CH655010A5 - Pharmazeutischer wirkstoff mit antitumoraktivitaet. - Google Patents

Pharmazeutischer wirkstoff mit antitumoraktivitaet. Download PDF

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CH655010A5
CH655010A5 CH11501/79A CH1150179A CH655010A5 CH 655010 A5 CH655010 A5 CH 655010A5 CH 11501/79 A CH11501/79 A CH 11501/79A CH 1150179 A CH1150179 A CH 1150179A CH 655010 A5 CH655010 A5 CH 655010A5
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tumor
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antitumor
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CH11501/79A
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Chikao Yoshikumi
Takayoshi Fujii
Masahiko Fujii
Kenichi Matsunaga
Yoshiharu Oguchi
Koichi Niimura
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Kureha Chemical Ind Co Ltd
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Description

25 Die Erfindung betrifft einen pharmazeutischen Wirkstoff, der Antitumoraktivität hat, ohne Pyrexie und Anaphylaxie zu verursachen.
Obwohl seit einiger Zeit verschiedene Arten von pharmazeutischen Antitumormitteln vorgeschlagen und zur prakti-30 sehen Anwendung gebracht worden sind, zeigen sie fast alle Nebenwirkungen, wie Leukocytopenie, Alopezie und gastrointestinale Störungen. Daher sind der Anwendbarkeit dieser Mittel Grenzen gesetzt.
In neuer Zeit wurde die Verwendung einer Substanz als 35 Antitumormittel untersucht, die durch chemisches Binden eines Antikörpers für Tomorantigen (im folgenden als Anti-tumor-Antikörper bezeichnet) mit einer Antitumorsubstanz erhalten ist. Da der für solche Substanzen verwendete Antitumor-Antikörper nicht ausreichend zur Entfernung von all-40 gemeinen Immunoglobulin gereinigt wurde, konnte er nicht als reiner Antitumor-Antikörper erkannt werden. Wenn ein derartiges, durch Bindung eines solchen Antitumor-Antikörpers an eine Antitumorsubstanz erhaltenes Mittel als Antitumormittel verabreicht wird, tritt Pyrexie und Anaphylaxie 45 als unvermeidliche Wirkung des in dem obigen Antitumor-Antikörper enthaltenen Immunoglobulins auf.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass die bisher bei Verwendung von Antitumor-Antikörper beobachteten Nebenwirkungen durch Verwendung von Antitu-50 mor-Antikörper vermieden werden, der ausweislich Affinitätschromatografie oder Affinitätsfällung praktisch rein ist. Affinitätschromatografie und Affinitätsfallung werden nachfolgend auch kurz als «Affinitätsreinigung» bezeichnet.
Der erfindungsgemässe Wirkstoff hat die in Anspruch 1 55 angegebenen Merkmale; bevorzugte Formen des Wirkstoffes haben die in den Ansprüchen 2 bis 4 angegebenen Merkmale.
Der Wirkstoff wird vorzugsweise nach einem Verfahren erhalten, das die Merkmale von Anspruch 5 oder 11 besitzt. 6o In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 das IR-Absorptionsspektrum eines Wirkstoffes, der durch Binden eines gereinigten Antisarcoma-180-Antikörpers von Mäusen an Mitomycin C gemäss der Erfindung erhalten wurde,
65 Fig. 2 das IR-Absorptionsspektrum des gereinigten Antikörpers, der durch Affinitätsreinigung eines Antiserums erhalten wurde, das von einem männlichen Patienten genommen worden war, der an Rectalkrebs litt,
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Fig. 3 das UV-Absorptionsspektrum des oben erwähnten gereinigten Antikörpers,
Fig. 4 das IR-Absorptionsspektrum eines Wirkstoffes, der durch Binden eines gereinigten Antisarcoma-18-Antikör-pers von Mäusen an Doxorubicin-hydrochlorid gemäss der Erfindung erhalten wurde,
Fig. 5 das IR-Absorptionsspektrum eines Wirkstoffes, der durch Binden eines gereinigten Antisarcoma-I80-Anti-körpers von Ratten an Chlorambucil gemäss der Erfindung erhalten wurde,
Fig. 6 das IR-Absorptionsspektrum eines Wirkstoffes, der durch Binden von gereinigtem Antisarcoma- I80-Anti-körper von Ratten an Uramustin gemäss der Erfindung erhalten wurde,
Fig. 7 das IR-Absorptionsspektrum eines Wirkstoffes, der durch Binden von gereinigtem Antisarcoma-180-Anti-körper von Kaninchen an Cytarabin gemäss der Erfindung erhalten wurde, und
Fig. 8 das UR-Absorptionsspektrum eines Wirkstoffes, der durch Binden von gereinigtem Antisarcoma-180-Anti-körper von Mäusen an 5-Fluoruracil gemäss der Erfindung erhalten wurde.
