DE3236298A1 - Krebszellen bekaempfende lymphocyten, verfahren zu deren herstellung und anti-krebsmittel, welche die lymphocyten enthalten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Krebszellen bekämpfende Lymphocyten (nachfolgend als "Killerzellen" bezeichnet) und ein Verfahren zu deren Herstellung. Sie betrifft insbesondere Killerzellen, die spezifisch auf Krebszellen mit einem glykoverwandten Antigen, das sich von den Krebszellen ableitet (dieses Antigen wird nachfolgend als "GRA" bezeichnet), reagiert und die Krebszellen zerstört, sowie ein Verfahren zur Herstellung'der Killerzellen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein neues Anti-Krebsmittel, welches die Killerzellen oder GRA als aktiven Bestandteil enthält.

Immunansprechende Effektorzellen, insbesondere T-Lymphocyten, die eine Hauptrolle bei einer zellausgelösten Immunreaktion spielen, verursachen eine Zurückweisung von Pfropfstellen aufgrund eines Fremzellen-Antigens, bewirken jedoch keine merkliche oder nur eine sehr begrenzte Immunoinhibierung gegen Krebszellen. Infolgedessen werden die Krebszellen nicht zerstört, sondern ver-₍ vielfältigen sich in vivo und verursachen schliesslich den Tod des von Krebs befallenen Trägers.

BAD ORIGINAL

25

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Der hierbei vorhandene Mechanismus ist jedoch noch nicht vollständig klar und es sinä verschiedene Untersuchungen angestellt wordne, um nähere Erkenntnisse zu erlangen über die Art der Materialbasis, die in einem solchen System vorkommt. Z.B. werden Zeiloberflächenmarkierungen auf Mäuseleukämiezellen oder Embrionalkarzinomzellen unter Verwendung von Lektinen, wie Dolichos biflorus-Agglutinin (DBA) und Erdm.i.ssagglutinin (PNA) in Diochem. Biophys. Res. Comm. 89 (2) 448-455 (1979), Ibid. 96-(4) 1547-1553 (1980), J. Biochem. 8J3 473-481 (1981) und Cell JN3 183-191, September 1979 beschrieben.

Soweit bekannt ist, sind bisher jedoch nochkeine Versuche unternommen worden, um neue Lymphocyten zur Verfügung zu.r stellen, die Krebszellen spezifisch bekämpfen können, und die Anti-Krebsmittel darstellen unter Anwendung einer Immunansprechung der Lymphocyten.

20 35

Gründliche Untersuchungen über die Immunansprechung des Trägers gegenüber Krebszellen und deren Anwendung zur Behandlung von Krebs haben nun ergeben, dass - in einem krebszellenspezifischen Antigen, das nicht in differentierten Normalzellen zu finden ist, GRA vorhanden ist, das als Immunogen für den Träger wirkt und eine sehr hohe Immunogenität aufweist, das eine Immunreaktion, die spezifisch auf Krebszellen ist, verursacht. Es wurde weiterhin festgestellt, dass dann, wenn man GRA zum Sensibilisieren von Lymphocyten verwendet, man Killerzellen erhält, die spezifisch auf GRA-enthaltende Krebszellen wirken und dass man bei Verabreichung der Killerzellen an einen Träger diese GRA erkennen und auf GRA-enthaltende Krebszellen einwirken, diese zerstören und dass man auf diese Weise eine sehr gute Wirkung bei der Behandlung und Vorbeugung von Krebs erzielen kann.

Die Erfindung betrifft gemäss einer Ausführungsform Killerzellen.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform betrifft, die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Killerzellen.
25

Gemäss einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Anti-Krebsmittel, enthaltend Killerzellen oder GRA als aktiven Bestandteil.

BAD ORfGINAL

Fig. 1 ist eine Mikrofotografie von Daudi-Krebszellen,

Fig. 2 ist eine Mikrofotografie, welche die
5 Bildung von Belägen von GRA-1-K-T auf

Krebszellen gemäss Fig. 1 zeigt,

Fig. 3 ist eine Mikrofotografie von KATO-III-

Zellen,
10

Fig. 4 ist eine Mikrofotografie, die die Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T auf
Krebszellen gemäss Fig. 3 zeigt,

Fig. 5 ist eine Mikrofotografie von BT-I-

Krebszellen,

Fig. 6 ist eine Mikrofotografie, welche die

Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T
20 auf den Krebszellen von Fig. 5 zeigt,

Fig. 7 ist eine Mikrofotografie von MKN-45-

Krebszellen,

Fig. 8 ist eine Mikrofotografie, welche die

Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T auf Krebszellen gemäss Fig. 7 zeigt,

Fig. 9 ist eine Mikrofotografie von MOLT-Krebszellen,

Fig. 10 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T auf Krebszellen gemäss Fig. 9 zeigt,

Fig. 11 ist eine Mikrofotografie von BT-1, das

mit einer Mischung von unsensibilisierten humanen peripheren Blutlymphocyfen behandelt wurde,

Fig. 12+13 sind jeweils Mikrofotografien von Krebszellengewebe einer krebsigen Maus, der GRA-M-Ii-KrTAerabreicht wurde,

ist eine Fotografie und zeigt einen Krebszustand bei einer krebsigen Mäusegruppe, der GRA-M-1 verabreicht wurde,

ist eine Fotografie und zeigt, den Krebszustand bei einer krebsigen Mäusegruppe, der kein GRA-M-T verabreicht wurde.

Fig. 16 ist eine Mikrofotografie und zeigt Krebszellengewebe einer krebsigen Mäusegruppe, der kein GRA-M-1 verabreicht wurde,

Fig. 17 ist eine Mikrofotografie von Krebszellengewebe einer Gruppe, die mit gRA-M-1 behandelt wurde,
30

	Fig.	14
15
	Fig.	15
20

BAD ORIGiNiAL

Fig. 18 zeigt ein SDS-Gel-Elektrophorese-Diagramm von GRA unter Verwendung von Protein-Färbung nach der C.B.B.-Methode,

Fig. 19 bis 21 zeigen SDS-GeI.Elektrophorese-Diagramme

unter Verwendung von Zuckerfärbungen mittels der PAS-Methode.

Fig. 22 ist eine schematische Darstellung der Er-'i 0 gebnisse vom SDS-Gel-Elektrophoreses-

Diagramm von GRA unter Verwendung der Proteinfärbung mittels der C.B.B.-Methode.

Fig. 23 ist eine grafische Darstellung, welche die Tumorwachstumsrate bei C3H/HE/6 Mäusen,

denen X5563 Immunmäuse-Milzzellen und Y5563-Zellen transplantiert worden waren.

Die Killerzellen gemäss der Erfindung kann man beispielsweise herstellen gemäss einem Verfahren, bei dem GRA zum Sensibilisieren von Lymphocyten verwendet werd.

4H

- ys -

Das bei dem obigen Verfahren verwendete GRA erhält man aus GRA enthaltenden Krebszellen von Menschen oder Tieren, z.B. von kultivieren Krebszellen, transplantierten Krebszellen, spontan auftretenden Krebszellen, durch chemische Substanzen oder durch Viren induzierten Krebszellen oder Krebszellen, die man aus Geweben - herausoperiert hat unter Anwendung der folgenden Verfahren .

Zellmembrankomponenten werden von Krebszellen der vorerwähnten Art abgetrennt und mit einem Lektin behandelt, welches sich spezifisch mit terminaler Galaktose oder endständigem N-Acetylgalactosamirr, "wobei GRA mit dem Lektin verbunden leicht abgetrennt werden kann, bindet (s. J.B.C. ,250,

8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm., b_£, 144 (1975); Z. Immunität s for sch., 1_3£, 423-433 (1966); Br. J. Exp. Pathol., 2]_, 228-236 (1946); Proc. Nath. Acad. Sei. USA, 75, Nr. 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry, 1_3, 196-204 (1974); und Carbohydrate Research, 5J_, 107-118 (1976)), wodurch GRA sich mit dem Lektin vereint und leicht abgetrennt werden kann.

Die Trennung der Krebszellenmembrankomponenten kann man auf einfache bekannte Weise erzielen, z.B. durch eine Homogenisierungsmethode und eine Solubilisierungsmethode unter Verwendung eines Auflösungsmittels. Vorteilhaft ist es, eine Methode anzuwenden, bei welcher Krebszellen in physiologischer Kochsalzlösung oder in einem geeigneten Puffer homogenisiert werden, ein Teil des Niederschlags durch beispielsweise Zentrifugenabtrennung gesammelt wird und in physiologischer Kochsalzlösung oder einem Puffer mittels eines Lösungsmittels

BAD ORIGiNA!

ΑΌ

gelöst wird, worauf man den überstehenden Teil dann beispielsweise durch Zentrifugenabscheidung abtrennt. Als Auflösungsmittel kann man beispielsweise oberflächenaktive Mittel, wie sie allgemein bekannt sind, um Zellmembranen aufzulösen, verwenden, z.B. nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.), NP-40 (hergestellt von Shell Co., Ltd.), Digitonin und Harnstoff,oder anionische oberflächenaktive Mittel, z.B. Natriumdodecylsulfonat (SDS).

Aus den so erhaltenen Zellmembrankomponenten kann man GRA, das in der Lage ist, sich mit Lektin unter Anwendung üblicher chemischer oder biochemischer Verfah-

15. ren und indem man von den Eigenschaften des Lektins Gebrauch macht, abtrennen. Beispiele für solche Verfahren sind eine Affinitätschromatografie, bei der man einen ein Lektin enthaltenden Säulenträger verwendet, eine Immunausfallungsmethode, unter Verwendung von GRA-Antikörper oder dergleichen, eine Dialysemethode, eine Gelfiltrationsmethode, eine Elektrophoresemethode oder eine physikalische Ausfällung unter Verwendung eines Zuckerprotein ausfällenden Mittels, z.B. Polyethylenglykol und Aceton, oder eine Kombination- solcher Verfahren. Besonders bevorzugt ist die Affinitätschromatografie unter Verwendung einer Säule, die ein Lektin enthält, wobei man den Säulenträger leicht herstellen kann, indem man Lectin auf einem unlöslichen Träger immobilisiert. Die Immobilisierung von Lektin auf.einem unlöslichen Träger kann man in bekannter Weise, wie sie für die Immobilisierung von Biosubstanzen angewendet

AIo

wird, durchführen. Von diesen Methoden wendet man bevorzugt die Cyanobromidaktivierungs-Polysaccharid-Methode und eine Inunobilisierungsmethode unter Verwendung von N-Hydroxysuccimidester an. Die Cyanobfomidaktivierungs-Polysaccharid-Methode ist eine Methode,

bei der ein unlöslicher Träger mit Cyanobromid behan- - delt wird und das so erhaltene aktivierte Produkt wird dann unter milden Bedingungen einer Kupplungsreaktion mit einem Lektin unterworfen, wobei das Lektin immobilisiert wird. Bei.der Behandlung des unlöslichen Trägers mit Cyanbromid wendet man beispielsweise basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid und Natriumhydrogenkarbonat an_r um den pH auf 7,5 bis 12 einzustellen und dann behandelt man den Träger in einem Lö-

15 sungsmittel, wie Wasser, Acetonitril oder einem

bei pH 7,5 bis 12 gehaltenen Puffer_r z.B. einem 0,1M Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH etwa 8,7) und 0,01M Phosphatpuffer (pH etwa 7,7) bei Raumtemperatur während etwa 1 bis 12 Minuten. Im allgemeinen wendet man vorzugsweise eine dem unlöslichen Träger äquivalente Menge an Cyanbromid an.

