NO161601B

NO161601B - Fremgangsmaate for fremstilling av et glykorelatert antigen

Info

Publication number: NO161601B
Application number: NO822215A
Authority: NO
Inventors: Masakazu Adachi
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1981-10-01
Filing date: 1982-06-29
Publication date: 1989-05-29
Also published as: NZ201112A; MX7437E; SE8204058D0; DD209577A5; PT75148B; FI77157B; FR2513882B1; DE3249568C2; DD221917A5; AU554858B2; FR2513882A1; IT8248724A0; IL66270A; AT382080B; DE3236298A1; CH655660B; FI77157C; ATA363782A; AU8545882A; BE893704A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et glykolrelatert antigen (GRA) som sensitiverer lymfocytter til kreftcellecytotoksiske lymfocytter, og som også i seg selv kan anvendes som et anti-kreftmiddel, og det karakteristiske ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at GRA isoleres fra humane eller muse-kreftcellemembrankomponenter ved affinitetskromatografering på en peanøttlektin-(PNA)- og/eller Dolichos bønneagglutinin-lektin-(DBA)-holdig uoppløselig bærer.

Det er kjent at immunrespons-effektorceller, spesielt T-lymfocytter spiller en hovedrolle i celle-formidlet immunrespons, bevirker avstøtning av podninger som skyldes fremmedcelle-antigener, men fremviser ikke noen særlig eller meget begrenset inhibering mot kreftceller. Kreftcellene blir således ikke ødelagt og formerer seg in vivo og fører endelig til døden for den kreftbærende vertsorganisme.

Den mekanisme som er ansvarlig for å skille mellom selv og ikke-selv er ikke fullstendig klar og forskjellige under-søkelser har vært foretatt for å skaffe innsikt i naturen av den materialbasis som er involvert i dette system, f. eks celleoverflatemarkører på mus-leukemia-celler eller embryo-nale karcinom-celler under anvendelse av lektiner som f. eks Dolichos bønneagglutinin (DBA) og peanøtt-agglutinin (PNA) som beskrevet i Biochem. Biophys. Res. Comm. 89 (2) 448 - 455

(1979), Ibid. 96 (4) 1547 - 1553 (1980), J. Biochem. 89 473 - 481 (1981) og Cell 18 183 - 191 (september 1979).

Såvidt vites har det imidlertid ikke vært noen særlig forsøk på å tilveiebringe nye lymfocytter som kan bekjempe kreftceller spesifikt og også tilveiebringe anti-kreftmidler under anvendelse av immunrespons i lymfocytter.

Som et resultat av omfattende studier vedrørende immunrespons for vertsorganismen til kreftceller og dens anvendelse for behandling av kreft, er det nå funnet at i et kreftcelle-spesifikt antigen som ikke finnes i differensierte normale celler, er der GRA som virker som et immunogen for vertsorganismen og har meget høy immunogenisitet som bevirker en immunrepons som er spesifikk for kreftcellene. Det er videre funnet at når GRA anvendes for sensitivering av lymfocytter kan det oppnås kreftcellecytotoksiske lymfocytter som virker spesifikt på kreftceller inneholdende GRA og hvis de krefcellecytotoksiske lymfocytter tilføres verten, gjen-kjenner de GRA og virker på kreftcellene inneholdende GRA og ødelegger dem og de fremviser således en utmerket virkning ved behandling og forhindring av kreft.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er' et mikrofotografi av Daudi-kreftceller.

Fig. 2 er et mikrofotografi som illustrerer dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftcellene i fig. 1.

Fig. 3 er et mikrofotografi av KATO-III kreftceller.

Fig. 4 er et mikrofotografi som illustrerer dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftcellene i fig. 3.

Fig. 5 er et mikrofotografi av BT-I kreftcelle.

Fig. 6 er et mikrofotografi som viser dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftcellene i fig. 5.

Fig. 7 er et mikrofotografi av MKN-45 kreftceller.

Fig. 8 er et mikrofotografi som viser dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftceller i fig. 7.

Fig. 9 er et mikrofotografi av MOLT kreftceller.

Fig. 10 er et mikrofotografi som viser dannelsen av plater av GRA-1-K-T i kreftcellene i fig. 9. Fig. 11 er et mikrofotografi av BT-1 behandlet med en blanding av usensitiverte human periferale blod-lymfocytter. Fig. 12 og 13 er hver et mikrofotografi av kreftcellevevet i kreftbærende mus tilført GRA-M-1-K. Fig. 14 er et mikrofotografi som viser tilstanden for kreft i en kreft-bærende musegruppe som tilføres GRA-M-1. Fig. 15 er et mikrofotografi som viser krefttilstanden i en kreftbærende musegruppe som ikke tilføres GRA-M-1. Fig. 16 er et mikrofotografi som viser kreftcellevevet i en kreftbærende musegruppe som ikke tilføres GRA-M-1. Fig. 17 er et mikrofotografi av kreftcelle-vevet av gruppen som tilføres GRA-M-1. Fig. 18 viser et SDS gel-elektroforesediagram av GRA under anvendelse av proteinfarging ved hjelp av C.B.B.-metoden. Fig. 19-21 viser SDS gel-elektroforesediagrammer av slik GRA under anvendelse av sukkerfarging ved hjelp av PAS-metoden. Fig. 22 er en skjematisk illustrasjon av resultatene av SDS gel-elektroforesediagram av GRA under anvendelse av proteinfarging ved hjelp av C.B.B.-metoden, og Fig. 23 representerer en grafisk fremstilling som viser tumor-vekst-takten i C3H/HE mus transplantert med X5563 immune muse-miltceller og X5563-celler.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Kreftcellecytotoksiske lymfocytter kan fremstilles f. eks ved hjelp av en metode hvor GRA anvendes for å sensitivere lymfocytter.

