AT390002B

AT390002B - Verfahren zur herstellung von krebszellen bekaempfenden lymphocyten

Info

Publication number: AT390002B
Application number: AT0354585A
Authority: AT
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1981-10-01
Filing date: 1985-12-09
Publication date: 1990-03-12
Also published as: NZ201112A; MX7437E; SE8204058D0; DD209577A5; PT75148B; FI77157B; FR2513882B1; DE3249568C2; DD221917A5; AU554858B2; FR2513882A1; IT8248724A0; IL66270A; AT382080B; DE3236298A1; CH655660B; FI77157C; ATA363782A; AU8545882A; BE893704A

Description

Nr. 390002

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Krebszellen bekämpfenden Lymphocyten (nachfolgend als "Killcrzellen") bezeichnet

Immunansprechende Effcktorzellen, insbesondere T-Lymphocytcn, die eine Hauptrolle bei einer zcllausgclöstcn Immunreaktion spielen, verursachen eine Zurückweisung von Pfropfstcllcn aufgrund eines Fremdzcllcn-Antigcns, bewirken jedoch keine merkliche oder nur eine sehr begrenzte Immunoinhibicning gegen Krebszellen. Infolgedessen werden die Krebszellen nicht zerstört, sondern vervielfältigen sich in vivo und verursachen schließlich den Tod des von Krebs befallenen Trägers.

Der hierbei vorhandene Mechanismus ist jedoch noch nicht vollständig klar und es sind verschiedene Untersuchungen angestclit worden, um nähere Erkenntnisse zu erlangen über die Art der Malerialbasis, die in einem solchem System vorkommt Z. B. werden Zellobcrflächenmarkierungen auf Mäuselcukämiezellen oder Embrionalkarzinomzellcn unter Verwendung von Lektinen, wie Dolichos biflorus-Agglulintn (DBA) und Erdnußagglutinin (PNA) in Biochem. Binphvs. Res. Comm. «9 (2) 448455 (1979), Ibid. 96 (4) 1547-1553 (1980). J. Biochem· 89 473481 (1981) und Cell 18 183-191. September 1979 beschrieben.

Soweit bekannt ist, sind bisher jedoch noch keine Versuche unternommen worden, um neue Lymphocyten zur Verfügung zu stellen, die Krebszellen spezifisch unter Anwendung einer Immunansprechung der Lymphocyten bekämpfen können.

Gründliche Untersuchungen über die Immunansprechung des Trägers gegenüber Krebszellen und deren Anwendung zur Behandlung von Krebs haben nun ergeben, daß in einem krebszellenspezifischen Antigen, das nicht in differentierten Normalzeiten zu finden ist, ein glykoverwandtes Antigen (im folgenden mit "GRA" bezeichnet) vorhanden ist, das als Immunogcn für den Träger wirkt und eine sehr hohe Immunogenität aufweist, das eine Immunreaktion, die spezifisch auf Krebszellen ist, verursacht Es wurde weiterhin festgestcllt, daß dann, wenn man GRA zum Sensibilisieren von Lymphocyten verwendet man Killerzellcn erhält die spezifisch auf GRA-cnthaltcnde Krebszellen wirken und daß man bei Verabreichung der Killcrzellen an einen Träger diese GRA erkennen und auf GRA-cnthaliendc Krebszellen cinwirkcn, diese zerstören und daß man auf diese Weise eine sehr gute Wirkung bei der Behandlung und Vorbeugung von Krebs erzielen kann.

Das erfindungsgemäßc Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß Lymphocyten mit einem von Krebszellen abgeleiteten, glykoverwandten Antigen sensibilisiert werden, wobei das Antigen eine Krcbszcllenmembrankomponcnic ist, die reaktionsfähig ist, um sich mit einem Lektin zu kombinieren, welches sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder N-Acctylgalaktosamin kombiniert

Bevorzugt wird dabei, daß das glykoverwandte Antigen dadurch erhalten wird, daß Zellmembrankomponenten von Krebszellen homogenisiert oder solubilisiert, mit einem Lektin, das spezifisch mit einer endständigen Galaktose oder einem N-Acetylgalaktosamin kombiniert sein kann, in Verbindung bringt, wobei ein Lektinzellmcmbrankomplcx gebildet wird, dieser Komplex gewonnen wird, worauf das Lektin von dem Komplex abgespalten und in die lektinfreie Zcllmcmbrankomponcntcn gewonnen werden.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete GRA erhält man aus GRA enthaltenden Krebszellen von Menschen oder Tieren, z. B. von kultivierten Krebszellen, transplantierten Krebszellen, spontan auftretenden Krebszellen, durch chemische Substanzen oder durch Viren induzierten Krebszellen oder Krebszellen, die man aus Geweben herausoperiert hat unter Anwendung der folgenden Verfahren.

Zcllmembrankomponenten werden von Krebszellen der vorerwähnten Art abgetrennt und mit einem Lektin behandelt, welches sich spezifisch mit terminaler Galaktose oder endständigem N-Acetylgalactosamin, wobei GRA mit dem Lektin verbunden leicht angetrennt werden kann, bindet (s. J. B. C., 250, 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm., 62. 144 (1975); Z. Immunitälsforsch., 138.423433 (1966); Br. j. Exp. Pathol., 22, 228-236 (1946); Proc. Nath. Acad. Sei. USA, 25, Nr. 5, 2215-2219 (1978); Biochcmistry, 12. 196-204 (1974); und Carbohydrate Research, 51,107-118 (1976)), wodurch GRA sich mit dem Lektin vereint und leicht abgetrennt werden kann.

