DE69627780T2

DE69627780T2 - Peptid das eine Immunantwort gegen menschlichen Magenkrebs induziert und Arzneimittel die es enthält zur Vorbeugung oder Behandlung von Magenkrebs

Info

Publication number: DE69627780T2
Application number: DE69627780T
Authority: DE
Inventors: Kokichi Chuo-ku Kikuchi; Noriyuki Toyohira-ku Sato; Hiromitsu Rishirifuji-machi Sahara; Takahiro Setana-gun Yasojima; Yoshimasa Chuo-ku Wada; Manabu Kawasaki-shi Suzuki; Junji Kawasaki-ku Hamuro
Original assignee: Kikuchi Kokichi Sapporo; Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Kikuchi Kokichi Sapporo; Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-30
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-10-01
Also published as: US5837248A; EP0770624A2; EP0770624A3; US6368852B1; EP0770624B1; US20050208064A1; KR970015602A; US20030186406A1; JPH09151200A; DE69627780D1; CN1158856A; KR100378901B1

Description

Peptid, das zum Induzieren einer Immunantwort gegen menschlichen Magenkrebs befähigt ist und dieses enthaltendes Mittel zur Prävention oder Behandlung von menschlichem Magenkrebs
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid, das zum Induzieren von zytotoxischen T Lymphozyten (CTL) (1) gegen menschliche Magenzellen in vivo oder in vitro befähigt ist, und auf eine dieses Peptid kodierende DNA. Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Peptid, das befähigt ist, CTL gegen menschliche Magenzellen durch Bindung an HLA-A31-Antigen (2) zu präsentieren (2) und auf eine das Peptid kodierende DNA. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Mittel zur Verhütung oder Behandlung von menschlichem Magenkrebs, das Mittel, welches ein Peptid enthält, das zum Induzieren von CTL gegen menschliche Magenkrebszellen in vivo oder in vitro befähigt ist und auf eine Vaccine zur Prävention oder Behandlung von menschlichem Magenkrebs, wobei die Vaccine einen rekombinanten Virus oder ein rekombinantes Bakterium mit einer DNA, die dieses Peptid kodiert, enthält.
Hintergrund der Erfindung
Für die Pharmacotherapie von malignen Tumoren wurden chemotherapeutische Mittel, welche direkt Tumorzellen schädigen, oder immuntherapeutische Mittel verwendet, mit denen die Behandlung durch nicht-spezifische Aktivierung der Immunität eines Wirtsorganismus und Erhöhen der bioprotektiven Funktion des Wirtsorganismus erfolgt. Zur Zeit gibt es jedoch kein Mittel, mit dem maligne Tumoren, vor allem Tumoren des Verdauungstrakts, völlig geheilt werden können.
In den letzten Jahren haben Untersuchungen unter Verwendung von tierischen Tumoren, hauptsächlich von der Maus, gezeigt, daß Tumoren völlig geheilt werden können, indem eine antigenspezifi sche Immunantwort gegen Tumorantigene und tumorspezifische Antigene, die in verschiedenen Tumorzellen vorhanden sind, verstärkt wird. Klinisch wurde die Behandlung durch Erhöhen der antigenspezifischen Immunantwort gegen diese tumorspezifischen Antigene durchgeführt.
Im Hinblick auf Mittel oder Methoden, durch die Tumoren durch Erhöhung der Tumorantigen-spezifischen Immunantwort behandelt werden, wurde berichtet, daß ein monoklonaler Antikörper gegen ein Antigen verwendet wird, welches in Tumorzellen exprimiert und hauptsächlich von B-Zellen erkannt wird, daß eine tumorspezifische Immunantwort induziert wird, indem den Patienten ihre eigenen Tumorzellen oder löslich gemachte Fraktionen davon, welche durch Bestrahlung oder Chemikalien inaktiviert wurden, als Vaccine verabreicht wurden und daß zur Erhöhung der Immunogenizität von Tumorzellen Viren oder verschiedene Cytokin-Gene in Tumorzellen eingebracht werden und die so behandelten Tumorzellen selbst den Patienten verabreicht werden, wodurch eine tumorspezifische Immunantwort induziert wird.
Es ist jedoch festzuhalten, daß T-Zellen, einschließlich CTL, hauptsächlich für die Tumorabstoßung in vivo wirken. Es wurde klargestellt, daß die Behandlung mit Hilfe eines Antikörpers gegen ein B-Zell-Erkennungsantigen beschränkt ist.
Außerdem wurde festgestellt, daß die Immunantwort mit T-Zellen in einem Zustand, in dem zwei funktionelle Sub-Populationen (Thl und Th2 Untergruppen), die in T-Zell-Populationen vorhanden sind, aktiviert werden, entweder intensivierend oder suppresiv wirkt und daß die durch Tumorzellen selbst, die zahlreiche Antigene enthalten, verursachte Immunreaktion manchmal die Immunantwort gegen die Tumorzellen sogar unterdrückt.
Darüber hinaus kann im Hinblick auf die Impfung mit desaktivierten Tumorzellen die Möglichkeit eines erneuten Wachstums von Tumoren durch Reaktivierung in vivo nicht vollständig ausgeschlossen werden. Es verbleibt somit das Problem der Sicherheit.
