KR100209180B1 - 아세만난을 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

아세만난은, 해소 또는 치료의 주요 기작이 환자의 면역계에 의한 개입을 필요로 하는 다수의 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다. 아세만난은 면역계에 직접적인 자극효과를 지닌다. 알로에로부터 유도된 아세만난과 같은 아세틸화 만난 유도체를 투여함으로써, 암, 바이러스질환, 호흡기 및 면역 조절 질환, 염증, 감염 및 침습을 치료하는 방법이 기술되어 있다. 본 방법은 조직배양물, 동물 및 식물에서 사용할 수 있음이 밝혀졌다.

Description

[발명의 명칭]

아세만난을 포함하는 약제학적 조성물

[발명의 배경]

A. 발명의 분야

본 발명은 생물학적 반응 조절체의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은, 주로 아세틸화 만난 또는 이의 유도체인 다당류 물질의 치료학적 용도에 관한 것으로서, 이들은

1) 사람, 기타 포유동물 및 새를 포함한 동물 및 식물의 바이러스 질환 증상을 경감시키고/시키거나 치료한다. 이들 다당류 물질은 단독으로 또는 기타 약물과 배합된 상태로, 직접적인 항바이러스 작용 또는 그들의 면역 자극 활성을 통해 바이러스 복제를 억제하게 된다;

2) 사람, 기타 포유동물, 동물, 새 및 식물에서 암종에 대한 면역계 반응을 향상시킨다. 이들 다당류 물질은 신체의 면역 세포를 자극하여 종양 세포 표면을 직접 변화시킴으로써 자극된 면역 세포가 종양 세포를 비-자기(not self)세포인 것으로서 인지하게 된다;

3) 항원, 독소, 알레르기 항원 및 자가면역 질환에서 나타나는 자가 항원에 대한 신체 반응을 변화시킨다. 이들 다당류 물질은 면역 조절 세포가 보다 적절히 작용하도록 함으로써 항상성을 이루게 한다;

4) 질환의 제거 또는 치료에 있어서의 최종 단계가 면역 반응을 필요로 하는 광범위한 질환 상태에서 기타 약물과의 보조적 요법으로서 작용한다. 이들 다당류 물질은 이들로 인한 독성이 없는 항감염성, 항종양성, 소염성 및 항우울증(antidepressant) 약물과 함께 사용할 수 있다. 배합물의 효능은 단일 약물 단독에서보다 우수하다.

B. 일반적인 배경 정보의 기술

알로에는 백합과의 일원이다. 알로에 베라는 2가지 주요 액체 공급원인 황색 라텍스(삼출물) 및 투명한 겔(점질물)을 함유한다. 알로에 바르바덴시스(Aloe barbadensis) 밀러(Miller) 잎의 무수 삼출물을 알로에로서 언급한다. 시판명은 쿠라카오(Curacao) 알로에이다. 이는 주로 알로인, 알로에-에모딘 및 페놀로 이루어진다[참조: Bruce, South African Medical Journal, 41:984 (1967); Morrow et al., Archives of Dermatology, 116:1064-1065(1980); Mapp et al., Planta Medica. 18:361-365 (1970); Rauwald, Archives Pharmazie, 315:477-478 (1982)]. 안트라퀴논 및 이의 글리코사이드를 포함하는 다수의 페놀계 화합물은 약제학적으로 활성인 것으로 공지되어 있다[참조: Bruce, Execlsa, 5:57-68 (1975); Suga et al., Comestics and Toiletries. 98:105-108 (1983)].

식물의 유조직 세포로부터의 점질성 젤리를 알로에 베라 겔로 언급한다. 일반적으로 겔이 부적절한 가공 기술에 의해 오염되지 않는 한 분해되어 겔의 탈색을 야기하는 안트라퀴논은 존재하지 않는다. 알로에 베라 겔은 약 98.5중량% 물로 이루어진다. 전체 고체 성분의 60% 이상이 탄수화물 공급원의 다당류로 구성된다. 유기산 및 무기 화합물, 특히 칼슘 옥살레이트가 고체 성분의 나머지를 차지한다.

알로에 베라는 다양한 문화권에서 구충제, 하제 및 건위제로서의 전통적 의약이었고 특히, 나(leprosy), 화상 및 알레르기성 질환에 사용되었다[참조: Cole et. al., Archives of Dermatology and Syphilology, 47:250(1943); Chopra et al., Glossary of Indian Medicinal Plants. Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi (1956); Ship, Journal of the American Mdical Association. 238(16): 1770-1772 (1977); Morton, Atlas of Medicinal Plants of Middle American Bahamas to Yucatan. Charles C. Thomas Publisher, 78-80(1981); Diez-Martinez. La Zabila, Communicado NO. 46 Sobre Recursos Bioticos Potenciales del Pais, INIREB, Mexico (1981); Dastur, Medicial Plants of India and Pakistan: D.B. Taraporevala Sons Co., Private Ltd., Bombay 16-17(1962)].

알로에 베라는 피부학 분야, 특히 방사선으로 유발된 피부 질환 치료시 광범위하게 특성화되어 왔다[참조: Mackee, X-rays and Radium in the Treatment of Diseases of the Skin, 3rd Ed., Lea dn Febiger, Philadelphia, 319-320 (1938); Rovatti et al., Industrial Medicine and Surgery, 28:364-368 (1959); Zawahry et al., Quotations From Medical Journals on Aloe Research, Ed. Max B. Skuosen, Aloe Vera Research Institute, Cypress, California, 18-23 (1977); Cera et al., Journal of the American Animal Hospital Association. 18:633-638 (1982)]. 바이러스박멸제, 살균제 및 살진균제로서의 분해 문제 및 부인과 질환에 있어서의 의학상 적용을 교시한 과학 문헌의 실체가 광범위하게 문헌[참조: Grindley et al., Journal of Ethnopharmacology, 16:117-151 (1986)]에 적절히 고찰되어 있다.

잎이 가공처리되는 방식에 따라, 점질물 및 당(sugar)은 탈수화된 겔의 주요 성분이 된다. 밝혀진 당은 갈락톨스, 글류코스, 만노서, 람노스, 크실로스 및 우론산이다. 의견이 상충되는 면도 있으나, 점질물은 주로 만난 또는 글루코만난으로 이루어진다[참조: Eberebu et al., The Chemical Charaterization of Carrisynin Preparation); Mandal et al., Carbohydrate Research. 86:247-257 (1980b); Roboz et al., Journal of the American Chemical Society, 70:3248-3249(1948); Gowda et al., Carbohydrate Research. 72:201-205 (1979); Segal et al., Lipydia, 31:423 (1968)].

이와 같은 연구 이전에, 알로에 베라내 활성 물질(들)의 실체에 대한 논쟁이 지속되었다. 따라서 겔내에 존재하는 성분과 삼출물내에서 발견되는 성분을 명백히 구분하는 것이 중요하다. 대부분의 겔은 다양한 기타 성분을 소량 함유하는 주로 다당류 특성의 점질물이다. 일부 활성에 있어서는 다당류 기재와 기타 성분간의 상승 작용이 존재할 수 있음이 관찰되었다[참조: Leung, Excelsa 8:65-68 (1978); Henry, Cosmetics and Toiletries, 94:42-43, 46, 48, 50 (1979)]. 예를 들면, 일부 연구자들은 상처 치유에 있어 효과적인 성분이 탄닌산[참조: Fretag, Pharmazie, 9:705 (1954)] 및 일종의 다당류일 것이라고 보고하고 있다[참조: Kameyama, Wound-healing compositions from Aloe arborescens extracts. Japanese Patent#7856995, (1979)].

하지만, 다당류가 기타 성분의 도움 없이도 약리학적 및 생리학적 활성을 나타낼 수 있음을 지적하는 문헌의 많은 예가 존재한다[참조: Gialdroni-Grassi, International Archieves of Allergy and Applied Immunology, 76(Supple. 1): 119-127 (1985); Ohno et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33(6):2564-2568 (1985); Leibovici et al., Chemico-Biological Interactions, 60:191-200 (1986); Ukai et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 31:741-744 (1983); Leibovici et al., Anticancer Research, 5:553-558 (1985)]. 이러한 예들중 하나는 아테롬성 동맥경화증의 진행에 관한 것이다. 일반 집단내, 특히 과콜레스테린혈증 가계내에셔의 과지혈증은 관상 동맥성 심장병 및 사망과 관련된다. 식이섬유 섭취가 높은 국가에서는, 아테롬성 동맥 경화증이 드물게 발생한다[참조: Trowell et al., Editors, Refined Carbohydrate Foods and Disease, London, Academic Press, 207 (1975)]. 펙틴과 구아는 정상인 및 과지혈증 환자에 있어서 콜레스테롤을 저하시키는 것으로 보고되었다[참조: Kay et al., American Journal of Clinical Nutrition, 30:171-175 (1977)]. 만노오스 및 갈락토오스로 이루어진 다당류인 로커스트 빈 검은 정상 및 가계 콜레스테린혈증 환자 모두에서 혈장 지단백질 콜레스테롤 농도를 저하시킨다[참조: Zavoral et al., American Journal of Clinical Nutrition, 38:285-294 (1983)]. 탄수화물 식사에 구아검을 첨가하면 정상 및 당뇨병 환자 모두에서 글루코스의 식후 증가를 감소시킨다[참조: JJenkins et al., Lencet. 2:779-780 (1977)]. 문헌[참조: Kuhl et al., in Dianetes Care. 6(2):152-154 (1983)]은, 구아검이 임신한 인슐린-의존성 당뇨병 환자의 혈당을 조절할 수 있음을 입증하고 있다.

다당류의 항종양 활성은 널리 보고되어 왔다. 렌티누스 시아티포르미스(Lentinus cyanthiformis)로부터 제조된 다당류는 종양에 대한 숙주 방어를 상승시키는 것으로 공지되어 있다[참조: Rethy et al., Annales Immunologiae Hungaricae, 21:285-290 (1981)]. 버섯, 효모 또는 세균 추출물로부터의 다당류가 바이러스 감염 및 종양 발생에 대한 고도의 숙주 방어 활성을 유도할 수 있다는 보고가 있어 왔다[참조: Chihara, Nature, 222:687 (1969); Shwartzman et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 29:737-741 (1932); 문헌[참조: Suzuki et al., Journal of Pharmacobio-Dynamics, 7(7): 492-500 (1984)]은 또한 진균 그리폴라 프론도사(Grifola frondosa)의 배양된 자실체로부터 추출한 다당류 뷴획(GF-1)의 항종양 활성을 보고하고 있다. 이 분획은 복강내(IP), 정맥내(IV) 및 종양내(IT) 투여하는 경우 동등한 고도의 수준으로 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 하지만, 경구 투여(PO)는 효과적이지 않다. GF-1 분획은 또한 마우스에서 고형암 형태의 메쓰(Meth) A 섬유육종 및 MM 46 암종에 대해 항종양 작용을 나타낸다. 렌티난은 GF-1과 유사한 6-측쇄된-1-3-결합된 글루칸으로서 메쓰 A 섬유육종에 대해 효과적이지 않다[참조: Chihara, The antitumor polysaccharide Lentinan: an overview; Manipulation of Host Defense Mechanisms; Ed. by Aoki et al., Excerpta Medica, North Holland, 1-16 (1981); Sasaki et al., Carbohydrate Research, 47(1):99-104 (1976)]. 합성된 측쇄 다당류는 종양에 대한 활성을 갖는 것으로 보고되었다[참조: Matsuzaki et al., Makromol. Chem., 186(3):449-456 (1985)]. 문헌[참조: Matsuzaki et al., Makromol. Chem., 187(2):325-331 (1986)]에서는 상당한 활성을 나타내는 측쇄된 다당류를 아이보리 넛트 만난(-(1-4)-D-만노피라노스) 및-(1-4)-결합된 글루코만난으로부터 합성하였다. 딕티오포리아 인더시아타(Dictyophoria indusiata) 피쉬(Fisch)의 자실체로부터 추출한 부분 아세틸화 선형-(1-3)-D-만난 또한 항종양 활성을 나타낸다[참조: Hara. Carbohydrate Research, 143:111 (1982)].-(1-3)-글루칸 타입 중합체가-(1-4)-글루칸 및 헤미셀루로스 중합체보다 고도의 항종양 활성을 나타내기 때문에, 항종양 작용은 중합체 주쇄의 타입 및 이의 중합화도에 좌우되는 것으로 보인다[참조: Matsuzaki et al., Makromol. Chem., 187:325-331(1986)]. 세균 배양 여액으로부터 수득한-(1-3)-글루칸의 카복시메틸화 유도체는 주사후 2시간 이내에 확립된 육종 180 종양으로부터 상당한 세포손실을 유발하였다[참조: Baba, Journal of Immunopharmacology, 8(6):569-572 (1986)]. 동 저자는 상기 물질의 주사로 인해 다형핵 백혈구의 보상적 증가를 관찰하였다. 동시에, 면역 조절 및 항종양 활성을 갖는 것으로 공지된 디펩타이드인 베스타틴[참조: Ishizuka, Journal of Antibiotics, 32:642-652 (1980)]은 종양 산출성(yield) 및 다형핵 백혈구 수에 영향을 미치지 않는다[참조: Baba et al., 상기 참조].

헤파린[참조: Jolles et al., Acta Univ. Int. Cancer, 16:682-685(1960); Suemasu et al., Gann. 61(2):125-130(1970)], 황산화 라미나란 및 덱스트란[참조: Jolles et al., British Journal of Cancer. 17:109-115 (1963)]을 포함한 황산화 다당류의 항종양 효과에 대한 다수의 보고가 있어 왔다. 문헌[참조: Yamamoto et al., in Japanese Journal of Experimental Medicine, 54:143-151 (1984)]에는 추가 황산화에 의한 푸코이단 분획의 항종양 활성의 향상이 기록되어 있다. 황산화 생성물은 L-1210 백혈병에 대해 활성이 있는 것으로 입증되었다. 황산염 그룹을 갖는 다당류는 또한 사람 T 세포 유사분열물질 및 쥐 폴리클로날 B 세포 활성화제인 것으로 보고되고 있다[참조: Sugawara et al., Microbiological Immunology, 28(7):831-839 (1984)]. 일반적으로, 황산염 그룹이 있는 고분자량의 동종-다당류가 이러한 특성들을 갖는다[참조: Dorries, European Journal of Immunology, 4:230-233 (1974); Sugawara et al., Cell Immunology, 74:162-171 (1982)].

효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 추출한 글루칸이 세포 및 액소성 면역의 조절제임이 보고되었다[참조: Wooles et al., Science, 142:1078-1080 (1963)]. 다당류는 또한 쥐의 다능성 조혈 간세포, 과립구 대식세포 콜로니-형성 세포 및 골수구 및 적혈구 콜로니 형성 세포의 증식을 자극한다[참조: Pospisil et al., Experientia, 38:1232-1234 (1982); Burgaleta, Cancer Research, 37:1739-1742 (1977)]. 문헌[참조: Maisin et al., Radiation Research, 105:276-281 (1986)]은 또한 다당류의 정맥내 투여로 X-선 노출에 대한 쥐 조혈 간세포가 보호됨으로써, 이와 같이 노출된 마우스의 치사률이 감소됨을 보고하고 있다.

문헌[참조: Lackovic et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 134:8740879(1970)]은 효모 세포벽을 취해 만난만 남기고 모든 구성 물질을 추출하여 이것이 단핵세포에 의한 α-인터페론 생산의 유도에 관여함을 발견하였다. 생리학적 반응에 관여하는 것으로 확인된 정제된 만난은 5,500 내지 20,000달톤의 분자량을 갖는다.

문헌[참조: Seljelid et al., Experimental Cell Research, 131(1):121-129 (1981)]은 시험관내에서 불용성 또는 겔-형성 다당류가 대식세포를 활성화시키나, 상응하는 가용성 글리칸은 그렇지 못함을 관찰하였다. 보그왈드[참조: Bogwald, Scandinavian Journal of Immunology, 20:355-360 (1984)]는 시험관내에서 대식세포에 대해 자극효과를 나타내는 다당류를 고정시켰다. 이로써 저자는 다당류의 공간적 배열이 시험관내 대식세포에 대한 효과에 있어 결정적인 것으로 간주하게 되었다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로부터 분리된 정제된 다당류는 시험관내에서 사람 말초 혈액 임파구에 의한 항체 반응을 유도한다[참조: Wirz et al., Clinical Immnology and Immunopathology, 33:199-209 (1984)]. 정상인과 칸디다 감염된 개체의 혈청중 항-칸디다 항체간에는 현저한 차이가 있다[참조: Wirz et al., 상기 참조].

다당류 및 펩타이드에 결합된 다당류의 항바이러스 활성이 관찰되었다. 스즈키[참조: Suzuki et al., Journal of Antibiotics, 32:1336-1345 (1979), Suzuki et al., 상기 참조]는 렌티누스 에도데스(Lentinus edodes)의 균사 배양물로부터 추출된 펨티도만난(KS-2)의 항바이러스 작용을 보고하였다. 경구 및 복강내 투여 모두 피크 혈청 인터페론 역가를 증가시키고, 이로써 바이러스 감염에 대해 마우스를 보호한다. 이것은 덱스트란 포스페이트(DP-40)[참조: Suzuki et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 149(4)1069-1075 (1975)] 및 9-메틸스트렘트이미돈(9-MS)[참조: Saito et al., Antimier, Agent Chemotherapy, 10(1):14-19 (1976)](이들은 정맥내 또는 복강내 투여되는 경우에만 마우스에서 고도의 인터페론 역가를 유도한다)와는 상반된다.

알로에 베라 겔의 소염 활성은 경구적 입증을 통해서 및 권위있는 과학지 모두에서 널리 보고된 바 있다. 루벨[참조: Rubel, Cosmetics and Toiletries, 98:109-114 (1983)]은 알로에 겔의 소염 작용의 가능한 기작을 완전히 논의하고 있다. 문헌[참조: Ukai et al., Journal of Pharmacobio-Dynamics. 6(12):983-990 (1983)]은 몇몇 진균의 자실체로부터 추출한 다당류의 소염 활성을 주목하고 있다. 다당류는 카라기난-유도된 부종에 있어 현저한 억제 작용을 나타낸다. 중합체중 하나인 O-아세틸화-D-만난 (T-2-HN)은 추가로 화상 통각과민에 있어 페닐부타존 보다 훨씬 탁월한 억제 작용을 나타내었다[참조: Ukai et al., 상기 참조].

또 다른 연구자들은 또한 복합 다당류[참조: Saeki et al., Japanese Journal of Pharmacology, 24(1):109-118(1974)], 당단백질[참조:Arita et al., Journal of Biochemistry, 76(4):861-869 (1974)] 및 황산화 다당류[참조: Rocha et al., Biochemical Pharmacology, 18:1285-1295(1969)]의 소염 작용을 보고하였다.

다당류가 글로코만난, 만난, 펙틴 또는 몇 개의 기타 조성물인지의 여부에 관한 논쟁은 일련의 화학적 정제 단계에 의해, 약간 변형된 추출방법에 의해 해결되어[참조: Yagi et al., Planta Medica, 31(1):17-20 (1977)], 알로에 아르보레센스(Aloe arborescens) 밀러 바르 나탈렌시스로부터 아세틸화 만난(알로에 만난)을 분리하였다. 하지만, 오보도바[참조: [참조: Ovodova, Khim Prior, Soedin, 11(1):325-331 (1975)]는 동일 알로에 종의 주성분으로서 보다 먼저 펙틴을 분리해냈다.

이들 면역학적 활성 다당류의 구조 및 구조적 변이체 타입은 이의 효능 및 독성을 조절하는 인자인 것으로 보인다. 이들의 작용 양식(들)은 거의 인식된 바 없다; 하지만, 최근, 일부 다당류가 임파구 및 대식세포가 광범위한 면역학적 활성 물질을 생산하도록 유도한다는 증거가 있다. 예를 들면, 2-케토-3-데옥시-D-만노-옥툴로손산(KDO)은 지다당류(LPS)의 화학적 일부로서, 대식세포 숙주 방어 활성화를 위한 최소의 시그날을 제공하는 것으로 보인다[참조: Lebbar et al., Eur. J. Immunol 16(1):87-91 (1986)]. 본 발명의 조성물은 이들 면역학적 활성 물질의 모든 특성을 갖는다; 이는 모든 공지된 생물학적 활성 다당류중 가장 강력한 것이지만 독성이 관찰되지 않는 점이 상이하다. 또한 바이러스 당단백질 합성의 변형을 통해 특정 항바이러스 활성을 증명한다.

다수의 약리학 연구가 최근 알로에 베라 겔에 대해 수행되었다. 그 결과는 방사 화상의 신속한 치유[참조: Rowe. J. Am. Pharm. Assoc., 29:348-350 (1940)] 및 환부의 가속화된 치유[참조: Lushbaugh et al., Cancer, 6:690-698 (1953)]를 포함한다. 알로에 베라 겔로 치료한 열 화상은 비치료된 화상보다 훨씬 신속하게 치유된다[참조: Ashley et al., Plast. Reconstr. Surg., 20:383-396 (1957), Rovatto, supra, Rodriguez-Bigas et al., J. Plast. Reconstr. Surg., 81:386-389 (1988)]. 겔은 다리 궤양의 치료[참조: El Zawahry et al., Int. J. Dermatol., 12:68-73 (1973)] 및 수술후 치유의 촉진[참조: Payne, Thesis submitted to Faculty of Baylor University, Waco. TX, MS Degree]에 있어 유용하다. 실험상 증거는 알로에 베라의 추출물이 항-감염 특성[참조: Solar, Arch. Inst. Pasteur Madagascar, 47:9-39 (1979)]을 지녀 식작용을 향상시킴을 제시한다[참조: Stepanova, Fiziol. Akt. Veshchestva, 9:94-97 (1977)].

알로에 베라 겔의 활성 분획은 만노스 단량체 대 아세틸 그룹의 비가 약 1:0.91인 O-아세틸 그룹이 산재된 장쇄 다분산된-(1,4)-결합된 아세틸화 만난으로서 캐링톤 래보러토리즈, 인코포레이티드(Carrington Laboratories, Inc, Irving, Texas 소재)에 의해 확인되었다. 아세만난은 캐링톤 래보러토리즈, 인코포레이티드에 의해 분 리되고 개발된화합물인카리신(Carrisyn)의 생물학적 활성성분의 비특허명이다[참조: 본원에 참조로서 인용된 미합중국 특허 제4,735,935호 및 제4,851,224호 및 미합중국 특허원 제07/229,164호].

글루코만난 및 갈락토만난을 포함하는 만난은 인류에 의해 오래전부터 사용되었다. 예를 들면, 식물 검 형태의 갈락토만난은 식품 조직의 조절을 위한 결합제로서 광범위하게 사용된다. 추가로, 일부 만난은 상당한 치료학적 특성[참조: Davis and Lewis, eds. Jeanes A., Hodge J., In: American Chemical Society Symposium, Series 15. Washington, DC, American Chemical Society, 1975]을 나타낸다.