Ein für die Erfindung geeigneter, d.h. ausreichend reiner Antitumor-Antikörper ist allgemein erhältlich durch Reinigung der Immunoglobulinfraktion, die durch das Antigen von Tumoren einschliesslich von Sarcoma-180, Sato-Lungenkrebs, L-1210 Leukämie, P-388 Leukämie, Ehrlich-Krebs, Yoshida-Sarcoma, akute lymphatische Leukämie, Medullar-Tumor oder anderen Krebsformen des Menschen induziert ist, mit Hilfe von Affinitätschromatografie- oder Affinitätsfallungsmethoden.
Die Herstellung des eigentlichen Antikörpers zu dem oben genannten Tumorantigen folgt vorzugsweise der in «Proceedings of the VIth Annual Meeting of Japan Society oflmmunology», 1976, Seite 198, beschriebenen Methode oder der Methode von M. J. Dauphin et al (siehe J. Immu-nol., 113,1974, Seite 948). Bei der zuerst genannten Methode unter Verwendung von komplettem Adjuvans nach Freund werden Tumorzellen subkutan in die Versuchstiere injiziert, um diese zu immunisieren, und der Antikörper aus den immunisierten Tieren gewonnen. Bei der zuletzt genannten Methode wird ein Tumorantigen intraperitoneal drei- bis viermal Tieren injiziert, um diese zu immunisieren, und der Antikörper aus den immunisierten Tieren gewonnen.
Ausserdem kann für die vorliegende Erfindung entweder der Alloantikörper oder der Genoantikörper verwendet werden, wobei jedoch die Verwendung des Alloantikörpers bevorzugt wird.
Bisher wurde zur Reinigung der Antikörper allgemein sowohl das Aussalzen mit Ammoniumsulfat als auch die Io-nenaustausch-Chromatografie, typisch mit DEAE-Cellulo-sekolonnen, angewendet. Zur Herstellung erfindungsgemäs-ser Wirkstoffe wird dagegen die Affinitätschromatografie bzw. die Affinitätsfällung angewendet, so dass selektiv nur der spezifische Antikörper für die Tumorzellen aus der Immunoglobulinfraktion gewonnen wird. Die Affinitätschromatografie bzw. Affinitätsfällung beruht auf einer spezifischen Affinität zwischen Substanzen lebender Körper, z. B. zwischen einem Enzym und einem Substrat, oder zwischen einem Antikörper und Antigen und folgender Abtrennung einer Komponente eines solchen Paares.
Beispiele für hier geeignete Affinitätschromatografie-bzw. Affinitätsfallungsmethoden sind die folgenden:
1. Die Methode, bei der die Moleküle eines Antigens, das aus Tumorzellen extrahiert wird, kovalent an einen Träger, wie Agarose-Gel gebunden werden, wobei Bromcyan verwendet wird und wobei nach dem Füllen einer Kolonne mit dem Träger eine Lösungeines Antikörpers durch die Kolonne geführt wird, um den Antikörper an das Antigen zu binden; dann wird eine ausreichende Menge eines Lösungsmittels durch die Kolonne geführt, um den nicht-gebundenen Antikörper auszuwaschen, und eine Pufferlösung mit einem niedrigeren pH-Wert durch die Kolonne geführt, um die Bindung zwischen dem Antikörper und dem Antigen aufzuheben und den abgetrennten Antikörper zu eluieren.