GRA anvendt i denne metode kan oppnås fra humane kreftceller inneholdende GRA, fra mennesker og dyr, særlig mus, f. eks dyrkede kreftceller, transplanterte kreftceller, spontant-forekommende kreftceller, kjemisk substans- eller virus-induserte kreftceller, og kreftceller avledet fra operert vev, ved hjelp av den følgende metode.

Cellemembrankomponenter separeres fra kreftceller som beskrevet i det foregående og behandles med et lektin som kombinerer spesifikt med en terminal galaktose eller et termianalt N-acetylgalaktosamin, hvorved GRA kombineres med lektinet og lett kan separeres.

Eksempel på galaktosebindende lektin inkluderer peanøttlektin (PNA), (Se J.B.C. 250, 8518 - 8523 (1975), Z. Immunitaets-forsch, 138, 423 - 433 (1969), Br. J. Exp. Pathol, 27, 228 - 236 (1946), Proe. Nath. Acad. Sei. USA, 75, No. 5, 2215 - 2219 (1978), Biochemistry, 13, 196 - 204 (1974), og Carbo-hydrate Research, 51, 107 - 118 (1976)). Eksempler på N-acetylgalaktosamin-bindende lektin inkluderer Dolichos-bønne (Dolichos biflorus) agglutinin (DBA).

Separeringen av kreftcellemembrankomponentene kan oppnås ved hjelp av kjent teknikk som f. eks homogeniseringsmetoden og en oppløsningsmetode under anvendelse av et oppløsnings-middel. Det er mer fordelaktig å anvende en metode hvor kreftceller homogeniserer i fysiologisk saltløsning eller i en passende buffer, en del av det utfelte samles ved hjelp av en teknikk som f. eks sentrifugalseparering og oppløses i fysiologisk saltløsning eller en buffer ved anvendelse av er oppløsningsmiddel, og supernatantdelen separeres ved hjelp av en teknikk f. eks sentrifugalseparering. Oppløsningsmidler som kan anvendes inkluderer overflateaktive midler som er generelt kjent å kunne oppløse cellemembranene, som f. eks ikke-ioniske overflateaktive midler, f. eks "TRITON X-100", "NP-40" digitoni og urea, samt anioniske overflateaktive midler, f. eks natriumdodecylsulfonat (SDS).

Fra de således oppnådde kreftcellemembrankomponenter isoleres

da GRA som er i stand til å kombinere med lektinet ved anvendelse av affinitetskromatografering under anvendelse av en kolonnebærer inneholdende lektin. Kolonnebæreren kan lett fremstilles ved immobilisering av lektin på en uoppløselig bærer. Slik immobilisering av lektin på en uoppløselig bærer kan gjennomføres ved kjente metoder som anvendes konven-

sjonelt ved immobilisering av biosubstanser. Av disse metoder foretrekkes anvendelse av en cyanbromid-aktiverings-poly-sakkaridmetode og en immobiliseringsmetode under anvendelse av N-hydroksysuccinimidestere. Cyanbromid-aktiverings-polysakkaridmetoden er en metode hvori en uoppløselig bærer behandles med cyanbromid og det aktiverte produkt oppnådd på

denne måte underkastes en koblingsreaksjon med lektin under milde betingelser for immobilisering av lektinet. Ved behandling av den uoppløselige bærer med cyanbromid, anvendes f. eks basiske forbindelser som natriumhydroksyd og natriumhydrogenkarbonat for å innstille pH fra 7,5 til 12, og bæreren behandles i et løsningsmiddel som f. eks vann,

acetonitril, eller en buffer holdt ved 7,5 til 12, f. eks en 0,1 M natriumhydrogenkarbonat-buffer (pH omtrent 8,7) og en 0,01 M fosfatbuffer (pH omtrent 7,7) ved romtemperatur i 1 til 12 minutter. Vanligvis er den mengde cyanbromid som anvendes foretrukket tilsvarende mengden av den uoppløselige bærer.

En hvilken som helst kjent uoppløselig bærer som har lav ikke-spesifikk adsorbsjon til alle biosubstanser, har høy porøsitet, inneholder en funksjonell gruppe som er i stand til immobilisering av biosubstanser under milde betingelser,

og er kjemisk og fysikalsk tilstrekkelig stabil kan anvendes ved oppfinnelsen. Uoppløselige bærere som kan anvendes inkluderer en bærer fremstilt av cellulose, f. eks amino-etylcellulose, karboksymetylcellulose, bromacetylcellulose og p-anilin-cellulose, en bærer av fornettet dekstran, f. eks "Sephadex" og "CM-Sephadex" og en bærer av agarose, f. eks "Sepharose 2B", "Sepharose 4B" og "Sepharose 6B".

