DD221917A5 - Verfahren zur herstellung von krebszellen-cytotoxischen lymphocyten - Google Patents
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Abstract
Ziel der Erfindung ist die Entwicklung von Anti-Krebsmitteln. Erfindungsgemäß besteht das Verfahren darin, saß man Lymphocyten mit einem von Krebszellen abgeleiteten glykoverwandten Antigen sensibilisiert, wobei das Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem Lektin, das sich spezifisch mit einer endständigen Galaktose oder enständigem N-Acetylgalaktosamin verbindet, kombiniert.
Description
Verfahren zur Herstellung von Krebszellen - cytotoxiscfaen Lymphocyten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von Krebszellen-cytotoxischen Lymphocyten.
5 CHARAKTERISTIK DER ERFINDUNG: ·:
Iinmunansprechende Effektorzellen, insbesondere T-Lymphocyten, die eine Hauptrolle bei einer zellausgelösten Immunreaktion spielen, verursachen eine Zurückweisung von Pfropf stellen aufgrund eines Frem.clrzellen-Antigens bewirken jedoch keine merkliche oder nur eine sehr begrenzte Immunoinhibierunq gegen Krebszellen. Infolgedessen werden die Krebszellen nicht zerstört, sondern veivielfältigen sich in vivo und verursachen schliesslich den Tod des von Krebs befallenen Trägers.
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Der hierbei vorhandene Mechanismus ist jedoch noch nicht vollständig klar und es sind verschiedene Untersuchungen
' ' angestellt wordne, um nähere Erkenntnisse zu erlangen über die Art der Materialbasis, die in einem solchen System vorkommt. Z.B* werden Zelloberflächehmarkierungen auf Mäuseleuk£miezelien öder Embrionalkarzinomzellen unter Verwendung von Lektinen, wie Dolichos biflorus-Agglutinin (DBA) und Erdnussagglutinin (PNA) in Biochem. Biophys. Res. Comm. >9v(2) 448-455 (1979), Ibid. 96 (4) 1547-1553 (1980), J. Biochem. 89 473-481 (1981) und Ce_nj_8 183-191 ,September 1979 „beschrieben.
Soweit bekannt ist, sind bisher jedoch nochkeine Versuche Unternommen worden, um neue Lymphocyten zur Verfügung zu: stellen, die Krebszellen spezifisch bekämpfen können, und die |Anti-Krebsmittel darstellen unter Anwendung einer Immunansprechung der Lymphocyten.
20 25
Gründliche Untersuchungen über die Immunansprechung des Trägers gegenüber Krebszellen und deren Anwendung zur Behandlung von Krebs haben nun ergeben, dass in einem krebszellenspezifischen Antigen, das nicht in differentierten Normalzeilen zu finden ist, GRA vorhanden ist* das als Immunogen für den Träger wirkt und eine sehr hohe Immunogenität aufweist, das eine Immunreaktion, die spezifisch auf Krebszellen ist, verursacht. Es wurde weiterhin festgestellt, dass dann, wenn man GRA zum Sensibilisieren von Lymphocyten verwendet^ man Killerzellen erhält, die spezifisch auf GRA-enthaltende Krebszellen wirken und dass man bei Verabreichung der Killerzellen an einen Träger diese . GRA erkennen und auf GRA-enthaltende Krebszellen einwirken/diese zerstören und dass, man auf diese Weise eine sehr gute Wirkung bei der Behandlung und Vorbeugung von Krebs erzielen kann
DARLEGUNG DES WESENS DER ERFINDUNG; Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von. Krebszellen-rcytotoxischen Lymphocyten.
Das bei dem obigen Verfahren verwendete GRA erhält man aus GRA enthaltenden Krebszellen von Menschen öder Tieren, z.B. yonkultivieren Krebszellen/ transplantierten Krebszellen, spontan auftretenden Krebszellen, durch .chemische Substanzen oder durch Viren induzierten Krebszellen oder Krebszellen, die man aus Geweben herausoperiert hat unter Anwendung der folgenden Ver- . · ' . : fahren. '"/'.-' '? ': .. '.' :' "' .y\ . ' "' " . . " '.·. .V ' ' ' . .'
1Ö Zellmembrankompphenten werden von Krebszellen der vorerwähnten Art abgetrennt und mit einem Lektin behandelt, welches sich spezifisch mit terminaler Galaktose oder endständigem N-Acetylgalactosämin-, "wobei GRA mit dem Lektin verbunden leicht abgetrennt werden kann, bindet (s. J.B.C, ,250, 8518-8523 (1975) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., bz, 144 (1575); Z. Immunitätsforsch., U8, 423-433 (1966); Brv J. Exp. Pathol^, 2_7» 228-236 (1946); Proc.Nath. Acad. Sei. USA, TSr Nr. 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry, ry, 196-204 (1974); und Carbohydrate Research, 5^, 107-118 (1976)), wodurch GRA sich mit dem Lektin vereint und leicht abgetrennt werden kann.
Die Trennung der Krebszellenmembrankomponenten kann man auf einfache bekannte Weise erzielen, z.B. durch eine Homogenisierungsmethode und eine Solubilisierungsmethode Unter Verwendung eines Auflösungsmittels. Vorteilhaft .ist es, eine Methode anzuwenden, bei welcher Krebszellen in physiologischer Kochsalzlösung oder in einem geeigneten Puffer homogenisiert werden, ein Teil des Niederschlags durch beispielsweise Zentrifugenabtrennung gesammelt wird und in physiologischer Kochsalzlösung oder einem Puffer mittels eines Lösungsmittels
gelöst wird, worauf man den überstehenden Teil dann beispielsweise durch Zentrifugenabscheidung abtrennt. : · Als Auflösungsmittel kann man beispielsweise oberflächenaktive Mittel, wie sie allgemein bekannt sind, um Zellmembranen aufzulösen, verwenden, z.B. nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 — (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.),? ν NP-40 (hergestellt von Shell Co., Ltd.), Digitonin und Harnstoff, oder anionische oberflächenaktive Mittel, z>B. Natriumdodecylsulfonat (SDS).
Aus den so erhaltenen Zellmembrankomponenten kann man GRA, das in der Lage ist, sich mit Lektin unter Anwendung üblicher chemischer oder biochemischer Verfah- ren und indem man von den Eigenschaften des Lektins Gebrauch macht, abtrennen. Beispiele für solche Verfahren sind eine Affinitätschromatografie, bei der man einen ein Lektin enthaltenden Säulenträger verwendet, eine Immunausfällungsmethode, unter Verwendung von GRA-Antikörper oder dergleichen, eine Dialysemethode,
eine GeIfiltrationsmethode, eine Elektrophoresemethode . oder eine physikalische Ausfällung unter Verwendung
' ; eines Zuckerprotein ausfällenden Mittels, z.B. Polyethylenglykol und Aceton, oder eine Kombination solcher Verfahren. Besonders bevorzugt ist die Affinitätschromatografie unter Verwendung einer Säule, die ein Lektin ; enthält, wobei man den Säulenträger leicht herstellen kann, indem man Lectin auf einem unlöslichen Träger immobilisiert. Die Immobilisierung von Lektin auf einem unlöslichen Träger kann man in bekannter Weise, wie sie für die Immobilisierung von Biosubstanzen angewendet
wird, durchführen. Von diesen Methoden wendet man bevorzugt die Cyanobromidaktivierungs-Polysaccharid-Methode und eine IininQbilisierungsinethode unter Verwendung von N-Hydroxysuccimidester an. Die Cyanobromidaktivierungs-Polysaccharid-Methqde ist eine Methode, bei der ein unlöslicher Träger mit Cyanobromid behandelt wird und das so erhaltene aktivierte Produkt j wird dann unter milden Bedingungen einer Kupplungsreaktion mit einem Lektin uhterwörfen, wobei das Lektin immobilisiert wird. Bei der Behandlung des unlöslichen Trägers mit Cyanbromid wendet man beispielsweise basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid und Natriumhydrogenkarbonat an, um den pH auf 7,5 bis 12 einzustellen und dann behandelt man den Träger in einem Lö-
15 sungsmittel, wie Wasser, Acetonitril oder einem
bei pH 7,5 bis 12 gehaltenen Puffer, z.B. einem 0,1M Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH etwa 8,7) und 0,01M Phosphatpuffer (pH etwa 7,7) bei Raumtemperatur während etwa 1 bis 12 Minuten. Im allgemeinen wendet man vorzugsweise eine dem unlöslichen Träger äquivalente Menge an Cyanbromid an.
Jeder bekannte unlösliche Träger, der gegenüber allen Biosubstanzen eine niedrige nichtspezifische Adsorption zeigt, der eine hohe Porösität hat und der eine funktionelle Gruppe aufweist, die unter milden Bedingungen in der Lage ist, Biosubstanzen zu immobilisieren und der chemisch und physikalisch ausreichend stabil ist, kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Verwendbare unlösliche Träger sind beispielsweise Träger, die aus Zellulose hergestellt wurden, z.B.
-. 7 -
· Dais bei dem obigen Verfahren verwendete GRA erhält man aus GRA enthaltenden Krebszellen von Menschen oder Tieren, z.B. von kultivieren Krebszellen, transplantierten Krebszellen, spontan auftretenden Krebszellen, durch chemische Substanzen oder durch Viren induzier-· ten Krebszellen oder Krebszellen, die man aus Geweben herausoperiert hat unter Anwendung der folgenden Ver- "
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TO Zellmeihbrankomponenten werden von Krebszellen der vorerwähnten Art abgetrennt und mit einem Lektin behandelt, welches sich spezifisch mit terminaler Galaktose oder end-
. ständigem N-Äcetylgalactosämin-i·wobei GRA mit dem Lektin verbunden leicht abgetrennt werden kann, bindet (s. J.B.C. ,250, 8518-8523 (1975) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., bz,
144 (1975); 't. Immunitätsforsch., 228, 423-433 (19j56)j : Bf. J. Exp. Pathol., 2T_, 228-236 (1946); Proc. Nath.
Acad. Sei. USA, ;75_, Nr. 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry, 12' 196-204 (1974); und Carbohydrate Research, 5±, 107-118 (1976)), wodurch GRA sich mit dem Lektin vereint
und leicht abgetrennt werden kann. . ' ; _..- Λ". ;... ' . ' :;.: . . . · \ [ ' ' ' ' . . ' ' '- ' '
Die Trennung der Krebszellenmembrankomponenten kann man : auf einfache bekannte Weise erzielen, z.B. durch eine Homogenisierungsmethode und eine Solubilisierungsmethode unter Verwendung eines Auflösungsmittels, Vor- · teilhaft ist es, eine Methode anzuwenden, bei welcher, Krebszellen in physiologischer Kochsalzlösung oder in einem geeigneten Puffer homogenisiert werden, ein Teil des Niederschlags durch beispielsweise Zentrifugenäb- - trennung gesammelt wird und in physiologischer Kochsalzlösung oder einem Puffer mittels eines Lösungsmittels
gelöst wird, worauf man den überstehenden Teil dann beispielsweise durch Zentrifugenabscheidung abtrennt. Als Auflösungsmittel kann man beispielsweise oberflächenaktive Mittel, wie sie allgemein bekannt sind, - um Zellmembranen aufzulösen, verwenden, z.B. nicht- ionische oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.), NP-40 (hergestellt von Shell Co., Ltd.), Digitonin und Harnstoff,oder anionische oberflächenaktive .Mittelf z.B. Natriumdodecylsulfonat (SDS).