2. Die Methode, bei welcher der Antikörper ohne Verwendung einer Kolonne zur Bindung mit dem Antigen veranlasst wird, indem der Träger, an welchen das Antigen wie oben beschrieben gebunden ist, und eine Lösung des Antikörpers gemischt werden, worauf nach dem Waschen der Trägerteilchen zur Entfernung des nicht-gebundenen Antikörpers der Antikörper herausgelöst wird.
3. Die Methode, bei welcher die Tumorzellen selbst anstelle des Trägers verwendet werden, an welchen das Antigen gebunden wird.
Allgemein hat ein durch Affinitätschromatografie oder Affinitätsfällung gewonnenes Antitumor-Immunoglobulin eine höhere Reinheit, als die bisher verwendeten Immuno-globulinfraktionen.
Als Antitumorsubstanzen, die durch Amidbindung an den durch Affinitätschromatografie oder Affinitätsfallung gereinigten Antitumor-Antikörper gebunden werden, sind unter anderen geeignet: antibiotische Substanzen, wie Mito-mycin C, Doxorubicin-hydrochlorid, Bleomycin, Daunoru-bicin, Actinomycin D und Sarcomycin, antimetabolitische Substanzen, wie Cytarabin, 8-Azaguanin, 5-Fluoruracil, Methotrexat und Natriumaminopterin, und Alkylierungsmittel, wie Chlorambucil, Melphalan, Uramustin, ACNU und Cy-clophosphamid. Alle oben genannten Antitumorsubstanzen sind bekannt und durch ihre Trivialnamen angegeben; ihre Strukturformeln sind beispielsweise in folgenden Literaturstellen beschrieben:
«Iyakuhin Yoran (Manual of Drugs)», Herausgeber: Osaka Prefectural Assoc. Hospitals' Pharmacysts; und
«Biseibutsuyakuhin Kagaku» (die Chemie von Wirkstoffen, die von Mikroorganismen abgeleitet sind), Herausgeber: Y. Ueno et al.
Für die Amidbindung kann die oben erwähnte Antitumorsubstanz an den oben erwähnten Antitumor-Antikörper entweder über die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe der Substanz mit entweder der Carboxylgruppe oder der Aminogruppe des Antikörpers gebunden sein; die Bindung kann allgemein so erhalten werden, dass man die Antitumorsubstanz unter milden Bedingungen mit dem Antikörper umgesetzt wird. Hierbei kann, wenn erforderlich, eine glattere Umsetzung dadurch erzielt werden, dass man vorher in die Antitumorsubstanz eine Aminogruppe ödere mehrere Aminogruppen bzw. eine Carboxylgruppe oder mehrere Carboxylgruppen einführt. Die Einführung der Amino- bzw. Carboxylgruppen wird vorzugsweise dadurch ausgeführt, dass man die Antitumorsubstanz selbst oder deren Salz mit einem der Metalle Natrium, Kalium oder Silber mit einer Verbindung der Formel X(CH2)n COOH umsetzt, worin X das Chlor- oder Bromatom und n eine Zahl von 1 bis 3 bedeutet; die Antitumorsubstanz bzw. ihr Salz kann zur Einführung von Amino- oder Carboxylgruppen aber auch mit einer Verbindung der Formel HCl • NH2(CH2)„ COX umgesetzt werden, worin X das Chlor- oder Bromatom darstellt und n eine Zahl von 1 bis 3 ist. Die Umsetzung mit einer der genannten Verbindungen erfolgt vorzugsweise in einem wasserlöslichen Lösungsmittel, z. B. Methanol, Ethanol, Dime-thylsulfoxid oder Dioxan, bei Temperaturen von 0-50 "C, vorzugsweise 10-40 "C, während Zeitspannen von 10 min bis 72 Std. Durch Umkristallisieren des so erhaltenen Reaktionsproduktes aus einem Lösungsmittel, wie Wasser, einem Alkohol, Chloroform oder Dioxan, wird ein Derivat der An-
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titumorsubstanz erhalten, in welches mindestens eine Aminogruppe bzw. mindestens eine Carboxylgruppe eingeführt ist. Eine bevorzugte Verbindung der Formel X(CH,)n COOH ist Chloressigsäure.
