Hintergrund der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Immunologie und
insbesondere neue Verfahren zur in vivo-Immunisierung oder
Therapie, wobei Liganden, die durch den T-Zellrezeptorkomplex
gebunden werden, allein oder in Kombination mit anderen
Molekülen auf festen Trägern mit einem Durchmesser von mehr als
etwa 0,2 um angeordnet sind, wobei bekannt ist, daß sie in
vivo T-Zell-vermittelte Reaktionen hervorrufen und
verstärken.
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Zur Erleichterung für den Leser sind die folgenden
Abkürzungen, die zur Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung
und der Erfindung verwendet werden, nachstehend definiert.
Definitionen
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Klasse I-Protein Produkte der K-, D- oder L-Loci von Mäuse-
MHC, z. B. H-2Kk oder H-2b. (H-2-Protein
bedeutet das gleiche wie Klasse
I-Protein.)
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ConA Concanavalin A (Extrakt von Schwertbohnen
(Canavalia ensiformis), ein mitogenes
Lectin).
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CTL Cytolytische T-Lyinphocyten.
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CY Cyclophosphamid.
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DMSO Dimethylsulfoxid.
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E Effektorzellen.
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EL4 Ein primärer Mäuse-Thymustumor.
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I. p. Intraperitoneal.
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I. v. Intravenös.
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LMI Großes mehrwertiges Immunogen ("Large
multivalent immunogen", in früheren
Veröffentlichungen als "Pseudocyten"
bezeichnet).
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MHC Haupthistokompatibilitätskomplex.
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P815 Ein Mäuse-Mastocytom.
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PBL Lymphocyten aus peripherem Blut.
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PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.
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pCTL Vorläufer cytolytischer T-Lymphocyten.
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PEL Peritoneale Exsudat-Lymphocyten.
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RDM4 Ein Mäuse-Lymphom.
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S. c. Subkutan.
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T Zielzellen.
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TCR T-Zellrezeptor.
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TH T-Helferzellen.
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Die Aktivierung von T-Helferzellen und cytotoxischen T-
Zellen spielt eine kritische Rolle bei der Auslösung von
Immunreaktionen in vivo, und zwar sowohl von humoralen als auch
von zellvermittelten Reaktionen gegen fremde Antigene; wobei
es sich bei den fremden Antigenen um Komponenten von
Bakterien, Parasiten, Viren, transformierten Zellen oder
transplantierten Zellen handelt. Die Immunisierung mit Vaccinen,
die fremde Antigene enthalten, ist wirksam bei der Auslösung
von humoralen Reaktionen (Antikörperreaktionen), sie ist im
allgemeinen jedoch unwirksam bei der Aktivierung der
zellvermittelten Immunität. Die gegenwärtigen Formulierungen sind
also unwirksam hinsichtlich der Aktivierung einer Hauptwaffe
der Immunsystemabwehr gegen das Eindringen fremder
Organismen.
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T-Zellen werden normalerweise als Folge der Bindung an ein
Antigen, das auf der Oberfläche einer anderen Zelle
präsentiert wird, aktiviert; die Bindung und die Aktivierung werden
durch den antigenspezifischen,
Haupthistokompatibilitätskomplex-beschränkten (MHC-beschränkten) T-Zellrezeptor (TCR)
vermittelt. Studien in vitro haben gezeigt, daß MHC-Moleküle
allein oder zusammen mit einem fremden Antigen T-Zellen
aktivieren können, wenn sie künstlichen Membranen einverleibt
werden (S. J. Burakoff und M. F. Mescher, 1982, Reconstituted
membranes and liposomes in the study of lymphocyte
interactions. In: G. Poste, B. Nicholson (Hrsg.), Cell Surface
Reviews, North Holland, Elsevier. S. A. N. Goldstein und M. F.
Mescher, 1986, Cell-sized, supported artificial membranes
(pseudocytes): Response of precursor cytotoxic T lymphocytes
to class I MHC proteins. J. Immunol., Bd. 137, S. 3383).
Diese in vitro-Studien haben auch Hinweise darauf ergeben,
daß die Größe der Oberfläche für die Wechselwirkung, die
zwischen der T-Zelle und der antigentragenden Membran möglich
ist, sowie die Oberflächendichte des Antigens wichtig für
eine wirksame Aktivierung sind (S. A. N. Goldstein und M. F.
Mescher, 1987, Cytotoxic T cell activation by class I protein
on cell-size artificial membranes: antigen density and Lyt-
2/3 function. J. Immunol., Bd. 138, S. 2034. S. H. Herrmann
und M. F. Mescher, 1986, The requirements for antigen
multivalency in Class I antigen recognition and triggering of
primed precursor cytolytic T lymphocytes. J. Immunol., Bd.
138, S. 2816). Eine Stimulierung in vitro kann zwar
auftreten, es ist jedoch nicht über die wirksame Verwendung von
subzellulären Formen von bekannten T-Zellantigenen für die
Auslösung oder Verstärkung cytotoxischer T-Zellreaktionen in
vivo berichtet worden.
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Die Entwicklung von Immunogenen als Vaccine oder
therapeutische Mittel in vivo ist Gegenstand eines starken Interesses
seit sehr langer Zeit, und zahlreiche Formulierungen sind in
Tiermodellen und bei Menschen getestet worden. Viele sind
zwar sehr wirksam bei der Auslösung einer humoralen Reaktion,
die meisten sind jedoch unwirksam bei der Aktivierung der
zellvermittelten Immunität. Die meisten Formulierungen
erfüllen nicht die kritischen Anforderungen für die
PCTL-Aktivierung, die durch in vivo-Versuche, über die hier berichtet
wird, gezeigt wird. Die Bedeutung der Mehrwertigkeit bei der
Herstellung eines wirksamen Immunogens ist in einem gewissen
Maße erkannt worden. Neuere Beispiele umfassen "Iscoms"
(immunstimulierende Komplexe), also Teilchen, die aus
amphipathischen Antigenen und einer hydrophoben Matrix (Quil A) mit
Adjuvanseigenschaften bestehen (B. Morein, The iscom
antigenpresenting System, Nature, Bd. 332 (1988), S. 287), und
Proteosomen mit Antigen mit einem liposomähnlichen
physikalischen Zustand (G. H. Lowell, L. F. Smith, R. D. Seid und W.
D. Zollinger, Peptides bound to proteosomes via hydrophobic
feet become highly immunogenic without adjuvants. J. Exp.
Med., Bd. 167 (1988), S. 658). Obwohl sie mehrwertig sind,
sind sie immer noch klein im Vergleich zu Zellen, wobei
Iscoms einen Durchmesser von etwa 0,035 um und Proteosomen
einen Durchmesser von etwa 0,1 um aufweisen. Sie können also
die Aufnahme durch Makrophagen der Wechselwirkung mit
B-Zellen optimieren, sie sind jedoch noch deutlich unterhalb der
kritischen Größe für die Aktivierung von PCTL. Ferner tragen
gegenwärtig formulierte Immunogene nicht Klasse
I-MHC-Proteine, die an der Erkennung durch H-2-beschränkte CTL
beteiligt sind.
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Beträchtliche Forschungsanstrengungen haben sich auf
Studien der molekularen Anforderungen hinsichtlich der
Zelloberfläche für die antigenspezifische Aktivierung von Vorläufern
cytolytischer T-Lymphocyten (PCTL) und cytolytischer
T-Effektorlymphocyten (eCTL) gerichtet. Ein hauptsächlicher Ansatz
besteht in der Verwendung gut definierter künstlicher
Membranen, die die relevanten, affinitätsgereinigten Antigene
tragen. Neue Methoden sind für die Herstellung künstlicher
Membranen, die auf Kügelchen mit Zellgröße (> 0,2 um, z. B.
Durchmesser von 5 um) getragen werden, entwickelt worden, und
es ist nun festgestellt worden, wie in der vorliegenden
Anmeldung offenbart wird, daß diese künstlichen Membranen
immunogene Reaktionen in vivo hervorrufen, die sich nicht bei der
Injektion kleiner Immunogene zeigen. Diese trägergebundenen
Membranen, die in unseren vorherigen Veröffentlichungen als
Pseudocyten bezeichnet wurden, werden nun als große
mehrwertige Immunogene (LMI) bezeichnet.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
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Die Erfindung betrifft die Herstellung von großen
mehrwertigen Immunogen-Liganden (LMI-Liganden) in einer stabilen
Anordnung auf einem physikalischen Träger, der größer als 0,2
um (als Durchmesser oder in der größten Abmessung) ist, und
ihre Einführung für prophylaktische oder therapeutische
Zwecke in vivo. Die Liganden umfassen: i) Moleküle, die durch
Oberflächenrezeptoren unter Einschluß von T-Zellrezeptoren in
einer antigenspezifischen Weise gebunden werden; und ii)
Moleküle, die mit Zelloberflächenkomponenten in einer
nicht-antigenspezifischen Weise in Wechselwirkung treten, um
antigenspezifische Wechselwirkungen oder die Zellaktivierung zu
fördern. Die LMI-Herstellung erfolgt nach einer beliebigen einer
Reihe von Verfahren, die zu einer stabilen
0berflächenanordnung
führen, und zwar unter Einschluß des Einverleibens in
eine Membran oder der Adsorption oder kovalenten Kupplung an
eine Oberfläche, wobei der kritische Parameter die Größe des
physikalischen Trägers ist.
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Auf der Basis von in vitro-Ergebnissen wurden Experimente
durchgeführt, um die in vivo-Wirkungen der Verabreichung von
antigentragenden, künstlichen Membranen mit Zellgröße, die
als große mehrwertige Immunogene (LMI) bezeichnet werden, zu
untersuchen. LMI, die Alloantigen tragen, stimulieren nicht
die Entwicklung einer CTL-Reaktion, wenn die Verabreichung i.
p. erfolgt. Sie verstärken jedoch in dramatischer Weise die
alloantigenspezifische Reaktion, wenn die Verabreichung
zusammen mit allogenen Tumorzellen erfolgt. Ähnliche Ergebnisse
wurden bei der Untersuchung der lytischen Reaktionen auf das
Tumorzellwachstum in syngenen Tieren beobachtet. Die i. p.
erfolgende Übertragung von EL4-, RDM4- oder P815-Tumorzellen
in syngene Mäuse führt zum Tumorwachstum und schließlich zum
Tod der Mäuse. Wenn LMI, die Tumorantigen in Form der
Plasmamembran, die von den Tumorzellen isoliert wurde, tragen, zum
Zeitpunkt der Übertragung verabreicht werden, dann entwickelt
sich eine starke lytische Reaktion innerhalb von 10 bis 12
Tagen. Ferner wird die peritoneale Tumorbelastung in
LMI-behandelten Tieren im Vergleich mit den Kontrollen dramatisch
verringert (oder ausgeschaltet; Verringerung > 99 %).
