DE3249568A1 - Glykoverwandtes antigen, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung zur bekaempfung von krebs - Google Patents

Description

HOFFMANN · EITLE ^'PARTNER "" "

PATENT- UND RECHTSANWÄLTE O 2 4 S ü D ö

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS . DIPL.-iNG. K. GORG DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

P 32 49 568.4 39 855 o/sm

OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., Tokyo / Japan

Glykoverwandtes Antigen, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Bekämpfung von Krebs

Immunansprechende Effektorzellen, insbesondere T-Lymphocyten, die eine Hauptrolle bei einer zellausgelösten Immunreaktion spielen, verursachen eine Zurückweisung von Pfropfstellen aufgrund eines Fremzellen-Antigens, bewirken jedoch keine merkliche oder nur eine sehr begrenzte Immunoinhibierung gegen Krebszellen. Infolgedessen werden die Krebszellen nicht zerstört, sondern vervielfältigen sich in vivo und verursachen schliesslich den Tod des von Krebs befallenen Trägers.

Der hierbei vorhandene Mechanismus ist jedoch noch nicht

j I

vollständig klar und es sind verschiedene Untersuchungen angestellt wordne, um nähere Erkenntnisse zu erlangen über die Art der Materialbasis, die in einem solchen System vorkommt. Z.B. werden Zelloberflächenmarkierungen auf Mäuseldukämiezellen oder Embrionalkarzinomzellen unter Verwendung von Lektinen, wie Dolichos biflorus-Agglutinin (DBA) und Erdnussagglutinin (PNA) in Biochem. Biophys.. Res. Comm. 89 (2) 448-455 (1979), Ibid. 96 (4) 1547-1553 (1980),

J. Biochem. 89 473-481 (1981) und Cell 18 183-191, September 1979 beschrieben.

\BELLASTRASSE 4 · D-8000 MÜNCHEN 81 · TELEFON CO89J 911OB7 ■ TELEX O5-29619 CPATHEJ ■ TELEKOPIERER 918356

Soweit bekannt ist, sind bisher jedoch nochkeine Versuche unternommen worden, um neue Lymphocyten zur Verfügung zu;: stellen, die Krebszellen spezifisch bekämpfen können, und die Anti-Krebsmittel darstellen unter Anwendung einer Immunansprechung der Lymphocyten.

Gründliche Untersuchungen über die. Immunansprechung des Trägers gegenüber Krebszellen und deren Anwendung zur Behandlung von Krebs haben nun ergeben, dass - in einem krebszellenspezifischen Antigen, das nicht in differentierten Normalzellen zu finden ist, GRA vorhanden ist, das als Immunogen für den Träger wirkt und eine sehr hohe Immunogenität aufweist, das eine Immunreaktion, die spezifisch auf Krebszellen ist, verursacht. Es wurde weiterhin festgestellt, dass dann, wenn man GRA zum Sensibilisieren von Lymphocyten verwendet, man Killerzellen erhält, die spezifisch auf GRA-enthaltende Krebszellen wirken und dass man bei Verabreichung der Killerzellen an einen Träger diese GRA erkennen und auf GRA-enthaltende Krebszellen einwirken, diese zerstören und dass man auf diese Weise eine sehr gute Wirkung bei der Behandlung und Vorbeugung von Krebs erzielen kann.

Die Erfindung betrifft ein glykoverwandten Antigen, das aus einer Krebszellenmembrankomponente isoliert wurde und daß-"sich mit einem Lektin kombiniert, welches sich mit einer endständigen Galaktose oder einem endständigen Galaktosamin verbindet.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines glykoverwandten Antigens, bei dem man Zellmembrankomponenten aus Krebszellen durch Homogenisierung oder Solubilisierung gewinnt,die Zellmembrankomponente mit

-A-

einem Lektin, welches sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder einem endständigen N-Acetylgalaktosamin unter Ausbildung eines Lektin-Zellmembrankomponentenkomplex kombiniert, behandelt, den erhaltenen Komplex 5 sammelt und das Lektin aus dem Komplex abtrennt und die lektinfreie Zellmembrankomponente sammelt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Anti-Krebsmittel enthaltend GRA als aktiven 10 Bestandteil.

Fig. 1 ist eine Mikrofotografie von Daudi-Krebszellen,

Fig. 2 ist eine Mikrofotografie, welche die

Bildung von Belägen von GRA-1-K-T auf Krebszellen gemäss Fig. V zeigt,

Fig. 3 ist eine Mikrofotografie von KATO-III-Zellen,

Fig. 4 ist eine Mikrofotografie, die die Bildung von Belägen durch GRA-I-K-T auf Krebszellen gemäss Fig. 3 zeigt,

Fig. 5 ist eine Mikrofotografie von BT-I-Krebszellen,

Fig. 6 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T

"i auf den Krebszellen von Fig. 5 zeigt,

Fig. 7 ist eine Mikrofotografie von MKN-45-Krebszellen,

Fig. 8 ist eine Mikrofotografie, welche die

Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T auf Krebszellen genäss Fig. 7 zeigt,

Fig. 9 ist eine Mikrofotografie von MOLT-

Krebszellen,

Fig. 10 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T auf Krebszellen gemäss Fig. 9 zeigt,

Fig. 11 ist eine Mikrofotografie von BT-1, das mit einer Mischung von unsensibilisierten humanen peripheren Blutlymphocyten .,π behandelt wurde,

Fig. 12 + 13 sind jeweils Mikrofotografien von Krebszellengewebe einer krebsigen Maus, der GRA-M-IHKtT.\erabreicht wurde,

Fig. 14 ist eine Fotografie und zeigt einen

Krebszustand bei einer krebsigen Mäusegruppe, der GRA-M-1 verabreicht wurde,

Fig. 15 ist eine Fotografie und zeigt den Krebszustand bei einer krebsigen Mäusegruppe, der kein GRA-M-1 verabreicht wurde.

Fig. 16 ist eine Mikrofotografie und zeigt Krebszellengewebe einer krebsigen Mäuse

gruppe, der kein GRA-M-1 verabreicht wurde,

Fig. 17 ist eine Mikrofotografie von Krebszellengewebe einer Gruppe, die mitgRA-M-1 behandelt wurde,

Fig. 18 zeigt ein SDS-Gel-Elektrophorese-Diagrainm von GRA unter Verwendung von Protein-Färbung nach der C.B.B.-Methode,

Fig. 19 bis 21 zeigen SDS-GeI.Elektrophorese-Diagramme

unter Verwendung von Zuckerfärbungen mittels der PAS-Kethode.

Fig. 22 ist eine schematische Darstellung der Er-0 gebnisse vom SDS-Gel-Elektrophoreses-

Diagramm von GRA unter Verwendung der Proteinfärbung mittels der C.B.B.-Methode.

Fig. 23 ist eine grafische Darstellung, welche die Tumorwachstumsrate bei C3H/HE/6 Mäusen,

denen X5563 Immunmäuse-Milzzellen und Y5563-Zellen transplantiert worden waren.

GRA erhält man

aus GRA enthaltenden Krebszellen von Menschen oder Tieren, z.B. von kultivieren Krebszellen, transplantierten Krebszellen, spontan auftretenden Krebszellen, durch chemische Substanzen oder durch Viren induzierten Krebszellen oder Krebszellen, die man aus Geweben ■ herausoperiert hat unter Anwendung der folgenden Verfahren.

0 Zellmembrankomponenten werden von Krebszellen der vorerwähnten Art abgetrennt und mit einem Lektin behandelt, welches sich spezifisch mit terminaler Galaktose oder endständigem N-Acetylgalactosämirr, 'wobei GRA mit dem Lektin verbunden leicht abgetrennt werden kann, bindet (s. J.B.C. ,250,

8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm., t£_r 144 (1975); Z. Immunitätsforsch., 1J38.' 423-433 (1966); Br. J. Exp. Pathol., 27_, 228-236 (1946); Proc. Nath. Acad. Sei. USA, 7J5, Nr. 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry, 13, 196-204 (1974); und Carbohydrate Research, 5J, 107-118 (1976)), wodurch GRA sich mit dem Lektin vereint und leicht abgetrennt werden kann.

Die Trennung der Krebszellenmembrankomponenten kann man auf einfache bekannte Weise erzielen, z.B. durch eine Homogenisierungsmethode und eine Solubilisierungsmethode unter Verwendung eines Auflösungsmittels. Vorteilhaft ist es, eine Methode anzuwenden, bei welcher Krebszellen in physiologischer Kochsalzlösung oder in einem geeigneten Puffer homogenisiert werden, ein Teil des Niederschlags durch beispielsweise Zentrifugenabtrennung gesammelt wird und in physiologischer Kochsalzlösung oder einem Puffer mittels eines Lösungsmittels

gelöst wird, worauf man den überstehenden Teil dann beispielsweise durch Zentrifugenabscheidung abtrennt. Als Auflösungsmittel kann man beispielsweise oberflächenaktive Mittel, wie sie allgemein bekannt sind, um Zellmembranen aufzulösen, verwenden, z.B. nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.), NP-40 (hergestellt von Shell Co., Ltd.), Digitonin und Harnstoff,oder anionische oberflächenaktive Mittel, z.B. Natriumdodecylsulfonat (SDS).

Aus den so erhaltenen Zellmembrankomponenten kann man GRA, das in der Lage ist, sich mit Lektin unter Anwendung üblicher chemischer oder biochemischer Verfahren und indem man von den Eigenschaften des Lektins Gebrauch macht, abtrennen. Beispiele für solche Verfahren sind eine Affinitätschromatografie, bei der man einen ein Lektin enthaltenden Säulenträger verwendet, eine Immunausfällungsmethode, unter Verwendung von GRA-Antikörper oder dergleichen, eine Dialysemethode, eine Gelfiltrationsmethode, eine Elektrophoresemethode oder eine physikalische Ausfällung unter Verwendung eines Zuckerprotein ausfällenden Mittels, z.B. Polyethylenglykol und Aceton, oder eine Kombination solcher Verfahren. Besonders bevorzugt ist die Affinitätschromatografie unter Verwendung einer Säule, die ein Lektin enthält, wobei man den Säulenträger leicht herstellen kann, indem man Lectin auf einem unlöslichen Träger 'immobilisiert. Die Immobilisierung von Lektin auf einem

30 unlöslichen Träger kann man in bekannter Weise, wie

sie für die Immobilisierung von Biosubstanzen angewendet

wird, durchführen. Von diesen Methoden wendet man bevorzugt die Cyanobromidaktivierungs-Polysaccharid-Methode und eine Iiiunobilisierungsinethode unter Verwendung von N-Hydroxysuccimidester an. Die Cyanobromidaktivierungs-Polysaccharid-Methode ist eine Methode,

bei der ein unlöslicher Träger mit Cyanobromid bahan- - delt wird und das so erhaltene aktivierte Produkf wird dann unter milden Bedingungen einer Kupplungsreaktion mit einem Lektin unterworfen, wobei das Lektin immobilisiert wird. Bei der Behandlung des unlöslichen Trägers mit Cyanbromid wendet man beispielsweise basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid und Natriumhydrogenkarbonat an, um den pH auf 7,5 bis 12 einzustellen und dann behandelt man den Träger in einem Lö-

15 sungsmittel, wie Wasser, Acetonitril oder einem

bei pH 7,5 bis 12 gehaltenen Puffer _r z.B. einem 0,1M Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH etwa 8_r7) und 0,01M Phosphatpuffer (pH etwa 7,7) bei Raumtemperatur während etwa 1 bis 12 Minuten. Im allgemeinen wendet man vorzugsweise eine dem unlöslichen Träger äquivalente Menge an Cyanbromid an.

Jeder bekannte unlösliche Träger, der gegenüber allen Biosubstanzen eine niedrige nichtspezifische Adsorption zeigt, der eine hohe Porosität hat und der eine funktionelle Gruppe aufweist, die unter milden Bedingungen in der Lage ist, Biosubstanzen zu immobilisieren und der chemisch und physikalisch ausreichend stabil ist, kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Verwendbare unlösliche Träger sind beispielsweise Träger, die aus Zellulose hergestellt wurden, z.B.

— /9 —

Aminoethylzellulose, Carboxymethylcellulose, Bromoacetylzellulose und p-Anilinozellulose, oder ein Träger aus vernetzten! Dextran,· z.B. Sephadex und CM-Sephadex (hergestellt von Farmacia Corp.) und ein Träger aus Agarose, z.B. Sepharose 2B, Sepharose 4B und Sepharose 6B (hergestellt von Farmacia Corp.).

Bei der Kupplungsreaktion des wie oben erhaltenen, mit Cyanbromid aktivierten Trägers wird der mit Cyanbromid aktivierte Träger in einer Menge angewendet, die 30 bis 80 mal der des Lektins entspricht und man führt die Umsetzung in einem geeigneten Lösungsmittel, wie einer 0,1 Mol/l wässrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat (enthaltend 0,5 Mol/l Natriumchlorid; pH 8,4) bei einer Temperatur zwischen 0 und 40⁰C und vorzugsweise 2 und .8⁰C während einer Zeit von etwa 10 bis Stunden durch. Auf diese Weise erhält man einen Lektin enthaltenden Träger für eine Affinitätschromatografie.

20 Bei der Chromatografie unter Verwendung des Lektin

enthaltenden, wie oben beschrieben hergestellten Trägers, kombiniert sich das gewünschte GRA mit dem auf dem Träger enthaltenen Lektin und wird in der Säule festgehalten. Anschliessend werden Substanzen, die zu einer Kombination in der Lage sind, z.B. mit einem Lektin, durch die Säule laufen gelassen, wobei einer Austauschreaktion stattfindet, oder man führt alternativ eine Adsorptionsabtrennung (mit einer Eluierlösung) durch-, z.B. mit einem hochkonzentrierten Salz, einer wässrigen

Lösung von Kaliumthiocyanat und einem Nitratpuffer, um das gewünschte GRA abzutrennen und zu gewinnen.

- ve -

Bei der Austauschreaktion sind Substanzen, die in der Lage sind, sich mit einem Lektin zu verbinden, wenn ein Träger für die Äffinitätschromatografie, enthaltend ein galaktosebindendes Lektin, verwendet wird, beispielsweise solche, die sich mit einem endständigen galaktoseverbindendem Lektin kombinieren, -z.B. Galaktose, Disaccharide, enthaltend endständige Galaktose,und Oligosaccharide,enthaltend eine endständige Galaktose. Beispiele für Substanzen, die in der Lige sind, sich mit einem Lektin zu verbinden, wenn als Träger für die Affinitätschromatografie ein N-Acetylgalaktosamin-bindendes Lektin verwendet wird, sind solche, die sich mit einem endständigen N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektin verbinden könnten, z.B. N-Acetylgalaktosamin, Disaccharide, enthaltend ein endständiges N-Acetylgalaktosamin und Oligosaccharide, enthaltend ein endständiges N-Acetylgalaktosamin .

Das so erhaltene GEA enthält Glykoprotein, enthaltend eine Galaktose und/oder N-Acetylgalaktosamin-Endgruppe, Glykolipide und/oder Saccharide.

Das so hergestellte GRA kann gewünschtenfalls lyophiliisert werden und auch in üblicher Weise unter Anwendung üblicher Trennmethoden gereinigt werden. Beispielsweise kann man solehe GRA-Zubereitungen, die mit einem galaktosebindenden lektin isoliert wurden, einer Trennmethode unterwerfen, unter'Anwendung eines N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektins und GRA, das mit einem N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektin dann isoliert wurde, kann nach einer Trennmethode behandelt werden, unter Verwendung eines galaktosebindenden Lektins.

Die hier verwendeten Lymphocyten sind nicht kritisch und alle Lymphocyten von normalen oder krebsigen Menschen oder Tieren können verwendet werden. Beispiele hierfür sind Lymphocyten, die man von peripherem Blut, Knochenmark, Lymphknoten, aus der Milz, den Mandeln oder der Thymusdrüse erhält. Diese Lymphocyten werden durch physikalische oder chemische Methoden, durch eine Oberflächenmeipbranmethode oder dergleichen isoliert.

10

Die Sensibilisxerung von Lymphocyten'mit GRA erfolgt, indem man die Lymphocyten auf einem Kulturmedium, enthaltend GRA, während einer Zeit von 1 bis 10 Tagen, vorzugsweise 2 bis 7 Tagen, kultiviert.

Als Kulturmedium für die Verwendung zum Sensibilisieren der Lymphocyten können verschiedene übliche Nährmedien verwendet werden, die üblicherweise für solche Zellkultivierungen verwendet werden. Bevorzugte Beispiele schliessen ein RMPI 1640-Medium, eine Eagle-MEM-Kultur, etc.-, dem Humanserum, Kalbsfötusserum (FCS), Kalbsserum, Pferdeserum oder dergleichen zugegeben wurde. Die Menge des zur Kultur gegebenen GRA beträgt im allgemeinen 1 bis 1.000 ng/ml und vorzugsweise 1 bis

²⁵ I . '

-Vi-

500 ng/ml, berechnet als Menge Zucker pro 1 χ 10 /ml Lymphocyten.

Die Kultivierung wird in üblicher Weise, z.B. bei einem pH von 7,2 und bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt.

Die so hergestellten Killerzellen sind im wesentlichen normale Lymphocyten

0 und haben eine GRA-spezifische Zellenbekämpfungsaktivität. Beispielsweise hat GRA-1-KT, eine der erfindungsgemässen Killerzellen, Eigenschaften die bei humanen peripheren Blut-T-Zellen vorkommen und zeigt eine zeilbekämpfende Aktivität, die spezifisch gegenüber Krebszellen, enthaltend GRA, ist, wie in den später folgenden Beispielen gezeigt wird.

Typische Beispiele für die neuen Killerzellen

sind GRA-1-KZ und -GRA-M-1, die in den nachfolgend beschriebenen Beispielen hergestellt werden. -Diese Killerzellen sind bei der Anmelderin erhältlich und eine Probe von GPA-i-rKT-'Zellen ist bei ATCC am 27. September 1982 hinterlegt worden und hat die Nummer ATCC CRL 8175 erhalten

Pie« Killerzellen kann man unlimitiert

vervielfältigen,unter Verwendung des vorerwähnten Kulturmediums, enthaltend einen T-Zellen-Wachstumsfaktor (TCGF, IL-2 ). In diesem Falle kann man eine selektive Kultivierung von Klonen der Killerzellen mittels einer üblichen ültraverdünnungsmethode durchführen. Die Killerzellen können stabil über lange Zeiträume in

-1/3-

beispielsweise flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.

Das GRA kann einzeln als aktiver Bestandteil eingesetzt werden oder es kann zusätzlich in Kombination

mit anderen bakteriziden Mitteln und krebsinhibierenden Mittel verwendet werden. Krebsinhibierende Mittel, die das erfindungsgemässe GRA als aktiven Bestandteil enthalten, können in jeder Form vorliegen, unter der Voraussetzung, dass sie GRA in wirksamen Mengen enthalten· Im allgemeinen wird das Mittel intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär in Form einer Lösung, einer Suspension oder als Emulsion verwendet. Man kann es auch als Trockenprodukt herstellen und dann unmittelbar vor der Verwendung durch Zugabe eines geeigneten Trägers in eine Flüssigkeit überführen. Dieses flüssige Mittel kann ein Suspensionsmittel, z.B. Methylzellulose, ein Emulgiermittel, z.B. Lecithin, Konservierungsmittel, z.B. Methyl-p-hydroxybenzoat, Stabilisierungsmittel und dergleichen enthalten, soweit diese keine

25 nachteilige Wirkung auf die Immunisierungsfunktion

bei Menschen oder Tieren hervorrufen. Auch Puffer können enthalten sein.

Geeignete wässrige Träger sind beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung und ein geeigneter nichtwässriger Träger kann beispielsweise ein Pflanzenöl,

z.B. Sesamöl, ein Mineralöl, z.B. Paraffin, oder ein tierisches Öl, z.B. Squallene, oder auch Propylenglykol sein. Zur Erhöhung der immunologischen Wirkung kann man ein geeignetes Adjuvants inkorporieren. Geeignete Adjuvantien sind beispielsweise Freund's

Complete Adjuvants, Saponin bei Tieren und Aluminium- - hydroxid beim Menschen.

Das erfindungsgeir.ässe Anti-Krebsmittel kann einmal oder wiederholt über längere Zeiträume einem Krebspatienten zur Behandlung von Krebs verabreicht werden oder man kann es jemandem verabreichen, der krebsanfällig ist, um dadurch dem Krebs vorzubeugen.

Da LD₅₀ (Maus, intraperitoneal) von GRA wenigstens

500 mg/kg, berechnet als Zuckermenge, beträgt, zeigt das Anti-Krebsmittel gemäss der Erfindung eine niedrige Toxizität und man kann es deshalb innerhalb eines weiten Dosierungsbereiches verabreichen. Obwohl die Konzentration von GRA in dem Anti-Krebsmittel gemäss der Erfindung nicht kritisch ist, wird doch bevorzugt, es in einer Menge vonO„001bis ίΟΟ μg/ml, berechnet als Menge des Zuckers, zu verwenden. Hinsichtlich der Dosierung des Anti-Krebsmittels wird im allgemeinen bevorzugt, das Mittel in einer Menge von 0,001 bis 1.000 ug/kg/Tag auf einmal oder in verschiedenen Anteilen zu verabreichen, wobei jedoch diese Dosierung von dem Krankheitsgrad, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten abhängt.

Das so hergestellte Anti-Krebsmittel, welches die

Killerzellen als aktiven Bestandteil enthält, wird vorzugsweise als injizierbare Lösung in Kombination mit Trägern, die bei der Herstellung von Blutmedizinen Anwendung finden, verwendet. Die hier verwendeten Träger sind nicht kritisch, jedoch bevorzugt man Träger, die die gleiche Tonizität wie Blut aufweisen. Besonders wird physiologische Kochsalzlösung bevorzugt. Bei der Herstellung des .Mittels wäscht man vorzugsweise die Killerzellen ausreichend mit einer physiologischen Kochsalzlösung oder dergleichen, um das vorerwähnte Kulturmedium zu entfernen und anschliessend wird es dann in einem Träger aufgenommen.

Die Konzentration an Killerzellen in dem Mittel ist

nicht besonders begrenzt, sie beträgt jedoch vorzugs-

5 9
weise zwischen 10 und 10 pro Milliliter. Verabreicht man die Killerzellen intraperitoneal in einer Dosis von 10 pro Maus, so stellt man keine Toxizität fest. Zwar hängt die Dosis des erfindungsgemässen Anti-Krebsmittels von dem Grad der Krankheit, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten ab, jedoch wird im allgemeinen das Mittel vorzugsweise in einer Dosis von 10 bis

1 2
10 /kg/Tag auf einmal oder in verschiedenen Anteilen

verabreicht. 25

Die folgenden Beispiele, Referenzbeispiele, .Versuchsbeispiele und Vergleichsbeispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Referenzbeispiel· 1
Lokalität_von_GRA

5 (1)~^A Herstellung von FITC-markiertem Lektin

(PNA-FITC)

• 10 mg Erdnusslektin (PNA), hergestellt von EY Co.) wurden in 2 ml eines Ο,ΟΙΜ Phosphatpuffers, enthaltend

10 0,85 % NaCl (pH 7,2) gelöst. In 1 ml eines 0,5M

Hydrogenkarbonatpuffers (pH 9,0) wurden 2 mg FITC (her gestellt von Sigma Laboratories Inc.) gelöst und ein 0,5 ml Anteil der gebildeten Lösung wurde zu dem zuvor hergestellten PNA-Puffer gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend über Sephadex G25 (10 mm χ 300 mm, hergestellt von Farmacia Corp.) getrennt. Das Anfangspeak wurde gesammelt. FITC/PNA-Verhältnis: 1,0.

20 (D-B Zubereitung von FITC-markiertem Lektin

(DBA-FITC)

In gleicher Weise wie in (1)-A oben erhielt man DBA-FITC unter Verwendung von DBA, hergestellt von EY Co.. EITC/DBA-Verhältnis = 0,9.

(D-C So jabohnenagglutinin-FITC (TIFT-SBA) ist von Ey Co. erhältlich.
FITC/SBA-Verhältnis = 1,4. 30

IO

-Yi-

(2) Lokalität von GRA auf verschiedenen Krebszellen

(a) Human kultivierte Krebszellen (V χ 10 ) wurden dreimal mit einem 0,05 M tris-Salzsäurepuffer, enthaltend 0,85 % NaCl (pH 7,2) durch Zentrifugenverfahren gereinigt und dann wurden 100 μΐ PNA-FITC, DBA-FITC oder SBA-FXTC, (200 μg/ml), hergestellt und gemäss (1), zugegeben. Die Mischung wurde 3 0 Minuten zur Umsetzung bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung derUmsetzung wrude das Reaktionsgemisch dreimal mit einem 0,01M Phosphatpuffer, enthaltend 0,85 % NaCl (pH 7,2) gewaschen und anschliessend wurden die Zellen auf eine Glasplatte gelegt und unter

15 einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Krebszellen sind alle bekannt und wurden von "First Pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University", bezogen

i I

10

25 30 35

	-W-	Krebszellen	(Neuroblastoma)	324956	von
	Tabelle 1		(Neuroblastoma)
			(Neuroblastoma)	positives Ver	DBA SBA
	(Burkitt Lymphoma)	(Neuroblastoma)	hältnis	1,4
	(Burkitt Lymphoma)	(Neuroblastoma)	GRA (%)	5,2
	(Burkitt Lymphma)		PNA	0
	(T-Zellen Lymphona		98,3	6,7
Raji	(T-Zellen Leukemia)		93,1	4,8
Dauji	(B-ZeIlen Lymphoma)		50,1	5,3
BT-1	(IgD-Myeloma)	44,3	10,0
P-12	(Lungenkrebs,squamös)	0,6	2,0
MOLT	(Lungenkrebs,squamös)	19,2	0,4
Fujimaki	(Lungenkrebs,adenocarcinom)	0,6	0
ODA	(Lungenkrebs, kleine Zellen)	70,4	0
QG-5 6	(Lungenkrebs, grosse Zellen)	78,4	0
PC-1	(Magenkrebs, por.)	77,1	0,1
PC-3	(Magenkregs sig.)	68,0	0
QG-90	(Magenkrebs por.)	17,0	40,3
PC-13	(Magenkrebs, adsq.)	63,7	0,4
MK-2	(Magenkrebs,tubI)	57,3	0,1
KATO-III	(Magenkrebs,tubI)	1,0	0
MKN-45	(Harnblasenkrebs ca.)	4,6	0
MKN-1	(Harnblasenkrebs ca.)	0,4	21,4
MKN-28	(Harnblasenkrebs ca.)	0,5 '	0
MKN-74	(Harnblasenkrebs ca.)	37,4	1,0
MGH-U1	(Nierenkrebs)	4,5	0
KU-2	(Nierenkrebs)	14,6	0,6
T-24	Kuramochi{Eierstockkrebs)	13,1	0
NBT-2 '	NB-1	23,9	1,7
NRC-12	YT-nu	3,3	0,5
KU-I	TGW-nu-1	80,0	0
	TGW-nu-11	20,9	1,0
GOTO	3,6	0
4,1
2,0
0,5

	1	2	3249568	90,7
96,9		0	,3
44,6		3
14,6		0	,1
5,4		1
5,7		0	,7
92,0

Xb

- 3-9 -

ITO (Embryonalcarcinoma)

NEC-8 (Embryonalcarcinoma)

SCH (Choriacarbinoma, Magen)

GCH (Chriocarcinoma, Uterus)

5 YN-1 (Rhabdomyosarcoma)

Maus X 5563 (Plasinacytoma)

Maus MHI34 (Hepatoma) 18,6 0 6,4

(b) Das maligne Gewebe von Krebszellen wurde durch ein Sieb aus. rostfreiem Stahl (150 mesh) gegeben, unter

Erhalt einer Einzelzeilensuspension. Nach zweimaligem Waschen mit 0,01M-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 2mMol CaCl₂, 2mMol MgCl₂ und 0,85% NaCl wurden 5x1O⁵ Zellen in 100 μΐ Puffer resuspendiert. 100 μΐ FITC-PNA oder FITC-DBA (200 ng/ml) wurden zu der Zellsuspension gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit kaltem PBS wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
20

Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Das maligne Gewebe von Krebspatienten wurde von der Kansai Medical Universität erhalten.

Tabelle 2

GRA

Nr. Krebspatienten-Gewebe _{pNA DBA}

1	Magenkrebs
2	Magenkrebs
3	Magenkrebs
4	Magenkrebs
5	Magenkrebs
6	Magenkrebs
7	Brustkrebs
8	Brustkrebs
9	Brustkrebs
10	Brustkrebs
11	Dickdarmkrebs
12	Dickdarmkrebs
13	Esophaguskreb s
14	Hepatoma

_U|| j_

:-Anmerkung: " + " bezeichnet das GRA auf der Zelloberfläche;

"-" bedeutet, dass GRA auf der Zelloberfläche nicht vorkommt.

Referenzbeispiel 2
25

(1) -A Herstellung von immobilisiertem Lektin (PNA-Sepharose)

3g CNBr-aktivierte Sepharose 4B (hergestellt von Farmacia Corp.) wurden gründlich mit 1 mmol HCl gewaschen und in 200 ml 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) suspendiert. Dazu wurden 5 ml eines p,01M Phosphatpuffers (pH 8,5), enthaltend 20 mg PNA, gegeben und dann erfolgte die Umsetzung bei 25°C während 2 Stunden, wobei man einige Male rührte unter Erhalt von PNA-Sepharose.

(1)-B In gleicher Weise wie bei (D-A oben, mit der Ausnahme, dass DBA anstelle von PNA verwendet wurde, erhielt man DBA-Sepharose.

(2) Herstellung von GRA

(a) BT-I (Burkitt Lymphoma)-Zellen (1,3 χ 10⁸) wurden 3 mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann wurden 30 ml eines 0_f01M tris-Salzsäurepuffers (pH 7,4), enthaltend 2 % Triton X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂ zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 4°C gerührt und dann einer Ultrazentrifugenabscheidung mit einer Rate von 100.000 χ g unterworfen. Von 28 ml der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde ein 14 ml-Anteil durch eine Säule (Durchmesser O₁.5, Länge 1 cm) für die Affinitätschromatografie geschickt, wobei die Säule mit PNA-Agaroseperlen (hergestellt von Maruzen Co., Ltd.), die zuvor mit einem tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,1 % Triton X-100, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl^ und 2 mmol MgCl- ins Gleichgewicht gebracht worden waren, geschickt. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer, wie er oben verwendet wurde, wurde mit einem 0,01M tris-Salsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,1M Laktose, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂, 2 mmol MgCl₂ und IP, 1 % Triton X-100 eluiert. Der so edierte Anteil

wurde mit einer 0,1M tris-Salzsäurepufferlösung, enthaltend O₁- 85 % NaCl, 2 mmol MgCl₂ und 2 mmol CaCl₂ 48 Stunden dialysiert, wobei man 17 mg einer GRA-Lösung erhielt. In dieser GRA-Lösung wurde die Menge an Protein und die Menge an Zucker nach der Folin-Lowry-Methode bzw. nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode - bestimmt j diese Mengen betrugen 644 \iq bzw.. 120 ug. Dieses Produkt wird nachfolgend als "GRA-1" bezeichnet.

1 0 (b) C3/HE._Mäuse-Brustkrebs-^1>iMT-^zellen Π ^{x 10} !wurden 3~mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann wurden 30 ml einer 0,01M tris-Salzsäurepufferlösung (pH 7,4), enthaltend 2 % Triton X-100, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂, zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 4°C gerührt. Anschliessend wurde die Mischung einer uitrazentrifugenabscheidung in einer Rate von 100.000 χ g während 2 Stunden unterworfen, und die überstehende Flüssigkeit wurde über Nacht mit einem 0,1M tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend-0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂, dialysiert. Die so dialysierte Flüssigkeit wurde auf 3 ml konzentriert und ein 1 ml-Anteil wurde durch eine Säule (Durchmesser 0,5, Länge 2 cm), die mit der gleichen PNA-Sepharose, wie zuvor verwendet, gefüllt worden war und die mit einem tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,05 % Triton X-100, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂, ins Gleichgewicht gebracht worden war, einer Affinitätschromatografie unterworfen. Nachdem man gründlich mit der gleichen Pufferlösung wie zuvor gewaschen hatte, eluierte man mit

- 23-

einer O_r1M tris-Salzsäurepufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,1M Laktose, 0,85 % NaCl, 2 nunol CaCl₂, 2 mmol MgCl- und 0,005 % Triton X-100, und der so eluierte Anteil wurde dann 48 Stunden dialysiert mit einem 0,01M tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂- Man erhielt 2 ml einer GRA-Lösung. In dieser GRA-Lösung betrug der Proteingehalt 156 μg und der Zuckergehalt 94 μg. Diese Lösung wird nachfolgend als "GRA-M-1" bezeichnet.

(c) Annähernd 120 g (Nassgewicht) KATO-III wurde in einem Waring-Mischer in 100 ml PBS homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren mit 100.000 g während einer Stunde wurden die Pellets in 100 ml einer 2% Triton X-100-Lösung in 0,01M Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) ,enthaltend 0,15M NaCl gelöst. Die bei der Zentrifugierung mit 100.000 g während 1 h erhaltene überstehende Lösung wurde auf eine Säule von PNA-Sepharose 4B (0,8x15 cm) zugegeben, die zuvor mit 0,015 % Trito X-100 in 0,01M Tris'HCl (pH 7,6), enthaltend 0,15M NaCl ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgetragen. Nach dem Waschen mit 50 ml des Puffers wurde GRA mit dem 0,1M Laktose enthaltenden Puffer eluiert. Das eluierte GRA wurde gegen 0,85 % NaCl dialysiert, konzentriert mittels Sephadex Pharmacia Co. und bei

25 -20 C vor der Anwendung gelagert.

Die Mengen an Protein und Zucker, in gleicher Weise bestimmt wie bei (a) oben, betrugen 2,0 mg bzw. 0,8 mg. Dieses Produkt wird nachfolgend als "GRA-2" bezeichnet.

³⁰ ii

(d) Wie in (c) wurden die folgenden GRA-Proben erhalten:

	Material	.11	GRA	Zuckerge halt (mg)
	Quelle	-2A-	Proteingehalt (mg)	0,09
	BT-a	Tabelle 3	0,5
GRA-	Exzidierter			0,5
Probe	Brustkrebs	Menge(g)	0,25	0,38
GRA-3	QG-4 6	33	0,6	0,54
GRA-4	QG-90		1,0	0,45
-	Raji	5	0,78	28,4
GRA-5	MMT	24	11,3	0,07
GRA-6	LLC	26	0,06	0,35
GRA-7	MH-135	29	0,65	0,23
GRA-M-2	X-5563	200	0,56
GRA-M-3	14,4
GRA-M-4	85
GRA-M-5	25

(e) In gleicher Weise wie bei (c), jedoch unter Verwendung von NKN-45 (etwa 29g) anstelle von Kato-III und unter Verwendung vn DBA-Sepharose, erhalten gemäss (1)-B, anstelle von PNA-Sepharose 4B und unter Eluieren mit N-Acetylgalaktosamin erhielt man eine GRA-Zubereitung mit einem Proteingehalt von 0,03 mg und einem Zuckergehalt von 0,01 mg. Dies wird

25 nachfolgend als GRA-8 bezeichnet.

(f) GRA-3, hergestllt gemäss (d) (5 ml) wurde auf eine DBA-Sepharose-Säule gegeben und mit Tris-HCl-Puffer (0,015 % Triton X-100, 2 mMol MgCl₂, CaCl₂, 0,85 % NaCl) eluiert,

wobei man 4 ml-Fraktionen Nr. 1-1:2 erhielt. Fraktionen 1-3 werden als "GRA-3-A" bezeichnet und Fraktionen 4-12 als "GRA-3-B". Dann wurde die Säule mit dem gleichen Puffer eluiert, der jedoch 0,1M N-Acetylgalktosamin enthielt und wobei man Fraktionen erhielt die mit "GRA-ß-C" bezeichnet

35 werden.

(g) SDS-Gelelektrophorese

Jede · derobigen GRA-Zubereitungen wurde einer Elektrophorese unterworfen, wobei die Methode von Fairbanks et al: Biochemistry, Band 10, S. 2606, 1971, angewendet wurde.

Die Ergebnisse werden in den Fig. 18 bis 22 gezeigt.

In den Fig. 18-19 bedeuten die Zahlen 1 bis 5 folgendes: 1 ...Standard; 2 . . . GRa-M-3; 3.. .GRA-7; 4...GRA-1; und 5 ... GRA-2.

In Fig. 20 bedeuten die Zahlen 1 bis 4 folgendes: 1...Standard; 2...GRA-M-2; 3...GRA-6; 4...GRA-5. 15

In Fig. 21 bedeuten die Zahlen 1 bis- 3 folgendes: 1...GRÄ-M-4; 2...GRA-M-5; 3... Standard:

In Fig. 22 bedeuten die Zahlen 1 bis 4 folgendes: 20 1...GRA-3; 2...GRA-3-A; 3...GRA-3-B, 4...GRA-3-C.

Fig. 18 zeigt den Zustand von GRA nach einer Proteinanfärbung gemäss C.B.B. (Fairbanks et al: Biochemistry, Band 10, S. 2606, 1971).
25

Fig. 19 bis 21 zeigen den Zustand von GRA nach Behandlung mit einer Zuckerfarbreaktion gemäss PAS-Methode (R.M. Zacharius et al: Anal. Biochem. Band 30, S. 128 (1962)).

Fig. 22 ist eine schematische Darstellung der Ergebnisse von Anfärbungen gemäss der vorerwähnten C.B.B.-Methode.

! ι

Als Standard wurden die nachfolgenden, von Biorad Lab. Calif.USA erhaltenen Substanzen verwendet: 35

I)

K Dalton; Myosin
" ; ß-Gälactosidase
92,5 " ; Phosphorylase
66,2 " ; BSA
45 " ; Ovalbumin

21,5 β ; Sojabohnentrypsin-Inhibitor

Referenzbeispiel 3

(a) Die Milz von japanischen Affen (erhalten von der. Japan Plymates Co., Ltd.j wurde herausoperiert und 2 mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium (hergestellt von der Flow Laboratory Co., Ltd.) gewaschen. Die Zellen wurden unter Verwendung von Mesh (hergestellt von Millipore Inc._f 150 mesh) filtriert und einem spezifischen Schwerkraftzentrxfugenverfahren (spezifische Schwerkraft

1,076) unterworfen, wobei man 2 1 von 2 χ 10 /ml Lymphocyten erhielt. Die so erhaltenen Lymphocyten wurden 3 mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium gewaschen und die Anzahl der Lymphocyten wurde auf 5 χ 10^/ml unter Verwendung des gleichen Mediums wie zuvor, enthaltend 10 % FCS, eingestellt. Dann Hess man sie in einer Kohlendioxid-Fermentationsvorrichtung 1 Stunde bei 37°C stehen. Die überstehenden Lymphocyten wurden gewonnen

und die Anzahl der Lymphocyten wurde unter Verwendung des gleichen Kulturmediums wie vorher angegeben, enthaltend 1 % FCS auf 1 χ 10 /ml eingestellt. Anschliessend wurden 1 μ9/πι1 Indomethacin (hergestellt von Sigma Laboratories Inc.) und 0,2 % PHA-P (hergestellt von Difco Co.) zugegeben und dann wurde die Kultivierung in einer Kohlendioxidgas-Fermentationsvorrichtung 48 Stunden bei 37⁰C durchgeführt. Nachdem man 10 Minuten eine Zentrifugenabscheidung (3.000 UpM) durchgeführt hatte, wurde die gebildete überstehende Flüssigkeit gewonnen und sterilisiert, indem man sie durch ein Millipore-Filter (hergestellt von der Millipore Inc., 0,2 um) filtrierte und wobei man 2 1 TCGF erhielt.

(b) Als Quelle von TCGF wurde die überstehende Flüssigkeit von mischkultivierten periphelren Blutlymphocyten von 10 gesunden Spendern verwendet. Nicht zusammenhängende Lymphocyten, hergestellt von CF. (Conray. Ficol (Japan Immunoresearch Co.)) abgetrennten Lymphcyten durch Adsorption auf Plastikoberflächen bei 37°C während 1 h wurden in RPMI 1640-Medium, enthaltend 1 % FCS (1,5x10⁶Zellen/ml) suspndiert und mit 0,2 % PHA-P, indomethacin (1ug/ml) und Human-B-Zellen (BT-1) (1,5x10⁵ Zellen/ml), vorbehandelt mit Mitomycin C (50 μΐη/ml) inkubiert. Nach 4 8 Stunden wurde die aufschwimmende Kultur geerntet und als TCGF-Quelle verwendet (H.Inoue et al, Scand.J. Immunol. 12, S. 149-145 (1980)).

Referenzbeispiel 4

5 (1) Human-periphere Blutlymphocyten

50 ml Blut, erhalten von gesunden Erwachsenen oder Pateinten mit verschiedenen Krebsen durch Häparinisierung, wurden unter Verwendung von Ficol Pack (hergestellt durch Farmacia Japan Co., Ldt.) einer Zentrifugenabscheidung unterworfen, wobei man 5x10 periphere Blutlymphocyten erhielt.

15 (2) Mäuse-Milzlymphocyten

Die Milz einer C3H/He-Maus (männlich, 6w) wurde exzidiert und 2-mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium

ORIGINAL INSPECTED

10

gewaschen. Dann wurde die Milz mittels einer Injektionsnadel gelockert und durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl (100 mesh) zur Entfernung grosser Teile passiert. Die so filtriertenZellen wurden 2 mal mit dem gleichen Kulturmedium wie oben gewaschen und dann einer Zentrifugentrennung mit einer Rate von 1.200 HpM während 10 Minuten unterworfen, wobei man 4x10 Milzlymphocyten erhielt.

Beispiel 1

GRA-1 (Menge an Protein 40 ug/ml - Menge an Zucker 7,5 μg/ml, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2,(2a) ) wurden auf das 1.000-fache des Ursprungsvolumens mit einem RPMI-1640-Kulturmedium, enthaltend 15 % FCS, verdünnt, unter Erhalt eines Sensibilisierungs-Kulturmediums.
20

Lymphocyten von humanem peripheren Blut (5 χ 10 /5 ml), erhalten gemäss Referenzbeispiel 4(1), wurden zu 5 ml des Sensibilisierungs-Kulturmediums, hergestellt wie oben, gegeben und dies wurde dann in eine Laborschale gegeben und 2 Tage bei 37°C kultiviert. Anschliessend erfolgte eine weitere Kultivierung auf einem RPMI-164 0-Kulturmedium, enthaltend 20 % TCGF und 15 % FCS, erhalten gemäss Referenzbeispiel 3 _r für weitere 5 Tage, 'wobei man 20 ml einer Killerzellenlösung, enthaltend 1 χ 10⁶ Killerzellen/ml, ■
als GRA-1-K-T bezeichnet.

1x10 Killerzellen/ml, erhielt. Diese wird nachfolgend

Beispiel 2

Die Mäuse-Milzlymphocyten, die im Referenzbeispiel 4(2) erhalten worden waren, wurden unter Verwendung eines RPMI-1640-Kulturmediums,· enthaltend 15 % FCS, auf eine Zahl von 5x10 /ml eingestellt. Dazu wurde GRA-M-I, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2(2b) gegeben, so dass das Endprodukt 1,5 μg/ml Protein und 0,9 μg/ml Zucker enthielt. Ein 5 ml-Anteil des erhaltenen Gemisches wurde in eine Laborschale (60 mm χ 15 mm, hergestellt von Falcon Co.) 2 Tage bei 37^PC kultiviert. Es wurde die Bildung von Klonen beobachtet. Der Anteil wurde weiter in einem RPMI-1640-Kulturmedium mit 15 % FCS, enthaltend 20 Vol.% TCGF (hergestellt

15 von Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd.)

während 4 Tagen kultiviert, wobei man 50 ml einer KiI--lerzellenlösung, enthaltend 1x10 Killerzellen/ml erhielt. Diese wird nachfolgend als GRA-M-1-K-T bezeichnet .

Beispiel 3

Lymphocyten (5x10 ) von peripherem Blut gesunder Spender wurde in einem RPMI-1640-Medium, enthaltend 40 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-2 und 15 % FCS bei 37^?C inkubiert. Am zweiten Tag wurde das vorerwähnte Human-TCGF zu dem Medium zugegeben, bis dessen Konzentration 20 % erreichte und die Inkubierung wurde 3 Tage fortgesetzt, wobei man Killer-Zellen erzielt, diese werden nachfolgend als "GRA-2-K-T" bezeichnet.

Beispiel 4

Killerzellzubereitungen GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T und GRA-3-C-K-T wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von fRA-8, GRA-3-A und GRA-3-C hergestellt (Proteingehalt: 50 ng/ml/ und des TCGF, das im Referenzbeispiel 3-(b) erhalten wurde.

10 Beispiel 5

C3HE/Mäusen (weiblich 8 Wochen alt) wurde intradermal X5563-Zellen (10 ) des gleichen Stammes implantiert und nach 7 Tagen wurde derTumor chirurgisch herausgeschnit-

-5 ten. Nach weiteren 7 Tagen wurden X5563-Zellen (10 ) gleichen Stammes inokuliert und Mäuse, die gegenüber der Inokulierung resistent waren, wurden als Immun-Mäuse bezeichnet.

Die Milzzellen der Immunmäuse und von C3H/HE-Mäusen wurden unter üblich angewendeten Methoden präpariert.

Jedes Lot von Milzzellen (5x10 /Well) wurde mit 40 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-M-5 in RPMI-1640-Medium, enthaltend 15 % FCS während 5 Tagen sensibilisiert unter Erhalt von Killerzellen.

Killerzell—Zubereitungen, die aus normalen Milzzellen erhalten wurden, werden nachfolgend als "GRA-M-5-K-t-1" bezeichnet, und solche, die von Immunen Milzzellen erhalten wurden, werden mit "GRA-M-5-K-T-2" bezeichnet.

35

Beispiel 6

Lymphocyten von peripherem Human-Blut (5x10 ) wurden in 5 ml RPMl-1640-Medium, enthaltent 50 ng/ml (Proteingehalt) GRA-1 bei 37⁰C während 2 Tagen inkubiert. Am dritten Tag wurden die Lymphocyten in das RPMI-1640-Medium, enthaltend 10 % Serum von dem Spender der Lymphocyten t und 0 bis 100 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-1 übetragen und die Inkubierung wurde nach weiteren 5 Tagen fortgeführt, wobei man die in der nachfolgenden Tabelle gezeigten Killerzellen-Zubereitungen erhielt.

	Tabelle 4	Killerzellen
GRA-Kontentration	(ngVml)	GRA-1-K-T-1
Erster Tag	Tag 3	GRA-1-K-T-2
50	0	GRA-I-K-T-3
50	1,6	GRA-1-K-T-4
50	3,2	GRA-1-K-T-5
50	6	GRA-1-K-T-6
50	12,5	GRA-1-K-T-7
50	25	GRA-1-K-T-8
50	50	•
50	200
Beispiel 7

(a) Lymphocyten von peripherem Blut (PBL) von verschiedenen Krebspatienten nach der Operation wurden mit GRA-3 sensibilisiert unter Erhalt von Killerzeller-Zubereitungen. PBL (5x10 ) von den Patienten wurde in RPMI-1640-Medium, enthaltent 50 ng/ml (Proteingehalt) von lRA-3 währen 2 Tagen inkubiert und dann inkubierte man in RPMI-1640-Medium, enthaltend 20 % TCGF und 15 % FCS weitere 5 Tage unter Erhalt der Killerzellen, die in Tabelle 5 gezeigt werden.

	-	10	Periphere	36 -IA-	+ +	14	3249
			Krebs	Tabel'le 5	+ +	35
				Blut-Lymphocyten	+	21
		Magenkrebs		+ -	7	Killerzellen
	Magenkrebs		+ -	35
5	Brustkrebs		+	21	GRA-3-K-T-1
Brustkrebs	P-GRA D-GRA Tage nach der	GRA-3-K-T-2
Brustkrebs	Operation	GRA-3-K-T-3
Magenkrebs	GRA-3-K-T-4
GRA-3-K-T-5
GRA-3-K-T-6

In der obigen Tabelle bduetet P-GRA und D-GRA die 15 Lokalität von GRA, ausgedrückt als Maligne-Gewebe

(durch Operation entnommen) von Krebspatienten, von denen PBL in gleicher Weise gesammelt worden war, wie im Referenzbeispiel 1, 2-(b). P-GRA und D-GRA wurden erhalten unter Verwendung von FITC-PNA bzw. FITC-DBA. Die Tage nach der Operation geben die Zeit an, wann BPL nach der Operation gesammelt worden war.

(b) PBL (5x10 ), gesammelt von Brustkrebspatienten 21 Tage nach der Operation wurde in RPMI-164O-Medium, enthaltend 50 ng/ml (Proteingehalt) GRA-3 und 10 % Serum von den Patienten während 7 Tagen inkubiert, um das PBL zu sensibilisieren und unter Erhalt von Killerzellen-Zubereitungen. Diese werden nachfolgend als GRA-3-K-T-7 bezeichnet.

Beispiel 8

(i) GRA-M-1, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2(2b) wurde mit physiologischer Kochsalzlösung so verdünnt, dass der Gehalt an Zucker 1, 0 ug/ml und an Protein 1,6 ug/ml betrug. Auf diese Weise erhielt man sin Anti-Krebsmittel Nr. 1.

c t

(ii) Ein Krebsgewebe von C3H/He spontan auftre-0 tendem Brustkrebs wurde steril zu einem 5 mm kubischen Klumpen geschnitten und unter die Rückenhaut von jeweils 10 C^H/He-Mäusen des gleichen Stammes wie oben (7 Wochen alt, männlich) transplantiert. 7 Tage nach der Transplantation wurde die Fixierung und Multiplizierung des Krebses bestätigt. 5 dieser Mäuse erhielten subkutan das gemäss (i) hergestellte Anti-Krebsmittel Nr. 1 in einer Dosis von 300 μΙ/Tag in 2-tägigem Abstand. Die restlichen 5 Mäuse wurden als unbehandelte Kontrolle verwendet. 10 Tage nach der ersten Verabreichung wurde der Tumor operativ entfernt und dessen mittleres Gewicht gemessen. Gleichzeitig wurde eine pathohistologische Untersuchung durchgeführt.

Tumorvolumen

25 behandelte Gruppe: 22,3mm³ (Fig.14) Kontrolle: 162,7 mm³ (Fig.15)

Dies bedeutet, dass der Tumor um 86,3 % zurückging. 3 0

In der Kontrollgruppe (Fig.16) wurden vogelnestähnli che Krebskörper gebildet, wobei die Art des Gewebes

J*

einem markähnliehen kanalförmigen Krebs entsprach und eine Verfielfachung der Krebszellen über das Gesamtgewebe festgestellt wurde. Andererseits verursachten bei der Gruppe, die mit dem Mittel behandelt wurde i(Fig. 17) die Krebszellen eine Verflüssigungsnecrosis

an den Stellen, wo sich die Krebszellen gebildet hatten . und .eine Verkalkung und Firosis wur- .

den festgestellt, wobei nur eine sehr geringe Menge an Krebszellen zurückblieb. Dies bestätigte die Anti-Krebseigenschaften des erfindungsgemässen Anti-Krebsmittels.

Testbeispiel 1

GRA-1-K-T (1 μΐ), erhalten gemäss Beispiel 1, wurde auf eine Mikroplatte (hergestellt von Falcon Corp.) gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurden 4 μΐ FCS (hergestellt von Falcon

20 Corp.) zugegeben und die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Neuraminidase-

N behandelte rote Blutzellen von Schafen (SRBC ), eingestellt auf eine Anzahl von 1 χ 10 /ml, und 5 μΐ eines 0,1M Phosphatpuffers (pH 7,2) zu dem 0,85 % NaCl zugegeben worden waren, wurden zugegeben und dann wurde die Platte einer Zentrifugenabscheidung in einer Rate von 6.000 Upm während 5 Minuten unterworfen. Dann wurde die Platte umgedreht und nicht-umgesetzte SRBC wurde entfernt. Eine Färbelösung (Brilliant Cresyl Blau,

30 ' 'hergestellt von Merck & Co.) wurde zum Färben der

Lymphocyten zugegeben und eine rosettenförmig ausgebildete

Positivität wurde festgestellt. Wenigstens 98 % zeigten die rosettenförmige Positivität (T-Zellen).

Testbeispiel 2

if i§£i}eKrebszellen abtötende Aktivität

(a) Von den in Tabelle 1 gezeigten Krebszellen wujrden die nachfolgenden 5 Zellstämme mit unterschiedlichen GRA-Positivitätsverhältnissen als zu bekämpfende Human-Krebszellen verwendet:

15 Zu bekämpfende Krebszellen:

Nr.	1	BT-1	(Burkitt Lymphoma)
Nr.	2	Daudi	(Burkitt Lymphoma)
Nr.	3	KATO-III	(Magenkrebs)
Nr.	4	MKN-45	(Magenkrebs)
Nr.	5	MOLT	(T-Zellen Leukemia)

Auf einer Mikroplatte (hergestellt von Falcon Corp.) wurden pro Vertiefung 5 χ 10" der zu bekämpfenden Krebszellen durch Zentrifugenabscheidung mit einer einer Rate von 8.000 üpm während 5 Minuten aufgebracht.

Dann wurden vorsichtig 4 χ 10 pro Vertiefung des nach Beispiel 1 erhaltenen GRA-1-K-T zugegeben und dann wurde 1 Stunde inkubiert.
30

Die Abtötungsaktivität · wurde je nach dem¹Grad der

Belagbildung festgestellt und wie folgt bewertet:

++ eine merkliche Abtotungsaktivität wird fest- - -

gestellt

+ eine Abtotungsaktivität wird festgestellt + eine geringe Abtotungsaktivität wird feststellt
- eine Abtotungsaktivität kann nicht festgestellt

werden. 10

In einer Kontrollgruppe wurden unsensibilisierte humane periphere Blutlymphocyten, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden waren, jedoch ohne Verwendung von GRA, verwendet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt.

Aus Tabelle 6 geht hervor, dass die erfindungsgemäss gebildeten Killer-T-Zellen eine starke GRA-spezifische eytotoxische Aktivität aufweisen. 20

Tabelle 6.

	zu bekämpfende	(Fig.	1)	GRA-Positivver-	Beurteilung	der Be-
	Krebszelle	: (Fig.	3)	hältnis (%)	lagbildung
GRA-1-K-T-	Daudi	(Fig.	5)	93,1	++ (Fig.	2)
Gruppe	ΚΛΤΟ-ΙΙ]	(Fig-	7)	57,3	+ (Fig.	4)
	BT-1	(Fig.	9)	50,1	++ (Fig.	6)
	MKN-45			1rO	+ (Fig.	3)·
	MOLT			0,6	- (Fig.1	0)
Kontroll	BT-1		50,1	- (Fig.1	1)
gruppe

- ys -

(b)

Die gleichen zu bekämpfenden Krebszellen, wie

sie in (a) verwendet wurden (3,2 χ 10 ) wurden mit 8x10 GRA-1-K-T (Zellverhältnis 5/1) vermischt und das gebildete Zellgemisch (Gesamtanzahl 4 χ 10 ) wurde in einem 15 % FCS enthaltenden RPMI-1640-Medium kultiviert. Nach 1 Stunde wurde die Anzahl der verbliebenen Seilen gezählt und das Inhibierungsverhältnis wurde gemäss folgender Gleichen errechnet:

Cytotoxizität (%) =

Anzahl der Zellen (1 _ ₍ nach der Kultivierung _{) y/] QQ)} Anzahl der Zellen vor der Kultivierung (4 χ 106)

Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

zu bekämpfen	Anzahl	106	der Zellen	der KuI-	x 106	TCyto-
de Zellen	vor der Kul	106	nach	tivierung	χ 106	:toxizität
	tivierung	106	2,9	χ 106	U)
Daudi	4 χ	106	3,7	χ 106	28
KATO-III	Δ ν	106	3,2	χ 106	7,5
BT-1	4 χ	3,9	20
MKN-45	4 χ	4,2	2', 5
MOLT	4 χ	-5

(c) Das Verfahren von (b) wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass das Mischverhältnis von GRA-1-K-T..' zu den zu bekämpfenden Krebszellen auf 5/3 verändert wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 8

zu bekämpfen de Zellen	Anzahl < vor der Kul tivierung	χ 106	äer Zellen nach der Kul tivierung	χ 106	Cyto- toxizität . (%)
Daudi	4	χ 106	3,6	χ 106	91 -
KATO-III	4	χ 106	3,6	χ 106	. 24
BT-1	4	χ 106	1,4	χ 106	65
MKN-45	4	χ 106	3,7	χ 106 ■	7,2
MOLT	4	4,1	-3

Testbeispiel 3

C3H/He-spontan brustkrebsige Mäuse erhielten subkutan GRA-M-1-KT-, erhalten gemäss Beispiel 2, in einer Dosis von 2 χ 10 /0,3 ml Mais 3-mal wöchentlich jeden zweiten Tag. Nach 10 Tagen wurde der Fokus herausgenommen und untersucht. Bei diesem Versuch stellt man fest, dass GRA-1-K-T eino hohe Bindungsaktivität gegenüber Daudi, KATO-III und BT-1, aber nur eine niedrige Bindungsaktivitat gegenüber MKN-45 und MOLT zeigt.

Wie in Fig. 12 gezeigt wird, fand eine Infiltration von Lymphocyten in die Krebszellen statt und ein Aufbrechen des Tumorbereiches wurde festgestellt. Aus Fig. 13 geht hervor, dass eine Kalzifizierung der Tumorfläche stattgefunden hat und daraus kann man sehen, dass die erfindungsgemässen Krebszellen eine Antitumoraktivität aufweisen.

Vergleichsbeispiel 1

In diesem Beispiel wurden Krebszellen per se als spezifische Antigene anstelle von GRA für das Verfahren I i ι

gemäss der Erfindung verwendet.

Krebszellen-sensibilisierte Lymphocyten wurden in gleicher VJeise wie in Beispiel 1 erhalten, wobei jeicäoch anstelle von GiRA, BT-I, Daudi, KATO-III oder MKN-45 in einer Menge von 1x10 pro Laborschale verwendet wurden.

Mit diesen Lymphocyten wurde die c.ytotoxische 35

HS

Aktivität in gleicher Weise wie im Testbeispiel 2(a) untersucht und die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt.

Aus Tabelle 9 geht hervor, dass die oben hergestellten Lymphocyten keine cytotoxische Aktivität aufweisen.

Tabelle 9

zu bekämpfende Zelle

BT-1 Daudi KATO-III MKN-45

Zellen, die für die Sensibilisierung von Lymphocyten verwendet wurden

BT-1

Daudi

KATO-III

MKN-45

Testbeispiel 4

In gleicher Weise wie im Testbeispiel 2-(b) wurde die krebszellenabtötende Aktivität von GRA-(-K-T, GRA-3-A-K-T und GRA-3-C-K-T, erhalten in Beispiel 4, bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle TO gezeigt.

Zelle

Tabelle 10 % Cytotoxizität

GRA-8-K-T

GRA-3-A-K-T

GRA-3-C-K-T

KATO-III	8	,0
BT-1	4	,3
MKN-45	20
MOLT	0

Testbeispiel 5

5,0 5,0 5,0 0

5,0 4,0 20 0

(a) Die Cytotoxizität der Killerzellen-Zubereitungen, erhalten gemäss Beispiel 6 wurde mittels eines Cr-Färbetests (J. Immunol., 122, 2527-2533 (1979)) bestimmt. Dazu wurden 50 \iCi radioaktives Cr (Japan Isotope Association) zu KATO-III (2x10 ) gegeben und die Zellen wurden 1 h bei 37°C in RPMI-1640-Medium inkubiert und anschliessend durch Zentrifugieren gewaschen unter Erhalt von Cr-markierten Target-Zellen. Die Killerzellen (Effektorzellen) (2x10 ) wurden zu den Target-Zellen (1x10 ) gegeben (das Verhältnis E/T betrug 20/1) und die Mischung wurd 4 h bei 37°C in RPMI-1640-Medium inkubiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch Zentrifugieren gesammelt und die Radioaktivität wurde durch einen Flüssigsintiilator gezählt.

Die spezifische Cr-Freigabe (%),die der cytolytischen Aktivität der Effektorzellen entspricht, wurde nach folgender

Gleichung bestimmt:

51
Spezifische CR-Freigabe (%)

(Freigabe im Versuch ) - (Spontane Freigabe)

(Maximale Freigabe)

- (Spontane Freigabe)

- 4Ä -

Die maximale Freigabe zeigt die Radioaktivität wenn alle Zellen aufgelöst sind.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 11 gezeigt:

	Tabelle 11	Spezifische Freigabe 51Cr: (%)
Killerzellen	13
GRA-1-K-T-1	25
GRA-1-K-T-2	22
GRA-1-K-T-3	20
GRA-1-K-T-4	22
GRA-1-K-T-5	25
GRA-1-K-T-6	27
GRA-1-K-T-7	32
GRA-1-K-T-8

Aus den Ergebnissen in Tabelle 11 ist erkennbar, dass TCGF und FCS keine Beziehung auf die Induzierung der Killerzellen haben.

(b) Cytotoxizität von GRA-2-K-T erhalten in Beispiel 3 wurde in gleicher Weise wie in (a) oben mittels des Cr-

51 Freigabetestes bestimmt. Die spezifische Cr-Freigabe betrug 14,3 % bei einem Cr-markiertem KATO-III als Target-Zelle (E/T = 20/1).

Testbeispiel 6

(a) Unter Verwendung von KATO-III (E/T = 20/1) wurde die Cytotoxizitat von Killerzellen, erhalten gemäss Beispiel 7-(a) in gleicher Weise wie im Testbeispiel 2-(b) bestimmt.

Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt:

	Tabelle 12	% Cytotoxizitat
Killer-Zellen	38,0
GRA-3-K-T-1	18,2
GRA-3-K-T-2	20,9
GRA-3-K-T-3	23,2
GRA-3-K-T-4	24,5
GRA-3-K-T-5	20,2
GRA-3-K-T-6

(b) Die Cytotoxizitat von GRA-3-K-T-7, erhalten gemäss

51 Beispiel 7- (b) wurde unter Verwendung von Cr-KATO-III

(E/T = 29/1) als Target-Zellen in gleicher Weise wie im Testbeispiel 5 bestimmt. Die spezifische Cr-Freigabe |der Killerzellen betrug 25,5 %..
25

Testbeispiel 7

Die Cytotoxizitat von Killerzellen, erhalten in Beispiel 5,

51
wurde mittels des Cr-Freigabetests in gleicher Weise wie im Testbeispiel 5 bestimmt. Die verwendeten Target-Zellen waren Cr-markierte X5563-Zellen. Als Kontrolle wurden Lymphocyten, die in gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhalten worden waren mit der Ausnahme, dass die Sensibilisierung der Milzzellen durchgeführt worden war mit 1x10 /Well von

35 Mitomycin C-behandelten X5563-Zellen (5x10 /ml von

- 4-6 -

X5563-Zellen wurden mit 50 ug/ml Mitomycin C während 60 Minuten behandelt) anstelle von GRA-M-5, verwendet.

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 13 gezeigt:

	Tabelle	4	13	0:1	20:1 1	0:1
	Spezifische	1 1		2,7 8,4 0,0	6,3 20,6 1 0,0	5,7 3,7 0,0
		51Cr-Freigabe (%)
Killerzellen	E/T-Verhältnis
GRA-M-5-K-T-1 GRA-M-5-K-T-2 Kontrolle

Testbeispiel 8 (H-2-Assay)

GRA-M-1, GRA-M-3 und GRA-M-4, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2 wurden einer Serienverdünnung mit PBS (0,85 % NaCl) unterworfen, unter Erhalt von Proben.

Anti-H2-Serum vom National Institute of· Genetic Research und die obigen Proben wurden vermischt und bei 4°C 2 h inkubiert und dann wurden Target-Zellen entsprechend dem verwendeten Anti-H-2-Serum zugegeben. Milzzellen oder Lymphknotenzellen, erhalten aus B10 (H-.2^b) und B10-BR (H-2^k) Mäusen nach üblichen Methoden wurden als Target-Zellen verwendet. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS wurde Komplement (Kaninchen) zu den Zellen zugegeben und die Zellen wurden 1 h bei 37°C inkubiert und mit 0,2 5Trypan-Blau-PBS angefärbt zur Bestimmung der prozentualen Cytotoxizitat. Das Anti-H-2-Serum wurde in einer Maximalverdünnung verwendet, so dass es wenigstens 95 %ige Cytotoxizitat bei Abewesen-

35 heit von GRA zeigte.·

so ■'■■■'■- '·■■"

Die Blockierungswirkuhg von GRA in den Systemen wird in Tabelle 14 gezeigt:

Tabelle 14 GRA Anti-H-2 Serum, Kongentration Target-Zellen

5 GRA-M-I D-23 fAnti-H-2K^k), X80 BlOBR (H-2^k)

or , Milzzellen

D-32 (Anti-H-2D^K), X300

GRA-M-3 D-33 (Anti-H-2K^b), X600 BIO (H-2^b1

oder, Milzzellen

D-2 (Anti-H-2D^D), X80

10 GRA-M-4 D-23 , X80 BlO-BR (h-2^k)

oder Lympftknotenzel-ien

D-32 , Χ300

Die Ergebnisse werden in Tabelle 15 gezeigt. 15 Table

	Anti-H-2	X2	X4	I	% Cytotoxizität	X64	-	X256	X512	0	*
	Serum	-	13	II	Verdünnung der Probe	14	X128	14	13	14	13
GRA		-	97	III	X8 X16 X52	97	13	97	96	96	14
I	D-23	-	95	14 12 13	94	96	95	96	95	13
	D-32	-	19	99 96 97	15	95	11	12	13	14
	-	-	98	95 95 95	98	12	99	99	99	15
II	D-33	-	95	15 14 12	97	99	97	95	95	17
	D-2	100	100	98 99 99	-	95	-	■-	100	10
	D-23	99	99	96 95 95	-	-	-	-	99	10
III	D32	GRA	100 100		-
	Anmerkung -. I I	GRA	99 99
	I	GRA	: GRA-M-I
		: GRA-M-3
		: GRA-M-4

"*" bedeutet % Cytotoxizität, wenn.Jiurr_-w-U . ' Komplement verwendet wurde.

Aus den Ergebnissen in Tabelle 15 kann man entnehmen, dass GRA-M-1, GRA-M-3 und GRA-M-4 keine H-2 haben.

Testbeispiel 9 5

C57BL/6 Mäusen wurde unter S.C. LLC (2x10 ) des gleichen Stammes transplantiert und nach 6 Tagen wurde 1ng (Protein) GRA-M-3, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2-(d), subkutan verabreicht. Diese Verabreichung wurde einmal täglich in gleicher Dosierung an 4 Tagen wiederholt. Am Tage nach der letzten Verabreichung wurden die Tumorzellen herausgeschnitten und gewogen. Zur Kontrolle wurden Tiere verwendet, denen nur physiologische Kochsalzlösung verabreicht worden war. Jede Testgruppe bestand aus 5 Tieren.

Als Ergebnis stellte man fest, dass das durchschnittliche Krebsgewicht bei der Kontrollgruppe etwa 500 mg war. Bei der GRA-M-3-behandelten Gruppe zeigten 3 ein Verschwinden der Tumore und zwei zeigten ein durchschnittliches Tumor-

20 gewicht von 100 mg.

Testbeispiel 10

C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit 1 ng (Protein) GRA-M-3, erhalten in Referenzbeispiel 2(d),einmal täglich während 3 Tagen immunisiert und am 5. Tag wurden Milzzellen von den Tieren zur Gewinnung von Effektor-Zellen gesammelt. Eine Mischung der Effektorzellen und von Lewis-Lungencarcinom '(LLC) als Target-Zellen in einem Verhältnis von E/T = 50/1 3Ö wurde hergestellt und ein Teil (1x10 ) davon wurde in Mäusen des gleichen Stammes transplantiert und eine Winn-Assay Wurde durchgeführt (J. Immunol. 86, S. 228-239 (1961)).

fa

' Elie erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 16 gezeigt. 35

	Sl -VS-	16	Tag 17	Tag 18	Tag	Krebses (%)	324956
	Tabelle	Wachstumsgeschwindigkeit des	5,5	5,7	3,1	19 Tag 20
Effektor		Tag 15	39,5	37,1	55,4	1,4	Tag 20 Mortali
zellen	5,7	65,1	61,7	98,1	76,8	tät / fruppe
A	21,4		96,4	0/10
B	39,3		' 4/10
C	4/10

Anmerkung: Gruppe A sind die Milzzellen von GRA-M-3-immu-

nen Mäusen;

Gruppe B sind die Milzzellen ναι normalen Mäusen; Gruppe C sind die Milzzellen von Mäusen, 10 Tage nach der Transplantation von LLC(1x10 );

Die Krebswachstumsrate wurde nach folgender Gleichung berechnet:

rn -T

Ά Ν

Krebswachstumsrate (%) = ——=—- χ 100

dabei bedeutet T die Dicke der Fussohle an der Seite wo der Krebstranplantiert war und T-, die Dicke einer normalen Fussohle.

ι' !

25 Testbeispiel 11

C3H/He Mäuse wurden mit 4,5 ug (Protein) GRA-M-4, erhalten in Referenzbeispiel 2-(d) und 0,1 ml Freund's Complete Adjuvant sacrococcygeal immunisiert. Nach 2 Wochen wurden Lymphknotenzellen in üblicher Weise gesammelt und als Responder-Zellen für die Bestimmung der proliferativen Ansprechung durch GRA-M-4 verwendet.

S3

- Bff -

Zu diesem Zweck wurden Responder-Zellen (4x10 ) mit RPMI-1640-Medium, enthaltend 15 % FCS in Gegenwart von GRA-M-4 während 5 Tagen inkubiert. Während der letzten 18 Stunden der Inkubierungszeit wurde IuCi von H-Thyitiidine ( H-TdR) zu dem Medium zugegeben und die Inkorporation in die Zellen wurde gezählt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt.

Tabelle 17

Konzentra- 3-H-TdR-Inkorporation GRA-M-R tion (ng/ml) (Mittel cpm + Standardirrtum)

S.I.

Kontrolle Versuch

0	5.302 +_	1	.761
0,5	7.903 _+	1	.290
1	10.076 +		936
5	10.686 +_		429
20	10.615 +	1	.270
40	8.565 +	1	.419

1,5 1,9 2,0 2,0 1,6

Anmerkung: "S.I." ist der Stimulierungsindex, ausgedrückt durch Experiment/Kontrolle

Jestbeispiel 12

Die verzögerte Hypersensibilisierung (DTH)-Ansprechung von CSH/HE-Normalmäsuen, X5563-Immunmäusen und MH134-Immunrnäusen, erhalten in gleicher Weise wie in Beispiel 5, und von GRA-M-4-Immunmäusen und GRA-M-5-Immunmäusen, erhalten In gleicher Weise wie im Testbeispiel 11, wurde durch die Fussohlen-Reaktion (FPR) bestimmt. Dazu wurden GRA- oder MMC-behandelte Tumorzellen in die Haut der Fussohle im

-Si-

Hinterbein der Tiere eingegeben und das Anschwellen der Fusssohle 24 h nach der Behandlung wurde festgestellt. Die DTH-Ansprechung wurde berechnet, indem man die Anschwellung vor der Behandlung von der nach der Behandlung (10 mm) abzog.

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabellen 18 gezeigt.

Tabelle 18

_2 Mittleres Fussohlenanwachsen (10 mm)

Versuch Normalmäuse MH134 Immunmäuse

1	2,8	13,6
2	12,4	32,0
3	3,6	3,6
4	3,2	22.0
5	6,8	27,6

Anmerkung: Gruppe 1: Syngenische normale Milz 1x10 /20 μΐ-

Medium (Hanks-Lösung)

Gruppe 2: MH134-Zellen 1x10⁶/20 μΐ Medium Gruppe 3: Medium 20 μΐ

Gruppe 4: GRA-M-4, 0,8 μg (Protein)/20 μΐ Medium Gruppe 5: GRA-M-4, 0,4 μ9 ν

sS

-Vl-

Tabelle 19

Mittleres FussohlensrwacfcBen (10 mm)

Versuch Normalmaus X5563-Immunmaus MH134 Immunmaus

1	5,4	4	,3	1	,1
2	0,9	-		24	,3
3	2,0	16	,9		—

10 Anmerkung: Gruppe 1; Medium (Hanks-Lösung) 20μ1

Gruppe 2; GRA-M-4, 4 ug (Protein)/20 μΐ Medium Gruppe 3; GRA-M-5,

	Tabelle 20	GRA-M-4-Immunmau s
		-0,3 24,6
Versuch	_2 Mittleres Fussohlenanwachsen (10 mm)
1 2	Normalmaus
1,7 5,1

Anmerkung: Gruppe 1; Medium (Hanks-Lösung 20 μΐ

Gruppe 2; GRA-M-4, 4 ug (Protein)/20 μΐ Medium

	Tabelle	21
	Mittleres	_2 Fussohlenanwachsen (10 mm)
Versuch	Normalmaus	GRA-M-4-Immunmau ε
1 2 3	-1/8 6,3 6,8	0,6 20,0 6,3

Amerkung: Gruppe 1; Medium (Hanks-Lösung) 20 11

Gruppe 2; GRA-M-4, 4 μg (Protein)/ 20 μΐ Medium

Gruppe 3; 4 ug (Protein)/ 20 μΐ Medium des

Teiles, der durch eine PNA-Säule zur Zeit von GRA-M-4 (nachfolgend "C.P.") hindurchging

	Tabelle	22
	Mittleres	_2 Fussohlenanwachsen (10 mm)
Versuch	Normalmaus	GRA-M-4-Immunmaus
1 2 3 4	2,4 2,6 2,4 5,5	-1,0 17,7 1,8 18,9

Anmerkung: Gruppe 1; Medium( Hanks-Lösung 20 μΐ

Gruppe 2: GRA-M-4, 3,8 μπι (Protein)/ 20 μΐ Medium Gruppe 3: 3,8 μg (Protein)/20 μΐ von CP. (siehe oben)

Gruppe 4: 3,8 μg (Protein) von GRA-M-4 und 3,8 μg (Protein)/ 20 μΐ Medium von CP.

25 Referenzversuch

X5563-Immunmäuse wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhalten. Die Milzzellen dieser Immunmäuse wurden als Effektorzellen verwendet und die Effektorzellen (10 ) und die Target-ZeIlen (X5563, 10 ) wurden zusammen auf Mäusen des gleichen Stammes transplantiert. Dann wurde eine Winn-Assay in gleicher Weise wie im Testbeispiel 10 durchgeführt.

Die erzielten Ergebnisse werden in Fig. 23 gezeigt, in welcher die Abszisse die Tage und die Koordinate die mittlere Krebsgrösse (cm²) jf Standardirrtum anzeigt, und in welcher die verschiedenen Markierungen folgende Bedeutung haben: 5

• · : Gruppe,zu welcher keine Effektor-Zellen gegeben

wurden;

ο ο : Gruppe, zu welcher nicht-behandelte Effektor-Zellen -gegeben wurden;

Λ A '· Gruppe, zu welcher Effektorzellen, die mit Kaninchen-Komplement behandelt worden waren, gegeben wurden;

χ -x : Gruppe, zu welcher Effektor-Zellen, die mit Anti-

Thy 1 (New England Nuclear Co., USA) behandelt worden waren, und zu der Kaninchen-Komplement gegeben

wurde;

D D: Gruppe, zu der Effektorzellen, die mit Anti-Lyt

(New England Nuclear Co., USA) behandelt worden waren, und zu der Kaninchen-Komplement gegeben wurde;

K fi: Gruppe, zu der Effektor-Zellen, die mit Anti-Lyt

(New England Nuclear Co., USA) behandelt und zu der Kaninchen-Komplement gegeben wurde.

Aus den Ergebnissen von Fig. 23 wird ersichtlich, dass Lyt 1 Typ T-Zellen eine wichtige Rolle in dem Mechanismus des in vivo Effektes bei der Tumorimmunitat spielen.

Weiterhin ist es bekannt, dass die DTH-Ansprechung durch Lyt-1 T-Zellen (J. Exp.Med. 143, S. 1543-39 (1976)) hervorgerufen wird.

Claims (15)

1. PATENT- UND RECHTSANWÄLTE

   PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

   DIPL.-ING. K. FCICHSLE . DR. RER. NAT. B. HANSEN . DR. RER. NAT. H -A. BRAUNS · DIPL.-ING. K. GDRG

   DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

   Patentansprüche

   / 1J Glykoverwandtes Antigen, das aus einer Krebszellen- \_y membrankomponente isoliert wurde und daß sich mit einem Lektin kombiniert, welches sich mit einer endständigen Galactose oder einem endständigen N-Acetylgalactosamin verbindet.
2. 2. Glykoverwandtes Antigen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Krebszellen Human-Krebszellen sind.
3. 3. Glykoverwandtes Antigen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin sich spezifisch mit einer endständigen Galaktose verbindet.
4. 4. Glykoverwandtes Antigen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin Erdnußlektin ist.
5. 5. Glykoverwandtes Antigen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Lektin spezifisch mit einem endständigen N-Acetylgalactosamin verbindet.
6. 6. Glykoverwandtes Antigen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin Dolichos-Bohnenagglutinin ist.
7. 7. Glykoverwandtes Antigen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Krebszellenmembrankomponente eine solche ist, die sich mit einem mit endständiger Galactosebindenden Lektin oder einem mit endständigem N-Acetylgalactosamin-bindenden Lektion kombiniert.

   ORIGINAL INSPECTED

   VRABELLASTRASSE 4 . D-8O0O MÜNCHEN 81 . TELEFON CO 89) 91IO 87 · TELEX 5-29619 CPATHE) · TELEKOPIERER 9183
8. 8. Glykoverwandtes Antigen gemäß Anspruch 7, dadurch 'gekennzeichnet, daß die Krebszellenmembrankomponente eine solche ist, die sich mit Erdnußlektin oder Dolichos-Bohnenagglutinin kombiniert.
9. 9. Verfahren zur Herstellung eines glykoverwandten Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellmembrankomponenten aus Krebszellen durch Homogenisierung oder Solubilisierung gewinnt, die Zellmembrankomponente mit einem Lektin, welches sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder einem endständigen N-Acetylgalactosamin unter Ausbildung eines Lektin-ZeIlmembrankomponentenkomplex kombiniert, behandelt, den erhaltenen Komplex sammelt und das Lektin aus dem Komplex abtrennt und die lektinfreie Zellmembrankomponen-

   15 te sammelt.
10. 10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Krebszellen Humankrebszellen sind.
11. 11. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Lektin verwendet, welches sich spezifisch mit endständiger Galactose verbindet.
12. 12. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Lektin verwendet, welches sich spezifisch mit einem endständigen N-Acetylgalactosamin verbindet.
13. 13. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß iman ein glykoverwandtes Antigen aus einer Krebszellenmembrankomponente zunächst mit einem ersten Lektin, das sich spezifisch mit endständiger Galactose verbindet und dann mit einem zweiten Lektin, welches sich spezifisch mit einem endständigen N-Acetylgalactosamin verbindet, isoliert.
14. 14. Antikrebsmittel enthaltend als aktiven Bestandteil ein aus Krebszellen erhaltenes glykoverwandtes Antigen aus einer Krebszellenmembrankomponente, die sich mit einem Lektin verbindet, welches sich spezifisch mit endständiger Galactose oder einem N-Acetylgalactosamin verbindet.
15. 15. Verwendung eines glykoverwandten Antigens gemäß Anspruch 1 für die Bekämpfung von Krebs.