Das Binden des gereinigten Antitumor-Antikörpers an eine Antitumorsubstanz, die mindestens eine Aminogruppe oder mindestens eine Carboxylgruppe aufweist, erfolgt vorzugsweise durch Auflösen beider Reaktionskomponenten in einem wasserlöslichen Lösungsmittel und Zugabe eines Car-bodiimides als Katalysator zur Durchführung der Umsetzung bei Temperaturen von 0-50 °C, vorzugsweise 10-40 'C, während Zeitspannen von 10 min bis 8 Std., vorzugsweise 30 min bis 5 Std., und Abbrechen der Umsetzung durch Zusatz einer Pufferlösung, wie Essigsäure/Natriumacetat.
Dann wird im allgemeinen zur Entfernung von nicht-umgesetzter Antitumorsubstanz, Katalysator, Komponenten der Pufferlösung und Salzen aus der Reaktionsmischung dieser einer Reinigung unterzogen, vorzugsweise durch Dialyse, Gelfiltration, Ultrafiltration oder einer Kombination dieser Methoden. Beispiele für das als Katalysator in der obigen Umsetzung verwendbare Carbodiimid sind 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, l-Cyclohexyl-3-(3-morpholinoethyl)-carbodiimid und Dicyclohexylcarbodi-imid.
In dem durch die obige Umsetzung erhältlichen Wirkstoff sind der Antikörper und die Antitumorsubstanz durch mindestens eine Amidbindung aneinander gebunden und das Molarverhältnis von Antikörper zu Antitumorsubstanz beträgt 1:2 bis 1:5 in den Fällen, bei welchen die Antitumorsubstanz eine antibiotische Substanz ist, bzw. 1:1 bis 1:10 in den Fällen, bei welchen die Antitumorsubstanz eine antimetabolitische Substanz oder ein Alkylierungsmittel ist.
Im folgenden werden die toxikologische Spezifität, die pharmakologischen Wirkungen und die Herstellung des Wirkstoffes bzw. seiner Komponenten näher erläutert.
Die Akuttoxizität wurde durch intravenöse Verabreichung von 300 mg des Wirkstoffes pro Kilogramm Körpergewicht von Mäusen als Versuchstiere bestimmt. Da bei den als Versuchstiere verwendeten Mäusen innerhalb einer Woche nach der Verabreichung keine Todesfälle beobachtet worden sind, kann angenommen werden, dass der Wirkstoff für medizinische Zwecke verwendbar ist.
Ausweislich der unten beschriebenen Wirkungsprüfungen ist der Wirkstoff gemäss der Erfindung gegen verschiedene Krebsformen bzw. krebsartige Erkrankungen wirksam, wie die folgenden: akute Leukämie, malignes Lymphom, Carcinom, Sarcom, malignes ziliares Epitheliom, akute myelogene Leukämie, Melanom, akute lymphatische Leukämie, Myelom und dergleichen.