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Eine einzigartige und erstaunliche synergistische Wirkung
tritt auf, wenn LMI und Cyclophosphamid (CY) in Kombination
zur Behandlung von tumortragenden Wirten verwendet werden.
Ein Aspekt der Erfindung ist daher die gemeinsame Verwendung
von LMI und CY bei der Behandlung von Tumoren.
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Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur
Behandlung eines Säugers mit einem Tumor, um die
Zellreaktionen zu aktivieren. Das Verfahren wird durch die Verabreichung
von großem mehrwertigem Immunogen, das im wesentlichen aus
mehrwertigen Ligandenanordnungen besteht, die auf großen
Teilchen mit einem Hauptdurchmesser größer als 0,2 um
getragen werden, in vivo durchgeführt. Gemäß einem bevorzugten
Verfahren weist das große mehrwertige Immunogen einen
Durchmesser von etwa 5,0 um auf. Das große mehrwertige Immunogen
kann einen wesentlich größeren Durchmesser aufweisen; es sind
jedoch keine wesentlichen Vorteile für größere Durchmesser
bekannt. Die Zellaktivierung kann in der Aktivierung von
antigenspezifischen T-Zellen, Makrophagen, Monocyten oder
natürlichen Killerzellen bestehen.
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Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur
Behandlung eines Säugers, von dem nicht bekannt ist, oder der
nicht in Verdacht steht, einen Tumor zu haben, um die
Zellreaktionen zu aktivieren und auf diese Weise das Wachstum von
Tumoren in dem Säuger zu hemmen oder zu verhindern. Das
Verfahren wird durch Verabreichung von großem mehrwertigem
Immunogen, das im wesentlichen aus einer mehrwertigen
Ligandenanordnung besteht, die auf großen Teilchen mit einem
Hauptdurchmesser größer als 0,2 um getragen werden, in vivo
durchgeführt. Gemäß einem bevorzugten Verfahren weist das große
mehrwertige Immunogen einen Durchmesser von etwa 5,0 um auf.
Die Zellaktivierung kann in der Aktivierung
antigenspezifischer T-Zellen, Makrophagen, Monocyten oder natürlicher
Killerzellen bestehen.
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Individuelle T-Zellen unterscheiden sich im Hinblick auf
die Spezifität ihrer antigenspezifischen Rezeptoren (TCR),
zeigen ansonsten aber gemeinsame Aktivierungsanforderungen.
Daten, die die Wirksamkeit von LMI für allogene Modelle
(Transplantation) und Tumormodelle zeigen, werden vorgelegt.
Implizit ist in diesen Befunden die Anwendung von LMI zur
Immunisierung oder Behandlung anderer Erkrankungen, die
T-Zellreaktionen beinhalten, unter Einschluß viraler, bakterieller,
parasitärer, Graft-versus-host- und Autoimmunerkrankungen. In
allen Fällen ist das wesentliche Verfahren das gleiche, und
die Verwendung würde sich nur im Hinblick auf die Wahl des
Antigens (Ligand), der dem LMI einverleibt wird,
unterscheiden.
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Sowohl für die Behandlung als auch für die Prävention von
Säugererkrankungen kann das Verfahren mit einer
Stoffzusammensetzung durchgeführt werden, wie sie vorstehend
beschrieben wurde, und zwar mit oder ohne Zugabe eines Liganden in
einer physikalischen Form, die sich von der des großen
mehrwertigen Immunogens unterscheidet. Die Ligandenkomponente
kann im wesentlichen aus Antikörpern, die spezifisch für eine
Zelloberfläche, ein Antigen, ein Hapten oder andere
immunogene Spezies sind, oder einem Gemisch verschiedener Liganden
bestehen. Der Ausdruck "Ligand" wird hier in seinem
allgemeinen immunochemischen Sinn verwendet, d. h. es handelt sich um
ein beliebiges Molekül, das einen Komplex mit einem anderen
Molekül bildet oder an eine spezifische Determinante bindet
oder diese einschließt, wie auf einer Zelle, einer Oberfläche
oder einem Molekül, wobei die üblicheren Beispiele dafür
Antikörper und Antigene sind (vgl. z. B. D. P. Stites, J. D.
Stobo und J. V. Wells, Basic & Clinical Immunology, Appleton
& Lange, Norwalk, CT, 1987).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 stellt graphisch Daten dar, die zeigen, daß die
Verstärkung der CTL-Reaktion in vivo spezifisch für das
Antigen auf der LMI-Oberfläche ist.
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CD2F1-Mäusen wurde i. p. der angegebene Stimulus
injiziert. Tumorzellen und Kügelchen wurden mit 10&sup7; Kügelchen
verwendet. H-2Kb wurde aus EL4-Tumorzellen gereinigt, und H-
2Kk aus RDM4-Tumorzellen. 10 Tage nach der Injektion wurden
peritoneale Zellen entnommen und auf die cytolytische
Aktivität unter Verwendung von &sup5;¹Cr-markierten RDM4- und EL4-Zielen
in einem 4-stündigen Assay bei den angegebenen Effektor:Ziel-
Verhältnissen untersucht. Die Ergebnisse sind als prozentuale
spezifische Chrom-Freisetzung gezeigt. Zellen von Mäusen, die
den RDM4-Stimulus (allein oder mit Kügelchen) erhielten,
töteten nicht die EL4-Ziele ab, und Zellen, die den
EL4-Stimulus (allein oder mit Kügelchen) erhielten, töteten nicht die
RDM4-Ziele ab (auf dem Graph nicht gezeigt).
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Fig. 2 stellt graphisch Daten dar, die zeigen, daß die
spezifische Verstärkung der CTL-Aktivierung in vivo von der
Antigendichte auf der LMI-Oberfläche abhängt.
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C57BL/6-Mäusen wurde i. p. der angegebene Stimulus
injiziert. RDM4-Tumorzellen und LMI wurden mit 10&sup7; pro Tier
verwendet. LMI, die eine hohe Dichte an Antigen trugen, wurden
unter Verwendung von 10 ug H-2 pro 10&sup7; Kügelchen hergestellt,
und LMI geringer Dichte wurden unter Verwendung von 3 ug pro
10&sup7; hergestellt. H-2Kk-Antigen wurde aus RDM4-Zellen
gereinigt,
und H-2d-Antigen aus P815-Tumorzellen. 10 Tage nach der
Injektion wurden peritoneale Zellen entnommen und auf die
cytolytische Aktivität unter Verwendung von &sup5;¹Cr-markierten
RDM4-Zielen (H-2k) und P815-Zielen (H-2d) untersucht. PEL aus
2 Mäusen pro Gruppe wurden für den Assay vereinigt.
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Fig. 3 stellt graphisch Daten dar, die zeigen, daß die
Verabreichung von LMI die peritoneale Tumorbelastung
verringert.
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Behandelte Mäuse (+) erhielten 10&sup7; LMI, die Tumorantigen
(Plasmamembran) trugen, zur gleichen Zeit. Neun (EL4 und
RDM4) oder elf (P815) Tage später wurden peritoneale Zellen
gewonnen und gezählt. Die gezeigten Werte sind Mittelwerte,
die für 2 Mäuse in jeder Gruppe erhalten wurden. Die
prozentuale Verringerung der Tumorbelastung in behandelten Tieren
ist im Vergleich mit unbehandelten (-) Kontrollen gezeigt.
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Fig. 4 stellt graphisch Daten dar, die zeigen, daß die
Tumorverringerung es erfordert, daß das Tumorantigen
(Plasmamembran) auf LMI und nicht als freie Plasmamembranvesikel
verabreicht wird.
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C57BL/6-Mäusen wurden i. p. 106 lebende EL4-Zellen
verabreicht. Gleichzeitig wurden 10&sup7; LMI, die EL4-Plasmamembran
trugen, oder EL4-Plasmamembran in Suspension verabreicht. Die
Membranen wurden in einer Menge verwendet, die äquivalent zu
der auf dem LMI (1x Plasmamembran) war, oder in einer 10-fach
höheren Dosis (10x Plasmamembran). Peritoneale Zellen wurden
am 13. Tag gewonnen und gezählt. Die Werte sind Mittelwerte,
die für 2 Mäuse in jeder Gruppe erhalten wurden, und der
Bereich, der für das Paar erhalten wurde, ist gezeigt.
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Fig. 5 stellt graphisch Daten dar, die die Wirksamkeit von
drei Wegen der Verabreichung von LMI hinsichtlich der
Verringerung des Tumorwachstums zeigen.
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CD2F1-Mäusen wurden i. p. 10&sup5; P815-Zellen überimpft.
Gleichzeitig wurden LMI mit entweder P815-Plasmamembran oder
normalen Mäuseserumproteinen (NMS) auf dem angegebenen Weg
verabreicht, und zwar unter Verwendung von 10&sup7; LMI/Maus in
allen Fällen. Peritoneale Zellen wurden 11 Tage nach der
Überimpfung gewonnen und gezählt. Gruppen von mit
tumorantigentragenden LMI behandelten Mäusen bestanden aus jeweils 4
Mäusen, und die gezeigten Werte sind die Mittelwerte mit den
angegebenen Standardabweichungen. Kontrollgruppen (nur Tumor-
und NMS-LMI behandelt) bestanden aus jeweils 2 Mäusen, und
die Mittelwerte sind gezeigt. Die Gewinnung von peritonealen
ausgewaschenen Zellen von normalen Mäusen, die weder eine
Tumorüberimpfung noch LMI erhalten hatten, wurde für 6 Mäuse
bestimmt (unterer Balken), und die Standardabweichung ist
angegeben.
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Fig. 6 stellt graphisch Daten dar, die die
tumorspezifische cytolytische Aktivität von peritonealen
Exsudat-Lymphocyten aus Mäusen, die mit LMI behandelt wurden, zeigen.