Die Trennung der Krcbszcllcnmembrankomponcnten kann man auf einfache bekannte Weise erzielen, z. B. durch eine Homogenisierungsmethode und eine Solubilisierungsmethode unter Verwendung eines Auflösungsmiucls. Vorteilhaft ist es, eine Methode anzuwenden, bei welcher Krebszellen in physiologischer Kochsalzlösung oder in einem geeigneten Puffer homogenisiert werden, ein Teil des Niederschlags durch beispielsweise Zentrifugenabtrennung gesammelt wird und in physiologischer Kochsalzlösung oder einem Puffer mittels eines Lösungsmittels gelöst wird, worauf man den überstehenden Teil dann beispielsweise durch Zctrifugcnabscheidung abtrennt. Als Auflösungsmittel kann man beispielsweise oberflächenaktive Mittel, wie sie allgemein bekannt sind, um Zellmembranen aufzulösen, verwenden, z. B. nichlionischc oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.), NP40 (hergestellt von Shell Co., Ltd.), Digitonin und Harnstoff, oder anionische oberflächenaktive Miuel, z. B. Natriumdodecylsulfonat (SDS).

Aus den so erhaltenen Zellmembrankomponcntcn kann man GRA, das in der Lage ist, sich mit Lektin unter Anwendung üblicher chemischer oder biochemischer Verfahren und indem man von den Eigenschaften des Lektins Gebrauch macht, abtrennen. Beispiele für solche Verfahren sind eine Afiinitätschromatografic, bei der man einen ein Lektin enthaltenden Säulenträger verwendet, eine Immunausfällungsmethode, unt,,r Verwendung von GRA-Antikörper oder dergleichen, eine Dialysemethode, eine Gelfiltrationsmcthode, eine Elektrophoresemethodc oder eine physikalische Ausfällung unter Verwendung eines Zuckcrprotein ausfallenden Mittels, z. B. -2-

Nr. 390002

Polyethylcnglykol und Aceton, oder eine Kombination solcher Verfahren. Besonders bevorzugt ist die Affiniütschrcmaiografie unter Verwendung einer Säule, die ein Lektin enthält, wobei man den Säulen träger leicht hersisllcn kann, indem man Lektin auf einem unlöslichen Träger immobilisiert Die Immobilisierung von Lektin auf einem unlöslichen Träger kann man in bekannter Weise, wie sie für die Immobilisierung von Biosubstanzen angewendet wird, durchführen. Von diesen Methoden wendet man bevorzugt die Cyanobiomiddctivierungs* Polysäccharid-Mcihodc und eine Immobilisicrungsmcthode unter Verwendung von N-Hydroxysuccimidester an. Die Cyanobromidaktivierungs-Polysaccharid-Methodc ist eine Methode, bei der ein unlöslicher Träger mit Cyanobromid behandelt wird und das so erhaltene aktivierte Produkt wird dann unter milden Bedingungen einer Kupplungsreaktion mit einem Lektin unterworfen, wobei das Lektin immobilisiert wird. Bei der Behandlung des unlöslichen Trägers mit Cy&nbromid wendet man beispielsweise basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid und Natriumhydrogenkarbonat an, um den pH auf 7 J5 bis 12 einzustellen und dann behandelt man den Träger in einem Lösungsmittel, wie Wasser, Acetonitril oder einem bei pH 7,5 bis 12 gehaltenen Puffer, z. B. einem 0,1 M Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH etwa 8,7) und 0,01 M Phosphatpuffer (pH etwa 7,7) bei Raumtemperatur während etwa 1 bis 12 Minuten. Im allgmeinen wendet man vorzugsweise eine dem unlöslichen Träger äquivalente Menge an Cyanbromid an.

Jeder bekannte unlösliche Träger, der gegenüber allen Biosubstanzen eine niedrige nichtspezifische Adsorption zeigt, der eine hohe Porosität hat und der eine funktionelle Gruppe aufweist, die unter milden Bedingungen in der Lage ist, Biosubstanzen zu immobilisieren und der chemisch und physikalisch ausreichend stabil ist, kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Verwendbare unlösliche Träger sind beispielsweise Träger, die aus Zellulose hcrgestcllt wurden, z. B. Aminocthylzcllulose, Carboxymethylzellulosc, Bromoacetylzcllulosc und p-Anilinozellulose, oder ein Träger aus vernetztem Dextran, z. B. Sephadex und CM-Sephadex (hcrgestcllt von Farmacia Corp.) und ein Träger aus Agarose, z. B. Sepharose 2B, Sepharose 4B und Sepharose 6B (hcrgestcllt von Farmacia Corp.).