Ved koblingsreaksjonen av den cyanbromid-aktiverte bærer som oppnådd ovenfor med lektin anvendes den cyanbromid-aktiverte bærer som i en mengde på fra 30 til 80 ganger lektinmengden og de omsettes i et passende løsningsmiddel som f. eks en 0,01 mol/l vandig løsning av natriumhydrogen-karbonat (inneholdende 0,5 mol/l natriumklorid, pH 8,4) ved en temperatur på fra 0 til 40°C, foretrukket fra 2 til 8°C i en periode på fra 10 til 20 timer. På denne måte kan det fremstilles en bærer for affinitetskromatografering inneholdende lektin.

Ved affinitetskromatografering under anvendelse av den lektinholdige bærer som fremstilt ovenfor kombinerer det ønskede GRA med lektinet inneholdt i bæreren og innesperres i kolonnen. Deretter kan substanser som er i stand til å kombinere med f. eks lektin føres gjennom kolonnen for å gjennomføre en utvekslingsreaksjon, eller alternativt føres en adsorbsjonsseparator (eluerende oppløsning), f. eks en saltoppløsning med høy konsentrasjon, en vandig oppløsning av kaliumtiocyanat eller en nitratbuffer gjennom kolonnen for dissosiering og erholdelse av ønsket GRA.

Ved utvekslingsreaksjonen inkluderer eksempler på substanser som er i stand til å kombinere med lektin når en bærer for affinitetskromatografering inneholdende galaktosebindende lektin anvendes, de substanser som kan kombinere med et terminalt galaktosekombinerende lektin, f. eks galaktose, disakkarider inneholdende en terminal galaktose og oligosakkarider inneholdende en terminal galaktose, og eksempler på substanser i stand til å kombinere med lektin når en bærer for affinitetskromatografering inneholdende N-acetylgalaktosamin-bindende lektin anvendes inkluderer substanser som kan kombinere med et terminalt N-acetylgalaktosamin-kombinerende lektin, f. eks N-acetylgalaktosamin, disakkarider inneholdende et terminalt N-acetylgalaktosamin og oligosakkarider inneholdende et terminalt N-acetylgalaktosamin.

Det således oppnådde GRA inneholder glykoprotein inneholdende galaktose og/eller N-acetylgalaktosamin-terminus, glykolipid og/eller sakkarid.

Det således fremstilte GRA kan frysetørres om ønsket og ytterligere renses under anvendelse av ordinære separasjons-metoder. F. eks kan de GRA-preparater som isoleres med et galaktose-bindende lektin underkastes en separasjonsmetode under anvendelse av et N-acetylgalaktosamin-kombinerende lektin, og de preparater som isoleres med et N-acetylgalaktosamin-kombinerende lektin kan behandles ved hjelp av en separasjonsmetode under anvendelse av et galaktosebindende lektin.

Lymfocytter som anvendt heri er ikke kritiske, og hvilke som helst lymfocytter fra normale eller kreft-bærende mennesker eller dyr kan anvendes. Eksempler inkluderer slike lymfocytter som oppnås fra perifert blod, benmarg, lymfeknuter, milt, mandler og thymus. Disse lymfocytter isoleres ved hjelp av fysikalske eller kjemiske metoder, en overflatemembran-metode eller lignende.

Sensitivering av lymfocytter med GRA gjennomføres ved dyrking av lymfocytter på et dyrkingsmedium inneholdende GRA i en periode på fra ltillO døgn, foretrukket fra 2til7 døgn.

Som dyrkingsmedia for bruk ved sensitiveringen av lymfocytter kan anvendes foreskjellige vanlige næringsmedia som kon-vensjonelt anvendes ved celledyrking. Foretrukne eksempler inkluderer et RPMI 1640 medium, en Eagle MEM kultur, etc. med human serum, føtalt kalveserum (FCS), kalveserum, hesteserum eller lignende tilsatt dertil. Mengden av GRA som tilsettes til dyrkingen er vanligvis fra 1 til 1.000 ng/ml og foretrukket fra 5 til 500 ng/ml, beregnet som en mengde av sukker pr 1 x 10<6>/ml lymfocytt.

Dyrkingen gjennomføres ved hjelp av den vanlige metode,

f. eks ved pH omtrent 7,2 og en temperatur på omtrent 37°C.

De kreftcellecytotoksiske lymfocytter er hovedsakelig normale lymfocytter og har en GRA-spesifikk cellebekjempende aktivitet. F. eks har GRA-1-K-T, som er en av de kreftcellecytotoksiske lymfocytter, egenskaper felles med humane perifere blod T-celler og viser en cellebekjempende aktivitet som er spesifikk mot kreftceller inneholdende GRA, som er vist i det eksempel som er beskrevet senere.

Typiske eksempler på kreftcellecytotoksiske lymfocytter er GRA-1-K-T og GRA-M-1.

De kreftcellecytotoksiske lymfocytter kan formeres ubegrenset på det ovenfor beskrevne dyrkingsmedium inneholdende en T-cellevekstfaktor (TCGF, IL-2). Den selektive dyrking av kloning av de kreftcellecytotoksiske lymfocytter kan gjennomføres ved den konvensjonelle ultra-fortynningsmetode, og lymfocyttene kan lagres stabilt over et langt tidsrom, f. eks i flytende nitrogen.

GRA fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse kan anvendes separat som en aktiv bestanddel og kan dertil anvendes i kombinasjon med andre anti-bakterielle midler og kreft-inhiberende midler. Kreftinhiberende midler inneholdende GRA som en aktiv bestanddel kan ha en hvilken som helst form bare de er i den tilstand at GRA inneholdes i effektive mengder. Vanligvis tilføres midlet intravenøst, subkutant, intradermalt eller intramuskulært som en opp-løsning, suspensjon eller emulsjon. I tillegg kan det leveres som et tørt produkt som kan gjøres flytende ved tilsetning av en passende bærer før bruk. Disse flytende midler kan inneholde et suspensjonsmiddel, f. eks metyl-cellulose, et emulgeringsmiddel, f. eks lecitin, konser-veringsmidler som f. eks metyl-p-hydroksybenzoat, et stabiliseringsmiddel som ikke utøver som sådant skadelig innvirkning på den immuniserende funksjon av mennesker eller dyr, en buffer, og lignende.

Vandige bærere som kan anvendes inkluderer fysiologisk saltløsning, og ikke vandige bærere som kan anvendes inkluderer vegetabilsk olje, f. eks sesamolje, mineralolje som f. eks paraffin, animalsk olje som f. eks squalen. og propylenglykol. I tillegg, for immunologisk forbedring, kan passende tilsetningsmidler innlemmes. Tilsetningsmidler, som kan anvendes inkluderer "Freunds" komplette tilsetningsmidler, saponin for dyr og aluminiumhydroksyd for mennesker.

Det kreftinhiberende middel inneholdende GRA kan tilføres en gang eller gjentatte ganger over en lang tidsperiode til kreftpasienter for behandling av kreft, eller kan tilføres personer som er i ferd med å få kreft for prevensjon av denne.

Da LD50 (mus, intraperitonealt) av GRA er minst 500 mg/kg beregnet som en mengde av sukker, har det kreftinhiberende middel lav giftighet og kan derfor tilføres innefor vide doseringsområder. Selv om konsentrasjonen av GRA i det kreftinhiberende middel ikke er kritisk, foretrekkes vanligvis en konsentrasjon i området 0,001till00 ug/ml beregnet som en mengde sukker. Med hensyn til dosen av det kreftinhiberende middel foretrekkes det vanligvis at dette tilsettes i en mengde på 0,001 til 1.000 ug/kg/døgn, samtidig eller i flere porsjoner, selv om dette varierer avhengig av graden av sykdom, alder og kjønn av pasienten.

Gra kan anvendes for sensitivering av lymfocytter til kreftcellecytotoksiske lymfocytter. Slike kreftcellecytotoksiske lymfocytter i form av et kreftinhiberende middel anvendes foretrukket som en injiserbar oppløsning i kombinasjon med bærere som anvendes ved fremstilling av slike blodmedisiner. Bærere som anvendt heri er ikke kritiske, men bærere med en tonisitet tilsvarende blodets foretrekkes. Spesielt foretrekkes fysiologisk saltløsning. Ved fremstilling av midlet foretrekkes det at de kreftcellecytotoksiske lymfocytter vaskes tilstrekkelig med fysiologisk saltløsning eller lignende for å fjerne det ovenfor beskrevne dyrkingsmedium og deretter bringes til å flyte i en bærer.

Konsentrasjonen av kreftcellecytotoksiske lymfocytter i midlet er ikke spesifikt begrenset, men er foretrukket fra IO<5> til 10^ pr ml. Når de kreftcellecytotoksiske lymfocytter tilføres intraperitonealt i en dose på 10^ pr mus, iakttas ingen giftighet. Selv om dosen av det kreftinhiberende middel fremstilt på basis av de kreftcellecytotoksiske lymfocytter varierer avhengig av graden av sykdom, alder og kjønn av pasienten, foretrekkes det vanligvis at midlet tilføres i en dose på lO^tillO^-^/kg/døgn i en porsjon eller i oppdelte porsjoner.

De følgende eksempler, undereksempeler, testeksempler og referanstest gis for å illustrere oppfinnelsen mer detaljert.

UNDEREKSEMPEL 1

Lokalitet av GRA

(1) - A Fremstilling av FITC-merket lektin (PNA-FITC).

10 mg peanøttlektin (PNA), ble oppløst i 2 ml av en 0,01 M fosfatbuffer inneholdende 0,85 % NaCl (pH = 7,2). I 1 ml av en 0,5 M hydrogenkarbonatbuffer (pH = 9,0) ble oppløst 2 mg FITC, og en 0,5 ml porsjon av den resulterende oppløsning ble tilsatt til den ovenfor fremstilte PNA-buffer. Blandingen ble så omrørt ved romtemperatur i 2 timer og ble deretter

separert på "Sephadex G25" (10 mm x 300 mm). Den initiale topp ble oppsamlet. FITC/PNA forhold = 1,0.

(1) - B Fremstilling av FITC-merket lektin (DBA-FITC).

På samme måte som i (l)tilA ovenfor ble DBA-FITC oppnådd under anvendelse av DBA. FITC/DBA forhold = 0,9. (1) - C Soyabønne-agglutinin FITC (FITC-SBA). FITC/SBA forhold = 1,4.

(2) Lokalitet av GRA i forskjellige kreftceller.

(a) Dyrkede human-kreftceller (1*10^) ble vasket tre ganger med en 0,05 M tris saltsyrebuffer inneholdende 0,85 % NaCl (pH = 7,2) ved hjelp av en sentrifugeringsmetode og deretter ble 100 pl PNA-FITC, DBA-FITC eller SBA-FITC (200 ug/ml) fremstilt som ovenfor under (1) tilsatt dertil. Den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i 30 minutter for å bringes til reaksjon. Etter fullført reaksjon ble reak-sjonsblandingen vasket tre ganger med en 0,01 M fosfatbuffer inneholdende 0,85 % NaCl (pH =7,2) og deretter ble cellene anbragt på en glassplate og undersøkt under et fluorescens-mikroskop.

Mus X5563 og mus MH134 ble behandlet og undersøkt på samme måte som ovenfor.

Resultatene er vist i Tabell 1. De anvendte kreftceller er alle kjente og er erholdt fra First Pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University.

Resultatene er vist i Tabell 2. De maligne vev fra kreftpasienter var blitt oppnådd fra Kansai Medical University.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av GRA

(l)tilA Fremstilling av immobilisert lektin (PNA-"Sepharose")

3 g CNBr-aktivert "Sepharose 4B" ble fullstendig vasket med

1 mM HC1 og suspendert i 200 ml 0,1 M natriumhyrdrogen-karbonat (pH = 8,5). Deretter ble 5 ml av en 0,01 M fosfatbuffer (pH = 8,5) inneholdende 20 mg PNA tilsatt og blandingen ble reagert ved 25°C i 2 timer under leilighetsvis omrøring for fremstilling av PNA-"Sepharose". (l)tilB På samme måte som i (l)tilA ovenfor med unntagelse av at DBA anvendes i stedet for PNA, ble DBA-"Sepharose" oppnådd.

(2) Fremstilling av GRA

(a) BT-1 (Burkitt lymphom) celler (1,3 • IO<8>) ble vasket tre ganger med fysiologisk saltløsning og 30 ml av 0,01 M Tris-saltsyrebuffer (pH =7,4) inneholdende 2 % "TRITON X-100", 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 nffl MgCl2 ble tilsatt dertil. Blandingen ble omrørt ved 4°C i 15 minutter og ble så underkastet ultrasentrifugerende separasjon ved 100.000 x g. Av 28 ml av den således oppnådde supernatantvæske ble en

14 ml porsjon ført gjennom en kolonne (diameter 0,5, lengde

1 cm) for affinitetskromatografering, fylt med PNA-agarose-kuler som var blitt ekvilibrert med en Tris-saltsyrebuffer (pH =7,4) inneholdende 0,1 % "TRITON X-100" 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgCl2- Etter å ha vært vasket med den samme buffer som anvendt ovenfor, ble blandingen eluert med en 0,01 M Tris-saltsyrebuffer (pH = 7,4) inneholdende 0,1 M laktose, 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 og 0,1 % "TRITON X-100". Den således eluerte porsjon ble dialysert med en 0,01 M Tris-saltsyrebuffer inneholdende 0,85 % NaCl, 2 mM MgCl2 og 2mM CaCl2 i 48 timer til å gi 17 ml av en GRA-oppløsning. Med GRA-oppløsningen ble mengden av protein og mengden av sukker målt ved hjelp av Folin-Lowry-metoden henholdsvis fenol-svovelsyre-metoden og de ble funnet å være henholdsvis 644 ug og 120 ug. Dette omtales i det følgende som "GRA-1".

(b) C3H/He muse-mammakreftceller (MMT) (1 • 10<10>) ble vasket tre ganger med fysiologisk saltløsning og 30 ml av en 0,01 M Tris-saltsyrebuffer (pH = 7,4) inneholdende 2 % "TRITON X-100", 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgCl2 ble tilsatt dertil. Blandingen ble omrørt ved 4°C i 30 minutter. Deretter ble blandingen underkastet ultra-sentrifugeringsseparasjon ved 100.000 x g i 2 timer og deretter ble supernatantvæsken dialysert over natten med en 0,1 Tris-saltsyrebuffer