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Tumorspezifische cytolytische Aktivität von peritonealen
Exsudat-Lymphocyten aus Mäusen, die mit LMI behandelt wurden;
C57BL/6-Mäusen wurden 10&sup6; lebende EL4-Zellen überimpft. Die
behandelten Mäuse erhielten 10&sup7; LMI, die EL4-Membranen
trugen, zur gleichen Zeit (EL4 + LMI). Kontrollmäusen ohne
lebenden Tumor wurden ebenfalls 10&sup7; LMI, die EL4-Membranen
trugen (nur LMI), injiziert. Nach 12 Tagen wurden peritoneale
Zellen gewonnen; man ließ sie 1 Stunde an Kunststoff
anhaften, und nicht-haftende Zellen wurden auf die lytische
Aktivität in einem 4-stündigen Cr-Freisetzungsassay unter
Verwendung von EL4- und RDM4-Zielen untersucht. Die LMI-behandelten
Mäuse waren die gleichen wie diejenigen, die in Fig. 4
gezeigt wurden, wobei die Tumorbelastung um > 99 % durch die
LMI-Behandlung verringert worden war. Zellen von einzelnen
Mäusen wurden untersucht, und die Ergebnisse sind für beide
Tiere aus jeder Gruppe gezeigt. Die Abtötung ist als
prozentuale spezifische Freisetzung ausgedrückt. Die spontane
Freisetzung betrug 195 cpm für EL4 und 248 cpm, und die gesamte
freisetzbare Menge betrug 2549 für EL4 und 2938 für RDM4.
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Fig. 7 stellt graphisch Daten dar, die die erneute
Stimulierung der tumorspezifischen CTL-Reaktion durch Milzzellen
von mit LMI behandelten Mäusen zeigen.
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Um die in Fig. 7-A graphisch dargestellten Daten zu
erhalten, wurden C57BL/6-Mäusen i. p. 106 lebende EL4-Zellen
überimpft und gleichzeitig 10&sup7; LMI, die EL4-Antigen trugen,
verabreicht. 12 Tage später wurden die Milzen (2 Mäuse)
entnommen, vereinigt und in eine Kultur mit oder ohne bestrahlte
EL4-Zellen gegeben. Nach 6 Tagen der Kultur in vitro wurden
die Zellen auf ihre lytische Aktivität in einem 4-stündigen
Cr-Freisetzungsassay unter Verwendung von EL4- und
RDM4-Zielen untersucht. Die Ergebnisse sind für Zellen gezeigt, die
mit bestrahlten EL4 kultiviert wurden. Die in Abwesenheit von
Stimulatoren kultivierten Zellen wiesen bei keinem der Ziele
eine lytische Aktivität auf.
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Um die in Fig. 7-B graphisch gezeigten Daten zu erhalten,
wurden CD2F1-Mäusen 10&sup6; lebende P815-Zellen überimpft, und
gleichzeitig wurden sie entweder mit nichts (nichts), 10&sup7;
LMI, die P815-Antigen trugen (LMI-P815), oder 10&sup7; LMI, die
normales Mäuseserum trugen (LMI-NMS), behandelt. 7 Tage
später wurden die Milzen entnommen (2 Mäuse pro Gruppe) und in
eine Kultur allein oder mit bestrahlten P815-Zellen gegeben.
Nach 6 Tagen der Kultur in vitro wurde die lytische Aktivität
für P815- und RDM4-Ziele untersucht. Die für erneut
stimulierte Zellen im Hinblick auf P815-Ziele erhaltenen
Ergebnisse sind gezeigt. Es wurde keine Abtötung von RDM4-Zielen
festgestellt. Zellen, die nicht erneut in vitro stimuliert
wurden, lysierten weder P815- noch RDM4-Ziele.
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Fig. 8 stellt Daten dar, die die Überlebenszeit von Mäusen
zeigen, die nur mit LMI, nur mit CY und mit LMI+CY gemeinsam
behandelt wurden, wobei die Behandlung am Tag der
Tumorüberimpfung begann, was den Synergismus zwischen LMI und CY
bei der Behandlung von Tumoren zeigt, wenn sie zusammen
verwendet werden.
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Fig. 9A stellt Daten dar, die die relative mittlere
Tumorfläche bei Mäusen zeigen, die nur mit LMI, nur mit CY und mit
LMI+CY zusammen behandelt wurden, wobei die Behandlung 10
Tage nach dem Datum der Tumorüberimpfung begann, wenn Tumoren
bei den Mäusen aufgetreten waren, was den Synergismus
zwischen LMI und CY bei der Behandlung von Tumoren zeigt, wenn
sie zusammen verwendet werden.
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Fig. 9B stellt Daten dar, die die Überlebens zeit von
Mäusen zeigen, die nur mit LMI, nur mit CY und mit LMI+CY
zusammen behandelt wurden, wobei die Behandlung 10 Tage nach dem
Datum der Tumorüberimpfung begann, wenn Tumoren bei den
Mäusen aufgetreten waren, was den Synergismus zwischen LMI und
CY bei der Behandlung von Tumoren zeigt, wenn sie zusammen
verwendet werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Ein zentraler Befund von in vitro-Studien besteht darin,
daß CTL-Bindung und Transmembransignalübertragung eine
hochgradig mehrwertige Wechselwirkung über einen erheblichen
Bereich der CTL-Oberfläche erfordern. LMI erfüllen diese
kritischen Anforderungen, und sie sind quantitativ genauso wirksam
wie antigentragende Zellen bei der Stimulierung von
Reaktionen in vitro. Die Wirkungen von antigentragenden LMI in vivo
sind durch Experimente definiert worden, die allogene
Reaktionen untersuchen, und mögliche Anwendungen von LMI bei der
Immuntherapie sind unter Verwendung von 3
Mäusetumor-Modellsystemen bewertet worden.
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LMI, die affinitätsgereinigtes Alloantigen tragen,
stimulieren nicht die Entwicklung einer CTL-Reaktion, wenn sie i.
p. verabreicht werden, die Reaktion von bestrahlten allogenen
Zellen in vivo wird jedoch erheblich verstärkt (10- bis 50-
fach), wenn auch LMI verabreicht werden. Diese unerwartete
und dramatische Verstärkung ist antigenspezifisch und hängt
von der Alloantigendichte auf dem LMI ab.
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CTL-Reaktionen gegenüber syngenen Tumoren wurden unter
Verwendung von LMI, die gereinigte Plasmamembranen, die aus
Tumorzellen isoliert wurden, trugen, untersucht. Die
untersuchten Tumorzellen umfaßten P815 (ein Mastocytom), EL4 (ein
primärer Thymustumor) und RDM4 (ein Lymphom). Alle wachsen
rasch im Bauchfell von syngenen Mäusen und töten die Mäuse
innerhalb von 2 bis 4 Wochen. Die in vivo-Verabreichung von
LMI, die Tumormembranen tragen, führt zu einer dramatischen
Verringerung der peritonealen Tumorbelastung, und zwar zu
einer mehr als 99 %-igen Verringerung im Vergleich mit
Kontrollen am 12. Tag in einigen Fällen. Wie im Fall der
allogenen Reaktion rufen LMI, die Tumorantigen tragen, keine CTL-
Reaktion hervor, wenn sie allein verabreicht werden.
Peritoneale Lymphocyten von Tieren, denen ein Tumor überimpft wurde
und die mit LMI behandelt wurden, entwickeln jedoch einen
hohen Grad an tumorspezifischer cytolytischer Aktivität. Ferner
bauen Milzzellen von Tieren, deren Tumorbelastung durch LMI-
Behandlung verringert oder ausgeschaltet wurde, eine starke,
tumorspezifische Reaktion auf, wenn sie in vitro erneut
stimuliert werden, während Milzzellen von unbehandelten,
tumortragenden Tieren eine geringe, wenn überhaupt eine Reaktion
zeigen. Die Verabreichung von Tumorantigen in einer
geeigneten Form kann also das Tumorwachstum dramatisch verringern.
Die Wirkung ist sehr wahrscheinlich zumindest zum Teil durch
tumorspezifische CTL vermittelt.
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Die Anwendung dieser Befunde und Methoden auf die
Krebstherapie bei Tieren und Menschen ist unmittelbar einsichtig,
und die Anwendung auf andere Krankheiten gehört klar zum
Können des Fachmanns, insoweit als die immunochemische
Begründung, auf der die Erfindung beruht, allgemein und nicht
einzigartig für Tumoren und dergl. ist.
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Die Erfindung umfaßt Verfahren zur Behandlung eines
Säugers, um virale, bakterielle, parasitäre, Graft-versus-host
- und Autoimmunerkrankungen sowie die spezielle Klasse von
Erkrankungen, die vorstehend erörtert wurde, zu verhindern oder
zu behandeln, um im Säuger Zellreaktionen zu aktivieren,
wobei die Verfahren die Verabreichung einer Zusammensetzung mit
großem mehrwertigem Immunogen umfassen, das im wesentlichen
aus mehrwertigen Ligandengruppierungen besteht, die auf
großen Teilchen mit einem Hauptdurchmesser größer als 0,2 um
als Träger aufgebracht sind, vorzugsweise unter Verwendung
von Zusammensetzungen, bei denen das große mehrwertige
Immunogen einen Hauptdurchmesser von etwa 5 um oder größer
aufweist, wobei die Zusammensetzung wahlweise einen Liganden in
einer physikalischen Form, die von der des großen
mehrwertigen Immunogens verschieden ist, umfaßt und in Form einer
injizierbaren Lösung vorliegt.
Materialien und Verfahren
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MHC-Klasse I- und Klasse II-Antigene wurden durch
Affinitätschromatographie gereinigt.
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Die Proteine in Desoxycholat-haltigem Puffer wurden mit
einer Suspension von SpherisorbR ODS1R (5 um)-Kügelchen
(Phase Sep, Norwalk, CT) gemischt, und Lipid wurde zugegeben.
SpherisorbR ODS1R sind kugelförmige, mikroporöse
Siliciumdioxidteilchen.
Die Porengröße beträgt 80 Å, und
C18-Alkylketten sind kovalent an das Siliciumdioxid gebunden.