Aus den so erhaltenen Zellmembrankomponenten kann man GRA, das in der Lage ist, sich mi.t Lektin unter Anwendung üblicher chemischer oder biochemischer Verfah-.Τ5 ren und indem man von den Eigenschaften des Lektins. \:: Gebrauch macht, abtrennen. Beispiele für solche-Veffahren sind ein(& Affinitatschromatografie, bei der man ',: [, einen ein Lektin enthaltenden Säulenträger verwendet, eine Immunausfällüngsmethode, unter Verwendung von GRA-Antikörper oder dergleichen, eine Dialysemethode,
eine Gelfiltratiqnsmethode, eine Elektrophoresemethode : oder eine physikalische Ausfällung unter Verwendung
eines Zuckerprotein ausfällenden Mittels, z.B. Polyethy- ; ν lenglykol und Aceton; oder eine Kombination solcher Verfahren. Besonders bevorzugt ist die( Affinitätschroma-' tögrafie unter Verwendung einer Säule, die ein Lektin enthält, wobei man den Säulenträger leicht herstellen kann, indem man Lectin auf einem unlöslichen Träger , ; Immobilisiert. Die Immobilisierung von Lektin auf einem unlöslichen Träger kann man in bekannter Weise, wie sie für die Immoliilisierung von Biosubstanzen angewendet
wird, durchführen. Von diesen Methoden wendet man bevorzugt die Cyanobromidaktivierungs-Polysaccharid-
r Methode und eine Immobilisierungsmethode unter Verwendung von N-Hydroxysuccimidester an. Die Cyanobromidäktivierungs-Polysaccharid-Methode ist eine Methode,
bei der ein unlöslicher Träger mit Cyanobromid behan- ; delt wird und das so Erhaltene aktivierte Produkt wirct dann unter milden Bedingungen einer Kupplungsreak— tion mit einem Lektin unterworfen, wobei das Lektin immobilisiert wird. Bei der Behandlung des unlöslichen Tragers mit Cyanbromid wendet man beispielsweise, basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid und Natrium-' hydrogenkarbonat an, um den pH auf 7,5 bis 12 einzu- ;. stellen und dann behandelt man den Träger in einem Lösungsmittei, wie Wasser, Acetonitril oder einem bei pH 7,5 bis 12 gehaltenen Puffer, z,B. einem 0/.1M , Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH etwa 8,7) und 0,01M Phösphatpuffer (pH etwa 7,7) bei Raumtemperatur während etwa 1 bis 12 Minuten. Im allgemeinen wendet man vorzugsweise eine dem unlöslichen Träger äquivalente Menge an Cyanbromid an; .
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Jeder bekannte unlösliche Träger, der gegenüber allen Biosubstanzen eine niedrige nichtspezifische Adsorption zeigt, der eine hohe Porosität hat und der eine funk·^
tionelle Gruppe aufweist, die unter milden Bedingungen • in der Lage ist/ Biosubstanzen zu immobilisieren und der chemisch und physikalisch ausreichend stabil ist, kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Verwendbare/unlösliche Träger sind beispielsweise Träger; die aus Zellulose hergestellt wurden, z.B.
Amihoethylzellulose, Carboxymethylzellulose, Bromoacetylzellulose und p-Anilinozellulose, oder ein Träger aus vernetzten! Dextran,· z.B. Sephadex und CM- _ Sephadex (hergestellt von Farmacia Corp.) und ein Träger aus Agarose, z.B. Sepharose 2B, Sepharose 4B Y ^ undSepharose 6B (hergestellt von Farmacia Corp.).
Bei der Kupplungsreaktion des wie oben erhaltenen, mit Cyänbromid aktivierten Trägers wird der mit Cyanbromid _/ 10 aktivierte Träger in einer Menge angewendet, die 30 bis 80 mal der des Lektins entspricht und man führt die Umsetzung in einem geeigneten Lösungsmittel, wie einer 0,1 Mol/l wässrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat (enthaltend 0,5 Mol/l Natriumchlorid; pH 8,4) bei einer Temperatur zv?ischen 0 und 400C und Vorzugsweise 2 und 8°C Während einer Zeit von etwa 10 bis..20 Stunden durch. Auf diese Weise erhält man einen Lektin " enthaltenden Träger für eine Äffinitätschromatografie.
Bei der Chromatografie unter Verwendung des Lektin enthaltenden, wie oben beschrieben hergestellten Trägers, kombiniert sich das gewünschte GRA mit dem auf dem Träger enthaltenen Lektin und wird in der Säule festgehalten. Anschliessend werden Substanzen, die zu einer Kombination in der Lage sind, z.bI mit einem Lektin,
durch die Säule laufen gelassen, wobei einer Austausch- " reaktion stattfindet, oder man führt alternativ eine Adsorptionsabtrennung (mit einer Eluierlösung)durch, z.B. mit einem hochkonzentrierten Salz, einer wässrigen ' Lösung von Kalaumthiöcyanat und einem Nitratpuffer, um das gevmnsch.te GRA abzutrennen und zu gewinnen.
Bei der Austauschreaktion sind Substanzen, die in der Lage sind, sich mit einem Lektin z\i verbinden, wenn ein Träger für die Affinitätschromatografie, enthaltend ein galaktosebindendeS Lektin, verwendet wird, beispielsweise solche, die sich mit einem endständigen galaktoseverbindendem Lektin kombinieren, z.B· Galaktose, Disaccharide, enthaltend end-* ständige Galaktose,und Oligosaccharide,enthaltend eine eridständige Galaktose. Beispiele für Substanzen, die in der Lage sind, sich mit einem Lektin zu verbinden, wenn als ' Träger für die Affinitätschromatografie ein N-Acetylgalaktos-. ;-, amin-bindendes Lektin verwendet wird, sind solche, die Sich S-" mit einem endständigen N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektin verbinden könnten, z.B. N-Acetylgalaktosamin, Disaccharide, enthaltend ein endständiges N-Acetylgalaktosamin und Oligosaccharide, enthaltend ein endständiges N-Acetyl-'#; i-;-;'. ' galaktosamin. - ;- .· " . r--''.-': .· . ' " - . . " ;:··';/'
Das so erhaltene GRA enthält Glykoprotein, enthaltend eine Galaktose und/oder N-Acetylgalaktosamin-Endgruppe, Glykolipide und/oderSaccharide.
Das so.hergestellte GRA kann gewünschtenfalls lyophiliisert werden und auch in üblicher Weise unter Anwendung üblicher Trennmethoden gereinigt werden. Beispielsweise kann man solehe GRA-Zubereitungen, die mit einem galaktoSebindenden Lektin isoliert wurden, einer Trennmethode unterwerfen, , unter Anwendung eines N-Acetylgalaktosamin verbindenden
Lektins und GRA, das mit einem N-Acetylgalaktosamin ver- · bindenden Lektin dann isoliert wurde, kann nach einer Trennmethode behandelt werden, unter Verwendung eines galaktosebindenden Lektins.
Die hier verwendeten Lymphocyten sind nicht kritisch ; und alle Lymphocyten von normalen oder krebsigen ' ; Menschen oder Tieren können verwendet werden. Beispie·* Ie hietfür sind Lymphocyten, die.man von peripherem Blut, Knochenmark, Lymphknoten, aus der Milz, den Mandeln oder der Thymusdrüse erhält. Diese Lymphocyten werden durch physikalische oder chemische Methoden, durch eine Oberflächerunembränmethode oder derglei-V;:';'-'' chen isoliert. _/;" . ;· .; ;. \ · ;:
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Die Sensibilisierung von Lymphocyten mit GRA erfolgt> indem man die Lymphocyten auf einem Kulturmedium, enthaltend GRA, während einer Zeit von 1 bis 10 Tagen,
1 vorzugsweise 2 bis 7 Tagen, kultiviert.
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Als Kulturmedium für die Verwendung zum Sensibilisieren der Lymphocyten können verschiedene übliche Nährmedien verwendet werden, die üblicherweise für solche ; Zellkultivierungen verwendet werden. Bevorzugte Beispiele schliessen ein RMPI 1'6;40-Mediumf eine Eagle-MEM-Kultur, etc., dem Htimanserum, Kalbsfötusserum (FCS), Kalbsserum, Pferdeserum oder dergleichen zugegeben
: wurde. Die Menge des zur Kultur gegebenen GRA beträgt im allgemeinen 1 iis 1.000 ng/ml und vorzugsweise 1 bis
: -. 13 -
500' ng/ml, berechnet als Menge Zucker.· pro 1 χ 10 /ml
Lymphocyten
Die Kultivierung wird in üblicher Weise, ζ.?, bei . einem pH von 7,2 und bei einer Temperatur von etwa ': 37eC durchgeführt.
Die so hergestellten Killerzellen gemäss der Erfindung sind im wesentlichen normale Lymphöcyten und haben eine GRA-spezifische Zellenbekämpfungsaktivität, Beispielsweise hat GRA-1-KT, eine der erfindungsgemässen Killerzellen, Eigenschaften die bei humanen peripheren Blut-T-Zellen vorkommen und zeigt eine zellbekämpfende Aktivität, die spezifisch gegen·* über Krebszellen, enthaltend GRA, ist, wie in den später folgenden Beispielen gezeigt wird. ' V^
Typische Beispiele für die neuen Killerzellen gemäss der Erfindung sind GRA-1-KZ und GRA-M-1, die in den nachfolgend beschriebenen Beispielen hergestellt wer-' ..; den. Diese Kilierzellen sind bei der Anmelderin erhältlich und bei ATCC hinterlegt worden.
Die.erfindungsgemässeh Killerzellen kann man unlimitiert vervielfältigen,unter Verwendung des vorerwähnten Kulturmediums, enthaltend einen T-Zellen-Wachstumsfaktor (TCGF, IL-2 ). in diesem Fälle kann man eine selektive Kultivierung von Klonen der Killerzellen mittels einer üblichen Ultraverdünnungsmethode durchführen. Die Killerzellen können stabil über lange Zeiträume in /
beispielsweise flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden,
Das GRA kann einzeln als aktiver Bestandteil eingesetzt werden oder es kann zusätzlich in Kombination mit anderen bakteriziden Mitteln und krebsinhibierenden Mittel verwendet werden. Krebsinhibierende Mittel,
. die das erfihdungsgemässe GRA als aktiven Bestandteil enthalten/ können in jeder Form vorliegen, unter der Voraussetzung, dass sie GRA in wirksamen Mengen enthalten· Im allgemeinen wird das Mittel intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär in Form einer Lösung, einer Suspension öder als Emulsion verwendet. Man kann es auch als Tröckehprodukt herstellen und dann unmittelbar ι vor der Verwendung durch Zugabe eines geeigneten Trägers in eine Flüssigkeit überführen. Dieses flüssige Mittel; kann ein Suspensionsmittel, z.B. Methylzellulose, ein Emulgiermittel, z.B. Lecithin, Konservierungsmittel, z.B. Methyl-p-hydroxybenzoat, Stabilisierungsmittel und dergleichen enthalten, soweit diese keine nachteilige Wirkung auf die Immunisierungsfunktion
bei Menschen oder Tieren hervorrufen. Auch Puffer kön- · ; nen enthalten sein.
Geeignete wässrige Träger sind beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung und ein geeigneter nichtwässriger Träger kann beispielsweise ein Pflanzenöl,
- z.B. Sesamöl, ein Mineralöl, ζ.B; Paraffin, öder ein tierisches öl, z.B. Squallene, oder auch Propylenglykol sein. Zur Erhöhung der immunologischen Wirkung kann man ein geeignetes Adjuvants inkorporieren. 5 Geeignete Adjuvantien sind beispielsweise Freund1s V Complete Adjuvants, Saponin bei Tieren und Aluminiumhydroxid beim Menschen.