Bei der Kupplungsreaktion des wie oben erhaltenen, mit Cyanbromid aktivierten Trägers wird der mit Cyanbromid aktivierte Träger in einer Menge angewendet, die 30 bis 80 mal der des Lektins entspricht und man führt die Umsetzung in einem geeigneten Lösungsmittel, wie einer 0,1 Mol/1 wäßrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat (enthaltend 0,5 Mol/1 Natriumchlorid; pH 8,4) bei einer Temperatur zwischen 0 und 40 °C und vorzugsweise 2 und 8 °C während einer Zeit von etwa 10 bis 20 Stunden durch. Auf diese Weise erhält man einen Lektin enthaltenden Träger für eine Affinitätschromatografie.

Bei der Chromatografle unter Verwendung des Lektin enthaltenden, wie oben beschrieben hcrgcstelltcn Trägers, kombiniert sich das gewünschte GRA mit dem auf dem Träger enthaltenen Lektin und wird in der Säule festgehalten. Anschließend werden Substanzen, die zu einer Kombination in der Lage sind, z. B. mit einem Lektin, durch die Säule laufen gelassen, wobei eine Austauschreaktion stattfindet, oder man führt altemjuv eine Adsorptionsabtrennung (mit einer Eluierlösung) durch, z. B. mit einem hochkonzentrierten Salz, einer »äßngcn Lösung von Kaliumlhiocyanat und einem Nitratpuffer, um das gewünschte GRA abzutrennen und zu gewinnen. Bei der Austauschrcaktion sind Substanzen, die in der Lage sind, sich mit einem Lektin zu verbinden, »enn em Träger für die Affinitätschromatografie, enthaltend ein galaktoscbindendes Lektin, verwendet wird, bci\picU*ciNC solche, die sich mit einem endständigen galaktoscverbindendem Lektin kombinieren, z. B. Galaktose. Disaccharide, enthaltend endständige Galaktose, und Oligosaccharide, enthaltend eine endständige Galaktose. Beispiele für Substanzen, die in der Lage sind, sich mit einem Lektin zu verbinden, wenn als Träger (ur die Afflnitätschromatografie ein N-Acctylgalaklosamin-bindcndcs Lektin verwendet wird, sind solche, die skh mit einem endständigen N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektin verbinden könnten, z. B. N-Acetyigalaku^amm. Disaccharide, enthaltend ejn endständiges N-Acetylgalaktosamin und Oligosaccharide, enthaltend ein cmistandigcs N-Acetylgalaktosamin.

Das so erhaltene GRA enthält Glykoprotein, enthaltend eine Galaktose und/oder N-Acetylgalakiovwmn· Endgruppe, Glykolipide und/oder Saccharide.

Das so hergestcllte GRA kann gcwünschtenfalls lyophilisiert werden und auch in üblicher Weise unter Anwendung üblicher Trennmethoden gereinigt werden. Beispielsweise kann man solche GRA-Zubcrciiungcn. die mit einem galaktosebindenden Lektin isoliert wurden, einer Trennmethode unterwerfen, unter Anwendung eines N-Acciylgalaktosamin verbindenden Lektins und GRA, das mit einem N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektin dann isoliert wurde, kann nach einer Trennmethode behandelt werden, unter Verwendung eines galaktosebindcnden Lektins.

Die hier verwendeten Lymphocyten sind nicht kritisch und alle Lymphocyten von normalen oder krcbsigcn Menschen oder Tieren können verwendet werden. Beispiele hierfür sind Lymphocyten, die man von pcnpbcrcm Blut, Knochenmark, Lymphknoten, aus der Milz, den Mandeln oder der Thymusdrüse erhält. Diese Lymphocyten werden durch physikalische oder chemische Methoden, durch eine Obcrflächcnmembranmethode oder dergleichen isoliert.

Die Sensibilisierung von Lymphocyten mit GRA erfolgt, indem man die Lymphocyten auf einem Kulurmedium, enthaltend GRA, während einer Zeit von 1 bis 10 Tagen, vorzugswci'O 2 bis 7 Tagen, kultiviert.

Als Kulturmedium für die Verwendung zum Sensibilisieren der Lymphocyten können verschiedene übliche Nährmedien verwendet werden, die üblicherweise für solche Zellkultivierungen verwendet werden. Bevorzugte Beispiele schließen ein RMPI 1640-Medium, eine Eagle-MEM-Kultur, etc., dem Humanscrum, Kalbsföuisscrum

P00R

Nr. 390002 (FCS), Kalbsscrum, Pfcrdcscrum oder dergleichen zugegeben wurde. Die Menge des zur Kultur gegebenen GRA betrügt im allgmeinen 1 bis 1.000 ng/ml und vorzugsweise 1 bis 500 ng/ml, berechnet als Menge Zucker pro 1 x lflfyml Lymphocytcn.

Die Kultivierung wird in üblicher Weise, z. B. bei einem pH von 7,2 und bei einer Temperatur von etwa 37 °C durchgeführt.

Die so hcrgcstcllten Killetzellcn gemäß der Erfindung sind im wesentlichen normale Lymphoctcn und haben eine GRA-spczifischc ZcllcnbckämpfungsaktivitäL Beispielsweise hat GRA-l-KT, eine der erfindungsgemäßen Killcizcllcn, Eigenschafen die bei humanen peripheren Blut-T-Zcllcn Vorkommen und zeigt eine zellbekämpfcnde Aktivität, die spezifisch gegenüber Krebszellen, enthaltend GRA,ist, wie in den später folgenden Beispielen gezeigt wird.