(pH = 7,4) inneholdende 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgCl2- Den således dialyserte væske ble inndampet til 3 ml og en 1 ml porsjon ble så ført gjennom en kolonne (diameter 0,5 cm, lengde 2 cm) for affinitetskromatografering, fylt med

den samme PNA-"Sepharose" som anvendt ovenfor som var blitt ekvilibrert med en Tris-saltsyrebuffer (pH = 7,4) inneholdende 0,005 % "TRITON X-100", 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgCl2. Etter fullstendig vasking med den samme buffer som anvendt ovenfor, ble den eluert med en 0,01 M Tris-saltsyrebuf f er (pH = 7,4) inneholdende 0,1 M laktose, 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 og 0,005 % "TRITON X-100" og den således eluerte porsjon ble dialysert i 48 timer med en 0,01 M Tris-saltsyrebuffer (pH = 7,4) inneholdende 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 og MgCl2 til å gi 2 ml av en GRA-oppløsning. Med den således oppnådde GRA-oppløsning var mengden av protein og mengden av sukker henholdsvis 156 ug og 94 ug. Denne omtales i det følgende som "GRA-M-1". (c) Omtrent 120 g (våt vekt) av KATO-III ble homogenisert i 100 ml PBS ved hjelp av en Waring-blander. Etter sentrifugering ved 100.000 x g i 1 time ble pelleten oppløst med 100 ml 2 % "TRITON X-100" i en 0,01 M Tris-HCl-buffer (pH = 7,6) inneholdende 0,15 M NaCl. Supernatanten samlet ved sentrifugering ved 100.000 x g i 1 time ble tilført en kolonne av PNA-"Sepharose 4B" (0,8 x 15 cm) ekvilibrert med 0,15 % "TRITON X-100" i 0,01 M Tris-HCl (pH =7,6) inneholdende 0,15 M NaCl. Etter vasking med 50 ml buffer ble GRA eluert med bufferen inneholdende 0,1 M laktose. Den eluerte GRA ble dialysert mot 0,85 % NaCl, konsentrert ved hjelp av "Sephadex" og lagret ved -20°C før bruk.

Mengdene av protein og sukker bestemt på samme måte som under (a) ovenfor ble funnet å være 2,0 mg, henholdsvis 0,8 mg. Dette omtales i det følgende som "GRA-2". (d) På samme måte som under (c) ovenfor ble følgende GRA-prøver oppnådd. (e) På samme måte som under (c) ovenfor med unntagelse av at MKN-45 (omtrent 29 g) ble anvendt i stedet for Kato-III, DBA-"Sepharose" oppnådd under (1)-B ovenfor ble anvendt i stedet for PNA-"Sepharose 4B" og eluering ble gjennomført med N-acetylgalaktosamin, ble det oppnådd et GRA-preparat med et proteininnhold på 0,03 mg og et sukkerinnhold på 0,01 mg. Dette omtales i det følgende som "GRA-8". (f) GRA-3 fremstilt under (d) ovenfor (5 ml) ble innført i en DBA-"Sepharose" kolonne og eluert med Tris-HCl-buffer (0,015 %) "Triton X-100", 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,85 % NaCl til å gi 4 ml fraksjoner nr ltill2. Fraksjoner nr ltil3 betegnes "GRA-3-A" og nr 4till2 betegnes "GRA-3-B". Deretter ble kolonnen eluert med samme buffer, men inneholdende 0,1 M N-acetylgalaktosamin til å oppnå fraksjoner som betegnes "GRA-3-C".

(g) SDS gel-elektroforese.

Hver av GRA-preparatene i samsvar med de ovennevnte metoder ble underkastet elektroforese i samsvar med metoden beskrevet av Fairbanks et al: Biochemistry, bind 10, side 2606, 1971. De oppnådde resultater er vist i fig. 18til22. I fig. 18till9 indikerer tallene ltil5 følgende: ltilstandard; 2tilGRA-M-3; 3tilGRA-7;

4tilGRA-l; og 5tilGRA-2.

I fig. 20 indikerer tallene ltil4 følgende:

ltilstandard; 2tilGRA-M-2; 3tilGRA-6;

4tilGRA-5.

I fig. 21 indikerer tallene ltil3 følgende:

ltilGRA-M-4; 2tilGRA-M-5; 3tilstandard.

I fig. 22 indikerer tallene ltil4 følgende:

ltilGRA-3; 2tilGRA-3-A; 3tilGRA-3~B;

4tilGRA-3-C.

Fig. 18 viser tilstanden for GRA underkastet proteinfarge-reaksjonen i henhold til C.B.B, metoden (Fairbanks et al. : Biochemistry, bind 10, side 2606, 1971). Fig. 19til21 viser tilstanden for kreftceller behandlet med sukker-fargereaksjon i henhold til PAS-metoden (R.M. Zacharius et al., Anal. Biochem., bind 30, side 148 (1962)). Fig. 22 viser em skjematisk illustrasjon av resultatene ved farging i samsvar med C.B.B.-metoden beskrevet ovenfor.

For standard-substanser gjengitt i det følgende ble det anvendt henholdsvis:

Fremstilling av kreftcellecytotoksiske lymfocytter ved hjelp av GRA oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse er gjenstand for avdelt ansøkning nr 85.3541 og behandles ikke detaljert her.