Um die vorstehend erläuterten Schwierigkeiten zu untersuchen und zu vermeiden, wurde eine Methode vorgeschlagen, bei der ein Antigenprotein zur Aktivierung von CTL, von dem angenommen wird, daß es eine zentrale Rolle bei der Tumorabstoßung spielt, identifiziert wird und CTL mit Hilfe dieses Antigenproteins aktiviert wird.
Durch Forschungsarbeiten wurde in den letzten Jahren klargestellt, daß CTL durch ein Peptid von etwa 8 bis 12 Aminosäuren, das durch Proteasefragmentierung eines antigenischen Proteins erhalten wird, induziert wird, wobei dieses Protein als Antigen präsentierendes Molekül für CTL wirkt, indem es an ein HLA-Rntigen gebunden wird. Im Hinblick auf ein Krebsantigen-Peptid wird daher angenommen, daß durch Auffinden eines Peptids, das an ein HLA-Molekül gebunden ist, so daß es CTL gegen Tumorzellen induziert, dieses Peptid als Mittel zum Verhüten oder Behandeln von Krebs verwendet werden kann.
Bisher jedoch wurde nur ein Peptid, das von einem Protein der MAGE-Familie, Mart-1, Thyrosinase, gp100, welches ein in Melanom-Tumoren vorhandenes Krebsantigen ist, abgeleitet ist, identifiziert. Was den Krebs des Verdauungstrakts einschließlich Magenkrebs betrifft, sind zur Zeit das Vorhandensein eines Krebsantigen-Peptids, das zur Induktion von CTL befähigt ist; und die Struktur eines solchen Krebsantigen-Peptids unbekannt.
Durch die vorliegende Erfindung sollen bereitgestellt werden: (i) ein Peptid, das zur Induktion einer Immunantwort gegen menschlichen Magenkrebs befähigt ist, (ii) dieses Peptid kodierende DNA, (iii) ein Mittel zur Verhütung oder Behandlung von menschlichem Magenkrebs, welches das vorstehende Peptid enthält, (iv) eine Vaccine zum Verhüten oder Behandeln von menschlichem Magenkrebs, wobei die Vaccine ein rekombinantes Virus oder ein rekombinantes Bacterium enthält, das die das vorstehend erwähnte Peptid kodierende DNA aufweist.
Liu et al. (1995) Nature Medicine 1(3): 267–271 berichtet, daß menschliche autologe tumorspezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL), aus peripherem Blut-auf kleinen Formalin-fixierten in Paraffin eingebetteten Schnitten eines Magenkrebses erzeugt wurden.
Yasoshima et al. (1995) Biotherapy 9(5): 667–668 berichten über die Aufklärung des zytotoxischen Mechanismus bei menschlichem Magenkrebs. Ein I-abgebauter CTL-Klon der MHC-Klasse, TcHST-2 und die autologe Magen-Siegelringzell-Karzinomlinie HST-2 wurden erstellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfinder haben sich auf die Tatsache konzentriert, daß CTL, welche das Tumorantigen erkennen, eine wichtige Rolle für den bioprotektiven Mechanismus gegen Tumorzellen spielen. Dabei wurden Untersuchungen mit der Annahme durchgeführt, daß die wirksame Induktion von CTL mit Hilfe eines Peptids, das als Teil einer Vaccine verwendet werden kann, oder mit einem Transformanten, der das Peptid kodierende DNA enthält, wirksam zur Verhütung oder Behandlung von Krebs sein kann.
Es ist bekannt, daß das HLA-Antigen an das Krebsantigen-Peptid gebunden ist und als Antigen-präsentierendes Molekül für CTL wirkt, wodurch CTL induziert werden. Es wird demnach angenommen, daß durch Auffinden eines Peptids, welches gegen Magenkrebszellen reaktive CTL aktivieren kann, es möglich sein kann, dieses als Mittel zum Verhüten oder Behandeln von Magenkrebs zu verwenden.
Die vorliegenden Erfinder haben erfolgreich einen CTL-Zellstamm (Tc-HST-2) bereitgestellt, der spezifisch mit Magenkrebszellen reagiert, die durch HLA-A31 restriktiert wurden, wobei dieser Stamm von einem an Magenkrebs erkrankten Patienten hergeleitet wurde, und sie haben erfolgreich einen Stamm von Magenkrebszellen (HST-2) bereitgestellt, gegen den diese CTL wirksam sind, wobei dieser Stamm von dem gleichen Patienten (3) erhalten wurde.
Es ist jedoch unklar, ob diese CTL ein Tumorantigen erkennen und falls ja, welches Antigen diese CTL erkennen. Vor allem wurde das Vorliegen eines Krebsantigen-Peptids, das spezifisch in Krebs des Verdauungstrakts einschließlich Magenkrebs existiert, und welches zur Induktion von CTL befähigt ist, keinesfalls identifiziert und weit weniger charakterisiert.
Die vorliegenden Erfinder haben nun jedoch ein HLA-gebundenes Peptid, das auf der Zelloberfläche der Magenkrebszelle HST-2 vorhanden ist, gereinigt und haben ein Peptid identifiziert, welches den CTL-Zellstamm Tc-HST-2 aktiviert. Darüber hinaus haben sie dieses identifizierte Peptid in üblicher Weise chemisch synthetisiert. Somit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, daß dieses Peptid tatsächlich den CTL-Zellstamm Tc-HST-2 aktiviert. Es wurde außerdem gefunden, daß dieses Peptid auch in arideren Magenkrebszellen als HST-2 exprimiert wird.
Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß das vorstehend genannte Peptid als Mittel zum Verhüten oder Behandeln von Magenkrebs verwendet werden kann.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung: (i) ein wie in den beigefügten Ansprüchen definiertes Peptid, welches ein Fragment eines Magenkrebs-Antigenproteins ist, das in menschlichen Magenkrebszellen vorliegt, wobei das Fragment an ein HLA-Molekül gebunden ist und zur Induktion einer zytotoxischen T-Zelle befähigt ist, deren Zielzellen die Magenkrebszellen sind, (ii) ein Mittel zum Verhüten oder Behandeln von menschlichem Magenkrebs, wobei das Mittel das vorstehend genannte Peptid enthält, (iii) das vorstehend genannte Peptid kodierende DNA, und (iv) eine Vaccine zum Verhüten oder Behandeln von menschlichem Magenkrebs, wobei die Vaccine ein rekombinantes Virus oder ein rekombinantes Bacterium, das diese DNA aufweist, enthält.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Elutionsmuster eines HLA-gebundenen Peptids aus HST-2-Magenkrebszellen in einer Umkehrphasen HPLC-Kolonne. In 1 gibt die Linie die Acetonitril-Konzentration an und die Kurve gibt die Absorption bei OD 210 bei jeder Konzentration an.
2 ist eine graphische Darstellung, welche die spezifische Zytotoxizität von Tc-HST-2 bei Verwendung eines HST-2-abgeleiteten an HLA-gebundenen Peptids zeigt.
O gibt die spezifische Zytotoxizität bei Verwendung von HST-2 an.
♦ zeigt die Zytotoxizität an, wenn eine HLA-A31-positive KG-1-Zelle als Ziel-T-Zelle verwendet wird.
Alle dieser Versuche wurden so durchgeführt, daß das Verhältnis von Ziel-T-Zellen zu CTL 1:100 war.
3 ist ein Elutionsmuster der 12. Fraktion, welche die in 2 gezeigte CTL-Induzierbarkeit hat, in einer Umkehrphasen HPLC-Kolonne.
In 3 gibt die Linie die Acetonitril-Konzentration an und die Kurve gibt die Absorption bei OD 210 für jede Konzentration an.
4 ist eine graphische Darstellung, welche die spezifische Zytotoxizität von Tc-HST-2 bei Verwendung eines von HST-2-abgeleiteten an HLA-gebundenen Peptids zeigt.
☐ gibt die spezifische Zytotoxizität an, wenn HST-2 als Ziel-T-Zelle verwendet wird.
♦ gibt die Zytotoxizität an, wenn als Ziel-T-Zelle eine HLA-A31-positive CCRF-CEM-Zelle verwendet wird.
Alle Versuche wurden so durchgeführt, daß das Verhältnis von Ziel-T-Zellen zu CTL 1:100 betrug.
5 ist eine graphische Darstellung, welche die CTL-Induzierbarkeit von Tc-HST-2, gemessen nach der TNF-Freisetzungsmethode zeigt, wobei Peptid 1 (SEQ ID NO:1), Peptid 1-9 (SEQ ID NO:2), Peptid (SEQ ID NO:3) und Peptid 1-7 (SEQ ID NO:4) verwendet wurden.
Die TNF-empfindlichen Wehi-Zellen wurden durch die Freisetzung von TNF geschädigt und die Aufnahme von MTT durch die übrigen Zellen wird vermindert. Die Peptidkonzentrationen waren 10 mM, 1 mM und 0,1 mM. In allen Tests wurde HST-2 als Ziel-T-Zelle verwendet und das Verhältnis von Ziel-T-Zellen zu CTL betrug 1:100.
∎ gibt die Zytotoxizität bei Zugabe von Peptid 1 an.
☐ gibt die Zytotoxizität bei Zugabe von Peptid 1-9 an.
Δ gibt die Zytotoxizität bei Zugabe von Peptid 1-8 an.
O gibt die Zytotoxizität bei Zugabe von Peptid 1-7 an.
Die gestrichelte Linie zeigt die Zytotoxizität an, wenn kein Peptid zugegeben wurde.
6 ist eine graphische Darstellung, welche die Zytotoxizität von TC-HST-2 zeigt, wenn MKN28 A31(+)cl-2-Zellen und MKN28 A31(+)cl-5-Zellen verwendet wurden, die Unterlinien (sub-lines) sind, welche durch künstliche Expression von HLA-A31 und MKN28 Magenkrebs-Elternzellen erhalten wurden. Alle Versuche wurden so durchgeführt, daß das Verhältnis von Ziel-T-Zellen zu CTL 1:100 betrug.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Um ein Peptid zu identifizieren, welches ein Fragment eines in einer menschlichen Magenkrebszelle vorhandenen Magenkrebs-Antigenproteins ist, wobei das Fragment an ein HLA-Molekül gebunden ist und befähigt ist, eine zytotoxische T-Zelle, welche die Magenkrebszelle als Zielzelle hat, zu induzieren, ist es erforderlich, (i) einen menschlichen Krebszellstamm des HLA-Typs bereitzustellen, der in großen Mengen in vitro gezüchtet werden kann und (ii) einen CTL-Zellstamm bereitzustellen, der mit dem vorstehend erwähnten Krebszellstamm reagiert, so daß das HLA-Molekül und der T-Zellrezeptor restriktiert werden und Zytotoxizität verursacht wird, welcher in großer Menge in vitro gezüchtet werden kann.