순수한 만난은 이들이 일부 효모의 주요 구조 성분일지라도 고등 식물에 있어서는 비교적 흔하지 않다. 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 세포벽의 약45%가 만난으로 이루어진다. 이 만난은 β-(1,6)-, β-(1,3)- 및 β-(1,2)-결합된, 부분적으로 인산화된 D-만노스 잔기로 이루어진 수용성 분자이다[참조: McMurrough et al., Biochem. J., 105:189-203(1967)]. 기타 생물학적 활성 만난은 칸디다 유틸리스(Candida utilis)[참조: Oka et al., Gann, 60:287-293 (1969), Oka et al., Gann, 58:35-42(1968)]. 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 로도토룰럼 루브럼(Rhodotorulum rubrum)[참조: Wheat et al., Infect. Immun., 41:728-734, (1983)]로부터 수득된다. 만난(갈락토만난 및 글루코만난을 포함)은 만노시다제에 의한 공격에 대해 비교적 내성이 있으나 엑소- 및 엔도-만나제에 의해 분해될 수 있다[참조: Emi, et. al., Agr, Biol. Chem., 36:991-1001 (1972). Snaith, et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 28:401-445, (1973) Herman, Am. J. Clin. Nutr., 24:488-498 (1971), McMaster, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 135:87-90(1970), Jones et al., J. Biol. Chem., 243:2442-2446 (1968), Eriksson et al., Acta. Chem. Scand., 22:1924-1934 (1968)]. 포유동물에서 만난의 가장 현저한 생물할적 활성은 대식세포의 활성화 및 T 세포의 자극이다. 그 결과, 이들은 감염성 질환 및 종양에 대한 현저한 활성을 지닌 강력한 면역자극제임이 밝혀졌다[참조: Hasenclever et al., J. Immun., 93:763-771 (1964)].

사카로마이세스 만난(15mg/kg/일)은, 아마도 세망내피계 자극제로서 작용하는 방식으로 정상적인 숫컷 ddI 마우스에서 탄소 정화를 향상시킨다[참조: Suzuki et al., Gann, 62:553-556(1971)]. 이 동일한 만난은 또한 비장에서 항체-형성 세포의 수를 증가시킨다[참조: Suzuki et al., Gann, 62:343-352(1971)]. 마우스 복강 세포(대식세포와 임파구 혼합물)를 사용한 시험관내 연구는 일부 만난 및 만난-단백질 복합체가 생체내 및 시험관내 모두에서 인터페론 방출을 자극할 수 있음을 지적하고 있다[참조: Lackovic et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 134:874-879 (1970)]. 만난은 내독소와 유사한 방식으로 인터페론 방출을 자극하지만, 내독소와는 달리 최소의 독성을 야기한다[참조: Borecky et al., Acta Virol., 11:264-266 (1967). Hasenclever, 상기 참조]. 칸디다 알비칸스로부터의 만난은 이러한 방식으로 활성이나, 사카로마이세스 세레비지애로부터의 만난은 비활성이다[참조: DeDlercq et al., Ann. NY Acad. Sci., 173:444-461 (1970)]. 다른 연구소에서는 불일치되거나 열악한 결과가 수득되었다[참조: DeDlercq, 상기 참조]. 이들 상이점은 중합체에서의 경미한 구조 또는 크기 차이로부터 기인할 수 있다[참조: Suzuki et al., Jpn. J. Microbiol., 12:19-24(1968)]. 저 분자량 만난(5.5-20kDa)이 인터페론 유도 검정에 있어 가장 강력한 경향이 있고, 또한 사카로마이세스 만난은 칸디다 만난보다 훨씬 큰 경향이 있기 때문에 후자가 보다 관련된 것 같다.

리포마이세스 스타케이(Lipomyces starkeyi)로부터의 20kDa 갈락토만난은 약한 인터페론-유도 특성을 갖는다. 반대로, 칸디다 알비칸스 만난은 정맥내 투여 2 내지 24시간 후 인터페론 활성을 나타내보였다[참조: Borecky, 상기 참조].

마이크로엘로보스포리아 그리세아(Microellobosporia grisea) 배양액으로부터의 분해된 만노글루칸인 DMG는 대식세포, 천연 킬러(NK) 세포 및 킬러 T 세포의 세포독성 활성을 자극하여, 인터루킨-1(IL-1) 및 콜로니 자극 인자(CSF)의 분비를 향상시킨다. 이것은 렌티난[레티누스 에도데스(Lentinus edodes)로부터의 글루칸]보다 강력한 항종양 활성을 나타낸다[참조: Nakajima et al., Gann, 75:260-268(1984). Inoue et al., Carbohyd. Res., 114:164-168 (1983)]. DMG는 대식세포가 IL-1을 증가된 양으로 생산하도록 자극한다. 또한, DMG는 1) 양 적혈구에 대한 항체 생산, 2) 복강 세포뿐 아니라 비장의 천연 킬러 활성 및 3) 복강 대식세포의 세포정지(cytostatic) 활성을 증가시킨다[참조: Nakajima et al., Gann, 75:253-259(1984)].

사람에 있어, 주요 만노스-결합 단백질은 급성-상 단백질이다; 이들 농도는 스트레스를 받은 개체에서 상승한다[참조: Ezekowitz et al., J. Exp. Med., 169:185-196 (1989)]. 사람 면역결핍성 바이러스의 엔벨로프 당단백질(HIV gp 120 및 gp 41)은 만노스-결합 단백질에 대한 강력한 리간드인 것으로 여겨지는 만노스가 풍부한 올리고사카라이드를 함유한다. 그 결과, 만노스-결합 단백질은 임파아구의 HIV 감염을 억제하여 HIV에 감염된 세포에 선택적으로 결합할 수 있다. 유리된 효모 만난은 이 단백질이 감염된 세포에 결합하는 것을 경쟁적으로 방해할 수 있다. 따라서, 만노스-결합 단백질 농도의 증가를 유도하는 인자는 HIV에 대한 보호를 부여할 수 있다.

[본 발명이 해결하고자 하는 문제점]

면역 조절질환, 바이러스 및 암은 지속적으로 사람, 기타 포유동물, 기타 동물, 새 및 식물에 있어 질병률 및 치사율 모두에 있어 주요 원인이 되어 왔다. 현재 사용중인 약물과 연루된 문제는 소위 일반적인 도성, 효능 부족(또는 둘 다), 특이성의 결핍 및 원인성 유기체 또는 제제에 의한 내성의 발달이다. 따라서, 아직 치료학적으로 효과적이지 않은 우수한 무독성 제제가 질환 치료에 요구된다. 아세만난은 면역 조절 및 항바이러스 특성의 독특한 조합 작용을 갖는 것으로 밝혀졌다.

[발명의 요약]

따라서 본 발명의 목적은, 동물에 있어 면역계를 강화시키거나 자극하는데 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 투여함을 포함하여, 동물의 면역계를 강화하거나 자극하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은, 단핵세포 및 대식세포를 활성화시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 단핵세포 및 대식세포, 말초성 혈액 인접 세포에 의한 사이토킨(예: 인터루킨, 인터페론 및 프로스타글란딘)의 합성 및 생산을 활성화시키고, 유도하며/하거나 강화시키는 방법을 제공하는 것이다.

추가의 목적은, 단핵세포 및 대식세포를 활성화시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 투여함을 포함하여, 동물에서 대식세포 식작용을 자극하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 추가의 목적은, 항바이러스 작용을 나타내기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 조직 배양물, 동물 또는 식물에 투여함을 포함하여, 조직 배양물, 동물 또는 식물에서 항바이러스 작용을 일으키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 단핵세포 및 대식세포를 활성화시키고 바이러스에 감염된 세포에서 바이러스 복제를 변경시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 바이러스에 감염된 사람에게 투여함을 포함하여, 바이러스에 감염된 사람에게서 결핍성 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은, 인터페론 합성을 유도하고, 항체 형성을 향상시키며, T-세포 활성을 향상시키고, 킬러 세포 활성을 향상시키며, 흉성 활성을 자극하고, 당단백질의 글리코실화를 변경시키며, 제2메신저(messenger) 합성 및 활성을 변경시키고, 바이러스 복제를 억제시키거나 이들의 조합 작용을 유도시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에게서 항바이러스 작용을 일으키는 방법을 제공하는 것이다.

추가의 목적은, 바이러스 복제를 변경시키기에 충분한 예정된 양의 아세틸화 만난 유도체를 주 종균 배양액에 가함을 포함하여, 백신 생산용 주 종균 배지내에서 결핍성 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

추가의 목적은, 사이토킨 합성을 자극하는데 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 면역계 세포에 의한 사이토킨 합성을 자극하고 강화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물 또는 동물의 면역계가 종양 또는 암의 성장을 억제하는데 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 식물 또는 동물에게 투여함을 포함하여, 식물 또는 동물의 면역계가 종양 또는 암의 성장을 억제하도록 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은, 식물 또는 동물의 면역계가 종양 또는 암을 비-자기(not self)로서 인지하도록 하기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 식물 또는 동물에게 투여함을 포함하여, 식물 또는 동물의 면역계가 종양 또는 암의 성장을 파괴하거나 억제하도록 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 바이러스, 화학물질, 방사선, 유전적 또는 기타 기원의 암에 걸린 동물에서 항암 효과를 일으키는 방법을 제공하는 것이다.

추가의 목적은, 온코진(oncogene)의 제1 및 제2메신저 발현을 억제하기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 유전성 기원의 종양에 걸린 동물에게 투여함을 포함하여, 상기 동물에서의 항 종양 효과를 나타내는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은, 조직 생육성을 회복하기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 궤양화 및/또는 괴사와 같은 조직 손상을 감소시키고 연조직 모세관 베드 혈관 관류를 회복하는 방법을 제공하는 것이다.

또 하나의 목적은 염증성 장 질환과 관련된 증상을 감소시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 염증성 장 질환과 관련된 증상을 완화시키는 방법을 제공하는 것이다.

추가의 목적은 다발성 경화증과 관련된 증상을 완화시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 사람에게 투여함을 포함하여, 사람에서 다발성 경화증과 관련된 증상을 완화시키는 방법을 제공하는 것이다.

또 하나의 목적은 신경화학 질환 및 우울증과 관련된 증상을 완화시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 신경화학 질환 및 우울증과 관련된 증상을 완화시키는 방법을 제공하는 것이다.

추가의 목적은, 자가면역 질환에 관여하는 세포 및 조직의 면역억제 및/또는 면역 조절을 유발시키기에 충분한 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서의 급성 및 만성 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 추가의 목적은 동물 체조직 회복 기작 및 면역계가 외상에 대해 보다 신속하고 적절하게 반응하기에 충분하도록 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서의 외상성 상해를 보다 신속하게 치유하도록 하는 방법을 제공하는 것이다.

추가의 목적은, 천식, 결막염, 비염 및 기관지염과 관련된 증상에 관여하는 세포 및 조직의 면역을 조절하기에 충분한 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물의 호흡계에 작용함으로써 천식, 결막염, 비염 및 기관지염과 관련된 증상을 경감시키는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 추가의 목적은, 동물체 면역계가 감염성 유기체에 의한 감염을 방지하기에 충분한 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 감염성 유기체에 의한 감염을 예방하도록 하는 동물내에서의 예방 효과를 나타내는 방법을 제공하는 것이다.

또한 추가의 목적은, 동물체 및 그의 조직이 세포 생성물을 생산시키고, 조직이 유아 세포 기능 및 특성을 발현시키고 재기능하도록 하는 유전자를 상향 조절(up-regulate)시키기에 충분한 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 효소계 및 기관계가 노화된 조직을 재기능하도록 재활성화시키는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 추가의 목적은, 예정된 양의 아세틸화 만난 유도체를 백신 생성물에 가함을 포함하여, 보조 효과를 일으킴으로써 백신을 면역강화시키는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 추가 목적은, 단핵세포 및 대식세포를 활성화시키고, 세포독성 세포 및/또는 항체에 의한 특이 종양 세포 용해 및 천연 킬러 세포 활성을 강화시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 동물에게 투여함을 포함하여, 종양을 앓는 동물을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 추가 목적은, 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 세포내로 도입하여 세포내 또는 세포 표면에서 바이러스 당단백질을 변경시킴을 포함하여, 아세틸화 만난 유도체를 (i) 바이러스 감염으로부터 비감염 세포를 보호하도록 당단백질을 변경시키기 위해서 비감염세포 및/또는 (ii) 바이러스 감염된 세포에서 바이러스 발현을 파괴하거나 억제시키는 당단백질을 생산하기 위해서 바이러스-감염된 세포의 세포 기능질내로 도입시키는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 추가의 목적은, 아세틸화 만난 유도체를 바이러스에게 비감염성을 부여하기에 충분한 양으로 세포내에 도입하여, 바이러스에 감염된 세포내에서 바이러스 발현을 예방하거나 억제하는 당단백질을 생산하기 위해 바이러스-감염된 세포의 세포 기능질내로 아세틸화 만난 유도체를 도입하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 추가의 목적은, (i) 도입 이전의 세포에서 보다 광범위한 면역학적 반응을 제공하는 광범위한 스펙트럼의 특이 항체가 생산되도록 하고 (ii) 광범위한 스펙트럼의 항체 생산 속도를 향상시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 세포내로 투여함을 포함하여, 바이러스 감염된 세포에서 바이러스 발현을 예방하거나 억제하는 변경된 당단백질을 생산시키기 위해 바이러스-감염된 세포의 세포 기능질내로 아세틸화 만난 유도체를 도입시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은, 당단백질 합성을 위해 추가의 아세틸화 만난 유도체를 제공하기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도첼 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 동물에서 흡수불량 및 점막 세포 성숙 증후군을 정상화하는 세포내 및 세포외 대사 경로에 이르기까지 동물내에서의 아세틸화 만난 유도체의 양을 증가시킴으로써 만노실 트랜스퍼라제 활성에 대한 미카엘리스-멘텐(Km) 역학을 가속시키는 방법을 제공하는 것이다.

추가의 목적은, 변형된 바이러스 당단백질을 생산하고 변형된 바이러스 당단백질을 감염된 세포의 표면 상에서 발현시킴으로써 이들이 액모성 항체에 노출되도록 하기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 포유동물의 감염된 세포내로 투여함을 포함하여, 항원 표면상에서 변형된 바이러스 당단백질 항원을 발현시켜 세포 독성 임파구에 의한 항체-의존성 세포 붕해(ADCC)를 개시하도록 바이러스-감염된 포유동물 세포를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은, 중추신경계 세포내에서 반흔 형성을 감소시키고 반흔이 작용성 조직으로 치환되도록 하기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 사람에게 투여함을 포함하여, 다발성 경화증과 관련된 증상을 감소시키기 위해 사람에게 아세틸화 만난 유도체를 도입하는 방법을 제공하는 것이다.

또 하나의 목적은, 염증성 장 질환과 관련된 병변에서의 궤양의 조직 재생을 증가시키고 상기 병변의 국소 조직내 자가 면역성 면역글로불린을 감소시킴에 의해 염증성 장 질환과 관련된 병변을 소멸시키기에 충분한 양의 아세틸화 만난 유도체를 포유동물에게 투여함을 포함하여, 염증성 장 질환과 관련된 증상을 감소시키기 위해 포유동물에게 아세틸화 만난 유도체를 도입하는 방법을 제공하는 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 HIV-감염된 MT-2 세포의 생육성에 있어 아세만난 및 AZT의 상승적 항바이러스 효과를 나타낸다.

제2도는 HIV-감염된 MT-2 세포의 생육성 증가율(%)로 정량화시킨 아세만난 및 AZT의 상승적 항바이러스 효과를 나타낸다.

[바람직한 양태의 상세한 설명]

카리신(Carrisyn)은 본 발명의 양수인에 의해 알로에 바르바덴시스 밀러의 잎 내부 겔의 정제된 에틸 알콜 추출물에 대해 부여된 상품명이다. 카리신의 활성 성분은 협회[United States Adopted Name Council]에 의해 아세만난으로 지정되었다. 카리신 추출물의 73% 이상의 성분은 아세만난이다; 카리신 추출물은 통산 약 73 내지 90%의 아세만난을 포함한다. 카리신 추출물은 일반적으로, 잎의 외피를 제거한 후 하기와 같은 방법으로 내부 육편 또는 점질물을 제거하고 가공처리함으로써 제조한다: 즉, pH를 조절하고, 에탄올 추출하며, 동결건조시키고 분쇄한다[참조: 미합중국 특허원 제869,261호(현 미합중국 특허 제4,735,935호)의 부분 연속 출원인 미합중국 특허원 제144,872호(1988년 1월 출원). 본원에 참조로서 인용됨]. 이와 같은 방식의 가공처리는 필수적으로 어떠한 공유 결합도 변경시키지 않음으로써 어떠한 독성 화합물도 생성시키지 않는 것으로 예견된다. 이들 제조 단계는 전통적인 알로에 생성물 제조업자가 다당류를 표준화하고 안정화시킬 수 없었던 한계를 극복하고자 개발되었다.

카리신은 솜털 모양의 백색 무정형분말로서, 물 및 디메틸 설폭사이드에 난용성이고 대부분의 기타 유기 용매에 불용성이다. 이 분말은 필수적으로 선형 β(1-4)-D-만노실 단위로 이루어진 다당류를 73% 이상 함유한다. 다당류는 산소 원자를 통해 중합체에 결합된 아세틸 그룹이 무작위로 산재되어 있는 장쇄 중합체이다. 중합체의 속명은 아세만난이다. 아세틸화 또는 알칼린 하이드록사메이트 방법에 의한 측정시 단량체당 약 0.91개 아세틸 그룹의 비이다[참조: Hestrin, Journal of Biological Chemistry, 180:240-261 (1949)]. 중성 당 결합 분석으로,(1-6) 결합을 통해 쇄에 부착되는 D-갈락토피라노스는 매 70개 당에 대해 약 1개의 비로 존재하는 것으로 나타난다. 20:1의 만노스대 갈락토스의 비는 갈락토스 단위가 주로(1-4)글리코사이드 결합에 의해 함께 결합됨을 나타낸다. 아세만난의 화학 구조는 하기와 같다:

[용어 정의]

본원에 사용된 것으로서 용어 바이러스는 DNA 및 RNA 바이러스 모두를 포함한다. 이는 엔벨로프 바이러스이거나 또는 비-엔벨로프 바이러스일 수 있다. 한 경우를 제외하고 모든 경우에서 용어 엔벨로프 바이러스란 변형된 숙주 세포막내에 둘러싸인 바이러스를 의미하는 것으로 이해될 수 있다; 폭스바이러스(poxvirus)는 그들 자체의 엔벨로프를 생산한다. 일반적인 엔벨로프 바이러스가 표 1에 설명되어 있다.

본원에서 사용된 용어 종양은 바이러스, 화학, 방사선, 유전자 및 기타에서 기원하는 종양을 포함하여 악성과 비-악성 신생물 모두를 포함한다. 이는 배성(embryonic) 외배엽 기원, 배성 중배엽 기원, 또는 배성 내배염 기원의 것일 수 있다. 이는 배성 표면 외배엽, 배성 신경외배엽, 배성 머리 중배엽 배성 근축 중배엽, 배성 중간 중배엽, 배성 측생 중배엽, 또는 배성 내배엽으로부터의 것일 수 있다. 따라서, 동물에서의 종양은 피부 조직 및 연 조직의 종양, 근육의 종양, 연결 조직 및 인접 연 조직의 종양 및 종양-형 병변, 골 및 연골의 종양, 림프 조직 및 조혈 조직의 종양, 호흡계의 종양, 소화관의 종양, 간, 담낭 및 췌장의 종양, 비뇨계의 종양, 생식기의 종양, 유방선의 종양, 내분비선의 종양, 및 신경계 및 안구의 종양 등을 포함한다.

사람 악성 종양은 급성 임파성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 만성 임파 백혈병, 진성 다혈구혈증, 골수 이형성을 갖는 척수경화증, 다발성 골수종, 1차 고분자글로불린혈증, 호지킨(Hodgkin) 질환, 비-호지킨 임파종, 피부암, 악성 흑색종, 두부 및 경부암, 폐암, 위장암, 유방암, 부인과암, 영양배엽 질환, 고환암, 전립선암, 신장암, 방광암, 내분비 종양, 뇌종양, 망막아종, 신경아세포종, 월름(Wilm) 종양, 골 형성원성 육종, 에빙(Ewing) 육종 및 연 조직 육종을 포함한다.

본원에 사용된 용어 미생물은 기생충, 세균 및 감염을 야기시키는 기타 유기체 및 작용물을 포함한다. 기생충은 절지 동물 기생충, 장내 기생충, 원생동물 기생충 및 헤마원생동물 기생충을 포함한다. 이러한 기생충의 예는 여드름 진드기, 십이지장충 및 구충류를 포함한다.

용어 글리코실화는 단백질 분자에 탄수화물 분자가 가해진 것을 의미한다. 아세틸화된 만난 유도체, 특히 아세만난은 2가지의 가능한 기작에 의해 이의 치료 효과를 발휘할 수 있다. 한가지는 글리코시다제 I의 억제와 같이 글리코실화를 변화시키거나 아세틸화 만난 유도체를 당단백질에 삽입시키는 것이다. 다른 가능한 기작은 바이러스 또는 종양의 항원성을 강화시키거나 숙주의 면역 적응을 강화시키는 것이다. 항원의 강화는 대식세포에 의한 표시(presentation); T 또는 B 세포 또는 이들 모두에 의한 수용, 변화된 항원 표시 또는 보조 효과를 통해 성취될 수 있다. 어떤 점에서는, 아세틸화 만난 유도체는 숙주가 종양 또는 감염물(예: 바이러스 또는 다른 미생물)을 비-자기로서 인지하는 것을 강화시킨다.

아세틸화 만난 유도체의 투여는 국소 적용, 경구 섭취, 복강내 경로, 정맥내 경로 또는 투여의 다른 비경구 경로로 달성할 수 있다.

아세틸화 만난 유도체는 단일 제제로서 수령자에게 제공되거나 숙주 면역계의 참여 또는 보조가 요구되는 다른 공지된 치료제와 함께 사용하여 최대의 치료효과를 성취할 수 있다.

본 발명에 이르러, 아세만난은 배양물중 사람의 말초 혈액 인접 세포에 의한 IL-1 및 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성에 대해 강력한 유도체인 것으로 밝혀졌다. 본 발명은 IL-1 방출의 제1의 실제적인 무-독성 자극제인 것으로 생각된다. IL-1은 임파구, 섬유아세포, B-임파구 및 내피세포의 활성 및 생성에 영향을 미치는 것으로 문헌에 보고된 중요한 대식세포 생성물이다[참조: Old, Scientific American, 258(5):59-60, 69-75(1988)].

IL-1은 상처 치유에 쥬요한 섬유아세포 증식을 유도한다. IL-1은 또한 (1) 골수 활성을 강화시키고(이는 골수가 저하된 개체에서 치료 활성을 가질 수 있다) (2) 일반적으로 면역계를 강화시킨다.

배합된 임파구 배양물(MLC)을 사용한 일련의 실험으로, 아세만난이 용량-관련된 양상으로 이들 임파수의 동종항원 반응을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 아세만난을 단핵세포와 배양하면 단핵세포-유도된 시그날이 T 임파구의 렉틴에 대한 반응을 강화시킨다. MLC에 대한 아세만난 효과의 관련 조사로, 천연 킬러 세포의 식작용과 활성이 증가하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 시험관내 시험 시스템에서, 아세만난은 무-독성이며 면역강화제이다.