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Ein typisches Verhältnis von Komponenten betrug 6 ug H-2-
Protein:5 nMol Lipid:10&sup7; Kügelchen. Die Suspension wurde dann
48 Stunden zur Entfernung von Desoxycholat dialysiert. Am
Ende dieser Zeit sind das gesamte Protein und Lipid mit den
Kügelchen assoziiert, und etwa 50 % des Proteins sind auf der
Kügelchenoberfläche exponiert (S. A. N. Goldstein und M. F.
Mescher, Cell-sized supported artificial membranes
(pseudocytes): Response of precursor cytotoxic T lymphocytes to
class I MHC proteins, J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 3383).
Nach der Dialyse wurden die Kügelchen für die Verwendung
durch mehrmaliges Waschen in einem geeigneten Puffer
vorbereitet, wobei die Kügelchen durch Zentrifugation bei geringer
Geschwindigkeit pelletiert wurden.
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Für Komponenten der CTL-Oberfläche spezifische Antikörper
wurden den Kügelchen durch ein Verdünnungsverfahren
einverleibt. SpherisorbR ODS1R (5 um)-Kügelchen (Phase Sep,
Norwalk, CT) wurden in Dimethylsulfoxid suspendiert
(typischerweise 1,5 mg trockene Kügelchen in 0,02 ml Dimethylsulfoxid).
Diese Suspension wurde dann zu einer Lösung des Antikörpers
unter Bedingungen gegeben, die zu einer großen Verdünnung des
Dimethylsulfoxids führten. Die Protein-Kügelchen-Suspension
wurde dann 1 Stunde bei 4ºC gerührt, und die Kügelchen wurden
anschließend gewonnen und 3 mal mit Puffer gewaschen.
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Plasmamembranen, die von Tumorzellen isoliert werden,
tragen tumorspezifische Antigene. Isolierte Plasmamembranen
wurden auf SpherisorbR ODS1R-Kügelchen auf die gleiche Weise,
wie es vorstehend beschrieben wurde, aufgetragen. In
Dimethylsulfoxid suspendierte Kügelchen wurden zu einer
Suspension von Tumorzellplasmamembranen in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung gegeben. Es wurde 1 Stunde bei 4ºC inkubiert,
und dann wurden die Kügelchen 2 mal durch Zentrifugation bei
geringer Geschwindigkeit gewaschen, um ungebundene
Membranvesikel zu entfernen.
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Die in vitro erfolgende CTL-Aktivierung wurde auf einem
von zwei Wegen bewertet. Gemäß dem ersten Verfahren wurde die
Induktion einer cytolytischen Reaktion durch Mäusemilzzellen
in Kultur gemessen. Ausführliche Verfahren dafür sind
veröffentlicht worden (S. J. Burakoff und M. F. Mescher, 1982,
Reconstituted membranes and liposomes in the study of
lymphocyte interactions. In: G. Poste, B. Nicholson (Hrsg.) Cell
Surface Reviews, North Holland, Elsevier. S. A. N. Goldstein
und M. F. Mescher, Cell-sized, supported artificial membranes
(pseudocytes): Response of precursor cytotoxic T lymphocytes
to class I MHC proteins. J. Immunol., Bd. 137, (1986), S.
3383). Gemäß dem zweiten Verfahren wurde die Aktivierung von
clonierten Effektor-CTL durch Messung ihrer stimulierten
Freisetzung von Serinesteraseaktivität in das Medium bestimmt
(M. Pasternak, C. R. Verret, M. A. Liu und H. N. Eisen,
Serine esterase in cytolytic T lymphocytes. Nature, Bd. 322
(1986), S. 740).
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C57BL/6 und (CBA x DBA/2)F1 (CD2F1)-Mäuse wurden von
Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA, bezogen. H-2Kk-, H-2Kb und
K-2d-Klasse I-Mäuse-MHC-Antigene wurden gereinigt, wie es
bereits beschrieben wurde (M. F. Mescher, K. C. Stallcup, C. P.
Sullivan, A. P. Turkewitz und S. H. Herrmann: Purification of
murine MHC antigens by monoclonal antibody affinity
chromatography. In: J. J. Langone, H. VanVunakis (Hrsg.), Methods in
Enzymology, New York, Academic Press, Bd. 92 (1983), S. 86).
Die Antigene wurden Kügelchen mit 5 um unter Anwendung des
vorstehend beschriebenen Dialyseverfahrens einverleibt. Die
erhaltenen LMI wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
suspendiert und Mäusen i. p. mit 10&sup7; Kügelchen pro Maus
entweder allein oder zusammen mit 10&sup7; allogenen Tumorzellen
injiziert. Die verwendeten Tumorzellinien waren RDM4 (H-2k),
ein Lymphom, das aus AKR-Mäusen stammt, und EL4 (H-2b), ein
primärer Thymustumor mit C57BL/6-Ursprung. 10 Tage nach der
Injektion wurden die Mäuse getötet, und peritoneale Zellen
wurden gewonnen, gewaschen und gezählt. In einigen Fällen
wurden anhaftende Zellen durch einen Zyklus des Anheftens an
Kunststoffschalen entfernt. Die cytolytische Aktivität der
peritonealen Zellpopulation wurde durch Messung ihrer
Fähigkeit, allogene Tumorzellziele abzutöten, unter Verwendung von
&sup5;¹Cr-markierten Zielzellen in einem 4-stündigen Standard-
Chrom-Freisetzungsassay bei mehreren verschiedenen Effektor
(E) zu Ziel (T)-Verhältnissen bewertet. Die Ergebnisse sind
entweder als prozentuale spezifische Lyse bei variierenden
E:T-Verhältnissen oder als lytische Einheiten ausgedrückt.
Eine lytische Einheit ist als die Zahl von Effektorzellen
(peritoneal) definiert, die für eine 50 %-ige Lyse der Ziele
in dem 4-stündigen Assay erforderlich ist.
Ergebnisse und Diskussion
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Die Ergebnisse von in vivo-Versuchen unter Verwendung von
2 Mäusemodellen haben die Fähigkeit von LMI gezeigt,
zellvermittelte Reaktionen zu induzieren und das Tumorwachstum zu
verringern. Die kritischen Befunde werden hier zusammengefaßt
und diskutiert, und Einzelheiten der Daten und
Kontrollversuche werden im folgenden Abschnitt vorgelegt.
-
Das erste eingesetzte Modell ist das der aIIogenen
CTL-Induktion, bei dem für Klasse I-MHC-Antigene auf einer fremden
Zelle spezifische CTL aktiviert werden. Die Einführung eines
allogenen Tumors in ein Tier führt zur Induktion einer
spezifischen CTL-Reaktion und zur Abstoßung des Tumors. Bisherige
Versuche in unserem Labor, Antigen auf Liposomen zu
verwenden, um diese Reaktion in vivo zu induzieren, führten zur
Entwicklung einer humoralen Reaktion (Antikörperreaktion), es
konnte jedoch kein Hinweis auf die Induktion der
zellvermittelten Immunität erhalten werden, und zwar ungeachtet der
Tatsache, daß diese Form von Antigen eine CTL-Reaktion in
vitro induzieren kann. Liposomen sind teilchenförmig und
stellen eine mehrwertige Form des Antigens bereit, sie sind
jedoch klein mit einem Durchmesser von weniger als 0,1 um.
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Die Verabreichung von MHC-Antigen auf LMI führt in vivo zu
einer dramatischen Verstärkung der allogenen CTL-Reaktion,
wenn die Verabreichung zusammen mit lebenden Tumorzellen
erfolgt.
Tabelle I
Lytische Einheiten (gesamt) Ziel
Stimulus
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Alloantigen auf LMI verstärkt spezifisch die in
vivo-Aktivierung der CTL-Reaktion gegen alloantigentragende
Tumorzellen. Tumorzellen und/oder LMI wurden i. p. CD2F1-Mäusen
injiziert. Zellen und LMI wurden mit 10&sup7; pro Tier verwendet. LMI
wurden unter Verwendung von 10 ug H-2Kk pro 10&sup7; Kügelchen
hergestellt. 10 Tage nach der Injektion wurden peritoneale
Zellen entnommen und auf die cytolytische Aktivität unter
Verwendung von mit Chrom markierten RDM4- und EL4-Zielzellen
bei 3 E:T-Verhältnissen untersucht. Die cytolytische
Aktivität ist in lytischen Einheiten, die berechnet wurden, wie es
unter "Methoden" beschrieben wurde, angegeben.
-
Wie in Tabelle I gezeigt ist, stimulierten RDM4 (H-2k)-
Zellen eine Reaktion von 6 lytischen Einheiten. LMI, die H-
2Kk trugen, stimulierten keine Reaktion, wenn sie allein
verabreicht wurden, wenn sie jedoch zusammen mit Tumorzellen
verabreicht wurden, verstärkten sie die Reaktion etwa
100fach auf 625 lytische Einheiten. Diese verstärkte Reaktion
blieb spezifisch, indem die Effektorzellen wirksam Ziele, die
H-2k-Antigen trugen, abtöteten, jedoch eine geringe abtötende
Wirkung für EL4 (H-2b)-Ziele, die ein anderes Antigen trugen,
aufwiesen.
-
Weitere Experimente ergaben durchwegs eine 20- bis 100-
fache Verstärkung bei LMI-Behandlung und bestätigten ferner
die Antigenspezifität dieser Wirkung (Fig. 1). Die
Wirksamkeit der Verstärkung hängt von der Oberflächendichte des
Antigens auf dem LMI ab (Fig. 2). Die Verstärkung hängt auch
von der Größe der antigentragenden Teilchen ab; die Injektion
des gleichen gereinigten Antigens auf Liposomen (Durchmesser
(0,2 um) verstärkte die Reaktionen nicht.
-
Die Verstärkung der Induktion der allogenen cytolytischen
Aktivität durch LMI zeigte die Möglichkeit der Verwendung von
LMI, um schützende CTL-Reaktionen zu verstärken und auf diese
Weise eine Therapie für eine Reihe von Krankheiten unter
Einschluß viraler Infektionen und Krebs bereitzustellen. Die
Verstärkung einer schwachen cytolytischen Reaktion durch LMI,
die ein geeignetes Antigen tragen, könnte zur Bildung einer
CTL-Population führen, die zur wirksamen Ausschaltung viral
infizierter oder krebsartiger Zellen, die die Erkrankung
hervorrufen, imstande ist.