Das erfindungsgemässe Anti-Krebsmittel kann einmal oder wiederholt Über längere Zeiträume einem Rrebspa-' .. tienten zur Behandlung von Krebs verabreicht' werdenoder man kann es jemandem verabreichen, der krebsanfäl lig ist, um dadurch dem Krebs vorzubeugen. ·
1'5 Da XiDe0 (Maus, intraperltoneal) von GRA wenigstens ν 500 mg/kg, berechnet als Zuckermenge, beträgt, zeigt , das Anti-Krebsmittel gemäss der Erfindung eine niedrige : Tokizität und man kann .es deshalb innerhalb eines ' weiten Dosierungsbereiches verabreichen. Obwohl die Konzentration von GRA in dem Anti-Krebsmittel gemäss
der Erfindung nicht kritisch ist, wird doch bevorzugt, es in einer Menge von 0„001 bis 100 ug/ml, berechnet ^ als Menge des Zuckers, zu verwenden. Hinsichtlich der
Dosierung des Anti-KrebsmitteIs wird im allgemeinen U25 bevorzugt, das Mittel in einer Menge von 0,001 bis ; 1.000 ug/kg/Tag auf einmal oder in.verschiedenen An-.:': teilen zu verabreichen, wobei jedoch diese Dosierung von dem Krankheitsgrad, dem Alter Und dem Geschlecht des Patienten abhängt.
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Kilierzellen als aktiven Bestandteil enthält, wird vorzugsweise als injizierbare Lösung in Kombination mit Trägern/ die bei der Herstellung von Blutmedizinen. Anwendung finden, verwendet. Die hier verwendeten Träger sind nicht kritisch, jedoch bevorzugt man Träger,
die die gleiche Tonizität wie Blut aufweisen. Besonders wird physiologische Kochsalzlösung bevorzugt. Bei der Herstellung des Mittels wäscht man vorzugsweise die ; Killerzellen ausreichend mit einer physiologischen Koch-TO salzlösung oder dergleichen, um das vorerwähnte Kulturmedium zu entfernen und anschliessend wird es dann ν / ' ^
Die Konzentration an Killerzellen in dem Mittel ist nicht besonders begrenzt, sie beträgt jedoch vorzugs-
- ·. /V- ·· ·.-,·»..·. Q -.
weise .zwischen 10 und 10 pro Milliliter. Verabreicht man die Killerzeilen intraperitoneal in einer Dosis von TO pro Maus, so stellt man keine Toxizität fest. Zwar hängt die Dosis des. erfindungsgemässen Anti-Krebsmittels von dem Grad der Krankheit, dem Alter und dem : Geschlecht des Patienten ab, jedoch wird im ällgerneinen das Mittel vorzugsweise in einer Dosis von 10 bis
10 /kg/Tag auf einmal oder in verschiedenen Anteilen : ; _. '':· ,.'.; verabreicht..;::;'}-.;', '[ .'...,- / .' . v---·' ' '- :'2s^.:y -[ '; ; ·. " .·. ....':: ; :;.': , " .; ;.'.-:- "'i'.--..-'- ,. ' : , < Die folgenden Beispiele, Referenzbeispiele, Versuchs-' ν ν beispie ieι und Ve'rgleichsbeispiele beschreiben die Er- ; findung, ohne si^ie zu beschränken..
- .17 -
(I)-A Herstellung von FITC-markiertem Lektin .
(PNA-FITC)
10 mg Erdnusslektin (PNA), hergestellt von EY Co.) wurden in 2 ml einesO,01M Phosphatpuffers, enthaltend
AQ Of8? % NaCl (pH 7/2) gelöst. In 1 ml eines 0,5M w Kydrogenkarbpnatpuffers (pH 9,0) wurden 2 mg FITC (hergestellt von Sigma Laboratories Ine.) gelöst und ein 0,5 ml Anteil der gebildeten Lösung wurde zu dem zuvor hergestellten PNA-Puffer gegeben.; Die Mischung wurde2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend über Sephadex G25 (10 nun χ 300 mm, hergestellt von· Farmäcia Corp.) getrennt. Das Anfangspeak wurde gesammelt, FITC/PNA-Verhältnis: 1,0.
20. (D-B Zubereitung von FITC-markiertem Lektin
• (DBA-FITC)
' . . ^ .·"'..' ' . - '' . . . .
In gleicher Weise wie in (D-A oben erhielt man DBA-FITC unter Verwendung von DBA, hergestellt von EY Co. EITC/DBA-Verhältnis » 0,9.
(1)-C Sojabohnenagglutinin-FiTCfTIFT-SBA) ist von Ey Co. erhältlich
FITC/SBA-Verhältnis » 1,4.
(2) Lokalität von GRA auf verschiedenen Krebs-
νΐ '·λ '.. -·': -.'"'"-i" ' ' 'zellen · ' .· . . ' ' " : -.' '' ' ·. ''·...
(a) Human kultivierte Krebszellen (1 χ 10 ) wurden dreimal mit einem 0,05 M tris-Salzsäurepuffer, enthaltend
0/85 % tiaCl (pH 7,2) durch Zentrifugenverfahren gereinigt und dann wurden 100 μΐ PNA-FITC, DBA-FITC ~ oder SBA-FITC, (200 ug/ml), hergestellt und gemäss (Ϊ), zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten zur Umsetzung bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung derUmsetzung wrude das Reaktionsgemisch dreir mal mit einem 0,01M Phosphatpuffer, enthaltend 0,85 % NaCl (pH 7/2) gewaschen und anschliessend wurden die Zellen auf eine Glasplatte gelegt und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Die*Krebs-,zellen sind alle bekannt und wurden von "First Pathology Laboratories* Medical Department of Niigata University",
- 1-9 -Tabelle 1
| Krebszellen | (Neuroblastoma) | positives Ver | von | |
| (Neuroblastoma) | hältnis | |||
| (Neuroblastoma) | GRA (%) | DBA SBA | ||
| (Burkitt Lyinphoma) | (Neuroblastoma) | PNA | 1'4 | |
| Räji | (Burkitt Lyinphoma) | (Neuroblastoma) | 98,3 | 5,2 · |
| Daujl | (Burkitt Lymphma) | 93,1 | o | |
| BT-1 | (T-Zellen Lyinphoma | 50,1 | 6,7 | |
| P-12 | (T-Zeilen Leukemia) | 44,3 | 4,8 | |
| MOLT | (B-Zellen Lymphoma) | 0,6 | 5,3 | |
| Fujimaki | (IgD-Myeloma) . | 19,2 | 10,0 | |
| ODA , | (Lungenkrebs,squamös) | 0,6 | 2*0 | |
| QG-56 | (Lungenkrebs,squamös) | 70,4 | 0,4 | |
| PC-I. '· ' :..' | (Lungenkrebs'-, adenocarclnom) | 78,4 | 0 | |
| PC-3 | (Lungenkrebs> kleine Zellen) | 77,1 | 0 | |
| QG-90 | (Lungenkrebs/ grosse Zellen) | 68,0 | 0 | |
| PC-13 | (Magenkrebs, por.) | 17,0 | 0,1 \ · | |
| MK-2 | (Magenkregs sig.) | 63,7 | 0 | |
| KATO-III | (Magenkrebs por.) | 57,3 | 40,3 | |
| MKN-45 | (Magenkrebs, adsq.) | 1#0. | 0,4 | |
| MKN-1 | (Magenkrebs/tubl) | 4,6 | 0,1 | |
| MKN-28 | (Magenkrebs,tubl) | 0,4 | 0 | |
| MKN-74 | (Harnblasenkrebs ca·) | 0,5 | 0 | |
| MGH-Ut:' | (Harnblasenkrebs ca.) | 37,4 | 21,4 | |
| KÜ-2 | (Harnblasenkrebs ca.) | 4,5 | 0 | |
| T-24 | (Harnblasenkrebs ca.) | 14,6 | 1,0 | |
| NBT-,2 | (Nierenkrebs) | 13,1 | o | |
| NRC-12 | (Nierenkrebs) | 23,9 | 0,6 | |
| KU-1 | Kuramochi (Eierstockkrebs) | 3,3 | 0 | |
| NB-1 | 80,0 | 1,7 | ||
| YT-nu | 20,9 | 0,5 | ||
| TGW-nu-1 | 3,6 | o | ||
| TGW-nu-11 | 4.1 | 1,0 | ||
| GOTO | 2,0 | o · | ||
| 0,5 |
| ITO | (Embryonalcarcinoma) "" | 96,9 | 12,3 | 90,7 |
| NEC-8 | (Embryonalcarcinoma) | 44,6 | 0 | 6,4 |
| SCH | (Choriacarbinoma; Magen) | 14,6 | 3,1 | |
| GCH | (Chriocarcinoma, Uterus) | 5,4 | 0 | |
| YN-I | (Rhabdömyosarcoma) | 5,7 | 1,7 . | |
| Maus | X 5563 (Plasmacytoma) | 92,0 | 0 | |
| Maus | MH134 (Hepatoma) | 18,6 | 0 | |
(b) Das maligne Gewebe von Krebszellen wurde durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl (150 mesh) gegeben, unter
Erhält einer Einzelzellensuspension. Nach zweimaligem Waschen mit 0,01MvHCl-PUffer (pH 7,4},enthaltend 2mMol ν CaCl2, 2mMpl MgCl2 und 0,85% NaCl wurden 5x1O5 Zellen
in 100 μΐ Puffer resuspehdiert.. 100 μΐ FITÖ-PNA odsr FITC-DBA (200 ^g/ml) wurden zu der Zellsuspension gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur·20 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit kaltem PBS ν wμrden die Zeilen unter einem Fluoreszenzmikroskop un-'.:; . ter sucht./ .-,; 'V--.-;· . .-' ' v- " ..-. · . ; ' .- ; ;:.;/ 'ϊ''Ο--:'.'ι.'::-... .- , ;. -.- .... . -.- - ;'; .';:' ' .
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Das maligne Gewebe von Krehspatienten wurde von der Kansai Medical Universität erhalten.
- 21 Tabelle 2
GRA
Nr. Krebspatienten-Gewebe PNA DBA
| 1 | Magenkrebs |
| 2 | Magenkrebs |
| 3 | Magenkrebs |
| 4 | Magenkrebs· |
| 5 | Magenkrebs |
| Magenkrebs | |
| 7 | Brustkrebs |
| 8 | Brustkrebs |
| 9 | Brustkrebs |
| 10 | Brustkrebs |
| 11 | Dickdarmkrebs |
| 12 | Dickdarmkrebs |
| 13 | Esophaguskrebs |
| 14 | Hepatoma |
| !•Anmerkung: " + " be ze |
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11 Dickdarmkrebs + +
2Ö :·Anmerkung:' "+" bezeichnet das GRA auf der Zelloberfläche;
"-" bedeutet, dass GRA auf der Zelloberfläche nicht vorkommt.
f Referenzbeispiel 2 ' '
/:: 25 · ', ". ; .. ' ';.' : . ' ' · ' .'· ' ' .' '.-.' : ' ' ' ' : Herstellung^von^GRA
(1)-A Herstellung von immobilisiertem Lektin r (PNÄ-Sepharose)
' ' " '"., ' · * » '
3 g CNBr-aktivierte Sepharose 4B (hergestellt von Farmacia Cörp.) wurden gründlich mit 1 mmol HCl gewaschen und in 200 ml 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) suspendiert. Dazu wurden 5 ml eines p,01M Phosphatpuffers (pH 8,5), enthaltend 20 mg PNA, gegeben und dann.erfolgte die Umsetzung bei 25°C während 2 Stunden, wobei man einige Male rührte unter Erhalt von PNA-Sepharose.
- (D-B In gleicher Weise wie bei (D-A oben, mit
: der Ausnahme, dass DBA anstelle von PNA verwendet wurde, erhielt man DBA-Sepharose.