Als der vorstehend angegebene menschliche Krebszellstamm des HLA-Typs (i) können die durch die vorliegenden Erfinder bereitgestellten HST-2-Zellen verwendet werden (4). Dieser Zellstamm ist ein Magenkarzinom-Siegelringzellstamm, der aus karzinomatösen Asciten eines an Magenkrebs leidenden Patienten gebildet wurde.
Als der vorstehend angegebene CTL-Zellstamm (ii) kann der durch die vorliegenden Erfinder bereitgestellt Tc-HST-2 verwendet werden.
Es wurde angegeben, daß dieser CTL-Zellstamm spezifisch mit HST-2-Zellen reagiert und gleichzeitig HST-2 Antigen und HLA-A31-Antigen erkennt (5).
Die HST-2-Zelle kann verwendet werden, um das HLA-gebundene Peptid, welches das Magenkrebs-Antigenpeptid enthält, das zum Induzieren der CTL-Aktivität des Tc-HST-2-Zellstamms befähigt ist, zu erhalten. Dabei wird die HST-2-Zelle unter üblichen Inkubationsbedingungen inkubiert, beispielsweise in RPMI1640 Medium, das Rinderembryonen-Serum enthält. Dann wird die Kultur mit Phosphat-Salz-Pufferlösung gewaschen. Danach wird das an der Zelloberfläche vorhandene HLA-Molekül-gebundene Peptid wirksam mit einer 0,1%igen Lösung von Trifluoressigsäure (TFA) (6) extrahiert.
Das zur Induktion der CTL-Aktivität der Tc-HST-2-Zelle befähigte Magenkrebs-Antigenpeptid kann durch Umkehrphasenchromatographie aus dem oben genannten HLA-gebundenen Peptid gereinigt werden. Die Reinigung dieses Magenkrebs-Antigenpeptids.wird später in den Beispielen beschrieben.
Das Tc-HST-2-reaktive Magenkrebs-Antigenpeptid in der HLA-gebundenen Peptidfraktion, das durch Umkehrphasenchromatographie abgetrennt wurde, kann durch Messen der CTL-Induzierbarkeit jeder Fraktion identifiziert werden (6). HLA-A31-positive HST-2- oder KG-1-Zellen werden mit ⁵¹Cr enthaltendem Natriumchromat radioaktiv markiert und dann mit dem durch Umkehrphasenchromatographie abgetrennten HLA-gebundenen Peptid vermischt. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 37°C inkubiert und dann wird Tc-HST-2 zugesetzt. Das resultierende Gemisch wird weitere 12 Stunden inkubiert. Die CTL- Induzierbarkeit kann bestimmt werden, indem die Radioaktivität des in dem Überstand freigesetzten ⁵¹Cr gemessen wird.
Die Aminosäuresequenz des Magenkrebs-Antigenpeptids, das durch Induzieren der CTL-Aktivität der durch Umkehrphasenchromatographie abgetrennten Tc-HST-2-Zelle befähigt ist, kann in üblicher Weise mit Hilfe einer Protein-Sequenziervorrichtung durch Festphasentechnik bestimmt werden. Beispielsweise kann ein durch SEQ ID NO:1 der Sequenzliste dargestelltes Peptid als Peptid erwähnt werden, das CTL-Induzierbarkeit besitzt, und kann erfindungsgemäß verwendet werden. Außerdem kann man auch ein durch SEQ ID NO:2 dargestelltes Peptid verwenden, das durch Deletion einer Aminosäure von dem C-Terminal des Peptids der SEQ ID NO:1 erhalten wird. Außerdem kann ein Peptid verwendet werden, welches die durch SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 dargestellte Aminosäuresequenz als Teil der gesamten Aminosäuresequenz enthält.
Das erfindungsgemäße Peptid liegt im Bereich eines aus wenigen Aminosäuren gebildeten Peptids bis zu einem aus vielen Aminosäuren gebildeten Peptid.
Ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 der Sequenzliste dargestellt ist, kann nicht verwendet werden, weil es keine CTL-Induzierbarkeit besitzt (siehe nachstehende Beispiele).
Das Verfahren zur Herstellung dieser Peptide ist nicht speziell beschränkt. Das Peptid kann unter Verwendung einer Festphasen-Peptidsynthese-Methode oder einer rekombinanten DNA-Methode hergestellt werden.
So kann beispielsweise ein CTL-induzierbares Peptid, das als Zielzelle eine Magenkrebszelle hat, wie es durch SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 dargestellt ist, unter Verwendung einer konventionellen Festphasen-Peptidsynthese-Methode synthetisiert werden. Es kann auch dadurch hergestellt werden, daß die DNA, welche die dieses Peptid bildenden Aminosäuren kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor eingeschleust wird und BCG-Bakterien oder E. coli, die mit diesem transformiert wurden, inkubiert werden.
Die solche Peptide kodierende DNA kann aus der Aminosäuresequenz hergeleitet werden. Die jeder Aminosäuresequenz entsprechenden Kodons sind natürlich dem Fachmann gut bekannt.
Alle der erfindungsgemäßen Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und es wurde durch Umkehrphasen-HPLC gezeigt, daß diese einzelne Bestandteile sind. Die Peptide wurden dann durch massenspektrometrische Analyse identifiziert und in einem CTL-Test verwendet.
Das erfindungsgemäße Peptid kann die CTL-Aktivität des Magenzellspezifischen CTL-Stamms Tc-HST-2 induzieren. Die CTL-Induzierbarkeit kann mit Hilfe der vorstehend angegebenen Chrom-Freisetzungsmethode oder durch eine TNF-Freisetzungsmethode gemessen werden (7).
Bei der TNF-Freisetzungsmethode wird die HLA-A31-positive HST-2-oder KG-1-Zelle mit dem erfindungsgemäßen Peptid gemischt und das Gemisch wird 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wird Tc-HST-2 zugesetzt und das resultierende Gemisch wird weitere 12 Stunden inkubiert. Die Aktivität des im Überstand freigesetzten TNF wird gemessen (7), um die CTL-Induzierbarkeit zu bestimmen.
Beispielsweise werden TNF-empfindliche Wehi164-Zellen mit einer Testprobe vermischt und das Gemisch wird 24 Stunden inkubiert. Dann wird eine MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-z-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid]-Lösung zu der Kultur zugesetzt und das resultierende Gemisch wird weitere 3 Stunden inkubiert. Nachdem das in den Mitochondrien umgewandelte Formazan in Säure/Propanol gelöst wurde, wurde dessen Menge durch Absorption bei OD570 gemessen, um die TNF-Aktivität festzustellen.
Das erfindungsgemäße Peptid, beispielsweise das Peptid mit der durch SEQ ID NO:1 dargestellten Aminosäuresequenz kann Magen- krebszellen-spezifische CTL als T-Zell-Epitop induzieren. Es ist daher zu erwarten, daß es als Mittel zum Verhüten oder Behandeln von menschlichem Magenkrebs wirksam ist.
Bei der Anwendung kann das erfindungsgemäße Peptid (i) als solches, (ii) zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger und/oder Verdünnungsmittel, oder (iii) zusammen mit Adjuvantien, falls erforderlich, verabreicht werden, wobei die Verabreichung durch Injektion oder durch subkutane Absorption durch eine Schleimhaut, durch Sprühen oder dergleichen erfolgt. Der Träger kann beispielsweise menschliches Serumalbumin sein, und das Verdünnungsmittel kann beispielsweise PBS oder destilliertes Wasser sein.
Das Mittel zum Verhüten oder Behandeln von menschlichem Magenkrebs enthält geeigneterweise 0,01 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 95 Gew.-%, des Peptids, das ein Fragment eines in einer menschlichen Magenkrebszelle vorhandenen Magenkrebs-Antigenproteins ist, wobei das Fragment an ein HLA-Molekül gebunden ist, geeigneterweise ein HLA-A31-Molekül, und das befähigt ist, zytotoxische T-Zellen zu induzieren, die als Zielzelle die Magenkrebszelle haben.
Dieses Mittel wird Erwachsenen in einer solchen Dosis verabreicht, daß die Menge des erfindungsgemäßen Peptids zwischen 0,1 mg und 100 mg pro Verabreichung beträgt. Dieser Bereich ist jedoch nur eine Richtlinie und kann nicht kritisch sein. Die Formulierung der Zubereitung ist nicht speziell beschränkt. So kann ein gefriergetrocknetes Mittel oder ein Mittel in Form eines Granulats, das einen Träger, wie ein Saccharid enthält, verwendet werden. Eine solche Zubereitung hat keine problematische akute Toxizität bei der oben erwähnten Verabreichung.
Adjuvantien, die dem erfindungsgemäßen Mittel zugesetzt werden können, um die CTL-Induzierbarkeit zu steigern, umfassen Mikroorganismen, wie BCG, ISCOM (8), QS-21 des Saponin-Typs (9), Liposome und Aluminiumhydroxid.
Ein immunologischer Aktivator kann als Adjuvans eingesetzt werden, beispielsweise Lentinan, Schizophyllan und Picibanil. Zytokine, welche das Wachstum. oder die Differenzierung von T-Zellen erhöhen, wie IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6 und TNF können ebenfalls als Adjuvantien verwendet werden.
Es wurde berichtet (op cit supra und 10), daß die Immunantwort von CTL oder dergleichen in vivo mit Hilfe der vorstehend angegebenen Methode induziert werden kann.
Es ist möglich, daß das betreffende Antigenpeptid in vitro zu Zellen, die von dem Patienten erhalten wurden, oder Zellen, welche den gleichen HLR-Haplotyp haben, zugesetzt wird, um das Antigen zu präsentieren, wonach diese Zellen in ein Blutgefäß des Patienten eingebracht werden, um wirksam CTL im Körper des Patienten zu induzieren. Es ist auch möglich, daß das jeweilige Peptid zu peripheren Blutlymphozyten des Patienten gegeben wird und die das Peptid enthaltenden Lymphozyten in vitro inkubiert werden, um CTL in vitro zu induzieren, wonach die resultierenden Lymphozyten in ein Blutgefäß des Patienten zurückgeführt werden. Die Behandlung durch eine solche Zellübertragung wurde bereits als Krebstherapie praktisch durchgeführt und ist dem Fachmann gut bekannt.
DNA, die das erfindungsgemäße Magenkrebs-Antigenpeptid kodiert, kann in einen geeigneten Vektor eingefügt werden. Viren, wie Vaccinia-Virus oder Bakterien, wie BCG, welche diese rekombinante DNA enthalten, können wirksam als Lebendvaccine zum Verhüten oder Behandeln von Magenkrebs verwendet werden.