Typische Beispiele für die Killcrzcllcn, die gemäß der Erfindung in den nachfolgend beschriebenen Beispielen hcrgcstcllt wurden, sind GRA-1-KZ und GRA-M-1.

Diese Killcrzcllcn sind bei der Patentinhaberin erhältlich.

Die crfindungsgcmäß hcrgcstcllten Killcrzcllcn kann man unlimitiert vervielfältigen, unter Verwendung des vorerwähnten Kultur mediums, enthaltend einen T-Zcllcn-Wachstumsfakior (TCGF, IL-2). In diesem Falle kann man eine selektive Kultivierung von Klonen der Killcrzcllcn mittels einer üblichen Ultraverdünnungsmcthode durchführen. Die Killcrzcllcn können stabil über lange Zeiträume in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.

Anhand nachfolgender Beispiele soll das erflndungsgemäße Verfahren erläutert werden,

Beispiel-!: BT-1 (Burkitt Lymphoma)-Zcllcn (1,3 x 10¾ wurden 3 mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann wurden 30 ml eines 0.01M tris-Salzsäurcpuffcrs (pH 7,4), enthaltend 2 % Triton X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl2 und 2 mmol MgCl2 zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 4 °C gerührt und dann einer Ullrazcntrifugcnabscheidung mit einer Rate von 100.000 x g unterworfen. Von 28 ml der dabei erhaltenen übcrstchcndcn Flüssigkeit wurde ein 14 ml-Anteil durch eine Säule (Durchmesser 0,5, Länge 1 cm) für die Affinitätschromatograflc geschickt,, wobei die Säule mit PNA-Agaroscperlcn (hcrgcstcllt von Maruzcn Co., Ltd.), die zuvor mit einem tiis-Salzsäurcpuffcr (pH 7,4), enthaltend 0,1 % Triton X-100,0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl2 und 2 mmol MgCl2 ins Gleichgewicht gebracht worden waren, geschickt. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer, wie er oben verwendet wurde, wurde mit einem 0,01M tris-Salzsäurcpuffcr (pH 7,4), enthaltend 0,1M Laktose, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl2,2 mmol MgCl2 und 0,1 % Triton X-100 cluicrL Der so c.'uicrte Anteil wurde mit einer 0,1M tris-Salzsäurcpuffcrlösung, enthaltend 0,85 % NaCl, 2 mmol MgCl2 und 2 mmol CaCl2 48 Stunden dialysiert, wobei man 17 mg einer GRA-Lösung erhielt. In dieser GRA-Lösung wurde die Menge an Protein und die Menge an Zucker nach der Folin-Lowry-Mcthodc bzw. nach der Phcnol-Schwcfclsäurc-Mcthode bestimmt; diese Mengen betrugen 644 pg bzw. 120 pg. Dieses Produkt wird nachfolgend als "GRA-Γ bezeichnet GRA-lwurdcn auf das 1.000-fachc des Ursprungsvolumens mit einem RPMI-1640-Kullurmcdium, enthaltend 15 % FCS, verdünnt, unter Erhalt eines Sensibilisierungs-Kulturmediums.

Lymphocylen von humanem peripheren Blut (5 x 10^/5ml), wurden zu 5 ml des Sensibilisierungs-Kulturmediums, hergcstclll wie oben, gegeben und dies wurde dann in eine Laborschale gegeben und 2 Tage bei 37 °C kultiviert. Anschliessend erfolgte eine weitere Kultivierung auf einem RPMI -1640-Kulturmedium, enthaltend 20 % TCGF und 15 % FCS, wie in Beispiel 4 beschrieben, für weitere 5 Tage, wobei man 20 ml einer Killcrzcllcnlösung, enthaltend 1 x 10^ Killcrzellcn/ml, erhielt. Diese wird nachfolgend als GRA-l-K-T bezeichnet

Beispiel .2;

Die Mäusc-Milzlymphocytcn wurden unter Verwendung eines RPMI-1640-Kulturmcdiums, enthaltend 15 % FCS, auf eine Zahl von 5 x 10^/ml eingestellt. Dazu wurde GRA-M-1, erhallen gemäß Beispiel 1 aus C3/HE-Mäusc-Brustkrcbs-MMT-Zcllcn gegeben, so daß das Endprodukt 1,5 pg/ml Protein und 0,9 pg/ml Zucker enthielt Ein 5 ml-Anteil des erhaltenen Gemisches wurde in eine Laborschaic (60 mm x 15 mm, hcrgcstcllt von Falcon Co.) 2 Tage bei 37 °C kultiviert. Es wurde die Bildung von Klonen beobachtet Der Anteil wurde weiter in einem RPMI-1640-Kulturmedium mit 15 % FCS, enthaltend 20 Vol. % TCGF (hergcstellt von Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd.) während 4 Tagen kultiviert, wobei man 50 ml einer

Killcrzellcnlösung, cnhaltcnd 1 x 10^ Killcrzellcn/ml erhielt. Diese wird nachfolgend als GRA-M-1 -K-T bezeichnet -4-