TESTEKSEMPEL 1

(i) "GRA-M-1" som oppnådd under Eksempel 1 ((2) (b)) ble fortynnet med fysiologisk saltløsning slik at mengdene av sukker og protein var 1,0 ug/ml, henholdsvis 1,6 ug/ml for derved å fremstille et anti-kreftmiddel nr 1. (ii) En kreftklump av C3H/He spontant opptredende brystkreft ble sterilt kuttet til 5 mm kubisk klump og transplantert inn under rygghuden av 10 C3H/He mus av samme stammer som ovenfor (7 uker gamle, hannmus). 7 døgn etter transplantasjonen ble fiksering og formering av tumoren bekreftet. 5 av musene ble hver tilført subkutant anti-kreftmiddel nr 1 som fremstilt under i) ovenfor i en dose på 300 ul pr døgn med 2 døgns mellomrom. De resterende 5 mus ble holdt som ubehandlede kontrolldyr. 10 døgn etter den første tilførsel ble tumoren skåret ut ved operasjon og den midlere vekt ble målt. Samtidig ble det gjennomført pato-histologisk undersøkelse.

Dette betyr at der var en 86,3 % reduksjon i tumoren. Pato-histologisk undersøkelse: I kontrollgruppen (Fig. 16) ble det tildannet fuglelignende kreftkropper og typen av vev var lik medulær kanalikulær kreft og formering av kreftcellene ble iakttatt over hele vevet. På den annen side, i den gruppe som har tilført midlet (Fig. 17) bevirket krefcellene likvifiserende nekrose av de steder hvor kreftcellene ble- dannet, og kalsifisering og fibrose opptrådte, etterlatende bare en meget begrenset mengde av kreftceller. På denne måte ble anti-tumoregen-skapene av anti-kreft-midlet fremstilt på basis av oppfinnelsen iakttatt.

TESTEKSEMPEL 2 (H-2 forsøk)

GRA-M-1, GRA-M-3 og GRA-M-4 oppnådd under Eksempel 1 i det foregående ble seriefortynnet med PBS (0,85 % NaCl) for fremstilling av prøver.

Anti-H-2 serum fra National Institute of Genetic Research og den ovennevnte prøve ble blandet og inkubert ved 4°C i to timer og en målcelle tilsvarende det anvendte anti-H-2-serum ble tilsatt dertil. Miltceller eller lymfeknuteceller oppnådd fra B10 (H-2<b>) og B10 • BR(H-2<k>) mus ved hjelp av konvensjonelle metoder ble anvendt som målceller. Etter vasking av cellene med PBS ble komplement (kanin) tilsatt til cellene som ble inkubert ved 37°C i 1 time og farget med 0,2 % trypan-blått-PBS for bestemmelse av prosent cytotoksisitet. Anti-H-2 serum ble anvendt i maksimal fortynning slik at det viste i det minste 95 % cytotoksisitet i fravær av GRA.

Blokkeringseffekten av GRA ble bestemt for systemer vist i Tabell 4 som følger.

De oppnådde resultater er vist i Tabell 5.

Fra resultatene vist i Tabell 5 i det foregående kan det sees at GRA-M-1, GRA-M-3 og GRA-M-4 mangler H-2.

TESTEKSEMPEL 3

C57BL/6 mus ble transplantert under S.C. med LLC (2'IO<6>) fra den samme stamme og etter 6 døgn ble 1 ng (protein) av GRA-M-3 oppnådd i Eksempel 1 (d) tilført subkutant. Deretter ble tilførsel gjentatt i 4 døgn en gang daglig ved samme dosering. Dagen etter den endelige tilførsel ble tumorcellene skåret ut og veiet. Som en kontroll ble anvendt dyr tilført fysiologisk saltløsning. Hver testgruppe omfattet 5 dyr.

Som et resultat ble gjennomsnittlig tumorvekt av kontrollgruppen funnet å være 500 mg. Den GRA-M-3 tilførte gruppe 3 viste forsvinning av tumor og to hadde gjennomsnittlig tumorvekt på omtrent 100 mg.

TESTEKSEMPEL 4

C57BL/6 mus ble immunisert subkutant med 1 ng (protein) av GRA-M-3 oppnådd i Eksempel 1 (d) en gang i døgnet i 3 døgn og det femte døgn ble miltceller samlet fra dyret for oppnåelse av effektorceller. En blanding av effektorcellene og Lewis lungekarcinom (LLC) som målcelle i et forhold på E/T = 50/1 ble fremstilt og en del (1-10<5>) derav ble transplantert til mus av den samme stamme og Winn-bedømmelse ble gjennomført (J. Immunol. 86, side 228til239 (1961)).

De oppnådde resultater er vist i den følgende Tabell 6.

Bemerk: Gruppe A representerer miltceller fra GRA-M-3

immune mus.

Gruppe B representerer miltceller fra normale mus. Gruppe c representerer miltceller fra mus etter 10 døgn fra transplanteringen av LLC (1*10^).

Tumorveksttakt ble beregnet i samsvar med følgende ligning:

Tumorveksttakt l

hvori T^ representerer tykkelsen av fotputen på den side hvor tumoren ble transplantert og T^j representerer tykkelsen av den normale fotpute.

TESTEKSEMPEL 5

C3H/He mus ble immunisert med 4,5 ug (protein) av GRA-M-4 oppnådd i Eksempel 1 (d) og 0,1 ml av Freund's Complete Adjuvant i sakro-coccygeal-partiet. Etter to uker ble lymfeknuteceller samlet ved hjelp av konvensjonell metode og ble anvendt som respondercelle for bestemmelse av formerings-respons ved GRA-M-4.

For dette formål ble responderceller (4-10^) inkubert i RMPI-1640 medium inneholdende 15 % FCS i nærvær av GRA-M-4 i 5 døgn. Under endelig 18 timers inkubasjonsperiode ble 1 uCi av ^H-thymidin (-^H-TdR) tilsatt til mediet og dets innlem-melse i cellene ble telt.

De oppnådde resultater er vist i den følgende Tabell 7.

TESTEKSEMPEL 6

Hypersensitivitet av forsinket type (DTH) respons av C3H/He normale mus, X5563 immune mus og MH134 immune mus (gjenstand for avdelt ansøkning nr 85.3541) og GRA-M-4 immune mus og GRA-M-5 immune mus oppnådd på samme måte som i Testeksempel 5 ble bestemt ved hjelp av fotputereaksjonen (FPR). Det vil si at GRA eller MMC-behandlede tumorceller ble innført ved fotputeenden av bakfoten av dyret og svelling av fotputen 24 timer etter tilførslen ble bestemt. Graden av DTH respons ble beregnet ved å trekke svellingen før tilførselen fra svellingen etter tilførsel (lO-^ mm).

De oppnådde resultater er vist i Tabellene 8till2.

Bemerk: Gruppe 1; syngenisk normal milt 1*10^/20 ul medium

(Hanks oppløsning)

Gruppe 2; MH134 celler l-10<6>/20 pl medium

Gruppe 3; Medium 20 ul

Gruppe 4; GRA-M-4, 0,8 ug (protein)/20 ul medium Gruppe 5; GRA-M-4, 0,4 ] ig, (protein)/20 ul medium

Bemerk: Gruppe 1; medium (Hanks oppløsning) 20 ul Gruppe 2; GRA-M-4, 4 \ xg (protein)/20 ul medium Gruppe 3; GRA-M-5, 4 ] ig (protein)/20 ul medium Bemerk: Gruppe 1; medium (Hanks oppløsning) 20 ul Gruppe 2; GRA-M-4, 4 ] ig (protein)/20 ul medium.

Bemerk: Gruppe 1; medium (Hanks oppløsning) 20 ul Gruppe 2; GRA-M-4, 3,8 ug (protein) /20 ul medium Gruppe 3; 4 pg (protein)/20 ul medium av fraksjonen som passerte gjennom PNA-kolonnen ved tidspunktet for GRA-M-4 (heretter

"CP. ") .

Bemerk: Gruppe 1; medium (Hanks oppløsning) 20 ul

Gruppe 2; GRA-M-4, 3,8 \ xg (protein)/20 ul medium Gruppe 3; 3,8 rø (protein)/20 ul medium av "CP."

ovenfor

Gruppe 4; 3,8 ] ig (protein) av GRA-M-4 og 3,8 \ ig (protein)/20 ul medium av "CP.".

Terapeutiske forsøk med de sensitiverte kreftcellecytotoksiske lymfocytter som kan oppnås ved at de utsettes for GRA oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse, er også gjenstand for ovennevnte avdelte ansøkning nr 85.3541.

REFERANSETEST

Miltceller fra X5563 immune mus ble anvendt som effektor-celle og effektorceller (IO<7>) og målcellene (X5563, IO<5>) ble sammen transplantert til mus av samme stamme. Winnforsøk ble

gjennomført på samme måte som i Testeksempel 4.

De oppnådde resultater er vist i Fig 23 hvori abscissen indikerer døgn og koordinat viser midlere tumorstørrelse (cm<2>) ± S.E. og forskjellige merker representerer følgende: • ~— • : Gruppe hvori ef f ektorceller ikke ble tilsatt. 0—. q : Gruppe hvori ikke-behandlede effektorceller ble tilsatt.

^ : Gruppe hvori effektorcellene behandlet med

kaninkomplement ble tilsatt.

x m^ : Gruppe hvori effektorceller behandlet med

anti-Thy 1 og kaninkomplement ble tilsatt. q : Gruppe hvori effektorceller behandlet med

anti-Lyt 1 og kaninkomplement ble tilsatt. B % : Gruppe hvori effektorceller behandlet med anti-Lyt 2 og kaninkomplement ble tilsatt.

Fra resultatene vist i Fig. 23 kan det sees at Lyt 1 type T-celler spiller en viktig rolle ved mekanismen til in vivo effektorceller ved tumor-immunitet.

Det er videre kjent at DTH respons formidles ved hjelp av Lyt-1 T-celler (J. Exp. Med. 143, s. 1534 - 39 (1976)).

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av et glykorelatert antigen (GRA) som sensitiverer lymfocytter til kreftcellecytotoksiske lymfocytter, og som også i seg selv kan anvendes som et anti-kreftmiddel,

karakterisert ved at GRA isoleres fra humane eller muse-kreftcellemembrankomponenter ved affinitetskromatografering på en peanøttlektin-(PNA)- og eller Dolichos bønneagglutinin-lektin(DBA)-holdig uoppløselig bærer.