Für die Herstellung bzw. Formulierung von Antitumor-mitteln, die den erfindungsgemässen Wirkstoff als aktive Komponente enthalten, sowie die Verabreichungsmethoden solcher Mittel kann auf den Stand der Technik verwiesen werden. Als Beispiele für Verabreichungsmethoden kann die orale Verabreichung, die Verabreichung durch Injektion sowie die rektale Verabreichung genannt werden. Beispiele für Zubereitungen, die sich für derartige Verabreichungsmethoden eignen, sind Pulver, Granulate, Tabletten, Injektionszubereitungen und Suppositorien. Die Verabreichungsmethode durch Injektion und die hierfür geeigneten Zubereitungen werden meist bevorzugt. Zur Herstellung einer injizierbaren Zubereitung sind wie üblich wasserlösliche Lösungsmittel, sterilisiertes Wasser, Ringer-Lösung und dergleichen, geeignet. Auch wasserunlösliche Lösungsmittel, Isotonisierungs-mittel, Analgetica, Stabilisationsmittel, Antiseptica, Suspensionsmittel, Puffer, Emulgatoren und dergleichen, können als Zusätze verwendet werden, wenn dies zweckmässig ist.
Beispielsweise kann man 10 mg des erfindungsgemässen Wirkstoffes und 50 mg Mannit in destilliertem Wasser zu 10 ml einer wässrigen Lösung ansetzen und nach üblicher Sterilisierung die sterile Lösung in eine Injektionsampulle einfüllen oder die Lösung gewünschtenfalls gefriertrocknen und vor der Verabreichung mit wässriger physiologischer Kochsalzlösung wieder auflösen.
In der Regel kann der erfindungsgemässe Wirkstoff in Zubereitungen mit Konzentrationen von allgemein 0,01 bis 90 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 60 Gew.%, enthalten sein.
Die für die Therapie zu verwendende Dosis bzw. Dosierung erfindungsgemässer Wirkstoffe hängt vom Krankheitszustand des Patienten ab, beträgt aber allgemeine 0,11 bis 9 g pro Tag bei Erwachsenen, vorzugsweise 0,1 bis 6 g.
Da ausserdem bei erfindungsgemässen Wirkstoffen die Tumortropie sowie die Antitumoraktivität des Antikörpers und die Antitumoraktivität der an den Antikörper gebundenen Antitumorsubstanz erhalten bleibt, gelangt der Wirkstoff bei der Verabreichung in wirksamer Weise an den Zielort des Tumors und entfaltet seine Antitumoraktivität.
Wenn man zur Beurteilung der Wirkung auf die Menge an erfindungsgemässem Wirkstoff als Basis abstellt, zeigt die Verabreichung des erfindungsgemässen Wirkstoffes, der die Antitumorsubstanz in einer Menge entsprechend Vio bis Vzo der Verabreichungsmenge derselben Antitumorsubstanz für sich enthält, den gleichen Inhibierungsgrad gegen die Tumorproliferation, wie die Verabreichung des Antitumormit-tels selbst; der durch die Antitumorsubstanz, die in dem Wirkstoff als Komponente enthalten ist, verursachte Nebenwirkungsgrad beträgt nur Vio bis V20 des Nebenwirkungsgrades der Antitumorsubstanz für sich. Diese Effekte können wahrscheinlich einer synergetischen Wirkung der vorteilhaften Eigenschaften der beiden Komponenten erfindungsgemässer Wirkstoffe zugeschrieben werden.
Im folgenden werden Beispiele für die Herstellung und die pharmakologische Wirksamkeit des erfindungsgemässen Wirkstoffes gegeben.