Nr. 390002

Mimsli;

Lymphccyten (S x 106) von peripherem Blut gesunder Spender v/urde in einem RPMI-1640-Medium, enthaltend 40 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-2 und 15 % FCS bei 37 °C inkubiert. Am zweiten Tag wurde das vorerwähnte Human TCGF zu dem Medium zugegeben, bis dessen Konzentration 20 % erreichte und die 5 Inkubicrung wurde 3 Tage fortgesetzt, wobei man Killer-Zellen erzielt, diese werden nachfolgend als "GRA-2-K-T bezeichnet. figfcpteli:

Annähernd 29 g (Naßgewicht) NKN-45 wurde in einem Waring-Mischer in 100 ml PBS homogenisiert Nach 10 dem Zentrifugieren mit 100.000 g während einer Stunde wurden die Pellets in 100 ml einer 2% Triton X-100-Lösung in 0,01M Tris*HCl-Puffer (pH 7,6), enthaltend 0,15M NaCl gelöst Die bei der Zentrifugierung mit 100.000 g während 1 h erhaltene überstehende Lösung wurde auf eine Säule von DBA-Sepharose (0,8 x 15 cm) zugegeben, die zuvor mit 0,015 % Trito X-1G0 in 0,01M Tris-HCl (pH 7,6), enthaltend 0.15M NaCl ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgetragen. Nach dem Waschen mit 50 ml des Puffers wurde 15 GRA mit dem 0,1M N-Acetylgalaktosamin enthaltenden Puffer eluiert Das eluierte GRA wurde gegen 0,85 % NaCl dialysiert, konzentriert mittels Scphadex Pharmacia Co. und bei -20 °C vor der Anwendung gelagert

Man erhält eine GRA-Zubercitung mit einem Proteingehalt von 0,03 mg und einem Zuckergehalt von 0,01 mg (nachfolgend mit GRA-8 bezeichnet).

Unter Verwendung der wie nachstehend hcrgestcllten mit TCGF bczeichneten Lymphocyten erhält man wie in 20 Beispiel 1 eine Killerzellenverbreitung, die mit GRA-8-K-T bezeichnet wird.

HfigJsllung von.TCGF (a) Die Milz von japanischen Affen (erhalten von der Japan Plymates Co., Ltd.) wurde herausoperiert und 2 mal mit einem RPMI-1640-Kulturmcdium (hcrgestellt von der Flow Laboratory Co.. Ltd.) gewaschen. Die 25 Zellen wurden unter Verwendung von Mesh (hcrgestellt von Millipore Ine., 150 mesh) filtriert und einem spezifischen Schwerkraftzentrifugenverfahren (spezifische Schwerkraft 1,076) unterworfen, wobei man 21 von 2 x 10^/ml Lymphocyten erhielt. Die so erhaltenen Lymphocyten wurden 3 mal mit einem RPMI-1640* Kulturmedium gewaschen und die Anzahl der Lymphocyten wurde auf 5 x lO'Vml unter Verwendung des gleichen Mediums wie zuvor, enthaltend 10 % FCS, eingestellt. Dann ließ man sie in einer Kohlendioxid-30 Fermentationsvorrichtung 1 Stunde bei 37 °C stehen. Die überstehenden Lymphocyten wurden gewonnen und die Anzahl der Lymphocyten wurde unter Verwendung des gleichen Kulturmediums wie vorher angegeben, enthaltend 1 % FCS auf 1 x 106/ml eingestellt. Anschließend wurden 1 pg/ml Indomethacin (hergestellt von Sigma Laboratories Inc.) und 0,2 % PHA-P (hcrgestellt von Difco Co.) zugegeben und dann wurde die Kultivierung in einer Kohlendioxidgas-Fermentationsvonichtung 48 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Nachdem man 10 Minuten 35 eine Zentrifugenabscheidung (3.000 UpM) durchgeführt hatte, wurde die gebildete Uberstehende Flüssigkeit gewonnen und sterilisiert, indem man sie durch ein MUlipore-Filter (hergestellt von der Millipore Inc., 0,2 jim) filtrierte und wobei man 21 TCGF erhielt. (b) Als Quelle von TCGF wurde die überstehendc Flüssigkeit von mischkultivierten peripheren Blutlymphocyten von 10 gesunden Spendern verwendet. Nicht zusammenhängende Lymphocyten, hergestellt von 40 C.F. (Conray. Ficol (Japan Immunorcsearch Co.)) abgetrennten Lymphocyten durch Adsorption auf Plastikoberflächen bei 37 °C während 1 h wurden in RPMI 1640-Medium, enthaltend 1 % FCS (1,5 x 10^ Zellen/ml) suspendiert und mit 0,2 % PHA-P, Indomethacin (1 pg/ml) und Human-B-Zellen (BT-1) (1,5 x 10^ Zcllcn/ml), vorbehandelt mit Mitomycin C (50 μιη/ml) inkubiert. Nach 48 Stunden wurde die aufschwimmende Kultur geerntet und als TCGF-Quelle verwendet (H.Inoue et al, ScandJ.Immunol. 12, 45 S. 149-145 (1980)).

Beispiel 5.;

Unter Verwendung von BT-a statt NKN-45, wie in Beispiel 4, erhält man eine mit GRA-3 bezeichnctc Probe mit einem Proteingehalt von 0,5 mg und einem Zuckergehalt von 0,09 mg, diese wurde auf eine DBA-50 Sepharose-Säule gegeben und mit Tris-HCl-Puffer (0,015 % Triton X-100,2 mMol MgClj.CaClj, 0,85 % NaCl) eluiert, wobei man 4 ml-Fraktionen Nr. 1-12 erhielt. Fraktionen 1-3 werden als "GRA-3-A" bezeichnet und Fraktionen 4-12 als "GRA-3-Bn. Dann wurde die Säule mit dem gleichen Puffer eluiert, der jedoch 0,1 M N-Acetylgalaktosamin enthielt und wobei man Fraktionen erhielt die mit "GRA-ß-C" bezeichnet werden.

Wie in Beispiel 4 wurde aus der Fraküon GRA-3-A und TCGF die Zubereitung GRA-3-A-K-T erhalten.

Beispiel 6;

Die Zubereitung GRA-3-C-K-T erhält man, wie in Beispiel 5, unter Verwendung oer Fraktion GRA-3-C. -5- 55

Nr. 390002

BsfepisL?; C3HE/Mäusen (weiblich 8 Wochen alt) wurde intradermal X5563-Zellen (10**) des gleichen Stammes implantiert und nach 7 Tagen wurde der Tumor chirurgisch herausgeschnitten. Nach weiteren 7 Tagen wurden X5563-Zellen (10¾ gleichen Stammes inokuliert und Mäuse, die gegenüber der Inokulierung resistent waren, wurden als Immun-Mäusc bezeichnet

Die Milzzellen der Immunmäuse und von C3H/HE-Mäusen wurden unter üblich angewendeten Methoden präpariert

Jedes Lot von Milzzellen (5 x 10*VWelI) wurde mit 40 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-M-5 in RPMI-1640-Medium, enthaltend 15 % FCS während 5 Tagen sensibilisiert unter Erhalt von Killerzellen.

Killerzell-Zubereitungcn, die aus normalen Milzzcllcn erhalten wurden, werden nachfolgend als "GRA-M-5-K-t-Γ bezeichnet, und solche, die von Immunen Miizzellen erhalten wurden, werden mit "GRA-M-5-K-T-2" bezeichnet

Beispiel 8:

Lymphocyten von peripherem Human-Blut (5 x 10¾ wurden in 5 ml RPMI*1640-Medium, enthaltend 50 ng/ml (Proteingehalt) GRA-1 bei 37 °C während 2 Tagen inkubiert. Am dritten Tag wurden die Lymphocyten in das RPMI-1640-Medium, enthaltend 10 % Serum von dem Spender der Lymphocyten, und 0 bis 100 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-1 übertragen und die Inkubicrung wurde nach weiteren 5 Tagen fortgeführt, wobei man die in der nachfolgenden Tabelle gezeigten Killerzellen-Zubereitungcn erhielt

Tabelle 1 GRA-Konzentration fne/mll Erster Tas Tag 3 Killerzellen 50 0 GRA-l-K-T-1 50 1,6 GRA-l-K-T-2 50 3.2 GRA-l-K-T-3 50 6 GRA-l-K-T-4 50 12,5 GRA-l-K-T-5 50 25 GRA-l-K-T-6 50 50 GRA-l-K-T-7 50 200 GRA-l-K-T-8 Beispiel 9: (a) Lymphocyten von peripherem Blut (PBL) von verschiedenen Krebspatienten nach der Operation wurden mit GRA-3 sensibilisiert unter Erhalt von Killcrzellcr-Zubereitungen. PBL (5 x 10¾ von den Patienten wurde in RPMI-1640-Medium, enthaltend 50 ng/ml (Proteingehalt) von IRA-3 während 2 Tagen inkubiert und dann inkubierte man in RPMI-1640-Medium, enthaltend 20 % TCGF und 15 % FCS weitere 5 Tage unter Erhalt der Killerzellen, die in Tabelle 2 gezeigt werden.

Tabelle 2

Periphere Blut-Lymphocyten

Krebs P-GKA JH?RA Tage nach der _Operation_ KiJlsrzgllen Magenkrebs + + 14 GRA-3-K-T-1 Magenkrebs + + 35 GRA-3-K-T-2 Brustkrebs + - 21 GRA-3-K-T-3 Brustkrebs + - 7 GRA-3-K-T-4 Brustkrebs + - 35 GRA-3-K-T-5 Magenkrebs + - 21 GRA-3-K-T-6

In der obigen Tabelle bedeutet P-GRA und D-GRA die Lokalität von GRA, ausgedriiekt als Maligne-Gewebe (durch Operation entnommen) von Krebspatienten, von denen PBL in gleicher Weise gesmimelt worden war, wie im Beispiel 1. P-GRA und D-GRA wurden erhalten unter Verwendung von F1TC-PNA bzw. FITC-DBA. Die Tage nach der Operation geben die Zeit an, wann BPL nach der Operation gesammelt worden war. -6-

Nr. 390002 (b) PBL (S x 10®), gesammelt von Brustkrebspatienten 21 Tage nach der Operation wurde in RPMI-1640-Medium, enthaltend SO ng/ml (Proteingehalt) GRA-3 und 10 % Serum von den Patienten während 7 Tagen inkubiert, um das PBL zu sensibilisieren und unter Erhalt von Killerzellen-Zubereitungen. Diese werden nachfolgend als GRA-3-K-T-7 bezeichnet 5

Testhelsptei

Snezifischeitebszellen abtötende AKitvitat

Es wurden die nachfolgenden S Zellenstämme mit unterschiedlichen GRA-Positivitätsverhältnissen als zu bekämpfende Human-Krebszellen verwendet: 10 Zu bekämpfende Krebszellen:

Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 15 Nr. 4 Nr. 5 BT-1 (Burkitt Lymphoma)

Caudi (Burkitt Lymphoma) ΚΑΤΟ-ΙΠ (Magenkrebs) NKN-45 (Magenkrebs) MOLT (T-Zellen Leukemia)

Aus einer Mikroplatte (hcrgestelll von Falcon Corp.) wurden pro Vertiefung S x 10^ der zu bekämpfenden Krebszellen durch Zentrifugenabscheidung mit einer Rate von 8.000 Upm während S Minuten aufgebracht. Dann 20 wurden vorsichtig 4 x 10® pro Vertiefung des nach Beispiel 1 erhaltenen GRA-l-K-T zugegeben und dann wurde 1 Stunde inkubiert.

Die Ablötungsaktivität wurde je nach dem Grad der Belagbildung festgestellt und wie folgt bewertet: ++ eine merkliche Abtötungsaktivität wird festgcstellt 25 + eine Abtötungsaktivität wird festgestellt ± eine geringe Abtötungsaktivität wird feststem • eine Abtötungsaktivität kann nicht festgestellt werden.

In einer Kontrollgruppe wurden unsensibilisierte humane periphere Blutlymphocyten, die in gleicher Weise 30 wie in Beispiel 1 hcrgestcllt worden waren, jedoch ohne Verwendung von GRA, verwendet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt.

Aus Tabelle 3 geht hervor, daß die erfmdungsgemäß gebildeten Killer-T-Zellen eine starke GRA-spezifische cytotoxische Aktivität aufweisen. 35 zu bekämpfende Krebszelle GRA-Positivverhältnis (%) Beurteilung der Be-laßbildung GRA-l-K-T- Gruppe Daudi (Fig. 1) 93,1 ++ (Fig. 2) ΚΑΤΟ-ΙΠ (Fig. 3) 57,3 + (Fig. 4) BT-1 (Fig. 5) 50,1 ++ (Fig. 6) MKN-45 (Fig. 7) 1,0 ± (Fig. 8) MOLT (Fig. 9) 0,6 - (Fig. 10) KontrollRruppc BT-1 50,1 • (F^ ID_ (b) Die gleichen zu bekämpfenden Krebszellen, wie sie in (a) verwendet wurden (3,2 x 10®) wurden mit 8 x 10“* GRA-l-K-T (Zellverhältnis 5/1) vermischt und das gebildeteZcllgemisch (Gesamtanzahl 4 x 10®) wurde in einem 15 % FCS enthaltenden RPM1-1640-Medium kultiviert. Nach 1 Stunde wurde die Anzahl der 50 verbliebenen Zellen gezählt und das Inhibierungsveihältnis wurde gemäß folgender Gleichung erreicht:

Anzahl der Zellen nach der Kultivierung

Cytotoxizitäl (%) = (1- (-) x 100) 55 Anzahl der Zellen vor der Kultivierung (4 x 106)

Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. -7- 60

Nr. 390002

Tabelle 4 zu bekämpfende Zellen Anzahl vor der Kultivierung 1er Zellen nach der Kultivierung Cyto- toxizität (%) Daudi 4x 106 2,9 x 106 28 ΚΑΤΟ-ΙΠ 4x 106 3,7 x 106 75 BT-1 4x 106 3,2 x 106 20 MKN-45 4 x 106 3,9 x 106 25 MOLT 4x 106 4.2 xlO6 -5 (c) Das Verfahren von (b) wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das Mischverhältnis von GRA-l-K-T zu den zu bekämpfenden Krebszellen auf 5/3 verändert wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5 zu bekämpfende Anzahl der Zellen Cyto- Zellen vor der Kultivierung nach der Kultivierung toxizität (%) Daudi 4x 106 3,6 x 106 91 KATO-m 4xl06 3,6 x 106 24 BT-1 4xl06 1,4 x 106 65 MKN-45 4x 106 3,7 x 106 12 MOLT 4x 106 4.1 x 106 -3

In den Figuren wird die Wirksamkeit erfindungsgemäß gewonnen Lymphocyten veranschaulicht.

Fig. 1 ist eine Mikrofotografie von Daudi-Krcbszellen,

Fig. 2 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen von GRA-l-K-T auf Krebszellen gemäß Fig. 1 zeigt.

Fig. 3 ist ein Mikrofotografie von KATO-III-Zellen,

Fig. 4 ist eine Mikrofotografie, die die Bildung von Belägen durch GRA-l-K-T auf Krebszellen gemäß Fig 3 zeigt,

Fig. 5 ist eine Mikrofotografie von BT-I-Krebszellcn,

Fig. 6 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen durch GRA-l-K-T auf den Krebszellen von Fig. 5 zeigt,

Fig. 7 ist eine Mikrofotografie von MKN-45-Krebszellen,

Fig. 8 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen durch GRA-l-K-T auf Krebszellen gemäß Fig. 7 zeigt,

Fig. 9 ist eine Mikrofotografie von MOLT-Krebszellen,

Fig. 10 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen durch GRA-l-K-T auf Krebszellen gemäß Fig. 9 zeigt,

Fig. 11 ist eine Mikrofotografie von BT-1, das mit einer Mischung von unsensibilisierten humanen peripheren Blutlymphocytcn behandelt wurde,

Fig. 12 und 13 sind jeweils Mikrofotografien von Krebszcllengcwebe einer krebsigen Maus, der GRA-M-l-K-T verabreicht wurde,

Fig. 14 ist eine Fotografie und zeigt einen Krebszustand bei einer krebsigen Mäusegruppc, der GRA-M-1 verabreicht wurde,

Fig. 15 ist eine Fotografie und zeigt den Krebszustand bei einer krebsigen Mäusegruppe, der kein GRA-M-1 verabreicht wurde.

Fig. 16 ist eine Mikrofotografie und zeigt Krebszcllengcwebe einer krebsigen Mäusegruppc, der kein GRA-M-1 verabreicht wurde,

Fig. 17 ist eine Mikrofotografie von Krcbszcllengewcbe einer Gruppe, die mit g RA-M-1 behandelt wurde.

Fig. 18 zeigt ein SDS-Gcl-EIektrophorcse-Diagramm von GRA unter Verwendung von Protein-Färbung nach der C.B.B.-Mcthode,

Fig. 19 bis 21 zeigt SDS-Gel.Elektrophorcsc-Diagramme unter Verwendung von Zuckerlärbung mittels der PAS-Methode.

Fig. 22 ist eine schematische Darstellung der Ergebnisse vom SDS-Gel-Elcktrophoreses-Diagramm von GRA unter Verwendung der Proteinfärbung mittels der C.B.B.-Mcthode. -8-

Claims

5 Nr. 390002 Fig. 23 ist eine grafische Darstellung, welche die Tumorwachstunisrate bei C3H/HE/6 Mäusen, denen X3S63 Immunmäuse-Milzzellen und Y5563-Zellen transplantiert worden waren. PATENTANSPRÜCHE 10 1. Verfahren zur Herstellung von Lymphocyten, die Krcbszellcn-cytotoxisch sind, dadurch gekennzeichnet, daß Lymphocyten mit einem vom Krebszellen abgeleiteten, glykoverwandten Antigen sensibilisiert werden, wobei das Antigen eine Krebszcllenmembrankomponente ist, die reaktionsfähig ist, um sich mit einem Lektin zu 15 kombinieren, welches sich spezifisch mit endständiger Galaktose oder N-Acetylgalaktosamin kompinien.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das glykoverwandte Antigen dadurch erhalten wird, daß Zellmembrankomponenten von Krebszellen homogenisiert oder solubilisiert, mit einem Lektin, das spezifisch mit einer endständigen Galaktose oder einem N-Acetylgalaktosamin kombiniert sein kann, in 20 Verbindung bringt, wobei ein Lektinzellmembrankomplex gebildet wird, dieser Komplex gewonnen wird, worauf das Lektin von dem Komplex abgespalten und die lektinfrcie Zellmembrankomponenten gewonnen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin, das spezifisch mit endständiger Galaktose kombiniert sein kann, ausgewählt wird aus Lektin von Erdnüssen, Ricinus communis, Sojabohnen, 25 oder, das spezifisch mit endständigem N-Acetylgalaktosamin kombiniert sein kann, ausgewählt wird aus Dolichosbohnen-Agglulinin, Lektin von "braid-orangc", Helix-pomatia, Limabohnen, Sojabohnen oder Bauhinia.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin Lektin von Sojabohnen oder Dolichosbohnen-Agglutinin ist. 30
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das glykoverwandte Antigen dadurch aus den Krebszellenmembrankomponenten zunächst mit einem Lektin, das spezifisch mit endständiger Galaktose kombiniert ist, und dann mit einem zweiten Lektin, das spezifisch mit einem endständigen N-Acetylgalaktosamin kombiniert ist, isoliert wird. 35
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Lektin Lektin von Erdnüssen und das zweite Dolichosbohnen-Agglutinin ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensibilisierung eine 40 Kultivierung der Lymphocyten in einem Nährmedium, das von Krebszellen abgeleitetes glykoverwandtes Antigen enthält, über eine Zeitdauer von 1 bis 10 Tagen ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des glykoverwandten Antigens in der Nährlösung zwischen 1 bis 1000 ng/ml beträgt. 45
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem pH von etwa 7,2 und bei etwa 37 °C erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch Verwendung eines Nährmcdiums enthaltend Human-50 Serum, Kalbsfötus-Scrum, Kalbs-Serum oder Pfcrdc-Serum. 55 Hiezu 14 Blatt Zeichnungen -9-