아세만난은 임파구를 활성적으로 자극시켜 림포카인을 분비하고 또한 HIV-감염된 임파구가 글루코시다제 I 억제제의 기작과 유사한 기작에 의해 변화된 당단백질(GP-120)을 생성하게 만든다[참조: Gruters et al., Nature 330:74-77(1987) and Pal et al., Intervirol. 30:27-35(1989)]. 아세만난은 식작용을 영위하며 아세만난이 당단백질 합성과 직접적으로 대립하는 곳에서 단핵세포의 골지체/당단백질 기구로 명백히 펌핑된다.

A. 독물학

아세만난의 독물학적 효과가 생체내와 시험관내 시스템 모두에서 조사되었다. 아세만난은 시험관내 시험 시스템에서 돌연변이 물질 또는 배자발생 물질이 아니다. 시험관내에서, 이 화합물은 H-9, MT-2 및 CEM-SS 임파구 세포에 대해 무-독성이다. 아세만난에 대한 생체내 독물학 연구는, 개에서의 91일간의 준만성적 경구 독성 연구, 래트에서의 180일간의 만성적 경구 독성 연구 및 사람에서의 180일간의 만성적 경구 독성 연구를 포함한다. 이들 연구에서, 91일동안 일일당 아세만난 825mg/kg까지를 투여받은 개에게서 관측성 독성 효과는 없다. 180일 동안 사료에서 아세만난 38,475ppm까지를 섭취한 래트에게서 임상적 효과, 심한 병리학적 효과 또는 독성 효과는 주목되지 않았다. 180일 동안 일일당 아세만난을 800mg 투여받은 사람 환자에게서 불리한 임상적 효과 또는 독성 효과가 관측되지 않았다.

파일럿 조사에서, 개에게 아세만난을 투여한 결과 완전한 백혈구 세포수를 세고 형태적 차이를 파악하기 위해 취해진 혈액샘플에서 확실한 단구 증가증을 야기시켰다. 고 용량의 아세만난을 경구 투여한지 2시간 내에, 매우 활성화된 단핵 세포가 순환계에 출현했다. 유사한 효과가 사람에서도 관찰되었다.

생물학적 시스템으로의 아세만난의 도입 또는 흡수를 추적하기 위해 사람 말초 혈액 단핵세포 세포 배양물 및 C-표지된 아세만난을 사용한 연구를 수행하였다. 이러한 연구에서, C-표지된 아세만난의 검출 양은 사람 말초 단핵세포/대식세포 세포에 의해 흡수되거나 섭취되었다. 피크 도입은 48시간째에 발생하였다. 5/의 농도에서,¹⁴C-표지된 아세만난은 단핵세포/대식세포 세포에 대해 세포 독성이 없으며 분해된 세포 질량(중량/용적: w/v)은 분해된 아세만난 용액(w/v)보다 760배가 컸다. 이러한 결과는, 대식세포가 세포 독성이 아닌 매우 높은 수준에서 아세만난의 세포내 농도를 유지시킬 수 있다는 것을 제시한다.

발열물질 검정은 아세만난의 주사 용액 1/을 사용하여 U.S.P XXI, Biological Test [151]에 개요된 발열물질 시험 프로토콜에 따라 래비트에서 수행되었다. 주사된 아세만난의 알려지지 않은 전신계적 효과 때문에 U.S.P.에 명시된 것보다 더욱 자주 온도를 측정하였다. 시험 동물에서 온도 변화는 U.S.P. 프로토콜에서 허용된 최소 변화를 초과하지 않았다: 따라서, 이 용액은 발열 물질의 부재에 대한 U.S.P. 조건을 만족시켰다. 주사된 아세만난은 한 마리의 래비트에서 0.3의 최대 체온 증가를 유도했다. 이러한 온도 증가는 주사한지 90분에 나타났다. 아세만난은 시험관내에서 대식세포 및 단색세포에 의한 IL-1 분비의 유도제이다. IL-1은 강력한 발열물질이므로, 이러힌 래비트에서 최소한의 지연된 온도 증가가 설명될 수 있다.

24명의 사람에 대해서 경구-투여된 아세만난의 안정성 및 허용성에 대한 연구를 기록 및 완성하였다. 임상 실험 결과, 정상 범위밖의 변화가 다음과 같이 발생하였음이 밝혀졌다: 즉, 7명의 피험자에서 CO₂가, 3명의 피험자에서 콜레스테롤이, 2명의 피험자에서 트리글리세라이드가, 한명의 피험자에서 인이, 4명의 피험자에서 헤모글로빈이, 2명의 피험자에서 호염구가, 3명의 피험자에서 단핵세포가, 3명의 피험자에서 호산구가, 4명의 피험자에서 임파구가, 2명의 피험자에서 호중구가, 및 적혈구 및 백혈구 세포에서 각각 하나, 소수의 적혈구 및 백혈구 세포가 또한 뇨에서 발견되었다. 이러한 변화는 임상적으로 무관했다.

면역 프로필 결과, CD-16, CD-4(T-4), CD-8+Leu7, CD-4+CD-25, CD-8+CD-16, Leu7 및 TQ-1에 대한 1일의 수치와 7일의 수치 사이에 그룹 차이를 보였다. 유사분열물질 반응이 낮은 범위에 있었다.

정상 범위를 초과하는 치명적인 표시는 나타나지 않았다. 뇨 배출에 있어 그룹 차이가 없었다. 그룹 IV에서 한 피험자가 설사를 했으며 조사중 대변을 보았다. 그룹 I에서 한 피험자가 조사 2 내지 4일중 대변을 보았다. 총 5명의 피험자가 총 8개의 부작용을 나타냈다. 모든 사건은 6일 동안 매일 아세만난 1600 내지 3200mg을 경구 투여받은 피험자에서 발생했다.

B. 투여방식

아세만난의 물리적 특성에 의해 당 분야의 전문가들에게 공지된 모든 약제학적 용량 형태로 제형화되고 통합될 수 있다. 아세만난의 생약제학적 특성 및 독물학적 특성에 의해 생유기체의 조직 및 기관에 사용하고 광범위한 용량에 걸쳐 투여할 수 있다.

아세만난은 일일당 0.001/내지 1000/체중의 용량으로 경구, 비경구, 국소 및 국부(locally)적으로 동물에게 투여할 수 있다.

적합한 보조제와 배합된 아세만난은 환제, 정제 및 제피정제와 같은 고체용량 단위로 압착되거나 충전될 수 있으며 또는 캅셀제로 가공할 수 있다. 이들 경구 용량 형태는 일일당 체중 kg당 약 0.1내지 1000의 용량으로 투여될 수 있다.

적합한 액체 비이클을 사용하는 경우, 아세만난을 액제, 현탁제 또는 유제로 주사할 수 있다. 이들 생성물은 일일당 체중당 0.001내지 1000의 비율로 투여될 수 있다. 백신 또는 다른 생성물에 대한 보조 성분으로서의 아세만난은 보조된 생성물의 단위 용량당 0.001 내지 1000의 비율로 사용될 수 있다.

아세만난의 국소 투여는 가공 겔, 크림, 로션, 용액, 연고 또는 분말의 형태일 수 있다. 이들 제제는 아세만난을 90%까지 포함할 수 있다.

[실시예 1]

아세만난으로 자극된 사람 유착 말초성 혈액 백혈구에 의한 인터루킨-1 및 PGE2의 생산

A. IL-1 생산의 유도

사람 단핵 세포를 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque: Pharmacia, Sweden)에서 밀도-구배 원심분리에 의해 헤파린 처리된 전체 혈액으로부터 분리한다. 세척한 후, 세포를 25mM Hepes를 포함하고 50U/ml 페니실린, 50/스트렙토마이신 및 20mM L-글루타민으로 보충된 RPM1-1640에 2 x 10⁶세포/의 농도로 재현탁시킨다. 세포 현탁액 2분취량을 6-웰 평판의 각각의 웰에 분배하고 5% CO₂-함습 대기중, 37에서 1시간 동안 배양한다. 비유착 세포를 제거시킨 후, 유착 세포를 상술한 배지로 3회 세척한다. 5% 혼주된 사람 AB 혈청으로 보충된 배지 2을 각각의 웰에 가한다. 배양물을 상이한 농도의 아세만난으로 자극한다. 20/의 최종 농도의 이.콜라이(Sigma 0111:B4)로부터의 리포다당류(LPS)를 사용한 동시 대조군 및 어떠한 부가도 없는 대조군(배경)이 포함된다. 배양물을 24시간 동안 상기한 바와 같이 37에서 배양한다. 상등액을 수거하고 원심분리시켜 세포를 제거한 후, 48시간 동안 PBS 500용적에 대해 투석하고(1회 갈아줌) 이어서 상술한 바와 같이 25mM Hepes, 항생제 및 L-글루타민을 갖는 RPMI-1640 20용적에 대해 4시간 동안 투석한다. 상등액을 IL-1 활성이 평가될때까지 -20에서 동결시킨다.

B. 상등액중의 IL-1 측정

다음 2가지의 상이한 공정이 IL-1을 검정하는데 이용된다:

(1) 흉성세포 증식 검정 및 (2) IL-1에 대해 특이적인 ELISA 검정

1. 5 내지 8주된 C₃H/HeJ 마우스로부터의 흉선세포를 사용한다. 균질한 세포 현탁액을 5% FCS, 100U/페니실린, 50g/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민 및 5 x 10⁵2-머캅토에탄올로 보충된 최소 필수 배지(MEM) 중에 제조한다. 세포 농도를 조절하고 1 x 10⁶m 세포/웰로 96-웰 평판에 분배한다. 식물성 혈구응집소(PHA)를 10/웰의 농도로 각각의 웰에 가한다. 샘플을 1:10으로부터 최종 희석율로 연속적으로 희석시키고, 25용적을 각각의 웰에 가한다. 매 희석물을 4중 시험한다. 평판을 72시간 동안 5% CO₂를 갖는 함습 대기중, 37에서 72시간 배양하고 마지막 16시간 동안 [³H]-티미딘(0.5Ci/웰)으로 펄스시킨다. 세포를 자동 세포 수거기를 사용하여 섬유 유리 필터상에 수거하고, 표준 섬광 공정으로 방사능을 측정한다. 그 결과는 최종 1:10 희석율의 상등액에 반응하여 흉성세포에 의해 도입된 티미딘의 양(cpm)으로써 표시한다.

2. IL-1에 대한 2개의-부위를 갖는 샌드위치 ELISA. 이 공정은 최근에 문헌[참조: Journal of Immunology, 138:4236(1987)]에 기술되어 있으며 이 문헌의 기술이 본원에 참조로써 구체적으로 인용되었다. 또한 문헌[참조: U.S. 특허 제 3,654,090호 및 U.S. 특허 제 RE 31,006gh, Schuurs 등]도 참조한다. 간단히 설명하면, IL-1에 대한 모노클로날 정제된 항체 IL-1-H6(100/웰, 10/)를 4에서 밤새 비닐 검정 평판 웰상에 피복시킨다. 웰을 PBS/0.5% 티메로살(Thimerosal)로 세척하고, 실온에서 5% 무수 탈지유/0.5% 티메로살/PBS 200로 1시간 카운터피복시킨다. 세척한 후, 샘플 또는 사람 재조합 IL-1 표준물 50/웰 및 IL-1[1% 무수 탈지유/0.5% 티메로살/PBS 중의 바이오티닐 처리된 IL-1-H67(2㎍/ml)]의 비-중복 에피토프에 대한 또 다른 모노클로날 항체 50을 가하고, 평판을 실온에서 2시간 항온처리한다. 세척후 스트렙트아비딘-퍼옥시다제의 1:1000 희석물 1000/웰을 가하고, 평판을 1시간 동안 항온처리한다. 웰을 세척하고, OPD 기질 용액 100을 사용하여 암소에서 30분 동안 항온처리한 후, 450에서의 흡광도를 측정한다.

C. PGE₂의 측정

PGE₂를 동일한 비-투석된 상등액중에서 방사선면역검정으로 평가한다. PGE₂(ICN Biomedical, Inc., Costa Mesa. CA)에 대한 항체를 제조자의 교시에 따라 사용한다(본원에 참조로 인용된다).

D. 관찰

대표적인 실험이 표 2에 나타나 있다. 아세만난은 사람 유착성 말초 혈액 백혈구에 의한 IL-1 생성의 강력한 유도체이다. 1 내지 10/의 용량에서, 아세만난 추출물은 IL-1 생성의 참조 유도제인 LPS 20/에 의해 유도된 것과 비교되는 IL-1의 생성을 유도하였다. 동일한 용량 범위의 아세만난은 또한 LPS(양성 대조군) 20/에 의해 유도된 것과 비교되는 수준으로 PGE₂의 생성을 유도하였다.

[실시예 2]

시험관내 식작용에 대한 아세만난의 효과

아세만난의 효과는 식작용 기능에 대한 이의 효과를 확인하기 위해 시험관내에서 조사하였다. CBA 마우스에 아세만난 1mg/kg를 복강내 주사하고, 3일후 복막 및 비장 대식세포를 수집한다. 각각 양성 및 음성 대조군으로서 티오글리콜레이트 및 염수를 유사하게 시험한다. 대식세포를 항-양 적혈구 세포(sheep red blood cells; SRBC) 역가의 존재 및 부재하에 섭취 인자로서 SRBC와 함께 배양하고, SRBC를 섭취한 세포의 %로서 식작용을 조직학적으로 측정한다. 아세만난 처리후 비-특이적 식작용이 약간 증가되나, 식작용은 항체의 존재하에 상당히 증가되었다. 보체의 존재하에서, 아세만난-자극되고 항체-중재된 식작용은 상당히 높은 정도로 증가되었다. 이러한 결과는 아세만난이 대식세포의 수를 증가시키고 이들의 식작용 활성을 강화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 반응은 상처 치유 및 항-감염제의 자극제로서 아세만난의 효과에 기여할 수 있다.

A. 방법 및 재료

아세만난을 이의 무수 형태로 실온에서 저장한다. 각각의 실험에 필요한 양을 칭량하고 600와트에서의 2분 노출로 극초단파 처리한다. 이어서, 이를 멸균 플라스틱 원심분리 튜브에 옮기고, 추가의 1분 동안 극초단파 처리한다. 이 재료를 세포 배양 배지(RPMI-1640) 내에서 목적하는 농도로 희석시킨다.

[식작용 세포]

마우스 비장 세포를 Harlan Sprague-Dawley로부터 구입한 BALB/c 마우스로부터 구입한다. 마우스를 CO질식시켜 죽이고, 이의 비장을 무균적으로 꺼낸다. 이어서, 이 세포를 문헌[참조: Journal of Immunology, 71:220, 본원에 참조로 구체적으로 인용됨]의 방법에 따라 나일론 울 컬럼 분획화에 의해 유착 및 비-유착 집단으로 분리시킨다. 유착 세포를 하기와 같이 현미경 분석한 결과, 대식세포(단핵세포) 및 임파구가 4 대 1의 비율이었다. 단일-세포 현탁액을 단층 파괴로부터 얻은후, 유착 단일 세포와 비유착 단일 세포 모두를 피콜-하이파크에 놓고 원심분리시켜 임파구와 대식세포의 혼합물을 얻는다.

[배지발생 검정]

표준 배자발생 검정법이 하기에 개요되어 있다. 이 검정법에 사용되는 유사분열물질은 Burroughs Wellcome으로부터 구입한 PHA-P이다. 개개의 실험에 대해 지시되는 바와 같이, 배양물을 5% CO함습 대기중에 72시간 동안 유지시킨다. 삼중 수소 처리된 티미딘을 배양 기간의 최종 6시간 동안 가한다. 평저 미세역가 조직 배양 평판을 사용하며 웰당 세포 농도는 5 x 10 개 마우스 세포/0.2이다. 세포가 웰에 부착되면, 아세만난 또는 유사분열물질을 가한다. 자극지수(SI)를 하기식으로 계산한다:

[세포 염색]

간단히 설명하면, 세포 도말을 하기와 같이 비-특이적 에스테라제 염색물로 염색한다. 2개의 점적중 약 2 x 10⁶개 세포를 태 송아지 혈청 2점적 및 35% 포름알데히의 25ml, 아세톤 45ml, KH₂PO₄100mg, Na₂HPO₄10mg 및 물 30ml의 혼합물로 구성된 고정 용액 4 점적과 혼합한다. 슬라이드를 나프틸 아세테이트 10mg과 에틸렌 글리콜 모노메틸에테르 1.4ml 중의 Fast Blue 염색물 4.5mg의 혼합물[0.1M 트리스말레에이트 완충액 pH 7.8(라이트 염색물)을 포함]과 함께 배양한다. 염색물을 10분 동안 반응시킨 후 20초 동안 물에 세척한다. 다시 세척하기 전에 30초동안 김사(Giemsa) 염색물 0.2g, 에탄올 12.5ml 및 글리세롤 12.5ml의 카운터 염색물을 사용한다.

[복막 대식세포의 유도]

염수 티오글리콜레이트 브로쓰(1mg/kg) 또는 아세만난(1mg/kg)을 암컷 BALB/c 마우스에 복강내 주사하여 복막 삼출 대식세포를 유도한다. 유도된 세포를 주사한 지 3일 후 복강으로부터 제거한다.

대식세포를 인산염-완충된 염수(PBS)로 2회 세척하고, 새로운 배지 2ml로 덮은후, 대식세포 현탁액 0.1ml를 각각의 튜브에 가한다. 배양물을 37, 함습 5% CO₂-95% 공기 배양기에 30 내지 60분 동안 둔다. 배양물을 PBS로 2회 세척하고, PBS 2ml로 덮는다. 각 쌍의 커버 슬립중 하나를 바늘-코 겸자로 떼어내고, 단지 증류수에 5초 동안 담근후, 배양 접시에 신속히 놓는다. PBS를 제거시키고, 배양물을 빙-냉 글루타르알데하이드로 덮는다. 10분 후, 글루타르알데하이드를 제거시키고, 커버 슬립을 증류수로 입힌다.

올려놓은 커버슬립을 상 대조 현미경의 오일 액침 렌즈를 사용하여 신속히 조사한다. 유착은 저장 쇼크를 입지않은 커버슬립상에 기록되고 섭취는 증류수중에서 용해된 커버슬립상에 기록된다.

[항체-의존적 식작용 및 항체-독립적 식작용

Austin Biologics Lab oratory(Austin, Texas)로부터 구입한 SRBC를 PBS(pH 7.2)중에서 3회 세척한다. BALB/c 마우스에 10⁶개 세포를 복강내 주사한 후, 주사한지 14일째에 채혈한다. 혈청을 수집하고, 혼주한 후, 45분 동안 56에서 열-불활성화시킨다. 환저 미세역가 웰을 사용하여 응집반응 역가를 측정한 결과 1024였다.

항체-독립적-식작용을 20% 태 송아지 혈청(FCS)을 포함하는 RPMI-1640중에서 SRBC(0.5% v/v)와 대식세포(10⁶개)를 배양하여 측정한다. 여러 시점에서 슬라이드를 제조하여 염색한다. 섭취된 적혈구 세포를 갖는 대식세포(%)를 200개 세포/슬라이드 및 3개 슬라이드/동물을 계수하여 시각적으로 측정한다.

항-SRBC 혈청 또는 IgM 분획물(최소 역가: 2000)과 혼합된 SRBC(20% FCS를 갖는 RPMI-1640중 0.5%)를 사용하여 항체-의존적 식작용을 측정한다. 혼합물을 37℃에서 15분 동안 항온처리한 후, PBS(pH 7.2)중에서 2회 세척하고, 최초 용적으로 재현탁시킨다.

[혈청 분획화]

전체 혈청을 분획화하여 유글로불린(euglobulin) 침전 및 증류수에 대한 투석으로 IgM을 제거한다. 24시간 동안 4에서 투석시킨 후, 20분 동안 1500 x G에서 원심분리시켜 침전물을 제거시키고, 상등액을 이온 전기영동 및 보체-중재된 용해로 분석한다. 5% 미만의 최초 IgM이 남는다.

B. 결과

대식세포에 대한 아세만난의 영향을 평가하기 위해서, 제1실험은 아세만난과 함께 시험관내에서 배양된 마우스 비장 세포를 사용한다(표 3).

(a) 대식세포(단색세포)를 에스테라제 염색으로 측정한다. 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타낸다. 결과는 실험당 200개의 세포를 조사하는 6개의 실험으로부터 구한다. 임파구는 에스테라제로 염색되지 않는 세포이며 라이트 염색(wright stain)에 의해서 임파구가 나타난다.

배양물을 72시간 또는 96시간 동안 항온처리하고 실험 끝에 도포 표본을 만들어 라이트 염색 및 에스테라제 방법으로 염색한다. 대식세포 및 임파구의 상대비율(%)을 측정한다. 72시간째에, 대식구의 수가 아세만난으로 처리하지 않는 경우 30%부터 웰당 아세만난 0.2㎍으로 처리한 경우 45%까지 용량-관련 증가를 보였다. 자료를 세포%로 나타내므로 임파구가 부수적으로 감소하였다. 96시간째에, 아세만난의 존재하에 대식세포(%)가 용량-관련 증가를 보였다. 96시간째에, 웰당 아세만난 0.2㎍을 갖는 배양물은 황색상으로 나타나는 바와 같이 상당한 산성증을 보였다. 또한, 96시간 배양물은 아마도 배양 시간이 더욱 길므로 대식세포 수준(%)이 보다 낮았다. 대식세포 수의 아세만난-유도된 증가를 공지 표준물에 연관시키기 위해, 유사분열물질 PHA-P를 사용하는 유사한 실험을 수행하였다. 그 결과가 표 4에 나타나 있다.

(a) 단핵세포를 에스테라제 염색으로 측정한다. 결과를 평균 ± 표준편차로 나타낸다. 결과는 6회 실험으로부터의 것이다. 임파구는 에스테라제에 의해 염색되지 않는 세포이며, 라이트(Wright) 염색에 의해 임파구가 보였다.

대식세포의 %가 72시간째에는 변화하지 않지만, 96시간동안 PHA-P와 함께 항온처리한 후에는 대식세포가 용량-관련 증가를 보였다. 비교상, 아세만난은 PHA-P보다 2배 효과적이다. 대식세포의 %는 PHA-P를 사용한 경우의 7%와 비교하여 아세만난을 사용한 경우 최대 16%로 증가하였다(표 3 및 표 4).

아세만난은 대식세포의 %를 증가시키는 것으로 나타났으므로, 식세포의 활성도 또한 증가되는 지의 여부를 측정하였다. 염수, 티오글리콜레이트 브로쓰 또는 아세만난으로 처리된 CBA 마우스로부터의 복막 삼출 세포를 [식세포]로 사용하고 양의 적혈구 세포를 섭취될 입자로서 사용하였다(표 5).

(a) 이 결과는 동물당 2개의 슬라이드로 200개 세포/슬라이드를 계수하여 측정한다. 결과는 2회 실험을 기준으로 한다.

(b) 식작용 율(%)은 적혈구 섭취를 보이는 세포의 비율을 나타낸다. 그 결과는 평균 ± 표준편차로 나타낸다.