Beispiel 1
1-1. Herstellung und Reinigung des Antikörpers durch Affinitätsfällung (3):
Nach Kultivieren von Zellen vom Aszitestyp von Sarcoma- 180, die unter Verwendung von ICR-Mäusen sukzessiv gezüchtet worden waren, in einer wässrigen physiologischen Kochsalzlösung, die Mitomycin C in einer Konzentration von 50 Mikrogramm/ml enthielt, während 30 min bei einer Temperatur von 37 °C wurde die überstehende Flüssigkeit abzentrifugiert und die proliferierten Zellen dreimal mit wässriger 0,85%iger physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die auf diese Weise ihrer Proliferationsaktivität beraubten Sarcoma-180-Zellen wurden mit Adjuvans nach Freund (komplettes Adjuvans, im folgenden als FCA bezeichnet) vermischt und die Mischung subkutan in die Fusssohlen von Kaninchen mit durchschnittlichen Körpergewichten von 2,9 kg in einer Dosierung von 108 Zellen pro Tier injiziert. Die Kaninchen wurden durch eine wiederholte Injektion der Zellen zwei Wochen nach der ersten Verabreichung, wiederum unter intravenöser Verabreichung einer gleichen Anzahl von Zellen an die Tiere, immunisiert. Eine Woche nach der letzten Injektion wurde das gesamte Blut der Kaninchen durch eine in die Halsarterie eingeführte Kanüle gesammelt und das so gewonnene Blut zur Herstellung von gereinigtem Antiserum in folgender Weise verwendet:
Die ausgesalzene Fraktion, welche durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Menge von 20-30% des Sättigungsgewichtes zu 100 ml Antiserum gebildet worden war, wurde gesammelt und erneut in 20 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde durch Dialyse gegen wässrige 10 mM Phos4
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phatpufferlösung (im folgenden als PBS bezeichnet) bei einem pH-Wert von 7,0 während 72 Std. bei einer Temperatur von 4 °C vom Salz befreit. Bei dieser Dialysebehandlung wurde die Aussendialyseflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt. Eine gleiche Menge Blutzellen einer normalen ICR-Maus wurde dreimal mit wässriger Natriumcloridlösung gewaschen und dann mit der entsalzten Lösung der Mischung 30 min bei einer Temperatur von 4 C zum Erzielen der Absorption stehengelassen. Dann wurde die Mischung zur Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die oben beschriebene Arbeitsweise wurde viermal wiederholt, d.h. es wurden insgesamt fünf Absorptionsbehandlungen durchgeführt. Der so erhaltene Antikörper gilt hier als vorgereinigter Antikörper und wird allgemein als IgG bezeichnet. Dann folgt eine weitere Reinigung nach folgender Methode: Die der Absorptionsbehandlung unterzogene überstehende Lösung wird mit einer gleichen Menge an Zellen von Sarcoma-180 vermischt und die Mischung dann 30 min bei 4 °C zur Bindung des Antikörpers gegen Sarcoma-180 an die Zellen von Sarcoma-180 stehengelassen und die überstehende Lösung dann durch Zentrifugieren entfernt. Eine wässrige Glycin/Salzsäure-Pufferlösung von pH 3,0 wird dann dem Niederschlag zur Freisetzung des Antikörpers zugegeben. Die Mischung wurde zur Gewinnung der überstehenden Lösung, welche den Antikörper enthält, zentrifugiert. Nach Einstellen des pH-Wertes der überstehenden Lösung auf nahezu neutral durch Zusatz von wässriger 0,1 n Natriumhy-doxidlösung wurde die nahezu neutrale Lösung bei 4 'C während 24 Std. gegen PBS dialysiert, wobei die Aussenflüs-sigkeit alle 8 Std. gewechselt wurde. Die so erhaltene dialy-sierte Lösung ist eine wässrige Lösung, die Anti-Sarcoma-180-Antikörper von Kaninchen enthält.