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Um dies zu testen, wurden 3 verschiedene Mäusetumormodelle
untersucht. LMI wurden durch Beschichten von Kügelchen mit
Plasmamembranvesikeln, die aus RDM4-, P815- und
EL4-Tumorzellen isoliert worden waren, hergestellt. RDM4 ist ein Lymphom,
das aus AKR-Mäusen stammt, P815 ist ein Mastocytom, das aus
DBA2-Mäusen stammt, und EL4 ist ein primärer Thymustumor mit
C57BL/6-Ursprung. Die Tumoren wachsen bei i. p. Injektion in
syngene Mäuse (d. h. Mäuse vom Stamm des Ursprungs) rasch und
töten die Mäuse innerhalb von 10 bis 20 Tagen.
Plasmamembranen wurden aus den Tumorzellen gereinigt und als Antigen
verwendet, wobei die Membranvesikel LMI unter Anwendung des
Verfahrens, das die Verdünnung aus Dimethylsulfoxid beinhaltet,
einverleibt wurden. Bei allen drei Tumoren führte die
Verabreichung von LMI, die das entsprechende Antigen trugen, zu
einer dramatischen Verringerung der Anzahl der Tumorzellen,
die 9 Tage nach der Überimpfung vorhanden waren (Fig. 3).
Diese dramatische Verringerung in der Tumorbelastung wurde
reproduzierbar in zahlreichen Versuchen beobachtet, und in
vielen Fällen unterscheidet sich die Anzahl der Zellen, die
aus LMI-behandelten Tieren gewonnen wurde, nicht von der
Anzahl, die aus Kontrolltieren, die niemals einen Tumor
erhalten hatten, gewonnen wurde; d. h., die LMI-Behandlung hat den
Tumor vollständig ausgeschaltet.
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Die Verringerung der Tumorbelastung hängt kritisch von der
physikalischen Größe des antigentragenden Teilchens ab. Die
Verabreichung von isolierten Plasmamembranvesikeln mit
Durchmessern von weniger als 0,2 um hat keine signifikante Wirkung
auf das Tumorwachstum, während die gleichen Vesikel, die LMI
einverleibt werden, in wirksamer Weise das Tumorwachstum
verringern (oder ausschalten) (Fig. 4). In den vorstehenden
Versuchen wurden LMI intraperitoneal, d. h. an der Stelle des
Tumorwachstums, verabreicht. LMI sind auch wirksam
hinsichtlich einer Verringerung des intraperitonealen Tumorwachstums,
wenn sie subkutan oder intravenös verabreicht werden (Fig.
5). Gegenwärtige Daten zeigen, daß die Verabreichung i. v.
möglicherweise der wirksamste Weg ist, die Erfindung hängt
jedoch nicht von einer Verabreichung i. v. ab. Diese
Ergebnisse erweitern das Potential für die Verwendung von LMI in
der Immuntherapie, indem sie zeigen, daß LMI nicht an der
Stelle des Tumorwachstums verabreicht werden müssen, um
wirksam zu sein.
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Mäuse entwickeln eine geringe oder keine tumorspezifische
CTL-Reaktion bei Überimpfung von syngenen Tumoren, die hier
verwendet wurden, und die Tumoren wachsen und töten das Tier.
Im Gegensatz dazu wurde eine wirksame tumorspezifische
cytolytische Aktivität bei Mäusen festgestellt, denen der Tumor
überimpft wurde und die mit LMI behandelt wurden. Peritoneale
Exsudat-Lymphocyten von Tieren, denen ein Tumor überimpft
wurde und die mit LMI behandelt wurden (7 bis 10 Tage nach
der Überimpfung), zeigten eine starke lytische Aktivität
gegenüber dem Tumor, der für die Überimpfung verwendet wurde,
jedoch keine lytische Aktivität für ein irrelevantes
Tumorziel (Fig. 6). Eine tumorspezifische cytolytische Aktivität
wurde bei behandelten Tieren auch gezeigt, indem nachgewiesen
wurde, daß Milzzellen von diesen Tieren eine starke,
tumorspezifische Reaktion bei erneuter Stimulierung in vitro
entwickelten (Figuren 7A und B). Im Gegensatz dazu entwickelten
Milzzellen von tumortragenden Tieren, die keine
LMI-Behandlung erhielten, keine Reaktion (Fig. 7B).
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Wie im Fall der allogenen Reaktion verstärken
antigentragende LMI (von einem nicht nachweisbaren Niveau) die
tumorspezifischen cytolytischen Reaktionen. Zusammen mit der
Aktivierung der lytischen Reaktion tritt eine dramatische
Verringerung oder eine Ausschaltung des Tumorwachstums bei den
Tieren auf. Es ist zwar noch nicht bewiesen, es scheint jedoch
sehr wahrscheinlich, daß die aktivierten cytolytischen
T-Lymphocyten
die Ausschaltung des Tumorwachstums vermitteln.
Unabhängig vom Mechanismus der Wirkung der LMI-Behandlung
zeigen die erhaltenen Ergebnisse klar den Wert der Erfindung für
die Krebsimmuntherapie bei Säugern. Ferner sind die
parallelen Befunde, die für zwei verschiedene untersuchte
Modellsysteme erhalten wurden, eine starke Stütze für den Schluß,
daß die Behandlung mit LMI, die geeignete Antigene tragen,
geeignet für die Immunisierung und/oder Therapie bei anderen
Erkrankungen ist, bei denen T-Lymphocyten eine schützende
Rolle spielen können, und zwar unter Einschluß viraler,
bakterieller und parasitärer Infektionen, der Graft-versus-host-
Erkrankung und von Autoimmunerkrankungen.
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Die Befunde der vorstehend beschriebenen in vivo-Versuche
zeigen enge Parallelen zwischen der in vitro-Aktivität von
LMI bei der Aktivierung von T-Zellen und ihrer in
vivo-Aktivität. Auf dieser Basis haben weitere in vitro-Versuche eine
Anzahl möglicher nützlicher Ansätze für die Konstruktion von
LMI gezeigt, die die in vivo-Aktivität verstärken würden. Zum
Beispiel aktivieren LMI, die nur nominale Antigene (d. h.
keine MHC-Klasse I- oder -Klasse II-Proteine) tragen, in
vitro-CTL Reaktionen. Beispiele für derartige nominale
Antigene umfassen Peptide, die Sequenzen entsprechen, die in
viralen Proteinen oder in tumorspezifischen Antigenen vorhanden
sind. Ein geeignetes virales Peptid kann die
Serinesterasefreisetzung durch clonierte, virusspezifische CTL aktivieren,
und dieses Hapten allein kann clonierte, haptenspezifische
CTL stimulieren, sofern das nominale Antigen LMI einverleibt
wird.
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LMI, die Antigen und zusätzliche Moleküle tragen, die an
Komponenten auf T-Zelloberflächen binden, fördern spezifische
Wechselwirkungen. Das gemeinsame Einverleiben von Alloantigen
und zusätzlichen Liganden führt zu einer stärkeren in vitro-
CTL-Reaktion, als sie nur mit dem Alloantigen auf dem LMI
erhalten wird. Zusätzliche LMI-Liganden, von denen gezeigt
wurde, daß sie die antigenspezifische Auslösung verstärken,
umfassen Antikörper, die spezifisch für
CTL-Oberflächenproteine sind (unter Einschluß von H-2, theta und Lyt-2) und
irrelevante Klasse I-Proteine (jedoch nicht Klasse
II-Proteine).
Auf der Basis der in vitro erhaltenen Wirkungen
werden diese Ansätze Anwendung bei der Entwicklung von LMI mit
einer optimalen in vivo-Aktivität, um spezielle Reaktionen
hervorzurufen, haben.
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Zusammenfassend wurde bei früheren Anstrengungen, um zu
bestimmen, ob die in vivo-Verabreichung von Alloantigen auf
Liposomen in vivo-CTL-Reaktionen stimulieren oder verstärken
könnte, eine gute Antikörperreaktion auf das Alloantigen
erhalten, es wurden jedoch keine Einflüsse auf die Entwicklung
von CTL-Reaktionen festgestellt.
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Es wurde nun festgestellt, daß das gleiche Alloantigen,
wenn es Kügelchen mit 5 um einverleibt wird, wobei großes
mehrwertiges Immunogen gebildet wird, in vivo-CTL-Reaktionen
auf antigentragende Zellen dramatisch verstärken kann. Das
therapeutische Potential dieses Ansatzes ist durch den Befund
gezeigt worden, daß LMI, die ein geeignetes Tumorantigen
tragen, das Wachstum von Tumoren bei Mäusen in vivo dramatisch
verringern (oder ausschalten) können. Kritische Parameter für
die Herstellung wirksamer LMI sind die Teilchengröße (> 0,2
um; z. B. Durchmesser von 5 um) und die Dichte des Antigens
auf dem Teilchen. Der Nachweis der Wirksamkeit der
LMI-Behandlung in zwei verschiedenen Modellsystemen (allogene und
tumorspezifische Reaktionen) erlaubt den Schluß, daß dieser
Ansatz mögliche Vorteile für die Immunisierung und/oder
Therapie bei anderen Erkrankungen, die T-Zellreaktionen
beinhalten, bereitstellt.
Einzelheiten der Daten
-
Die i. p. erfolgende Injektion von allogenen Tumorzellen
führt in 8 bis 12 Tagen zu einer peritonealen
Exsudat-Lymphocyten-Population mit Alloantigen-spezifischer
CTL-Aktivität, und optimale Reaktionen werden unter Verwendung von 10&sup7;
Stimulatorzellen erhalten. Wenn 10&sup7; alloantigentragende LMI
i. p. zusammen mit den Stimulatorzellen injiziert werden,
dann ist die cytolytische Aktivität von PEL, die 10 Tage
später gewonnen werden, gegenüber PEL aus Tieren, denen nur
Stimulatorzellen injiziert wurden, dramatisch verstärkt. Fig. 1
zeigt die Ergebnisse eines doppelt reziproken Versuchs, der
belegt, daß LMI zu einer Verstärkung führen, wenn sie das
gleiche Alloantigen wie die Stimulatorzellen tragen, jedoch
keine Reaktion stimulieren, wenn sie allein injiziert werden.