Jeder bekannte unlösliche Träger, der gegenüber allen · Biosubstanzen eine niedrige nichtspezifische Adsorption zeigt, der eine hohe Porosität hat und der eine funktionelle Gruppe aufweist, die unter milden Bedingungen in der Lage ist, Biosubstanzen zu immobilisieren und der chemisch und physikalisch ausreichend stabil ist, kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Verwendbare unlösliche Träger sind beispielsweise Träger, die aus Zellulose hergestellt wurden, z.B.

BAD ORIGINAL

Aminoethylzellulose, Carboxymethylzellulose, Bromoacetylzellulose und p-Anilinozellulose, oder ein Träger aus vernetztem Dextran, z.B. Sephadex und CM-Sephadex (hergestellt von Farmacia Corp.) und ein Träger aus Agarose, z.B. Sepharose 2B, Sepharose 4B und Sepharose 6B (hergestellt von Farmacia Corp.).

Bei der Kupplungsreaktion des wie oben erhaltenen, mit Cyanbromid aktivierten Trägers wird der mit Cyanbromid aktivierte Träger in einer Menge angewendet, die 30 bis 80 mal der des Lektins entspricht und man führt die Umsetzung in einem geeigneten Lösungsmittel, wie einer 0,1 Mol/l wässrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat (enthaltend 0,5 Mol/l Natriumchlorid; pH 8,4) bei einer Temperatur zwischen 0 und 40°C und vorzugsweise 2 und 8°C während einer Zeit von etwa 10 bis 20 Stunden durch. Auf diese Weise erhält man einen Lektin enthaltenden Träger für eine Affinitätschromatografie.

20 Bei der Chromatografie unter Verwendung des Lektin

enthaltenden, wie oben beschrieben hergestellten Trägers, kombiniert sich das gewünschte GRA mit dem auf dem Träger enthaltenen Lektin und wird in der Säule festgehalten. Anschliessend werden Substanzen, die zu einer Kombination in der Lage sind, z.B. mit einem Lektin, durch die Säule laufen gelassen, wobei einer Austauschreaktion stattfindet, oder man führt alternativ eine Adsorptionsabtrennung (mit einer Eluierlösung) durch, z.B. mit einem hochkonzentrierten Salz, einer wässrigen Lösung von Kaläumthiocyanat und einem Nitratpuffer, um das gewünschte GRA abzutrennen und zu gewinnen.

Bei der Austauschreaktion sind Substanzen, die in der Lage sind, sich mit einem Lektin zu verbinden, wenn ein Träger für die Affinitätschromatografie, enthaltend ein galaktosebindendes Lektin, verwendet wird, beispielsweise solche, die sich mit einem endständigen galaktoseverbindendem Lektin kombinieren, z.B. Galaktose, Disaccharide,enthaltend endständige Galaktose,und Oligosaccharide,enthaltend eine endständige Galaktose. Beispiele für Substanzen, die in der Lage sind, sich mit einem Lektin zu verbinden, wenn als Träger für die Affinitätschromatografie ein N-Acetylgalaktosamin-bindendes Lektin verwendet wird, sind solche, die sich mit einem endständigen N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektin verbinden könnten, z.B. N-Acetylgalaktosamin, Disaccharide, enthaltend ein endständiges N-Acetylgalaktosamin und Oligosaccharide, enthaltend ein endständiges N-Acetylgalaktosamin.

Das so erhaltene GRA enthält Glykoprotein, enthaltend eine Galaktose und/oder N-Acetylgalaktosamin-Endgruppe, Glykolipide und/oder Saccharide.

Das so hergestellte GRA kann gewünschtenfalls lyophiliisert werden und auch in üblicher Weise unter Anwendung üblicher Trennmethoden gereinigt werden. Beispielsweise kann man solehe GRA-Zubereitungen, die mit einem galaktosebindenden lektin isoliert wurden, einer Trennmethode unterwerfen, unter Anwendung eines N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektins und GRA, das mit einem N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektin dann isoliert wurde, kann nach einer Trennmethode behandelt werden, unter Verwendung eines galaktosebindenden Lektins.

-BAD ORIGINAL

Die"hier verwendeten Lymphocyten sind nicht kritisch und alle Lymphocyten von normalen oder krebsigen Menschen oder Tieren können verwendet werden. Beispiele hierfür sind Lymphocyten, die man von peripherem Blut, Knochenmark, Lymphknoten, aus der Milz, den Mandeln oder der Thymusdrüse erhält. Diese Lymphocyten werden durch physikalische oder chemische Methoden, durch eine Oberflächenmembranmethode oder dergleichen isoliert.

Die Sensibilisierung von Lymphocyten mit GRA erfolgt, indem man die Lymphocyten auf einem Kulturmedium, enthaltend GRA, während einer Zeit von 1 bis 10 Tagen, vorzugsweise 2 bis 7 Tagen, kultiviert.

Als Kulturmedium für die Verwendung zum Sensibilisieren der Lymphocyten können verschiedene übliche Nährmedien verwendet werden, die üblicherweise für solche Zellkultivierungen verwendet werden. Bevorzugte Beispiele schliessen ein RMPI 1640-Medium_r eine Eagle-MEM-Kultur, etc., dem Humanserum, Kalbsfötusserum (FCS), Kalbsserum, Pferdeserum oder dergleichen zugegeben wurde. Die Menge des zur Kultur gegebenen GRA beträgt im allgemeinen 1 bis 1.000 ng/ml und vorzugsweise 1 bis

25

500 ng/ml, berechnet als Menge Zucker.pro 1 χ 10 /ml Lymphocyten.

Die Kultivierung wird in üblicher Weise, z.B. bei einem pH von 7,2 und bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt.

Die so hergestellten Killerzellen gemäss der Erfindung sind im wesentlichen normale Lymphocyten und haben eine GRA-spezifische Zellenbekämpfungsaktivität. Beispielsweise hat GRA-I-KT, eine der erfindungsgemässen Killerzellen, Eigenschaften die bei humanen peripheren Blut-T-Zellen vorkommen und zeigt eine zellbekämpfende Aktivität, die spezifisch gegenüber Krebszellen, enthaltend GRA, ist, wie in den später folgenden Beispielen gezeigt wird.

Typische Beispiele für die neuen Killerzellen gemäss der Erfindung sind GRA-1-KZ und -GRA-M-1_r die in den nachfolgend beschriebenen Beispielen hergestellt werden. Diese Killerzellen sind bei der Anmelderin erhältlich und eine Probe von GRA-i-rKIVZellen ist bei ATCC am 27. Septeirfoer 1982 hinterlegt worden und hat die Nummer ATCC CRL 8175 erhalten.

Die erfindungsgemässen Killerzellen kann man unlimitiert vervielfältigen,unter Verwendung des vorerwähnten Kulturmediums, enthaltend einen T-Zellen-Wachstumsfaktor (TCGF, IL-2 ). in diesem Falle kann man eine selektive Kultivierung von Klonen der Killerzellen mittels einer üblichen ültraverdünnungsmethode durchführen. Die Killerzellen können stabil über lange Zeiträume in

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«Μ

beispielsweise flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.

Das GRA kann einzeln als aktiver Bestandteil eingesetzt werden oder es kann zusätzlich in Kombination

mit anderen bakteriziden Mitteln und krebsinhibierenden Mittel verwendet werden. Krebsinhibierende Mittel, die das erfindungsgemässe GRA als aktiven Bestandteil enthalten, können in jeder Form vorliegen, unter der Voraussetzung, dass sie GRA in wirksamen Mengen enthalten-Im allgemeinen wird das Mittel intravenös, subkutan, intfadermal oder intramuskulär in Form einer Lösung, einer Suspension oder als Emulsion verwendet. Man kann es auch als Trockenprodukt herstellen und dann unmittelbar vor der Verwendung durch Zugabe eines geeigneten Trägers in eine Flüssigkeit überführen. Dieses flüssige Mittel kann ein Suspensionsmittel, z.B. Methylzellulose, ein Emulgiermittel, z.B. Lecithin, Konservierungsmittel, z.B. Methyl-p-hydroxybenzoat, Stabilisierungsmittel und dergleichen enthalten, soweit diese keine

25 nachteilige Wirkung auf die Immunisierungsfunktion

bei Menschen oder Tieren hervorrufen. Auch Puffer können enthalten sein.

Geeignete wässrige Träger sind beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung und ein geeigneter nichtwässriger Träger kann beispielsweise ein Pflanzenöl,

Xi

-2T-

z.B. Sesamöl,. ein Mineralöl, z.B. Paraffin, oder ein tierisches öl, z.B. Squallene, oder auch Propylenglykol sein. Zur Erhöhung der immunologischen Wirkung kann man ein geeignetes Adjuvants inkorporieren. Geeignete Adjuvantien sind beispielsweise Freund's

Complete Adjuvants, Saponin bei Tieren und Aluminium- - hydroxid beim Menschen.

Das erfindungsgemässe Anti-Krebsmittel kann einmal oder wiederholt über längere Zeiträume einem Krebspatienten zur Behandlung von Krebs verabreicht werden oder man kann es jemandem verabreichen, der krebsanfällig ist, um dadurch dem Krebs vorzubeugen.

Da LD₅₀ (Maus, intraperitoneal) von GRA wenigstens

500 mg/kg, berechnet als Zuckermenge, beträgt, zeigt das Anti-Krebsmittel gemäss der Erfindung eine niedrige Toxizität und man kann es deshalb innerhalb eines weiten Dosierungsbereiches verabreichen. Obwohl die Konzentration von GRA in dem Anti-Krebsmittel gemäss der.Erfindung nicht kritisch ist, wird doch bevorzugt, es in einer Menge vonO„001 bis 100 μg/ml, berechnet als Menge des Zuckers, zu verwenden. Hinsichtlich der Dosierung des.Anti-Krebsmittels wird im allgemeinen bevorzugt, das Mittel in einer Menge von 0,001 bis 1.000 μg/kg/Tag auf einmal oder in verschiedenen Anteilen zu verabreichen, wobei jedoch diese Dosierung von dem Krankheitsgrad, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten abhängt.

Das so hergestellte Anti-Krebsmittel, welches die

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Killerzellen als aktiven Bestandteil enthält, wird vorzugsweise als injizierbare Lösung in Kombination mit Trägern, die bei der Herstellung von Blutmedizinen Anwendung finden, verwendet. Die hier verwendeten Tr äger sind nicht kritisch, jedoch bevorzugt man Träger, die die gleiche Tonizität wie Blut aufweisen. Besonders wird physiologische Kochsalzlösung bevorzugt. Bei der Herstellung des Mittels wäscht man vorzugsweise die . Killerzellen ausreichend mit einer physiologischen Koch-Salzlösung oder dergleichen, um das vorerwähnte Kulturmedium zu entfernen und anschliessend wird es dann in einem Träger aufgenommen.

Die Konzentration an Killerzellen in dem Mittel ist

nicht besonders begrenzt, sie beträgt jedoch vorzugs-

5 9
weise zwischen 10 und 10 pro Milliliter. Verabreicht

man die Killerzellen intraperitoneal in einer Dosis

von 10 pro Maus, so stellt man keine Toxizität fest. Zwar hängt die Dosis des erfindungsgemässen Anti-Krebsmittels von dem Grad der Krankheit, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten ab, jedoch wird im allgemeinen das Mittel vorzugsweise in einer Dosis von 10 bis

1 2

10 /kg/Tag auf einmal oder in verschiedenen Anteilen

verabreicht. 25

Die folgenden Beispiele, Referenzbeispiele, Versuchsbeispiele und Vergleichsbeispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Referenzbeispiel 1

5 (D ~^A Herstellung von FITC-markiertem Lektin

(PNA-FITC)

- 10 rag Erdnusslektin (PNA), hergestellt von EY Co.) wurden in 2 ml eines O,01M Phosphatpuffers, enthaltend

10 0,85 % NaCl (pH 7,2) gelöst. In 1 ml eines 0,5M

Hydrogenkarbonatpuffers (pH 9,0) wurden 2 mg FITC (hergestellt von Sigma Laboratories Ine.) gelöst und ein 0,5 ml Anteil der gebildeten Lösung wurde zu dem zuvor hergestellten PNA-Puffer gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend über Sephadex G25 (10 mm χ 300 mm, hergestellt von Farmacia Corp.) getrennt. Das Anfangspeak wurde gesammelt. FITC/PNA-Verhältnis: 1,0.

20 (D-B Zubereitung von FITC-markiertem Lektin

(DBA-FITC)

In gleicher Weise wie in (D-A oben erhielt man DBA-FITC unter Verwendung von DBA, hergestellt von EY Co.. EITC/DBA-Verhältnis =0,9.

(D-C Sojabohnenagglutinin-FITC(TIFT-SBA) ist von Ey Co. erhältlich.
FITC/SBA-Verhältnis =1,4. 30

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(2) Lokalität von -GRA auf verschiedenen Krebszellen

(a) Human kultivierte Krebszellen (1 χ 10 ) wurden dreimal . mit einem 0,05 M tris-Salzsäurepuffer/ enthaltend 0,85 % NaCl (pH 7,2) durch Zentrifugenverfahren gereinigt und dann wurden 100 μΐ PNA-FITC, DBA-FITC oder SBA-FITC, (200 μg/ml), hergestellt und gemäss (1), zugegeben. Die Mischung wurde 3 0 Minuten zur Umsetzung bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung derUmsetzung wrude das Reaktionsgemisch dreimal mit einem 0,01M Phosphatpuffer, enthaltend 0,85 % NaCl (pH 7,2) gewaschen und anschliessend wurden die Zellen auf eine Glasplatte gelegt und unter

15 einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Krebszellen sind alle bekannt und wurden von "First Pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University", bezogen

	- 2-5 - at	Krebszellen	positives Ver hältnis von GRA (%)	DBA SBA
	Tabelle 1		PNA	1,4
	(Burkitt Lymphoma)	98,3	5,2
	(Burkitt Lymphoma)	93,1	0
Raji	(Burkitt Lymphma)	50,1	6,7
Dau j i.	(T-Zellen Lymphoma	44,3	4,8
BT-1	(T-Zellen Leukemia)	0,6	5,3
P-I 2	(B-Zellen Lymphoma)	19,2	10,0
MOLT	(IgD-Myeloma)	0,6	2,0
Fujimaki	(Lungenkrebs,squamös)	70,4	0,4
ODA	(Lungenkrebs,sguamös)	78,4	0
QG-5 6	(Lungenkrebs,adenocarcinom)	77,1	0
PC-1	(Lungenkrebs, kleine Zellen)	68,0	0
PC-3	(Lungenkrebs, grosse Zellen)	17,0	0,1
QG-90	.(Magenkrebs, por.)	63,7	0
PC-13	(Magenkregs sig.)	57,3	40,3
MK-2	(Magenkrebs por.)	1,0	0,4
KATO-III	(Magenkrebs, adsq.)	4,6	0,1
MKN-45	(Magenkrebs,tubl)	0,4	0
MKN-1	(Magenkrebs,tubl)	0,5 '	0
MKN-28	(Harnblasenkrebs ca.)	37,4	21,4
MKN-74	(Harnblasenkrebs ca.)	4,5	0
MGH-Ü1	(Harnblasenkrebs ca.)	14,6	.1,0
KU-2	(Harnblasenkrebs ca.)	13,1	0
T-24	(Nierenkrebs)	23,9	0,6
NBT-2 '	(Nierenkrebs)	3,3	0
NRC-12	(Eierstockkrebs)	80,0	1,7
KU-1	(Neuroblas toma)	20,9	0,5
Kuramochi	(Neuroblastoma)	3,6	0
NB-1	(Neuroblastoma)	4,1	1,0
YT-nu	(Neuroblastoma)	2,0	0
TGW-nu-1	(Neuroblastoma)	0,5
TGW-nu-11
GOTO

BAD ORIGINAL

96,9	12	,3
44,6	0
14,6	3	,1
5,4	0
5,7	1	,7
92,0	0

- 26 -

a*

ITO (Embryonalcarcinoma)

NEC-8 (Embryonalcarcinoma)

SCH (Choriacarbinoma, Magen)

GCH (Chriocarcinoma, Uterus)

5 YN-1 (Rhabdomyosarcoma)

Maus X 5563 (Plasmacytoma) 92,0 0 90,7

Maus MH134 (Hepatoma) 18,6 0 6,4

(b) Das maligne Gewebe von Krebszellen wurde durch ein Sieb aus. rostfreiem Stahl (150 mesh) gegeben, unter

Erhalt einer Einzelzellensuspension. Nach zweimaligem Waschen mit 0,01M-HCl-Puffer (pH 7,4) , enthaltend 2mMol CaCl₂, 2mMol MgCl₂ und 0,85% NaCl wurden 5x1O⁵ Zellen in 100 μΐ Puffer resuspendiert. 100 μΐ FITC-PNA oder FITC-DBA (200 ng/ml) wurden zu der Zellsuspension gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit kaltem PBS wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
20

Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Das maligne Gewebe von Krebspatienten wurde von der Kansai Medical ■Universität erhalten.

Tabelle 2

GRA

Nr. Krebspatienten-Gewebe

T	Magenkrebs
2	Magenkrebs
3	Magenkrebs
4	Magenkrebs
5	Magenkrebs
6	Magenkrebs
7	Brustkrebs
8	Brustkrebs
9	Brustkrebs
10	Brustkrebs
11	Dickdarmkrebs
12	Dickdarmkrebs
13	Esophaguskrebs
14	Hepatoma
'. Änm	p.rkuncf: " + " beze

:-Anmerkung: " + " bezeichnet das GRA auf der Zelloberfläche;

"-" bedeutet, dass GRA auf der Zelloberfläche nicht vorkommt.

Referenzbeispiel 2
25

(1) -A Herstellung von immobilisiertem Lektin • (PNA-Sepharose)

3g CNBr-aktivierte Sepharose 4B (hergestellt von Farmacia Corp.) wurden gründlich mit 1 mmol HCl gewaschen und ■ in 200 ml 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) suspendiert. Dazu wurden 5 ml eines p,01M Phosphatpuffers ι (pH 8,5), enthaltend 20 mg PNA, gegeben und dann erfolgte die Umsetzung bei 25°C während 2 stunden, wobei man einige Male rührte unter Erhalt von PNA-Sepharose.

BAD ORfGINAL

(I)-B In gleicher Weise wie bei (D-A oben, mit
der Ausnahme, dass DBA anstelle von PNA verwendet wurde, erhielt man DBA-Sepharose..

(2) Herstellung von GRA

(a) BT-1 (Burkitt Lymphoma)-Zellen (1,3 χ 10⁸) wurden 3 mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann wurden 30 ml eines 0,01M tris-Salzsäurepuffers (pH 7,4), enthaltend 2 % Triton X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl, und 2 mmol MgCl₂ zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 4°C gerührt und dann einer ültrazentrifugenabscheidung mit einer Rate

15 von 100.000 χ g unterworfen. Von 28 ml der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde ein 14 ml-Anteil durch eine Säule (Durchmesser 0_r5, Länge 1 cm) für die Affinitätschromatografie geschickt, wobei die Säule mit PNA-Agaroseperlen (hergestellt von Maruzen Co., Ltd.),

20 aie zuvor mit einem tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4),
enthaltend 0,1 % Triton X-100, 0,85 % NaCl,. 2 mmol
CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂ ins Gleichgewicht gebracht worden waren, geschickt. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer, wie er oben verwendet wurde, wurde mit

²⁵ einem 0_f01M tris-Salsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend
0«1M Laktose, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂, 2 mmol MgCl₂
und P,1 % Triton X-100 eluiert. Der so eluierte Anteil

V ν, W

wurde mit einer 0,1M tris-Salzsäurepufferlösung, enthaltend O₁-85 % NaCl, 2 mmol MgCl₂ und 2 mmol CaCl₂ 48 Stunden dialysiert, wobei man 17 mg einer GRA-Lösung erhielt. In dieser GRA-Lösung wurde die Menge an Protein und die Menge an Zucker nach der Folin-Lowry-Methode bzw. nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode - bestimmt j diese Mengen betrugen 644 ;ig bzw.. 120 μ^. Dieses Produkt wird nachfolgend als "GRA-1" bezeichnet.

1 0 (b) C3/€E-Mäuse-Brustkrebs-^I>!MT-^zei:Len (1 x 10 ) wurden 3~mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann wurden 30 ml einer 0,01M tris-Salzsäurepufferlösung (pH I₁ 4), enthaltend 2 % Triton X-100, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂, zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 4°C gerührt. Anschliessend wurde die Mischung einer uitrazentrifugenabscheidung in einer Rate von 100.000 χ g während 2 Stunden unterworfen, und die überstehende Flüssigkeit wurde über Nacht mit einem 0,1M tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,85 % NaCl₁- 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂J dialysiert. Die so dialysierte Flüssigkeit wurde auf 3 ml konzentriert und ein 1 ml-Anteil wurde durch eine Säule (Durchmesser 0,5, Länge 2 cm), die mit der gleichen PNA-Sepharose,- wie zuvor verwendet, gefüllt worden war und die mit einem tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,05 % Triton X-100, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂, ins Gleichgewicht gebracht worden war, einer Affinitätschromatografie unterworfen. Nachdem man gründlich mit der gleichen Pufferlösung wie zuvor gewaschen hatte, eluierte man mit

BAD ORIGINAL

einer O_f1M tris-Salzsäurepufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,1M Laktose, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂, 2 mmol MgCl₂ und 0,005 % Triton X-100, und der so eluierte Anteil wurde dann 48 Stunden dialysiert mit einem 0,01M tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂. Man erhielt 2 ml einer GRA-Lösung. In dieser GRA-Lösung betrug der Proteingehalt 156 ug und der Zuckergehalt 94 μg. Diese Lösung wird nachfolgend als "GRA-M-1" bezeichnet. 10

(c) Annähernd 120 g (Nassgewicht) KATO-III wurde in einem Waring-Mischer in 100 ml PBS homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren mit 100.000 g während einer Stunde wurden die Pellets in 100 ml einer 2% Triton X-100-Lösung in 0,01M Tris-HCl-Puffer (pH 7,6),enthaltend 0,15M NaCl gelöst. Die bei der Zentrifugierung mit 100.000 g während 1 h erhaltene überstehende Lösung wurde auf eine Säule von PNA-Sepharose 4B (0,8x15 cm) zugegeben, die zuvor mit 0,015 % Trito X-100 in 0,01M Tris-HCl (pH 7,6), enthaltend 0,15MUaCl ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgetragen. Nach dem Waschen mit 50 ml des Puffers wurde GRA mit dem 0,1M Laktose enthaltenden Puffer eluiert. Das eluierte GRA. wurde gegen 0,85 % NaCl dialysiert, konzentriert mittels Sephadex Pharmacia Co. und bei

25 -20⁰C vor der Anwendung gelagert.

Die Mengen an Protein und Zucker, in gleicher Weise bestimmt wie bei (a) oben, betrugen 2,0 mg bzw. 0,8 mg. Dieses Produkt wird nachfolgend als "GRA-2" bezeichnet. 30

(d) Wie in (c) wurden die folgenden GRA-Proben erhalten:

- -31 -

	Material	Tabelle 3	GRA	Zuckerge halt (mg)
GRA-	Quelle		Proteingehalt (mg)	0,09
Probe	BT-a	Menge (g)	0,5
GRA-3	Exzidierter	33		0,5
GRA-4	Brustkrebs		0,25	0,38
	QG-4 6	5	0,6	0,54
GRA-5	QG-90	24	1,0	0,45
GRA-6	Raji	26	0,78	28,4
GRA-7	MMT	29	11,3	0,07
GRA-M-2	LLC	200	0,06	0,35
GRA-M-3	MH-135	14,4	0,65	'0,23
GRA-M-4	X-5563	85	0,56
GRA-M-5	25

(e) In gleicher Weise wie bei (c), jedoch unter Verwendung von NKN-45 (etwa 29g) anstelle von Kato-III und unter Verwendung vn DBA-Sepharose, erhalten gemäss (1)-B, anstelle von PNA-Sepharose 4B und unter Eluieren mit N-Acetylgalaktosamin erhielt man eine GRA-Zubereitung mit einem Proteingehalt von 0,03 mg und einem Zuckergehalt von 0,01 mg. Dies wird

25 nachfolgend als GRA-8 bezeichnet.

(f) GRA-3, hergestllt gemäss (d) (5 ml) wurde auf eine DBA-Sepharose-Säule gegeben und mit Tris-HCl-Puffer (0,015 % Triton X-100, 2 mMol MgCl₃, CaCl₃, 0,85 % NaCl) eluiert,

wobei man 4 ml-Fraktionen Nr. 1-1:2 erhielt. Fraktionen 1-3 werden als "GRA-3-A" bezeichnet und Fraktionen 4-12 als "GRA-3-B". Dann wurde die Säule mit dem gleichen Puffer eluiert, der jedoch 0,1M N-Acetylgalktosamin enthielt und wobei man Fraktionen erhielt die mit "GRA-ß-C" bezeichnet

35 ' werden.

BAD ORIGINAL

(g) SDS-Gelelektrophorese

Jede ·. derobigen GRA-Zubereitungen wurde einer Elektrophorese unterworfen, wobei die Methode von Fairbanks et al: Biochemistry, Band 10, S. 2606, 1971, angewendet wurde.

Die Ergebnisse werden in den Fig. 18 bis 22 gezeigt.

In den Fig. 18-19 bedeuten die Zahlen 1 bis 5 folgendes: 1 ... Standard; 2 . . . GRa-M-3; 3... GRA-7; 4...GRA-1; und 5 ... GRA-2.

In Fig. 20 bedeuten die Zahlen 1 bis 4 folgendes: !...Standard; 2...GRA-M-2; 3...GRA-6; 4...GRA-5. 15

In Fig. 21 bedeuten die Zahlen 1 bis 3 folgendes: 1...GRA-M-4; 2...GRA-M-5; 3...Standard:

In Fig. 22 bedeuten die Zahlen 1 bis 4 folgendes: 20 1...GRA-3; 2...GRA-3-A; 3...GRA-3-B, 4...GRA-3-C.

Fig. 18 zeigt den Zustand von GRA nach einer Proteinanfärbung gemäss C.B.B. (Fairbanks et al: Biochemistry, Band 10, S. 2606, 1971).
25

Fig. 19 bis 21 zeigen den Zustand von GRA nach Behandlung mit einer Zuckerfarbreaktion gemäss PAS-Methode (R.M. Zacharius et al: Anal. Biochem. Band 30, S. 128 (19.62)).

Fig. 22 ist eine schematische Darstellung der Ergebnisse von Anfärbungen gemäss der vorerwähnten C.B.B.-Methode.

Als Standard wurden die nachfolgenden, von Biorad Lab. Calif.USA erhaltenen Substanzen verwendet: 35

200 K Dalton; Myosin

116 " ; ß-GälactosIdase 92,5 " ; Phosphorylase 66,2 " ;, BSA

45 " ; Ovalbümin

21,5 β ; Sojabohnentrypsin-Inhibitor

10 Referenzbeispiel 3

(a) Die Milz von japanischen Affen (erhalten von der. Japan Plymates Co., Ltd.) wurde herausoperiert und 2 mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium (hergestellt von der Flow Laboratory Co., Ltd.) gewaschen. Die Zellen wurden unter Verwendung von Mesh (hergestellt von Millipore Inc., 150 mesh) filtriert und einem spezifischen Schwerkraftzentrifugenverfahren (spezifische Schwerkraft

1,076) unterworfen, wobei man 2 1 von 2 χ 10 /ml Lymphocyten erhielt. Die so erhaltenen Lymphocyten wurden 3 mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium gewaschen und die Anzahl der Lymphocyten wurde auf 5 χ 10^/ml unter Verwendung des gleichen Mediums wie zuvor, enthaltend 10 % FCS, eingestellt. Dann liess man sie in einer Kohlendioxid-Fermentationsvorrichtung 1 Stunde bei 37⁰C stehen. Die überstehenden Lymphocyten wurden gewonnen

BAD ORfGINAl

und die Anzahl der Lynphocyten wurde unter Verwendung des gleichen Kulturmediums wie vorher angegeben, enthaltend 1 % FCS auf 1 χ 10 /ml eingestellt. Anschliessend wurden 1 μg/ml Indomethacin (hergestellt von Sigma Laboratories Inc.) und 0,2 % PHA-P (hergestellt von Difco Co.) zugegeben und dann wurde die Kultivierung in einer Kohlendioxidgas-Fermentationsvorrichtung 48 Stunden bei 37⁰C durchgeführt. Nachdem man 10 Minuten eine Zentrifugenabscheidung (3.000 UpM) durchgeführt hatte,- wurde die gebildete überstehende Flüssigkeit gewonnen und sterilisiert,- indem man sie durch ein Millipore-Filter (hergestellt von der Millipore Inc., 0,2 μπι) filtrierte und wobei man 2 1 TCGF erhielt.

(b) Als Quelle von TCGF wurde die überstehende Flüssigkeit von mischkultivierten periphelren Blutlymphocyten von 10 gesunden Spendern verwendet. Nicht zusammenhängende Lymphocyten, hergestellt von CF. (Conray. Ficol (Japan Immunoresearch Co.)) abgetrennten Lymphcyten durch Adsorption auf Plastikoberflächen bei 37°C während 1 h wurden in RPMI 1640-Medium, enthaltend 1 % FCS (1,5x10⁶Zellen/ml) suspndiert und mit 0,2 %_ PHA-P, INdomethacin (lug/ml) und Human-B-Zellen (BT-1) (1,5x1O⁵ Zellen/ml), vorbehandelt mit Mitomycin C (50 nrn/ml) inkubiert. Nach 48 Stunden wurde die aufschwimmende Kultur geerntet und als TCGF-Quelle verwendet (H.Inoue et al, Scand.J. Immunol. 12, S. 149-145 (1980)).

I Λ* V

Vo

Referenzbeispiel 4

5 (1) Human-periphere Blutlymphocyten

50 ml Blut, erhalten von gesunden Erwachsenen oder Pateinten mit verschiedenen Krebsen durch Häparinisierung, wurden unter Verwendung von Ficol Pack (hergestellt durch Farmacia Japan Co., Ldt.) einer Zentrifugenabscheidung unterworfen, wobei man 5x10 periphere Blutlymphocyten erhielt.

15 (2) Mäuse-Milzlymphocyten

Die Milz einer C3H/He-Maus (männlich, 6w) wurde exzidiert und 2-mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium

BAD ORIGINAL

- 35a -

gewaschen. Dann wurde die Milz mittels einer Injektionsnadel gelockert und durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl (100 mesh) zur Entfernung grosser Teile passiert. Die so filtriertenZellen wurden 2 mal mit dem gleichen Kulturmedium wie oben gewaschen und dann einer Zentrifugentrennung mit einer Rate von 1.200 HpM während 10 Minuten unterworfen, wobei man 4 χ 10⁷ Milzlymphocyten erhielt.

Beispiel 1

GRA-1 (Menge an Protein 40 μg/mlj Menge an Zucker

7,5 μg/ml, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2,(2a)) wurden auf das 1.000-fache des Ursprungsvolumens mit einem RPMI-1640-Kulturmedium, enthaltend 15 % FCS, verdünnt, unter Erhalt eines Sensibilisierungs-Kulturmediums.

Lymphocyten von humanem peripheren Blut (5 χ 10 /5 ml) , erhalten gemäss Referenzbeispiel 4(1), wurden zu 5 ml des Sensibilisierungs-Kulturmediums, hergestellt wie oben, gegeben und dies wurde dann in eine Laborschale gegeben und 2 Tage bei 37°C kultiviert. Anschliessend erfolgte eine weitere Kultivierung auf einem RPMI-1640-Kulturmedium, enthaltend 20 % TCGF und 15 % FCS, erhalten gemäss Referenzbeispiel 3_r für weitere 5 Tage, wobei man 20 ml einer Killerzel-lenlösung, enthaltend 1x10 Killerzellen/ml, erhielt. Diese wird nachfolgend als GRA-1-K-T bezeichnet.

- .ZBb -

Beispiel 2

Die Mäuse-Milzlymphocyten, die im Referenzbeispiel 4(2) erhalten worden waren, wurden unter Verwendung eines RPMI-1640-Kulturmediums,· enthaltend 15 % FCS, auf eine Zahl von 5x10 /ml eingestellt. Dazu wurde GRA-M-1, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2(2b) gegeben, so dass das Endprodukt 1_r5 μg/ml Protein und 0,9 ug/ml Zucker enthielt. Ein 5 ml-Anteil des erhaltenen Gemisches wurde in eine Laborschale (60 mm χ 15 mm, hergestellt von Falcon Co.) 2 Tage bei 37⁰C kultiviert. Es wurde die Bildung von Klonen beobachtet. Der Anteil wurde weiter in einem RPMI-1640-Kulturmedium mit 15 % FCS, enthaltend 20 Vol.% TCGF (hergestellt

15 von Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd.)

während 4 Tagen kultiviert, wobei man 50 ml einer Killerzellenlösung, enthaltend 1 χ 10 Killerzellen/ml erhielt. Diese wird nachfolgend als GRA-M-1-K-T bezeichnet .

Beispiel 3

,6.

Lymphocyten (5x10 ) von peripherem Blut gesunder Spender wurde in einem RPMI-1640-Medium, enthaltend 40 ng/ml (^roteingehalt) von GRA-2 und 15 % FCS bei 37?C inkubiert. Am zweiten Tag wurde das vorerwähnte Human-TCGF zu dem Medium zugegeben, bis dessen Konzentration 20 % erreichte und die Inkubierung wurde 3 Tage fortgesetzt, wobei man Killer-Zellen erzielt, diese werden nachfolgend als "GRA-2-K-T" bezeichnet.

BAD ORIGINAL

- 3-6 -

Beispiel 4

Killerzellzubereitungen GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T und GRA-3-C-K-T wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von fRA-8, GRA-3-A und GRA-3-C hergestellt (Proteingehalt: 50 ng/ml/ und des TCGF, das im Re!ferenzbeispiel 3-(b) erhalten wurde.

10 Beispiel 5

C3HE/Mäusen (weiblich 8 Wochen alt) wurde intradermal X5563-Zellen (10 ) des .gleichen Stammes implantiert und nach 7 Tagen wurde derTumor chirurgisch herausgeschnitten. Nach weiteren 7 Tagen wurden X5563-Zellen (10 ) gleichen Stammes inokuliert und Mäuse, die gegenüber der Inokulierung resistent waren, wurden als Immun-Mäuse bezeichnet.

Die Milzzellen der Immunmäuse und von C3H/HE-Mäusen wurden unter üblich angewendeten Methoden präpariert.

Jedes Lot von Milzzellen (5x10 /Well) wurde mit 40 ng/ml (Proteingehalt) von GEA-M-5 in RPMI-1640-Medium, enthaltend 15 % FCS. während 5 Tagen sensibilisiert unter Erhalt von Killerzellen.

Killerzell-Zubereitungen, die aus normalen Milzzellen erhalten wurden, werden nachfolgend als "GRA-M-5-K-t-1" bezeichnet, und solche, die von Immunen Milzzellen erhalten wurden, werden mit "GRA-M-5-K-T-2" bezeichnet.

Uo

η -

Beispiel 6

Lymphocyten von peripherem Human-Blut (5x10 ) wurden in 5 ml RPMI-1640-Medium, enthaltent 50 ng/ml (Proteingehalt) GRA-1 bei 37⁰C während 2 Tagen inkubiert. Am dritten Tag wurden die Lymphocyten in das RPMI-1640-Medium, enthaltend 10 % Serum von dem Spender der Lymphocyten, und 0 bis 100 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-1 übetragen und die Inkubierung wurde nach weiteren 5 Tagen fortgeführt, wobei man die in der nachfolgenden Tabelle gezeigten Killerzellen-Zubereitungen erhielt.

	Tabelle 4	Killerzellen
GRA-Kontentration	(ng/ml)	GRA-1-K-T-1
Erster Tag	Tag 3	GRA-1-K-T-2
50	0	GRA-1-K-T-3
50	1,6	GRA-1-K-T-4
50	3,2	GRA-1-K-T-5
50	6	GRA-1-K-T-6
50	12,5	GRA-1-K-T-7
50	25	GRA-1-K-T-8
50	50
50	200
Beispiel 7

(a) Lymphocyten von peripherem Blut (PBL) von verschiedenen Krebspatienten nach der Operation wurden mit GRA-3 sensibilisiert unter Erhalt von Killerzeller-Zubereitungen. PBL (5x10 ) von den Patienten wurde in RPMI-1640-Medium, , enthaltent 50 ng/ml (Proteingehalt) von lRA-3 währen 2 Tagen inkubiert und dann inkubierte man in RPMI-1640-Medium, enthaltend 20 % TCGF und 15 % FCS weitere 5 Tage unter Erhalt der Killerzellen, die in Tabelle 5'gezeigt werden.

BAD ORIGINAL

	3236298
H4 - 38 -
Tabelle 5

Periphere Blut-Lymphocyten

10

Krebs

Magenkrebs Magenkrebs Brustkrebs Brustkrebs Brustkrebs Magenkrebs

P-GRA D-GRA Tage nach der Killerzellen Operation

14	GRA-3-K-T-1
35	GRA-3-K-T-2
21	GRA-3-K-T-3
7	GRA-3-K-T-4
35	GRA-3-K-T-5
21	GRA-3-K-T-6

In der obigen Tabelle bduetet P-GRA und D-GRA die Lokalität von GRA, ausgedrückt als Maligne-Gewebe (durch Operation entnommen) von Krebspatienten, von denen PBL in gleicher Weise gesammelt worden war, wie im Referenzbeispiel 1, 2-(b). P-GRA und D-GRA wurden erhalten unter Verwendung von FITC-PNA bzw. FITC-DBA. Die Tage nach der Operation geben die Zeit an, wann BPL nach der Operation gesammelt worden war.

(b) PBL (5x10 ), gesammelt von Brustkrebspatienten 21 Tage nach der Operation wurde in RPMI-1640-Medium, enthaltend 50 ng/ml (Proteingehalt) GRA-3 und 10 % Serum von den Patienten während 7 Tagen inkubiert, um das PBL zu sensibilisieren und unter Erhalt von Killerzellen-Zubereitungen. ^Diese werden nachfolgend als GRA-3-K-T-7 bezeichnet.

30

35

- 26 -

Beispiel 8

(i) GRA-M-1, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2(2b) wurde mit physiologischer Kochsalzlösung so verdünnt, dass der Gehalt an Zucker 1,0 ug/ml und an Protein 1,6 μg/ml betrug. Auf diese Weise erhielt man ein Anti-Krebsmittel Nr. 1.

(ii) Ein Krebsgewebe von C3H/He spontan auftretendem Brustkrebs wurde steril zu einem 5 mm kubischen Klumpen geschnitten und unter die Rückenhaut von jeweils 10 C₃H/He-Mäusen des gleichen Stammes wie oben (7 Wochen alt, männlich) transplantiert. 7 Tage nach der Transplantation wurde die Fixierung und Multiplizierung des Krebses bestätigt. 5 dieser Mäuse erhielten subkutan das gemäss (i) hergestellte Anti-Krebsmittel Nr. 1 in einer Dosis von 300 μΙ/Tag in 2-tägigem Abstand. Die restlichen 5 Mäuse wurden als unbehandelte Kontrolle verwendet. 10 Tage nach der ersten Verabreichung wurde der Tumor operativ entfernt und dessen mittleres Gewicht gemessen. Gleichzeitig wurde eine pathohistologische Untersuchung durchgeführt.

Tumgrvolumen

25 behandelte Gruppe: 22,3 mm³ (Fig.14) Kontrolle: 162,7 mm³ (Fig.15)

Dies bedeutet, dass der Tumor um 86_f3 % zurückging. 30

In der Kontrollgruppe (Fig.16) wurden vogelnestähnli che Krebskörper gebildet, wobei die Art des Gewebes

BAD ORIGINAL

einem markähnlichen kanalförmigen Krebs entsprach und eine Verfielfachung der Krebszellen über das Gesamtgewebe festgestellt wurde. Andererseits verursachten bei der Gruppe, die mit dem Mittel behandelt wurde )(Fig.17) die Krebszellen eine Verflüssigungsnecrosis

an den Stellen, wo sich die Krebszellen gebildet hatten . und eine Verkalkung und . Firosis wurden festgestellt, wobei nur eine sehr geringe Menge an Krebszellen zurückblieb. Dies bestätigte die Anti-TO Krebseigenschaften des erfindungsgemässen Anti-Krebsmittels,

Testbeispiel 1

GRA-1-K-T (1 μΐ), erhalten gemäss Beispiel 1, wurde auf eine Mikroplatte (hergestellt von Falcon Corp.) gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurden 4 μΐ FCS (hergestellt von Falcon Corp.) zugegeben und die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Neuraminidasebehandelte rote Blutzellen von Schafen (SRBC ), eingestellt auf eine Anzahl von 1x10 /ml, und 5 μΐ eines 0,1M Phosphatpuffers (pH 7,2) zu dem 0,85 % NaCl zuge-

25 geben worden waren, wurden zugegeben und dann wurde

die Platte einer Zentrifugenabscheidung in einer Rate von 6.000 Upm während 5^: Minuten unterworfen. Dann wurde

N die Platte umgedreht und nicht-umgesetzte SRBC wurde

entfernt. Eine Färbelösung (Brilliant Cresyl Blau, 30 hergestellt von Merck & Co.) wurde zum Färben der

Lymphocyten zugegeben und eine rosettenförmig ausgebildete

UH

Positivität wurde festgestellt. Wenigstens 98 % zeigten die rosettenförmige Positivität (T-Zellen).

