドは、修飾ＲＮＡヌクレオチドを含有する。
用語「ヌクレオシド」は、糖部分、好ましくはリボースまたはデオキシリボースに共有結合した塩基を含む。好ましいヌクレオシドの例は、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含む。ヌクレオシドはまた、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基または保護基を含んでもよいアミノ酸またはアミノ酸アナログに連結した塩基をも含む。好適な保護基は当該技術分野において周知である（P. G. M. WutsおよびT. W. Greene、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第２版、Wiley-Interscience、New York、1999年を参照）。
用語「ヌクレオチド」は、ホスファート基またはホスファートアナログをさらに含むヌクレオシドを含む。
核酸分子は、分子の細胞への標的化および／または送達のために、疎水性部分と結びついてもよい。ある態様において、疎水性部分はリンカーを介して核酸分子と結びつく。ある態様において、結びつきは非共有結合性相互作用を介する。他の態様において、結びつきは共有結合を介する。当該技術分野において知られているいずれのリンカーも、核酸を疎水性部分に結びつけるために使用されてもよい。
当該技術分野において知られているリンカーは、公開された国際PCT出願：WO 92/03464、WO 95/23162、WO 2008/021157、WO 2009/021157、WO 2009/134487、WO 2009/126933、米国特許出願公開第2005/0107325号、米国特許第5,414,077号、米国特許第5,419,966号、米国特許第5,512,667号、米国特許第5,646,126号および米国特許第5,652,359号に記載されており、これらは本明細書に参照して組み込まれる。リンカーは、多原子リンカーに対する共有結合程度に単純であってもよい。リンカーは環式または非環式であってもよい。リンカーは、任意に置換されていてもよい。ある態様において、リンカーは核酸から切断されることができる。ある態様において、リンカーは、生理学的条件下で加水分解されることができる。ある態様において、リンカーは、酵素（例としてエステラーゼまたはホスホジエステラーゼ）により切断されることができる。
ある態様において、リンカーは、核酸を疎水性部分から分離するスペーサー要素を含む。スペーサー要素は１〜３０個の炭素またはヘテロ原子を含んでもよい。ある態様において、リンカーおよび／またはスペーサー要素はプロトン化可能な官能基を含む。かかるプロトン化可能な官能基は、核酸分子のエンドソーム脱出を促進してもよい。プロトン化可能な官能基はまた、核酸の細胞への送達を支援することもでき、例えば分子の全体の電荷を中性化する。他の態様において、リンカーおよび／またはスペーサー要素は、生物学的に不活性である（すなわち、もたらされる核酸分子に対して生物学的活性または機能を付与しない）。
ある態様において、リンカーおよび疎水性部分を持つ核酸分子は、本明細書に記載された式のものである。ある態様において、核酸分子は、式：
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ａは、結合；置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族であり；
Ｒ１は、疎水性部分であり；
Ｒ２は、水素；酸素保護基；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族；置換または非置換、分枝または非分枝のアシル；置換または非置換、分枝または非分枝のアリール；置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロアリールであり；および
Ｒ３は、核酸である、
で表される。
ある態様において、分子は、式：
で表される。
ある態様において、分子は、式：
で表される。
ある態様において、分子は、式：
で表される。
ある態様において、分子は、式：
で表される。
ある態様において、ＸはＮである。ある態様において、ＸはＣＨである。
ある態様において、Ａは結合である。ある態様において、Ａは、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、分枝または非分枝の脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝の脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のアルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜２０アルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜１２アルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜１０アルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜８アルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜６アルキルである。ある態様において、Ａは、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のヘテロ脂肪族である。
ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ａは、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ａは、式：
式中、
Ｒの出現の各々は、独立して、天然または非天然のアミノ酸の側鎖であり；および
ｎは、１から２０までの整数である、
で表される。ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ｒの出現の各々は、独立して、天然のアミノ酸の側鎖である。ある態様において、ｎは、１から１５までの整数である。ある態様において、ｎは、１から１０までの整数である。ある態様において、ｎは、１から５までの整数である。
ある態様において、Ａは、式：
式中、ｎは、１から２０までの整数である、
で表される。ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、ｎは、１から１５までの整数である。ある態様において、ｎは、１から１０までの整数である。ある態様において、ｎは、１から５までの整数である。
ある態様において、Ａは、式：
式中、ｎは、１から２０までの整数である、
で表される。ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、ｎは、１から１５までの整数である。ある態様において、ｎは、１から１０までの整数である。ある態様において、ｎは、１から５までの整数である。
ある態様において、分子は、式：
式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書に定義された通りであり；および
Ａ’は、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族であるか；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である、
で表される。
ある態様において、Ａ’は、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ｒ１はステロイドである。ある態様において、Ｒ１はコレステロールである。ある態様において、Ｒ１は親油性ビタミンである。ある態様において、Ｒ１はビタミンＡである。ある態様において、Ｒ１はビタミンＥである。
ある態様において、Ｒ１は、式：
式中、ＲＡは、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族であるか；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である、
で表される。
ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。
ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。
ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。
ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。
ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ａは、結合；置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族であり；
Ｒ１は、疎水性部分であり；
Ｒ２は、水素；酸素保護基；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族；置換または非置換、分枝または非分枝のアシル；置換または非置換、分枝または非分枝のアリール；置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロアリールであり；および
Ｒ３は、核酸である、
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ａは、結合；置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族であり；
Ｒ１は、疎水性部分であり；
Ｒ２は、水素；酸素保護基；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族；置換または非置換、分枝または非分枝のアシル；置換または非置換、分枝または非分枝のアリール；置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロアリールであり；および
Ｒ３は、核酸である、
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ａは、結合；置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族であり；
Ｒ１は、疎水性部分であり；
Ｒ２は、水素；酸素保護基；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族；置換または非置換、分枝または非分枝のアシル；置換または非置換、分枝または非分枝のアリール；置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロアリールであり；および
Ｒ３は、核酸である、
で表される。ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
式中、Ｒ３は、核酸である、
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
式中、Ｒ３は、核酸であり；および
ｎは、１から２０までの整数である。
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
本明細書に使用される用語「連結部(linkage)」は、天然に存在する、隣接するヌクレオモノマーに共有結合する未修飾ホスホジエステル部分（−Ｏ−（ＰＯ２−）−Ｏ−）を含む。本明細書に使用される用語「置換連結部(substitute linkage)」は、ネイティブなホスホジエステル基の、隣接するヌクレオモノマーに共有結合するあらゆるアナログまたは誘導体を含む。置換連結部は、ホスホジエステルアナログ、例としてホスホロチオアート、ホスホロジチオアートおよびＰ−エチオキシホスホジエステル(P-ethyoxyphosphodiester)、Ｐ−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホジエステル、メチルホスホナートおよびリンを含有しない結合、例としてアセタールおよびアミドを含む。かかる置換連結部は、当該技術分野において知られている（例としてBjergarde et al. 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843; Caruthers et al. 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47）。ある態様において、ホスホロチオアート連結部などの非加水分解性連結部が好ましい。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、疎水的に修飾されたヌクレオチドまたは「疎水性修飾」を含む。本明細書に使用される「疎水性修飾」は、（１）塩基の全体的な疎水性が著しく増大し、および／または、（２）塩基がなお通常のワトソン−クリック相互作用に類似するものを形成することができるように修飾された塩基を指す。いくつかの非限定的な塩基修飾の例は、５位のウリジンおよびシチジン修飾、例えばフェニル、４−ピリジル、２−ピリジル、インドリル、および、イソブチル、フェニル（Ｃ６Ｈ５ＯＨ）；トリプトファニル（Ｃ８Ｈ６Ｎ）ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；およびナフチルを含む。
末端（３’または５’末端）、ループ領域またはｓｄ−ｒｘＲＮＡの他のいずれの部分にも付着し得る別の型の抱合体は、ステロール、ステロール型分子、ペプチド、低分子、タンパク質などを含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、１つより多い抱合体（同じまたは異なる化学的性質のもの）を含んでもよい。いくつかの態様において、抱合体は、コレステロールである。
標的遺伝子特異性を増大させるかまたはオフ・ターゲットサイレンシング作用を低減するための別の方法は、ガイド配列の５’末端の２番目のヌクレオチドに対応する位置にて、２’修飾（２’−Ｏ−メチル修飾など）を導入することである。これにより、ダイサー耐性ヘアピン構造におけるこの２’修飾の配置が可能になり、それにより、オフ・ターゲットサイレンシングがより少ないか、オフ・ターゲットサイレンシングを有さない、より良好なＲＮＡｉコンストラクトを設計することが可能となる。
一態様において、本発明のヘアピンポリヌクレオチドは、ＤＮＡである１つの核酸部分と、ＲＮＡである１つの核酸部分とを含み得る。本発明のアンチセンス（ガイド）配列は、ＲＮＡ様およびＤＮＡ様の領域を含む「キメラオリゴヌクレオチド」であり得る。
語「ＲＮａｓｅ Ｈ活性化領域」は、オリゴヌクレオチド、例としてキメラオリゴヌクレオチドの、当該オリゴヌクレオチドが結合する標的ＲＮＡ鎖を切断するＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる領域を含む。典型的には、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化領域は、ＤＮＡまたはＤＮＡ様ヌクレオモノマーの（少なくとも約３〜５、典型的には約３〜１２、より典型的には約５〜１２、より好ましくは約５〜１０の、連続したヌクレオモノマーの）最小コアを含む（例として米国特許第5,849,902号を参照）。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化領域は、約９個の連続したデオキシリボース含有ヌクレオモノマーを含む。
語「非活性化領域」は、アンチセンス配列、例としてキメラオリゴヌクレオチドの領域であって、ＲＮａｓｅ Ｈを動員または活性化しないものを含む。好ましくは、非活性化領域は、ホスホロチオアートＤＮＡを含まない。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非活性化領域を含む。一態様において、非活性化領域は、ヌクレアーゼに対して安定であることができるか、または、標的に対して相補的であることおよびオリゴヌクレオチドにより結合される標的核酸分子と水素結合を形成することにより、標的に対する特異性を提供し得る。
一態様において、連続したポリヌクレオチドの少なくとも一部は、置換連結部、例としてホスホロチオアート連結部により連結されている。
ある態様において、ガイド配列を超えるヌクレオチドの殆どまたは全ては（２’修飾されていようがいまいが）ホスホロチオアート連結部により連結されている。かかるコンストラクトは、その血清タンパク質に対するより高いアフィニティーに起因して、薬物動態が改善されている傾向がある。ポリヌクレオチドの非ガイド配列部分におけるホスホロチオアート連結部は一般に、一旦ガイド鎖がＲＩＳＣにロードされた後は、ガイド鎖の活性に干渉しない。
本発明のアンチセンス（ガイド）配列は、「モルホリノオリゴヌクレオチド」を含んでもよい。モルホリノオリゴヌクレオチドは非イオン性であり、ＲＮａｓｅ Ｈ非依存的機構により機能する。モルホリノオリゴヌクレオチドの４つの遺伝子塩基（アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン／ウラシル）は、６員のモルホリン環に連結されている。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例として非イオン性ホスホロジアミダート(phosphorodiamidate)サブユニット間連結部によって、４つの異なるサブユニット型を結合することにより作られる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、以下を含む多数の利点を有する：ヌクレアーゼに対する完全な耐性（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1996. 6:267）；予測可能な標的化（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；細胞における確実な活性（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:63）；優れた配列特異性（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:151）；最小限の非アンチセンス活性（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；および簡便な浸透圧または掻爬による送達（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:291）。モルホリノオリゴヌクレオチドはまた、高用量におけるその非毒性のために好ましい。モルホリノオリゴヌクレオチドの調製の議論は、Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:187において見出され得る。
本明細書に記載の化学修飾は、本明細書に記載のデータに基づき、一本鎖ポリヌクレオチドのＲＩＳＣ中へのローディングを促進すると考えられる。一本鎖ポリヌクレオチドは、ＲＩＳＣ中へのローディングおよび遺伝子サイレンシングの誘導において活性であることが示されている。しかしながら、一本鎖ポリヌクレオチドについての活性のレベルは、デュプレックスポリヌクレオチドと比較したとき、２〜４桁の規模でより低いと考えられる。
本発明は、（ａ）一本鎖ポリヌクレオチドの安定性を著しく増大し、（ｂ）ポリヌクレオチドのＲＩＳＣ複合体への効率的なローディングを促進し、および（ｃ）一本鎖ヌクレオチドの細胞による取り込みを改善する、化学修飾パターンの説明を提供する。図１８は、細胞において一本鎖ポリヌクレオチドの効力を達成するために有益であり得る化学修飾パターンのいくつかの非限定的な例を提供する。化学修飾パターンは、リボース修飾、骨格修飾、疎水性ヌクレオシド修飾と、抱合体型修飾との組み合わせを含んでもよい。加えて、態様のいくつかにおいて、単一のポリヌクレオチドの５’末端は、化学的にリン酸化されていてもよい。
さらに他の態様において、本発明は、ＲＩＳＣ阻害性ポリヌクレオチドの機能を改善する化学修飾パターンの説明を提供する。一本鎖ポリヌクレオチドは、基質競合機構を通して、予めロードされたＲＩＳＣ複合体の活性を阻害することが示されている。通常アンタゴマー(antagomer)と称されるこれらの型の分子について、活性には、通常、高濃度が必要であり、in vivoでの送達はあまり効果的ではない。本発明は、（ａ）一本鎖ポリヌクレオチドの安定性を著しく増大し、（ｂ）ＲＩＳＣによるポリヌクレオチドの基質としての効率的な認識を促進し、および／または、（ｃ）細胞による一本鎖ヌクレオチドの取り込みを改善する、化学修飾パターンの説明を提供する。図６は、細胞において一本鎖ポリヌクレオチドの効力を達成するために有益であり得る化学修飾パターンのいくつかの非限定的な例を提供する。化学修飾パターンは、リボース修飾、骨格修飾、疎水性ヌクレオシド修飾と、抱合体型修飾との組合せを含んでもよい。
本発明により提供される修飾は、全てのポリヌクレオチドに対して適用可能である。これは、一本鎖ＲＩＳＣ侵入性ポリヌクレオチド、一本鎖ＲＩＳＣ阻害性ポリヌクレオチド、多様な長さ（１５〜４０ｂｐ）の従来のデュプレックス化ポリヌクレオチド、非対称性デュプレックス化ポリヌクレオチドなどを含む。ポリヌクレオチドは、５’末端修飾、リボース修飾、骨格修飾および疎水性ヌクレオシド修飾を含む、多様な化学修飾パターンにより修飾されていてよい。
合成
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において知られているいずれの方法によっても、例として酵素による合成および／または化学合成を使用して、合成され得る。オリゴヌクレオチドは、in vitroで（例として酵素による合成および化学合成を使用して）、またはin vivoで（当該技術分野において周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して）合成され得る。
好ましい態様において、化学合成は、修飾ポリヌクレオチドのために使用される。直鎖オリゴヌクレオチドの化学合成は、当該技術分野において周知であり、溶液または固相の技術により達成され得る。好ましくは、合成は、固相方法によるものである。オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト、亜リン酸トリエステル、Ｈ−ホスホナートおよびホスホトリエステル方法を含む、いくつかの異なる合成手順のいずれかにより、典型的には自動合成方法により、作られてもよい。
オリゴヌクレオチドの合成プロトコルは当該技術分野において周知であり、例として米国特許第5,830,653号；WO 98/13526；Stec et al. 1984. J. Am. Chem. Soc. 106:6077；Stec et al. 1985. J. Org. Chem. 50:3908；Stec et al. J. Chromatog. 1985. 326:263；LaPlanche et al. 1986. Nucl. Acid. Res. 1986. 14:9081；Fasman G. D., 1989. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. 1989. CRC Press, Boca Raton, Fla.；Lamone. 1993. Biochem. Soc. Trans. 21:1；米国特許第5,013,830号；米国特許第5,214,135号；米国特許第5,525,719号；Kawasaki et al. 1993. J. Med. Chem. 36:831；WO 92/03568；米国特許第5,276,019号；および米国特許第5,264,423号において見出され得る。
選択される合成方法は、所望のオリゴヌクレオチドの長さに依存し得、かかる選択は、当業者の技術の範囲内である。例えば、ホスホロアミダイトおよび亜リン酸トリエステル法により、１７５またはそれより多いヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを生成し得、一方、Ｈ−ホスホナート法は、１００ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドのために良好に機能する。修飾塩基がオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、および特に、修飾ホスホジエステル連結部が使用される場合、合成手順は、必要に応じて、公知の手順に従って変えられる。このことに関して、Uhlmannら（1990, Chemical Reviews 90:543-584）は、修飾塩基および修飾ホスホジエステル連結部を有するオリゴヌクレオチドを作製するための参考文献および概略手順を提供する。オリゴヌクレオチドを作製するための他の例示的な方法は、Sonveaux、1994年、「Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis」；Agrawal、Methods in Molecular Biology 26:1において教示される。例示的な合成方法はまた、「Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach」（Gait, M. J. IRL Press at Oxford University Press. 1984）においても教示される。その上、修飾ヌクレオチドを持ついくつかの配列を含む規定の配列の直鎖オリゴヌクレオチドは、数個の商業的供給源から容易に入手可能である。
オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、または、ゲルクロマトグラフィーおよび高圧液体クロマトグラフィーを含む多数のクロマトグラフィー的方法のいずれにより、精製されてもよい。ヌクレオチド配列、特に未修飾ヌクレオチド配列を確認するために、オリゴヌクレオチドは、マクサム・ギルバートシークエンシング、サンガーシークエンシング、キャピラリー電気泳動シークエンシング、ワンダーリングスポット(wandering spot)シークエンシングの手順を含む、知られている手順のいずれかにより、またはHybond紙に結合させたオリゴヌクレオチドの選択的化学分解を使用することにより、ＤＮＡシークエンシングに供されてもよい。短いオリゴヌクレオチドの配列はまた、レーザー脱離質量分析または高速原子衝撃によっても分析され得る（McNeal, et al., 1982, J. Am. Chem. Soc. 104:976；Viari, et al., 1987, Biomed. Environ. Mass Spectrom. 14:83；Grotjahn et al., 1982, Nuc. Acid Res. 10:4671）。シークエンシング方法はまた、ＲＮＡオリゴヌクレオチドについても利用可能である。
合成されたオリゴヌクレオチドの品質は、オリゴヌクレオチドを、例としてBergot and Egan. 1992. J. Chrom. 599:35の方法を使用して、キャピラリー電気泳動および分解性強アニオンＨＰＬＣ(denaturing strong anion HPLC:SAX-HPLC)により試験することにより、確認され得る。
他の例示的な合成技術は、当該技術分野において周知である（例としてSambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Second Edition (1989)；DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glover Ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis（M J Gait Ed, 1984；Nucleic Acid Hybridisation (B D Hames and S J Higgins eds. 1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；またはシリーズであるMethods in Enzymology（Academic Press, Inc.)を参照）。
ある態様において、対象とするＲＮＡｉコンストラクトまたは少なくともその一部は、対象とするコンストラクトをコードする発現ベクターから転写される。この目的のために、当該技術分野において認識されるいずれのベクターも使用されてもよい。転写されたＲＮＡｉコンストラクトは、所望の修飾（未修飾センス鎖を修飾されたものにより置き換えることなど）が行われる前に、単離、精製されてもよい。
送達／キャリア
細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込み
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物は、１以上の細胞または細胞ライセートと接触させられて（すなわち、接触させられるか、または、本明細書においては投与または送達されるとして言及される）、これに取り込まれる。用語「細胞」は、原核および真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞を含む。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、ヒト細胞と接触させられる。
本発明のオリゴヌクレオチド組成物を、in vitroで、例として試験管または培養ディッシュ中で（対象中へ導入されても、されなくてもよく）、またはin vivoで、例として哺乳動物対象などの対象において、細胞と接触させてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、局所的にまたはエレクトロポレーションを介して投与される。オリゴヌクレオチドは、エンドサイトーシスによって遅い速度で細胞に取り込まれるが、エンドサイトーシスされたオリゴヌクレオチドは、一般に隔絶され、例として標的核酸分子へのハイブリダイゼーションのために利用可能ではない。一態様において、細胞による取り込みを、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿により容易になされ得る。しかしながら、これらの手順はin vitroまたはex vivoの態様でのみ有用であり、便利ではなく、いくつかのケースにおいては細胞毒性と関連する。
他の態様において、細胞中へのオリゴヌクレオチドの送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロールもしくはデキストラン、エレクトロポレーションを含む好適な、当該技術分野において認識される方法により、または、トランスフェクションにより、例としてカチオン性、アニオン性または中性脂質組成物もしくはリポソームを使用して、当該技術分野において知られている方法を使用して（例としてWO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；米国特許第4,897,355号；Bergan et al. 1993. Nucleic Acid Research. 21:3567を参照）、増強され得る。増強されたオリゴヌクレオチドの送達はまた、ベクター（例としてShi, Y. 2003. Trends Genet 2003 Jan. 19:9； Reichhart J M et al. Genesis. 2002. 34(1-2):1604；Yu et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:6047；Sui et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:5515を参照）、ウイルス、ポリアミンまたはポリリジン、プロタミンもしくはＮｉ、Ｎ１２−ビス（エチル）スペルミンなどの化合物を使用するポリカチオン抱合体（例としてBartzatt, R. et al.1989. Biotechnol. Appl. Biochem. 11:133；Wagner E. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4255を参照）の使用によっても媒介され得る。
ある態様において、本発明のｓｄ-ｒｘＲＮＡは、多様なベータ−グルカン含有粒子を使用して送達されてもよく、該粒子はＧｅＲＰ（グルカンカプセル化ＲＮＡロード粒子）として言及され、これは2010年3月4日出願の米国仮出願第61/310,611号、表題「食細胞への標的化送達のための製剤および方法」に記載されており、参照して組み込まれる。かかる粒子はまた、米国特許公開US 2005/0281781 A1およびUS 2010/0040656、ならびにPCT公開WO 2006/007372およびWO 2007/050643においても記載されており、参照して組み込まれる。ｓｄ-ｒｘＲＮＡ分子は、疎水的に修飾されていてもよく、および任意に、脂質および／または両親媒性ペプチドと結びついていてもよい。ある態様において、ベータ−グルカン粒子は酵母に由来する。ある態様において、ペイロードトラップ(payload trapping)分子は、少なくとも約１０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００ｋＤａ、５００ｋＤａ等の分子量のポリマーである。好ましいポリマーは、（限定せずに）カチオン性ポリマー、キトサンまたはＰＥＩ（ポリエチレンイミン）などを含む。
グルカン粒子は、酵母細胞壁などの真菌細胞壁の不溶性構成要素に由来し得る。いくつかの態様において、酵母はパン酵母である。酵母由来グルカン分子は、１以上のβ−（１，３）−グルカン、β−（１，６）−グルカン、マンナンおよびキチンを含み得る。いくつかの態様において、グルカン粒子は中空の酵母細胞壁を含み、これにより、粒子は細胞に似た３次元構造を維持し、この中でＲＮＡ分子などの分子と複合体化するかまたはこれをカプセル化し得る。酵母細胞壁粒子の使用に関連するいくつかの利点は、構成要素の利用可能性、それらの生分解性の性質、および、それらの食作用細胞を標的化する能力である。
いくつかの態様において、グルカン粒子は細胞壁からの不溶性構成要素を抽出することにより調製され得、例えばパン酵母（フライシュマンのもの）を１ＭのＮａＯＨ／ｐＨ４．０、Ｈ２Ｏで抽出し、続いて洗浄および乾燥することによる。酵母細胞壁粒子を調製するための方法は以下の文献に議論され、これらから参照して組み込まれる：米国特許第4,810,646号、同第4,992,540号、同第5,082,936号、同第5,028,703号、同第5,032,401号、同第5,322,841号、同第5,401,727号、同第5,504,079号、同第5,607,677号、同第5,968,811号、同第6,242,594号、同第6,444,448号、同第6,476,003号、米国特許公開第2003/0216346号、同第2004/0014715号および同第2010/0040656号ならびにPCT公開第WO02/12348号。
グルカン粒子を調製するためのプロトコルもまた、以下の文献に記載されており、これらから参照して組み込まれる：Soto and Ostroff (2008), “Characterization of multilayered nanoparticles encapsulated in yeast cell wall particles for DNA delivery”; Bioconjug Chem 19(4):840-8；Soto and Ostroff (2007), “Oral Macrophage Mediated Gene Delivery System,” Nanotech, Volume 2, Chapter 5 (“Drug Delivery”), pages 378-381；およびLi et al. (2007), “Yeast glucan particles activate murine resident macrophages to secrete proinflammatory cytokines via MyD88-and Syk kinase-dependent pathways.” Clinical Immunology 124(2):170-181。
酵母細胞壁粒子などのグルカン含有粒子はまた、商業的にも得られ得る。いくつかの非限定的例は以下を含む：Biorigin（Sao Paolo, Brazil）からのNutricell MOS 55、SAF-Mannan（SAF Agri, Minneapolis, Minn.）、Nutrex（Sensient Technologies, Milwaukee, Wis.）、アルカリ抽出粒子、例えばNutricepts（Nutricepts Inc., Burnsville, Minn.）およびASA Biotech製造のもの、Biopolymer Engineeringからの酸抽出ＷＧＰ粒子および有機溶媒抽出粒子、例えばAlpha-beta Technology, Inc.（Worcester, Mass.）からのAdjuvax（商標）およびNovogen（Stamford, Conn.）からの微粒子グルカン。
酵母細胞壁粒子などのグルカン粒子は、製造および／または抽出方法に依存して種々のレベルの純度を有し得る。いくつかの例において、粒子はアルカリ抽出、酸抽出または有機溶媒抽出して、細胞内構成要素および／または細胞壁の外部マンノタンパク質層を除去する。かかるプロトコルは、５０〜９０％の範囲のグルカン含量（ｗ／ｗ）を有する粒子を製造し得る。いくつかの例において、低純度の粒子、すなわち低グルカンｗ／ｗ含量の粒子が好ましい場合もあり、一方他の態様においては、高純度すなわち高グルカンｗ／ｗ含量の粒子が好ましい場合もある。
酵母細胞壁粒子などのグルカン粒子は、天然の脂質含量を有し得る。例えば、粒子は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％または２０％ｗ／ｗを超える脂質を含有し得る。例のセクションにおいて、グルカン粒子２つのバッチ：ＹＧＰ ＳＡＦおよびＹＧＰ ＳＡＦ＋Ｌ（天然脂質含有）の有効性を試験する。いくつかの態様において、天然脂質の存在はＲＮＡ分子の複合体化または捕捉を支援し得る。
グルカン含有粒子は典型的には、およそ２〜４ミクロンの直径を有するが、２ミクロン未満または４ミクロンを超える直径の粒子もまた、本発明の側面に適合する。
送達するＲＮＡ分子（単数または複数）は、グルカン粒子に複合体化されるか、そのシェル内に「捕捉」される。粒子のシェルまたはＲＮＡ構成要素は、Soto and Ostroff (2008) Bioconjug Chem 19:840に記載され、参照して組み込まれているように、視覚化のために標識され得る。ＧｅＲＰをロードする方法は以下にさらに議論される。
オリゴヌクレオチドの取り込みのための最適なプロトコルは、多数の因子に依存するであろうが、最も重要なのは、使用される細胞の型である。取り込みにおいて重要な他の因子は、これらに限定されないが、オリゴヌクレオチドの性質および濃度、細胞のコンフルエンス、細胞を入れる培養の種類（例として懸濁培養であるかまたはプレート培養であるか）および細胞を培養する培地の種類を含む。
カプセル化剤
カプセル化剤は、ビヒクル内にオリゴヌクレオチドを捕捉する。本発明の他の態様において、オリゴヌクレオチドは、キャリアまたはビヒクル、例としてリポソームまたはミセルと結びついてもよいが、他のキャリアを使用され得ることは、当業者により理解される通りである。リポソームは、生体膜と類似する構造を有する脂質二重層からなるビヒクルである。かかるキャリアは、細胞による取り込みを促進するため、または、オリゴヌクレオチドを標的化するため、または、オリゴヌクレオチドの薬物動態または毒性学的特性を改善するために、使用される。
例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはまた、その中に活性成分が分散してまたは脂質層に接着した水性濃縮層からなる小体中に多様に存在して含有される医薬組成物であるリポソーム中にカプセル化されても、投与されてもよい。オリゴヌクレオチドは、溶解性に依存して、水性層および脂質層の両方に存在しても、一般にリポソーム懸濁液(liposomic suspension)と称されるものの中に存在してもよい。疎水性層は一般に、必ずではないが、レシチンおよびスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、リン酸ジアセチルなどの多かれ少なかれイオン性の界面活性剤、ステアリルアミンまたはホスファチジル酸または疎水性の性質の他の材料を含む。リポソームの直径は一般に、約１５ｎｍから約５ミクロンまでの範囲である。
薬物送達ビヒクルとしてのリポソームの使用は、幾つかの利点を与える。リポソームは、細胞内安定性を増大し、取り込み効率を増大し、生物学的活性を改善する。リポソームは、細胞膜を構成する脂質と類似の様式において配置された脂質からなる、中空の球体ビヒクルである。これらは、水溶性化合物を封入する内部の水性の空間を有し、直径０．０５から数ミクロンまでの範囲のサイズである。数個の研究から、リポソームが核酸を細胞へ送達し得ること、および、核酸が生物学的に活性であり続けることが示される。例えば、リポフェクチンまたはLIPOFECTAMINE（商標）2000などの本来は研究用ツールとして設計された脂質送達ビヒクルは、無傷の(intact)核酸分子を細胞へ送達し得る。
リポソームを使用することの具体的な利点は以下を含む：それらは組成物において非毒性であり生分解性であること；それらは長期の循環半減期を呈すこと；および、認識分子が、組織へ標的化するために、それらの表面へ容易に付着され得ること。最後に、液体懸濁液または凍結乾燥製品のいずれにおいても、リポソームベースの医薬のコスト効率の良い製造は、受容可能な薬物送達システムとしてのこの技術のバイアビリティを実証している。
いくつかの側面において、本発明に関連する製剤は、天然に存在するかまたは化学的に合成されたかまたは修飾された、飽和および不飽和の脂肪酸残基のクラスについて選択されてもよい。脂肪酸は、トリグリセリド類、ジグリセリド類または個々の脂肪酸の形態で存在してもよい。他の態様において、非経口栄養のために薬理学において現在使用されている脂肪酸および／または脂質の乳液の、よく検証された混合物の使用が利用されてもよい。
リポソームベースの製剤は、オリゴヌクレオチドの送達のために広範に使用される。しかしながら、市販の脂質またはリポソーム製剤の殆どは、少なくとも１つの正に荷電した脂質（カチオン性脂質）を含有する。この正に荷電した脂質の存在は、高レベルのオリゴヌクレオチドのローディングを得るために、および、リポソームの膜融合特性を増強するために、必須であると考えられている。最適な正に荷電した脂質の化学的性質(chemistries)を同定するための、数個の方法が実施され、公開されている。しかしながら、カチオン性脂質を含有する市販のリポソーム製剤は、高レベルの毒性によって特徴づけられる。in vivoでの限定された治療インデックスにより、正に荷電した脂質を含有するリポソーム製剤が、ＲＮＡサイレンシングを達成するために必要とされる濃度よりもごく僅かに高い濃度において、毒性（すなわち肝臓の酵素の増大）と関連することが明らかとなっている。
本発明に関連する核酸は、疎水的に修飾され得、中性ナノトランスポーターに包含され得る。中性ナノトランスポーターのさらなる説明は、2009年9月22日に出願されたPCT出願PCT/US2009/005251、表題「中性ナノトランスポーター」から参照して組み込まれる。かかる粒子は、定量的なオリゴヌクレオチドを非荷電の脂質混合物中に組み込むことができる。かかる中性ナノトランスポーター組成物においてカチオン性脂質が毒性レベルを欠いていることは、重要な特性である。
PCT/US2009/005251に実証されているとおり、オリゴヌクレオチドは、カチオン性脂質を有さない脂質混合物中に効率的に組み込まれ得、かかる組成物は、治療用オリゴヌクレオチドを機能的な様式で細胞に効果的に送達し得る。例えば、脂質混合物が、ホスファチジルコリンベースの脂肪酸およびコレステロールなどのステロールから構成されたとき、高レベルの活性が観察された。例えば、中性脂質混合物の１つの好ましい製剤は、少なくとも２０％のＤＯＰＣまたはＤＳＰＣおよび少なくとも２０％のコレステロールなどのステロールから構成される。１：５の脂質対オリゴヌクレオチド比率という低さでも、オリゴヌクレオチドの非荷電製剤中での完全なカプセル化を得るのに充分であることが示された。
中性ナノトランスポーター組成物は、オリゴヌクレオチドの中性脂質製剤中への効率的なローディングを可能にする。組成物は、分子の疎水性が増大するような様式において修飾されている（例えば、疎水性分子が、疎水性分子に、オリゴヌクレオチド末端または末端でないヌクレオチド、塩基、糖もしくは主鎖上で、（共有結合的にまたは非共有結合的に）付着されている）オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドは、中性脂質製剤と混合されている（例えば、少なくとも２５％のコレステロールおよび２５％のＤＯＰＣまたはそのアナログを含有する）。別の脂質などのカーゴ分子もまた、組成物中に含まれ得る。この組成物は、製剤の一部がオリゴヌクレオチド自体中に構築される場合、中性脂質粒子中におけるオリゴヌクレオチドの効率的なカプセル化を可能にする。
いくつかの側面において、５０から１４０ｎｍまでの範囲のサイズの安定な粒子は、疎水性オリゴヌクレオチドを好ましい製剤と複合体化することにより形成され得る。製剤は、それ自体では典型的には小さい粒子を形成せず、むしろ集塊物を形成し、これは疎水性修飾オリゴヌクレオチドを付加することにより、安定な５０〜１２０ｎｍの粒子へと転換されることに言及することは興味深い。
本発明の中性ナノトランスポーター組成物は、疎水性修飾ポリヌクレオチド、中性脂質混合物および任意にカーゴ分子を含む。本明細書に使用される「疎水性修飾ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの修飾の前よりも疎水性にする少なくとも１つの修飾を有する、本発明のポリヌクレオチド（すなわちｓｄ−ｒｘＲＮＡ）である。修飾は、疎水性分子をポリヌクレオチドに付着（共有結合的または非共有結合的に）することにより達成されてもよい。いくつかの例において、疎水性分子は、親油性基であるかまたは親油性基を含む。
用語「親油性基」は、水に対するアフィニティーよりも高い、脂質に対するアフィニティーを有する基を意味する。親油性基の例は、これらに限定されないが、コレステロール、コレステリルまたは修飾コレステリル残基、アダマンチン、ジヒドロテステロン(dihydrotesterone)、長鎖アルキル、長鎖アルケニル、長鎖アルキニル、オレイル−リトコール酸、コレン酸、オレオイル−コレン酸、パルミチル酸、ヘプタデシル酸、ミリスチル酸、胆汁酸、コール酸またはタウロコール酸、デオキシコール酸、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド類、ビタミンＥなどのビタミン類、飽和または不飽和のいずれかの脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル類、ピレン類、ポルフィリン類、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン類、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、Texas-Red、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン色素（例としてＣｙ３またはＣｙ５）、Hoechst 33258色素、ソラレンまたはイブプロフェンを含む。コレステロール部分は還元されても（例としてコレスタン中のように）、または、置換されても（例としてハロゲンにより）よい。１分子における異なる親油性基の組み合わせもまた可能である。
疎水性分子は、ポリヌクレオチドの多様な位置において付着されてもよい。上記のとおり、疎水性分子は、ポリヌクレオチドの３’または５’末端などのポリヌクレオチドの末端の残基に連結されていてもよい。代わりに、これは、ポリヌクレオチドの内部のヌクレオチドまたは枝上のヌクレオチドに連結されていてもよい。疎水性分子が、例えばヌクレオチドの２’位に、付着されていてもよい。疎水性分子はまた、ポリヌクレオチドのヌクレオチドの複素環式塩基、糖または主鎖にも連結されていてもよい。
疎水性分子は、リンカー部分によりポリヌクレオチドに繋げられていてもよい。任意に、リンカー部分は、非ヌクレオチド性のリンカー部分である。非ヌクレオチド性のリンカーは、例として、脱塩基残基（ｄスペーサー）、トリエチレングリコール（スペーサー９）もしくはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコール、またはブタンジオールなどのアルカンジオールである。スペーサーユニットは、好ましくは、ホスホジエステルまたはホスホロチオアート結合により連結されている。リンカーユニットは、分子中に１回のみ現れても、または、例としてホスホジエステル、ホスホロチオアート、メチルホスホナートまたはアミン連結部などを介して、数回組み込まれてもよい。
典型的な抱合プロトコルは、配列の１以上の位置においてアミノリンカーを保有するポリヌクレオチドの合成を含むが、しかしながらリンカーは必要ではない。アミノ基は、次いで、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、抱合される分子と反応させられる。抱合反応は、まだ固体支持体に結合しているポリヌクレオチドを用いて、または、溶液相中でのポリヌクレオチドの切断に続いて、実施されてもよい。ＨＰＬＣによる修飾ポリヌクレオチドの精製は、典型的には、結果として純粋な材料を生じる。
いくつかの態様において、疎水性分子は、ミセル中へ組み込まれるために充分な疎水性を提供する、ステロール型抱合体、フィトステロール抱合体、コレステロール抱合体、側鎖の長さが変えられたステロール型抱合体、脂肪酸抱合体、任意の他の疎水性基抱合体、および／または内部ヌクレオシドの疎水性修飾である。
本発明の目的のために、用語「ステロール」またはステロイドアルコール類は、Ａ環の３位においてヒドロキシル基を持つステロイドのサブグループを指す。これらは、アセチル−コエンザイムＡからＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路を介して合成される両親媒性脂質である。全体的な分子は、極めて扁平である。Ａ環上のヒドロキシル基は、極性である。脂肪族鎖の残りは、非極性である。通常、ステロールは、１７位において８炭素鎖を有すると考えられる。
本発明の目的のために、用語「ステロール型分子」は、ステロイドアルコール類を指し、これは、ステロールと構造が類似する。主要な差異は、環の構造および２１位に結合する側鎖の炭素の数である。
本発明の目的のために、用語「フィトステロール」（また植物ステロールとも称される）は、植物において天然に存在する植物化学物質である、一群のステロイドアルコール類である。２００種を超えるフィトステロールが知られている。
本発明の目的のために、用語「ステロールの側鎖」は、ステロール型分子の１７位にて付着する側鎖の化学組成を指す。標準的な定義において、ステロールは、８炭素鎖を１７位に保有する４環構造に限定される。本発明において、従来のものよりも長いおよび短い側鎖を持つステロール型分子が記載される。側鎖は、分枝であってもよいし、二重の骨格を含有していてもよい。
よって、本発明に有用なステロールは、例えば、コレステロール、ならびに、１７位に２〜７個または９個の炭素より長い側鎖が結合しているユニークなステロールを含む。特定の態様において、ポリ炭素テイルの長さは、５〜９個の炭素の間で変動する。かかる抱合体は、特に肝臓への送達において、顕著により良好なin vivo効力を有してもよい。これらの型の分子は、従来のコレステロールに抱合されたオリゴヌクレオチドよりも５〜９倍低い濃度にて働くことが期待される。
代わりに、ポリヌクレオチドは、タンパク質、ペプチド、または、疎水性分子として機能する正に荷電した化学物質に結合していてもよい。タンパク質は、プロタミン、ｄｓＲＮＡ結合ドメインおよびアルギニンリッチペプチドからなる群から選択されてもよい。例示的な正に荷電した化学物質は、スペルミン、スペルミジン、カダベリンおよびプトレシンを含む。
他の態様において、疎水性分子抱合体は、疎水性修飾、ホスホロチオアート修飾および２’リボ修飾を含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドの最適な化学修飾パターンと組み合わされたとき（本明細書に詳細に記載されるとおり）、さらに高い効力を実証し得る。
他の態様において、ステロール型分子は、天然に存在するフィトステロールであってもよい。ポリ炭素鎖は、９個より長くても、直鎖であっても、分枝鎖であっても、および／または、二重結合を含有していてもよい。ポリヌクレオチド抱合体を含有するいくつかのフィトステロールは、多様な組織へのポリヌクレオチドの送達において、顕著により強力かつ活性であり得る。いくつかのフィトステロールは組織選択性を実証し得ることから、ＲＮＡｉを特異的に特定の組織へ送達するための手段として使用され得る。
疎水性修飾ポリヌクレオチドは、中性脂肪酸混合物と混合されて、ミセルを形成する。中性脂肪酸混合物は、疎水性修飾ポリヌクレオチドとともにミセルを形成し得る生理学的ｐＨにおいてまたはその付近において、正味の中性または僅かに正味の負の電荷を有する、脂質の混合物である。本発明の目的のために、用語「ミセル」は、非荷電性脂肪酸とリン脂質との混合物により形成される、小さいナノ粒子を指す。中性脂肪酸混合物は、毒性を引き起こさない量において存在する限りにおいて、カチオン性脂質を含んでもよい。好ましい態様において、中性脂肪酸混合物は、カチオン性脂質を含まない。カチオン性脂質を含まない混合物は、全脂質のうちの１％未満、好ましくは０％が、カチオン性脂質であるものである。用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨにおいてまたはその付近において、正味の正の電荷を有する、脂質および合成脂質を含む。用語「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨにおいてまたはその付近において、正味の負の電荷を有する、脂質および合成脂質を含む。
中性脂質は、強力であるが共有結合ではない引力（例として静電気、ファンデルワールス、パイ・スタッキング(pi-stacking)などの相互作用）により、本発明のオリゴヌクレオチドに結合する。
中性脂質混合物は、天然に存在するかまたは化学合成された、または、修飾された、飽和および不飽和脂肪酸残基のクラスから選択される製剤を含んでもよい。脂肪酸は、トリグリセリド、ジグリセリドまたは個別の脂肪酸の形態で存在し得る。他の態様において、薬理学において非経口栄養のために現在使用されている脂肪酸のよく確認された混合物および／または脂質乳液が利用されてもよい。
中性脂肪酸混合物は、好ましくは、コリンをベースとする脂肪酸およびステロールの混合物である。コリンをベースとする脂肪酸は、例えば、ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣおよびＤＥＰＣなどの合成のホスホコリン誘導体を含む。ＤＯＰＣ（化合物登録番号4235-95-4）は、ジオレオイルホスファチジルコリンである（ジエライドイルホスファチジルコリン、ジオレオイル−ＰＣ、ジオレオイルホスホコリン、ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ジオレイルホスファチジルコリンとしても知られる）。ＤＳＰＣ（化合物登録番号816-94-4は、ジステアロイルホスファチジルコリンである（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンとしても知られる）。
中性脂肪酸混合物中のステロールは、例えばコレステロールであってもよい。中性脂肪酸混合物は、完全にコリンベースの脂肪酸およびステロールからなっても、または、これは任意にカーゴ分子を含んでもよい。例えば、中性脂肪酸混合物は、少なくとも２０％または２５％の脂肪酸および２０％または２５％のステロールを有してもよい。
本発明の目的のために、用語「脂肪酸」は、脂肪酸の従来の説明に関する。これらは、個別の実体またはジグリセリドおよびトリグリセリドの形態において存在し得る。本発明の目的のために、用語「脂質乳液」は、食事から十分な脂質を得ることができない対象へ静脈内に与えられる安全な脂質製剤を指す。これは、大豆油（または他の天然に存在するオイル）と卵のリン脂質との乳液である。脂質乳液は、いくつかの不溶性麻酔剤の製剤のために使用されている。本開示において、脂質乳液は、イントラリピッド(Intralipid)、リポシン(Liposyn)、ニュートリピッド(Nutrilipid)などの市販の製剤の一部、特定の脂肪酸が濃縮されている改変された市販の製剤、または、完全にde novoで処方された脂肪酸とリン脂質との組合せであってもよい。
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させる細胞は、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、脂質、例として上記の脂質または脂質組成物の１つを含む混合物と、約１２時間〜約２４時間の間接触させられる。他の態様において、オリゴヌクレオチド組成物と接触させる細胞は、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、脂質、例として上記の脂質または脂質組成物の１つを含む混合物と、約１〜約５日間接触させられる。一態様において、細胞は、脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と、約３日間〜約３０日間接触させられる。他の態様において、脂質を含む混合物は、細胞と、少なくとも約５〜約２０日間、接触状態に置かれる。他の態様において、脂質を含む混合物は、細胞と、少なくとも約７〜約１５日間、接触状態に置かれる。
製剤の５０％〜６０％は、任意に、他のいずれの脂質または分子であってもよい。かかる脂質または分子は、本明細書において、カーゴ脂質またはカーゴ分子として言及される。カーゴ分子は、これらに限定されずに、イントラリピッド(intralipid)、低分子、膜融合ペプチドもしくは脂質を含むか、または、他の低分子が、細胞取り込み、エンドソームによる放出または組織分布特性を変えるために添加されてもよい。かかる特性が望ましい場合、カーゴ分子に耐性を示す能力は、これらの粒子の特性の改変のために重要である。例えば、いくつかの組織特異的代謝物の存在は、組織分布プロフィールを大幅に変える場合がある。例えば、多様な飽和レベルを有するより短いまたはより長い脂質鎖が濃縮されているイントラリピッド(intralipid)型製剤の使用は、これらの型の製剤の組織分布プロフィール（およびそれらのローディング）に影響を及ぼす。
本発明に従い有用なカーゴ脂質の例は、膜融合脂質である。例えば、双性イオン脂質ＤＯＰＥ（化合物登録番号4004-5-1、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）は、好ましいカーゴ脂質である。
イントラリピッド(Intralipid)は、以下の組成から構成され得る：１０００ｍＬが以下を含有する：精製大豆油９０ｇ、精製卵リン脂質１２ｇ、無水グリセロール２２ｇ、注射用水（１０００ｍＬへの十分量）。ｐＨは、水酸化ナトリウムで、約ｐＨ８に調整される。エネルギー含量／Ｌ：４．６ＭＪ（１９０ｋｃａｌ）。浸透圧（およそ）：３００ｍＯｓｍ／水１ｋｇ。他の態様において、脂質乳液は、５％のベニバナ油、５％の大豆油、乳化剤として添加される最大１．２％までの卵リン脂質および注射用水中の２．５％のグリセリンを含有する、リポシン(Liposyn)である。これはまた、ｐＨ調整のために水酸化ナトリウムを含有してもよい。ｐＨ８．０（６．０〜９．０）。リポシンは、２７６ｍＯｓｍｏｌ／リットル（実測値）の浸透圧を有する。
カーゴ脂質のアイデンティティー、量および比率のバリエーションは、これらの化合物の細胞による取り込みおよび組織分布の特徴に影響を及ぼす。例えば、脂質テイルの長さおよび飽和性のレベルは、肝臓、肺、脂肪および心筋細胞への異なる取り込みに影響を及ぼす。ビタミン類または異なる形態のステロールなどの特別な疎水性分子の添加は、特定の化合物の代謝に関与する特別な組織への分布に有利に働き得る。いくつかの態様において、ビタミンＡまたはＥが使用される。複合体は、異なるオリゴヌクレオチド濃度にて形成され、より高い濃度は、より効率的な複合体形成に有利に働く。
他の態様において、脂質乳液は、脂質の混合物に基づく。かかる脂質は、天然の化合物、化学合成された化合物、精製脂肪酸または他のいずれの脂質をも含んでもよい。さらに他の態様において、脂質乳液の組成は、完全に人工的なものである。特定の態様において、脂質乳液は、７０％を超えて、リノール酸である。さらに別の特定の態様において、脂質乳液は、少なくとも１％のカルジオリピンである。リノール酸（ＬＡ）は、不飽和オメガ−６脂肪酸である。これは、１８−炭素鎖および２個のシス二重結合を有するカルボン酸からなる無色の液体である。
本発明のさらに他の態様において、疎水性修飾ポリヌクレオチドの組織分布を変えるための手段として、脂質乳液の組成の変更が使用される。この方法論は、特定の組織へのポリヌクレオチドの特異的送達をもたらす。
他の態様において、カーゴ分子の脂質乳液は、７０％を超えるリノール酸（Ｃ１８Ｈ３２Ｏ２）および／またはカルジオリピンを含む。
イントラリピッド(intralipid)などの脂質乳液は、いくつかの非水溶性薬物（プロポフォール(Propofol)（Diprivanとして再処方されている）など）のための送達用製剤として、前から使用されてきた。本発明のユニークな特徴は、（ａ）修飾ポリヌクレオチドを１以上の疎水性化合物と組み合わせ、それによりこれが脂質ミセル中に組み込まれ得るというコンセプト、および（ｂ）可逆性キャリアを提供するためにこれを脂質乳液と混合すること、を含む。血流中への注射の後で、ミセルは通常、アルブミン、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびその他の血清タンパク質と結合する。この結合は可逆性であり、最終的に脂質は細胞により吸収される。ミセルの一部として組み込まれるポリヌクレオチドは、次いで、細胞の表面近くに送達されるであろう。その後、ステロール型送達を含むがこれらに限定されない多様な機構を通して、細胞による取り込みが起こり得る。
複合体化剤
複合体化剤は、強力であるが共有結合ではない引力（例として静電気、ファンデルワールス、パイ・スタッキングなどの相互作用）により、本発明のオリゴヌクレオチドに結合する。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを増大するために、複合体化剤と複合体化され得る。複合体化剤の例は、カチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドを細胞へ送達するために使用され得る。しかしながら、上記のとおり、カチオン性脂質を含まない製剤が、いくつかの態様において好ましい。
用語「カチオン性脂質」は、極性および非極性ドメインの両方を有する脂質および合成脂質であって、生理学的ｐＨまたはその付近において正に荷電することができ、核酸などのポリアニオンに結合して核酸の細胞中への送達を促進するものを含む。一般に、カチオン性脂質は、飽和および不飽和アルキル、ならびに、脂環式のエーテル類およびアミンのエステル類、アミド類、または、これらの誘導体を含む。カチオン性脂質の直鎖および分枝アルキルおよびアルケニル基は、例として、１から約２５個の炭素原子を含有し得る。好ましい直鎖または分枝アルキルまたはアルケン基は、６個以上の炭素原子を有する。脂環式基は、コレステロールおよび他のステロイド基を含む。カチオン性脂質は、例としてＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｆ−、アセタート、トリフルオロ酢酸、スルファート、亜硝酸化合物(nitrite)およびニトラートを含む多様な対イオン（アニオン）とともに調製され得る。
カチオン性脂質の例は、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）スターバーストデンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとの組合せ）、リポフェクターゼ(Lipofectase)、LIPOFECTAMINE（商標）（例えば、LIPOFECTAMINE（商標）2000）、ＤＯＰＥ、サイトフェクチン(Cytofectin)（Gilead Sciences、Foster City、Calif.）、およびユーフェクチン(Eufectins)（JBL、San Luis Obispo、Calif.）を含む。例示的なカチオン性リポソームは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、２，３，−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）から製造され得る。カチオン性脂質、例えばＮ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を１０００倍増大することが見出された（Vlassov et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。オリゴヌクレオチドはまた、例としてポリ（Ｌ−リジン）またはアビジンと複合体化されてもよく、脂質は、この混合物中、例としてステリル−ポリ（Ｌ−リジン）に含まれても含まれなくてもよい。
カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するために当該技術分野において使用されてきた（例として米国特許第5,855,910号；同第5,851,548号；同第5,830,430号；同第5,780,053号；同第5,767,099号；Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176; Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15:1を参照）。本発明のオリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするために使用され得る他の脂質組成物は、クレームされる方法と組み合わせて使用され得る。上で列記されるものに加えて、例として米国特許第4,235,871号；米国特許第4,501,728号；同第4,837,028号；同第4,737,323号において教示されるものを含む他の脂質組成物もまた、当該技術分野において知られている。
一態様において、脂質組成物は、剤、例としてウイルスタンパク質を、オリゴヌクレオチドの脂質媒介性トランスフェクションを増強するためにさらに含み得る（Kamata, et al., 1994. Nucl. Acids. Res. 22:536）。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、例として米国特許第5,736,392号に教示されるとおりのオリゴヌクレオチド、ペプチドおよび脂質を含む組成物の一部として、細胞と接触させられる。血清耐性である改善された脂質もまた記載されている（Lewis, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:3176）。カチオン性脂質および他の複合体化剤は、エンドサイトーシスを通して細胞中へ運搬されるオリゴヌクレオチドの数を増大するために作用する。
他の態様において、オリゴヌクレオチドの取り込みを最適化するために、Ｎ−置換グリシンオリゴヌクレオチド（ペプトイド）が使用され得る。ペプトイドは、トランスフェクションのためのカチオン性脂質様化合物を作製するために使用されてきた（Murphy, et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1517）。ペプトイドは、標準的な方法（例としてZuckermann, R. N., et al. 1992. J. Am. Chem. Soc. 114:10646; Zuckermann, R. N., et al. 1992. Int. J. Peptide Protein Res. 40:497）を使用して合成され得る。カチオン性脂質とペプトイドとの組合せであるリプトイド(liptoid)もまた、目的のオリゴヌクレオチドの取り込みを最適化するために使用され得る（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。リプトイドは、ペプトイドオリゴヌクレオチドを産生して、アミノ末端のサブモノマーをそのアミノ基を介して脂質にカップリングすることにより合成され得る（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。
正に荷電したアミノ酸を、高活性カチオン性脂質を作製するために使用され得ることは、当該技術分野において知られている（Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 93:3176）。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、親油性部分に結合した多数のアルギニン、リジン、ヒスチジンまたはオルニチン残基を含む（例として米国特許第5,777,153号を参照）。
他の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、約１〜約４個の塩基性残基を有するペプチドを含む。これらの塩基性残基は、例としてペプチドのアミノ末端、Ｃ末端または内部領域に位置され得る。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されてきた。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例としてリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例としてアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例としてグリシン（これはまた非極性であるとも考えられる）、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例としてアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖（例としてスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例としてチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。塩基性アミノ酸の他にも、ペプチドの他の残基の大多数または全てが、非塩基性アミノ酸から、例としてリジン、アルギニンまたはヒスチジン以外のアミノ酸から選択され得る。好ましくは、長い中性の側鎖を有する優勢の中性アミノ酸が使用される。
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、１以上のガンマカルボキシグルタミン酸残基またはγ−Ｇｌａ残基を有する天然または合成のポリペプチドを含む。これらのガンマカルボキシグルタミン酸残基により、ポリペプチドが、互いにおよび膜表面に、結合することが可能になる。言い換えると、一連のγ−Ｇｌａを有するポリペプチドは、ＲＮＡｉコンストラクトが、それが接触した膜が何であれそれに固着することを助けるための汎用送達モダリティーとして使用され得る。これは、少なくとも、ＲＮＡｉコンストラクトが血流からクリアランスされることを遅延し、それらが標的にホーミングするチャンスを増強し得る。
ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、天然のタンパク質中に存在してもよい（例えばプロトロンビンは１０個のγ−Ｇｌａ残基を有する）。代わりに、これらは、精製された、組み換え的に作製された、または、化学合成されたポリペプチド中に、カルボキシル化により、例えばビタミンＫ依存性カルボキシラーゼを使用して、導入され得る。ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、連続的であっても非連続的であってもよく、ポリペプチド中のかかるガンマカルボキシグルタミン酸残基の総数および位置は、ポリヌクレオチドの異なるレベルの「固着性(stickiness)」を達成するために調節／微調整され得る。
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させられる細胞は、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、例として上記の脂質または脂質組成物の１つなどの脂質を含む混合物と、約１２時間〜約２４時間接触させられる。他の態様において、オリゴヌクレオチド組成物と接触させる細胞は、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、例として上記の脂質または脂質組成物の１つなどの脂質を含む混合物と、約１日〜約５日間接触させられる。一態様において、細胞は、脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と、約３日間〜約３０日間までもの長さにわたり接触させられる。他の態様において、脂質を含む混合物は、細胞と、少なくとも約５〜約２０日間接触させたままに置かれる。他の態様において、脂質を含む混合物は、細胞と、少なくとも約７〜約１５日間接触させたままで置かれる。
例えば、一態様において、オリゴヌクレオチド組成物は、サイトフェクチンＣＳまたはＧＳＶ（Glen Research; Sterling, Va.から入手可能）、ＧＳ３８１５、ＧＳ２８８８などの脂質の存在下において、本明細書に記載されるとおり、長期のインキュベーション期間にわたって細胞と接触させられてもよい。
一態様において、細胞の、脂質およびオリゴヌクレオチド組成物を含む混合物とのインキュベーションは、細胞のバイアビリティを低下させない。好ましくは、トランスフェクション期間の後で、細胞は実質的に生存している。一態様において、トランスフェクションの後で、細胞は、少なくとも約７０％〜少なくとも約１００％生存している。他の態様において、細胞は、少なくとも約８０％〜少なくとも約９５％生存している。さらに他の例において、細胞は、少なくとも約８５％〜少なくとも約９０％生存している。
一態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書において「輸送ペプチド」として言及される、オリゴヌクレオチドを細胞中へ輸送するペプチド配列を付着させることにより修飾される。一態様において、組成物は、タンパク質をコードする標的核酸分子に対して相補的であるオリゴヌクレオチドおよび共有結合で付着している輸送ペプチドを含む。
語「輸送ペプチド」は、オリゴヌクレオチドの細胞中への輸送を容易にさせるアミノ酸配列を含む。それが連結されている部分の細胞中への輸送を容易にさせる例示的なペプチドは、当該技術分野において知られており、例としてＨＩＶ ＴＡＴ転写因子、ラクトフェリン、ヘルペスＶＰ２２タンパク質および線維芽細胞増殖因子２を含む（Pooga et al. 1998. Nature Biotechnology. 16:857；およびDerossi et al. 1998. Trends in Cell Biology. 8:84; Elliott and O'Hare. 1997. Cell 88:223）。
オリゴヌクレオチドは、知られている技術（例としてProchiantz, A. 1996. Curr. Opin. Neurobiol. 6:629; Derossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84；Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253、Vives et al. 1997. J. Biol. Chem. 272:16010）を使用して輸送ペプチドに付着させ得る。例えば、一態様において、活性化チオール基を保有するオリゴヌクレオチドは、そのチオール基を介して、輸送ペプチド中に存在するシステインに（例としてDerossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84; Prochiantz. 1996. Current Opinion in Neurobiol. 6:629; Allinquant et al. 1995. J Cell Biol. 128:919において教示されるとおり、例としてアンテナペディアホメオドメインの第２と第３とのヘリックスの間のβターン中に存在するシステインに）連結させる。他の態様において、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−（Ｎｐｙｓ）ＯＨ基は、最後の（Ｎ末端）アミノ酸およびＳＨ基を保有するオリゴヌクレオチドがペプチドにカップリングされ得るように、輸送ペプチドにカップリングされ得る（Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253）。
一態様において、連結基(linking group)はヌクレオモノマーに付着され得、輸送ペプチドはリンカーへ共有結合で付着させられ得る。一態様において、リンカーは、輸送ペプチドについての結合部位として、および、ヌクレアーゼに対する安定性を提供し得るものの両方として、機能し得る。好適なリンカーの例は、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル鎖、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル鎖、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル鎖、ペプチドおよびヘテロ原子（例としてＳ、Ｏ、ＮＨなど）を含む。他の例示的なリンカーは、スルホスクシンイミジル−４−（マレイミドフェニル）−酪酸（ＳＭＰＢ）（例としてSmith et al. Biochem J 1991.276: 417-2を参照）などの二官能性架橋剤を含む。
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、受容体により媒介されるエンドサイトーシス機構を遺伝子の細胞中への送達のために利用する、分子抱合体として合成される（例としてBunnell et al. 1992. Somatic Cell and Molecular Genetics. 18:559およびこれにおいて引用される参考文献を参照）。
標的化剤
オリゴヌクレオチドの送達はまた、オリゴヌクレオチドを細胞受容体へ標的化することによっても改善され得る。標的化部分は、オリゴヌクレオチドに抱合させても、オリゴヌクレオチドに結合したキャリア基（すなわち、ポリ（Ｌ−リジン）またはリポソーム）に付着させてもよい。この方法は、特異的受容体により媒介されるエンドサイトーシスを呈す細胞にとって良好に適する。
例えば、６−ホスホマンノシル化タンパク質に対するオリゴヌクレオチドの抱合体は、マンノース−６−リン酸特異的受容体を発現する細胞により、遊離オリゴヌクレオチドよりも２０倍効率的に内部移行される。オリゴヌクレオチドはまた、細胞受容体に対するリガンドに、生分解性リンカーを使用してカップリングされてもよい。別の例において、送達コンストラクトは、ビオチン化オリゴヌクレオチドと強固な複合体を形成するマンノシル化ストレプトアビジンである。マンノシル化ストレプトアビジンは、ビオチン化オリゴヌクレオチドの内部移行を２０倍増大することが見出された（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。
加えて、特異的リガンドは、ポリリジンベースの送達システムのポリリジン成分に抱合させられ得る。例えば、トランスフェリン−ポリリジン、アデノウイルス−ポリリジンおよびインフルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ−２のＮ末端膜融合ペプチド−ポリリジン抱合体は、真核細胞における受容体媒介性ＤＮＡ送達を大いに増強する。肺胞マクロファージ中のポリ（Ｌ−リジン）に抱合したマンノシル化糖タンパク質は、オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを増強するために採用されている（Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566）。
悪性細胞は、葉酸およびトランスフェリンなどの必須栄養素に対して高い必要性を有するので、これらの栄養素は、オリゴヌクレオチドをがん性細胞に標的化するために用いることができる。例えば、葉酸をポリ（Ｌ−リジン）に連結させると、前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）細胞およびヒトメラノーマ（Ｍ−１４）細胞において増強されたオリゴヌクレオチド取り込みが観察される（Ginobbi et al. 1997. Anticancer Res. 17:29）。別の例において、マレイル化されたウシ血清アルブミン、葉酸またはプロトポルフィリン三価鉄ＩＸによりコートされたリポソームは、マウスマクロファージ、ＫＢ細胞および２．２．１５ヒト肝細胞腫細胞において、オリゴヌクレオチドの増強された細胞による取り込みを示す（Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566）。
リポソームは、肝臓、膵臓、網膜内皮系において自然に蓄積する（いわゆる受動的標的化）。リポソームを、抗体およびプロテインＡなどの多様なリガンドにカップリングすることにより、これらは、特定の細胞集団に対して能動的に標的化され得る。例えば、プロテインＡ保有リポソームを、マウス主要組織適合複合体によりコードされるＬ細胞上に発現するＨ−２Ｋタンパク質に標的化されたＨ−２Ｋ特異的抗体により、予め処置されてもよい（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。
他のin vitroおよび／またはin vivoでのＲＮＡｉ試薬の送達は、当該技術分野において知られており、目的のＲＮＡｉコンストラクトを送達するために使用され得る。例えば、数例を挙げると、米国特許出願公開第20080152661号、同第20080112916号、同第20080107694号、同第20080038296号、同第20070231392号、同第20060240093号、同第20060178327号、同第20060008910号、同第20050265957号、同第20050064595号、同第20050042227号、同第20050037496号、同第20050026286号、同第20040162235号、同第20040072785号、同第20040063654号、同第20030157030号、WO 2008/036825、WO04/065601およびAU2004206255B2を参照（全て参照して組み込まれる）。
投与
オリゴヌクレオチドまたは治療用ＲＮＡ分子の投与または送達の最適な経路は、所望の結果および／または処置される対象に依存して変動し得る。本明細書に使用される「投与」は、細胞をオリゴヌクレオチドに接触させることを指し、in vitroで、in vivoで、またはex vivoで実施され得る。
投与の方法の非制限的な例は、硝子体内、網膜下、眼周囲（結膜下、テノン嚢下、眼球後、眼球周囲および後方近強膜）、局所、点眼、角膜インプラント、生分解性インプラント、非生分解性インプラント、眼内挿入、薄膜、持続放出性処方物、ポリマー、イオントフォレーシス、ヒドロゲルコンタクトレンズ、リバース−熱ヒドロゲルおよび生分解性ペレットを含む。
いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、目の前部以外の目の領域に投与される。驚くべきことに、治療用ＲＮＡ分子を目の前部以外の目の領域に投与することにより、目の前部における遺伝子発現が顕著に減少することが見出された。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子の投与の方法は、硝子体内である。治療用ＲＮＡの硝子体内投与により、角膜などの目の前部における標的遺伝子の発現が減少することは、予測できなかった。
他の態様において、治療用ＲＮＡ分子は、局所投与を介してなど目の前部に投与される。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、局所投与により角膜に投与される。
標的核酸分子から翻訳されるタンパク質の発現を最適に減少させるために、オリゴヌクレオチドの投薬量は、例としてＲＮＡ安定性の読み出しによりまたは治療応答により測定されるものとして、過度の実験なしに調整されてもよい。
例えば、核酸標的によりコードされるタンパク質の発現が測定され得、投薬レジメンがそれに従って調整される必要があるか否かを決定し得る。加えて、細胞におけるまたは細胞により産生されるＲＮＡまたはタンパク質のレベルの増大または減少は、当該技術分野において認識されるいずれの技術をも使用して測定され得る。転写が減少したか否かを決定することにより、標的ＲＮＡの切断を誘導する上でのオリゴヌクレオチドの有効性が決定され得る。
上記オリゴヌクレオチド組成物のいずれも、単独でまたは薬学的に許容し得るキャリアと組み合わせて、使用され得る。本明細書に使用される「薬学的に許容し得るキャリア」は、好適な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のためのかかる媒体および剤は、当該技術分野において周知である。従来のいずれの媒体または剤が活性成分と適合しない場合を除いて、これは治療用組成物において使用され得る。補足の活性成分もまた、組成物中に組み込まれ得る。
オリゴヌクレオチドは、非経口投与のために、リポソームもしくはポリエチレングリコールで修飾されたリポソーム中へ組み込んでも、または、カチオン性脂質と混和されてもよい。追加の物質、例えば特定の標的細胞上に見出される膜タンパク質に対して反応性の抗体の、リポソーム中への組み込みは、特異的な細胞型に対するオリゴヌクレオチドの標的化に役立ち得る。
in vivoでの適用に関して、本発明の製剤は、目へコンストラクトを送達するのに適した種々の形態で、患者へ投与され得る。好ましい態様において、非経口投与は、眼の投与である。眼の投与は、硝子体内、前房内(intracameral)、網膜下、結膜下、またはテノン嚢下であり得る。
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性または水分散性の形態における活性化合物の水性溶液を含む。加えて、好適な油性注射用懸濁液としての活性化合物の懸濁液も、投与されてもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、または、合成脂肪酸エステル類、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性注射用懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘性を増大させる物質を含有してもよく、任意に、懸濁液はまた、安定化剤を含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、液体の溶液、好ましくはハンクス溶液またはリンガー溶液などの生理学的に適合性の緩衝液中で処方されてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、固体の形態において処方されて、使用の直前に再溶解されるか懸濁されてもよい。凍結乾燥形態もまた、本発明において含まれる。
選ばれた送達方法は、細胞中への侵入をもたらすであろう。いくつかの態様において、好ましい送達方法は、リポソーム（１０〜４００ｎｍ）、ハイドロゲル、制御放出ポリマーおよび他の薬学的に適用可能なビヒクルならびにマイクロインジェクションまたはエレクトロポレーション（ex vivoでの処置のため）を含む。
本発明の医薬製剤は、乳液として調製され製剤化されてもよい。乳液は通常、１つの液体が別の液体中に通常は直径０．１μｍを超える液滴の形態で分散した、均質な系である。本発明の乳液は、乳化剤、安定化剤、色素、脂質、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤などの賦形剤を含んでもよく、抗酸化剤もまた、必要に応じて乳液中に存在してもよい。賦形剤は、水相、油相またはそれ自体が別の相として、溶液として存在してもよい。
本発明の乳液製剤に使用されてもよい天然に存在する乳化剤の例は、ラノリン、ミツロウ、リン脂質、レシチンおよびアカシアを含む。微細に分割された固体もまた、特に界面活性剤と組み合わせて、粘性の製剤において、良好な乳化剤として使用されてきた。乳化剤として使用されてもよい微細に分割された固体は、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤性粘土、顔料ならびに炭素またはステアリン酸グリセリルなどの非極性固体を含む。
乳液製剤に含まれてもよい保存剤の例は、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸を含む。乳液製剤に含まれてもよい抗酸化剤の例は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャーまたはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの抗酸化剤補助剤(antioxidant synergist)を含む。
一態様において、オリゴヌクレオチドの組成物は、マイクロエマルジョン(microemulsion)として製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および両親媒性物質の系であって、単一の光学的等方性および熱力学的安定性の溶液である。典型的には、マイクロエマルジョンは、第１に油を水性界面活性剤溶液中に分散させ、次いで、透明な系を形成するために、充分な量の第４の成分、一般的には中程度の鎖長のアルコールを加えることにより調製される。
マイクロエマルジョンの調製において使用されてもよい界面活性剤は、これらに限定されないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル類、テトラグリセロールモノラウラート（ML310）、テトラグリセロールモノオレアート（MO310）、ヘキサグリセロールモノオレアート（PO310）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（PO500）、デカグリセロールモノカプラート（MCA750）、デカグリセロールモノオレアート（MO750）、デカグリセロールセキオレアート（S0750）、デカグリセロールデカオレアート（DA0750）を、単独でまたは共界面活性剤（cosurfactant）と組合せて、含む。共界面活性剤、通常はエタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールなどの短鎖アルコールは、界面活性剤のフィルム中に浸透して、その後、界面活性剤分子の間で生み出される空隙のために不規則なフィルムを作り出すことにより、界面の流動性を増大させるのに役立つ。
しかしながら、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤の使用なしで調製されてもよく、アルコールを含まない自己乳化マイクロエマルジョン系が、当該技術分野において知られている。水相は、典型的には、これらに限定されないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であってもよい。油相は、これらに限定されないが、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル類、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジおよびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル類、脂肪アルコール類、ポリグリコール化(polyglycolized)グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの材料を含んでもよい。
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および増強された薬物の吸収の観点から特に関心がある。脂質ベースのマイクロエマルジョン（油／水および水／油の両方）が、薬物の経口でのバイオアベイラビリティーを増強するために提案されている。
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化の改善、酵素による加水分解からの薬物の保護、界面活性剤により誘導される膜の流動性および透過性の変化に起因する薬物吸収の増強の可能性、調製の容易性、固体投与形態と比べた経口投与の容易性、臨床的効力の改善ならびに毒性の低減を与える（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11:1385；Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85:138-143）。マイクロエマルジョンはまた、化粧品および医薬適用の両方における、活性成分の経皮送達においても有効であった。本発明のマイクロエマルジョンの組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドの全身吸収の増大を促進し、ならびに、胃腸管、膣、口腔および他の投与の領域内における、オリゴヌクレオチドの局所的な細胞による取り込みを改善することが予測される。
投与されるべき有用な投薬量および特定の投与の形態は、細胞型、in vivoでの使用については年齢、体重および特定の動物および処置されるべきその領域、使用される特定のオリゴヌクレオチドおよび送達方法、企図される治療および診断用途ならびに製剤の形態、例えば懸濁液、乳液、ミセルまたはリポソームなどの要因に依存して変動し、このことは当業者に容易に明らかであろう。典型的には、投薬量は、より低い量で投与され、所望の結果が達成されるまで増加させられる。オリゴヌクレオチドを送達するために脂質が使用されるとき、投与される脂質化合物の量は変化し得、一般に、投与されているオリゴヌクレオチド剤の量に依存する。
例えば、脂質化合物のオリゴヌクレオチド剤に対する重量比は、好ましくは約１：１から約１５：１までであり、約５：１〜約１０：１の重量比がより好ましい。一般に、投与されるカチオン性脂質化合物の量は、約０．１ミリグラム（ｍｇ）〜約１グラム（ｇ）まで変化する。一般的なガイダンスのために、典型的には、患者の体重の各１ｋｇ毎に約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの特定のオリゴヌクレオチド剤および約１ｍｇ〜約１００ｍｇの脂質組成物が投与されるが、より高いおよびより低い量も使用され得る。
本発明の剤は、医薬の投与に好適な生物学的に適合性の形態で、対象へ投与されるか、または、細胞と接触させられる。「投与に好適な生物学的に適合性の形態」は、オリゴヌクレオチドの治療効果があらゆる毒性効果を凌ぐ形態で、オリゴヌクレオチドが投与されることを意味する。一態様において、オリゴヌクレオチドは、対象へ投与される。対象の例は、哺乳動物、例としてヒトおよび他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマおよび農耕(farming)（農業(agricultural)）用動物；イヌ、ネコおよび他の家庭のペット；マウス、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドの活性量の投与は、所望の結果を達成するために必要な投与量および時間において、有効量として定義される。例えば、オリゴヌクレオチドの活性量は、細胞の型、使用されるオリゴヌクレオチド、ならびに、in vivoでの使用については疾患の状態、個体の年齢、性別および体重、ならびに、個体において所望の応答を惹起するオリゴヌクレオチドの能力などの因子に従って変動してもよい。細胞中でのオリゴヌクレオチドの治療的レベルの確立は、取り込みの速度と流出または分解の速度に依存する。分解の度合いを低下させることは、オリゴヌクレオチドの細胞内半減期を延長する。よって、化学修飾されたオリゴヌクレオチド、例としてリン酸骨格の修飾を持つものは、異なる用量を必要とする場合がある。
正確なオリゴヌクレオチドの投薬量および投与される用量の回数は、実験的におよび臨床試験において生み出されるデータに依存するであろう。所望の効果、送達ビヒクル、疾患の兆候および投与の経路などの数個の因子が、投薬量に影響を及ぼすであろう。投薬量は当業者により容易に決定され得、対象とする医薬組成物中へ製剤化される。好ましくは、処置の期間は、少なくとも疾患の症状の経過全体に及ぶであろう。
投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するために調整されてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返して投与されてもよく、例として数回の用量を毎日投与してもよく、または、その用量を、治療状況の要件に従って比例的に低減させてもよい。オリゴヌクレオチドが細胞へ投与されるかまたは対象へ投与されるかに関わらず、当業者は、対象とするオリゴヌクレオチドの適切な用量および投与のスケジュールを容易に決定することができるであろう。
局所、硝子体内、前房内、網膜下、結膜下およびテノン嚢下投与を含む、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの眼の投与は、投薬レジメンの試験を通して最適化され得る。いくつかの態様において、単回投与で充分である。投与されたｓｄ−ｒｘＲＮＡの効果をさらに延長するために、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、当業者が精通しているとおり、遅延放出製剤またはデバイスにおいて投与され得る。ｓｄ−ｒｘＲＮＡ化合物の疎水性の性質により、広範で多様なポリマーの使用が可能となり、これらのいくつかは、従来のオリゴヌクレオチド送達に適合しない。
他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは複数回投与される。いくつかの態様において、これは、毎日、週２回、毎週、２週間毎、３週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、６カ月毎または６カ月毎よりも低い頻度で、投与される。いくつかの例において、これは、１日、１週間、１カ月および／または１年に複数回投与される。例えば、これは、およそ１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間または１２時間を超えてから１回、投与される。これは、毎日１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０回を超えた回数、投与され得る。
本発明の側面は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡまたはｒｘＲＮＡｏｒｉ分子を対象へ投与することに関する。いくつかの例において、対象は患者であり、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の投与には、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子を医院で投与することを伴う。
いくつかの例において、眼の投与により送達されるｓｄ−ｒｘＲＮＡの有効量は、少なくともおよそ０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１００μｇより多く、全ての中間値を含む。
本明細書に記載の方法により投与されるｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、目の全ての細胞型に対して効率的に標的化される。
核酸を導入する物理的方法は、核酸を含む溶液の注射、核酸により被覆された粒子による衝撃、核酸の溶液中での細胞または生体の浸漬、核酸の存在下における細胞膜のエレクトロポレーション、核酸を含む組成物の目への局所適用を含む。ウイルス粒子中にパッケージングされたウイルスコンストラクトは、細胞中への発現コンストラクトの効率的な導入および発現コンストラクトによりコードされる核酸の転写の両方を達成する。脂質媒介性キャリア輸送、リン酸カルシウムなどの化学媒介性輸送などの、核酸を細胞へ導入するための当該技術分野において知られている他の方法が使用されてもよい。よって、核酸は、以下の活性の１以上を実施する構成要素とともに導入され得る：細胞による核酸の取り込みを増強する、一本鎖のアニーリングを阻害する、一本鎖を安定化する、あるいは、標的遺伝子の阻害を増大させる。
オリゴヌクレオチド安定性のアッセイ
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは安定であり、すなわちエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性である。オリゴヌクレオチドは、それが内因性の細胞ヌクレアーゼによる攻撃に対して少なくとも約３倍耐性が高いとき、ヌクレアーゼに対して実質的に耐性であるとして、および、それが対応するオリゴヌクレオチドよりも少なくとも約６倍耐性が高いとき、高度にヌクレアーゼ耐性であるとして、定義される。これは、当該技術分野において知られている技術を使用して、本発明のオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して実質的に耐性であることを示すことにより、実証され得る。
実質的な安定性が実証され得る１つの方法は、本発明のオリゴヌクレオチドが、細胞に送達されたときに機能すること、例としてこれらが標的核酸分子の転写または翻訳を低下させることが、例としてタンパク質レベルを測定することによりまたはｍＲＮＡの切断を測定することにより、示すことによる。標的ＲＮＡの安定性を測定するアッセイは、トランスフェクションの約２４時間後に実施され得る（例として当該技術分野において知られているとおり、ノーザンブロット技術、ＲＮａｓｅ保護アッセイまたはＱＣ−ＰＣＲを使用して）。代わりに、標的タンパク質のレベルが測定され得る。好ましくは、目的のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを試験することに加えて、対照の、非標的遺伝子（例としてアクチン、または好ましくは標的と類似する配列を有する対照）のＲＮＡまたはタンパク質のレベルが、特異性の対照として測定されるであろう。ＲＮＡまたはタンパク質の測定は、当該技術分野において認識されるいずれの技術を使用してもなされ得る。好ましくは、測定は、トランスフェクションの約１６〜２４時間後に開始してなされるであろう（M. Y. Chiang, et al. 1991. J Biol Chem. 266:18162-71；T. Fisher, et al. 1993. Nucleic Acid Research. 21 3857）。
本発明のオリゴヌクレオチド組成物がタンパク質合成を阻害する能力は、当該技術分野において知られている技術、例えば遺伝子の転写またはタンパク質合成における阻害を検出することにより、測定され得る。例えばヌクレアーゼＳ１のマッピングが実施され得る。別の例において、ノーザンブロット分析が、特定のタンパク質をコードするＲＮＡの存在を測定するために使用され得る。例えば全ＲＮＡは、塩化セシウムのクッションの上で調製され得る（例としてAusebel et al., 1987. Current Protocols in Molecular Biology（Greene & Wiley, New York）を参照）。次いで、ノーザンブロットが、ＲＮＡを使用してなされ、プローブされる（例として上記を参照）。別の例において、例えばＰＣＲを使用して、標的タンパク質により産生される特定のｍＲＮＡのレベルが測定され得る。さらに別の例において、ウェスタンブロットが、存在する標的タンパク質の量を測定するために使用され得る。なお他の態様において、タンパク質の量により影響を受ける表現型が検出され得る。ウェスタンブロットを実施するための技術は、当該技術分野において周知であり、例としてChen et al. J. Biol. Chem. 271:28259を参照。
別の例において、標的遺伝子のプロモーター配列をレポーター遺伝子に連結させ、レポーター遺伝子の転写を（例として以下に詳細に記載されるとおり）モニタリングしてもよい。代わりに、プロモーターを標的化しないオリゴヌクレオチド組成物を、標的核酸分子の一部をレポーター遺伝子に、レポーター遺伝子が転写されるように融合させることにより、同定してもよい。オリゴヌクレオチド組成物の存在下においてレポーター遺伝子の発現の変化をモニタリングすることにより、レポーター遺伝子の発現を阻害する上でのオリゴヌクレオチド組成物の有効性を決定することが可能である。例えば、一態様において、有効なオリゴヌクレオチド組成物は、レポーター遺伝子の発現を低減させるであろう。
「レポーター遺伝子」は、検出可能な遺伝子産物を発現する核酸であって、これは、ＲＮＡまたはタンパク質であってもよい。ｍＲＮＡ発現の検出は、ノーザンブロットにより達成することができ、タンパク質の検出は、当該タンパク質に対して特異的な抗体で染色することにより達成することができる。好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能な産物を産生する。レポーター遺伝子を、当該レポーター遺伝子の産物の検出が調節配列の転写活性の測定をもたらすように、調節ＤＮＡ配列に作動的に連結してもよい。好ましい態様において、レポーター遺伝子の遺伝子産物は、その産物に関連する固有の活性により検出される。例えば、レポーター遺伝子は、色、蛍光または発光に基づく検出可能なシグナルを酵素活性によって生じさせる遺伝子産物をコードしてもよい。レポーター遺伝子の例として、限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼをコードするものが挙げられる。
当業者は、本発明における使用のために好適な多数のレポーター遺伝子を容易に認識することができる。これらは、限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびベータ−ガラクトシダーゼを含む。かかるレポーター遺伝子の例は、F. A. Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, New York（1989）において見出すことができる。検出可能な産物、例として検出可能な酵素活性を有する、または、特定の抗体を生じることができる任意の産物をコードする任意の遺伝子を、本方法におけるレポーター遺伝子として使用することができる。
１つのレポーター遺伝子システムは、ホタルルシフェラーゼレポーターシステムである（Gould, S. J., and Subramani, S. 1988. Anal. Biochem., 7:404-408；本明細書に参照して組み込まれる）。ルシフェラーゼアッセイは、迅速かつ感受性である。このアッセイにおいて、試験細胞のライセートを調製し、ＡＴＰおよび基質ルシフェリンと組み合わせる。コードされた酵素であるルシフェラーゼは、迅速なＡＴＰ依存的な基質の酸化を触媒し、発光生成物を生成する。合計の光出力を測定し、これは、広範囲の酵素の濃度にわたって存在するルシフェラーゼの量に比例する。
ＣＡＴは、頻繁に使用されるもう１つのレポーター遺伝子システムである。このシステムの主な利点は、これが広範囲に有効性を確認されており、プロモーター活性の尺度として広く受容されていることである（Gorman C. M., Moffat, L. F., and Howard, B. H. 1982. Mol. Cell. Biol., 2:1044-1051）。このシステムにおいて、試験細胞をＣＡＴ発現ベクターによりトランスフェクトし、最初のトランスフェクションの２〜３日以内に、候補物質とともにインキュベートする。その後、細胞抽出物を調製する。抽出物をアセチルＣｏＡおよび放射活性クロラムフェニコールとともにインキュベートする。インキュベーションの後で、アセチル化されたクロラムフェニコールを、薄層クロマトグラフィーにより、非アセチル化形態から分離する。このアッセイにおいて、アセチル化の程度が、特定のプロモーターによるＣＡＴ遺伝子の活性を反映する。
別の好適なレポーター遺伝子システムは、ｈＧＨの免疫学的検出に基づく。このシステムはまた、迅速かつ使用するのも容易である（Selden, R., Burke-Howie, K. Rowe, M. E., Goodman, H. M., and Moore, D. D. (1986), Mol. Cell, Biol., 6:3173-3179；本明細書に参照して組み込まれる）。ｈＧＨシステムは、発現されたｈＧＨポリペプチドが、細胞抽出物ではなく培養液(media)中でアッセイされることにおいて有利である。よって、このシステムは、試験細胞の破壊を必要としない。このレポーター遺伝子システムの原理がｈＧＨには限定されず、むしろ、受容可能な特異性を有する抗体が利用可能であるかまたはこれを準備することができる任意のポリペプチドについての使用に適していることが、理解されるべきである。
一態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性を測定し、対照、例として当該技術分野において典型的に使用されるＲＮＡｉ分子（例として長さが２５ヌクレオチド未満であって、２ヌクレオチド塩基の突出を含むデュプレックスオリゴヌクレオチド）または平滑末端を有する未修飾ＲＮＡデュプレックスと比較する。
本発明のｓｉＲＮＡを使用して達成される標的ＲＮＡ切断反応は、高度に配列特異的である。配列同一性は、当該技術分野において知られている配列比較およびアラインメントアルゴリズムにより決定することができる。２つの核酸配列（または２つのアミノ酸配列）の％同一性を決定するために、配列を、最適な比較目的のためにアラインメントする（例として最適なアラインメントのために、第１の配列または第２の配列中にギャップを導入する）。配列の比較のために利用される局所アラインメントアルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムであって、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において修正されたものである。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれる。さらに、DharmaconおよびInvitorogenなどの多数の市販の主体により、これらのウェブサイト上でアルゴリズムへのアクセスが提供されている。Whitehead Instituteによっても、無料のｓｉＲＮＡ選択プログラムが提供されている。ｓｉＲＮＡと標的遺伝子との間の９０％より高い配列同一性、例として９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％までもの配列同一性が好ましい。
代わりに、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義される。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の例は、Sambrook, J.、E. F. FritschおよびT. Maniatis、1989年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.、第９章および１１章、ならびに、Current Protocols in Molecular Biology、1995年、F. M. Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.、セクション2.10および6.3-6.4において提供され、これらは本明細書に参照して組み込まれる。
治療的使用
遺伝子の発現を阻害することにより、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、タンパク質の発現が関与する任意の疾患を処置するために使用することができる。オリゴヌクレオチド組成物により処置することができる疾患の例として、単に説明するために、がん、網膜症、自己免疫疾患、炎症性疾患（すなわち、ＩＣＡＭ−１関連障害、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病）、ウイルス疾患（すなわち、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎）、ｍｉＲＮＡ障害および心血管性疾患が挙げられる。
上で議論され得るとおり、本明細書に記載の方法によって投与されるｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、目の全ての細胞型に有効に標的化される。
本発明の側面は、これに限定されないが、神経節細胞層（ＧＣＬ）、内網状層（ＩＰＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、外網状層（ＯＰＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）、杆体錐体の外節（ＯＳ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、杆体錐体の内節（ＩＳ）、結膜の上皮、虹彩、毛様体、角質、および眼の皮脂腺の上皮に位置する細胞を含む、目の種々の細胞型へのｓｄ−ｒｘＲＮＡの標的化に関する。
目に標的化されるｓｄ−ｒｘＲＮＡは、いくつかの場合において、目特異的遺伝子または他の組織よりも目において高いレベルで発現される遺伝子を標的化し得る。公にアクセス可能なデータベースを使用して、目特異的発現を有するかまたは他の組織に対して目で発現が増加する遺伝子を同定することができることを、当業者は容易に理解するだろう。かかるデータベースのいくつかの非制限的な例は、TISGED（組織特異的遺伝子データベース）ならびに組織特異的遺伝子発現および調節のためのTiGERデータベースを含む。他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、目特異的遺伝子を標的化しない。他の態様において、標的化される遺伝子は、目特異的発現または目における増加した発現を有していない。
いくつかの場合において、目を標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、目に関連する状態または障害の少なくとも１つの症状を軽減する。
本発明の側面は、目の前部に影響する眼の障害の処置に関する。
目の前部に関連する眼の状態または障害は、角膜瘢痕、角膜穿孔、角膜ジストロフィー、角膜損傷および／または角膜外傷（熱傷を含む）、角膜炎症、角膜感染、新生児眼炎、多形性赤斑（スティーブンス・ジョンソン症候群）、眼球乾燥症（ドライアイ症候群）、トラコーマ、オンコセルカ症（河川盲目症）、ハンセン病の角膜合併症、角膜炎、持続性角膜上皮欠損、虹彩角膜内皮症候群、フックスジストロフィー、睫毛乱生症、眼単純ヘルペス、角膜移植不全および／または拒絶を含む。
いくつかの態様において、当該状態または障害は、角膜グラフティングまたは移植である。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡ分子は、手術に先立つグラフトまたは移植片のex vivo処置として投与される。
いくつかの態様において、当該状態または障害は、角膜上の創傷またはスクラッチである。角膜への任意の障害または損傷が、本発明の側面に関する状態および障害によって包含されることが理解されるべきである。
いくつかの態様において、治療用ＲＮＡは、易感染性または損傷している目に投与される。いくつかの態様において、角膜は、易感染性または損傷している。治療用ＲＮＡ分子は、易感染性または損傷している角膜に投与される。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡは、角膜に局所投与される。
目に関連する状態または障害のいくつかの他の非制限的な例は、血管漏出／血管新生（例として、血管造影嚢胞様黄斑浮腫(angiographic cystoids macular edema)、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）に続発する黄班浮腫、緑内障または血管新生緑内障（ＮＶＧ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）；線維増殖性疾患（例として、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜上膜／硝子体黄班接着(vitreomacular adhesions）；加齢黄班変性（ＡＭＤ）（例として、脈絡膜血管新生(ウエット型ＡＭＤ）、地図状萎縮（進行性ドライ型ＡＭＤ）、初期〜中期ドライ型ＡＭＤ）；糖尿病性網膜症（例として、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、糖尿病黄班浮腫（ＤＭＥ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）；網膜変性疾患（および関連する疾患）；網膜血管閉塞性疾患（例として、網膜血管閉塞、網膜動脈閉塞）および他の網膜疾患）；網膜剥離；原因が未知の（突発性の）または全身性（例として自己免疫）疾患に関連するブドウ膜炎（全ブドウ膜炎を含む）または脈絡膜炎（多巣性脈絡膜炎を含む）などの炎症性疾患；上強膜炎または強膜炎；バードショット脈絡網膜炎(Birdshot retinochoroidopathy)；血管疾患（網膜虚血、網膜血管炎、脈絡膜血管不全(choroidal vascular insufficiency)、脈絡膜血栓症）；視神経の血管新生；視神経炎；眼瞼炎；角膜炎；虹彩血管新生；フックス虹彩異色性虹彩毛様体炎；慢性ブドウ膜炎または前部ブドウ膜炎；結膜炎；アレルギー性結膜炎（季節性または通年性、春季、アトピー性、および巨大乳頭結膜炎を含む）；乾性角結膜炎（ドライアイ症候群）；虹彩毛様体炎；虹彩炎；強膜炎；上強膜炎；角膜浮腫；強膜疾患；眼瘢痕性類天疱瘡；毛様体扁平部炎；ポスナーシュロスマン症候群；ベーチェット病；フォークト・小柳・原田症候群；過敏症反応；結膜浮腫；結膜静脈性うっ血；眼窩周囲蜂巣炎；急性涙嚢炎；非特異的血管炎；サルコイドーシス；乾性角結膜炎、ドライアイとしても知られる状態、乾性角膜炎、乾燥症候群、眼球乾燥症、およびドライアイ症候群（ＤＥＳ）、これは異常な涙の組成に起因する涙産生の減少および／または涙膜蒸発の増加に由来し得る；自己免疫疾患、関節リウマチ、エリテマトーデス、糖尿病、シェーグレン症候群に関連する疾患を含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、創傷治癒の方法として投与される。目に関連する状態または障害の非制限的な例は、米国特許公開第20100010082号および米国特許第6,331,313号から参照して組み込まれる。
血管新生／血管漏出
本発明の側面は、血管新生および／または血管漏出に関連する疾患および状態を処置することに関する。これらの状態のうち、ウエット型ＡＭＤおよびＤＭＥが最も罹患率が高く、ＰＤＲおよびＲＶＯに続発する黄班浮腫が最も罹患率が低く、まれな新生血管状態は、ＲＯＰおよび血管新生緑内障を含む。血管漏出は、ＤＭＥの駆動力であると考えられているが、血管漏出および血管新生の両方がＰＤＲを駆動する。本発明のオリゴヌクレオチドは、特定の疾患または状態の原因に基づいて選択され得る。例として、血管透過性に影響する抗血管新生オリゴヌクレオチドを含む組成物を選択してＤＭＥを処置してもよいが、増殖に影響する組成物を選択してＰＤＲを処置してもよい。あるいは、オリゴヌクレオチド組成物は、両方の状態の病原学的側面が標的化されるように、抗血管新生剤、例として、血管透過性に影響する標的の機能を阻害するｓｄ−ｒｘＲＮＡ、および、増殖に影響する標的の機能を阻害するｓｄ−ｒｘＲＮＡを含んでもよい。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、血管新生および／または血管透過性が処置される。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、血管透過性の阻害剤である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的化する。ＶＥＧＦは、古典的であり、ウエット型ＡＭＤの処置のための臨床的に確認された標的であり、ＤＭＥおよびＰＶＯ関連ＭＥについて承認が期待されている。ＶＥＧＦタンパク質は、チロシンキナーゼレセプターに結合し、がん、加齢黄班変性、関節リウマチおよび糖尿病性網膜症などの多発性障害に関係付けられる増殖因子である。このタンパク質ファミリーのメンバーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄを含む。ヒトＶＥＧＦタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_001171623.1(VEGF-A)、U43368(VEGF-B)、X94216(VEGF-C)、およびD89630(VEGF-D)である。
本発明の側面は、ＶＥＧＦに対して向けられるｒｘＲＮＡｏｒｉに関する。例のセクションにおいて記載されるように、ＶＥＧＦについて、１００を超える最適なｒｘＲＮＡｏｒｉ配列が本明細書で同定されている（表２および９）。ｒｘＲＮＡｏｒｉは、表２または９内の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む配列に対して向けられ得る。例として、ｒｘＲＮＡｏｒｉは、表２または９内の配列の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドを含む配列に対して向けられ得る。いくつかの態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉは、配列番号１３（ＡＵＣＡＣＣＡＵＣＧＡＣＡＧＡＡＣＡＧＵＣＣＵＵＡ）または配列番号２８（ＣＣＡＵＧＣＡＧＡＵＵＡＵＧＣＧＧＡＵＣＡＡＡＣＡ）の少なくとも１２個連続したヌクレオチドを含む配列に対して向けられる。ｒｘＲＮＡｏｒｉ分子のセンス鎖は、表２に提示される配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉのセンス鎖は、配列番号１３または配列番号２８の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。ｒｘＲＮＡｏｒｉのアンチセンス鎖は、表２内の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドに相補的であり得る。いくつかの態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉのアンチセンス鎖は、配列番号１３７７（ＵＡＡＧＧＡＣＵＧＵＵＣＵＧＵＣＧＡＵＧＧＵＧＡＵ）または配列番号１３７８（ＵＧＵＵＵＧＡＵＣＣＧＣＡＵＡＡＵＣＵＧＣＡＵＧＧ）の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。
ＶＥＧＦに対して向けられるｒｘＲＮＡｏｒｉの非制限的な例は、配列番号１３の配列を含むセンス鎖および配列番号１３７７の配列を含むアンチセンス鎖を含むｒｘＲＮＡｏｒｉ、または、配列番号２８の配列を含むセンス鎖および配列番号１３７８の配列を含むアンチセンス鎖を含むｒｘＲＮＡｏｒｉを含む。種々の修飾パターンがｒｘＲＮＡｏｒｉと適合性であることが理解されるべきである。本発明の側面は、ＶＥＧＦに対して向けられるｒｘＲＮＡｏｒｉを含み、ここで、ｒｘＲＮＡｏｒｉは修飾されているかまたは未修飾である。いくつかの態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉは目に投与される。
ｏｒｉ配列はまた、目においてＶＥＧＦを標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子に変換されてもよい。開示されたｏｒｉ配列は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ開発のためのＶＥＧＦ内の配列の非制限的な例を示すことが理解されるべきである。これらの配列の長さの変更および修飾、ならびにＶＥＧＦ内の他の配列もまた、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の開発と適合性である。ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、表２または９内の配列から選択される配列に対して向けられ得る。例として、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、表２または９内の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む配列に対して向けられ得る。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、表２または９内の配列から選択される配列の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の連続するヌクレオチドを含む配列に対して向けられ得る。
いくつかの態様において、ＶＥＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡは、表８内の配列から選択される配列の少なくとも１２個のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３１７（ＡＧＡＡＣＡＧＵＣＣＵＵＡ）または配列番号１３５７（ＵＧＣＧＧＡＵＣＡＡＡＣＡ）の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含み、および／または、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１３１８（ＵＡＡＧＧＡＣＵＧＵＵＣＵＧＵＣＧＡＵ）または配列番号１３５８（ＵＧＵＵＵＧＡＵＣＣＧＣＡＵＡＡＵＣＵ）の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。特定の態様において、ＶＥＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡは、配列番号１３１７を含むセンス鎖および配列番号１３１８を含むアンチセンス鎖を含む。種々の化学的修飾パターンがｓｄ−ｒｘＲＮＡと適合性である。配列番号１３１７および配列番号１３１８の修飾形態の非制限的な例は、それぞれ、配列番号１３７９（A. G. A. A.mC. A. G.mU.mC.mC.mU.mU. A.Chl）および１３８０（P.mU. A. A. G. G. A.fC.fU. G.fU.fU.fC.fU* G*fU*fC* G* A* U）によって示される。
特定の態様において、ＶＥＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡは、配列番号１３５７を含むセンス鎖および配列番号１３５８を含むアンチセンス鎖を含む。配列番号１３５７および配列番号１３５８の修飾形態の非制限的な例は、それぞれ、配列番号１３９７（mU. G.mC. G. G. A.mU.mC. A. A. A.mC. A.Chl）および配列番号１３９８（P.mU. G.fU.fU.fU. G. A.fU.fC.fC. G.fC. A*fU* A* A*fU*fC* U）によって示される。特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、配列番号１３９７および１３９８を含む。本明細書に開示されるｓｄ−ｒｘＲＮＡの他の修飾パターンもまた、本発明の側面と適合性であることが理解されるべきである。
本明細書に記載されるのは、ＶＥＧＦ以外のタンパク質をコードする遺伝子に対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡである。かかるｓｄ−ｒｘＲＮＡの非制限的な例としては、表３〜７に提示される。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、表３〜７内の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＣＴＧＦに対して向けられる。ＣＴＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡの非制限的な例は、表５内に提示される。いくつかの態様において、ＣＴＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１４３１（ＧＣＡＣＣＵＵＵＣＵＡＧＡ）の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含み、ＣＴＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１４３２（ＵＣＵＡＧＡＡＡＧＧＵＧＣＡＡＡＣＡＵ）の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。配列番号１４３１および１４３２の修飾形態の非制限的な例は、それぞれ、配列番号９４７（G.mC. A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU. A*mG*mA.TEG-Chl）および配列番号９４８（P.mU.fC.fU. A. G.mA. A.mA. G. G.fU. G.mC* A* A* A*mC* A* U.）によって示される。いくつかの態様において、ＣＴＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１４３３（ＵＵＧＣＡＣＣＵＵＵＣＵＡＡ）の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含み、ＣＴＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１４３４（ＵＵＡＧＡＡＡＧＧＵＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧ）の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。配列番号１４３３および１４３４の修飾形態の非制限的な例は、配列番号９６３（mU.mU. G.mC. A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU*mA*mA.TEG-Chl）および配列番号９６４（P.mU.fU. A. G. A.mA. A. G. G.fU. G.fC.mA.mA*mA*fC*mA*mA*mG* G.）によって示される。
いくつかの態様において、ＣＴＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖は、配列番号９４７または配列番号９６３の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む。特定の態様において、ＣＴＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡは、配列番号９６３の配列を含むセンス鎖および配列番号９６４の配列を含むアンチセンス鎖を含む。他の態様において、ＣＴＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡは、配列番号９４７の配列を含むセンス鎖および配列番号９４８の配列を含むアンチセンス鎖を含む。
ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、疎水的に修飾されていてもよい。例として、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、１以上の疎水性抱合体に連結され得る。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、少なくとも１つの５−メチルＣまたはＵ修飾を含む。
本発明の側面は、本明細書に記載のｒｘＲＮＡｏｒｉおよび／またはｓｄ−ｒｘＲＮＡ核酸を含む組成物に関する。組成物は、１以上のｒｘＲＮＡｏｒｉおよび／またはｓｄ−ｒｘＲＮＡを含み得る。いくつかの態様において、異なるタンパク質をコードする遺伝子に対して向けられる複数の異なるｒｘＲＮＡｏｒｉおよび／または異なるタンパク質をコードする遺伝子に対して向けられる複数の異なるｓｄ−ｒｘＲＮＡを含む。いくつかの態様において、組成物は、ＶＥＧＦに対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡおよびＣＴＧＦまたはＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）をコードする遺伝子などの他の遺伝子に対して向けられるｓｄ−ｒｘＲＮＡを含む。
いくつかの態様において、１以上のｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＩＧＴＡ５、ＡＮＧ２、ＣＴＧＦ、ＣＯＸ−２、補体因子３もしくは５、またはその組み合わせを標的化する。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、肥大軟骨細胞特異的タンパク質２４(Hypertrophic chondrocyte-specific protein 24)としても知られる結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）を標的化する。ＣＴＧＦは、創傷治癒および強皮症に関係づけられている分泌型ヘパリン結合タンパク質である。結合組織増殖因子は、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞を含む多数の細胞型において活性である。ヒトＣＴＧＦについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提示する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_001901.2およびM92934である。
いくつかの態様において、分泌型リン酸化タンパク質（ＳＰＰ１）としても知られているオステオポンチン（ＯＰＮ）、骨シアロタンパク質１（ＢＳＰ−１）および初期Ｔ細胞活性化(early T-lymphocyte activation)（ＥＴＡ−１）を標的化する。ＳＰＰ１は、ヒドロキシアパタイトに結合する分泌型糖タンパク質タンパク質である。ＯＰＮは、骨リモデリング、免疫機能、走化性、細胞活性化およびアポトーシスを含む、種々の生物学的プロセスに関係づけられている。オステオポンチンは、線維芽細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、象牙芽細胞、骨髄細胞、肥大軟骨細胞、樹状細胞、マクロファージ、平滑筋、骨格筋細胞、内皮細胞、内耳、脳、腎臓、脱落膜、および胎盤における骨外（骨ではない）細胞を含む種々の細胞型によって産生される。ヒトオステオポンチンについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_000582.2およびX13694である。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、哺乳動物において３つのアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）が存在するトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を標的化する。ＴＧＦβタンパク質は、増殖、遊走、アポトーシス、接着、分化、炎症、免疫抑制および細胞外タンパク質の発現を含む多数の細胞プロセスの調節に関与する増殖因子のスーパーファミリーに属する分泌型タンパク質である。これらのタンパク質は、上皮、内皮、造血、神経、および結合組織細胞を含む広範な範囲の細胞によって産生される。ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、それぞれ、BT007245、BC096235およびX14149である。ＴＧＦβファミリー内で、ＴＧＦβ３ではなく、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２が適切な標的の代表である。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、プロスタグランジンＧ／Ｈ合成酵素２（ＰＴＧＳ２）とも呼ばれるシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）を標的化する。ＣＯＸ−２は、脂質代謝およびプロスタノイドの生合成に関与し、関節リウマチなどの炎症性障害に関係づけられている。ヒトＣＯＸ−２についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、AY462100である。
他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＨＩＦ−１転写因子の１構成成分であるＨＩＦ−１αを標的化する。ＨＩＦ−１αは、ＶＥＧＦ依存性およびＶＥＧＦ独立性の血管新生促進経路および線維化促進(pro-fibrotic)経路の上流に作用する、低酸素に対する細胞応答の重要な制御因子である。ＨＩＦ−１αインヒビターは、レーザーＣＮＶおよびＯＩＲモデルにおいて有効である。ヒトＨＩＦ１αについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供するGenbankアクセッション番号は、U22431である。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ｍＴＯＲを標的化する。ｍＴＯＲは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のセリン／スレオニンキナーゼの構成成分であり、細胞成長、増殖、生存、転写および翻訳の制御因子である。ｍＴＯＲインヒビターは、抗血管新生（レーザーＣＮＶおよびＯＩＲモデルにおいて有効である）活性および抗線維化活性の両方を有する。ラパマイシンおよび他のｍＴＯＲインヒビターは、ＡＭＤおよびＤＭＥについての臨床試験において使用されている。ヒトｍＴＯＲについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、L34075である。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、造血幹細胞および内皮前駆細胞の組織へのホーミングを刺激する可溶性因子である、ＳＤＦ−１（ストロマ細胞由来因子１）を標的化する。ＳＤＦ−１は、ＶＥＧＦと相乗的に作用して、病的血管新生を駆動し、ＳＤＦ−１シグナル伝達の阻害はＯＩＲ、レーザーＣＮＶおよびＶＥＧＦ誘導性げっ歯類モデルにおける血管新生を抑制する。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＰＤＧＦ−Ｂ（血小板由来増殖因子β）を標的化する。トランスジェニックマウスにおけるＰＤＧＦ−Ｂの網膜過剰発現により、血管結合組織の増殖が生じ、ＰＤＧＦ−Ｂシグナル伝達の阻害は、レーザーＣＮＶモデルにおける抗ＶＥＧＦ処置の効力を強化する。ＰＤＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦの二重阻害は、ＮＶの退縮を促進し得る。ヒトＰＤＧＦ遺伝子およびタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、X03795(PDGFA)、X02811(PDGFB)、AF091434(PDGFC)、AB033832(PDGFD)を含む。
いくつかの態様において、治療用ＲＮＡは、ＴＩＥ１（免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ）を標的化する。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡは、ＴＩＥ２（ＴＥＫチロシンキナーゼ）を標的化する。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡは、アンギオポエチンを標的化する。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡは、ＡＮＧ１（アンギオポエチン１）を標的化する。いくつかの態様において、治療用ＲＮＡは、ＡＮＧ２（アンギオポエチン２）を標的化する。
他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＦＬＴ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）とも称される、ＶＥＧＦＲ１（血管内皮増殖因子１）を標的化する。この遺伝子は、血管内皮増殖因子レセプター（ＶＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーをコードする。ＶＥＧＦＲファミリーメンバーは、いくつかの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する細胞外リガンド結合領域、膜貫通セグメント、および細胞質ドメイン内のチロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインを含有するレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。このタンパク質は、ＶＥＧＦＲ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−Ｂおよび胎盤増殖因子に結合し、血管新生および脈管形成(vasculogenesis)において重要な役割を果たす。ヒトＶＥＧＦＲ１遺伝子およびタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_001159920、NP_001153392、NM_001160030、NP_001153502、NM_001160031、NP_001153503、NM_002019、およびNP_002010を含む。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメインレセプター）とも称される、ＶＥＧＦＲ２（血管内皮増殖因子レセプター２）を標的化する。キナーゼ挿入ドメインレセプターとも知られるこのドメインは、ＩＩＩ型レセプターチロシンキナーゼである。これは、ＶＥＧＦ誘導性内皮増殖、生存、遊走、尿細管形態形成および出芽(sprouting)の主要なメディエーターとして機能する。このレセプターのシグナル伝達および輸送は、Ｒａｂ ＧＴＰａｓｅ、Ｐ２Ｙプリンヌクレオチドレセプター、インテグリンアルファＶベータ３、Ｔ細胞タンパク質チロシンホスファターゼなどを含む複数の因子によって調節される。ヒトＶＥＧＦＲ２遺伝子およびタンパク質についてのDNAおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_002253およびNP_002244を含む。いくつかの態様において、血管新生および／または血管漏出の処置は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせの使用を含んでいてもよく、各々のｓｄ−ｒｘＲＮＡが異なる遺伝子を標的化する。例としては、ＶＥＧＦを標的化するｓｄ−ｒＲＮＡおよびＨＩＦ−１αを標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡが使用され得る。別の例としては、ｍＴＯＲを標的化するｓｄ−ｒＲＮＡおよびＳＤＦ−１を標的化するｓｄ−ｒＲＮＡが使用され得る。なお別の例としては、ＶＥＧＦを標的化するｓｄ−ｒＲＮＡ、ｍＴＯＲを標的化するｓｄ−ｒＲＮＡおよびＰＤＧＦ−Ｂを標的化するｓｄ−ｒＲＮＡが使用され得る。
ウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））
本発明の側面は、ＡＭＤの最も進行が速い形態（米国において〜１００万件の症例）の脈絡膜血管新生の処置に関し、これは、脈絡膜から網膜下空間への新しい血管の不適切な増殖およびこれらの血管からの流体の漏出から生じる。未処置の場合、７５％の患者が３年以内に法廷盲に進行する。硝子体内の抗ＶＥＧＦ剤は、ＣＮＶ病変増殖およびＣＮＶ病変からの血管漏出を阻害することによって、迅速に視力を改善し得る。しかしながら、既存の抗ＶＥＧＦは、ほとんどの患者における既存の病変の退行を引き起こさないかもしれない。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、ＣＮＶを処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡはＶＥＧＦを標的化する。他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＨＩＦ−１α、ｍＴＯＲ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＳＤＦ−１、ＩＧＴＡ５、ＡＮＧ２、ＣＴＧＦ、ＣＯＸ−２、または補体因子３もしくは５を標的化する。いくつかの態様において、ＣＮＶの処置は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせの使用を含み、各々のｓｄ−ｒｘＲＮＡは異なる遺伝子を標的化する。
糖尿病性黄班浮腫（ＤＭＥ）
ＤＭＥは、網膜血管からの血管漏出により生じ、視力を脅かす斑における流体の蓄積を生じ、これは、糖尿病患者の〜２〜５％において生じる。現在の標準治療は、焦点またはグリッドレーザー光凝固である。硝子体内の抗ＶＥＧＦ剤および副腎皮質ステロイドが有効であると示されているが、未だ承認されていない。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用してＤＭＡを処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡはＶＥＧＦを標的化する。他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＨＩＦ−１α、ｍＴＯＲ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＳＤＦ−１、ＩＧＴＡ５、ＡＮＧ２、ＣＴＧＦ、ＣＯＸ−２、または補体因子３もしくは５を標的化する。いくつかの態様において、ＤＭＥの処置は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせの使用を含み、各々のｓｄ−ｒｘＲＮＡは、異なる遺伝子を標的化する。
増殖糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）
ＰＤＲは、慢性網膜虚血に関連する。網膜血管新生は、網膜虚血に続発して生じ、硝子体出血、血管結合組織増殖、および牽引性網膜剥離を生じ得る。
特定の形態において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、ＰＤＲを処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡはＶＥＧＦを標的化する。他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＨＩＦ−１α、ｍＴＯＲ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＳＤＦ−１、ＩＧＴＡ５、ＡＮＧ２、ＣＴＧＦ、ＣＯＸ−２、または補体因子３もしくは５を標的化する。いくつかの態様において、ＰＤＲの処置は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせの使用を含み、各々のｓｄ−ｒｘＲＮＡは、異なる遺伝子を標的化する。
ＲＶＯに続発する黄班浮腫
ＲＶＯは、虚血性および非虚血性の形態で生じ得る。虚血性ＲＶＯは、黄班浮腫、網膜虚血、および血管新生を含む、いくつかの視力を脅かす合併症を生じ得る。非虚血性ＲＶＯは、より好ましい予後を有し、最も一般的な視力を脅かす合併症は黄班浮腫である。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、ＲＶＯに続発する黄班浮腫を処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡはＶＥＧＦを標的化する。他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＨＩＦ−１α、ｍＴＯＲ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＳＤＦ−１、ＩＧＴＡ５、ＡＮＧ２、ＣＴＧＦ、ＣＯＸ−２、または補体因子３もしくは５を標的化する。いくつかの態様において、ＲＶＯに続発する黄班浮腫の処置は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせの使用を含み、各々のｓｄ−ｒｘＲＮＡは、異なる遺伝子を標的化する。
虹彩血管新生／血管新生緑内障（ＮＶＧ）
ＮＶＧは、重篤な慢性的な眼の虚血に罹患する、目において発生するまれな障害である。最も一般的な原因は、進行性ＰＤＲまたは虚血性ＣＲＶＯである。虹彩血管新生は、虚血に起因して生じ、最終的に線維柱体網を閉塞させて、重篤な続発性緑内障を生じる。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、虹彩血管新生および／またはＮＶＧを処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡはＶＥＧＦを標的化する。他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＨＩＦ−１α、ｍＴＯＲ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＳＤＦ−１、ＩＧＴＡ５、ＡＮＧ２、ＣＴＧＦ、ＣＯＸ−２、または補体因子３もしくは５を標的化する。いくつかの態様において、虹彩血管新生および／またはＮＶＧの処置は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせの使用を含み、各々のｓｄ−ｒｘＲＮＡは、異なる遺伝子を標的化する。
増殖性網膜疾患
増殖性網膜疾患は、増殖性硝子体網膜症、増殖糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、網膜上膜（斑の表面にわたり増殖して網膜牽引を引き起こし得る細胞の透明な層）、およびウエット型ＡＭＤを含む。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、増殖性網膜疾患を処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡはＴＧＦβを標的化し、他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡはＣＴＧＦを標的化する。さらに他の態様において、複数のｓｄ−ｒｘＲＮＡがＰＤＧＦＲα、ｍＴＯＲ、ＩＧＴＡ５、またはその組み合わせを標的化する。また他の態様において、複数のｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＴＧＦβおよびＣＴＧＦ、ＰＤＧＦＲα、ｍＴＯＲ、ＩＧＴＡ５の少なくとも１つまたはその組み合わせを標的化する。さらなる態様において、複数のｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβ、ＰＤＧＦＲα、ｍＴＯＲ、ＩＧＴＡ５の少なくとも１つまたはその組み合わせを標的化する。特定の態様において、増殖性網膜疾患の処置は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせの使用を含み、各々のｓｄ−ｒｘＲＮＡは、異なる遺伝子を標的化する。
ドライ型ＡＭＤ
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、地図状萎縮（ＧＡ）（ウエット型ＡＭＤよりもゆっくりと進行する進行性ＡＭＤの１形態）および初期〜中期のドライ型ＡＭＤ（ＧＡまたはＣＮＶに先行するドライ型ＡＭＤの初期段階）を含む、ドライ型ＡＭＤを処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ（二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびプレマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、約２０〜２５ヌクレオチド長の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短い二本鎖ＲＮＡフラグメントに切断するＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのエンドリボヌクレアーゼ）の発現を阻害または調節する転写因子または他の分子を標的化する。
嚢胞様黄班浮腫
嚢胞様黄班浮腫は、手術後の中心窩嚢胞(erofoveal cysts)における網膜内流体の蓄積である。特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、嚢胞様黄班浮腫を治療する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ２）酵素を標的化する。
網膜色素変性症
網膜色素変性症は、いくつかの公知の遺伝子における変異によって引き起こされる遺伝性の網膜変性疾患である。特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、網膜色素変性症を処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを標的化する。
緑内障
緑内障は、視神経の変性によって特徴づけられる緩徐進行性(slowly progressive)の疾患である。疾患の進行期には、中央の視覚の喪失とともに、周辺において最初の視覚の喪失が発生する。緑内障関連の視覚の喪失について最も理解されている危険因子は、眼圧（ＩＯＰ）である。線維柱帯切除術は、強膜を介してチャネルまたはブレブを創出し、目の前側から過剰な流体を排出するのを可能にし、ＩＯＰの減少を生じるように設計された外科手順である。線維柱帯切除術の失敗の最も一般的な原因は、瘢痕組織によるブレブの妨害である。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、線維柱帯切除術から生じた瘢痕組織の形成を妨げる。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＣＴＧＦを標的化するが、他の態様において、ｓｄ−ｒＲＮＡはＴＧＦβを標的化する。さらに他の態様において、複数のｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＣＴＧＦおよびＴＧＦβの両方を標的化する。いくつかの態様において、瘢痕形成は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせ、ＣＴＧＦを標的化するものおよびＴＧＦβを標的化するものの組み合わせの使用によって妨げられる。
ブドウ膜炎
ブドウ膜炎は、脈絡膜、毛様体および虹彩から構成されるブドウ膜と呼ばれる、目の中間層の炎症によって特徴づけられる広範な群の障害である。当該障害は、前面、中間部、後方、または全ブドウ膜炎として解剖学的に分類され、感染性または非感染性として病理学的に分類される。
特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用してブドウ膜炎を処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、サイトカイン、例としてＴＮＦαを標的化する。他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２ＲまたはＣＴＬＡ−４を標的化する。さらに他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４４またはオステオポンチンを含む接着分子を標的化する。なお他の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２Ｒ、ＣＴＬＡ−４、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４４およびオステオポンチンの少なくとも１つを標的化する。いくつかの態様において、瘢痕組織形成は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせの使用により妨げられ、各々が異なる遺伝子を標的化する。
網膜芽細胞腫（Ｒｂ）
網膜芽細胞腫は、網膜の細胞における迅速に発達するがんである。特定の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、網膜芽細胞腫を処置する。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、腫瘍化において役割を果たすと考えられている核タンパク質ＨＭＧＡ２を標的化する。
特定の態様において、本発明のｓｄ−ｒｘＲＮＡを、複数の遺伝子サイレンシングに使用することができる。いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせを使用して、複数の異なる遺伝子を標的化する。例としては、新生血管障害の処置のために使用される場合、ＶＥＧＦを標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡを、ＨＩＦ−１αを標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡとともに使用することができる。別の例としては、ブドウ膜炎の処置に使用される場合、ＴＮＦαを標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡ、ＶＣＡＭ−１を標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡおよびＩＬ−２Ｒを標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡを組み合わせて使用することができる。
いくつかの態様において、複数のｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用して、ＶＥＧＦ、ＩＧＴＡ５、ＡＮＧ２、ＣＴＧＦ、ＣＯＸ−２、補体因子３、補体因子５、ＨＩＦ−１α、ｍＴＯＲ、ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−β、Ａｌｕ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２Ｒ、ＣＴＬＡ−４、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４４、オステオポンチン（ＳＰＰ１）またはこれらの任意の組み合わせを標的化し得る。いくつかの態様において、かかる複数標的化遺伝子サイレンシングを使用して、必要な場合、１以上の疾患または状態を処置し得る。
いくつかの態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ＭＡＰ４Ｋ４を標的化する。ＭＡＰ４Ｋ４はSaccaromyces cerevisiae Sterile 20（ＳＴＥ２０）に関連するタンパク質キナーゼのグループに属する哺乳動物セリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。ＭＡＰ４Ｋ４（Ｎｃｋ相互作用キナーゼ(Nck interacting kinase)としても知られる）は、ＮｃｋのＳＨ３ドメインと相互作用するタンパク質についてのマウススクリーニングにおいて最初に同定された。その発見以来、ＭＡＰ４Ｋ４は広範な生理学的機能に関連付けられ、関連付けられ続けている。
ＭＡＰ４Ｋ４発現のＲＮＡｉ媒介阻害のためのアプローチは、2008年11月19日に出願された、米国仮出願番号第61/199,661号、表題「ＲＮＡｉを介するＭＡＰ４Ｋ４の阻害」および2009年11月19日に出願された、PCT出願PCT/US2009/006211、表題「ＲＮＡｉを介するＭＡＰ４Ｋ４の阻害」に記載され、参照して組み込まれる。ＭＡＰ４Ｋ４を標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、本発明の側面と適合性である。いくつかの態様において、ＶＥＧＦを標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子およびＭＡＰ４Ｋ４を標的化するｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は一緒に投与され得る。
表１は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ標的の非制限的な例およびそれらが適用され得る領域を提示する。
表１：ｓｄ−ｒｘＲＮＡ標的および適用の例
一態様において、オリゴヌクレオチドによるin vitroでの細胞の処置を、対象から取り除かれた細胞のex vivoでの治療のため、または、対象に由来しないが対象へ投与される予定の細胞の処置のため（例として対象へ移植される予定の細胞における移植抗原の発現の除去）に使用することができる。加えて、in vitroでの細胞の処置を、非治療的セッティングにおいて、例として遺伝子の機能を評価するため、遺伝子の調節およびタンパク質合成を研究するため、または、遺伝子発現またはタンパク質合成を調節するように設計されたオリゴヌクレオチドに対して行われた改善を評価するために、使用することができる。in vivoでの細胞の処置は、タンパク質の発現を阻害することが望ましい特定の臨床的セッティングにおいて有用であり得る。対象とする核酸は、ヒト、非ヒト霊長類、非ヒト哺乳動物、非ヒト脊椎動物、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど）、家畜動物、ペット（ネコ、イヌなど）、ツメガエル、魚類、昆虫（ショウジョウバエなど）および線虫（C. elegans）などのＲＮＡｉ経路を有する任意の動物において、ＲＮＡｉに基づく治療に使用することができる。
本発明は、対象へ本発明の核酸を投与することにより、対象において、異常なまたは望ましくない標的遺伝子の発現または活性に関連する疾患または状態を阻害または予防するための方法を提供する。適切である場合、対象を始めに、続くＲＮＡｉ治療に対してより応答性となるように、プライミング剤により処置する。異常な、または望ましくない標的遺伝子の発現または活性により引き起こされるかこれが寄与する疾患についてのリスクを有する対象は、例えば当該分野で公知の診断または予後診断アッセイのいずれかまたは任意の組み合わせにより同定することができる。予防剤の投与は、疾患または障害が予防されるように、標的遺伝子の異常の特徴である症状の顕在化に先だって行われても、あるいは、その進行において遅れて行われてもよい。標的遺伝子の異常の型に依存して、例えば標的遺伝子、標的遺伝子アゴニストまたは標的遺伝子アンタゴニスト剤を、対象を処置するために使用することができる。
別の側面において、本発明は、治療を目的として、標的遺伝子発現、タンパク質の発現または活性を調節するための方法に関係する。したがって、例示的な態様において、本発明の方法は、標的遺伝子を発現することができる細胞を、標的遺伝子またはタンパク質に対して特異的な（例として前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに対して特異的な、または前記タンパク質のアミノ酸配列を特定する）本発明の核酸と、標的タンパク質の発現または１以上の活性が調節されるように、接触させることを含む。これらの方法は、in vitroで（例として細胞を剤とともに培養することにより）、in vivoで（例として剤を対象へ投与することにより）、または、ex vivoで行うことができる。
対象を始めに、所望される場合、続くＲＮＡｉ治療に対してより応答性になるように、プライミング剤で処置する。したがって、本発明は、標的遺伝子のポリペプチドまたは核酸分子の異常なまたは望ましくない発現または活性により特徴づけられる疾患または障害に罹患した対照を処置する方法を提供する。標的遺伝子の活性の阻害は、標的遺伝子が異常に制御されていないか、および／または、低下した標的遺伝子の活性が有益な効果を有する可能性がある状況において望ましい。
したがって、本発明の治療剤は、異常なまたは望ましくない標的遺伝子の活性に関連する障害を処置（予防的または治療的に）するために、対象に投与することができる。かかる処置と組み合わせて、薬理ゲノミクス（すなわち、個体のジェノタイプと外来化合物または薬物に対する個体の応答との間の関係の研究）を考慮してもよい。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度の間の関係を変化させることにより、重篤な毒性または治療の失敗をもたらす可能性がある。したがって、医師または臨床医は、治療剤を投与するか否かを決定する上で、ならびに、投薬量および／または治療剤による処置の治療レジメンを調整する上で、関連する薬理ゲノミクス研究において得られる知識を適用することを考慮してもよい。薬理ゲノミクスは、罹患個体における薬物の体内処理(disposition)および異常作用の変化に起因する、薬物に対する応答における臨床的に重要な遺伝的バリエーションに対処する。
本発明の目的のために、範囲は、「約(about)」ある特定の値から、および／または、「約」別の特定の値まで、本明細書に表記されてもよい。かかる範囲が表記される場合、別の態様は、当該ある特定の値および／またはもう一方の特定の値までを含む。同様に、値が近似(approximation)として表記される場合、先行する「約」の使用により、当該特定の値が別の態様を形成することが理解されるだろう。当該範囲の各々のエンドポイントが、他のエンドポイントに対して、そして、他のエンドポイントと独立して、の両方で重要であることがさらに理解されるだろう。
さらに、本発明の目的のために、用語「１つの(a)」または「１つの(an)」との実体は、その実体の１以上を指す。例として、「１つのタンパク質(a protein)」または「１つの核酸分子(a nucleic acid molecule)」は、これらの化合物の１以上または少なくとも１つの化合物を指す。したがって、用語「１つの(a)」（または１つの(an)）、「１以上(one or more)」および「少なくとも１つ」は本明細書で交換可能に使用され得る。用語「含む(comprising)」、「含む(including)」、「有する(having)」は交換可能に使用され得ることもまた注意すべきである。さらに、「〜からなる群から選択される」化合物は、２以上の化合物の混合物（すなわち、組み合わせ）を含む、後に続くリスト中の１以上の化合物を指す。本発明にしたがって、単離された、または、生物学的に純粋な、タンパク質または核酸分子が、その天然環境から取り出された化合物である。したがって、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、当該化合物が生成されている程度を必ずしも反映するものではない。本発明の単離された化合物は、その天然供給源から得ることができ、分子生物学技術を使用して産生することができ、または、化学合成によって産生することができる。
本発明は、以下の例によってさらに例示されるが、これらは決して、さらに限定するものとして解釈されるべきではない。本出願を通して引用された全ての参考資料（参考文献、交付済み特許、公開された特許出願および同時係属の特許出願を含む）の全体の内容は、参照してここに明示的に組み込まれる。
例
例１：ＲＸＩ−１０９の眼の投与
カニクイザルは、１日目に、生理食塩水または０．１、０．３３、または１ｍｇ／目のＲＸＩ−１０９の単回の両側性の硝子体内注射（５０μｌ）を受けた。硝子体内注射の７日後に目全体を回収した。ＣＴＧＦタンパク質レベルを、抗ＣＴＧＦ抗体を用いる免疫組織化学検出によって決定し、染色スライドのデジタル画像分析によって定量化した。ＣＴＧＦタンパク質レベルは、ＲＸＩ−１０９の投与後、角膜組織において、用量依存的に低減した。統計学的に有意なＣＴＧＦタンパク質レベルの低減が、１ｍｇ／目の群とＰＢＳ注射群との間で見出された。＊ｐ＜０．０５。
ＲＸＩ−１０９の配列は、配列番号９４７（G.mC. A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU. A*mG*mA.TEG-Chl）のセンス鎖配列および配列番号９４８のアンチセンス配列（P.mU.fC.fU. A. G.mA. A.mA. G. G.fU. G.mC* A* A* A*mC* A* U.）に対応する。
例２：ｓｄ−ｒｘＲＮＡは３Ｄ角膜上組織培養モデルにおいて全ての細胞層を透過する
ヒト角膜上皮細胞を利用する３Ｄ組織培養モデルであるＭａｔＴｅｋ角膜上モデルを使用して、ｓｄ−ｒｘＲＮＡが角膜を透過できるか否かを決定した。このモデルは、in vivoでの透過性バリアと比較可能であり、主要な角膜マーカーを発現するため、このモデルを使用して角膜における薬物透過性を決定した。細胞は、培地曝露（図２）または局所的（図３、下段）に蛍光標識したｓｄ−ｒｘＲＮＡ（５μＭ）を用いて処置した。さらに、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの取り込みを、スクラッチの存在下で（創傷を模倣するために）（図３）比較した。ｓｄ−ｒｘＲＮＡ曝露の２４時間後および４８時間後に、細胞を移動させ、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、そして、薄片を切り出した。蛍光顕微鏡を使用して、角膜上皮細胞におけるｓｄ−ｒｘＲＮＡの細胞内取り込みを検出した。ｓｄ−ｒｘＲＮＡの細胞内取り込みが、培地曝露（無傷またはスクラッチモデル）または局所投与（スクラッチモデル）後に角膜上モデルで観察された。
例３：ｄｓ−ｒｘＲＮＡは３Ｄ角膜上組織培養モデルにおいて標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを顕著に低減させる
ｓｄ−ｒｘＲＮＡを標的化するＭａｐ４ｋ４を、角膜上モデル（ヒト角膜上皮細胞）における活性について試験した。３Ｄ培養物中の角膜上皮細胞を、無血清培地中のＭａｐ４ｋ４標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡまたは非標的化対照(#21204)の濃度を変えて処置した。試験濃度は、５および１μＭであった。非標的化対照ｓｄ−ｒｘＲＮＡ（#21204）は、Ｍａｐ４ｋ４標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡと類似の構造であって、両鎖にわたり、類似の安定化修飾を含有する。投与から４８時間後、細胞を溶解し、ｍＲＮＡレベルを、遺伝子特異的TaqManプローブ（Life Technologies, Carlsbad, CA）を使用して、製造元のプロトコルに従いｑＰＣＲによって決定した。データを、ハウスキーピング遺伝子（ＰＰＩＢ）に対し正規化し、非標的化対照についてグラフ化する。エラーバーは、生物学的トリプリケートの平均からの標準偏差を表す。（図４）
表２：ｈＶＥＧＦステルス配列
表３：ＳＰＰ１（アクセッション番号NM_000582.2）ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列
表４：ＰＴＧＳ２（アクセッション番号NM_000963.2）ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列
表５：ＣＴＧＦ(アクセッション番号NM_001901.2)ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列
表６：ＴＧＦβ２（アクセッション番号NM_001135599.1）ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列
表７：ＴＧＦβ１（アクセッション番号NM_000660.3）
表８：ＶＥＧＦ（アクセッション番号NM_001171623.1）ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列の例
表９：選択されたＶＥＧＦ ｒｘＲＮＡｏｒｉ配列の例
表１０：安定性が増加した最適化されたＶＥＧＦ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列
表１１：ＭＡＰ４Ｋ４ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列の例
本発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面をこのように記載してきたが、種々の変更、修飾、および改善が当業者に容易に思い浮かぶことが理解されるべきである。かかる変更、修飾および改善は、本開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内であることが意図される。したがって、上述の説明および図面は、例示のためのみである。
均等物
当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な態様についての多数の均等物を理解するかまたはそれに気付くことができるであろう。かかる均等物は、以下のクレームによって包含されることが意図される。
特許文書を含め、本明細書に開示される全ての参考文献は、それらの全体が参照して組み込まれる。本出願は、2013年2月5日に出願された米国特許公開番号US2013/0131142、表題「眼の兆候におけるＲＮＡ干渉」、2009年9月22日に出願されたPCT公開第WO2010/033247号（出願第PCT/US2009/005247号）、表題「低減されたサイズの自己送達型ＲＮＡｉ化合物」、2012年2月16日にUS2012/0040459として公開され、2014年8月5日に特許交付された米国特許第8,796,443号、表題「低減されたサイズの自己送達型ＲＮＡｉ化合物」、2009年2月11日に出願されたPCT公開第WO2009/102427号（出願第PCT/US2009/000852号）、表題「修飾されたＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびそれらの使用」、および2011年2月17日に公開された米国特許公開第US2011-0039914号、表題「修飾されたＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびそれらの使用」の、全ての図面および明細書の全ての部分を含む全内容（配列表またはアミノ酸／ポリヌクレオチド配列を含む）を、参照して組み込む。

Claims (31)

  1. 目の前部に関連する眼の障害を処置するための方法であって、
    目の前部に関連する眼の障害を処置するのに有効な量で、治療用ＲＮＡ分子をそれが必要な対象の目に投与すること
    を含む、前記方法。
  2. 目の前部に関連する眼の障害が、角膜瘢痕、角膜穿孔、角膜ジストロフィー、角膜の損傷および／または外傷（熱傷を含む）、角膜炎症、角膜感染、新生児眼炎、多形性赤斑（スティーブンス・ジョンソン症候群）、眼球乾燥症（ドライアイ症候群）、トラコーマ、オンコセルカ症（河川盲目症）、ハンセン病の角膜合併症、角膜炎、持続性角膜上皮欠損、結膜炎、前部ブドウ膜炎、虹彩角膜内皮症候群、フックスジストロフィー、睫毛乱生症、眼単純ヘルペス、角膜のグラフティングまたは移植（手術に先立つグラフトまたは移植片のex vivo処置を含む）、角膜移植不全および／または拒絶からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 治療用ＲＮＡ分子が、目の前部以外の目の領域に送達される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 治療用ＲＮＡ分子が、目の前部に送達される、請求項１または２に記載の方法。
  5. 治療用ＲＮＡ分子が、硝子体内、網膜下、眼周囲（結膜下、テノン嚢下、眼球後、眼球周囲および後方近強膜）、局所、点眼、角膜インプラント、生分解性インプラント、非生分解性インプラント、眼内挿入、薄膜、持続放出性処方物、ポリマーおよび徐放性ポリマー、イオントフォレーシス、ヒドロゲルコンタクトレンズ、リバース／熱ヒドロゲルおよび生分解性ペレットからなる群から選択される方法により投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 治療用ＲＮＡ分子が、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＭＡＰ４Ｋ４、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＳＤＦ−１、ＩＧＴＡ５、ＡＮＧ２、ＨＩＦ−１α、ｍＴＯＲ、ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＳＰＰ１、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、補体因子３および５、ＰＤＧＦＲａ、ＰＰＩＢ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、Ｉｃａｍ−１、Ｔｉｅ １、Ｔｉｅ ２、ＡＮｇ １、Ａｎｇ ２およびｍｙｃからなる群から選択されるタンパク質またはこれらの組み合わせをコードする遺伝子に対して向けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 治療用ＲＮＡ分子が、ＣＴＧＦをコードする遺伝子に対して向けられる、請求項６に記載の方法。
  8. 治療用ＲＮＡ分子が、ＶＥＧＦをコードする遺伝子に対して向けられる、請求項６に記載の方法。
  9. 治療用ＲＮＡ分子が、Ｍａｐ４Ｋ４をコードする遺伝子に対して向けられる、請求項６に記載の方法。
  10. ２以上の異なるタンパク質をコードする遺伝子に対して向けられる２以上の異なる治療用ＲＮＡ分子が、共に、対象の目に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 同じタンパク質をコードする遺伝子に対して向けられる２以上の異なる治療用ＲＮＡ分子が、共に、対象の目に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 治療用ＲＮＡ分子が、ｓｄ−ｒｘＲＮＡである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ｓｄ−ｒｘＲＮＡが、表３〜８、１０または１１内の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号９４８または配列番号９６４の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
  15. ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖が、配列番号９４７または配列番号９６３の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
  16. ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖が、配列番号９４７を含み、および、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号９４８を含む、請求項１２に記載の方法。
  17. ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１３１７または配列番号１３５７の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
  18. ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号１３１８または配列番号１３５８の配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
  19. ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１３１７を含み、および、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号１３１８を含む、請求項１２に記載の方法。
  20. ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１３５７を含み、および、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号１３５８を含む、請求項１２に記載の方法。
  21. ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１３７９を含み、および、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号１３８０を含む、請求項１２に記載の方法。
  22. ｓｄ−ｒｘＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１３９７を含み、および、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号１３９８を含む、請求項１２に記載の方法。
  23. ｓｄ−ｒｘＲＮＡが、疎水的に修飾されている、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ｓｄ−ｒｘＲＮＡが、１以上の疎水性抱合体に連結されている、請求項２３に記載の方法。
  25. 治療用ＲＮＡ分子がｒｘＲＮＡｏｒｉである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  26. 表１１内の配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む配列に対して向けられる、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
  27. 表１１内の配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
  28. 治療用ＲＮＡ分子が、易感染性であるかおよび／または損傷している目に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  29. 角膜が、易感染性であるかおよび／または損傷している、請求項２８に記載の方法。
  30. 治療用ＲＮＡ分子が、角膜に投与される、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 治療用ＲＮＡ分子が、局所的に投与される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
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