CD2 (H-2d)-Responder wurden i. p. mit RDM4 (H-2k) oder EL4
(H-2b)-Zellen und LMI, die H-2Kk oder H-2Kb trugen, in
verschiedenen Kombinationen injiziert. Kb-LMI verstärkten die
Entwicklung einer EL4-spezifischen Reaktion, wenn sie
zusammen mit EL4-Stimulatorzellen verabreicht wurden, während
Kk-LMI dies nicht taten (linkes Diagramm). Kb-LMI, die allein
verabreicht wurden, führten zu keiner Reaktion. Das reziproke
Ergebnis (rechtes Diagramm) wurde unter Verwendung von RDM4-
Stimulatorzellen erhalten. Kk-LMI führten zu einer
Verstärkung, wenn sie zusammen mit RDM4 injiziert wurden, und Kb-LMI
taten dies nicht. Kk-LMI, die allein injiziert wurden,
führten zu keiner Reaktion. Alle Effektorpopulationen in diesem
Versuch wurden auf die Abtötung sowohl von EL4- als auch von
RDM4-Zielen untersucht.
-
Wie in Fig. 1 gezeigt ist, ist die Verstärkung der in
vivo-CTL-Reaktion spezifisch für das Antigen auf der LMI-
Oberfläche. CD2F1-Mäusen wurde i. p. der angegebene Stimulus
injiziert. Tumorzellen und Kügelchen wurden mit 10&sup7; pro Tier
verwendet. LMI wurden unter Verwendung von 10 ug H-2-Protein
pro 10&sup7; Kügelchen hergestellt. H-2Kb wurde aus
EL4-Tumorzellen gereinigt, und H-2Kk aus RDM4-Tumorzellen. 10 Tage nach
der Injektion wurden peritoneale Zellen entnommen und auf die
cytolytische Aktivität unter Verwendung von &sup5;¹Cr-markierten
RDM4- und EL4-Zielen in einem 4-stündigem Assay bei den
angegebenen Effektor:Ziel-Verhältnissen untersucht. Die
Ergebnisse sind als prozentuale spezifische Chrom-Freisetzung
angegeben. Zellen aus Mäusen, die den RDM4-Stimulus (allein
oder mit Kügelchen) erhielten, töteten EL4-Ziele nicht ab,
und Zellen, die den EL4-Stimulus (allein oder zusammen mit
Kügelchen) erhielten, töteten die RDM4-Ziele nicht ab.
-
Verstärkte Reaktionen blieben vollständig spezifisch für
das stimulierende Antigen, und Einflüsse Dritter wurden nicht
festgestellt, d. h. Effektoren, die aus der Injektion von Kb-
LMI zusammen mit RDM4-Stimulatoren erhalten wurden, hatten
keine lytische Aktivität für EL4-Ziele.
-
Die Spezifität der Verstärkung wurde unter Verwendung von
H-2Kk, H-2Kb und H-2d aus mehreren unabhängigen Antigen- und
LMI-Zubereitungen gezeigt. Auf der Basis eines Vergleichs des
E:T-Verhältnisses, das für ein gegebenes Niveau der Lyse der
Ziele erforderlich war, oder der Bestimmung der lytischen
Einheiten lag die Verstärkung in diesen Versuchen beim 10
- bis 100-fachen gegenüber der Reaktion, die erhalten wurde,
wenn nur Stimulatorzellen injiziert wurden. Wie für
CTL-Reaktionen zu erwarten ist, führt die Entfernung von anhaftenden
Zellen (durch einen Zyklus der Anheftung an Kunststoff) zu
einer erhöhten lytischen Aktivität bei PEL-Populationen aus
Tieren, die nur mit allogenen Zellen stimuliert wurden, und
aus LMI-behandelten Tieren. Von Effektorzellen, die in der
LMI-verstärkten PEL-Population vorhanden waren, wurde
bestätigt, daß es sich um T-Zellen handelte, indem gezeigt wurde,
daß die lytische Aktivität beseitigt wurde, wenn die Zellen
mit Anti-thyl-Antikörper und Komplement vor der Zugabe zu den
Zielzellen behandelt wurden.
-
Wie betont wurde, ist die physikalische Form, in der
gereinigtes Alloantigen verabreicht wird, kritisch. Antigen
auf LMI führt zu einer Verstärkung, in Liposomen
einverleibtes Antigen, das in der gleichen oder in höheren Dosen
verabreicht wird, hat jedoch keine verstärkende Wirkung. Es
scheint so, daß die Dichte auf dem LMI ebenfalls von
Bedeutung ist, was auch für die CTL-Aktivierung in vitro gilt. Wie
in Fig. 2 gezeigt ist, hängt die spezifische Verstärkung der
CTL-Aktivierung in vivo von der Antigendichte auf der LMI-
0berfläche ab. C57BL/6-Mäusen wurde i. p. der angegebene
Stimulus injiziert. RDM4-Tumorzellen und LMI wurden mit 10&sup7; pro
Tier verwendet. LMI, die eine höhere Dichte an Antigen
trugen, wurden unter Verwendung von 10 ug H-2 pro 10&sup7; Kügelchen
hergestellt, und LMI geringer Dichte wurden unter Verwendung
von 3 ug pro 10&sup7; hergestellt. H-2Kk-Antigen wurde aus RDM4-
Zellen gereinigt, und H-2d-Antigen aus P815-Tumorzellen. 10
Tage nach der Injektion wurden peritoneale Zellen entnommen
und auf die cytolytische Aktivität unter Verwendung von
&sup5;¹Crmarkierten RDM4 (H-2k)- und P815 (H-2d)-Zielen untersucht.
PEL von 2 Mäusen pro Gruppe wurden für die Untersuchung
vereinigt.
Eine größere lytische Aktivität wurde bei Tieren
festgestellt, die mit LMI hoher Dichte behandelt worden
waren, als bei denjenigen, die mit LMI geringer Dichte
behandelt worden waren (Fig. 2).
-
Alloantigen auf LMI verstärkt also spezifisch, was
ansonsten eine optimale in vivo-Reaktion gegenüber intakten
allogenen Stimulatoren ist, und die erhaltenen Effektor-CTL
behalten ihre Spezifität für das stimulierende Alloantigen. LMI
in vivo wirken anscheinend auf der Ebene der PCTL-Aktivierung
und nicht auf die Helferwaffe der Reaktion. In vitro sind LMI
sehr wirksam bei der Auslösung von PCTL, sie sind jedoch
unwirksam bei der Bereitstellung vqn Antigen für die Aufnahme,
Prozessierung und Präsentation für TH-Zellen. Alloantigen auf
Liposomen, das nicht zu einer Verstärkung in vivo führt,
sorgt für Antigen für die in vitro-TH-Zellaktivierung, ist
jedoch sehr unwirksam hinsichtlich der direkten Aktivierung
von PCTL.
-
LMI können die Ausdehnung der PCTL-Population stimulieren,
und zwar möglicherweise über einen IL-2-abhängigen autokrinen
Mechanismus. In Abwesenheit der TH-Zellaktivierung (d. h.
ohne ganze Zellen als Costimulatoren) werden die
proliferierenden Vorläufer möglicherweise aufgrund des Fehlens eines
spät wirkenden Differenzierungsfaktors nicht zu Effektoren.
LMI allein entwickeln also keine lytische Reaktion (können
sie jedoch initiieren). Warum LMI die PCTL-Ausdehnung
wirksamer stimulieren als intakte, antigentragende Zellen ist nicht
bekannt. Dies mag z. B. eine Folge ihrer Wechselwirkung mit
PCTL für längere Zeitspannen sein und auf diese Weise für
eine anhaltende Stimulierung der IL-2-Bildung sorgen.
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Auf der Basis der bei der Untersuchung von LMI-Wirkungen
auf die allogene CTL-Entwicklung erhaltenen Ergebnisse wurden
Experimente initiiert, um die Wirkungen von antigentragenden
LMI auf syngene, tumorspezifische Reaktionen zu untersuchen.
Wir haben EL4, einen Primären Thymustumor mit
C57BL/6-Ursprung, RDM4, ein Lymphom mit AKR-Ursprung, und P815, ein
Mastocytom mit DBA/2-Ursprung, untersucht. Alle diese Tumoren
wachsen in den Bauchfellen von syngenen Mäusen und töten
schließlich den Wirt. Tumorantigene, die für die
CTL-Erkennung
relevant sind, sind nicht definiert. Es können jedoch
Plasmamembranen von den Tumorzellen isoliert werden, und sie
tragen vermutlich die gleiche Gruppierung von
Oberflächenproteinen wie die intakten Tumorzellen. Daß dies Antigene
umfaßt, die von tumorspezifischen CTL erkannt werden, wird
durch Studien gezeigt, die belegen, daß Membranen, die von
Tumorzellen isoliert wurden, spezifisch die Induktion von
sekundären in vitro-tumorspezifischen Reaktionen stimulieren
können.
-
Tumorantigene in Form von Membranen tragende LMI können
ohne weiteres durch einfache Verdünnung von Kügelchen (die in
DMSO suspendiert sind) in einer Suspension van gereinigten
Plasmamembranvesikeln in PBS hergestellt werden. Wenn
antigentragende LMI i. p. zusammen mit Tumorzellen syngenen
Mäusen injiziert wurden, dann wurde eine dramatische
Verringerung der Tumorbelastung, die an den Tagen 9 bis 11 vorhanden
war, festgestellt. Dies war der Fall für alle drei
untersuchten Tumoren, und die Verringerung der Tumorbelastung trat
über einen Bereich der Tumorüberimpfung von 10&sup7; bis 10&sup7;
Zellen auf (Fig. 3). Obwohl immer noch erheblich, war die
Verringerung im Fall von RDM4 am geringsten, und bei einer
Überimpfung von 10&sup7; RDM4 hatte die LMI-Behandlung eine geringe
oder keine Wirkung. RDM4 ist der schnellstwachsende der drei
untersuchten Tumoren. Die Tumorverringerung tritt nicht auf,
wenn LMI keine Tumorplasmamembran tragen. LMI, die mit
normalem Mäuseserumprotein beschichtet sind, haben keinen Einfluß
auf die Tumorbelastung für irgendeinen der untersuchten
Tumoren (nicht gezeigt).