Wenn (i) DNA, die das Peptid der durch SEQ ID NO:1 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert, oder (ii) DNA, die ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die durch Modifizieren eines Teils der Sequenz von SEQ ID NO:1 erhalten wurde (beispielsweise ein Peptid der durch SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz) in ein Antigenproteingen eingeführt wird, welches in einem rekombinanten Virus oder einem rekombinanten Bacterium exprimiert wird, wird diese Peptidsequenz als Teil des Antigenproteins exprimiert, danach in den Zellen prozessiert und dem HLA-Antigen präsentiert, wodurch es möglich wird, CTL zu induzieren, welche das Peptid erkennen.
Die Dosis und die Verabreichungsmethode des Mittels sind die gleichen wie bei der üblichen Impfung oder Verabreichung von BCG-Vaccinen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele spezieller erläutert.
Beispiel 1
Reinigung des Tc-HST-2-Immunantwort-Peptids aus HST-2 und dessen Identifizierung: HST-2-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/ml) wurden in 50 ml eines 10% FCS-enthaltenden RPMI1640-Mediums (mit einem Gehalt an 2-mM Glutamin, 5 × 10⁵ M 2 ME, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 16 mM NaHCO₃) in einem 175 ml Kunststoffinkubator (Kat. Nr. 3028, hergestellt von Falcon) eingeimpft und wurden in Gegenwart von 5% CO₂-Gas in Luft 4 Tage lang bei 37°C inkubiert.
Nach Beendigung der Inkubation wurde der gebildete Überstand entfernt und der Rückstand wurde mit PBS (–) gewaschen. Dann wurden 20 ml einer 0,1%igen TFA-Lösung zugesetzt und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Ein HLA-gebundenes Peptid wurde von dem HLA-Molekül freigesetzt. Das freigesetzte HLA-gebundene Peptid wurde bei 10,000 × g 15 Minuten lang zentrifugiert, um den Zellrückstand abzutrennen.
20 ml der wie angegeben durch Inkubieren von HST-2 erhaltenen Lösung des HLA-gebundenen Peptids wurden gefriergetrocknet und in 5 ml einer 0,1%igen TFA-Lösung gelöst. 1 ml dieser Lösung des HLA-gebundenen Peptids wurde mit einer Umkehrphasen-HPLC-Kolonne behandelt (μ BONDSHERE; 5 μ C18-300 A, 19 mm × 150 mm). Die Umkehrphasen-HPLC-Kolonne war vorher mit destilliertem Wasser, das 0,1% TFA enthielt, equilibriert worden und die gewünschte Substanz wurde durch lineare Erhöhung der Konzentration von Acetonitril in 0,1% TFA von 0 bis 80% eluiert. Dieser Vorgang wurde bei einer Fließrate von 1 ml/min. durchgeführt. Das Eluat wurde in Anteilen von je 1 ml gewonnen.
Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde insgesamt 10 mal wiederholt. Fraktionen, welche die gleiche Retentionszeit hatten, wurden gewonnen und gefriergetrocknet. In den Elutionsmustern von HPLC in den vorstehend beschriebenen Vorgängen wurde keine wesentliche Differenz gefunden. Die Elutionsmuster von HPLC sind in 1 gezeigt.
Die CTL-Induzierbarkeit der HPLC-Elutionsfraktionen gegen Tc-HST-2-Zellen wurde in folgender Weise gemessen. 1 × 10⁶ HST-2 oder KG-1-Zellen, die HLA-A31-Antigen exprimieren, als Ziel-T-Zellen, wurden in einem 10% FCS-enthaltenden RPIM-Medium suspendiert, so daß die Anzahl der Zellen 1 × 10% Zellen/ml betrug. Zu der Suspension wurden 100 μl eines Gemisches aus Natriumchromat, das SiCr enthielt, und PBS gegeben und das resultierende Gemisch wurde in Gegenwart von 5% CO₂ 3 Stunden bei 37°C inkubiert, um die ⁵¹Cr-Markierung durchzuführen. Die ⁵¹Cr-markierten Zellen (1 × 10⁴ Zellen) wurden in 100 μl der Lösung suspendiert. 3 ml der das HLA-gebundene Peptid, das durch HPLC abgetrennt worden war, enthaltenden Lösung, wurden zugesetzt und das Gemisch wurde weiter unter den gleichen Bedingungen 3 Stunden lang inkubiert, wodurch das HLR-gebundene Peptid an das HLA-Molekül gebunden wurde.
Danach wurden Tc-HST-2-Zellen (2,5 × 105 Zellen/ml) in einer Menge von 100 μl zugesetzt und das Gemisch wurde unter den gleichen Bedingungen während 12 Stunden inkubiert. Nach einer 12-stündigen Inkubierung wurden 100 μl des gebildeten Überstands gewonnen und die in diesem Überstand freigesetzte Radioaktivität von ⁵¹Cr wurde mit Hilfe eines γ-Zählers gemessen, um die CTL-Aktivität zu messen.
Die spezifische Zytotoxizität wurde mit Hilfe der folgenden Formel errechnet.
wobei
der Mindest-Freisetzungswert den Meßwert von ⁵¹Cr angibt, der natürlich von den Ziel-T-Zellen in einer Vertiefung, die nur mit den Ziel-T-Zellen gefüllt ist, freigesetzt wird,
der maximale Freisetzungswert den Meßwert für ⁵¹Cr anzeigt, wenn die Zellen durch Zugabe des oberflächenaktiven Mittels 1% Triton X-100 zu den Ziel-T-Zellen zerstört wurden.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Wie aus 2 ersichtlich ist, wurde die CTL-Induzierbarkeit in der durch HPLC eluierten 12. Fraktion beobachtet.
Die 12. Fraktion, in der die CTL-Induzierbarkeit von Tc-HST-2 identifiziert wurde, wurde weiter mit Hilfe einer Umkehrphasen-HPLC-Kolonne (μ BONDSHERE, 5 μ C18-300A, 19 mm × 150 mm) behandelt. Die Umkehrphasen-HPLC-Kolonne war vorher mit 0,1% TFR enthaltendem destilliertem-Wasser equilibriert worden und danach wurde die gewünschte Substanz durch lineares Erhöhen der Konzentration von Acetonitril in einem 0,1% TFA enthaltenden Elutionsmittel von 0 bis 40% eluiert. Dieses Verfahren wurde mit einer Fließrate von 1 ml/min. durchgeführt. Das Eluat wurde in Anteilen von jeweils 1 ml gewonnen. Die obige Verfahrensweise wurde insgesamt 10 mal wiederholt. Fraktionen, welche die gleiche Retentionszeit zeigten, wurden gewonnen und gefriergetrocknet. Es wurde keine wesentliche Differenz in den Elutionsmustern von HPLC in den vorstehend erwähnten Verfahren festgestellt. Die Elutionsmuster von HPLC sind in 3 gezeigt.
Die CTL-Induzierbarkeit von Tc-HST-2-Zellen in den HPLC-Elutionsfraktionen wurde mit Hilfe der vorstehend erwähnten Methode gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Wie aus 4 ersichtlich ist, wurde die CTL-Induzierbarkeit in der durch HPLC eluierten 17. Fraktion identifiziert.
Die 17. Fraktion, deren CTL-Induzierbarkeit identifiziert worden war, wurde mit Hilfe einer analytischen Umkehrphasen-HPLC-Kolonne getrennt (ZORBAX, ODS-Kolonne, 4 mm × 250 mm). Die Umkehrphasen-HPLC-Kolonne war vorher mit 0,1% TFA enthaltendem destilliertem Wasser equilibriert worden und die gewünschte Substanz wurde danach durch lineares Erhöhen der Konzentration von Acetonitril in dem 0,1% TFA enthaltenden Elutionsmittel von 0 bis 60% eluiert. Dieses Verfahren wurde bei einer Fließrate von 1 ml/min. durchgeführt, wobei ein Hauptpeak erhalten wurde.
Dieser Peak wurde entnommen und in eine Protein-Sequenziervorrichtung (477A, hergestellt von ABI) eingeführt. Die Aminosäuresequenz wurde mit Hilfe der Edman-Abbaumethode bestimmt. Die Aminosäuresequenz des N-Terminals ist durch SEQ ID NO:1 der Sequenzliste dargestellt.
Beispiel 2
Synthese eines Magenkrebs-Antigenpeptids und Messung der CTL-Induzierbarkeit
Ein synthetisches Peptid 1, das die gleiche Aminosäureasequenz wie die durch SEQ ID NO:1 dargestellte hat, und drei Arten von Peptiden, welche die 9. bis 7. Aminosäure vom N-Terminal dieses synthetischen Peptids 1 enthalten, nämlich Peptid 1-9 (SEQ ID NO:2), Peptid 1-8 (SEQ ID NO:3) und Peptid 1-7 (SEQ ID NO:4), wurden unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthesegeräts (477A, hergestellt von ABI) gemäß dem Protokoll in der Gebrauchsanweisung dieser Vorrichtung hergestellt.
Diese synthetischen Peptide wurden aus dem Harz ausgeschnitten und mit Hilfe eines Gemisches von TFA und trockenem Ether umgefällt. Sie wurden durch Umkehrphasen-HPLC als einzelne Komponenten identifiziert und wurden weiterhin mit Hilfe eines Massen spektrometers identifiziert. Danach wurden sie der CTL-Prüfung unter Verwendung der TNF-Freisetzungsmethode unterworfen.
1 × 104 HST-2-Zellen, welche HLA-A31-Antigen exprimieren, wurden als Ziel-T-Zellen in 100 μl der Lösung suspendiert und 5 μl jedes der oben erwähnten vier synthetischen Peptide wurden derart zugesetzt, daß die Endkonzentration 10 μM, 1 μM oder 0,1 μM erreichte. Das Gemisch wurde weiter unter den gleichen Bedingungen während drei Stunden inkubiert, um das HLA-gebundene Peptid an das HLA-Molekül zu binden. Danach wurden Tc-HST-2-Zellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) in einer Menge von 100 μl zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde 12 Stunden unter den gleichen Bedingungen weiter inkubiert.
Nach der 12-stündigen Inkubierung wurden 30 μl des gebildeten Überstands gewonnen und die in den Überstand freigesetzte TNF-Aktivität wurde gemessen, um die CTL-Induzierbarkeit zu bestimmen. Die TNF-Aktivität wurde mit Hilfe folgender Methode gemessen.
7 × 10⁴ Wehi 164-Zellen, die TNF-empfindliche Zellen sind, wurden in 120 μl der Lösung suspendiert und 30 μl des vorstehend erhaltenen Überstandes wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang inkubiert. Nach Beendigung der Inkubierung wurden 5 mg/ml MTT in einer Menge von jeweils 10 μl in jede Vertiefung gegeben und das Gemisch wurde weiterhin drei Stunden inkubiert. Anschließend wurden 150 μ Propanol mit einem Gehalt an 0,01 Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, um das während der Inkubierung gebildete Formazan zu lösen. Dann wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen, um die TNF-Aktivität festzustellen.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Wie aus 5 ersichtlich ist, wurde CTL-Induzierbarkeit von TC-HST-2 in den synthetischen Peptiden 1 und 1-9 festgestellt.
Beispiel 3
Expression von Magenkrebs-Antigenpeptid in dem menschlichen Magenkrebs-Zellstamm MKN28:
Um festzustellen, ob ein durch TC-HST-2 erkanntes Magenkrebs-Antigenpeptid in anderen Magenkrebszellstämmen als HST-2 exprimiert wird, wurde die Zytotoxizität von TC-HST-2 gegen MKN28, einem HLA-A31-negativen menschlichen Magenkrebs-Zellstamm, mit Hilfe der S1Cr-Freisetzungsmethode bestimmt. Der Nachweis der CTL-Aktivität durch die S1Cr-Freisetzungsmethode wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. TC-HST-2 zeigte keine Zytotoxizität gegen die MKN28-Zellen, welche HLA-A31 nicht exprimierten. Andererseits zeigte TC-HST-2 ausgeprägte Zytotoxizität gegen MKN28 A31(+)cl-2 und MKN28 A31(+)cl-5, Unterlinien von MNK28, die durch Transfizieren von Plasmid pBJ-A31, welches das HLA-A31-Gen enthält, in, MKN28 durch Elektroporation für die Expression von HLA-A31 gebildet wurden. Dies ist in 6 gezeigt.
Durch die vorstehend erwähnten Ergebnisse wurde festgestellt, daß das durch TC-HST-2 erkannte Magenkrebs-Antigenpeptid auch in MKN28 exprimiert wurde und daß dieses Peptid auch an das HLA-A31-Molekül gebunden wurde und durch TC-HST-2 erkannt wurde.
Wirkungen der Erfindung
Das erfindungsgemäße Peptid kann CTL gegen menschliche Magenkrebs-Zellen in vivo oder in vitro induzieren und von diesem Peptid selbst und dem dieses Peptid enthaltenden Mittel kann erwartet werden, daß sie als Mittel zum Verhindern oder zur Behandlung von menschlichem Magenkrebs wirksam sind. Darüber hinaus müßte ein Virus oder ein Bakterium, welches rekombinante DNA enthält, die das zur Induktion von CTL gegen menschliche Magenkrebszellen befähigte Peptid kodiert, in vivo oder in vitro pharmazeutische Wirksamkeit als Vaccine zur Prävention oder Behandlung von menschlichem Magenkrebs besitzen.
Literaturzitate

1. Medical Immunology, überarbeitete 3. Auflage, zusammengestellt von Kikuchi Kokichi
2. Human Leucocyte Antigen, Modern Immunology, 2. Auflage, zusammengestellt von Yamamura Yuichi und Tada Tomio
3. J. Immunol. Meth. 154, 235–243, (1992), und Cancer 75, 1484-1489, (1995).
4. J. Immuno1. Meth., Bd. 154, S. 235–243 (1992); und Jpn. J. Cancer Res., Bd. 84, S. 906–913 (1993).
5. Cancer, Bd. 75, S. 1484–1489 (1995)
6. Science, Bd. 249, S., 283–287 (1990).
7. Immunogenetics, Bd. 35, S. 145 (1992).
8. Nature, Bd. 344, S. 873 (1990)
9. J. Immunol., Bd. 148, S. 1438 (1992)
10. Science, Bd. 255, S. 333 (1992)

Sequenzliste

Claims

Zusammensetzung, die ein Peptid enthält, welches ein Fragment eines in einer menschlichen Magenkrebszelle vorhandenen Magenkrebsantigenproteins ist, wobei das Peptid an HLA-A31 gebunden ist und die Antwort einer cytotoxischen T-Zelle, deren Zielzelle eine Magenkrebszelle ist, induzieren kann, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die durch SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 dargestellt ist.
Mittel zum Verhindern oder Behandeln eines menschlichen Magenkrebses, wobei das Mittel ein Peptid enthält, welches ein Fragment eines in einer menschlichen Magenkrebszelle vorhandenen Magenkrebsantigenproteins ist, wobei das Peptid an HLA-A31 gebunden ist und die Antwort einer cytotoxischen T-Zelle, deren Zielzelle eine Magenkrebszelle ist, induzieren kann, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die durch SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 dargestellt ist.
Peptid, welches ein Fragment eines in einer menschlichen Magenkrebszelle vorhandenen Magenkrebsantigenproteins ist, wobei das Peptid, wenn es an HLA-A31 gebunden ist, die Antwort einer cytotoxischen T-Zelle, deren Zielzelle die Magenkrebszelle ist, induzieren kann, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die durch die SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 dargestellt ist.
DNA, die das Peptid nach Anspruch 3 kodiert.
Impfstoff zum Verhindern oder Behandeln eines menschlichen Magenkrebses, wobei der Impfstoff einen rekombinanten Virus oder ein rekombinantes Bakterium mit der DNA nach Anspruch 4 enthält.