S (2) Herstellung von GRA ·
(a) BT-1 (Burkitt Lymphoma)-Zeilen (1,3 χ 108) wurden 3 mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann wurden 30 ml eines 0,01M tris-Salz- säurepuffers (pH 7,4), enthaltend 2 % Triton X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl2 und 2 mmol MgCl, zugegeben. Die Mischung würde 15 Minuten bei 4°C gerührt und dann einer ültrazentrifugenabscheidung mit einer Rate von 100.000 χ g unterworfen. Von 28 ml der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde ein 14 ml-Anteil • durch eine Säule (Durchmesser 0r5, Länge 1 cm) für die Affinitätschromatografie geschickt, wobei die Säu^e mit PNA-Agaroseperlen (hergestellt von Maruzen Co., Ltd.),
2Q die zuvor mit einem tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,1 % Triton X-100, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl- und 2 mmol MgCl2 ins Gleichgewicht gebracht wor-S-f den Waren, geschickt. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer, wie er oben verwendet wurde, wurde mit einem 0/OTM tris-Salsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,TM Laktose, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl2/ 2 mmol MgCl2 und P, 1 4 Triton X-100 eluiert. Der so eluierte Anteil
wurde mit einer 0,1M tris-Salzsäurepufferlösung, ent·? haltend 0,85 % NaCl, 2 mmol MgCl2 und 2 iranol CaCl2 48 Stunden dialysiert, wobei man 17 mg einer GRA-rLösung erhielt. In dieser GRA-Lösung wurde die Menge an Pro-
tein und die Menge an Zucker nach der Folin-Lowry-Methode bzw. nach der Phenöl-Schwefelsäure-Methode bestimmtJ diese Mengen, betrugen 644 ug bzw, 120 \ig. Dieses Produkt wird nachfolgend als "GRA-I" bezeichnet'*'
:-V (b) c3/BE.-Mäuse-Brustkrebs~MMT-2ellen Π x 10 )wurden 3~mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und darin wurden 30 ml einer 0,01M tris-Salzsäurepuffer-. lösung (pH 7,4), enthaltend 2 % Triton X-100, 0,85 % NaCl, 2 iranol CaCl2 und 2 mmol MgCl2/ zugegeben. Die
Mischung wurde 30 Minuten bei 4°C gerührt. Anschliessend würde die Mischung einer ultrazentrifugenabschei- : dung in einer Rate von J 0.0.0*00 χ g während 2 Stunden
• unterworfen, und die überstehende Flüssigkeit wurde übjer Nacht init ö^nem Ο,ίΜ tris^Salzsäurepüffer (pH 7,4), Enthaltend 0,85 % NäClr 2 mmol CaCl2 und 2 mraol MgCl2, dialysiert. Die so dialysierte Flüssigkeit wurde auf 3 ml konzentriert und ein 1 ml-Anteil wurde durch eine Säule (Durchmesser 0,5, Länge 2 cm), die mit der gleichen PNA-Sepharose, wie zuvor verwendet, gefüllt worden war und die mit einem tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4),enthaltend 0,05 % Triton X-TOO, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl2 und 2 mmol MgCl2, ins Gleichgewicht gebrächt worden war, einer Äffinitätschromatografie unterworfen. Nachdem man gründlich mit der gleichen Pufferlösung wie zuvor gewaschen hatte, eluierte man mit
einer Q, 1M tris-Salzsäurepufferlösung (pH 7,-4), enthaltend O, IM Laktose, 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl0, 2 mmol MgCl2 und 0,005 % Triton X-IOO, und der so eluierte Anteil wurde dann 48 Stunden dialysiert mit einem 0,01M tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,85 % NaCl, 2 mmol CaCl2 und 2 nunol MgCl2. Kan erhielt 2 ml einer GRA-Lösung. In dieser GRA-Lösung betrug der Proteingehalt 156 ug und der Zuckergehalt 94 iig. Diese Lösung wird nachfolgend als "GRA-M-1" bezeichnet. . "
(c) Annähernd 120 g (Nassgewicht) KATO-III wurde in einem Waring-Mischer in 100 ml PBS homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren mit 100.000 g während einer Stunde wurden die Pellets in 100 ml einer 2% Triton X-100-Lösung in 0,01M Tris-HCl-Puffer (pH 7,6),enthaltend 0,15M NaCl gelöst. Die bei der Zentrifugierung mit 100.000 g während ,1 h erhaltene überstehende Lösung wurde auf eine Säule von PNA-Sepharose' 4B (0,8x15 cm) zugegeben, die zuvor mit 0,015 % Trito X-100 in 0,01M Tris-HCl (pH 7,6), enthaltend 0,15M NaCl ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgetragen. Nach dem Waschen mit 50 ml des Puffers wurde GRA mit dem 0,1M Laktose enthaltenden Puffer eluiert. Das eluierte GRA wurde gegen 0,85 % NaCl dialysiert, konzentriert mittels Sephadex Pharmacia Co. und bei
"25 -2i3°C'vor der Anwendung gelagert. '
Die Mengen an Protein und Zucker, in gleicher Weise bestimmt wie bei (a) oben, betrugen 2,0 mg bzw. 0,8 mg. Dieses Produkt"wird nachfolgend als "GRA-2" bezeichnet. ," ··..
(d) Wie in (c) wurden die folgenden GRA-Proben erhalten:
| Material | Tabelle 3 | — .· | Menge(g) | GRA | Zuckerge | |
| GRA- · | Quelle | Proteingehalt | halt (mg) | |||
| Probe | 33 | (mq) | * ' . 0/09 | |||
| ,. - - BT-a | 0,5 | |||||
| GRA-3 | Exzidierter | ' ' .5 , | 0,5 | |||
| GRA-4 | Brustkrebs | 24 | 0,25\ | 0,38 | ||
| QG-46 | 26 | 0,6 | 0,54 | |||
| GRA-^5 | QG-90 | 29 | 1,0 | 0,45. | ||
| GRA-6 | Raji | 200 | 0,78 | 28,4 | ||
| GRA-7 | MMT | 14,4 | 11,3 | 0,07 | ||
| GRA-M-2 | 85 | 0,06 | 0,35 | |||
| GRA-M-3 | MH-135. | 25 | 0,65 | 0,23 | ||
| GRA-M-4 | X-5563 | 0,56 | ||||
| GRA-M-5^ | ||||||
(e) In gleicher Weise wie bei (c),·jedoch unter Verwendung von NKN-45 (etwa 29g) anstelle von Kato-III und unter Verwendung vn DBA-Sepharose, erhalten gemäss (D-B, anstelle von PNA-Sepharose 4B und unter Eluieren mit N-Acetylgalaktosamin erhielt inan eine GRA-Zubereitung mit einem Proteingehalt
' '. '· / von JD,03 mg und einem Zuckergehalt von 0,01 mg. Dies wird nachfolgend als GRA-8 bezeichnet. · '
(f) * GRA-3, herg^stllt gemäss (d) (5 ml) wurde auf eine DBA-Sepharose-Säule gegeben und mit Tris-HCl-Puffer (0,015 % Triton X-100, 2 mMol MgCl2, CaCl2, 0,85 % NaCl) eluiert, v;obei man 4 ml-Fraktionen Nr. 1-1:2 erhielt. Fraktionen 1-3 werden als "GRA-3-A" bezeichnet und Fraktionen 4-12 als "GRA-3-B". Dann wurde die Säule mit dem gleichen Puffer eluiert, der jedoch 0/, IM N-Acetylgalktosamin enthielt und wobei man Fraktionen erhielt die mit "GRA-ß-C" bezeichnet
werden. · .
(g) SDS-Ge!elektrophorese
Jede ·· derobigen GRA-Zubereitungen wurde einer Elektrophorese unterworfen, wobei die Methode von Fairbanks et al: BIochemistry, Band 10' :, S. 2606, 1971, angewendet wurde *
Die Ergebnisse werden in den Fig. 18 bis 22 gezeigt.
In den Fig. 18-19 bedeuten die Zahlen 1 bis 5 folgendes: 1 ... Standard; 2 ... GRa-M-3; 3... GRA-7; 4...GRA-1; und
In Fig. 20 bedeuten die Zahlen 1 bis 4 folgendes: 1 ...Standard; 2. ..GRA-M-2; 3...GRA-r6; 4...GRA-5.
' -V-:--'-'1. ' .; -. ' .'· '.. '.' ... ··: ' .·;
In Fig. 21 bedeuten die Zahlen 1 bis 3 folgendes: 1...GRA-M-4; 2.,.GRA-M-S; 3...Standard:
In Fig. 22 bedeuten die Zahlen 1 bis 4 folgendes: 20 1...GRA-3; 2...GRA-3-A; 3...GRA-3-B, 4...GRA-3-G,
Fig. 18 zeigt den Zustand von GRA nach einer Proteinanfärbung gemäss C.B.B. (Fairbanks et al: Biochemistry/ Band 10, S. 2606, 1971).
. ' ; ; ;'.: . - ; . '.' Fig. 19 bis 21 zeigen den Zustand von GRA nach Behandlung mit einer Zuckerfarbreaktion gemäss PAS-Methode (R.M. Zacharius et al: Anal. Biochem. Band 30, S. 128 (1962)).
Fig. 22 ist eineschernätische Darstellung der Ergebnisse von Anfärbungen gemäss der vorerwähnten C.B.B.-Methode.
Als Standard wurden die nachfolgenden, von Biorad Lab. Calif .USA erhaiteiien Substanzen verwendet:
K Dalton; Myosin
| 11 | 6 | Il | ; B-Gälactosidase |
| 92 | /5 | Il | ; Phosphorylase |
| 66 | ,2 | " | ; BSA |
| 45 | Il | ; Ovalbumin | |
| 21 | ,5 | β | ; Sojabohnentryps |
Referenzbeispiel 3
(a) Die Milz von japanischen Affen (erhalten von der. Japan Plymates Co., Ltd.} wurde herausoperiert und 2 mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium (hergestellt von der Flow Laboratory Co.,- Ltd.) gewaschen. Die Zellen wurden unter Verwendung von Mesh (hergestellt von Millipore Ine*f 150 mesh) filtriert und einem spezifischen Schwer-20. kraftzentrifugenverfahren (spezifische Schwerkraft
. · '. '.' . . . . η
1,076) unterworfen, wobei man 2 1 von 2. χ 10 /ml Lymphocytenerhielt. Die so erhaltenen Lymphocyten wurden ; 3 mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium gewaschen und
die Anzahl der Lymphocyten wurde auf 5 χ 107/ml unter Verwendung des gleichen Mediums wie zuvor, enthaltend - 10 % FCS, eingestellt. Dann liess man sie in einer Kohlendioxid-Fermentationsvorrichtuhg 1 Stunde bei 37eC stehen. Die überstehenden Lymphocyten wurden gewonnen
3Ov' ,' '·. .. .' ;: ' ; - "' . ' ' · · .
- 2 δ -
und die Anzahl der Lymphocyteh wurde unter Verwendung des gleichen Kulturmediums wie vorher angegeben, enthaltend 1 % FCS auf 1 χ 10 /ml eingestellt. Anschliessend wurden 1 ;.'\ig/ml Indomethacin (hergestellt von Sigma Laboratories Ine.) und 0,2 % PHA-^P (hergestellt von Dipco Co.) zugegeben und dann wurde die Kultivierung in einer Kohlendioxidgas-Fermentationsvorrichtung ' :. 48 Stunden bei 370C durchgeführt. Nachdem man 10 Minuten eine Zentrifugenabscheidung (3.000 UpM) durchge-— 10 führt hatte, wurde die gebildete überstehende Flüssigkeit gewonnen und sterilisiert, indem man sie durch eiii MiXlipore-Filter (hergestellt von der Millipore Ιηέ.., Ö,2 μίη) filtrierte und wobei man 2 1 TCGF erhielt.
(b) Als Quelle von TCGF wurde die überstehende Flüssigkeit von misbhkultivierten periphelren Blutlymphocyten
- von'10 gesunden Spendern verwendet. Nicht zusammenhängende Lymphpcyten, hergestellt von CF. (Conray. Ficol (Japan Immunpresearch Co.)) abgetrennten Lymphcyten durch Adsorption auf Plastikoberflächen bei 37°C während 1 h wurden : .;·. ..' -in RPMI 1640-Medium,, enthaltend 1 % FCS (1,5x106Zellen/ml) ^' suspndiert und mit 0,2 % PHA-P, INdomethacin (1ug/ml) und V: Huiman-ÖrZellen (BT-1J (1,5x105 Zellen/ml) , vorbehandelt
- mit Mitömyciri C (50 um/ml) inkubiert. Nach 48 Stunden wurde die aufschwimmende Kultur geerntet und als TCGF-
Quelle verwendet (H.Inoue et al, Scand.J. Immunol. 12, • S.-149-145 {1980)) .
5 (T) Human-periphere Blutlymphocyten
50 ml Blut, erhalten von gesunden Erwachsenen oder Pateinten mit verschiedenen Krebsen durch Häparinisie-, rung/ wurden unter Verwendung von Ficol Pack (hergestellt durch Farmacia Japan Co., Ldt.) einer Zentrifugenabscheidung unterworfen, wobei man 5 χ 10 periphere Blutlymphocyten erhielt. -
15 (2) Mäuse-Milzlymphocyten .
Die Milz einer C3H/He-Mau& (männlich, 6w) wurde exzidiert und 2-mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium
.- 30 -
gewaschen. Dann wurde die Milz mittels einer Injektionsnadel gelockert und durch ein Sieb ausrostfreiem Stahl·, (100 mesh)"zur Entfernung grosser Teile passiert. Die so filtriertenZellen wurden 2 mal mit dem gleichen Kulturmedium wie oben gewaschen und dann einer Zentrifugentrennung mit einer Rate von 1.200 UpM während 10 Minuten unterworfen, wobei man 4 χ 10 Milzlymphocyten erhielt.
το:' '' · ,f : ."' , . '.- .' ;' ; ' .' '
λ.;'-:.--"'; Beispiel 1 ".,·' ''..' '' -. ·.' ' .' ' · ' - .
GRA-1 (Menge an Protein 40 ug/mlj Menge an Zucker 7,5 ug/ml, erhalten'gemäss Referenzbeispiel 2(2a)) ! wurden auf das 1.000-fache des Ursprungsvolumens mit ;.; einem RPMI-1640-Kulturmedium, enthaltend 15 % FCS, verdünnt/ unter Erhait eines Sensibilisierungs-Kultur-
mediums. .
20 :' '-'^ ' ; .; .'. ; ' ' ' ·; . .. - ;. . . . '· .·
Lymphocyten von humanem peripheren Blut (5 χ 10 /5 ml), erhalten gemäss Referenzbeispiel 4(1), wurden zu 5 ml des Sensibilisierungs-Kulturmediums, hergestellt wie oben, gegeben und dies wurde dann in eine Laborschale
"25 gegeben und 2 Tage bei 37°C kultiviert. Anschliessend erfolgte eine weitere Kultivierung auf einem RPMI-1G4Ö-Kulturmedium, enthaltend 20 % TCGF und 15 % FCS, erhalten gemäss Referenzbeispiel 3, für weitere 5 Tage, wobei man 20 ml einer Killerzellenlösung, enthaltend
1 χ TO6 Killerzellen/ml, erhielt. Diese wird nachfolgend als GRA-1-K-T bezeichnet. ·
,:, ' :' Beispiel 2 · .· - ' . · . .- . ' .. : ·-. . , / .'
Die Mäuse-Milzlymphocyten, die im Referenzbeispiel 4(2) erhalten worden waren, wurden unter Verwendung eines RPMI-1640-Kulturmediums, enthaltend 15 % FCS, auf eine Zahl von 5 χ 10 /ml eingestellt. Dazu wurde GRA-M-1, erhalten gemäss Referenzbeispiel 2(2b) gegeben, so dass das Endprodukt 1,5 ug/ml Projbein und 0,9 pg/ml Zucker enthielt. Ein 5 ml-Anteil des erhaitenen Gemisches wurde in eine Laborschale (60 mm χ Xs mm, hergestellt von Faldon Co.) 2 Tage bei 37°C kultiviert. Es wurde die Bildung von Klonen beobachtet. Der Anteil wurde weiter in einem RPMI-1640-Kulturmedium mit 15 % FCS, enthaltend 20 Vol.% TCGF (hergestellt von Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd.)
während 4 Tagen kultiviert, wobei man 50 ml einer KiI- * lerzellenlösung, enthaltend 1 χ 10 Killerzellen/ml erhielt. Diese wird nachfolgend als GRA-M-I-K-T bezeichnet.
Lyinphocyten (5x10 ) von peripherem Blut gesunder Spender wurde in einem RPMI-1640-Medium, enthaltend 40 ng/ml (Pröteingehalt) von GRA-2 und 15 % FCS bei 370C inkubiert. Am zweiten Tag wurde das vorerwähnte Human-TCGF- zu dem Medium zugegeben, bis dessen Konzentration 20 % erreichte und die Inkubierung wurde 3 Tage fortgesetzt; wobei man Killer-Zellen erzielt^ diese werden nachfolgend als "GUA-2-K-T" bezeichnet. · '
Killerzellzubereitungen GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T und GRA-3-C-K-T wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von fRA-8, GRA-3-A und GRA-3-C hergestellt {Proteingehalt: 50 ng/ml/ und des TCGF/ das im Re'ferenzbeispiel 3-(b) erhalten wurde.
G3HE/Mäusen (weiblich 8 V7ochen alt) wurde intradermal '.. X5563-.Zell.eh (10 ) des .!.gleichen Stammes implantiert und nach 7Tagen wurde derTumor chirurgisch herausgeschnitten. IQach weiteren 7 Tagen wurden X5563-Zellen (10 ) gleichen Stammes inokuliert und Mäuse, die gegenüber der Inökulierungresistent waren, wurden als Immun-Mäüse feezeichnet.
Die MilzzeHen der Immunmäuse und von C3H/HE-Mäusen wur- : den unter üblich angewendeten Methoden präpariert.
Jedes Lot von Milzzellen (5x10 /Well) wurde mit 40 ng/ml (Proteingehalt) yon GRA-M-5 in RPMI-1640-Medium, enthaltend TS % FCS während 5 Tagen sensibilisiert unter Erhalt vdn Killerzelleh.
Killerzell-Zubereitungen, die aus normalen Milzzellen erhalten wurden, werden nachfolgend als "GRA-M-S-K-t-V bezeichnet, und solche, die von Immunen Milzzellen erhalten wurden, werden mit "GRA-M-5^K-T-2" bezeichnet.
Lymphocyten von peripherem Human-Blut (5x10 ) wurden in 5 ml RPMi-1640^-Medium, enttialtent 50 ng/ml (Proteingehalt) GRAH; 1 bei 37°C während 2 Tagen inkubiert. Am dritten Tag (!wurden die Lymphocyten in das RPMI-1640-Mediüm,enthaltend 10, % Serum von dem Spender der Lymphocyten, und (| bis 100 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-1 übetragen urjid die Inkubierung wurde nach weiteren 5 Tagen fortgeführt I wobei man die in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigten Klllerzellen-Zubereitungen erhielt.
· ·' .'.-. ' j; . ;.;- ' '' ' ' ' . . ..- · . ' '. ' ' . '"
' : .·'- ''·.' - $ ' : ' :'" Tabelle 4 ' . -.-.
ν.;.-; /-ν .(;;..ry:.'. . . : .;: ,. . . . ;·.; GRA-Kohte'ht!ation (ng/ml)
Erster /Tag | . Tag 3 Killerzellen
| 0 | 6 | GRA-1-K-T-1 |
| 3, | 2 | GRA-1-K-T-2 |
| 3/ | GRA-I-K-T·^ | |
| 6 | 5 | GRA-1-K-T-4 |
| 12, | GRA-1-K-T-5 | |
| 25 | GRA-1-K-T-6 | |
| 50 | GRA-1-K-T-7 | |
| 200 | GRA-1-K-T-8 | |
50 50
50
-.' '. ·;' ' ' ' . 50' '50
Ia) Lymphocyten von peripherem Blut (PBL) von verschiedenen Krebspatiehten nach der Operation wurden mit GRA-3 sensibilisiert unter Erhalt von Killerzeller-Zubereitungen. PBL (5x10 ) von: den Patienten wurde in RPMI-.1640-Medium, enthaltent 50 ng/ml (Proteingehalt) von lRA-3 währen 2 Tagen inkubiert und dann inkubierte man in RPMI-1640-Medium> ent-
. ' ''· .' -: ' ' ·' '*· '
haltend 20 % TCGF und 15 % FCS weitere 5 Tage unter Erhalt
\ der Kilierzellen/ die in Tabelle 5 gezeigt werden.
| P-GRA D-GRA | 5 · : ·. | Killerzellen | |
| Tabelle | - | ||
| '·! ." / ' Periphere Blut-Lymphocyten | + ·' ' + + '.. - · · '. + ".- - ·.." f .. + .' - -.+ -.' - .-' | Tage nach der | GRA-3-K-T-1 GRA-3-K-T-2 GRA-3-K-T-3 GRA-3-K-T-4 GRA-3-K-T-5 GRA-3-K-T-6 |
| Krebs | Operation | ||
| 14 ·;; '35 ': : 21 7 35 21 | |||
| Mägenkrebs Magenkrebs Brustkrebs Brüstkrebs Brustkrebs Magenkrebs | |||
In der obigen Tabelle feduetet P-GRA und D-GRA die Lokalität von GRA, ausgedrückt als Maligne-Gewebe (durch,Operation entnommen) von Krebspatienten, von denen
PBL in gleicher Weise gesammelt worden war, wie im Re- : : ferenzbeispiel 1/ 2-(b),. P-GRA und D-GRA wurden erhalten unter Verwendung von FITC-PNA bzw. FITG-DBA. Die Tage naöh der Operation geben die Zeit an, wann BPL nach der
Operation gesammelt worden war.
(b) PBL (5x10 ), gesammel-fe von Brustkrebspatienten 21 Tage nach der Operation wurde in RPMI-164O-Medium, enthaltend
.25 50 ng/ml (Proteingehalt) GRA-3 und 10 % Serum von den Patienten während 7 Tagen inkubiert, um das ^BL zu sensibilisieren und unter Erhalt von Killerzellen-Zubereitungen. Diese werden nachfolgend als GRA-3-K-T-7 bezeich-'
" ,' net.· ,-' ;, ..· '"-' . . ' ': ' -
·.: ... Beispiel 8 ' . · ·~ ·.. . "·\-:-':· ' ' -V,'1'/''''
(i) GRA-M-1> erhalten gemäss Referenzbeispiel 2(2b) wurde mit physiologischer Kochsalzlösung so S verdünnt, dass der Gehalt an Zucker 1,0 ug/ml und fan Protein 1', 6 ixg/tal betrug. Auf diese Weise erhielt man ein Anti-Krebsmittel Nr. 1. ;
(Ii) Ein Krebsgewebe von C3H/He spontan auftretendem Brustkrebs wurde steril zu einem 5 mm kubi-. ,' sehen Klumpen geschnitten und unter die Rückenhaut von jeweils 10 C3H/He-Mäusen des gleichen Stammes wie oben (7 Wochen alt, männlich) transplantiert. 7 Tage nach der Transplantation wurde die Fixierung und Multiplizierung des Krebses bestätigt. 5 dieser Mäuse erhielten subkutan das gemäss (i) hergestellte Anti-Krebsmittel Nr. 1 in einer Dosis von 300 μΙ/Tag in 2-tagigem Abstand. Die restlichen 5 Mäuse wurden als unbehandelte Kontrolle verwendet. 10 Tage nach der ersten Verabreichung wurde der Tumor operativ entfernt und dessen mittleres Gewicht gemessen. Gleichzeitig wurde eine pathohistologische Untersuchung durchgeführt.
Tumorvolumen ,
**m *~ Φ*, m*· m* ~m ^m mm Φ-~m m»—k .. % . \ . _ _
25 behandelte Gruppe: 22,3 mm3 (Fig.14) Kontrolle: 162,7 mm3 (Fig.15)
Dies bedeutet, dass der Tumor um 86,3 % zurückging.
In der Kontrollgruppe (Fig.16) wurden vogelnestähnli-* ehe Krebskörper gebildet, v/obei die Art des Gewebes
einem markähnlichen .kanalförmigen Krebs entsprach und eine Verfielfachung der Krebszellen über das Gesamtgewebe festgestellt wurde. Andererseits verursachten bei der Gruppe, die mit dem Mittel behandelt wurde ;·.-.) (Fig* Π) die Krebszellen eine, Verf lüssigungsnecrosis an den Stellen, wo sich die Krebszellen gebildet hatten und eine Verkalkung und . Firosis wurden festgestellt, wobei nur eine sehr geringe Menge -an Krebszellen zürückblieb. Dies bestätigte die Anti-Krebseigenschaften des erfindungsgemässen Anti-Krebsmittels
'J? .' : ',.'. . ' ' ' :-.--"7'..':' ' y .' ' ' .· ' '- .- :'·-.··' : ". '- ' ' ' '
: GRft-1-^-T ti μ1);# erhalten gemäss Beispiel 1, wurde f .auf eiiie MikroplÄtte ^hergestellt von Falcon Corp.) \ gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen i. Dann wuicden 4 μΐ FCS (hergestellt von Falcon Corp.) zugegeben und die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Neuraminidase-
; ' ' '·:·' - ' ' .. N ' ' · ·
behandelte rote Blutzellen von Schafen (SRBC ), einge- ·: :'. '.·' ' . · .· ··. · ο stellt auf eine Anzahl von 1 χ 10 /ml, und 5 μΐ eines Ό/IM Phosphatpuffers (pH 7,2) zu dem 0,85 % NaCl zugegeben worden waron, wurden zugegeben und dann wurde -die Platte einet Zentrifugenabscheidung in einer Rate von 6.000 üpm während 5 Minuten unterworfen. Dann wurde die Platte umgedreht und nicht-uragesetzte SRBCN wurde entfernt. Eine ^ärbelösung (Brilliant Cresyl Blau, hergestellt von Merck & Co.) wurde zum Färben der Lymphocyten zugegeben und eine rosettenförmig ausgebildete
positivität wurde festgestellt, Wenigstens 98 % zeigtendie rosettenförmige Positivität (T-Zellen).
e_Krebszellen_ abtöt6nde__ „Aktivität
(a) Von den in Tabelle 1 gezeigten Krebszellen v/urden die nachfolgenden 5 Zellstämme mit unterschied· -liehen GRA-Positivitätsverhältnissen als zu bekämpfende Human-Krebszellen verwendet: ,
15 Zu bekämpfende Krebszellen:
| Nr. | 1 | BT-1 | (Burkitt Lymphoma) |
| Nr; | 2 | Daudi | (Burkitt Lymphoma) |
| Nr ν | 3 | KATO-III | (Magenkrebs) |
| Nr. | 4 | MKN-45 | (Magenkrebs) |
| Nr. | 5 | MOLT | (T-Zellen Leukemia) |
Auf einer Mikroplatte (hergestellt von Falcon Corp.) wurden pro Vertiefung 5 χ 10* der zu bekämpfenden Krebszellen durch Zentrifugenabscheidung mit einer einer Räte von 8.000 üpm während 5 Minuten aufgebracht. ι Dann wurden vorsichtig 4 χ 10 pro Vertiefung des nach
ι Beispiel 1 erhaltenen GRA-1-K-T zugegeben und dann V7urde 1 Stunde ibkubiert. ·
ib. .''..' ' .; , :' 'V ' ·' "; V .'. .-.. ' ·· ' Die Abtötungsaktivität wurde je nach dem'Grad der
Belagbildung festgestellt und wie folgt bewertet: ++ eine merkliche Abtötungsaktivität wird fest- ':-
+ eine Abtötungsaktivität wird festgestellt · + eine geringe Abtötungsaktivität wird fest-
/ ;:/"' : ' ;. stellt · ' .-' ' ' · ' ·' ' ';' . . , . ' , ' - eine" Abtötungsaktivität kann nicht festgestellt
" ' .· . . werden; '-: ' ' : . . '" · ';'. .'·.· - ;. · /.. .·.-
in einer Kontrollgruppe wurden unsensibilisierte humane periphere Blutlymphocytenf die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden waren, jedoch ohne Verwendung von GRA, verwendet. Die Ergebnisse werden in
Aui Tabelle 6 geht hervor, dass die erfindungsgemäss • gebildeten Killeir-T-Zellen eine starke GIlA-spezifi- · sehe <aytotöxiscike Aktivität aufweisen.
| zu bekämpfende | 3y | GRA-Positiwer- | Beurteilung | der Be- | |
| '.. .· . . : | Krebszelle | ,.-: bältnis (%) | lagbildung | ||
| GRA-I-K-T- ' | " Daudi (Fig. | 7) | 93,1 ...V;· .-' | ++ (Fig. | 2) . |
| Gruppe | KATO-III (Fig. | 9) | " ' 57,3:\ ' ·.. : ;- | + (Fig. | 4) |
| BT-1 i(Fig. | '. '· . ""- | ++ "(Fig.; | |||
| MKN-45 (Fig- | /< .- * · | · .+. (Fig. | |||
| MOLT (Fig. | 0,6 | - (Fig.1 | oyy | ||
| Kontröll- | bt-i : .;::. | 50,1 | - CFig.1 | ||
| gruppe | |||||
.- 40,-
(b| Die gleichen' zu bekämpfenden Krebszellen, wie sie in (a) verwendet wurden (3,2 χ 10 ) wurden mit 8 χ io5 GRA-1-K-iT (Zellverhältnis 5/1) vermischt und das gebildete Zellgemisch (Gesamtanzahl 4 χ 10 ) wurde in einem 15 % FCS enthaltenden RPMI-1640-Medium kultiviert. Nach' 1 Stunde wurde die Anzahl der verbliebenen Zeilen gezählt und das Inhibierungsverhältnis wurde gemäss folgender Gleichenerrechnet:
cytotoxizität (%)
Anzahl der Zellen (1 _ ( nach der Kultivierung } χ Anzahl der Zellen vor der Kultivierung (4 χ ΙΟ6)
Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt,
10
| Tabelle T | äer Zellen nach der Kul tivierung | KZyto- rtoxizität . · ' | |
| 2,9 χ 10* | 28 | ||
| zu bekämpfen de Zellen | Anzahl < vor der Kul tivierung | 3,7 χ10* | 7,5 |
| Daudi | 4 x106 | 3,2 χ 106 | 20 |
| KATO-III | ; 4 X TO6 | 3,9 χ 10* | 2,5 |
| BT-1 | 4 χ TO6 | 4,2 χ 10* | |
| MKN-45 | 4 x106 | ||
| MOLT * ; ' | I 4 XiO6 | ||
15
(c) Das Verfahren von (b) wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass das Mischverhältnis von GRA-I-K-T:.' zu den zu bekämpfenden Krebszellen auf 5/3 verändert wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
20
25
30
| zu bekämpfen de Zellen | Anzahl < vor der Kul tivierung. ; | XiO6 | äer Zellen . nach der Kul tivierung . | χ 106 | Cy to- toxizität . (%) . |
| • Daudi | 4 | χ 106 | 3,6 | χ 106 | 91 |
| KATO-III | 4 | χ 106 | 3,6 | χ 106 | • 24 |
| BT-1 . | 4 | χ 106 | 1,4 | χ 106 | 65 |
| MKN-45 | 4 | χ 106 | 3,7 | χ 106 | 7,2 |
| MOLT | 4 | 4,1 | -3 |
C3H/He-spontan brustkrebsige Mäuse erhielten subkutan GRA-M-T-KT-, erhalten gemäss Beispiel 2, in einer Dosis vor» 2 χ 10 /0,3 ml Mais 3-mal wöchentlich jeden zweiten .Tag.. Nach 10 Tagen wurde der Fokus herausgenommen und untersucht. Bei diesem Versuch stellt man fest, dass GRA-1-K-T eine hohe Bindungsaktivität gegenüber Daudi, KATO-III und BT-1, aber nur eine niedrige Bindungsaktivitat gegenüber MKN-45 und MOLT zeigt.
' ;', ' " '' ."' .''." ' .' . · ' .. ':.- ' Wie in Fig. 12 gezeigt wird, fand eine Infiltration von Lymphocyten in die Krebszellen statt und ein Aufbrechen des Tumorbereiches wurde festgestellt. Aus F:äL5· 1^ geht hervor, dass eine Kalzifizierung der Tumorfläche {stattgefunden hat und daraus kann man sehen, dass die erfindungsgemässen Krebszellen eine Antitumoraktivität aufweisen.
In diesem Beispiel wurden Krebszellen per se als spezifische Antigene anstelle von GRA für das Verfahren gemäss der Erfindung verwendet. ,
Krebszellen-sensibilisierte Lymphocyten wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten, wobei jedoch anstelle von GRA, BT-1, Daudi, KATO-III oder MkN-45 in einer Menge von 1 χ 10 pro Laborschale verwendet wurden.
Mit diesen Lymphocyten wurde die cytotoxische
10
Aktivität in gleicher Weise wie im Testbeispiel 2(a) untersucht Und die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt. \., :'}'.: : : ::^\. ' ' ..:.-:'-::--[: ' ': . : ;,.' :
Aus Tabelle 9 geht hervor, dass die oben hergestellten Lymphocyten keine cytotoxische Aktivität aufweisen.'^ ':"' ..'' .^ . '. '- '.. '· .· . ' ' '
C;
15
20
- 25
30
zu bekämpfende Zelle
BT-1 Daudi KATO-III MKN-45
Zellen, die für die Sensibilisierüng von Lymphocyten verwendet wurden
Daudi
KATO-III
MKN-45
In gleicher Weise wie im Testbeispiel 2-(b) wurde die krebszellenabtötende Aktivität von GRA-(-K-T, GRA-3-A-K-T und GRA-S-C-K-T, erhalten in Beispiel 4, bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 10 gezeigt.
| GRA-8-K-T | Tabelle 10 | GRA-3-C-X-T- | |
| 8,0 4,3 20 0 | % Cytotoxizität | 5,0 20 0 | |
| Zelle | GRA-3-A-K~T | ||
| KATO-III BT-1 , MKN-45 MOLT | 5,0 5,0 5,0 0 | ||
'"''' ' Testbeispiel 5 :.:; ' ; .·;..". ' - : ' ι
· (ä) Die Cytotoxizität der KillerzeIlen-Zubereitungen, er-. halten gemäss Beispiel 6 wurde mittels eines Cr-Färbetests (J, Immunol., 122, 2527-2533 (1979)) bestimmt. Dazu
Γ wurden 50 uCi radioaktives Cr (Japan Isotope Association) zu ΚΑΤΟ-ΊίI (2x10 ) gegeben und die Zellen wurden ί h bei
"20 37°C in RPMI-I640-Medium inkubiert und anschliessend durch Zentrifugieren gewaschen unter Erhalt von Cr-markierten Target-Zellen. Die Killerzeilen (Effektorzellen) (2x1O6) wurden zu den Target-Zellen (1x10 ) gegeben (das Verhältnis
• E/T-betrug 20/1) und die Mischung wurd 4 h bei 370C in RPMI-1640-Medium inkubiert. Die überstehende^ Flüssigkeit würde durch Zentrifugieren gesammelt und die Radioaktivi-
r tätl· wurde durch ^inenFlüssigsintillator gezählt, ν
Die spezifische Cr-Freigabe (%),die der cytolytischen Aktivitiat der \Effektör2ellen entspricht, wurde nach folgender Gleichung bestimmt:
1 Spezifische 'CR _ (Freigabe im Versuch ) '.- (Spontane Freigabe)
Spezifische 'CR-Freigabe (%)
, (Maximale Freigabe) - (Spontane Freigabe)
. :: . : :: . : - 45 - - . - ' - V ; . · V
Die maximale Freigabe zeigt QIe Radioaktivität wenn alle Zellen aufgelöst sind. V
Die Ergebnisse werden in Tabelle 11 gezeigt:
• 5;v ' V vv, ' V -: ' . ' . : .... '. ' ; .;.
' - '(-:' ; "' :V--V :V- V Vv ' Tabelle 11 V-" V . ,, _' .· ' ... . ,
Killerzellen Spezifische Freigabe
GRA-ll-Kr-T-2 . 25
GRA-1-K-T-3 22
; /.' ; .. GRA-1-K-T-4 .· ' V'V.. V 20 . '" ; " .
15 GRA-^1-K-T-5 22
GRA-1-K-T-6 25
GRA-1-K-T-7 .27
GRA-1-K-T-8 32
Aus den Ergebnissen in Tabelle 11 ist erkennbar, dass TCGF und FCS keine Beziehung auf die Induzierung der Killerzellen haben. :
(b) Cytotoxizität von GRA-2-K-T erhalten in Beispiel 3 wurde in gleicher Weise wie in (a) oben mittels des Cr-Fredgabetestes bestimmt. Die spezifische Cr-Freigabe betrug 14,3 % bei einem 51Cr-markiertem KATO-III als Target^Zelle (E/T - 20/1).
. - 46
Testbeispiel· 6 ;: · *V . . ' ...; :-ν . . -.: [..-':' '"
(a) Unter Verwendung von KATO-III (E/T =20/1) wurde die Cytotoxizität von Killerzellen, erhalten gemäss Beispiel *7- (a) in gleicher Weise wie im Testbeispiel 2- (b) bestimmt.
Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt:
| Tabelle 12 | % Cytotoxizität | |
| Kilier-Zelleri | ||
| GRA-3-K-T-1 | ||
| GRA-3-K-T-2 | ||
| GRA-3-K-T-3 | ||
| GRA-3-K-T-4 | ||
| GRA-3-K-T-5 | ||
| GRA-3-K-T-6 | 38,0 | |
| 18,2 | ||
| 20,9 | ||
| 23,2 | ||
| 24,5 | ||
| 20,2 |
(b) Die Cytotoxizität von GRA-3-K-T-7, erhalten gemäss Beispiel 7-(b) wurde unter Verwendung von Cr-KATO-III (E/T s= 29/1) als Target-Zellen in gleicher Weise wie im ' Testbeispiel 5 bestimmt. Die spezifische .Cr-Freigabe der Killerzellen betrug 25,5 %.
Die Cytotoxizität von Killerzellen, erhalten in Beispiel 5, wurde mittels des Cr-Freigabetests in gleicher Weise wie im, Testbeispiel 5 bestimmt. Die verwendeten Target-ZeIlen warenCr-markierte X5563-Zellen. Als Kontrolle wurden Lymphocyten, die in gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhalten worden waren mit der Ausnahme, dass die Sensibilisicrung der Milzzellen durchgeführt worden war mit 1x10 /Well von
35 Mitomycin C-behandelten X55C3-Zellen (5x10 /ml von
X5563-Zellen wurden mit 50 ug-/ml Mitomycin C während 60 Minuten behandelt) anstelle von GRA-M-5, verwendet.
Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 13 gezeigt:
| Tabelle 13 | Cr-Freiigabe (%) | 1 | 20:1 1 | 0:1 | |
| Spezifische 51 | E/T-Verhältnis | 7 4 0 | 6,3 20,6 1 0,0 | 5'7 3,7 0,0 | |
| Killerzellen | 40: | ||||
| GBArM-S-X-T-I.' GRArM-S-K-T-? Kontrolle ' | 12, 18, :' o, | ||||
-' '; ; " ' . '·'.- -
.''' ' Test±>eispiel 8 <H-2-Assay)
· .-' · . ·. . . . . . ·.·.
beispiel 2 wurden einer Serienverdünnung mit PBS (0,85 % NaCl) unterworfen, unter Erhalt von Proben^
Anti-H2-Serum vom National Institute o£ Genetic Research und die obigen Proben wurden vermischt und bei 4eC 2h inkubiert und dann wurden Target-Zellen entsprechend dem verwendeten Anti-H-2-Serum zugegeben. Milzzellen oder Lymphknotenzellen,erhalten aus BIO (H-2 ) und B10*BR (H-2 ) Mäusen nach üblichen Methoden wurden als Target-Zellen verwendet. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS wurde Komplement (Kaninchen) zu den Zellen zugegeben und die Zellen wurden Vh bei 370C inkubiert und mit 0,2 5Trypan-Blaü-PBS angefärbt zur Bestimmung der prozentualen Cytotoxizität. Das Anti-H-2-Serum wurde in einer MaximalVerdünnung verwendet, so dass es wenigstens 95 %ige Cytotoxizität bei Abewesenheit von GRA zeigte.·-
f S .
10
20 25:
30 35
Die Blockierungswirkung von GRA in den Systemen wird in Tabelle 14 gezeigt:
' " "', '": -. , ; ·. . Tabelle 14 ' : ' ' ' ' ' - . ' ' ' " .',. ' '
| . GRA Anti-H-2 | D-23 D-32 | : Serum, Konzentration | X80 X300 | Target-zellen |
| GRA-M-I | D- 33 D-2 | (Anti-H-2Kk), or . (Anti-H-2DK), | X600 X80 | BlOBR (H-2k) Milzzellen |
| GRA-M-3 ^ | D-23 D-32 | (Anti-H-2Kb), oderK (Anti-H-2DD), | X80 X300 | BIO (H-zV Milzzellen |
| GRA-M-4·. ·.: ' .- '· -: ' ' · · ·.-' : | öder ' . . ' : - .· . ' '» | BlOvBR (h-2k) Üympftknotenze1len |
Die Ergebnisse werden in Tabelle 15 gezeigt.
: Table 15
| D-23 | X2 | - \ | Cytotoxizität | X4 | X8 X16 X32 | X64 | •X128 | XZ 56 | X512 | 14 | • | * | |
| Anti-H-2 | D-32 | - | Verdünnung der Probe | 13 | 14 12 13 | 14 | 13 | 14 | 13 | 96 | 13 | ||
| GRA Serum | Il . . - | - | 97 | 99 96 97 | 97 | 96 | 97 | 96 | 95 | 14 | |||
| I | D-33 | - | 95 | 95 95 95 | 94 | 95 | 95 | 96 | 13 | 13 | |||
| D-2 | - | 19 | 15 14 Γ-12 | 15 | 12 | 11 | 12 | .99 | 14 | ||||
| III D-23· | - | 98 | 98 99 ;; 99 | 9ß | 99 | 99 | 99 | 95 | 15 | ||||
| D32 | - | 95 | 96 95 95 | 97 | 95 | 97 | 95 | 100 | 17 | ||||
| Anmerkung ..... | 100 | 100 | 100 100 -·- | - | - | ' / " | 99 | 10 | |||||
| . . ' ,"''' ' | 99 | 99 | 99 99 | - | - | - | 10 | ||||||
| . '! ...'-. - y ' | GRA | I -..-: | GRA-M-I | - | |||||||||
| ' ' ,,'. '-y.'". ; -. | GRA | II : | GRA-M-3 | ·. ·· | |||||||||
| GRA | III: | GRA-M-4 | bedeutet % Cytotoxizität, wenn nur . | ||||||||||
| tl*tt | -— | ||||||||||||
Komplement verwendet wurde.
Aus den Ergebnissen in Tabelle- 15 kann man entnehmen, dass GRA-M-1; GRA-M-3 und GRA-M-4 keine H-2 haben.
.: ': '.: Testbeispiel 9 · . ^' ' ' '. '. '' ". "' ' · -ί:'"
C57BL/6 Mäusen wurde unter S.C. LLC (2x10 ) des gleichen Stammes transplantiert und nach 6 Tagen wurde 1ng (Protein) ~ GRA-M-3; erhalten gemäss·Referenzbeispiel 2-(d), subkutan verabreicht. Diese Verabreichung wurde einmal täglich in* gleicher Dosierung an 4 Tagen wiederholt. Am Tage nach der > letzten Verabreichung wurden die Tumorzellen herausgeschnitten und gewogen. Zur Kontrolle wurden friere verwendet, denen nur physiologische Kochsalzlösung verabreicht worden war. Jede Testgruppe bestand aus 5 Tieren.
;>. , ' ;.:" ·',;. -: '. ; ' ' ' ' .·-'. ' ' : ' ·' ·.." ' : ' ;·".. ' ' Als Ergebnis stellte man fest, dass das durchschnittliche Krebsgewicht bei der Kontrollgruppe etwa 500 mg war. Bei der GRA-M-3-behandelten Gruppe zeigten 3 ein Verschwinden der Ttimore und zwei zeigten ein durchschnittliches Tumor-
gewicht von 100mg. ; v
: .>· Testbeispiel 10 / VV"-.'V" - .': '":';:'.' ' . ' "'' ".;'- '' ":' '
". · .; . .<* · . '/ .. '.· ';" ' :. i ·; . ..·.· - '·· . .'· v ... · ;
. .: ' ' . * * *" ' ' "' vr-ri"':, " :J":-. ':' '..'s?-.' "'; '.'.''
ν C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit 1 ng (Protein) GRA-M-3, erhalten in Referenzbeispiel 2(d),einmal täglich während 3 Tagen immunisiert und am 5. Tag wurden Milzzellen von
den Tieren zur Gewinnung von Effektor-ZeIlen gesammelt. . Eine Mischung der Effektorzellen und von Lewis-Lungencarcinom
(LLC) als Target-Zellen in einem Verhältnis von E/T =50/1 wurde hergestellt und ein Teil (1x10 ) davon wurde in Mäusen ' des gleichen Stammes transplantiert und eine VJinn-Assay wurde duarchgeführt (J. Immunol. 86, S. 228-239 (1961)).
Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 16 gezeigt.
| Tabelle- | 16 | Tag | 17 | Tag 18 | Tag 19 | Tag | 20 | Tag 20 Mortali | |
| Effektor | 5, 39, 65, | -»- ui Ui,;/ ;·., | 5,7 37,1 61,7 | 3,1 55,4 98,1 | 1 76 96 | /4 Λ ., | tät / fruppe ' | ||
| zellen | 0/10 4/10 4/10 | ||||||||
| A B C | Wachstumsgeschwindiqkeit des Krebses (%) | ||||||||
| Tag 15 | |||||||||
| 5,7 21,4 39,3 | |||||||||
Anmerkung: Gruppe A sind die Milzzellen von GRA-M-3-immu-
-^ " nen Mäusen;
Gruppe B sind die Milzzellen vvon normalen Mäusen;
Gruppe C sind die Milzzellen von Mäusen,
10 Tage nach der Transplantation von LLCCTxIO );
15' ../ ' ' (" - ..' ' · · .; .'* · ' .; 1S
Die Krebswachstumsrate wurde nach folgender Gleichung berechnet:
. . . T ·*" T Krebsiffachstumsrate (%) = —- χ 100
dabei bedeutet TÄ die Dicke der Fussohle an der Seite wo der Krebstranplantiert war und Tn die .Dicke einer normalen Fussohle.
2.5 Testbeis.piel 11 ; "
C3H/He Mäuse wurden mit 4,5 \ig (Protein) GRA-M-4, erhalten in Referenzbeispiel 2-(d) und 0,1 ml FreundVs Complete Adjuvant sacrococcygeal immunisiert. Nach 2 Wochen wurden Lymphknotenzellen in üblicher Weise gesammelt und als Responder-Zellen für die Bestimmung der proliferativen Ansprechung durch GRA-M-4 verwendet.
Zu diesem'Zweck'wurden Responder-Zellen (4x10 ) mit RPMI-1640-Medium, enthaltend 15 % FCS in Gegenwart von GRA-M-4 während 5 Tagen inkubiert. Während der letzten 18 Stunden der In-
-. .'.. 3 kubierungszeit wurde ^Ci von H-Thymidine { H-TdR) zu dem Medium zugegeben und die Inkorporation in die Zellen wurde gezählt. ' ' . ...'."./· .·. .. ..· '.; .·.· : .. ; . \ ./v^·: ;v' '.· ' ' ν :
Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt.
GRA-M-R
Tabelle 17 .
..'· . ι
Konzentra- 3-H-TdR-Inkorporation
tion (nq/ml) (Mittel cpm + Standardirrtum)
Kontrolle
Versuch
0,5
5 20 40
5.302 i 1T761
7.903 i 1.290
10.076 i 936
10.686 jf 429
10.615 i 1.270
8.565 + 1.419
1,9 2,0 2,0
Anmerkung: "S.I." ist der Stimulierungsindex, ausgedrückt durch Experiment/Kontrolle :.'fi'~ ': ': ., . V./.^;':'.'"·':. ';:.';:
Testbeispiel 12
Die verzögerte Hypersensibilisierung (DTH)-Ansprechung von CSH/HE-Normalmäsuen/ X5563-Immunmäusen und MH134-Immun-• mausen, erhalten in gleicher Weise wie in Beispiel 5, und von GkA-M-4-Immunmäusen und GRA-M-5-Immunmäusen, erhalten in gleicher Weise wie im Testbeispiel 11, wurde durch die Fussohlen-Reaktioh (FPR) bestimmt. Dazu wurden GRA- oder Mt'iC-behandelte Tumor zellen in die Haut der Fussohle im
Hinterbein der Tiere eingegeben und das Anschwellen der Fuss-.sohle. 24'h nach der Behandlung wurde festgestellt. Die DTH-Anspreehung wurde berechnet, indem man die Anschwellung
' · '' . .'',·'· - . ' ." -2 '' ;: " '
vor deiJL Behandlung von der nach der Behandlung (10 mm) abzog. ' '·; .' ; ;. ' .;· ·:· . ' ' . · . ' ' ·
Die erzielten Ergebnisse werden in Tabellen gezeigt.*/·. : '. ' .'. . : "" ....
-
. ' ; ''. · . '·>'. .-. / , . .' . ·· _2 '
Mittleres Fussohlenanwachsen (10 mm) Versuch NormalmSuse ; MH134 Immunmäuse
| 12,4 | 13,6 | |
| ι ; ' . ;; : ' | 3,6 | 32,0 |
| 2 | 3,2 | 3,6 |
| 3 | 6.8 | 22.0 |
| 4 | 27,6 | |
| 5 | ||
Anmerkung; Gruppe 1s Syngenische normale Milz 1x10 /20 μΐ-
.· Medium . (Hanks-Lösung) ' Gruppe 2: MH134-Zellen 1x106/20μ1 Medium
Gruppe 3: Medium 20 μΐ
^ Gruppe 4: GRA-M-4, 0,8 pg (Protein)/20 μ1 Medium Gruppe 5: GRA-M-4, 0,4 μg «
- 53 Tabelle 19
| Mittleres | Fussohlensraachsen ( | 2 10 nun) | |
| Versuch | Normalmaus | X5563-Immunmaus MH1 | 34 Immunmaus * |
| '· -I"-· 2 '. 3 : · ' . | 5,4 : 0,9 2,0 | "" --ν 4,3 ' 16,9 | 1,1 24,3 |
iO Anmerkung: Gruppe 1; Medium (Hanks-LÖsung)' 20μ1 '.'.'...
Gruppe 2; GRA-M-4, 4 μg (Protein)/20 μ1 Medium ' ' ' · .*' Gruppe 3; GRA-M-5* "
15 "· Tabelle 20
_ -^ . , ^ Ii ι ι- ι ι i ι β _
. β '. 1
;· . . . " ' —2 ' " :
; Anmerkung: .Gruppe 1 .; Medium (Hanks-Lösung 20 μΐ
Gruppe 2} GRA-M-4, 4 μg (Protein)/20 μΐ Medium
25 \, '" ",: :.- .. '·.. .
| Versuch | Tabelle | 21 - /ν' ; · .. ..;... | |
| • 2 | )Mittleres | Fussohlenanwachsen (10 mm) | |
| Normalmaus | GRA-M-4-Immunmaus | ||
| 30 | -1/8 6,3 6,8 | 0,6 20,0 6,3 | |
" Amerkung: Gruppe 1; Medium (Hanks-Lösung) 20 11 35 Gruppe 2; GRA-M-4, 4 μg (Protein)/ 20 μΐ Medium
Gruppe 3; 4 jig (Protein)/ 20 μΐ Medium des
Teiles, der durch eine PNA-Säule zur Zeit von GRA-M-4 (nachfolgend 11CP.") hindunchging
| ' . " . | Tabelle | 22 |
| Mittleres | ' -2 Fussohlenanwachsen (10 min) | |
| Versuch | Nornialmaus | GRA-M-4-Immunmaus |
| . - ι . ' . ·; ' . ' "· 2 ' ; , . .'3-ν.;'". ; '. ' | 2,4 2,6 2,4 5,5 | 17,7 • ' . . ':.;' λ,8 ·. '/ ' 18,9 |
Anmerkung: Gruppe 1; Medium (Hanks-Lösung 20 ]xl
Gruppe^: GRA-M-4, 3,8 \im (Protein) / 20 μΐ Medium
Gruppe 3: 3,8 ug (Protein) /20 μΐ von CP. (siehe
oben) .
.Gruppe 4: 3,8 \ig (Protein) von GRA-M-4 und 3,8 μσ (Protein)/ 20 μ 1 Medium von CP.
Referenzversuch
X5563-Immunmäuse wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhalten. Die Milzizellen dieser Immunraäuse wurden als Effektorzellen verwendet und die Effektorzellen (10 ) und die. Target-Zellen . (X5563, 10 ) wurden zusammen auf Mäusen des gleichen Stammes transplantiert. Dann wurde eine Winn-Assay in gleicher Weise wie im Testbeispiel 10 durchgeführt.
Die erzielten Ergebnisse werden in Fig. 23 gezeigt/ in welcher die Abszisse die Tage und die Koordinate die mittlere Krebsgrösse (cm3) ± Standardirrtum anzeigt, und in welcher die verschiedenen Markierungen folgende Bedeutung haben:
©— —~ο: Gruppe,zu weicher keine Effektor-Zellen gegeben
wurden; ö———ο : Gruppe,, zu welcher nicht-behandelte Effektor- ..
Zellen-gegeben wurden;
\ 10 A—'—-vd : Gruppe, zu welcher Effektor zellen, die mit Kanin-S^v; · chen-Komplement behandelt worden waren, gegeben
wurden? χ—r—-x : Gruppe, zu welcher Effektor-ZeIlen, die mit Anti-Thy 1 (New England Nuclear Co., USA) behandelt worden . waren, und zu der :. Kaninchen-Komplement gegeben
D ' '". D: Gruppe, zu der Effektorzellen, die mit Anti-Lyt 1 . " (New England Nuclear Co., USA) behandelt worden waren, und zu der. Kaninchen-Komplement gegeben λ wurde; :
B.,.... .@; Gruppe, zu der Effektor-Zellen, die mit Anti-Lyt ' (New England Nuclear Co., USA) behandelt und zu .
t , der Kaninchen-Komplement gegeben wurde. >' '<.' '
Aus den Ergebnissen von Fig. 23 wird ersichtlich, dass Lyfl.Typ T-Zellen eine wichtige Rolle in dem Mechanismus des in vivo Effektes bei der Tumorimmunitat spielen.
. Weiterhin ist es bekannt, dass die DTH-Ansprechung durch Lyt-1 T-Zellen (J. Exp.Med. 143, S. 1543-39 (1976)) hervorgerufen wird.
Claims (8)
- Erfindungsansprüchi ;Ii Verfahren zur Herstellung von Krebszellen-cytotöxi- : sehen Lvmphocyten, dadurch g e k e nn ze i c h n e t-., ' daß man Lymphocyten mit einem von Krebäzelleh abgeleiteten glykoverwandten Antigen sensibilisiert, wobei das Antigen eine Krebszellenmembrankomponente ist, die sich mit einem Lektin, das sich spezifisch mit einer endständigen Galaktose oder endständigem N-Acetylgalaktosamin verbindet, kombi- : .niejrt; : ' - ..; " . ' · ·. ·
- 2. Verfahren gemäß iPunkt Λ, dadurch gekennzeichnet , daß das glykoverwandte Antigen erhalten wurde, indem man Krebszellenmembrankomponenten aus Krebszellen durch Homogenisierung oder Solubilisierung herstellte, die Zellmembrankomponente : mit einem Lektin , welches spezifisch mit einer * endständigen Galaktose oder mit endständigem N-Acetylgaiäktosmäin unter Bildung eines Lektin-Zellmembrankomponehtenkomplexes verbindet, behandelt, den erhaltenen Komplex sammelt, das Lektin aus dem Komplex r Γ abtrennt und eine lektinfreie Zellmembrankomponentegewinnt. ·" ;v:V:/ '.. : " '. ' .; · 'v\ ;3". Verfahren gemäß Punkt 2, dadurch g e k e η η - . ze ich net» daß das Lektin ein Lektin ist, welches sich spezifisch mit einer endständigen Galaktose verbindet> ausgewählt aus der Gruppe Erdnußlektin, Ricinuscommunis-Lektin und-Sojabohnenlektin - ein Lektin ist, welches spezifisch mit einem endständigen N-Acetylgalaktosmain, ausgewählt aus. der Gruppe Dolichosbohnenagglutinin, "braid orange"-Lektin, Helix pomatia-Lektin, Limabohnenlektin, Sojabohnenlektin und Bauhiniabohnenlektin^ , : .
- 4. Verfahren gemäß Punkt 3, dadurch g e k e η η - , ζ ei c h η e t , daß das Lektin Erdnußlektin oder Dolichosbohnenagglutinin ist.
- 5.' Verfahren gemäß Punkt 2, dadurch gekenn-2 ei c h η e t , daß das glykoverwandten Antigen :$ '. aus einer Krebszellmembrankomponente isoliert wird,., indem man es zuerst mit einem ersten Lektin, welches Sich spezifisch mit ehdständiger Galaktose und dann mit einem zweiten Lektin, welches sich spezifisch mit endständigem N-acetylgalaktosamin verbindet, umsetzt.
- 6. Verfahren gemäß Punkt 5, dadurch g e k e η η -ζ ei c h η e t , daß das erste Lektin Erdnußlektin und das zweite Lektin Dolichosbohnenagglutinin .: ist. ." . .':". . .,.
- 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, worin die Sensibilisierung durchgeführt wird, indem man Lymphocyten in einem Nährmedium, enthaltend ein Krebszelläbgeleitetes glykoverwandtes Antigen; während einer •Zeit von 1 bis 10 Tagen kultiviert.e.^Verfahren gemäß Punkt 7> dadurch <g e ken η - ":'":.."^"' ; ν,::;z;\&":± c h η e t "/ daß die Menge an glykoverwandtem : Antigen 1 bis 1000 mg/ml beträgt.
- 9. Verfahren gemäß Punkt 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lymphocyten bei einem pH-Wert von etwa 7,2 und einer Temperatur von etwa 37°C kultiviert.
- 10. Verfahren gemäß Punkt 9, dadurch g e k e η η zeich η et , daß das Nährmedium RPMI 640 ein Medium oder ein Eagle-MEM-Medium ist, wobei das Medium Humanserum, Kalbsfötenserum, Kalbsserum oder Pferdeserum enthält. ύ,,ΜΙ, ja geilen Zeichnungsn
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