-
Wie für die Verstärkung der allogenen Reaktionen ist die
physikalische Form des Antigens für eine wirksame
Verringerung der Tumorbelastung kritisch. Die Injektion von
Plasmamembranen als freie Membranvesikel (Durchmesser < 0,2 um) in
Suspension hat eine geringe oder keine Wirkung auf die
Tumorbelastung, während die gleichen Membranen auf LMI sehr
wirksam sind. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, erfordert die
Tumorverringerung, daß Tumorantigen (Plasmamembran) auf LMI und nicht
als freie Plasmamembranvesikel verabreicht wird.
C57BL/6-Mäusen wurden i. p. 10&sup6; lebende EL4-Zellen überimpft.
Gleichzeitig
wurden 10&sup7; LMI, die EL4-Plasmamembran trugen, oder EL4-
Plasmamembran in Suspension verabreicht. Die Membranen wurden
in einer Menge verwendet, die äquivalent zu der auf den LMI
war (1x Plasmamembran), oder in der 10-fach höheren Dosis
(10x Plasmamembran). Peritoneale Zellen wurden am 13. Tag
gewonnen und gezählt. Die Werte sind Mittelwerte, die für 2
Mäuse in jeder Gruppe erhalten wurden, und der Bereich für
das Paar ist gezeigt.
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Bei dem in Fig. 4 gezeigten Versuch wurden 2 Mäuse pro
Gruppe untersucht, und der gefundene Bereich ist gezeigt. Bei
den meisten der vorbereitenden Versuche, die hier beschrieben
werden, wurden 2 Mäuse pro Gruppe verwendet, wobei der
Bereich der Werte ähnlich wie der in Fig. 4 gezeigte war. Die
Daten werden als adäquat angesehen, um die dramatischen
Wirkungen der hier beschriebenen LMI-Behandlung zu zeigen.
-
Die begrenzte Dosis-Ansprech-Information, die bisher
erhalten wurde, deutet darauf hin, daß LMI wirksam hinsichtlich
der Verringerung der Tumorbelastung bis herunter zu
mindestens 10&sup6; pro Maus (nicht gezeigt) bleiben, einer 10-fach
geringeren Dosis als die, die in den hier gezeigten Versuchen
verwendet wurde. Die Kinetik des P815-Tumorwachstums und die
LMI-Wirkungen wurden in einem Versuch untersucht. Mäusen
wurden 10&sup5; Tumorzellen mit oder ohne Verabreichung von LMI
überimpft. Am 5. Tag war ein Tumorwachstum sowohl in Kontrollen
als auch in behandelten Tieren aufgetreten, und etwa 20 x 10&sup6;
peritoneale Zellen pro Maus wurden gewonnen. Über diese Zeit
hinaus trat weiter ein Wachstum in Kontrolltieren auf, die
Tumorbelastung nahm bei den behandelten Tieren jedoch ab. Am
9. Tag wiesen die Kontrollen 161 x 10&sup6; Zellen pro Maus auf,
während die behandelten Tiere 1,4 x 10&sup6; aufwiesen.
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Bei einigen Versuchen führte eine einzelne Injektion von
antigentragenden LMI zu einer mehr als 99 %-igen Verringerung
der Anzahl der peritonealen Zellen, die im Vergleich mit
Kontrollen gewonnen wurden (Fig. 4 und der vorstehend
beschriebene kinetische Versuch). Auf diesem Niveau ist die Anzahl
der Zellen, die von behandelten Tieren gewonnen wurde, nicht
signifikant verschieden von der, die von normalen Tieren
gewonnen wurde, die keinen Tumor erhalten hatten.
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Die wirksamen Wege der LMI-Verabreichung wurden in einem
ausreichenden Maß untersucht, um wirksame Verabreichungswege
festzulegen. Mäusen wurden i. p. 10&sup7; P815 überimpft, und LMI
wurden entweder i. p., i. v. (Schwanzvene) oder subkutan
verabreicht. 11 Tage später wurden die Tiere getötet,
peritoneale Zellen wurden ausgewaschen, und die Zellen wurden
gezählt. LMI, die P815-Membranantigen trugen, verringerten die
Tumorbelastung um 60 bis 70 %, wenn sie i. p. oder subkutan
verabreicht wurden. Relevante Daten sind graphisch in Fig. 5
dargestellt. CD2F1-Mäusen wurden i. p. 10&sup7; P815-Zellen
überimpft. Gleichzeitig wurden LMI, die entweder
P815-Plasmamembran oder normales Mäuseserumprotein (NMS) aufwiesen, auf dem
angegebenen Weg verabreicht, und zwar unter Verwendung von
10&sup7; LMI/Maus in allen Fällen. Peritoneale Zellen wurden 11
Tage nach der Überimpfung gewonnen und gezählt. Gruppen, die
mit tumorantigentragenden LMI behandelt wurden, bestanden aus
jeweils 4 Mäusen, und die gezeigten Werte sind Mittelwerte
mit den angegebenen Standardabweichungen. Kontrollgruppen
(nur Tumor und NMS-LMI-behandelt) bestanden aus jeweils 2
Mäusen, und die Mittelwerte sind gezeigt. Die Gewinnung von
peritonealen ausgewaschenen Zellen aus normalen Mäusen, die
weder einen Tumor noch LMI erhielten, wurde für 6 Mäuse
(unterer Balken) bestimmt, und die Standardabweichung ist
angegeben.
-
Die i. v. erfolgende Verabreichung war noch wirksamer als
die i. p. oder s. c. erfolgende Verabreichung, und die Anzahl
der Zellen, die von diesen Mäusen gewonnen wurde, war nicht
größer als die Anzahl, die von Mäusen gewonnen wurde, die
keinen Tumor erhalten hatten. Für alle Wege der Verabreichung
führten Kontroll-LMI, die mit normalem Mäuseserumprotein
beschichtet waren, nicht zu einer signifikanten Verringerung
der Tumorbelastung. Die gegenwärtigen Daten zeigen, daß die
i. v. erfolgende Verabreichung möglicherweise der wirksamste
Weg ist, die Erfindung ist jedoch nicht von einer i. v.
erfolgenden Verabreichung abhängig. Diese Ergebnisse erweitern
auch das Potential für LMI bei der Verwendung in der
Immuntherapie, indem sie zeigen, daß LMI nicht an der Stelle des
Tumorwachstums verabreicht werden müssen, um wirksam zu sein.
-
Berücksichtigt man die Wirkungen von antigentragenden LMI
auf die allogenen CTL-Reaktionen, so ist anzunehmen, daß die
LMI-Verabreichung einen Tumor in vivo als Ergebnis der
Aktivierung der tumorspezifischen CTL-Reaktionen beeinflußt. Wenn
nicht-haftende PEL-Zellen von Mäusen, denen EL4-Tumorzellen
und LMI, die EL4-Plasmamembranen trugen, verabreicht worden
waren, in einem 4-stündigen &sup5;¹Cr-Freisetzungsassay untersucht
wurden, dann war eine cytolytische Aktivität für EL4-Ziele
vorhanden, wie es in Fig. 6 gezeigt ist. Die Daten in Fig. 6
erläutern die tumorspezifische cytolytische Aktivität von
peritonealen Exsudat-Lymphocyten von Mäusen, die mit LMI
behandelt wurden. C57BL/6-Mäusen wurden 10&sup6; lebende EL4-Zellen
überimpft. Behandelte Mäuse erhielten gleichzeitig 10&sup7; LMI,
die EL4-Membranen trugen (EL4 + LMI). Kontrollmäusen ohne
lebenden Tumor wurden ebenfalls 10&sup7; LMI, die EL4-Membranen
trugen, injiziert (nur LMI). Nach 12 Tagen wurden peritoneale
Zellen gewonnen. Man ließ sie für 1 Stunde an Kunststoff
anhaften, und nicht-anhaftende Zellen wurden auf ihre lytische
Aktivität in einem 4-stündigen Cr-Freisetzungsassay unter
Verwendung von EL4- und RDM4-Zielen untersucht. Die
LMI-behandelten Mäuse waren die gleichen wie die, die in Fig. 4
gezeigt sind, bei denen die Tumorbelastung durch die
LMI-Behandlung um > 99 % verringert worden war. Zellen von einzelnen
Mäusen wurden untersucht, und die Ergebnisse sind für beide
Tiere jeder Gruppe gezeigt. Die Abtötung ist als prozentuale
spezifische Freisetzung ausgedrückt. Die spontane Freisetzung
betrug 195 cpm für EL4 und 248 cpm, und die Gesamtmenge an
freisetzbarem Material betrug 2549 für EL4 und 2938 für RDM4.
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Die Daten zeigen, daß die Aktivität spezifisch war, indem
keine Aktivität für RDM4-Ziele nachgewiesen wurde. PEL von
Mäusen, denen LMI, jedoch keine lebenden Tumorzellen
injiziert worden waren, zeigten für keines der Ziele eine
lytische Aktivität. PEL von Mäusen, denen der Tumor injiziert
worden war, die jedoch nicht mit LMI behandelt worden waren,
hatten ebenfalls keine abtötende Aktivität (nicht gezeigt),
die große Anzahl der Tumorzellen, die in dieser Population
vorhanden war, schließt eine endgültige Interpretation jedoch
aus, da sie als kalte Zielblockierer wirken könnten.
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Tumortragende Tiere wurden mit LMI-behandelten Tieren im
Hinblick auf die cytolytische Aktivität von
Milzzellpopulationen nach der erneuten Stimulierung in vitro mit
bestrahlten Tumorzellen in 6-tägigen Kulturen verglichen, um lytische
Reaktionen weiter zu untersuchen. Diese Daten sind in Fig. 7
gezeigt. Fig. 7A zeigt die Spezifität von CTL aus erneut
stimulierten Milzzellen von mit LMI behandelten,
EL4-Tumor-tragenden C57BL/6-Mäusen, und Fig. 7B stellt die Wirkung der
Behandlung auf die erneute Stimulierung von Milzzellen von
P815-Tumor-tragenden CD2F1-Mäusen dar.