(c) 스튜던트 T-시험으로 95% 신뢰 수준에서 평가시, 염수 대조군과 상당한 차이를 나타낸다.

120분에 걸쳐, 염수 대조군에서는 비특이적 식작용이 3% 내지 53% 증가했으나, 티오글리콜레이트 브로쓰-처리된 동물로부터 얻은 세포에서의 식작용은 89%로 증가되었다. 아세만난-처리된 동물에서의 식작용은 120분째에 63%로 증가하였다. 아세만난-자극된 식작용은 20 내지 120분후 대조군의 식작용보다 컸다; 그러나, 그 차이는 통계학적으로는 현저하지 않다.

식작용에 대한 아세만난의 영향이 항체-의존적인가의 여부를 측정하기 위해서, 유사한 실험을 항-SRBC를 사용하여 수행한다(표 6).

(a) 식작용은 적혈구 섭취는 갖는 세포의 평균(%)표준편차로서 나타낸다.

(b) 응집반응에 의한 항체 역가는 1:1024로 나타났다. 예비-처리 및 세포 공급원은 방법에서 기술된다.

(c) 스투던트 T-시험으로 95% 신뢰 수준에서 평가시, 염수 대조군과의 상당한 차이를 나타낸다.

혈청을 열(30분 동안 56)로 불활성화시킨다. 사용된 항체 역가는 혈구 응집반응 역가 이상인 2 x 10³이었다. 이 실험에서, 대식세포는 2가지 공급원(복강 및 비장)으로부터 얻는다. 다시, 마우스를 0.9% 염수 1ml, 1mg/kg 티오글리콜레이트 또는 1mg/kg 아세만난의 복강내 주사로 예비처리한다. 2 x 10³의 역가에서, 티오글리콜레이트-유도된 복막 대식세포의 식작용 활성은 염수-유도된 대조군의 활성보다 2배 큰 반면(89% 대 43%), 아세만난-유도된 대식세포는 대조군과 비교하여 30%가 더 활성이다(73% 대 43%). 아세만난-처리된 그룹 및 염수 대조그룹에서 식작용 활성의 차는 통계학적 유의성이 있다.

마우스 비장으로부터 얻은 대식세포로 유사한 결과를 얻었다. 식작용 활성은 복강으로부터 얻은 대식세포의 활성보다 낮았는데, 이는 아마도 비장 세포의 처리에 기인함직하다. 다시, 2 x 10³의 역가에서, 아세만난-유도된 대식세포는 95%의 신뢰도 수준에서 염수 대조군보다 식작용 활성이 상당히 높았다; 식작용 활성은 8 x 10³의 역가에서 대조군과 유사했다.

항체-중재된 식작용에 대한 보체(C')의 영향을 측정하기 위해서, 배지에 C'를 첨가한 실험을 수행한다(표 7).

(a) 식작용을 30분 동안 항온처리한 후 양의 적혈구 섭취(%)표준편차로 측정한다. 기니아 피그 보체를 가한다.

(b) 스튜던트 T-시험으로 95% 신뢰 수준에서 평가시, -C'에 비교되는 상당한 차이를 나타낸다.

용해가 일어나지 않았다는 것을 확인하기 위해서, IgM-고갈된 마우스 혈청을 사용한다(참조: 방법). 혈구 응집반응과 콤브스(coombs) 기술로 측정한 사용된 역가는 3000이다. 차이가 비록 아세만난으로 유도된 복막 세포의 경우에만 통계학적 유의성이 있다 해도, 복강과 비장 모두로부터의 세포가 C' 첨가시 이의 비첨가시보다 식작용에 있어 보다 활성이었다.

마지막으로, 아세만난 식작용 및 유착의 효과를 구분짓기 위해 실험을 수행한다(표 8).

(a) 세포 혼합물을 7분 동안 배양한다.

(b) 결과는 식작용 또는 유착을 보이는 식세포(%)표준편차로 나타낸다. 이 결과는 3마리의 동물을 사용하여 동물당 200개의 세포가 기록되는 하나의 실험으로부터 얻는다.

(c) 스튜던트 T-시험으로 95% 신뢰 수준에서 평가시, 염수 대조군과의 상당한 차이를 나타낸다.

이 실험에서, SRBC에 대한 항체는 2,000의 역가로 사용되나, 실험은 7분후 멈췄다. 복막과 비장 모두로부터의 아세만난-유도된 대식세포가 염수 대조군보다 유착에 있어 보다 효과적이고, 이미 보여진 바와 같이 티오글리콜레이트-유도된 그룹보다는 덜 효과적이었다.

C. 논의

이 결과들은, 아세만난이 직접 또는 간접적으로 식작용을 자극한다는 것을 나타낸다. 또한, 아세만난이 대식세포에 의한 식작용을 비특이적 및 특이적으로 항체-중재된 반응을 통해 강화시킨다는 것을 나타낸다. 이는, 아세만난이 식세포에 대해 면역 자극 특성을 갖는다는 것을 입증한다.

[실시예 3]

비특이적 종양 용해에 대한 아세만난의 효과

이 실시예는 아세만난-자극된 식세포에 의해 유도되는 비특이적 종양 사멸의 가능성을 조사한다.

A. 공정

[아세만난 중합체]

아세만난을 무수 형태로 유지시킨다. 각각의 실험에 필요한 양을 칭량하고, 600와트 전력에서의 2분 노출로 극초단파 처리한다. 재료를 멸균 원심분리 튜브(15ml)에 옮기고, 추가 1분 동안 극초단파 처리한다. 이 재료를 행크스 평형 염 용액(Hanks Balanced Salt Solution: HBSS)중에 목적하는 농도로 희석시킨다. 일부 실험에서는, 재료를 뚜렷한 활성의 손실없이 오토클레이빙시켜 멸균시킨다.

[세포]

대식세포를 Harlan/Sprague Dawley로부터 구입한 암컷 BALB/c 마우스의 복강으로부터 수거한다. 티어글리콜레이트 브로쓰(25/) 또는 아세만난(25/)를 수거하기 6일전에 일부 그룹의 동물에 복강내 주사한다. 염수 자극된 세포를 추가의 대조군으로서 사용한다. 수거된 세포를 HBSS 중에서 3회 세척하고, 5 x 10⁶세포/의 농도로 RPMI-1640 중에 희석시킨다.

[표적 세포]

표적 세포를 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하고(C₃H/HeN 섬유육종 L929) 계대배양시킨다. RPMI-1640 중의 10⁷개 세포를 포함하는 세포 현탁액 1ml과 혼합된⁵¹Cr 150mCi로 표지시킨다. 세포를 1시간 동안 배양한 후, RPMI-1640으로 3회 세척하고, 5 x 10⁴개 세포/의 최종 농도를 조절한다.

B. 검정

주효 세포(effector cell)의 분취량(100개 세포/㎕)를 평저 미세역가 평판에 놓고⁵¹Cr-표지된 세포를 실험 시점당 최소 3개의 복제물로 가한다. 시험 평판을 20시간 동안 7% CO₂(이전에는 5% CO₂)중, 37에서 배양한다. 15분 동안 250 x G로 평판을 원심분리시킨 후 상등액(100㎕)을 얻는다. 방사성의 양을 팩카드 감마 카운터상에서 검정한다. 대조군은 흉선구로 구성된다. 세포 독성율(CT%)을 하기와 같이 측정한다:

C. 결과

표 9는 초기 실험 결과를 나타낸다.

(a) 표적 세포의 총 cpm = 42,000

Cr 표적 세포와 함께 배양된 티오글리콜레이트-자극된 대식세포는 평균 2800cpm의 Cr을 방출시키고, 아세만난-표지된 세포는 평균 3100cpm의 방사선을 방출시켰다. 이들 그룹간에 통계학적 차이는 없다. 비자극된 대식세포는 2800cpm의 범위에서 방출시켰다. 그러나, 시험관내에서 아세만난으로 자극된 대식세포는 21,000cpm의 Cr을 방출시켰다. 이는 (1) 아세만난이 오래 지속되는 세포 용해효과를 유도하지 않으며 (2) 이의 활성화가 조직 배양중 비교적 단시간에 발생할 수 있다는 것을 나타낸다. 세포 독성율은 표적 세포가 파괴되는 경우 표적 세포로부터 방출되는 cpm에 상당한다.

세포 독성 검정을 사용한 시간에 따른 연속 실험이 표 10에 나타나 있다.

(a) 주사후 시간

(b) 대조군 세포의 cpm = 39,000

아세만난의 세포독성 효과는 자극한지 6시간내에 개시되어, 9시간 경에 최대에 증가된다. 이러한 활성화의 기작은 조사되지 않았다.

이 실시예에서 나타난 데이타는 아세만난이 암의 비특이적 치료시 중요한 역할을 알 수 있다는 것을 나타낸다.

[말의 유육종에 대한 강력한 효능의 선별]

2마리의 말상의 3개의 유육종을 아세만난으로 비경구 및 병소내 치료한다. 이 시도의 목표는 아세만난이 말의 유육종에 대한 효과적인 치료인지의 여부와 부작용에 대해 말을 관찰하는 것이다. 말 1에서, 하나의 유육종이 완전히 치유된 반면 제2유육종의 크기가 감소되지 않았다. 제3의 소결절 유육종이 치료하는 동안 전개되었다. 말 2에서는, 단일 유육종이 완전히 치유되었다. 이들 결과는, 아세만난이 말의 유육종의 치료에 효과적일 수 있다는 것을 제시한다.

3개의 의심되는 병소를 갖는 2마리의 말을 저렴한 가격으로 구입한다. 병소를 사진 찍고, 조사한 후, 조직병리학에 의해 유육종을 확인한다.

[말 1]

1일. 우측 뒷다리상의 2개의 병소 각각의 염수 10ml(병소 1) 및 염수 5ml(병소 2)중에 희석된 아세만난 50mg으로 직접 주사(20-게이지의 바늘)하여 치료한다. 염수 7.5ml 중에 희석된 아세만난 25mg을 정맥내 투여한다.

7일. 병소 1(상부 병소)를 염수 10ml 중에 희석된 아세만난 50mg(18게이지의 바늘)으로 치료한다. 병소 2를 염수 7.5ml 중에 희석된 아세만난 25mg으로 치료한다. 염수 10ml 중의 50mg을 정맥내 투여한다.

14일. 병소 1을 염수 10ml중의 아세만난 50mg으로 치료하고 병소 2를 염수 5ml 중의 아세만난 25mg으로 치료한다. 염수 25ml 중의 75mg을 정맥내 투여한다.

21일. 병소 1을 염수 10ml 중의 50mg으로 치료하고 병소 2를 염수 10ml 중의 25mg으로 치료한다. 염수 25ml 중의 100mg을 정맥내 투여한다.

29일. 병소 1을 21일에서와 같이 치료하되, 국소적 부어오름 때문에 병소 2는 직접적으로 치료하지 않는다, 염수 25ml 중의 100mg을 정맥내 투여한다.

42일. 병소 1을 직접적으로 치료하지 않는다, 병소 2를 염소 10ml 중의 아세만난 25mg으로 치료한다. 염수 50ml 중의 100mg을 정맥내 투여한다.

57일. 말 1을 안락사시킨다. 병소 1의 부위 및 병소 2, 서혜 임파절 및 치료 과정 동안 전개된 좌측 어깨상의 결절 병소로부터 조직 샘플을 취한다.

[말 2]

1일. 저부 좌측 가슴상의 병소를 염수 30ml 중에 희석된 아세만난 50mg으로 치료한다. 1/2은 피하(S/Q) 주사하고 나머지 1/2은 병소내 주사한다.

1, 16, 24, 30, 49, 56, 63, 70 및 77일에 말 2에 염수 60 내지 120ml 중에 희석된 아세만난 100mg을 정맥내 투여한다. 희석액의 양은 청명액을 만드는데 필요한 양으로 변화된다.

105, 113 및 120일에, 병소를 염수 5ml 중에 희석된 아세만난 25mg으로 병소에 따라 병소내 및 피하 처리한다. 추가의 75mg을 정맥내 투여한다.

결과 - 말 1: 1일. 병소 1의 크기는 2.5cm(가로 길이) x 2.5cm(세로 길이) x 1cm(두께)였다. 이 병소의 해결은 다음과 같다:

[말 1 - 병소 1]

일 측정치

1 2.5cm x 2.5cm x 1cm

7 2.5cm x 1.75cm x 1cm

14 2.0cm x 1cm x 1cm

21 2.0cm x 1cm x 피부 수준의 발열 조홍을 띰

29 2.0cm x 1cm x 평평하고 건성이 됨

42 모두 치유됨

병소 2는 1일에 2cm x 2cm x 1cm이었고 유의적 변화가 없었다.

[말 1 - 병소 2]

일 측정치

1 2cm x 2cm x 1cm

7 2cm x 2cm x 1cm

14 2cm x 2cm x 1cm

29 2cm x 2cm x 1cm - 전체 과관철, 여전히 부어오르고 통증이 있음

42 크기가 약간 작아지나 여전히 부어오르고, 통증은 없음

54 크기가 동일하며, 과관절 부어오름이 65%로 감소됨

결과 - 말 2 : 1일. 병소의 크기는 5cm x 3.5cm x 2.5cm이며, 2.5cm의 육경 기준을 갖는다. 완전히 해결될 때까지의 변화는 하기와 같다:

[말 2 -병소 1]

일 측정치

1 5cm x 3.5cm x 2.5cm

6 변화 없음

16 변화 없음 - 심한 육아종증을 보임

24 5cm x 3cm x 2.5cm

30 경감된 육아종증을 보임

49 4cm x 3cm x 2cm

56 4cm x 3cm x 2cm

63 3.8cm x 3cm x 2cm

70 3.7cm x 2.6cm x 1.8cm

77 2.7cm x 2cm x 1.3cm

105 2.5cm x 2cm x 1.3cm

113 3.5cm x 2.25cm x 1.5cm

120 2.5cm x 2.4cm x 0.6cm

177 병소가 완전히 없어짐

이들 말들에게 정맥내 투여한 후, 심박도수에 변화가 없었으며, 땀이 나거나 근육이 근섬유연축되거나 고통스러운 뚜렷한 표시가 없었다. 호흡의 심도에 있어서 약간의 증가가 말 1에서만 주목되었다. 국부적으로, 29일에 계획되는 바와 같이 병소에 주사하지 않아도 되기에 충분한 정도로, 말 1은 병소 1에서는 온건한 특성의 염증성 소포염을 보이고 병소 2에서는 급통증형인 염증성 소포염을 보였다. 병소 2는 보다 섬유성이고 주사하기가 더욱 어려우므로, 보다 많은 피의 피하 누출이 있었다. 이는 병소 2에 대한 효과의 부족을 설명한다. 말 2는 봉와염을 보이지 않았다.

결절성 유육종이 치료과정 동안 전개된다는 사실은, 정맥내 투여로 유육종을 병소내 치료에 대해 감작화할 수 있으나, 아세만난의 주요 효과가 전신적인 것이라기 보다는 오히려 국소적 조직 반응이 아닌가를 의심스럽게 한다.

말 2상의 병소가 치유되는 정확한 날자는 조사자가 113일과 177일 사이에 60-일 병가였으므로 알지 못한다. 56일경에 종양 크기가 상당히 감소하지 않는 것으로부터 판단하건데, 주간으로 정맥내 단독 투여하는 것이 말 2상의 유육종에 효과가 별로 없는 것으로 보인다.

[실시예 4]

[아세만난에 의한 사람 임파구의 알로-반응성 강화]

이 실시예는 동종항원(alloantigen)에 대한 면역 반응을 강화시키는 아세만난의 능력을 시험하고, 또한 강력한 강화가 단핵세포-유도된 현상인지의 여부를 시험하기 위해 고안된 것이다. 아세만난은 혼합된 임파구 배양물(MLC) 중의 공통 유전자형 항원에 대한 임파구 반응은 강화시키지 않으나, 중요하게도, 아세만난은 용량-반응 양상으로 (2.6 x 10 내지 2.6 x 10 M) 동종항원 반응을 증가시켰다. 아세만난의 이러한 효과는 특이적 반응이며 생체내에서 달성할 수 있는 시험관내 아세만난의 농도와 부합하는 것으로 밝혀졌다. 분리된 일련의 혼합 실험으로, 아세만난을 단핵세포와 배양하면 단핵세포-유도된 시그날이 렉틴에 대한 T 세포 반응을 강화시킨다는 것을 입증하였다. 아세만난이 알로에 베라 식물의 활성 성분이고 동종항원에 대한 임파구 반응을 증가시키는 중요한 면역강화제라는 결론에 도달했다. 이는 기작이 동종항원의 보호하에 IL-1의 단핵세포 방출을 강화시킨다는 것을 제시한다. 이러한 기작이 실험 동물 및 사람에서 바이러스 감염을 퇴치하는 아세만난의 능력을 부분적으로 설명할 수 있다.

이 실시예는 단핵세포-T-임파구의 모델에서 면역 강화제로서의 아세만난의 효과(혼합된 임파구 배양물중에서 나타나는 동종항원에 대한 세포-세포 상호작용반응)를 직접적으로 평가하도록 고안되었다. 이러한 모델은 면역학적으로 관련된 모델에서 추가의 단핵세포-대식세포 작용을 자극하는 아세만난의 능력을 시험한다.

A. 재료 및 방법

1. 세포 제조 단핵 백혈구를 달라스에 있는 텍사스 싸우스웨스턴 메디칼 센터 대학의 인스티투셔날 리뷰 보드(the Institutional Review Board of the University of Texas Southwestern Medical Center)에 의해 인가된 조사의 보호하에, 통지하여 동의를 얻은 정상인 지원자의 말초혈액으로부터 얻는다. 말초 혈액을 행크 균형 염 용액(HBSS) 중에 1:3으로 희석시키고, 피콜-하이파크 구배의 상단에 놓는다. 주요 조직적합성 비대증을 갖는 것으로 알려진 피험자로부터의 세포를 각각의 조사일에 구해 양성 혼합 임파구 반응을 확인한다. 특정 실험을 위해, 단핵 백혈구 혼주물을 억제하는 세포의 보다 면밀히 특성 분석된 계통을 분리시킨다. 표준 나일론 울 분리 기술로 T-임파구를 분리시킨다. 나일론 유출 세포는 약 90%의 순수한 T 세포를 포함한다. T-8 임파구 및 단핵세포-대식세포는 컬럼에 선호적으로 유착한다. 플런저를 사용해 컬럼을 통해 배지를 강제로 집어넣어 유착집단을 떼어낸다. 단핵세포(대식세포)를 농축시키기 위해, 유리 유착 공정을 이용하여 세포군을 95% 이상 순수하게 생성한다.

2. 아세만난 RPMI-1640 배지에 0.5%(w/v) 용액을 제조하고, 2.6 x 10 M, 2.6 x 10 M 및 2.6 x 10 M의 작업 농도로 더욱 희석시켜 이들 조사에서 아세만난을 시험한다.

3. 혼합된 임파구 배양물(MLC) 단일 배향 MLC를 미세역가 평저 조직 배양 평판(Costar Co., Cambridge. MA)에 준비한다. 상기한 피콜-하이파크 밀도 구배 기술로 분리시킨 단핵 세포를 세슘 공급원(Gammacell. Atomic Energy of Canada, Ontario, Canada)에 30분 동안 2000rad에 노출시킨 후 자극 세포로서 사용한다. 유사하게 분리시킨 반응 세포 및 자극제를 1.3 x 10 세포/ml로 조절한다. 각각의 웰에, 아세만난 또는 배지(대조군) 25μl, 10% 태 송아지 혈청이 보충된 RPMI-1640 25μl 및 각각의 세포집단 75μl를 가한다. 세포를 6일 동안 5% CO:95% 공기하에 37℃에서 배양한다. 배양물은 4시간 동안 H-티미딘(1μCi/웰)25μl로 펄스시킨 후 세포를 수거하고 계수한다. MLC에 대한 구심성 인지(afferent recognization) 및 반응에 대한 아세만난의 특이성을 조사하기 위해, 세포를 H-티미딘으로 펄스시키기 20분전에 가해진 작용물을 갖는 추가의 단일 배향 MLC를 준비한다.

4. 단핵세포-T 세포 상호작용 루이스 암컷 래트 비장을 멸균 강철 메쉬를 통해 RPMI-1640 배지내로 가늘게 찢는다. 단핵 백혈구를 상술한 바와 같은 피콜-하이파크 밀도 구배물의 경계면으로부터 수집한다. 유리 페트리 접시상에서 농축시키고 10 /ml의 최종 농도로 조절시킨 단핵세포를 2ml의 총 용적에서 아세만난 또는 배지(대조군)의 용량을 변화시키면서 배양하고 37에서 24시간 동안 배양한다. 단핵세포를 수거하고, 새로운 배지로 완전 세척한 후, 공통 유전자형 T 임파구와 10개의 T-세포: 1개의 단핵세포의 비율의 37에서 48시간 동안 식물 렉틴 식물성 혈구응집소(Difco, Detroit, MI) (1:100)을 첨가시켜 공동-배양한다. 세포를 MASH II(Whittaker, MA Bioproducts, Walkersville, MD) 상에서 수거하고, 플루오르에 놓고 섬광 계수기(Beckman Laboratories, Chicago, IL)로 계수한다. T 임파구를 아세만난과 배양하고 세척한 후 새로이 제조된 T 임파구와 다시 10:1의 PHA-P를 첨가시켜 공동-배양하여 대조 실험을 수행한다.

B. 결과

1. 동종항원 반응 아세만난은 자가항원에 대한 T-세포의 반응에 대해 통계학적으로 중요한 효과는 갖지 않는다. 작용물을 MLC의 개시시에 가하는 경우, 공통유전자형 자극을 받은 세포는 기술된 용량에서 시험 작용물의 존재 또는 부재시 동일하게 삼중 수소 처리된 티미딘을 도입시켰다. 경구 아세만난의 부재시, 이들 MLC는 4시간의 펄스말기에 삼중 수소 처리된 티미딘 2616 ± 1099cpm을 혼입시켰다. 비록 가해지는 작용물의 용량(2.6 x 10^-9M에서 3281 ± 1355, 2.6 x 10^-8M에서 3742 ± 1670 및 2.6 x 10^-7M에서 3828 ± 1978)에 대해 상향 추세가 있지만, DNA로의 이러한 동위원소 혼입 비율이 통계학적으로 유의성 있는 정도로 차이는 없다.

MLC에서 자기반응(autoresponse)에 대한 아세만난의 효과 부재와는 대조적으로, 동일한 면역학적 검정에서 동종 반응(alloresponse)에 대한 작용물의 효과가 있었다. 첫 번째로, 아세만난은 임파구의 능력을 방해하지 않으므로 MLC에서 제II형 동종항원적 차이를 인지하고 이에 반응한다. 이는 동유전자형 배양물을 최저 농도의 약물 존재하에서 동종 유전자형 반응과 비교하는 경우 분명하다. 두 번째로, 아세만난에 의한 동종반응의 용량-반응-관련 강화가 있었으므로 최고 용량인 2.6 x 10^-7M로 처리된 배양물은 비-아세만난 배양물보다 거의 60%의 증가를 반영한다. 강화된 동종 유전자형 반응이 아세만난 비첨가 조건에 대해 시험된 각 용량의 아세만난에 대해 현저한 것으로 나타나므로 용량 반응 관계가 가장 설득력 있게 입증된다.

아세만난이 임파구 동종반응에 대한 특이적 효과 또는 삼중 수소 처리된 티미딘 혼압에 대한 비특이적 효과를 발휘하는 가의 여부를 확인하기 위해서, 추적물을 배양물에 첨가하기 20분 전에 7일간 혼합된 임파구 배양물 MLC의 말기에 시약을 가한다. MLC의 말기에 펄스로서 이러한 방법으로 가하는 경우 아세만난의 효과가 없었다. 이들 자료는 MLC에서 임파성 반응의 강화에 대한 아세만난의 효과의 특이성을 지지한다.

2. 아세만난과 단핵세포-T 세포의 협동 아세만난이 동종항원에 반응하는 단핵세포를 직접 자극하여 항원 및/또는 유사분열물질에 대한 임파성 반응을 강화시킨다는 가설을 시험하기 위해서, 단핵세포의 정제 집단을 다양한 용량의 아세만난과 함께 24시간 동안 배양한다. 배양 말기에 세포를 완전히 세척한 후, 말초 혈액에서 밝혀진 천연 비를 가장하기 위해 T 임파구와 10:1의 비율로 공동-배양한다. 공동-배양된 세포를 식물성 혈구응집소로 자극시킨다. 아세만난과 미리 배양시킨 단핵 세포와의 공동 배양으로 유사분열물질 반응이 용량-관련 양상으로 상당히 증가되었다.

C. 논의

본 실시예는 아세만난이 중요한 임상적 가치를 갖는 면역 자극 약물로서 작용하는 능력을 조사한다.

아세만난은 동물 및 사람에게서 중요한 질환을 유발시키는 DNA 및 레트로바이러스 감염을 제한할 수 있는 것으로 믿어진다. 예를 들어, 동물 모델에서 아세만난은 고양이 바이러스 비기관지염을 호전시켰다. 추가의 증거는, 아세만난이 제II형 단순 포진 바이러스, 홍역 바이러스 및 가능하게는 HIV에 대해 시험관내 및 생체내에서 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다. 이 증거는, 면역학적 기작이 단핵세포를 식세포 및 항원의 구심성 인지에 기여하는 세포로서 강화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 조사들은 한편으로는 단핵세포의 식작용 특성을 직접적으로 강화시키며 또 다른 한편으로는 중요한 세포의 절대적 수의 증가를 보인다. 밝혀지고 있는 증거들은 아세만난이 활성화된 단핵세포에 의한 시그날 물질 IL-1의 제조를 강화시킨다는 사고를 지지한다.

이 실시예에 기술된 연구는 특히 아세만난이 면역-강화 시약일 수 있는 기작을 조사한다. 혼합된 임파구 배양물은 면역컴피턴트(immunocompetent) 세포가 바이러스에 대한 반응 및 인지에 필요한 각종 항원에 대한 반응에 참여하는 방식에 대한 시험관내 모델이다. 이 반응에서, 동종항원에 대한 반응을 생성하는 중요한 단핵세포-T-임파구 상효작용이 있다. 이것이 아세만난이 면역활성화제로서 작용하는 능력을 시험하기 위해 채택된 모델이다.

따라서, 아세만난이 MLC 중의 동종항원 반응에 대한 중요한 강화제이다. 기본의 약 60% 이상으로 시험된 최고 용량에서 강화되는 용량-반응 관계가 있다. 이는 통계학상의 중요성을 나타낼 뿐만 아니라 동종항원에 대한 반응에서 생물학적 관련 증가를 나타내며, 약물이 바이러스 공격에 대한 유기체의 반응을 보조할 수 있는 수단으로써 작용할 수 있음을 나타낸다. 아세만난의 이러한 효과는, 약물을 MLC의 말기에 가했을 때 약물이 추적인자 DNA 전구체인 삼중 수소 처리된 티미딘의 비-특이적 혼입 또는 자기(동유전자형 MLC)에 대한 기본 반응을 강화시키지 않는한, 동유전자형 자극에 특이적인 것으로 나타났다.

제2의 일련의 실험에서는, 단핵세포-T-임파구 상호작용이 적어도 부분적으로 MLC 중의 고조된 동종반응에 관여할 수 있다는 가설을 시험한다. 이러한 일련의 실험에서는, 아세만난을 단핵세포와 함께 배양하고, 이어서 처리되고 완전 세척된 단핵세포를 아세만난에 노출된 적이 없는 새로이 제조된 동유전자형 T-임파구와 혼합한다. 이들 실험은, 이전에 MLC에서 나타났던 반응과 동일한 정도(기본의 약 55% 이상)의 폴리클로날 유사분열물질 식물성 혈구 응집소에 대한 T-임파구 반응 강화 및 용량-반응 관계를 입증한다.

MLC에서 효과적이었던 연구에서 시험된 최저 용량이 단핵세포 실험에서는 효과가 없었다. 한계 용량이 시험되는 2개 모델에 대해 다르고, 유사분열물질에 대한 폴리클로날 반응 및 MLC에서 동종항원 반응에 대해 다를 수 있다는 것은 놀라운 일이 아니다. 또한 단핵세포 실험이 처리되는 세포 유형(단핵세포)를 나타내므로 약물 부재하에 면역 자극을 나타내는 T 세포에 대한 아세만난의 효과에 대한 보다 엄격한 시험이라는 것이 관찰될 수 있다. 동종항원 반응은 오직 또는 주로 IL-1의 아세만난-강화된 단핵세포 생성을 측정할 수 있는 한편, 폴리클로날 유사분열물질-강화된 반응은 각각 아세만난에 대해 상이한 한계 반응을 갖는 면역 자극 검정의 결과일 수 있다.

이들 실험에 사용되는 아세만난의 용량은 임상적으로 관련된다. 선택된 용량 범위는, 약물이 세포외 물에 분배되고 경구 투여되는 용량의 1/3 속도로 흡수되는 경우, 혈장중에서 달성되는 것으로 예측될 수 있는 아세만난의 농도를 일괄하기 위해 정확히 선택되고, 양상은 개에서의 이전의 약물학적 조사에 기초하여 선택된다. 또한 사람에게서 얻어질 수 있는 실제 농도가 이러한 범위에 있는 것으로 밝혀졌으므로, 임상 실시를 위한 이들 조사의 잠재적 연관성을 더욱 지지한다.

이들 실험에 의해 아세만난은 단핵세포로 하여금 단핵세포-유도된 시그날을 방출하도록 하여 렉틴에 대한 T4 세포 반응을 강화시키는 것으로 나타났다. 아세만난은 MLC 중의 동유전자형 항원에 대한 임파구 반응을 강화시키지 않는 반면, 용량-관련 방식으로 MLC 동종항원 반응을 증가시켰다. 이러한 반응은 생체내에서 달성할 수 있는 아세만난 농도에서의 아세만난-특이적인 반응인 것으로 밝혀졌다.

이러한 실험적 문서화는, 아세만난이 동종항원에 대한 임파구 반응을 증가시키는데 있어서 면역 강화제 및 생물학적 반응 변형제라는 것을 입증한다. 제시된 작용 기작은 IL-1을 방출시키기 위한 단핵세포의 자극을 수반하며; 아세만난의 존재하에서, IL-1은 단핵세포 배양물로부터 방출되는 것으로 나타났다. 단핵구의 아세만난 자극에 대한 약리학적 작용이 동물 및 사람에게서 바이러스 감염에 대한 아세만난 활성을 설명할 수 있다.

[실시예 5]

[아세만난의 시험관내 및 생체내 효능의 상관관계에 대한 약력학 기초]

아세만난의 약력학 양태를 평가하기 위하여,¹⁴C-표지된 물질을 복강내 및 정맥내 주사하고 경구 투여한다. 이전의 파일럿 연구의 결과를 기초로 하여, 특이활성이 17.4cpm/㎍인¹⁴C-표지된 아세만난 200mg/200ml의 수성 용량을 암캐(약 20mg/kg)에게 투여한다. 혈액, 뇨 및 변 샘플을 48시간 이상의 적절한 간격을 두고 취한다. 기관 및 조직 샘플은 동물을 희생시킨 후 취하여, 모든 샘플을 신틸레이션 분광계를 사용하여 방사활성을 분석한다.

아세만난의 역학 양태는 대부분의 약리학적 제제에서 볼 수 있는 바와 같은 일반적인 것이다; 하지만, 이의 생물학적 반감기(t 1/2)는 특별히 길다. 현저한 흡수가 3가지 경로의 투여에 의해 발생한다. 최대 혈중 농도는 정맥내 주사에 이어, 복강내 주사하고 경구 투여한 후 성취된다. 정맥내 주사후 즉시 200㎍/ml의 최대치를 나타내는 혈중 농도는 50 내지 60시간의 t 1/2로 감소하며; 혈장 농도는 혈액 농도의 약 두배이다. 비교해보면, 복강내 주사 후 혈중 농도는 24시간에 45㎍/ml에서 피크를 이룬 다음 정맥내에서 나타나는 바와 유사한 속도로 감소한다; 사실상, 혈중 농도는 8시간만 지나면 거의 90% 최대치에 이르게 된다. 경구 투여로, 혈중 농도는 3시간 후 측정가능하고 4 내지 5㎍/ml에서 피크를 이룬다. 혈액내에서의 비교적 오랜 반감기를 기본으로 하여, 3개의 반감기에 요구되는 시간을 간주하는 경우 약 7일의 치료학적 투여 간격이 합리적이다.

방사표지된 아세만난은 복강내 또는 정맥내 주사 후 간 및 비장에 주로 분포된다. 간, 골수, 흉선 및 임파절이 경구 투여후 주요 분포 부위이고, 이러한 발견은 아세만난에 대한 작용의 면역학적 부위와 일치한다. 48 내지 52시간 후 선별한 조직내 방사표지된 화합물의 수준은 정맥내 주사후 뇌에서의 최저 약 1㎍/g 내지 비장에서의 최고 85㎍/g의 범위이다. 흥미있는 것은, 뇌 및 척수에서의 농도가 비경구 투여와 비교하는 경우 경구 투여후 보다 높다(약 3㎍/g 조직). 이것은 첫 번째로 통과하는 동안 간이 중합체를 보다 작은 분자량 분획으로 부분 분해시킴으로써, 그것이 혈액-뇌 장벽을 투과시킬 수 있게 하기 때문이다.

요약하면, 임상 약력학 견지에서, 데이타는¹⁴C-표지된 아세만난이 (1) 연구된 모든 경로에 의해 8시간 이내에 피크 혈중 농도에 도달하고, (2) 비교적 오랜 생물학적 반감기를 가져 7일의 치료학적 투여 간격을 가능케 하며, (3) 중추신경계를 포함하여 평가된 모든 조직계에서 측정가능한 수준에 이를 수 있음을 나타낸다.

이들 약력학 데이타는 혈중 및/또는 조직내 아세만난 수준이 주사 또는 경구 투여후 시험관내에서 치료학적 항종양 또는 항바이러스 효과를 이룰 수 있는 공지의 수준을 배가시킬 수 있음을 나타낸다. 예를 들면 바이러스-감염된 노르만 뮤린 믹소육종(Norman Murine Myxosarcoma: NMM) 세포를 이식하고 24시간 이내에 1mg/kg 아세만난을 복강내 주사한 마우스는 NMM-처리된 대조 마우스[Peng et al., 출판을 위해 제출됨, 1990]에서의 0% 생존률과 비교하여 60일 후 35%의 생존률을 나타낸다. 1mg/kg의 복강내 용량에서 기대되는 피크 혈중 농도는 2㎍/ml(45㎍/ml x 1/20mg/kg)와 유사하다. 0.15㎍/ml의 농도의 T-임파구 배양물에 첨가된 아세만난(2.6^10-9M; 60,000MW)은 세포 독성 T-세포의 생성을 230% 증가시키고 생성된 세포독성 T-세포의 작용 수행력을 138%까지 증가시켜 이들이 감작화되는 표적 세포를 파괴한다[참조: Womble et al., Int. J. Immunopharmac. 10(8): 967-974 (1988)]. 세포 독성 T-세포는 NMM 세포와 같은 종양 세포에 대해 생성되는 것으로 여겨진다.

아세만난의 경구 투여후 수득되는 4 내지 5㎍/ml의 혈중 농도 또한, 이들이 시험관내에서 지도부딘(AZT)과의 최적 상승 효과를 이루게 하는 아세만난 농도에 상응하기 때문에 의미있다. 예를 들면, 0.001㎍/ml AZT 또는 3.2㎍/ml의 아세만난 단독은 HTLV-III_RFII바이러스로 감염된 CEM 세포의 생육성을 10% 이하로 증가시켰다. 함께 항바이러스 배합물의 보호 효과는 70%를 초과한다. 유사하게, 0.1㎍/ml AZT 및 1mg/ml의 아세만난의 배합은 80% 이상의 보호 효과를 나타낸다[참조; Kemp et al., 출판을 위해 제출됨. 1990].

따라서, 결론적으로, 이러한 약력한 연구는 시험관 내에서 연구되어 공지된 농도 이상의 아세만난 농도가 생체내에서 획득될 수 있음을 입증한다.

[실시예 6]

[HIV-1-감염된 환자에서 아세만난의 2가지 초기 임상 파일럿 연구 보고서]

사람 면역결핍 바이러스 제1형(HIV-1) 감염이 세계적으로 건강을 위협하고 있다는 발견 이전에, 항바이러스 약물을 제한적으로 개발하고 있었다. 개발 국가에 있어 모든 질병의 60% 이상이 규정된 바이러스 질환에 의해 유발된다는 인식에도 불구하고, 이러한 영역에 있어서의 진전은 거의 미흡했다. 대부분의 지역에서의 치료는 바이러스 복제를 방해하는 것보다는 증상 경감 및 편암함을 제공하도록 고안된 완화 수단의 적용으로 이루어진다. 완화 또는 증상 치료의 전체적인 무효성으로 인해, 범유행병적인 AIDS 질환은 HIV의 복제 사이클을 간섭하도록 표적화된 신규한 항바이러스 화합물로의 초유의 연구를 시작하게 되었다.

사람 면역 결핍성 바이러스인 경우, 바이러스-암호화 역전사 요소를 억제하는 항바이러스 제제 계열인 2', 3'-디데옥시뉴클레오사이드 동족체의 합성 및 개발로 대부분의 관심이 집중되었다. 이들 화합물중 하나인 AZT는 AIDS 치료에 대해 승인된 유일한 약물이다. 불행하게도, 수많은 연구가 밝힌바에 의하면 이 화합물은 생체내에서 극도의 독성을 나타내고 그의 효능은 시험관내에서는 높음에도 불구하고 생체내에서 상당히 낮다[참조: Richman et al., N. Engl. J. Med. 317:192-197 (1987)].

두가지 연구는 아세만난에 대한 사람 면역결핍성 바이러스 제1형(HIV-1)의 반응을 평가하였고 실험수치가 치료에 대한 반응을 예견하는데 사용될 수 있는 지의 여부를 측정하였다. 프로토콜은 개인 내과의의 연구 신약 사례로서 FDA에 제출되어 기관[Institutional Review Board of the Dallas-Ft. Worth Medical Center]에 의해 승인되었다.HIV-1 항체 포지티브이고 증상을 나타내는 환자를 매일 약 400 내지 800mg의 경구용 아세만난으로 치료하여 변형된 월터 리드(MWR) 임상 스코어 측정을 사용하여 임상적으로 평가하였다. CD4/CD8 임파구 계수 및 HIV-1(p24) 코어 항원 수준은 면역 경쟁성 및 활성 바이러스 하중을 나타내었다. 첫 번째 연구에서, 15인의 원래 환자는 평균 NWR 5.6을 나타내지만, 치료 350일 후 생존한 13인에서는 평균 1.8의 수치를 나타내었다. 10명 환자에서의 CD4 수준은 90일 이내에 346/㎣에서 471/㎣으로, 180일에는 610/㎣으로 증가하였다. 15명의 환자중 5명은 검출가능한 혈청 코어 항원을 갖고; 350일까지는 13명중 3명만이 검출가능하였으나 혈청 항원을 감소시켰다. 이러한 첫 번째 연구로부터의 데이타는 CD4 및 혈청 항원 수준 수치가 아세만난에 대한 반응을 예상할 수 있음을 시사한다. 26명 환자에서 실시한 두 번째 연구는 이를 확인해준다. 응집 그룹은 출발시에는 평군 MWR 값 3.0을 나타내고 그 후 90일재 평균 1.8을 나타낸다. 16명의 반응자의 CD4 수준은 이 기간중에 313/㎣에서 372/㎣으로 상승하였으나, 다른 10인에서는 63/㎣에서 77/㎣까지만 상승하였다. 우세적으로 반응하는 것으로 예견된 16명중 15명은 상승된 MWR, 증가된 CD4 수 및 항원 감소를 나타내었고, 이는 면역억제 정도 및 바이러스 하중이 치료에 대한 반응에 영향을 끼침을 나타낸다.

[실시예 7]

[증상성 및 무증상 HIV 환자중에서 아세만난 단독 및 AZT와 함께 수행한 상 II 연구]

47명의 HIV ＋ 환자(23명 무증상 환자, 24명 ARC 환자)를 아세만난의 이중-블라인드 무작위 상 II 연구에 참여시켰다. 프로토콜은 브뤼셀의 성 피엘(St. Pierre) 병원의 관련 윤리 위원회의 승인을 받았다. 동시적 AZT 요법을 병행하거나 병행하지 않은 상태에서 안전성 및 내성을 평가하기 위하여, 아세만난을 1000mg의 1일 용량으로 24주 동안 투여한다(125mg의 캅셀 2개, 1일 4회). 23명의 무증상 환자를 맹목적으로 배치시켜 아세만난(11명 환자. 그룹 1) 또는 위약(12aud 환자, 그룹 2)을 투여한다. 연구중에 매일 AZT 1000mg을 투여받은 24명의 ARC 환자중, 12명의 환자(그룹 3)는 또한 아세만난 1000mg(125mg의 캅셀 2개, 1일 4회)을 투여받고 12명 환자(그룹 4)는 또한 위약을 투여받는다. 47명 환자중 33명(70%)이 24주 연구 기간을 완료하였다(4개 그룹에서 각각 6, 9, 9 및 9). 환자수의 감소 이유는, 임상적 전개(8명 환자: 3, 3, 0, 2), 환자 자신의 의지(5명 환자: 2, 0, 2, 1) 또는 사망(그룹 3에서 1명의 환자가 자살) 때문이다. 부작용 또는 열악한 내성으로 인해 프로토콜로부터 탈락되는 환자는 없다. AZT 요법으로 인해, 그룹 1 및 2와 3 및 4 사이에는 약물 부작용, 주로, 오심 사례에 있어 통계학상 현저한 차이가 존재한다. 아세만난 그룹(1 및 3)과 위약 그룹(2 및 4) 사이에는 차이가 없다. 혈액학적 데이타를 연구 초기에 4개 그룹 사이에서 통계학적으로 비교한다. 제24주에 AZT를 병행 또는 병행하지 않은 환자 사이에서 적혈구 세포 수 및 평균 혈구 용량에 있어 통계학상 현저한 차이가 존재하지만, 위약 및 아세만난 환자사이에는 차이가 없다. 4개 그룹중에는 간 또는 신독성이 없다.

AZT 및 아세만난으로 처리한 12명의 환자(그룹 3)는 AZT 단독으로 처리한 환자(그룹 4)(초기 평균 K=81, 종료시 83)와 비교하는 경우 치료휴 카르토프스키(Karnofsky) 스코어 K에 있어 통계학상 현저히 상승하였다(p 0.008)(초기 평균 K=84, 종료시 90). AZT 단독으로만 처리한 2명의 환자는 배합 요법하에서는 없었던 AIDS를 발병시켰으나(1건 카포시, 1건 식도성 칸디다증) 부작용 박생에 관해서는 그룹 3과 4 사이에 통계학상 현저한 차이가 존재하지 않는다. AZT-처리한 환자의 CD4 세포 수의 비교는 배합 요법으로 처리한 환자중에서의 연구 말기에 상당히 큰 상승(p=0.01)을 나타낸다(그룹 4의 초기 145/㎣ 및 종료시 252/㎣과 비교하여 그룹 3의 초기 263/㎣ 및 종료시 369/㎣의 평균 CD4). 본 발명자들은 아세만난이 생물학적 독성이 없는 매우 널리 허용되는 화합물이고 ARC 환자 중에서 아세만난은 HIV 감염의 관리에 있어 AZT에 대한 보조적 요법으로서 작용한다고 결론지었다.

[실시예 8]

[시험관내 아세만난에 의한 HIV-1 복제 및 병인론의 농도-의존적 억제]

말초 혈액 단핵(PBM) 세포 및 2가지 규정된 CD4+ 세포주인 MT-2 및 CEM-SS를 HIV-1 감염에 대한 표적 세포로서 사용하고 다양한 농도의 아세만난으로 처리한다. 생육성은, 트립판 블루 염료-배출 시험에 의해 또는 생육세포에 의한 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드]의 포르마잔으로의 대사적 전환에 의해 측정한다. 바이러스 복제 및 하중은 POL 유전자로부터 제조된 HIV-1 프로브와 세포-관련된 바이러스 RNA 및 세포-유리된 RNA의 하이브리드화에 의해 측정한다. 아세만난 처리에 의한 PBM 세포의 보호는 농도 의존성인 것으로 보인다. 보호율(%)은 3.2 내지 100㎍/ml 아세만난 처리한 세로에 있어 14 내지 100% 범위이다. HIV-1 감염된 MT-2 세포의 아세만난으로 처리에 의한 보호는 농도-의존성 뿐 아니라 다중적 감염(multiplicity of infection; MOI) 의존적이다. MOI=0.01로 감염되어 62.5㎍/ml 아세만난으로 처리한 CEM-SS 세포 보호율은 85%를 초과한다. 세포 생육성에서의 증가뿐 아니라, 합포체 형성의 농도-의존적 감소가 관찰된다. 합포체는 62.5㎍/ml 이상의 아세만난으로 처리한 배양물 중에서는 검출할 수 없다. 바이러스 복제에 있어 농도-의존적 감소 또한 처리된 PBM 세포에 대해 관찰되었다. 62.5㎍/ml 이상 농도의 아세만난으로 PBM 세포를 처리하여 검출가능한 세포-관련된 바이러스 RNA를 95 내지 100% 감소시킨다. 62.5㎍/ml 이상 농도의 아세만난으로 바이러스-감염된 CEM-SS 세포를 처리하여 세포-유리된 바이러스의 60% 이상의 감소를 야기시켰다. 아세만난 처리는 바이러스-유도된 세포 융합을 억제하고, 감염된 세포 생육성을 증가시키며, 바이러스 하중을 감소시키고 유리 바이러스의 생산 및/또는 방출을 억제한다. 아세만난으로 인한 세포 독성은 어떠한 시험 농도로도 관찰되지 않는다.

[실시예 9]

[AZT(지도부딘)와 배합한 아세만난의 상승적 항바이러스 효과]

AZT와 아세만난 배합물의 보호 작용은 0.03의 MOI에서 HIV-1-감염된 MT-2 세포를 사용하여 시험관내에서 측정한다. 2가지 약물의 체커보어드 적정은 상승적 보호 효과가 발생했음을 나타낸다. 125㎍/ml 이하 농도의 아세만난이 이러한 관점에서 가장 효과적이다.

일부 형태의 배합 화학요법은, 그의 장기적 독성 효과를 제한시키고 내성 HIV 균주의 추가 발달을 우회시키면서 AZT의 효능을 증가시키기 위해 요구됨을 명백히 인지할 수 있다. 이와 같은 이유 및 AZT와 함께 투여하는 경우 임상적 HIV 감염에 대한 아세만난의 명백히 유리한 작용으로 이들 2가지 화합물이 시험관내 HIV 복제에 있어 상승적 억제 작용을 나타내는지의 여부의 측정이 결정된다.

바이러스 균주-HIV-1의 HTLV-IIIB 균주는 메릴랜드 베데스다 NIH의 알. 갈로(R. Gallo) 박사로부터 수득한다. 바이러스 스톡은 바이러스를 H9 임파 세포내에서 증식시켜 제조한다. 바이러스의 스톡 제제를 -80℃에서 보관한다. 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50)/세포-유리 바이러스 혼주물 스톡 ml을 MT-2 세포를 사용한 종말점 적정에 의해 측정한다. 감염 다중성(MOI)은 리드 및 무엔히(Reed and Muench) 방법으로 측정한다.

세포주-MT-2 세포를 2mM L-글루타민과 15%(v/v) 태송아지 혈청이 보충된 RPMI-1640 중에서 증식시킨다. MT-2 세포는 천연적으로 그들의 표면 상에서 CD4를 발현시킴으로써 HIV-1 감염에 있어 우수한 표적 세포가 된다. 추가로, 이들은 낮은 바이러스 복제 수준에서 세포 용해를 급속하게 진행시킨다.

항바이러스 활성의 1차 시험-MT-2 세포를 먼저 폴리브렌(2mg/ml)으로 30분 처리한 후 MOI 0.03에서 HIV로 감염시킨다. 바이러스 흡수 후, 세포를 펠렉화하고 완저 배지중에 재현탁시킨다. 그런 다음 감염된 세포를 96-웰 미세역가 평판내로 분배한다(2 x 10⁴세포/100μl/웰).

각각의 약물을 2mg/ml의 스톡 용액으로부터의 배지중에서 6회 연속 1/2 log₁₀의 희석비로 희석시킨다. AZT는 10μg/ml의 최고 농도로부터 0.032μg/ml의 낮은 농도까지 시험한다. 아세만난을 500μg/ml로 시험하고 15.62μg/ml의 저농도까지 점차 희석시킨다. 유사 검정을 3회 수행하고, 약물 세포 독성을 유사 농도에서 2회 측정한다. 대조는 비감염, 비처리 세포 배양물 및 바이러스-감염된 비처리 배양물을 포함한다. 평판을 공기중 5% CO₂의 함습 대기중에서 7일간 배양한다. 감염 후 제 7일에, MTT(450μg/ml)를 시험 평판에 부가하여 세포 생육성을 측정한다. 그런 다음, 0.01N HCl중 10% 나트륨 도데실 설페이트 용액을 가해 생성된 MTT 프로마잔을 용해시킨다. 색 강도는 생성된 포르마잔 양의 함수이고, 이는 각각의 웰중의 생육 세포수에 비례한다. 평판을 Vmax 평판 판독기(Moleculer Devices, Inc.)상에서 570nm의 파장하에 판독한다. 세포 생육성 변화율(%)은 하기 식으로 계산한다:

상기식에서, TI는 처리된 감염 세포에서의 광학 밀도(OD)이고, TO는 처리된 비람염 세포에서의 OD이며, OI는 비처리 감염 세포엣의 OD이고, OO는 비처리 비감염 세포에서의 OD이다.

아세만난-AZT 배합물의 항바이러스 활성-다양한 정도로 AZT와 배합한 아세만난의 항바이러스 활성을 상기한 미세;역가 감염 검정법을 사용하여 평가한다. 각각의 혼합물에 대해, 정의된 양의 시험 화합물을 RPMI-1640중에 용해하고, 각각의 희석물 0.1ml를 시험 웰에 가한다. 배합물을 2회 평가하고, 처리된 비감염 대조를 사용하여 약물 세포 독성을 측정한다. 각각의 화합물 또한 비-세포 독성 농도에서 단독으로 평가한다. 따라서 AZT는 0.32 내지 10㎍/ml의 농도 범위에서 시험되고, 아세만난은 15.62 내지 500㎍/ml의 농도 범위에서 평가된다. 세포 생육성 변화 %는 상기와 같이 측정한다.

HIV-감염된 MT-2 세포 생육성에 대한 AZT-아세만난 배합물의 효과는 제1 및 제2도에 나타나 있다.

아세만난 단독으로는 60㎍/ml의 용량에서 최대 40% 보호를 나타낸다. 보다 높은 용량에서 보호 효과는 일정하지 않다. AZT 단독은 0.03 내지 0.32㎍/ml의 용량 범위에서 최대 60 내지 67% 보호를 나타낸다. 하지만, 세포 변성 효과는 15.62 내지 250㎍/ml 아세만난의 존재하에 0.32㎍/ml AZT에 의해 완전히 사라질 수 있다.

여기서의 데이타는 AZT 및 아세만난이 시험관내 HIV-1으로 감염된 MT-2 세포상에서 상승적 보호 작용을 일으킴을 제시한다. 이들 결과는 동일 효과에 대한 임상적 증거를 지지한다. 정의상 상승적 효과란 화합물의 혼합물의 효과가 단독으로 작용하는 경우 이들의 효과의 합보다 더 큼을 의미한다. 따라서 0.01㎍/ml AZT를 15.62㎍/ml 아세만난과 혼합하는 경우(이들 각각 하나로는 보호성을 나타내지 않는다) 32%의 세포 생육성을 나타낸다. 사실상, 31.25 및 15.62㎍/ml의 비보호적 아세만난 농도에서, 0.1㎍/ml AZT 보호 효과에 있어 현저한 상승을 관찰할 수 있다.

0.32㎍/ml AZT(65% 보호)를 62.5㎍/ml 아세만난(40% 보호)과 혼합하는 경우, 혼합물은 100% 보호를 나타낸다. 명백히, 100% 이상의 생육성은 검출할 수 없기 때문에 이 경우 어떠한 상승적 효과도 은폐되지만 효과는 부가의 의사 외형을 나타낸다.

상승적 효과의 외형은 AZT 및 아세만난이 바이러스 사이클의 상이한 단계에서 바이러스 복제를 간섭하는 것으로 나타난다. 그 결과, HIV 복제 사이클중 한 단계에서 치사량 이하의 적중(hit)은 다른 단계에서의 적중을 보상할 수 있다. 두 적중의 조합은 합하여 바이러스에 치명적 작용을 나타낸다. 물론 AZT는 바이러스의 역전사효소 억제제로서 널리 공지되어 있다. 한편, 아세만난은 글리코실화 및 HIV 엔벨로프 가공을 방해할 수 있다.

[실시예 10]

[피부성 궤양 치료에 사용된 아세만난]

83세의 여성 환자, TB는 왼쪽 발의 측면 가장자리에 직경 25mm의 궤양을 앓고 있다. 궤양은 수개월 동안 진행되어 왔으며, 여러 가지 치료 요법에 대해 반응하지 않았다.

환부를 미합중국 특허 제4,735,935호의 실시예 3의 생성물 및 미합중국 특허 제4,735,935호의 실시예 7의 생성물로 1일 3회의 치료 스케쥴을 사용하여 치료한다. 세정된 환부를 미합중국 특허 제4,735,935호의 실시예 2의 생성물로 15분동안 침지시킨다. 환부로부터 과량의 생성물을 건조 멸균된 4X4 거즈로 흡수시킨다. 이어서, 미합중국 특허 제4,735,935호의 실시예 7의 생성물을 환부를 피복시키고 드레싱을 바꾸어줄 때 환부에 탈수가 일어나지 않도록 하기에 충분한 양으로 도포시킨다.

환부 치유 진행전도는 환부 결합 부위를 시차 촬영 및 면적계로 측정한다. 환부 봉합의 진행 정도는 표 11에 나타낸다.

실제로 표피 결함 부위가 12주만에 봉합되며, 14주가 되면 완전 봉합된다.

[실시예 11]

[삼차 신경통 치료제로서 사용된 아세만난]

제5의 삼차 신경통 또는 신경통은 삼차 신경의 하나 이상의 분지에 걸친 심하고 참기 어려운 통증을 특징으로 한다. 이러한 통증은 통상적으로 일시적이며 소위 발통대(trigger zone)로 불리는 면의 몇몇 영역을 건드림으로써 진정시킬 수 있다.

이러한 통증을 수반하는 질병의 원인 및 치유는 공지되어 있지 않다. 이러한 질병을 치료하려는 수회의 시도는 거의 성공하지 못했거나 전혀 성공하지 못했다. 각종 치료법에는 진통제, 페니토인, 두골을 이탈할 때 관련된 신경 분지의 말초 결출 및 98% 알콜의 반월 신경절내로의 주입이 포함된다.

보다 강력한 치료 --- 신경절에 근접한 신경의 감각성근의 분절 ---는 환자에게 분절된 신경에 의해 제공된 영역에 있어서의 무감각증을 영구적으로 남겨준다. 또 다른 최근의 치료 시도는 카바마제핀 및 페놀리오펜딜레이트 주입법을 사용한다. 그러나, 이들 주입은 불쾌한 혼몽(numbness)과 심한 부작용에 의해 복잡해질 수 있다.

전술한 어떠한 치료법도 바람직하지 못하다.

삼차 신경통을 앓고 있는 43세의 여자를 진단한다. 감염된 영역은 오른쪽 삼차 신경의 제1 및 제3분할을 포함한다.

환자는 오른쪽 머리카락을 빗거나 솔질함으로써 통증이 유발될 수 있다. 이 환자는 디아제팜(Valium), 항히스타민제, 진통제, 프로프라놀롤 하이드로클로라이드(Inderal) 및 페노바르비탈로 치료하는데 실패했다. 이 환자는 발병 이래로 통증이 없는 날이 없었다고 말했다.

제안된 치료법은 미합중국 특허 제4,735,935호의 실시예 2의 생성물 3개월 동안 1일 1 내지 2oz로 마심을 포함한다. 이 기간이 경과된 후, 치료법을 평가한다.

환자의 통증은 치료 개시 2주 이내에 현저히 감소된다. 환자는 수주 동안 편안했다고 말했다. 그러나, 환자가 상기 생성물을 마시지 않고 지낸 2주 동안에는 증상 및 통증이 재발되었다. 그러나, 약제를 다시 복용한 후, 수일이내에 통증이 사라졌다. 다음 수주동안, 그녀는 다시 편안함을 느꼈다.

6개월 이상 동안 중단없이 매일 상기 생성물을 마신 이후에 환자는 통증 유발없이 머리카락을 솔질하거나 빗을 수 있다고 얘기했다. 환자의 외관은 좋아졌으며 환자는 이전보다 편안하다고 말했다.

[실시예 12]

[염증성 장 질환에 있어서 아세만난을 사용하는 탐구 임상 파일럿 연구]

염증성 장 질환[inflammatory bowel disease (IBD)]은 크론병, 궤양성 대장염 및 위장관의 기타 증상에 대한 집합적인 용어이다. 크론병은 주로 회장 및 결장에서 발병하며, 반면에 궤양성 대장염은 결장으로 제한된다. IBD의 병인락을 설명하기 위해 3가지 이상의 신빙성 있는 가설들이 제안된 바 있다. 한 가설은 서서히 생장하는 세균 또는 바이러스와 같은 미지의 병원체가 면역계를 유발하여 만성 염증성 반응을 개시한다는 것이다. 두 번째 가설은 상기와 동일한 과정이 음식물에 내포된 오염물 또는 환경 오염물질과 같은 독성 물질에 의해 야기된다는 것이다. 제3의 가설은 염증성 반응이 자가면역 증상이라는 것이다. 그러나, 이들 질병의 정확한 원인(들)은 밝혀지지 않았다.

A. 환자 선택

이 연구 프로토콜은 FDA에 한 내과 의사의 연구 면역 신약으로서 제출되어 달라스-포트 워드 메디칼 센터의 IRB(Institutional Review Board)에 의해 승인되었다. 환자는 나이, 성별, 종족 또는 인종적 배경과 관계없이 선택하며, 모두 지원자이다. 각각은 내과의사가 브리핑하는 통지된 동의서를 받아 통지된 동의서 양식에 사인을 해야 한다.

하기 증상 및 IBD 증상이 병합되어 나타나는 환자만이 허용된다:

1. 설사(장 운동수)

2. 변에 혈액이 섞여 배출됨(잠복혈)

3. 과도한 점액 생성

4. 자발적 복통

5. 촉진시 복통

6. 연속적 경련

7. 기타(체중 감소 등)

상기 증상은 단일 증상을 나타내는 경우를 1. 모든 증상을 나타내는 경우를 7로 하여, 0 내지 7점의 임상 평점 평가시에 사용된다. 0의 평점은 환자에 아무런 증상을 나타내지 않음을 나타낸다.

B. 내시경 평가

내시경을 사용하여 하기 기준 평가에 따라 치료전 및 치료후의 환자를 평가한다:

1. 궤양화

- 융합성

- 발진성

- 선상

-분할성

2. 충혈

3. 삼출

4. 기타

동일한 숙련된 내시경 검사자가 분포 및 심도에 따라 점액 외관을 평가한다. 0의 평점은 환자의 점액 외관이 정상임을, 5의 평점은 가장 심각함을 나타낸다.

C. 조직학적 평가

조직학적 평가 평점은 하기와 같이 기록한다: 삼출물, 궤양화 점액, 부종, 혈장세포 임파구, 다형핵 세포, 호산구, 육아종, 음와 농양, 섬유증, 기타.

상기 임상적, 내시경 및 조직병인학적 기준치를 사용하여 IBD의 명시를 등급화하고 아세만난 치료에 대한 반응을 정량화한다. 내시경으로 물리적으로 검사하고 조직학적으로 샘플링하여 규칙적으로 스케쥴화된 왕진을 제한한다. 통상의 치료도중 원인이나 충격없이 어떠한 때라도 환자에게 약제 투여를 중단할 수 있다. 아세만난은 캐링톤 래보러토리즈, 인코로레이티드로부터 공급된다.

D. 임상 결과

9명의 IBD 환자를 허용하여 매일 캅셀중 200mg의 아세만난으로 치료한다. 환자의 나이 범위는 14 내지 46세이며, 4명의 여성과 5명의 남성이 포함된다. 전형적으로는, 환자들은 복통, 설사 또는 다수의 장 운동 증상을 나타내며, 배변에 통상적으로 점액 생성이 증가된 혈액 또는 수성 물질이나 또는 이들 원소들이 배합된 물질이 존재한다. 초기 내시경 검사에 의하면 점액성 취성을 갖는 혈관 출혈로부터 국소적, 광범위한 융합성 궤양, 즉 다발경-대장염(pan-colitis)으로의 점액 변화를 갖는 스펙트럼이 나타난다. 장 생검의 조직학적 검사에 의하면 손상 범위가 만성 염증성 세포의 비-특이적 증가로부터 다수의 다형핵 세포 및 호산구를 갖는 진성 궤양에 이르는 것으로 나타났다. 두 환자는 미세육아종 및 음와 농양을 갖는다. 모든 환자가 하나 이상의 아줄피딘, 프레드니손, 6-머캅토퓨린 및 플라질(Flagyl)을 포함하여 통상의 시약에 비반응성인 것으로 나타났다. 이모듐 및 정신안정제를 종종 상기 시약에 가한다.

모든 환자에 있어서 아세만난 약제에 대한 반응은 균일하게 바람직하며, 평점이 모두 증진되었다. 약제 치료전 및 약제 치로후의 평균 평점은 하기와 같다:

치료전 평균 임상 평점 4.56

(환자 9명의 평균치)

치료후 평균 임상 평점 0.44

(환자 9명의 평균치)

치료전 평균 내시경 평점 3.88

(환자 8명의 평균치)

치료후 평균 내시경 평점 0.00

(환자 2명의 평균치)

치료전 평균 조직학적 평점 6.25

(환자 8명의 평균치)

치료후 평균 조직학적 평점 N/A

(지원자 모두 생검을 거부함)

연구도중 아세만난에 기인한 부작용은 없는 것으로 관찰되었다. 자신들이 앓는 질병 발현이 상당히 심했던 몇몇 환자들은 2 내지 5일 이내에 실제로 통증 및 증상이 없는 것으로 말했다. 다른 환자들은, 특히 국소적 분할 질병(크론병 및 회장염)을 갖는 환자는 아세만난의 효과가 서서히, 보다 덜 급격하게 나타난다. 환자 모두 치료후 생검을 거부했으며, 2명의 환자만이 치료후 내시경 검사를 허용했다. 환자들에 의해 하기 이유들이 제시되었다:

(1) 생검 절차가 불편하고 (2) 개선된 증상으로 인해 비용이 정당하지 않다.

두 환자는 우연히도 증상이 나타날 때에만 아세만난을 흡입하는 에피소드가 있었다. 둘 다 약제를 사용한 지 24 내지 48시간만에 증상이 경감된 것으로 말했으나, 아세만난 치료를 지속하지 않은 지 4 내지 6주만에 약한 증상이 재현되었다. 후속적으로, 2 내지 3일 동안 다시 아세만난을 치료한 경우 증상이 완화되었다. 아세만난은 질병의 급성 염증 상태에 있어서 급격한 임상적 개진을 제공한다

[실시예 13]

[홍역 바이러스에 대한 아세만난의 시험관내 효과]

홍역 바이러스를 다양한 농도의 아세만난으로 배양시킨 후 VERO 세포의 감염성 배양물에 가한다. 이 실험의 목적은 아세만난이 감염성 세포 배양물내로 도입시키기 전에 감염을 억제하는지 또는 아세만난으로 처리된 홍역 바이러스를 불활성화시키는지를 측정하기 위한 것이다. 아세만난-처리된 바이러스는 2.5mg/ml의 역치 농도에서 바이러스의 세포성 질환 효과(CPE) 부재에 의해 증명된 바와 같이 VERO 단층을 감염시키지 않는다. CPE의 완전 부재는 바이러스 접종물중 5mg/ml의 아세만난에서 수득된다.

아프리카산 그린(Green) 원숭이 신장 세포(VERO 세포)를 표적 세포로서 사용한다. 홍역 바이러스를 적정하여 바이러스/세포 단층상에서 30 내지 50 반점/ml(20 TCID 단위/0.05ml)의 반점 총수를 수득한다. 이어서, 아세만난을 상이한 농도로 이러한 고정된 양의 바이러스를 함유하는 배지내로 도입시킨다.

아세만난 농도는 완전 조직 배양 배지에서 이루어진다. 약독화된 루벨라 바이러스 백신 분취량을 각각의 적정에 사용한다. 혼합물을 1시간 30분 동안 30℃에서 예비 항온처리하고 미리 제조한 조직 배양 챔버내 VERO 단층에 가한다.

홍역 바이러스와 융합성 VERO 세포 단층상에서 만 5일 동안 배양한 각종 농도의 아세만난의 합한 결과는 표 12에서 제공된다.

각종 농도의 아세만난으로 반복 챌린지한 경우 보호성 농도는 2 내지 4mg/ml에서 수득되며, 이는 홍역 바이러스 감염성 억제를 위한 전이 구간(transition zone)이다. 표 12를 주지한다. 5mg/ml의 아세만난 농도는 아세만난으로 예비 처리한 홍역 바이러스로 챌린지한 VERO 세포 단층에 대해 보호성을 일정하게 제공한다.

이 파일럿 연구에서, 홍역 바이러스에 대한 아세만난의 효과는 1) VERO 세포 단독(네가티브 대조군), 2) 홍역 바이러스를 접종시킨 VERO 세포(포지티브 대조군) 및 3) 아세만난으로 예비처리한 홍역 바이러스를 접종시킨 VERO 세포를 비교함으로써 평가한다. 반점 총수 분석에 의해 측정한 바와 같이 아세만난-예비처리된 바이러스-감염된 배양물(#3)에서 반점 생성이 현저히 감소된다. 바이러스 감염으로부터 배양물의 완전 보호는 바이러스를 5mg/ml의 아세만난으로 예비처리한 경우 수득된다.

[실시예 14]

[VERO 세포 배양물중 홍역 바이러스 감염을 역전시키는 아세만난의 수행능]

다양한 기간(0.5 내지 6시간) 동안 40 TCID/ml의 홍역 바이러스를 함유하는 배지에서 VERO 세포를 배양시킨 후 아세만난 5mg/ml를 부가한다. 세포를 홍역, 바이러스에 노출시킨 후 아세만난과 함께 배양하는 경우 감염으로부터 VERO 세포를 보호하지 못한다.

VERO 세포를 40 TCID/ml의 홍역 바이러스를 함유하는 배지와 함께 0.5 내지 6간 동안 배양한다. 이어서, VERO 세포를 새로운 배지로 세척하여 결합되지 않은 바이러스를 제거한다. 이어서, 5mg/ml의 아세만난을 함유하는 배지를 배양물에 가하고 배양물을 세포병리학에 대해 5일 후에 검사한다.

이 실험의 결과는 표 13에 나타난다.

1시간 30분의 아세만난 예비배양 배양물의 감염물이 보다 낮음이 주목된다. 보다 장기간 동안 아세만난으로 예비배양된 배양물에서 VERO 세포가 임상적으로 상당히 보호되는 것으로는 나타나지 않는다.

홍역 바이러스와 함께 예비 배양시킨 VERO 세포는 감염기가 종결된 후 5mg/ml의 아세만난을 부가함에 의해서 감염으로부터 크게 보호되지는 않는다.

[실시예 15]

[통상의 가금류에 있어서 보호성 면역 반응 유발에 대한 아세만난 효능의 판정 프로젝트]

전국적으로 가금업계에서 질병 및 관리에 관련된 문제로 인한 비용이 매년 20억 달러를 초과하여 손실된다. 감염성 점액낭 질환 바이러스(IBDV)와 같은 병원체인, 면역억제와 관련되어 치사 및/또는 질병을 유발시키는 레트로바이러스는 가축업계에 심각한 경제적 손실을 야기시킨다. IBDV는 특정하게 면역계의 액소성 암(humoral arm)의 선택적 파괴를 야기시키는 페브리시우스 점액낭내 전구체 B-세포를 표적으로 한다. 이는 후천성 면역 결핍증(AIDS)와 유사한 면역억제 상태를 야기시킨다.

가금업계는 일상적으로 생 바이러스를 경구 투여하거나 불활성화된 바이러스를 피하 주사함으로써 IBDV에 대한 양들을 예방 접종한다. 두 예방접종 방법이 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있지만, 백신의 사용과 관련된 고유 문제점이 도입된다. 생 바이러스 백신은 특이 균주에 대한 보호성 면역 반응 유도에 있어 보다 효과적이나, 바이러스 자체가 병독성을 회복하거나 백신 균주 복제가 일시적으로 면역억제하여 양의 2차 병원균에 대한양 집단의 감염성을 증가시킬 수 있다. 사멸한 바이러스 백신은 생 바이러스 백신과 관련된 동일한 문제점을 갖지 않으나, 면역 반응성이 감소되고 용량 의존적이다. 복합적인 하이테크 용액을 포함하는 예방 접종에 대한 다수의 대안적 방법이 평가되고 있으나, 사멸한 바이러스 백신중 추가 성분의 혼입에 의한 면역 반응의 직접적 변동은 잠재적으로 단순한 용액을 의미한다.

예비관찰을 기본으로 아세만난은 면역조절제로서 작용하며, 이러한 프로젝트는 이 화합물이 사별된 감염성 IBDV 백신에 대해 면역 반응을 유도하는지를 측정하기 위해 고안된 것이다.

A. 동물

달걀(구입원: SPAFAS, Inc)로부터 부화된 병아리를 모든 실험에 사용한다. 달걀이 부화되고 1일이 지난 병아리들을 호스폴 유니츠(Horsfall Units)에 둔다.

B. 항원

버사박(BursaVac) K(오일 유제)-사용된 아세만난: 로트 #80226-001; 1 또는 2mg/ml로 재현탁시킴(실험고안 참조).

C. 실험 고안:

연구 #1(그룹 1). 연구 #1에 대해서는 25마리의 생후 2주된 병아리를 5개의 그룹으로 분류한다. 각각의 그룹의 병아리를 하기와 같이 예방 접종한다:

그룹 1-모의 접종한 대조군

그룹 2-0.5ml의 오일 유제 백신으로 등에 피하 접종함.

그룹 3-물중에 현탁된 0.25ml의 아세만난(0.5mg/ml)와 0.25ml의 오일 유제 백신(구입원: Bio-Burs K: Key Vet., Gainesville, GA)의 1:1 혼합물로 피하 접종함.

그룹 4-산성수 중에 현탁된 0.5ml의 미세 캅셀로 경구 접종함.

그룹 5-0.5mg의 아세만난과 함께 산성수 중에 현탁된 0.5ml의 미세 캅셀로 경구 접종함.

연구 #2(그룹 2). 연구 #2에 대해서는 생후 1주일된 117마리의 SPF 병아리를 6개의 그룹으로 나눈다. 각 그룹의 병아리를 하기와 같이 예방 접종한다:

그룹 1-모의 접종한 대조군

그룹 2-물에 현탁된 아세만난 0.5ml(2mg/ml)으로 등에 피하 접종함.

그룹 3-0.5ml의 오일 유제 백신(구입원: Bio-Burs K; Key Vet., Gainesville, GA)으로 등에 피하 접종함.

그룹 4-물에 현탁된 0.25ml의 아세만난(1mg/ml)과 1:1로 혼합된 0.25ml의 오일 유제 백신으로 등에 피하 접종함.

그룹 5-물에 현탁된 0.25ml의 아세만난(2mg/ml)과 1:1로 혼합된 0.25ml의 오일 유제 백신으로 등에 피하 접종함.

그룹 6-0.5ml의 오일 유제 백신으로 등에 피하접종하며 물중에 현탁된 0.5ml의 아세만난(2mg/ml)으로 대퇴골 부분에 피하 접종함.

두 연구를 위해, 각각의 병아리로부터 일주 간격으로 혈청을 채취하고 혈청 IBDV ELISA 역가를 시판되는 아그리테크(AgriTech) IBDV ELISA 키트를 사용하여 측정한다. 플럭체크(FlockTech) 소프트웨어 프로그램(공급원: AgriTech Inc.,)을 역가 측정에 또한 사용한다.

D. 결과

병아리들은 물 또는 오일 유제에 현탁된 아세만난을 피하 또는 경구 투여한 결과 편안해 보였으며 부작용이 없었다.

연구 #1(그룹 1)의 경우, 예방 접종후 6주 경과 동안의 평균 ELISA 역가는 표 14에 제시된다.

제1 예방 접종 2주후, IBDV에 대한 역가가 오일 유제 또는 아세만난이 공급된 오일 유제로 처리한 병아리에서 증가되기 시작한다. 아세만난이 공급된 오일유제 백신으로 처리한 병아리는 전체 평균 역가가 오일 유제 백신으로 예방접종한 병아리의 역치보다 약 3.9배 더 높다. 예방 접종 3주 후에, 병아리를 재접종하면, 각각의 병아리는 제1예방접종시 제시된 동일한 항원 혼합물을 투여받는다. 제2예방 접종 1주후, 평균 역가 비율차는 약 4.1배로 증가된다. 제2예방 접종 2주후, 두 그룹에 대한 평균 역가가 피이크에 도달할 때, 이러한 비는 약 2.1로 하강한다. 제2예방 접종 3주후까지는, 예방접종시킨 두 그룹에 대한 평균 역가는 감소되기 시작하나, 오일 유제만으로 예비접종시킨 병아리에 대한 역가 감소는 보다 격심하며, 이의 역가 감소는 55%이며, 이에 비해 아세만난을 공급한 오일 유제로 예방 접종시킨 병아리의 역가 감소는 31%이다. 아세만난이 공급된 오일 유제로 처리한 새에서는 역가가 아세만난의 연장된 면역 자극 작용으로 인해 보다 높게 유지된다.

제2예비접종 3주 후, 오일 유제 백신 그룹(#2) 및 아세만난이 공급된 오일 유제 백신 그룹(#3)의 병아리를 다시 두 그룹(A 및 B)으로 나눈다. 그룹 A의 병아리는 동종의 생 백신 균주로 챌린지하고, 그룹 B의 병아리는 병독성 균주로 챌린지한다. 챌린지한지 3일 후, 병아리 모두를 부검한다. 백신 균주로 챌린지한 그룹 A의 병아리에서 면역계에 대한 효과는 없다. 그러나, 그룹 B의 병아리 모두는 조직학적 검사에 의해 증명된 바와 같이 병소가 있다. 이들 결과는 예기된 것이기는 하나, 제1예방 접종 만을 받은 병아리를 챌린지하는 경우 오일 유제 백신만을 접종한 병아리의 병소가 더 우세하게 관측되는 것으로 나타난다. 병아리를 생 바이러스 백신으로 예비 접종한 경우, 동종의 바이러스 챌린지에 내성이 있는 병아리의 임파 기관에서 병소가 나타난다.

연구 #2에 대해, 그룹 크기 및 예방접종 프로토콜을 변화시킨다. 표 15로부터 알 수 있듯이 결과는 일관성이 없다.

새들 사이의 차이를 초기에는 주사 2주후에 논평한다. 예기된 것보다 런트(runt) 수가 많으며, 밴딩(banding)시킨 병아리의 몇몇 부위에서 감염된 것으로 나타나고; 2차 세균 감염 외에 독소를 방출시키는 압박 괴사가 있다. 후자의 문제점을 피하고자 병아리를 다시 밴딩시키고 국소용 항생제로 처리한다. 그러나, 기술된 문제점은 아마도 총괄 면역억제를 야기하여 이 연구 결과를 무효화 할 것이다. 따라서, 실험을 종결시킨다.

연구 #2에 관련된 네가티브 인자에도 불구하고, 아세만난은 면역계의 총괄적 자극 효과, 즉, 아세만난 투여 부위로부터 멀리 떨어진 부위에서 투여된 시험 항원에 대해 증진된 면역 반응을 야기시킨다. 초기에는 아세만난이 오일 유제 백신과 혼합되어야만 하는 것 같았으나 항원 및 아세만난이 개별적으로 존재하는 경우에도 증진된 면역 반응이 유도되는 것 같다. 이러한 결과는 이들 화합물에 대한 적용 및 대안적 예방 접종 방법론을 전개시킨다.

아세만난은 보조 특성을 갖는다. 이는 체내에서 IBDV 항원의 영속 또는 유효한 발현을 증가시켜 림포카인을 방출시키고 임파구 반응을 증진시킨다.

[실시예 16]

[흡수 불량 증후군 치료에 사용된 아세만난]

사람의 흡수 불량 증후군은 결국에는 사망을 야기시킬 수 있는 소모성 증상을 초래할 수 있다. 착화 다당류 및 효소 억제 펩타이드를 함유하는 특정 입자를 식이로부터 중단시키는 경우 스프루우(sprue) 및 복강 질병과 같은 특정의 사람의 증후군을 경감시킬 수 있다. 이러한 식이 변화의 결과는 상기 증상을 경감시킨다. 그러나, 중요한 생리학적 문제가 환자에게 남겨져 있다; 소장 장 점막의 성숙이 세포 성숙에 필수적인 당단백질 합성 억제로 인해 저지된다. 이러한 소장 상호 작용의 실패는 흡수 표면을 감소시키고, 추가로 식이중에 존재하는 필수 아미노산, 지방산, 미네랄, 비타민 및 기타의 중요한 분자 물질을 흡수시키지 못한다.

만성 글루텐-민감성 스프루우로 인해 체중이 40파운드 이상 감량된 56세의 남성은 500 내지 800mg/일의 아세만난을 경구 투여한 후 만성 설사가 급격히 감소되어 점진적으로 체중이 증가되었다.

당단백질 합성에는 만노스가 필요하다. 식이에 추가의 만노스를 공급하는 경우 아마도 Km 속도를 변화시켜 당단백질 합성 속도를 증가시킨다. 효소 합성은 만노즈-대사 효소에 의해 리보좀/당단백질 합성을 촉진하는 결정적인 만노스 기질의 이용도에 의해 촉진된다. 이러한 당단백질의 합성 및 이용도 증가는 소장 점막 세포를 성숙시키고 스프루우 및 복강 질병과 관련된 증상을 감소시킨다. 또한, 당단백질 합성시 이러한 열역학적 변화는 현재 치료요법이 무효한 기타 범주의 질병에 대한 적용성을 갖는다.

[실시예 17]

[다발성 경화증과 관련된 증상 치료제로스의 아세만난]

다발성 경화증(MS)은 효과적인 치료법이 없는, 미지의 병인학적 신경 질환이다. 환자의 데이타 및 인구 통계 분석에 의하면, 이러한 질병은 아마도 바이러스성 기원의 병원체에 의해서 개시되는 것으로 나타난다. 중추 신경계 병소, 척수액 및 혈청 분석에 의하면 자가면역 성분이 또한 존재한다고 나타난다. 이러한 자가 면역 반응은 수초를 분해시킨다.

6년 이상 동안 다발성 경화증을 앓고 있으며, 4개월 동안 누워 있던 36세의 환자를 스테로이드로 치료한 후 가능한 보행 보조기를 사용하여 집안에서 걷게 한다. 집밖으로의 외출을 위해서는 휠체어가 요구된다. 담당 내과의는 환자에게 (사이톡산으로 치료하는 것을 포함하여) 화학적 요법 없이도 환자가 6개월 이내에 자리 보전 상태로 복귀할 것이라 조언했다.

환자는 모든 처방된 치료요법을 중단하고 매일 약 500mg의 아세만난을 경구 복용했다. 환자의 질병 상태는 약 10주가 경과할 때까지는 변화가 없었으며, 약 10주가 되어서는 환자가 이전보다 편안해졌다고 말했다. 2주후, 환자는 보행기를 사용하여 보다 장거리를 걸을 수 있으며, 한달 이상후에 지팡이만을 사용하여 걸을 수 있으며, 환자가(내과의가 얘기했듯이) 자리 보전 상태 이후로는 지팡이나 보행기를 사용하여 수시간 동안 쇼핑할 수 있게 된다.

환자는 10개월 이상 동안 이러한 정도의 상태를 유지하면서 다른 요법은 병행하지 않고 1일 약 500mg의 아세만난을 계속해서 섭취한다.

1986년 57세의 여성 환자 F.G.는 다리가 약해지고 성량이 점점 감소하며 다수의 기타의 신경근 증상을 나타내는 병력을 가지고 있었다. 죤스 홉킨스 메디칼 스쿨(Johns Hopkins Medical School)에서 MS를 NMR로 진단하였다. 환자가 800mg/일의 아세만난을 경구 투여 받기 시작하면서 광범위한 훈련 프로그램도 개시하였다.

치료 개시 6주후, 환자는 제한된 신체적 보호하에 상당히 오래 돌아다닐 수 있게 되었다. 환자의 성량은 점점 강해지고 기타 증상들이 개선되었다. 6개월이 되면서, 환자의 신경과 전문의에 의하면 NMR 기술에 의해 가시화된 반점이 복귀되었다. 환자는 계속해서 MS 관련된 증상이 경감되었다.

[실시예 18]

[물의 항바이러스제로서 사용된 아세만난]

버섯 경작 업계의 주요 문제점인 라프랑스(LaFrance) 바이러스에 대한 항바이러스제로서 아세만난을 평가한다. 사용된 배양토는 플레그(Flegg) 등의 방법을 변형시켜 제조한다. 라프랑스 바이러스-감염된 아가리쿠스 비스포루스 M8 스팬(agaricus bisporus M8 span)을 가하여 무수 물질이 3%인 배양토를 제조한다. 균사가 생성된 트레이를 플라스틱으로 덮고 24℃에서 14일 동안 배양한다. 아세만난을 균사가 생성된 배양토에 0.01 내지 2%(무수 중량 기준으로 계산)의 투여량으로 가하고 1.0파운드 무수 물질/트레이로 11'' x 7'' 트레이에 넣는다. 샘플링 백에 두 성분을 가하고 완전 혼합시킴으로써 이 물질을 배양토와 골고루 혼합시킨다. 균사가 생성된, 처리된 배양토를 뒤집고 물이끼류의 토탄 이끼를 상부에 위치시키고 24에서 7일 동안 추가로 배양하며; 이어서 상부에 위치한 물질을 온화하게 혼합시키고 플라스틱을 대체시키고 트레이를 추가로 10일 동안 배양 처리한다. 이어서, 플라스틱을 제거하고 트레이를 18에서 추가로 7일 동안 환경 챔버에서 배양시킨다. 버섯을 3주후에 일주일 간격으로 수확한다.

담포자체를 20ml의 STE(1.0M, NaCl; 0.5M Trizma base, pH 8.0 및 0.01M EDTA), 20ml의 LiCl 및 10ml의 10% SDS 중에서 균질화시킴으로써 이본쇄(ds) 바이러스 RNA에 대해 분석한다. ds RNA를 페놀중에서 추출하고 수성상을 와트만(Whatman) CF-11을 함유하는 Bio-Rad LC 칼럼을 통과시킨다. 셀룰로즈가 결합된 ds RNA를 세척한 후 STE로 용출시킨다. 에탄올로 침전시키고 시트레이트 용액중에서 재현탁시킨 후 분취량을 아가로즈 겔 전기 영동으로 특성화한다. ds RNA 패턴은 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화된다. 비처리군과 비교하여 0.01 내지 1.0%의 아세만난을 함유하는 실험 트레이로부터 분석된 담포자체에서 ds RNA에서의 감소가 나타난다.

[실시예 19]

[만성 피로 증후군 치료제로서 사용된 아세만난]

아세만난은 사람의 만성 바이러스성 증후군에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 2년 동안 현저하게 쇠약해진 만성피로증후군(CFS) 및 증가된 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 역가를 갖는 병력의 41세의 여성이 6개월 동안 아세만난을 800mg/일로 섭취한 결과 기면상태가 완전히 완화되었다. 환자가 증상없이 3개월을 지난 후, 아세만난 경구 투여를 중단하자 서서히 피로하여 피곤한 증상이 재현되었다. 아세만난을 다시 섭취해서 이러한 증후군 증상이 신속하게 경감되었다.

한 내과의의 여동생은 증감된 엡스타인-바르 항체를 갖는 만성 피로 증후군이 보다 오랜 기간 지속되었다. 다수의 임상 평가 및 치료 식이요법도 무효했다. 환자가 매일 800mg을 아세만난을 섭취하는, 아세만난 치료요법 개시 2 내지 3개월 후 현저하게 증진되어 이러한 증상이 제거되었다.

[실시예 20]

[아조직 기원의 종양 치료를 위한 방사선, 화학요법 및 아세만난의 병합]

41세의 메디칼 센터의 환자 W.H.는 심한 가슴 통증을 나타냈다. 방사선 사진은 가능한 혈관 기원의 종격동 응어리(mass)를 나타내며 환자는 심장혈관 중심으로 이전된다. 응어리는 목 하부부위로부터 횡경막쪽으로 확대되었으며 폐 사이에서 성장하여 심장 기저를 포함하는 것으로 측정되었다. 생검에 의하면 악성 태아 동관 종양으로 나타났다. 아세만난으로 경구 투여(방사선 및 화학요법을 병행하면서 1일 약 500mg)한다. 6년 동안 치료한 결과 환자는 흉부 X-선이 정상이 정상적이로 활기찬 생활을 영위하게 되었다. 문헌을 고찰해보니 진단 후 9 내지 12개월 후 20명의 종양 환자가 100% 사망했다.

[실시예 21]

[간 종양의 복합 약물 병합 화학 요법 및 아세만난 치료법]

환자 M.A.는 주요 불평이 그의 팬츠의 지퍼를 잠그지 목하고 벨트를 복부 주위로 매지 못한다는 것이었다. 1988년 4월 컴퓨터 축 단층촬영법(CAT) 주사에 의하면 간에서 방광으로 확대된 다발성 종양이 있는 것으로 밝혀졌다. 간에는 주로 직경이 10cm 이하인 20개 이상의 종양 덩어리가 위치하고 있었다. 예기되는 수명은 4 내지 6주였다. 환자는 HIV-1 감염용 아세만난을 800mg/일로 경구 투여해왔다. 수회의 화학요법 치료가 개시되고 아세만난이 계속 투여된다. 환자는 암 화학요법과 관련된 통상의 독성 및 부작용이 최소였다. 3개월 후 평가한 결과 CAT 주사에 의하면 종양 덩어리가 60% 감소한 것으로 추정되었다. 6개월 후, 종양 덩어리의 85%가 감소되었다. 12개월이 되면 종양이 최소로 되며, 24개월이 되면 간에 의문스러운 종양 덩어리의 극히 작은 반흔만이 나타난다. 모든 임상적 실험 연구는 정상이며, 환자는 현재 잘 지낸다.

[실시예 22]

[HIV 관련된 피부 종양의 아세만난 치료]

환자 S.G.는 팔에 촉진할 수 있는, 이미 생검에 의해 카포시 육종으로 진단된 두 개의 흑색 병변을 나타냈다. 5% DSMO를 포함하는 아세만난 겔을 팔의 피부 덩어리 위에 국소적으로 도포시키는 한편 다른 신체 부분의 유사 덩어리는 치료하지 않는다. 일주일 간격으로 재검사하니 병변의 평편해짐 및 탈색이 현저하게 나타났다. 치료 60일 후, 평편한 반흔 영역만이 남아 있게 된다. 동일한 환자의 기타 병변의 후속적 치료는 동일한 결과를 나타낸다.

환자 T.P.D.는 색소침착된 전형적인 카포시 육종을 갖는, 촉진할 수 있는 발목 병변을 나타냈다. 재배합된-인터페론(Roche) 1cc를 병변에 피하 주사한다. 크기 및 색소침착은 3일 정도면 증진된다. 밴드로 국소 아세만난 겔을 도포하고 1주일 지나면 말기에 병변의 흔적이 없다. 색소 침착의 반흔이나 변화는 없다.

[실시예 23]

[예비악성 피부 병변의 아세만난 치료]

머리가 벗겨지기 시작한 내과의인 환자 W.B.는 햇빛에 노출된 피부에 다수의 일광성 각화증을 나타냈다. 2주 동안 밤마다 아세만난 겔을 이들 병변에 도포하니 외관상 예비악성이던 인설, 가피 및 피부의 매끄럽지 못함이 없어졌다. 이러한 반응은 다른 많은 오래된 환자들에게도 나타난다.

[실시예 24]

[암 수술과 관련된 부종의 아세만난 치료]

1984년 1월, 인두 1차 종양의 외과 수술 절개, 방사상 목 절개, 방사선 및 화학 요법이 성공적이지 못했던 32세의 남성 환자 J.J.는 후두 및 식도의 전체적인 교합으로 인해 참을 수 없는 통증을 가지고 있었다. 임파선 차단으로 인해, 머리는 정상 크기의 약 2배가 되고 부종으로 전체 안면 특징이 없어졌다. 생명은 위경 검사 및 기관 절개술로 인해 유지되었다. 국소적 아세만난 겔(CDWG 0.025%)을 머리, 목 및 어깨 전체에 8시간 마다 도포시킨다(TID). 3일쯤 되어서 부종이 현저하게 감소되었으며, 10일쯤 되면 조직 체액이 과량으로 된다. 14일 내지 16일쯤 되면 목 기저, 턱의 각진 곳 및 귀 뒷부분의 영역이 기복이 있게 되었다. 피부를 절개시 괴저 조직이 이전의 경질의 불투과성 결절 종양 부위로부터 유출되기 시작했다. 환자는 회백색의 변성된 종양 덩어리를 유출시키기 시작했다. 계속 발생하는 광범위한 출혈을 위해 수차례 수혈한다. 서서히, 환자는 말하고, 수우프를 먹고, 입과 코를 통해 호흡하게 되었다.

[실시예 25]

[5-플루오로우라실 및 아세만난 배합물의 암 치료]

환자 C.M.은 약간의 직장 선암과 장간막 림프절 전이도가 높은 복막 절제 수술을 받았다. 환자는 방사선 치료를 거부했으며, 매주 5-플루오로우라실(5-FU)을 정맥내 주사하고 매일 800mg의 아세만난을 복용했다. 환자는 통상적으로 5-FU 치료와 관련된 구강 궤양, 심한 피로 또는 구토를 동반하는 오심을 나타내지 않았다. 동위원소 주사 및 컴퓨터화된 단층 촬영(CAT)에 의해 광범위하게 조사한 후, 환자는 외과수술 24개월 후 검지할 만한 선암이 나타나지 않았고 계속해서 정상이었다.

[실시예 26]

[다수 약물 배합 및 화학요법 및 아세만난 암 치료]

환자 H.H.는 결장 선암을 나타냈으며 절제하면 CEA 종양 소절이 증강되고 CAT 주사에 의해 간 결절이 증가되는 것으로 나타났다. 아세만난(800mg/일)으로 경구 투여를 개시하면서 매주 5-FU(500mg) 디카바지드(50mg)을 정맥내 주사하고 아세만난을 경구 투여(800mg) 했다. 점진적으로 종양 크기 및 CEA 값이 감소하고 부작용 또는 생화학적 또는 혈액학적 독성의 증거는 없다.

1990년 66세의 남성 환자 V.G.는 폐절제술 후 세기관지성 근원의 인설암에 대한 뼈 및 간의 전이를 나타냈다. 알칼리성 및 전체 간 효소가 정상 상한치 보다 3배 이상 많다. 매주 500mg 5-FU 및 50mg 디카바지드를 정맥내 투여하고 800mg의 아세만난을 매일 경구 투여하면서 1달 동안 치료하면 알칼리성 포스파타제 및 간효소가 환자의 전반적 증상 개선과 함께 처리전 수준의 절반으로 감소된다.

[실시예 27]

-남성 호르몬 요법을 사용한 아세만난 암 치료 및 다수 약물 배합 화학요법]

72세 남성 환자 J.R.은 전립선의 전이성 선암 수술후 및 방사선 치료후 산포스파타제(PAP) 및 전립선 특이 항원(PSA)의 증가를 나타냈다. 환자에게 아세만난(800mg/일), 5-FU(500mg) 및 디카바지드(50mg)을 경구 투여하기 시작했다. 종양마커 증가는 PAP에 있어 15단위, PSA에 있어 186U로 최고점에 달하여 일정하게 된다. 항-호르몬 제제 유렉신을 식이에 부가한다. PAP는 60일 이내에 3.0으로 PSA는 15로 감소된다. 이러한 반응은 어떠한 단계에서도 독성이나 부작용없이 이루어진다. 이 환자는 전체 식이를 지속한 상태에서 계속적으로 모니터한다.

[실시예 28]

[독소를 분비하는 동물 교합의 아세만난 치료]

아세만난은 항원, 독소, 알레르기 항원 및 자가항원에 대한 체내 반응을 변경시키는 것으로 나타난다. 2가지 아세만난 겔을 중국 남부의 수완기 지방(Swangi Province)으로 보냈다. 적십자 기구에서 상기 제품을 화상, 욕창, 울체성 궤양 및 당뇨성 피부 궤양화에 사용하기 위해 수령하였다. 약 1년후 적힙자 대표 위원은 아세만난 겔이 상기 질환을 유용하게 치료했음을 서신을 통해 밝히고 있으며, 그것은 또한 수동 작업 논에서 흔히 발생하는 물뱀 교합에 사용되어 왔던 어떠한 것보다 최고의 치료효과를 나타냄을 기록하고 있다. 뱀 교합은 종종 감염성이 되며 항생제에 반응하지 않으므로, 연조직에서 심재성 허혈로부터 초래되는 괴사로 피부 및 근육조직에 상당한 손실이 야기된다. 아세만난 겔로 환부를 폐쇄적으로 드레싱하여 비통제성 감염을 제거하고 주위 조직으로의 모세관 순환복구에 일조한다. 이러한 처리는 손 및 발가락, 근육, 신경 및 연조직을 보존시킨다.

[실시예 29]

[섬유아세포의 아세만난-처리된 배양물의 신생 형태 및 기능으로의 복귀]

60세 남성으로부터 수득된 섬유아세포의 아세만난-처리된 배양물은 이들 노화 세포의 형태에 있어 변화를 나타낸다. 이와 같은 변화는 시험관 내에서 이들 사람 세포에서의 노화 과정의 역전을 입증하는 것으로 보인다. 배양 배지내에서 아세만난(1mg/ml)으로 처리한 장기간 섬유아세포 배양물은 신생 세포의 생화학적 및 형태학적 특성을 나타내었다.

1989년 듀크대학의 한 내과의는 병리과에 제출된 외과용 표본으로부터의 안면 피부 생검을 검사하였다. 생검은 피부암 치료를 위해 수행된 몰(Mohl)의 수술로부터 입수한다. 수술후 아세만난 겔을 적용시켰다. 표본은 손상된 콜라겐 섬유를 파괴시키고 확장된 섬유아세포에 의한 미숙한 콜라겐 섬유를 신속히 재생시키며 보기드문 사생증(necrobiosis) 양태를 나타낸다. 결과는 이러한 노화 피부 표본에 있어 구조를 신속히 재구성(remodeling)하는 것이다.

1990년 동일 의료인은 아세만난을 투여받은 개의 흉선을 검사하였다. 이들 흉선은 대조군 개의 흉선보다 2 내지 6배 더 크다. 처리된 개의 흉선은 현미경학상 세포과다성으로, 이는 흉선세포의 과형성 및 활성화를 입증한다. T-임파구 및 양육(nurse)-세포의 증가된 수는 T-임파구 클론에 있어 명백한 확장을 나타낸다. 아세만난-처리된 동물의 조직에 있어 흉선 활성 및 섬유아세포 활성의 유도는 노쇠조직의 기능복귀를 야기한다.

[실시예 30]

[동물 및 사람에게서 콜레스테롤 수준에 대한 아세만난 효과]

855mg/kg/일의 아세만난을 투요받은 수캐는 91일간의 독성 연구 중에 혈청 콜레스테롤 수준이 통계학적으로 현저히 감소되는 것으로 관찰되었다. 유사한 결과는 매일 아세만난을 400 내지 3200mg의 용량으로 투여받은 정상 성인 남성 지원자에서도 관찰되었다. 관찰된 아세만난 요법의 중요한 효과는 이들 피험자에 있어 혈청 콜레스테롤 수준이 정상 수준까지 통계학상 현저하게 감소한다는 점이다. 연구 초기 24명 피험자의 평균 콜레스테롤 농도는 189mg/dl이다; 연구 종료시의 농도는 174mg/dl이다. 하기를 사용한 통계분석[Wilcoxen Sogned Ranks Tests의 CRUNCH 소프트웨어 버전]은 콜레스테롤 저하가 기회 변화에 기인하지 않는다는 98% 이상의 가능성을 나타낸다. 24명 환자중 7명의 콜레스테롤 농도는 치료 6일 후 20mg/dl 이상으로 감소하므로, 이러한 효과는 연구중에 피험자의 조절된 내성에 있어 단순한 식이 개선에 의해 기인하지 못한다.

[실시예 31]

[식물로부터 초래된 상해의 아세만난 치료]

수의용 아세만난을 공급하는 2명의 경쟁자 수렵꾼이 이를 소지하고 아프리카로 여행을 떠났다. 몇번의 설사후, 수렵꾼들은 그들 스스로 아세만난을 섭취하기로 결정했다. 아세만난은 800mg/일의 투여 수준으로 섭취하였다. 수렵꾼들은 다른 수렵꾼들보다 설사를 덜 앓았음을 기록하고 있다. 또한, 찔레 덤불로 인해, 수렵꾼들은 그들의 팔 및 다리에 무수한 상처를 입었다. 아세만난을 섭취한 수렵꾼들은 그들의 베이고 할퀸 상처부위가 실질적으로 밤새 치유되는 것으로 나타났다고 보고하고 있다. 발적 또는 염증은 나타나지 않는다. 그들이 미국으로 귀국할 때까지 모든 찰과상은 완전 치유되었다. 수렵대의 다른 구성원은 전신적 및 국소적 항생제 요법을 위해 그들의 의료인의 방문을 필요로 할 정도로 베인부분과 찰과상으로부터 심한 감염을 앓았다. 아세만난을 섭취한 2명의 수렵꾼은 감염 및 반흔을 나타내지 않았다.

[실시예 32]

[식물에 대한 과감작성으로부터 기인한 알레르기의 아세만난 치료]

아세만난을 사용하여 식물 알레르기항원의 염증 효과를 경감시킨다. 계절적 고초열의 공지된 가계력이 있는 환자 H.R.M.은 매년, 소양증, 소성, 울혈 및 점막 습윤을 경험한다. 1988년에 시작하여, 800mg/일의 아세만난을 5일간 경구투여하여 팽윤된 비점막에 의해 일어나는 동 두통을 포함한 고초열 증상을 실질적으로 제거할 수 있음이 발견되었다. 1989년, 수면시 및 이후 매 8시간 마다 안구 및 비강 점막에 국소 적용시킨 아세만난 겔은 H.R.M.에서와 유사한 효과 및 잇점을 야기함이 발견되었다.

유사한 결과가 사람 및 동물에 있어 담쟁이 덩굴 독 병변에 아세만난을 국소 투여함으로써 나타난다. 병변의 중증도 및 치유시간이 현저히 감소된다.

[실시예 33]

[화학물질에 대한 과감작성으로부터 야기되는 알레르기의 아세만난 치료]

아세만난을 사용하여 화학 알레르기 항원의 염증 효과를 경감시킨다. 직업 화가인 환자 T.R.은 페인트 및 용매로부터의 증기에 의해 유도되는 천명 및 기관지염으로 인해 그의 작업을 중단할 지경에 이르게 되었다. 800mg/일의 아세만난을 5일동안 경구투여 후, 그의 증상이 완화되었다. 화가는 매일 작업전 800mg의 아세만난을 매일 경구투여하여 작업을 지속할 수 있게 되었다.

[실시예 34]

[천식과 관련된 증상의 아세만난 치료]

72년간 천식을 앓아온 76세의 남성 T.T.는 비관련된 질환을 위해 매일 아세만난 800mg을 복용하였다. 치료 1년후, T.T.는 주치의에게 1년 이상 그의 에어로졸의 기관지 확장제를 사용하지 않았고 현저한 양이 단위로 남아있음을 밝혔다. 그의 아내는 그가 15년간 매월 평균 2단위를 복용하였고, 만성 천식을 위해 그 전에는 50년 동안 핸드 연무기를 사용했음을 진술하였다. 환자는 매일 아세만난 800mg을 계속적으로 복용하였고 더 이상 천명 또는 만성 기관지염을 앓지 않게 되었다.

[실시예 35]

[낭포성 섬유증과 관련된 증상의 아세만난 치료]

낭포성 섬유증 증상의 6개월 병력의 여대생은 800mg/일의 용량으로 경구 아세만난 요법을 시작한지 2주 이내에 에너지의 돌연한 회복을 보고하였다.

[실시예 36]

[HIV 감염의 결과로서 사이토메갈로바이러스 감염의 아세만난 치료]

27세 HIV-1 포지티브 남성 M.M.은 약제 투여에 의해서도 완화되지 않는 흉골하 통증을 2개월간 앓고 있다. 식도경 검사는 원위 식도점막의 침식을 기술하고 있다. 생검의 병리조직학적 염색은 내피 세포에서의 사이토메갈로바이러스 유기체를 기술하고 있다. 로젠지로서 1000mg의 아세만난을 3일간 경구투여하여 모든 증상을 제거하였다.

[실시예 37]

[류마티스 열 사례에 대한 속발증의 아세만난 치료]

25세 여성 S.M.은 급성 연쇄구균성 류마티스 발열후 야기되는 인후통 이후 관절염, 건염(tendonitis), 관절 부종, 임파구 및 상승된 침강률의 급성 개시가 나타난다. ASO 역가는 현저히 상승된다. 그녀의 자매 및 모친은 1년까지 지속되는 인카파시테이션(incapacitation)과 함께 급성 류마티스 발열의 심각한 복합 발작의 병력을 지니고 있다.

환자에게 아세만난 800mg을 매일 경구투여한다. 침강률 및 백혈구 수는 치료 6주까지 정상이고 모든 임상적 증상은 사라진다. 환자는 치료 8주후 고도의 우향성(dexterity)을 필요로 하는 수동 노동 작업성을 회복한다.

[실시예 38]

[자가면역질환 치료에 사용되는 아세만난]

범혈구 감소증, 2년 이상의 진행성 빈혈, 백혈구 감소증 및 혈소판 감소증 병력의 21세 여성(E.M.)을 1988년 6월 치료하기 시작했다. 그녀는 미합중국내 8개 주요 의료센터에서 제공된 치료에 대한 반응에 실패한 경력이 있다. 골수 이식을 치료의 다음 단계로서 제공하였다. 처음으로 검사하는 경우, 환자는 좌상, 점상 출혈, 피로, 저 헤모글로빈(6.1g%) 및 저 혈소판(20,000 내지 25,000/㎣) 및 1,500세포/㎣의 총 백혈구 수를 나타낸다. 그녀 자신의 백혈구 세포에 대한 항체는 전문 임상 병리연구소에 의해 보고되었다. 환자는 아세만난 800mg을 60일간 경구투여받는다. 연구 수치에 있어 소폭 상승이 주시되고 그녀의 피로감은 최소한도록 감소된다. 혈액환자는 저 용량의 프레드니손 및 말 항흉선세포 글로불린을 투여하였다. 전자는 이미 비효과적인 것으로 나타났다. 1988년 10월까지, 환자의 헤모글로빈은 10g% 이상이었고, 백혈구 수는 3,500세포/㎣이며 혈소판은 60,000이었다. 1998년 중반까지, 1일 800mg의 아세만난을 6개월 동안 경구 투여하여 회복하였다. 1990년 1월, 환자의 헤모글로빈은 12.7g%, 혈소판 120,000 및 백혈구 수 5,200세포/㎣으로 보고되었다. 환자는 현재 어떠한 약제도 투여하지 않으며 대학원의 전문 무용 안무가이다.

[실시예 39]

[전산 홍반성 낭창의 아세만난 치료]

전싱 홍반성 낭창 환자를 뉴욕 의료진에 의해 800mg/일의 아세만난을 경구투여하여 치료하였다. 의료진은, 아세만난 치료 8주후 모든 증상이 사라지고 실험실 수치가 현저히 상승하였음을 보고하였다. 지속적인 아세만난 치료는 이러한 환자 질환과 관련된 증상을 조절하는 것으로 나타났다.

[실시예 40]

[급성 류마티스 관절염의 아세만난 치료]

의료진은 급성 류마티스 관절염(RA)을 앓는 일군의 환자에서 상승된 RA 라텍스 수준 및 침강률이 나타남을 보고하였다. 800mg/일의 아세만난을 경구투여한지 6주 내지 8주 후, 환자의 증상은 상당히 감소되었고 현저히 상승된 임상적 실험치를 나타내었다.

[실시예 41]

[만성 류마티스 관절염의 아세만난 치료]

만성 RA, 변형관절, 피하결절, 걸결절의 20년 병력의 65세 여성 B.L.H.는 만성 통증을 앓고 있다. 1988년 가을 환자를 진찰하였을 때, 그녀는 거의 이득이 없는 골드 숏(gold shot)도 포함한 수많은 치료를 시행중이었다. 아세만난(800mg/일) 경구 투여를 권장했다. 6개월간은 효험이 없는 것으로 보고되었다. 1989년 중반, 아세만난을 매주 2회 이상 투여하는 경우 환자에게서 설사를 일으키는 것이 보고되었으나, 관절염 증상은 호전되었다. 이때, 매주 3회 아세만난 800mg이 허용되었고 RA 증상도 현저히 호전되었다. 1990년 1월 환자는 그녀가 최후 15년 중 최고 6개월의 삶을 경험하였음을 보고하고 있다. 요구되는 노력 및 그녀의 매일의 일상과 관련된 통증이 현저히 감소되었다.

[실시예 42]

[우울증 및 불안증의 아세만난 및 항우울증제 요법]

내과 의사는 중증도의 우울증 및 불안증을 위해 복용된 항우울증 약물 및 정신 요법에 대한 반응에 실패한 환자에게 1일 800mg의 아세만난을 경구투여하였다. 그는 일주일 말엽까지 환자의 정서가 보다 안정되었으며 환자를 장기적으로 관찰하는 동안 처음으로 태도에 있어 현저한 호전이 이루어짐을 보고하였다.

[실시예 43]

[고양이 백혈병의 아세만난 치료]

고양이 백혈병(FeLV)은 고양이가 다양한 임상적 징후를 나타내는 레트로바이러스(옹코바이러스 계열)감염이다. 림프세망계의 감염이 우세하고 대부분의 동물이 3년 이내에 사망한다. 이러한 질환의 현재 치료로는 증상이 있으며; 치료법이 존재하지 않는다.

말기 FeLV 질환에 걸린 45마리 고양이에게 1주에 6회 아세만난을 복강내 주사하여 치료하여 6주 더 관찰한다. 이 고양이는 치료기간 동안 주간별로 모니터하여 검사한다. 추가로 실험실 데이타는 연구초기, 중간 및 종료시 수득한다.

치료동물의 67%가 연구중에 호전되었다. 아세만난에 반응하지 않은 동물의 평균 생존시간은 28일 이하였다.

[실시예 44]

[HIV와 관련된 진균 감염의 아세만난 항진균 약물 치료]

3인의 HIV-1 환자 보고서는 이들 환자에게서 모발 백반증 및/또는 모닐리아성 만점 및/또는 구강 궤양이 나타나는 유사한 양식을 기술하고 있다. 이들의 상태는 통상 광범위하고 고통스럽다. 케타콘아졸의 사용은 일부 환자의 상태를 호전시켰으나 나머지는 무반응성이었다. 이들 요법중 800mg/일의 아세만난 경구투여를 부가시킨지 1주일 이내에, 환자는 이들 점액피부 병변이 제거되는 것으로 보고되었다. 아세만난 및 케타콘아졸을 3 내지 5일간 복용하여 수주 내지 수개월간 발병(outbreak)을 제거한다. 지속적인 아세만난 투여로 점액피부 감염을 제거하거나 이의 발병을 감소시킨다.

[실시예 45]

[HIV와 관련된 뉴모사이서티스 카리니(Pneumocystis carinii) 감염의 아세만난 및 항원생동물 약물 치료]

800mg/일의 아세만난을 경구투여받은 HIV-1 연구 환자를 X-선 진단-적합성이고 객관적으로 입중되는 뉴모사이스티스 카리니 폐렴(PCP)을 위해 아칸사스(Arkansas)의 유슈한 병원에 입원시킨다. V.A. 병원의 실험에서, PCP에 걸린 HIV-1 환자는 그들이 반응하는 경우, 치료학적 측정에 반응하는데 2주 이상이 소요된다. 환자는 1주일의 에어로졸의 펜타미딘에 반응하였고 아세만난 요법을 지속하였다. 그에게서 증상이 사라졌다.

[실시예 46]

[HIV와 관련된 크립토스포리디아증(cryptosporidiosis) 감염의 아세만난 및 항생제 치료]

만성 설사 및 체중 감소에 시달리는 HIV-1환자는 크립토스포리디아증 진단 대변에서 일반적인 항산성 포자를 갖는 것으로 나타났다. 800mg/일 경구용 아세만난 및 Q.I.D. 안사마이신(리프부틴) 250mg의 배합물을 매일 2주동안 투여하여 환자에게서 설사를 낫게하고 체중증가를 야기시켰다.

[실시예 47]

[HIV와 관련된 내성 사람 결핵의 아세만난 및 항결핵 약물 치료]

HIV-1 포지티브 환자 S.G.는 체중 감소가 진행되고 알려지지 않은 병인의 낮은 등급의 발열을 경험하게 된다. 복막후강 임파선증 및 덩어리의 생검 발견은 사람 결핵의 배양물로 나타났다. 환자는 800mg/일의 아세만난을 매일 투여 받았다. 항결핵 치료 기관은 300mg/일 이소니아지드, 600mg/일 리팜핀 및 1000mg/일 에탐부톨을 혼합한 치료로 24시간 이내에 환자가 무열성이 되고 10일 이내에 체중이 증가됨을 알수 있다.

[실시예 48]

[HIV와 관련된 사람에서의 내성 조류 결핵 감염의 아세만난 및 항결핵 약물 치료]

HIV-1 환자는 지속적인 설사를 앓게 되고 결국에는 마이코박테륨 조류 세포간 결핵(MAI)의 도말 및 배양물로 나타난다. 어떠한 제제도 효과적인 것으로 공지되어 있지 않다; 하지만, 안사마이신이 C.D.C.에 의해 공급되었다. Q.I.D. 안사마이신 250mg 및 800mg/일의 경구용 아세만난을 혼합하여 1주 이내에 설사를 종료시켰다. 일주일에 3 내지 4파운드 비율로 체중이 감소되는 환자는 2주 이내에 체중이 증가하기 시작한다. 피로감 및 일반적인 쇠약감이 사라진다. 생검 및 배양물-입증된 MAI를 나타내는 또 다른 HIV-1 환자 C.C.는 경구 아세만난 투여후 유사한 신속한 분해 및 네가티브 배양시험을 나타낸다.

[실시예 49]

[유방암의 시스플라틴 암 치료를 포함한 아세만난 및 다중약물 화학요법]

38세 여성 J.F.는 유방의 관세포 암으로 유방 절제를 시술한지 5년이 경과하였다. 환자는 복막전이의 복수로 인해 임신한 것으로 보인다. 용해성 종양의 간 및 복합 골부위의 CAT 주사 증거는 입증가능하다. 환자에게 화학요법을 연장하였을 때 4 내지 6개월 더 생존하는 것으로 평가되었다. 환자는 800mg/일의 경구 용량의 아세만난으로 출발하여 그녀의 지역 종양학자에 의해 제조되는 권장된 복합제 세포독성 화학 요법(아드리아마이신, 사이클로포스파미드, 미토마이신-C 및 5-FU)을 개시한 것으로 전해진다. 그녀는 아드리아마이신 및 기타 제제와 혼합하여 시스플라틴을 매주 정맥내 투여받았다. 연속적인 검사로 골 전이의 재-골화, 복수제거, 촉진되는 복부 덩어리 제거, 간 덩어리의 소멸 및 체중 증가를 나타내었다.

[실시예 50]

[피부의 진균 감염의 아세만난 치료]

40세 의사가 자신의 발가락 바닥사이 및 그위에 소양성, 갈라진 소성 병변에 아세만난 겔을 적용시켰다. 1주일 이내에, 의사는 그가 그의 만성 무좀을 주기적으로 치료해온지 20년동안 아세만난이 가장 효과적인 약제인 것으로 입증되는 반응 및 치유를 보고하고 있다. 다른 환자도 유사하게 호전되었음을 기록하고 있다. 놀랍게도, 기타 질환을 위해 아세만난을 복용했던 일부 환자도 무좀 병변의 개선을 기록하고 있다.

[실시예 51]

[해양 동물 자상의 아세만난 치료]

스쿠버다이빙을 하던 40세 여성이 불산호에 무릎을 다쳤다. 병소는 피부 표면의 약 9㎠를 덮는다. 사람에서 이러한 자상의 정상적인 임상 진행은 약 8시간의 강력한 염증 이후 14시간 동안의 피부 환부의 지연된 치유이다. 아세만난 겔을 상처에 적용시키면 완전히 치유되고 흉터가 거의 보이지 않는다.

[요약]

아세만난은 질환의 해소 또는 치료의 주요기작이 환자 면역계에 의한 개입을 필요로 하는 다수의 질환 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 아세만난은 면역계에 대해 직접적인 자극 효과를 갖는다, 추가로, 아세만난은 바이러스 또는 기타 감염성 유기체, 감염된 세포 및 종양 세포와 상호작용 하여 이들의 면역학적 감작성 표면 조성의 변화를 일으켜 이들 물질의 외관을 변경시키고 이들이 신체의 면역계에 의해 인지된 후 파괴되도록 한다.

따라서, 본 발명의 작용 및 투여는 상술한 기재내용으로부터 명백해질 것으로 간주된다. 예시되고 기재된 방법 및 기술은 바람직한 것으로 특성화되었으나, 하기 특허청구의 범위에서 정의된 발명의 취지 및 범주를 벗어남이 없이 다양한 변화 및 변형을 이룰 수 있음을 명백할 것이다.

Claims (5)

1. 아세만난 및 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 만성 호흡기 질환 치료용 약제학적 조성물.
2. 아세만난 및 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 세포의 노화과정 지연용 약제학적 조성물.
3. 아세만난 및 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 당뇨병 치료용 약제학적 조성물.
4. 아세만난 및 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 혈중 콜레스테롤 농도 조절용 약제학적 조성물.
5. 아세만난 및 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 혈관내에 형성된 반흔 제거용 약제학적 조성물.