Testbeispiel 2

Aktivität

(a) Von den in Tabelle 1 gezeigten Krebszellen wurden die nachfolgenden 5 Zellstämme mit unterschied- -liehen GRA-Positivitätsverhältnissen als zu bekämpfende Human-Krebszellen verwendet:

15 Zu bekämpfende Krebszellen:

Nr.	1	BT-1	(Burkitt Lymphoma)
Nr.	2	Daudi	(Burkitt Lymphoma)
Nr.	3	KATO-III	(Magenkrebs)
Nr.	4	MKN-45	(Magenkrebs)
Nr.	5	MOLT	(T-Zellen Leukemia)

Auf einer Mikroplatte (hergestellt von Falcon Corp.)

Δ.

wurden pro Vertiefung 5x10" der zu bekämpfenden Krebszellen durch Zentrifugenabscheidung mit einer einer

Rate von 8.000 Upm während 5 Minuten aufgebracht.

Dann wurden vorsichtig 4 χ 10 pro Vertiefung des nach Beispiel 1 erhaltenen GRA-1-K-T zugegeben und dann

wurde 1 Stunde inkubiert. 30

Die Abtötungsaktivität · wurde je nach dem'Grad der

BAD ORJGINAL

η m * *

Belagbildung festgestellt und wie folgt bewertet:

++ eine merkliche Abtötungsaktivität wird fest- -"- -

gestellt

5 + eine Abtötungsaktivität wird festgestellt + eine geringe Abtötungsaktivität wird feststellt

eine Abtötungsaktivität kann nicht festgestellt werden.
10

In einer Kontrollgruppe wurden unsensibilisierte humane periphere Blutlymphocyten, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden waren, jedoch ohne Verwendung von GRA, verwendet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt.

Aus Tabelle 6 geht hervor, dass die erfindungsgemäss gebildeten Killer-T-Zellen eine starke GRA-spezifische cytotoxische Aktivität aufweisen. 20

i Μ

Tabelle β

C t t C

t ι ί <

	zu bekämpfende Krebszelle	(Fig.	D	GRA-Positivver- hältnis (%)	Beurteilung lagbildung	der Be-
GRA-1-K-T-	Daudi	: (Fig.	3)	93r1	++ (Fig.	2)
Gruppe	KATO-IIΊ	(Fig.	5)	57,3	+ (Fig.	4)
	BT-1	(Fig-	7)	50,1	++ (Fig.	6)
	MKN-45	(Fig.	9)	1,0	+ (Fig.	8)
	MOLT			0,6	- (Fig.1	0)
Kontroll gruppe	BT-1		50,1	- (Fig.1	1)

er

ro

co

CD K)

CD

CO

- 44 -

(b)

Die gleichen zu bekämpfenden Krebszellen, wie

sie in (a) verwendet wurden (3_r2 χ 10 ) wurden mit 8 χ 10⁵ GRA-1-K-T (Zellverhältnis 5/1) vermischt und das gebildete Zellgemisch (Gesamtanzahl 4 χ 10 ) wurde in einem 15 % FCS enthaltenden RPMI-1640-Medium kultiviert. Nach 1 Stunde wurde die Anzahl der verbliebenen Zellen gezählt und das Inhibierungsverhältnis wurde geitiäss folgender Gleichen errechnet:

Cytotoxizität (%) =

Anzahl der Zellen (1 - ₍nach der Kultivierung Anzahl der Zellen vor der Kultivierung (4 χ 10⁶)

Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt.

HS

- 45. -

Tabelle 7

zu bekämpfen de Zellen	Anzahl vor der Kul tivierung	106	der Zellen nach der Kul tivierung	X 106	"Cyto- :toxi zität (%) j
Daudi	4 χ	106	2,9	χ 106	28
KATO-III	4 χ	106	3,7	χ 106	7,5
BT-1	4 χ	106	3,2	χ 106	20
MKN-45	4 χ	106	3,9	χ 106	2,5
MOLT	4 χ	4,2	—5

(c) Das Verfahren von (b) wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass das Mischverhältnis von GRA-1-K-T:. zu den zu bekämpfenden Krebszellen auf 5/3 verändert wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 8

zu bekämpfen de Zellen	Anzahl vor der Kul tivierung	X	106	der Zellen nach der Kul tivierung	χ 106	Cyto- toxizität . (%)
Daudi	4	X	106	3,6	χ 106	91
KATO-III	4	X	106	3,6	χ 106	.24
BT-1	4	X	106	1,4	χ 106	65
MKN-45	4	X	106	3,7	χ 106	,7,2
MOLT	4	4,1	-3

BAD ORIGINAL

Testbeispiel 3

C3H/He-spontan brustkrebsige Mäuse erhielten subkutan GRA-M-I-KT-, erhalten gemäss Beispiel 2, in einer Dosis von 2 χ 10 /0,3 ml Mais 3-mal wöchentlich jeden zweiten Tag. Nach 10 Tagen wurde der Fokus herausgenommen und untersucht. Bei diesem Versuch stellt man fest, dass GRA-1-K-T eine hohe Bindungsaktivität gegenüber Daudi, KATO-III und BT-1, aber nur eine niedrige Bindungsaktivitat gegenüber MKN-45 und MOLT zeigt.

Wie in Fig. 12 gezeigt wird, fand eine Infiltration von Lymphocyten in die Krebszellen statt und ein Aufbrechen des Tumorbereiches wurde festgestellt. Aus .jn; Fig. 13 geht hervor, dass eine Kalzifizierung der Tumorfläche stattgefunden hat und daraus kann man sehen, dass die erfindungsgemässen Krebszellen eine Antitumoraktivität aufweisen.

Vergleichsbeispiel 1

In diesem Beispiel wurden Krebszellen per se als spezifische Antigene anstelle von GRA für das Verfahren gemäss der Erfindung verwendet.

Krebszellen-sensibilisierte Lymphocyten wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten, wobei jedoch anstelle von GRA, BT-1, Daudi, KATO-III oder MKN-45 in einer Menge von 1x10 pro Laborschale verwendet wurden.

Mit diesen Lymphocyten wurde die 'äytotoxische 35

Aktivität in gleicher Weise wie im Testbeispiel 2(a) untersucht und die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt.

Aus Tabelle 9 geht hervor, dass die oben hergestellten Lymphocyten keine cytotoxische Aktivität aufweisen.

Tabelle 9

zu bekämpfende Zelle

BT-1 Daudi KATO-III MKN-45

Zellen, die für die Sensibilisierung von Lymphocyten verwendet wurden

BT-1 Daudi KATO-III MKN-45

Testbeispiel 4

In gleicher Weise wie im Testbeispiel 2-(b) wurde die krebszellenabtötende Aktivität von GRA-(-K-T, GRA-3-A-K-T und GRA-3-C-K-T, erhalten in Beispiel 4, bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 10 gezeigt.

BAD ORIGINAL

Zelle

Tabelle 1O % Cytotoxizität

GRA-8-K-T

GRA-3-A-K-T

GRA-3-C-K-T

KATO-III	8,0
BT-1	4,3
MKN-45	20
MOLT	0

Testbeispiel 5

5,0 5,0 5,0 0

5,0 4,0 20 0

(a) Die Cytotoxizität der KillerzeIlen-Zubereitungen, erhalten gemäss Beispiel 6 wurde mittels eines Cr-Färbetests (J. Immunol., 122, 2527-2533 (1979)) bestimmt. Dazu

51
wurden 50 \xC± radioaktives Cr (Japan Isotope Association)

7
zu KATO-III (2x10 ) gegeben und die Zellen wurden 1 h bei 37°C in RPMI-1640-Medium inkubiert und anschliessend durch

51 Zentrifugieren gewaschen unter Erhalt von Cr-markierten

Target-Zellen. Die Killerzellen (Effektorzellen) (2x1O⁶) wurden zu den Target-Zellen (1x10 ) gegeben (das Verhältnis E/T betrug 20/1) und die Mischung wurd 4 h bei 37⁰C in RPMI-1640-Medium inkubiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch Zentrifugieren gesammelt und die Radioaktivität wurde durch einen Flüssigsintillator gezählt.

Die spezifische Cr-Freigabe (%),die der cytolytischen Aktivitat der Effektorzellen entspricht, wurde nach folgender Gleichung bestimmt:

Spezifische CR-Freigabe (%)

(Freigabe im Versuch ) - (Spontane Freigabe)

(Maximale Freigabe)

- (Spontane Freigabe)

χ 100

5ft

Die maximale Freigabe geigt die Radioaktivität wenn alle Zellen aufgelöst sind,

Bi@ !rgebnisse wenden in Tabelle 11 gezeigt;

Tabelle 11

Killeszellen	Spezifische Freigabe
	51Cj: (%)
SSA-1-K-T-1	13
eiA-I=K=T=2	25
6SA-I=K=T=S	22
6SÄ-1-K-T-4	20
@SA=1=K=T=5	22
ßBA-1-Κ-ϊ-β	25
SSA-1-K-T-7	2?
6SA-1-K-T-8	32

den lä?gebnis§en in Tabelle 11 ist ea-kennbaa? _? dass und FSi keine Beziehung auf die Induzienang dear llen haben.

(te) CytetexiBitSt von- grä=2=K=t erhalten in Beispiel 3 in gleieheif weise wie in (a) oben mittels des Ca?·

F3?eifäbetes-feeg bestimait» Sie speaifisehe betrüg 14,3 % bei einea ¹ Ci-aarkierten.ΚΑϊΟ-III als (l/T =

BAD ORIGlNAI Testbeispiel 6

(a) Unter Verwendung von KATO-III (E/T = 20/1) wurde die Cytotoxizität von Killerzellen, erhalten gemäss Beispiel 7-(a) in gleicher Weise wie im Testbeispiel 2-(b) bestimmt.

Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt:

	Tabelle 12	C •i
Killer-Zellen
GRA-3-K-T-1
GRA-3-K-T-2
GRA-3-K-T-3
GRA-3-K-T-4
GRA-3-K-T-5
GRA-3-K-T-6
I Cytotoxizität
38,0
18,2
20,9
23,2
24,5
20,2

(b) Die Cytotoxizität von GRA-3-K-T-7, erhalten gemäss

51 Beispiel 7-(b) wurde unter Verwendung von Cr-KATO-Ii:

(E/T = 29/1) als Target-Zellen in gleicher Weise wie im

51 Testbeispiel 5 bestimmt. Die spezifische Cr-Freigabe

der Killerzellen betrug 25,5 %.

Testbeispiel 7

Die Cytotoxizität von Killerzellen, erhalten in Beispiel 5, wurde mittels des Cr-Freigabetests in gleicher Weise wie im Testbeispiel 5 bestimmt. Die verwendeten Target-Zellen waren Cr-markierte X5563-Zellen. Als Kontrolle wurden Lymphocyten, die in gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhalten worden waren mit der Ausnahme, dass die Sensibilisierung der Milzzellen durchgeführt worden war mit 1x10 /Well von

35 Mitomycin C-behandelten X5563-Zellen (5x10⁶/ml von

■■'Si» ''-U

X5563-Zellen wurden mit 50 μg/ml Mitomycin C während 60 Minuten behandelt) anstelle von GRA-M-5, verwendet.

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 13 gezeigt:

	Tabelle 13	40:1	20:1 1	0:1
		12,7 18,4 0,0	6,3 20,6 1 0,0	5,7 3,7 0,0
	51 Spezifische - Cr-Freigabe (%)
Killerzellen	E/T-Verhältnis
GRA-M-5-K-T-1 GRA-M-5-K-T-2 Kontrolle

Testbeispiel 8 (H-2-Assay)

GRA-M-1, GRA-M-3 und GRA-M-4, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2 wurden einer Serienverdünnung mit PBS (0,85 % NaCl) unterworfen, unter Erhalt von Proben.

Anti-H2-Serum vom National Institute o£> Genetic Research und die obigen Proben wurden vermischt und bei 4°C 2 h inkubiert und dann wurden Target-Zellen entsprechend dem verwendeten Anti-H-2-Serum zugegeben. Milzzellen oder Lymphknotenzellen, erhalten aus B10 (H-2 ) und B10-BR (H-2^k) Mäusen nach üblichen Methoden wurden als Target-Zellen verwendet. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS wurde Komplement (Kaninchen) zu den Zellen zugegeben und die Zellen wurden 1 h bei 37°C inkubiert und mit 0,2 5Trypan-Blau-PBS angefärbt zur Bestimmung der prozentualen Cytotoxizität. Das Anti-H-2-Serum wurde in einer Maximalverdünnung verwendet, so dass es wenigstens 95 %ige Cytotoxizität bei Abewesen-

35 heit von GRA zeigte.»

ORIGINAL

Die Blockierungswirkung von GRA in den Systemen wird in Tabelle 14 gezeigt:

Tabelle 14

GRA	Anti-H-2	Serum, Konzentration	X80 X300	Target-Zellen
GRA-M-I	D-23 D-32	fAnti-H-2Kk), or , (Anti-H-2DK),	X600 X80	BlOBR (H-2k) Milzzellen
GRA-M-3	D-33 D-2	(Anti-H-2Kb), oderK (Anti-H-2D ),	X80 X300	BIO (H-2bl Milzzellen
GRA -M-4	D-23 D-32	> oder •	BlO-BR (h-2k) Lympnknotenzel-len

Die Ergebnisse werden in Tabelle 15 gezeigt.

Table 15

	Anti-H-2	X2	%	Cvtotoxizität	X4	X8 X16 X32	X64	X128	X256	X512	0	*
	Serum	-	Verdünnung der Probe	13	14 12 13	14	13	14	13	14	13
GRA	-	-	97	99 96 97	97	96	97	96	96	14
I	D-23	-	95	95 95 95	94	95	95	96	95	13
	D-32	-	19	15 14 12	15	12	11	12	13	14
	. -	-	98	98 99 99	98	99	99	99	99	15
II	D-33	-	95	96 95 95	97	95	97	95	95	17
	D-2	100	100	100 100	-	-	-	-	100	10
	D-23	99	99	99 99	-	-	-	-	99	10
III	D32	GRA	I :	GRA-M-I
	Anmerkung -.	GRA	II :	GRA-M-3
		GRA	III:	GRA-M-4
•

m*m bedeutet % Cytotoxizität, wenn-nur-—-^ Komplement verwendet wurde.

Aus den Ergebnissen in Tabelle 15 kann man entnehmen, dass GRA-M-1, GRA-M-3 und GRA-M-4 keine H-2 haben.

Testbeispiel 9 5

C57BL/6 Mäusen wurde unter S.C. LLC (2x10 ) des gleichen Stammes transplantiert und nach 6 Tagen wurde 1ng (Protein) GRA-M-3, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2-(d), subkutan verabreicht. Diese Verabreichung wurde einmal täglich in gleicher Dosierung an 4 Tagen wiederholt. Am Tage nach der letzten Verabreichung wurden die Tumorzellen herausgeschnitten und gewogen. Zur Kontrolle wurden Tiere verwendet, denen nur physiologische Kochsalzlösung verabreicht worden war. Jede Testgruppe bestand aus 5 Tieren.

Als Ergebnis stellte man fest, dass das durchschnittliche Krebsgewicht bei der Kontrollgruppe etwa 500 mg war. Bei der GRA-M-3-behandelten Gruppe zeigten 3 ein Verschwinden der Tumore und zwei zeigten ein durchschnittliches Tumor-

20 gewicht von 100 mg.

Testbeispiel 10

C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit 1 ng ,(Protein) GRA-M-3, erhalten in Referenzbeispiel 2(d),einmal täglich während 3 Tagen immunisiert und am 5. Tag wurden Milzzellen von den Tieren zur Gewinnung von Effektor-Zellen gesammelt. Eine Mischung der Effektorzellen und von Lewis-Lungencarcinom (LLC) als Target-Zellen in einem Verhältnis von E/T = 50/1 wurde hergestellt und ein Teil (1x10 ) davon wurde in Mäusen des gleichen Stammes transplantiert und eine Winn-Assay wurde durchgeführt (J. Immunol. 86, S. 228-239 (1961)).

' Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 16 gezeigt. 35

BAD ORIGINAL

	Tabelle	16	5,5	17 Tag 18	Tag	Krebses	(%)	Tag 20 Msrtali-
Effektor	Wachstumsgeschwindigkeit des	39,5	5,7	3,1	19 Tag	20	tät / f ruppe
zellen	Tag 15 Tag	65,1	37,1	55,4	1,	4	0/10
A	5,7	: Gruppe A	61,7	98,1	76,	8	4/10
B-	21,4	sind die I		96,	4	4/10
C	39,3	ylilzzellen	von	GRA-M-3-immu-
Anmerkung

nen Mäusen;

Gruppe B sind die Milzzellen ναι normalen Mäusen;

Gruppe C sind die Milzzellen von Mäusen,

10 Tage nach der Transplantation von LLC(1x10 );

Die Krebswachstumsrate wurde nach folgender Gleichung berechnet:

Krebswachstumsrate (%) =

m _ m

¹A ¹N

T N

χ 100

dabei bedeutet T. die Dicke der Fussohle an der Seite wo der Krebsrfcranplantiert war und Ύ die Dicke einer normalen Fussohle.

Testbeispiel 11

C3H/He Mäuse wurden mit 4,5 μg (Protein) GRA-M-4, erhalten in Referenzbeispiel 2-(d) und 0,1 ml Freund 's Complete Adjuvant sacrococcygeal immunisiert. Nach 2 Wochen wurden Lymphknotenzellen in üblicher Weise gesammelt und als Responder-Zellen für die Bestimmung der proliferativen Ansprechung durch GRA-M-4 verwendet.

- 55 -

Zu diesem Zweck wurden Responder-ZeIlen (4x10 ) mit RPMI-1640-Medium, enthaltend 15 % FCS in Gegenwart von GRA-M-4 während 5 Tagen inkubiert. Während der letzten 18 Stunden der In-

3 3

kubierungszeit wurde l\iCx von H-Thymidine ( H-TdR) zu dem Medium zugegeben und die Inkorporation in die Zellen wurde gezählt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt.

Tabelle 17

GRA-M-R

Konzentra- 3-H-TdR-Inkorporation tion (ng/ml) (Mittel cpm + Standardirrtum)

S.I.

Kontrolle

Versuch

0,5

5
20
40

5.302 _+ 1.761

7.903 _+ 1.290

10.076 ± 936

10.686 + 429

10.615 jf 1.270

8.565 + 1.419

1,5 1,9 2,0 2,0

Anmerkung: ¹¹S.I." ist der Stimulierungsindex, ausgedrückt

durch Experiment/Kontrolle 25

Testbeispiel 12

Die verzögerte Hypersensibilisierung (DTH)-Ansprechung von C3H/HE-Normalmäsuen, X5563-Immunmäusen und MH134-Immunmausen, erhalten in gleicher Weise wie in Beispiel 5, und von GRA-M-4-Immunmäusen und GRA-M-5-Immunmäusen, erhalten in gleicher Weise wie im Testbeispiel 11, wurde durch die ■■ Fussohlen-Reaktion (FPR) bestimmt. Dazu wurden GRA- oder MMC-behandelte Tumorzellen in die Haut der Fussohle im

BAD ORIGINAL

53

Hinterbein der Tiere eingegeben und das Anschwellen der Fusssohle 24 h nach der Behandlung wurde festgestellt. Die DTH-Ansprechung wurde berechnet, indem man die Anschwellung vor der Behandlung von der nach der Behandlung (10 mm)

abzog.

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabellen 18 gezeigt.

Tabelle

_2

Mittleres Fussohlenanwachsen (10 mm)

Versuch Normalmäuse MH134 Immunmäuse

1	2,8	13,6
2	12,4	32,0
3	3,6	3,6
4	3,2	22.0
5	6,8	27,6

Anmerkung: Gruppe 1: Syngenische normale Milz 1x10 /2ü μΐ-

Medium (Hanks-Lösung)

Gruppe 2: MH134-Zellen 1x10⁶/20 μΐ Medium Gruppe 3: Medium 20 μΐ

Gruppe 4: GRA-M-4, 0,8 μg (Protein)/20 μΐ Medium Gruppe 5: GRA-M-4, 0,4 μ9 »

1*0

	Tabelle 19	2 Fussohlenawacfesen (10 mm)	MH13 4 Immunmaus
	Mittleres	X 5 5 6 3-Immunmaus	1/1 24,3
Versuch	Normalmaus	4,3 16,9
1 2 3	5,4 0,9 2,0

10 Anmerkung: Gruppe 1; Medium (Hanks-Lösung) 20μ1

Gruppe 2; GRA-M-4, 4 ug (Protein)/20 μΐ Medium Gruppe 3; GRA-M-5, "

	Tabelle 20	GRA-M-4-Immunmaus
		-0,3 24,6
Versuch	_2 Mittleres Fussohlenanwachsen (10 mm)
1 2	Normalmaus
1/7 5,1

Anmerkung: Gruppe 1; Medium (Hanks-Lösung 20 μΐ

Gruppe 2; GRA-M-4, 4 μg (Protein)/20 μΐ Medium

	Tabelle	21
	Mittleres	Fussohlenanwachsen (10 mm)
Versuch	Normalmaus	GRA-M-4-Immunmaus
1 2 3	-1,8 6,3 6,8	0,6 20,0 6,3

Amerkung: Gruppe 1; Medium (Hanks-Lösung) 20 11

Gruppe 2; GRA-M-4, 4 μg (Protein)/ 20 μΐ Medium

BAD ORIGINAL

<o4

88 -

Gruppe 3; 4 μg (Protein)/ 20 μΐ Medium des

Teiles, der durch eine PNA-Säule zur Zeit von GRA-M-4 (nachfolgend "CP.") hindur.chging

	Tabelle 22	GRA-M-4-Immunmaus
		-1,0
Versuch	_2 Mittleres Fussohlenanwachsen (10 mm)	17,7
1	Normalmaus	1,8
2	2,4	18,9
3	2,6
4	2,4
5,5 .

Anmerkung: Gruppe 1; Medium( Hanks-Lösung 20 μΐ

Gruppe 2: GRA-M-4, 3,8 μΐη (Protein)/ 20 μΐ Medium

Gruppe 3: 3,8 μg (Protein)/20 μΐ von CP. (siehe oben)

Gruppe 4: 3,8 μg (Protein) von GRA-M*-4 und 3,8 μg (Protein)/ 20 μΐ Medium von CP.

25 Referenzversuch

X5563-Immunmäuse wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhalten. Die Milzzellen dieser Immunmäuse wurden als Effek-. torzellen verwendet und die Effektorzellen (10 ) und die Target-ZeIlen (X5563, 10 ) wurden zusammen auf Mäusen des gleichen Stammes transplantiert. Dann wurde eine Winn-Assay in gleicher Weise wie im Testbeispiel 10 durchgeführt.

Die erzielten Ergebnisse werden in Fig. 23 gezeigt, in welcher die Abszisse die Tage und die Koordinate die mittlere Krebsgrösse (cm²) +_ Standardirrtum anzeigt, und in welcher die verschiedenen Markierungen folgende Bedeutung haben:

9 · : Gruppe,zu welcher keine Effektor-Zellen gegeben ft

wurden;

ο ο : Gruppe, zu welcher nicht-behandelte Effektor-Zellen ^gegeben wurden;

a A '' Gruppe, zu welcher Effektor zellen, die mit. Kaninchen-Komplement behandelt worden waren, gegeben wurden;

x χ : Gruppe, zu welcher Effektor-Zellen, die mit Anti-

Thy 1 (New England Nuclear Co., USA) behandelt worden waren, und zu der Kaninchen-Komplement gegeben

wurde;

D '" D: Gruppe, zu der Effektorzellen, die mit Anti-Lyt (New England Nuclear Co., USA) behandelt worden waren, und zu der Kaninchen-Komplement gegeben wurde;

B 1: Gruppe, zu der Effektor-Zellen, die mit Anti-Lyt (New England Nuclear Co., USA) behandelt und zu der Kaninchen-Komplement gegeben wurde.

Aus den Ergebnissen von Fig. 23 wird ersichtlich, dass ^y Lyt 1 Typ T-Zellen eine wichtige Rolle in dem Mechanismus des in vivo Effektes bei der Tumorimmunitat spielen.

Weiterhin ist es bekannt, dass die DTH-Ansprechung durch Lyt-1 T-Zellen (J. Exp.Med. 143, S. 1543-39 (1976)) hervorgerufen wird.

BAD ORIGINAL

Leerseite

Claims (2)

1. Krebszellen-cytotoxische Lymphocyten, die spezifisch gegenüber einem von Krebszellen abgeleiteten glykoverwandten Antigen sind.

•5

2. Lymphocyten gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man sie durch Sensibilisieruna von Lymphocyten mit dem von Krebszellen abgeleiteten glykoverwandten Antigen hergestellt hat.

TO 3. 'Lymphocyten gemäss Ansprüchen 1 oder 2, dadurch er e kennzeichnet, dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem Lektin, das sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder N-Acetylgalaktosamin verbindet, kom-

T5 biniert.

4. Lymphocyten gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankoinponente ist, die sich mit einem Lektin, das sich spezifisch mit endständiger Galaktose

5 verbindet, kombiniert.

5. Lymphocyten gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem mit endständigen N-Acetylgalaktosamin spezifisch bindendem Lektin kombiniert.

6. Verfahren zur Herstellung von Krebszellen-cycotoxischen Lymphocyten, dadurch gekennzeichnet , dass man Lymphocyten mit einem von Krebszellen abgeleiteten glykoverwandten Antigen sensibilisiert.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, welche sich mit einem Lektin, das sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder N-Acetylgalaktosamin verbindet, kombiniert.

8. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch g e k e η η -

zeichnet/ dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem spezifisch mit endständiger Galaktose verbindendem Lektin kombiniert.

9. Verfahren gemäss·Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, welche sich mit einem Lektin, das sich spezifisch mit endständigem N-Acetylgalaktosamin verbindet, kombiniert.

BAD ORIGINAL

-Β

ΙΟ. Anti-Krebsmittel, enthaltend als aktiven Bestandteil Krebszellen inhibierende Lymphocyten, die spezifisch gegenüber einem von Krebszellen abgeleiteten glykoverwandten Antigen sind.
5

11. Anti-Krebsmittel gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , dass die Krebszellen-cytototoxischen Lymphocyten erhalten wurden durch Sensibilisierung von Lymphocyten mit einem von Krebszellen

10 abgeleiteten glykoverwandten Antigen.

12. Anti-Krebsmittel gemäss Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet , dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem Lektin, das sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder N-Acetylgalaktosamin verbindet, kombiniert,

13. Anti-Krebsmittel gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass das glykoverwandte

20 Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die

sich mit einem Lektin, das sich spezifisch mit einer endständigen Galaktose verbindet, kombiniert.

14. Anti-Krebsmittel gemäss Anspruch 12,· dadurch g e kennzeichnet, dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem Lektin, das sich spzeifisch mit endständigem N-Acetylgalaktosamin verbindet, kombiniert.

15. Anti-Krebsmittel, enthaltend ein von Krebszellen abgeleitetes glykoverwandtes Antigen als aktiven Bestandteil.

16. Anti-Krebsmittel gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem Lektin, welches sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder N-Acetylgalaktosamin verbindet, komibniert.

17. Anti-Krebsmittel gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , dass das glykoverwandte Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem Lektin, welches sich spezifisch mit endständiger Galaktose verbindet, kombiniert.

18. Anti-Krebsmittel gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , dass das glykoverwandte Anti- gen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem Lektin₇ welches sich spezifisch mit endständigem N-Acetylgalaktosamin verbindet, kombiniert.

19. Verfahren zur Behandlung von Krebs, dadurch g e kennzeichnet, dass man einen krebsigen

Patienten Krebszellen-cytotoxische Lymphocyten, die spezifisch gegenüber einem von Krebszellen abgeleiteten glykoverwandten Antigen sind, oder ein Krebszellen-abgleitetes glykoverwandtes Antigen verabreicht. 25

20. Glykoverwandtes Antigen, das aus einer Human-Krebszellenmembrankomponente isoliert wurde, und das sich mit einem Lektin kombiniert, welches sich mit einer endständigen Galaktose oder einem endständigen N-Acetylgalaktosamin

30 verbindet.

21. Glykoverwandtes Antigen gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , dass das glykoverwandte Antigen hergestellt wurde, indem man ein glykoverwandtes " Antigen aus Human-Krebszellenmembrankomponente mit einem

BAD ORIGINAL

Lektin isoliert, welches sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder einem endständigen N-Acetylgalaktosamin verbindet.

22. Glykoverwandtes Antigen gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , dass das Lektin sich spezifisch mit einer endständigen Galaktose verbindet.

23. Glykoverwandtes Antigen gemäss Anspruch 22, dadurch geke"nnzeichnet, dass das. Lektin Erdnusslektin, Ricinus communis-Lektin oder Sojabohennlektin ist.

24. Glykoverwandtes Antigen gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Lektin Erdnuss lektin ist.

25. Glykoverwandtes Antigen gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , dass das Lektin sich spezifisch mit einem endständigen N-Acetylgalaktosamin verbindet.

26. Glykoverwandtes Antigen gemäss Anspruch 25, dadurch · gekennzeichnet , dass das Lektin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dolichosbohnenagglutinin, "braid orange"-Lektin, Helix pomatia-Lektin, Limabohnenlektin, Sojabohnenlektin und Bauhiniabohnenlektin.

27. Glykoverwandtes Antigen gemäss Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , dass das Lektin Dolichosbohncriagglutinin ist.

28. Glykoverwandtes Antigen hergestellt durch Isolieren eines glykoverwandten Antigens aus Human-Krebszellenmembrankomponente zunächst mit einen ersten Lektin, das sich spezifisch mit endständiger Galaktose verbindet und dann mit einem zweiten Lektin, welches sich spezifisch mit einem endständigen N-Acetylgalaktosamin verbindet.

29. Glykoverandtes Antigen gemäss Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , dass das erste Lektin Erdnusslektin und das zweite Lektin Dolichosbohnenagglutinin ist.

30. Verfahren zur Herstellung eines glykoverwandten Antigens, dadurch gekennzeichnet , dass man ein glykoverwandtes Antigen, das sich mit einem Lektin, welches sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder endständigem N-Acetylgalaktosamin verbindet, kombiniert, isoliert.

31. Verfahren gemäss Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet , dass man ein glykoverwandtes Antigen aus Human-Krebszellenmembrankomponente mit einem Lektin, das sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder endständigem N-Acetylgalaktosamin kombiniert,

25 isoliert.

32. Verfahren gemäss Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet , dass das Lektin ein solches ist, das sich spezifisch mit endständiger Galaktose kombiniert.

33. Verfahren gemäss Anpsruch 31, dadurch gekennzeichnet , dass das Lektin ein solches ist, das sich spezifisch mit endständigem N-Acetylgalaktos-

' amin kombiniert. 35

BAD ORIGINAL

34. Verfahren zur Herstellung von glykoverwandtem Antigen, dadurch gekennzeichnet , dass man ein glykoverwandtes Antigen aus Human-Krebszellenmembrankomponente isoliert, und zwar zuerst mit einem ersten Lektin, das sich spezifisch mit endständiger Galaktose verbindet, und dann mit einem zweiten Lektin, das sich spezifisch mit einem endständigen N-Acetylgalaktosamin verbindet.

35. Verfahren gemäss Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet , dass das erste Lektin Erdnusslektin und das zweite Lektin Dolichosbohnenagglutinin ist.