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C57BL/6-Mäusen wurden i. p. 10&sup6; lebende EL4-Zellen
überimpft, und 10&sup7; EL4-Antigen-tragende LMI wurden gleichzeitig
verabreicht (Fig. 7A). 12 Tage später wurden die Milzen (2
Mäuse) entnommen, vereinigt und in eine Kultur mit oder ohne
bestrahlte EL4-Zellen gegeben. Nach 6 Tagen der Kultur in
vitro wurden die Zellen auf die lytische Aktivität in einem 4-
stündigen Cr-Freisetzungsassay unter Verwendung von EL4- und
RDM4-Zielen untersucht. Es sind Ergebnisse für Zellen
gezeigt, die mit bestrahlten EL4 kultiviert wurden. Zellen, die
in Abwesenheit von Stimulatoren kultiviert wurden, wiesen für
keines der Ziele eine lytische Aktivität auf.
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CD2F1-Mäusen wurden 10&sup6; lebende P815-Zellen überimpft, und
sie wurden gleichzeitig mit nichts (nichts), 10&sup7; LMI, die
P815-Antigen trugen (LMI-P815), oder 10&sup7; LMI, die normales
Mäuseserum trugen (LMI-NMS), behandelt (Fig. 7B). 7 Tage
später wurden Milzen entnommen (2 Mäuse pro Gruppe) und in eine
Kultur allein oder mit bestrahlten P815-Zellen gegeben. Nach
6 Tagen der Kultur in vitro wurde die lytische Aktivität für
P815- und RDM4-Ziele untersucht. Die für erneut stimulierte
Zellen im Hinblick auf P815-Ziele erhaltenen Ergebnisse sind
gezeigt. Es wurde keine Abtötung von RDM4-Zielen
festgestellt. Zellen, die nicht in vitro erneut stimuliert worden
waren, lysierten weder P815- noch RDM4-Ziele.
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Fig. 7A zeigt, daß Milzzellen, die 12 Tage, nachdem den
Mäusen EL4-Tumor und LMI injiziert worden waren, entnommen
wurden, eine starke cytolytische Reaktion gegen EL4-Ziele,
nicht jedoch gegen RDM4-Ziele entwickeln konnten. Diese
Reaktion trat nur in Kulturen auf, bei denen bestrahlte
EL4-Stimulatoren
zugegeben wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden
erzielt, wenn Milzzellen von Mäusen untersucht wurden, denen
P815-Tumorzellen und keine weitere Zugabe, antigentragende
LMI oder LMI, die mit normalem Mäuseserum beschichtet waren,
injiziert wurden. Die erneute Stimulierung mit bestrahlten
P815 führte zur Entwicklung einer starken anti-P815-Reaktion
von Mäusen, die mit Tumor und antigentragenden LMI behandelt
worden waren (Fig. 7B). Im Gegensatz dazu wurde eine geringe
oder keine Reaktion von Zellen von Mäusen festgestellt, die
nur Tumor oder Tumor oder mit normalem Mäuseserum
beschichtete LMI erhalten hatten. In allen Fällen wurde keine
Reaktion bei Abwesenheit von bestrahlten P815-Stimulatorzellen
erhalten.
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Im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wurden in der
gleichen Art von Versuch bei der Untersuchung des RDM4-Tumors
in AKR-Mäusen erhalten. Milzzellen, die von Mäusen 12 Tage
nach der Injektion von RDM4 und antigentragenden LMI
entnommen wurden, entwickelten eine starke Reaktion (61 % Lyse bei
einem E:T von 2:1), die von einer erneuten Stimulierung mit
bestrahlten Stimulatoren abhängig war und die spezifisch für
RDM4-Ziele war. Zellen von Mäusen, denen nur Tumor gegeben
worden war, entwickelten eine geringe Reaktion bei erneuter
Stimulierung (8 % bei 2:1), was auch für Milzzellen von
normalen Mäusen gilt, die weder Tumorzellen noch LMI erhalten
hatten. Die LMI-Behandlungen, die zu einer PEL-Aktivität oder
einer Aktivität bei erneuter Stimulierung in vitro führen,
führen auch zu einer verringerten peritonealen Tumorbelastung
im Vergleich mit Kontrollen.
Tumortherapie unter Anwendung einer kombinierten Behandlung
durch LMI und Chemotherapie
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Bei Verwendung in Kombination zur Behandlung von Tumoren
tragenden Wirten haben LMI und Cyclophosphamid (CY)
hochgradig synergistische Wirkungen auf das Tumorwachstum und das
Überleben des Wirts. Das Tumorwachstum wurde in Mäusen durch
Injektion von syngenen P815-Tumorzellen mit 10&sup5;/Maus
induziert. Mäuse, die den intraperitoneal wachsenden, syngenen
P815-Tumor trugen, wurden am Tag 0 (Tag der Tumorüberimpfung)
mit LMI, 10&sup7; i. v., und am Tag 3 mit CY, 3 mg i. p.,
behandelt.
Weder CY allein noch LMI allein dehnten das Überleben
des Wirts in signifikanter Weise aus. Mäuse, die sowohl mit
LMI als auch mit CY behandelt worden waren, wiesen jedoch
ganz erheblich ausgedehnte Überlebenszeiten auf, wobei 40 %
der Mäuse mehr als 180 Tage überlebten, wie in Fig. 8 gezeigt
ist.
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Wenn P815-Mastocytomzellen subkutan syngenen Wirten
injiziert werden, dann wachsen sie als ein fester, subkutaner
Tumor. Außerdem metastatisiert der Tumor in Lymphknoten, Milz
und Lunge, und es sind die Metastasen, die den Wirt töten. Um
zu bestimmen, ob LMI und CY das Wachstum von vorhandenen
Tumoren beeinflussen können, wurden Mäusen subkutan P815-Zellen
(Überimpfung von 10&sup7;) injiziert, und man ließ die Zellen 10
Tage wachsen. Zu diesem Zeitpunkt hatten alle Mäuse
sichtbare, tastbare feste Tumoren. Gruppen von Mäusen wurden dann
mit CY, 3 mg i. p. (Tag 10), LMI, 10&sup7; i. v. (Tag 13), oder
beidem behandelt. Das Tumorwachstum wurde durch Messung der
Fläche bestimmt, und die Überlebenszeit wurde bestimmt. Wie
in Fig. 9B gezeigt ist, dehnte die Behandlung mit CY und LMI
sehr wesentlich die Überlebenszeit des Wirts aus (p< 0,002 für
unbehandelte gegenüber mit CY+LMI behandelten Wirte), während
keine der Behandlungen allein eine signifikante Wirkung
hatte. Das Wachstum des festen Tumors wurde durch die CY+LMI-
Behandlung dramatisch verringert, wie durch die in Fig. 9A
graphisch dargestellten Daten gezeigt wird. 0bwohl die
Behandlung mit CY allein keinen Einfluß auf die Überlebenszeit
hatte, verringerte sie das Tumorwachstum. Dieses Ergebnis
deutet darauf hin, daß die Chemotherapie allein die primäre
Tumormasse verringern kann, jedoch eine geringe oder keine
Wirkung auf Metastasen hat.
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Die vorstehenden Ergebnisse erweitern die Belege für die
Wirksamkeit der LMI-Behandlung auf zwei wichtigen Richtungen:
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1) Die Behandlung durch LMI und Chemotherapie kann
hochgradig synergistische Wirkungen auf Tumorwachstum und
Überleben des Wirts haben.
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2) Die kombinierte Behandlung durch LMI und Chemotherapie
kann das Überleben des Wirts wesentlich verlängern, wenn die
Behandlung erst begonnen wird, nachdem der Tumor aufgetreten
Behandlung erst begonnen wird, nachdem der Tumor aufgetreten
ist.
Zusammenfassende Darstellung
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Die LMI-Behandlung von Tumoren tragenden Tieren führt also
sowohl zu einer dramatischen Verringerung hinsichtlich der
Tumorbelastung als auch zum Auftreten einer wirksamen,
tumorspezifischen, cytolytischen Aktivität. Das Ausmaß und die
Spezifität der lytischen Aktivität und die antigenabhängige
erneute Stimulierung der Reaktion durch Milzzellen sind alles
sehr starke Argumente dafür, daß diese Reaktion durch
cytolytische T-Lyinphocyten vermittelt wird. Unabhängig vom
Wirkungsmechanismus der LMI-Behandlung zeigen die bisher
erhaltenen Ergebnisse den Wert der Erfindung für die
Krebsimmuntherapie bei Säugern.
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Therapeutische Anwendungen für LMI umfassen die in vivo-
Verabreichung allein oder in Kombination mit anderen Mitteln,
um gegen eine Krankheit zu immunisieren, oder als Therapie
für bestehende Krankheiten. Krankheiten, bei denen LMI sich
als wirksam erweisen werden, umfassen virale, bakterielle und
parasitäre Krankheiten, Krebs, Graft-versus-host-Krankheit
und Autoimmunerkrankungen. Liganden, die auf LMI verwendet
werden, umfassen, ohne Beschränkung hierauf, MHC-Moleküle,
natürliche oder synthetische Peptidantigene, Proteinantigene,
isolierte Plasmamembranen, Antikörper und weitere Liganden,
die durch Zelloberflächenkomponenten gebunden werden.
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Die Behandlung mit LMI und Chemotherapie kann hochgradig
synergistische Wirkungen auf das Tumorwachstum und das
Überleben des Wirts haben, und eine kombinierte Behandlung durch
LMI und Chemotherapie kann das Überleben des Wirts wesentlich
verlängern, wenn die Behandlung erst begonnen wird, nachdem
der Tumor aufgetreten ist.
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Während erhebliche Anstrengungen nötig sein werden, bevor
eine vollständige Charakterisierung des Mechanismus/der
Mechanismen, durch die LMI in vivo die Entwicklung von
CTL-Reaktionen verstärken, möglich sein wird und es bis jetzt nicht
bekannt ist, ob die cytolytische Reaktion die dramatische
Verringerung oder Ausschaltung eines Tumors vermittelt, der
sich entwickelt hat, bevor die LMI-Immuntherapie begonnen
wird, deuten die vorgelegten Daten und Ergebnisse auf einen
wesentlichen Durchbruch bei der Behandlung und Verhinderung
von Krankheiten.
Gewerbliche Anwendbarkeit
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Die vorliegende Erfindung findet Anwendung bei der
Erforschung und der Immunisierung und/oder Immuntherapie von
Tumoren und anderen zellvermittelten Erkrankungen von
Säugern, z. B. in der Veterinärmedizin und bei der
immuntherapeutischen Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen.