DE1943699A1 - Heilmittel mit proliferationshemmender Wirkung und Verfahren zur Herstellung dieses Heilmittels - Google Patents
Heilmittel mit proliferationshemmender Wirkung und Verfahren zur Herstellung dieses HeilmittelsInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung dieses Heilmittels
Die Erfindung betrifft ein Heilmittel mit krebsheiranender und '
krebsvernichtender Wirkung. Das Heilmittel besteht aus Immunkörpern, die durch Inkubation der Milz eines von einem Tumor
Befallenen mit den Krebszellen dieses Befallenen gebildet werden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur'Gewinnung
dieser Immunkörper aus der behandelten Milz.
Schon längere Seit war aus Tierversuchen bekannt, daß das Wachstum von TumorzeHresten signifikant reduziert werden
kann, wenn das Homogenat abgetöteter Tumorzellen dem befallenen Tier wieder injiziert wird. Dieses Homogenat steigert
offenbar die Abwehrbereitschaft des Körpers gegen den zurückgebliebenen Tumor.
Ebenfalls in Tierversuchen konnte nachgewiesen werden, daß in der ?iilz Antikörper gegen Tumoren gebildet werden, und daß die
in der MHz gebildeten Lymphzellen die Träger solcher körpereigener
Abwehrstoffe sind. Werden Milzzellen nach partieller Entfernung des Tumors mit Tumorzellen des gleichen Tieres inkubiert/
und wird ein Homogenat dieser inkubierten Milzzellen dem Tier wieder injiziert, dann entwickelt sich der Primärtumor
nicht weiter. Die proliferationshemmende Wirkung des
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Homogenats ist dann besonders stark, wenn die "ilzen der befallenen
Tiere erst 14 Tage nach der partiellen Tumorentfernung
herausgenommen werden.
Bei diesen Antikörpern handelt es sich also offenbar um zelluläre,
an Lymphozyten gebundene Körper, die sich nach der Tumorentfernung
in der M.ilz des Tumortr?gers anreichern. Diese
Immunkörper sind spezifisch, d.h., sie wirken nur gegen den Tumor des Tieres, von dem Tumor und M.ilz stammen; sie wirken
nicht bei anderen, nicht gengleichen Tieren der gleichen Art und Rasse, und auch nicht bei anderen Tumoren.
Interessant ist in diesem Zusammenhang, daß an Mäusen, die unmittelbar
nach der Geburt thymektomiert wurden, eine viel höhere Angehrate für Impftumoren beobachtet wurde als bei scheinthymektomierten
oder nicht operierten Mäusen. Der Thymus scheint somit als embryonaler und postnataler Codierungsort für die
immunkompetenten Lymphozyten eine große Rolle zu spielen.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die Antikörper, die offenbar in den Milzen der von Tumoren Befallenen gebildet v/erden,
zu isolieren und in eine Form zu bringen, in der sie den Befallenen als Heilmittel gegen ihren Tumor verabreicht v/erden
können.
Das erfindungsgeinäße Verfahren zur Gewinnung der Tumorantikörper
besteht darin, daß ein Homogenat, d.h. eine Suspension von feinstzerkleinerten Zellen, sowohl von Tumormaterial als
auch der Milz des Tumorträgers zubereitet wird. Mit dem Tumorhomogenat wird das Milzhomogenat inkubiert. Das derart behandelte
Homogenat wird dann angesäuert, wobei neben anderen Stoffen
auch die im Homogenat gebildeten Antikörper, die in diesem Stadium der Gewinnung wahrscheinlich noch an Milzzellen fixiert
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sind, in Lösung gehen. Diese saure Extraktion wird vorzugsvreise
dadurch gefördert, daß ein niederer aliohatischer Alkohol zugesetzt wird.
Nachdem der saure Extrakt vom unlöslichen Seilmaterial abgetrennt
worden ist, wird er neutralisiert, wobei ein Teil der
Proteine ausfällt, der abgetrennt wird. Die übrig gebliebene Lösung wird erneut angesäuert, und falls bei der sauren Extraktion
ein Alkohol zugegeben worden war, wird dieser nun
unter Vakuum bei mäßigen Temi
schreiten sollen, verdampft.
schreiten sollen, verdampft.
unter Vakuum bei mäßigen Temperaturen, die 45 C nicht überaus
der Mutterlauge wird nun das Immunmaterial zusammen mit restlichen Proteinen, Salzen und anderen Stoffen ausgesalzen,
und aus dem Niederschlag werden die Antikörper durch Eisessig extrahiert. Der vom Unlöslichen abgetrennte Eisessigextrakt
enthält die Antikörper aber noch in verunreinigter Form. Deshalb wird er aus dem Extrakt ausgefüllt, wobei sich zwei Fraktionen
bilden, die beide aktiv sind. Die erste Fraktion ist acetonunlöslich, die zweite fraktion ist acetonlöslich/ jedoch
petrol'^therunlöqlich. Das Ausfällender beiden Fraktionen wire:
vorzugsweise mehrmals wiederholt, bis schließlich jede Fraktion
keine Anteile der anderen Fraktion mehr aufweist.
Einer von einem Tumor befallenen Kranken wird mindestens ein Teil des Tumors entnommen und daraus in einem Homogenisator
ein Homogenat zubereitet. Dem gleichen Kranken wird die 'UIz
herausoperiert, die ebenfalls in einem Hopogenisator zu einen
Homocrenat verarbeitet wird.
Io g des Tumorhomogenats in etwa 2o g 'Ringerlösung werden nun
dem gesamten Milzhomogenat (etwa 15o g) bei 37°C drei Ftunden
inkubiert. 15o g dieses behandelten "ilzhomogenats worden mit
ORlßlNAL INSPECTED
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1,75ml konzentrierter Salzsäure und 45o ml 95%igem Isopropylalkohol
versetzt, und das Ganze wird 2 Std. im: Schnellrührer verarbeitet. Nach dem Abzentrifugieren des sauren Extraktes
wird der Rückstand noch einmal mit 3oo ml Isopropanol extrahiert.
Die Extrakte werden vereinigt.
Die vereinigten Extrakte werden mit Natronlauge auf einen nH-T-?ert
von 7,5 eingestellt. Der Niederschlag, der sich dabei bilr det, wird abfiltriert oder abzentrifugiert und verworfen.
Dann wird die übriggebliebene Lösung mit Salzsäure auf einen
pH-Wert von 2,5 angesäuert. Der Isopropy!alkohol wird unter
Vakuum bei höchstens 45°C abgedampft.
Zurück bleibt ein trüber, wässriger Extrakt, der mit einem Salz,
vorzugsweise mit Ammoniumsulfat, gesättigt wird. Zugleich wird
Äther zugesetzt, um das Fett zu extrahieren. Diese Operation wird zweckmäßig in einem Scheidetrichter vorgenommen. Dabei
bilden sich drei Phasen: eine untere wässrige und kochsalzgesättigte Phase, eine auf der wässrigen Phase schwimmende
Schicht aus ausgesalzten Material, und eine obere Schicht aus fetthaltigem Äther. Das gesamte Material wird abgenutscht; auf
der Nutsche bleibt das ausgesalzte Material zurück, das neben den Immunkörpern noch Proteine und Salze des Hilzhomogenats
enthält.
Dieses Material wird nun mit 25 ml Eisessig extrahiert; danach wird vom Unlöslichen, das aus Restproteinen und Salzen besteht
und verworfen wird, abfiltriert.
Das klare, gelb gefärbte Filtrat enthält die Tumorantikörper
noch in stark verunreinigter Form. Sie werden durch Ausfällen und Umfallen gereinigt. Hierzu wird der Eisessigextrakt mit 3
bis 4 Volumenteilen wasserfreiem Aceton versetzt, bis die stärkste Niederschlagsbildung überschritten ist; der gebildete,
ziemlich grobe, gelbliche Niederschlag wird abgenutscht. Die Ausbeute beträgt 0,1 bis O,2 g.
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Die acetonhaltige, zurückbleibende Lösung (etwa loo ml) wird
mit 4oo ml eines 1: l-Petroläther:Ä"thergemisches versetzt. Es
bildet sich ein feinflockiger/ weißlicher Niederschlag/ der ebenfalls abgenutscht wird. Die Ausbeute beträgt 0,05 bis
0,1 g trockene Substanz.
Der bei der Acetonfällung erhaltene Niederschlag wird mehrfach in Eisessig gelöst, und die Ausfällungen mit Aceton und Petroläther
werden wiederholt. Desgleichen wird derpei der Petrolätherausfällung
erhaltene Niederschlag in Eisessig gelöst und erneut mit Aceton und Petroläther/Äther ausgefällt, bis die
vereinigten Niederschläge nur noch aus acetonlösliehen Anteilen,
bzw. aus acetonunlöslichen Anteilen bestehen.
Beide Komponenten sind in physiologischer Kochsalzlösung löslich. Sie werden keimfrei filtriert, und die entstandenen Lösungen
stellen das fertige Heilmittel dar, das intravenös oder intramuskulär injiziett werden kann.
Die beiden wirksamen Fraktionen können gegebenenfalls noch weiter gereinigt werden, z.B. durch Elektrophorese oder durch
Säulenchromatographie. Die Antikörper laufen etwa mit der Wanderungsgeschwindigkeit
der Immun-Globuline des Blutserums.
Zum Aussalzen kann außer Kochsalz ein anderes akzeptables Salz, wie z.B. Ammoniumsulfat verwendet werden.
Um die relativ großen Volumen der wässrigen Extrakte zu vermeiden,
kann man den wässrigen Extrakt im Dünnschichtverdampfer auf etwa ein Viertel des Ausgangsvolumens einengen, so daß man
später kleinere Mengen des ausfällenden Mediums benötigt.
Da die Antikörper an Kaolin, Tierkohle und andere Absorbentien, wie z.B. Dextransulfat absorbiert werden, kann man auch so
vorgehen, daß man den sauren wässrigen und eingeengten Extrakt mehrfach mit Kohle behandelt und die Kohle mit Eisessig
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extrahiert, nachdem sie vorsichtig unter Vakuum getrocknet wurde.
Die Weiterverarbeitung dee Eisessigextraktes erfolgt wie
oben beschrieben.
Die eingeengten v/3 s sr igen Extrakte könnten auch mit einem
Schwermetallsalz, wie Bleiacetat, oder mit einem anderen eiweißfällenden
Mittel/ wie Trichloressigsäure behandelt werden, worauf die Niederschläge sorgfältig im Vakuum getrocknet und
dann mit Eisessig oder erst mit Wasser extrahiert werden. Bei
diesen zuletzt genannten Modifikationen des Herstellungsverfahrens wird aber relativ viel Eiweiß mitgeschleppt, so daß das
im Beispiel beschriebene Verfahren am vorteilhaftesten ist·.
Die aus dem Eisessig ausgefällten zwei Fraktionen können durch empfindliche chemische oder physikalische Methoden in insgesamt
neun Unterfraktionen aufgetrennt werden. Dabei würde aber zuviel Material verloren gehen und keine Erhöhung der Wirksamkeit
erzielt. Es genügt deshalb, die beiden oben beschriebenen Fraktionen zu gewinnen.
Durch entsprechende Vorbehandlung des Kranken kann die Ausbeute an Immunkörpern gesteigert werden. So kann z. B. der Kranke,
nachdem der Primärtumor entfernt wurde, mindestens 14 Tage mit einem wässrigen Extrakt des Tumorhomogenats behandelt werden,
worauf die Milz entnommen und das erfindungsgemäße Verfahren wie oben beschrieben vorgenommen wird. Dieser wässrige Extrakt
des Tumorhomogenats wird zwecJanäßigerweise auf die gleiche Weise
zubereitet wie die wässrige Lösung der Antikörper nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Das Tumorhomogenat, bzw. dessen
wässriger Extrakt wird in das Blut des Kranken injiziert. Gegebenenfalls kann auch eine leicht zugängliche Metastasse anstelle
des Primärtumors verwendet werden, Bestehen Metastasen neben
einem Primärtumor, sollte mindestens ein Teil des Primärtumors
entfernt und die Milz sofort exstirpiert werden. Die Aufarbeitung erfolgt dann in der angegebenen Weise»
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Claims (4)
1. Heilmittel mit proliferationshemmender Wirkung, bestehend
aus Immunkörpern, die aus einem Homogenat der Milz eines von
einem Tumor Befallenen, das mit einem Homogenat dieses Tumors inkubiert worden ist, durch saure Extraktion und Ausfällen einer
ersten, acetonunlösliehen Fraktion und einer zweiten,
petrolntherunlösliehen Fraktion aus dem sauren Extrakt gewonnen
worden sind.
2. Verfahren zur Herstellung des Heilmittels gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man
a) ein aus der 1^iIz eines von einem Tumor Befallenen zubereitetes
Homogenat mit einem aus diesem Tumor zubereiteten Homogenat inkubiert,
b) die Suspension des inkubierten Homogenats ansäuert, gegebenenfalls
unter Zusatz eines niederen Alkohols,
c) die Suspension abzentrifugiert,
d) das Zentrifugat auf einen pH-Wert von etwa 7,5 einstellt,
e) den gebildeten Niederschlag abfiltriert,
f) das Filtrat auf einen pH-Wert von etwa 2,5 ansäuert,
g) den gegebenenfalls zugesetzten Alkohol unter Vakuum bei Temperaturen unter 45°C abdampft,
h) die wässrige Lösung mit Salz, vorzugsweise mit Ammoniumsulfat,
sättigt, wobei man gegebenenfalls Äther zusetzt, i) den ausgesalzenen Niederschlag mit Eisessig extrahiert und
j) aus dem Eisessigextrakt eine erste acetonunlösliehe Fraktion
und eine zweite petrolätherunlösliehe Fraktion ausfällt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Ansäuern in den Stufen b) und f) Salzsäure, zum Neutralisieren
in der Stufe d) Matronlauge und als Alkohol in Stufe b)~
Isopropanol verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die in der Stufe h) erhaltenen Fraktionen durch wiederholtes
Auflösen in Eisessig und Ausfällen mit Aceton und PetrolHther vollkommen von Anteilen der anderen Fraktion befreit.
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1969
- 1969-08-28 DE DE19691943699 patent/DE1943699A1/de active Pending
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1970
- 1970-08-26 CH CH1274770A patent/CH537189A/de not_active IP Right Cessation
- 1970-08-27 FR FR7031363A patent/FR2068524B1/fr not_active Expired
- 1970-08-28 GB GB4148570A patent/GB1319528A/en not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT382080B (de) * | 1981-10-01 | 1987-01-12 | Otsuka Pharma Co Ltd | Verfahren zur herstellung von glykoverwandtem antigen |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2068524B1 (de) | 1974-08-23 |
| CH537189A (de) | 1973-05-31 |
| FR2068524A1 (de) | 1971-08-27 |
| GB1319528A (en) | 1973-06-06 |
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