1-2. Cytotoxizitätstest gegen Tumorzellen und normale Zellen:
Die durch den oben erhaltenen Immunoantikörper von Kaninchen verursachte Störung der Zellen wurde in Gegenwart eines Komplements (Meerschweinchenserum) wie folgt getestet:
Jeweils 100 Mikroliter der obigen wässrigen Lösung des Antikörpers und von drei verdünnten Antikörperlösungen s mit zehnfacher, hundertfacher und tausendfacher Verdünnung wurden mit 100 Mikroliter einer wässrigen Suspension von Sarcoma-180-Zellen oder den Milzzellen einer normalen ICR-Maus (bei jeder der Suspensionen wurde als Lösungsmittel das Medium nach Eagle mit Mindestgehalt an essen-lo tiellen Komponenten verwendet, wobei fünfmal 10ö Zellen pro ml vorhanden waren) und die Mischungen wurden 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurde ein aliquoter Anteil von 100 Mikroliter eines zweifach verdünnten Serums von Meerschweinchen zu jeder der oben genann-15 ten Mischungen zugegeben und die so erhaltenen Mischungen 30 min bei 37 °C inkubiert. Als Verdünnungsmittel wurde hierbei das oben erwähnte Medium nach Eagle (im folgenden als MEM) verwendet; das verdünnte Medium wird als «Komplement» bezeichnet. Nach dem Inkubieren wurde 2o das inkubierte Medium zur Gewinnung von Zellplätzchen zentrifugiert und nach einmaligem Waschen der Plätzchen mit MEM wurde eine wässrige Trypanblau-Lösung zu den Plätzchen zugesetzt, um diese zur mikroskopischen Bewertung der Zellenmortalität geeignet zu machen. 25 Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt. Daraus ergibt sich, dass bei Klassierung des Mortalitätsgrades der Zellen (Zell-Cytotoxizitätsaktivität) in drei Stufen « + », «+ +» bzw. «+ + +» (Fehlen von Zellenmortalität ist durch «—» bezeichnet) klar erkennbar ist, dass 30 die Toxizität des Antikörpers nach Reinigung für die Milzzellen von normalen ICR-Mäusen ausserordentlich gering ist und keine Zellmortalität bewirkt; dagegen zeigt der nach Reinigung des Antiserums entnommene Antikörper gegen Sarcoma-180-Zellen eine Cytotoxizität, die sich von der To-35 xizität des ohne Reinigung des Antiserums gewonnenen Antikörpers nicht wesentlich unterscheidet. Dies zeigt, dass die Reinigung des Antiserums sich für die Zwecke der Erfindung eignet.
TABELLE I Zellmortalität
Verdünnungsgrad der wässrigen Antikörperlösung
Zellen*
1
10
100
i 00!)
Vor Reinigung des Antiserums
A
+ + +
+ + +
+
—
nach Methode (3)
B
+ +
+
-
-
Nach Reinigung des Antise
A
+ + +
+ + +
+ +
—
rums nach Methode (3)
B
+
-
-
-
Kontrollversuch
A
—
—
(Eagle-MEM)
B
—
—
—
' A = Sarcoma-180-Zellen; B = Milzzellen von ICR-Mäusen.
Die für die obigen Bestimmungen verwendeten Milzzellen von ICR-Mäusen wurden wie folgt gewonnen: Die den Mäusen entnommene Milz wurde in Eagle-MEM mit zwei Pinzetten so fein zerteilt, dass das Material durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit einer Maschenweite von etwa 75 Mikrometer hindurchging, worauf das Filtrat einmal mit MEM gewaschen, mit 30 ml einer wässrigen, mit tris-(Hydroxymethylamino)-methan gepufferten 0,75%igen Ammoniumchloridlösung von pH 7,4 zum gewaschenen Filtrat für das Entfernen der Erythrozyten versetzt und das so behandelte Filtrat dreimal mit MEM gewaschen wurde.
1-3. Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatografie:
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Da bei der im obigen Abschnitt 1-1. angewendeten Methode (3) der Reinigung Probleme bezüglich der Abtrennung des reinen Antikörpers auftreten, die daran erkennbar sind, dass an den Mäusemilzzellen noch Störungen erkennbar 65 sind, wurde die folgende Reinigung des Antikörpers unter Verwendung einer Kolonne durchgeführt, in welcher das Tumorantigen in gebundener Form vorlag. Zunächst wurde die Reinigung am Antigen selbst durchgeführt.
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Tumorzellen von Sarcoma-180, Aszites-Typus, die sukzessiv an ICR-Mäusen gezüchtet worden waren, wurden gefriergetrocknet. Nach Zugabe einer wässrigen 5 mM Kaliumphosphatpufferlösung mit pH 7,4 wurde das Antigen 20 Std. aus den Zellen extrahiert. Die überstehende Lösung wurde durch Zentrifugieren bei 65'000 g während 10 min abgetrennt. Die so erhaltene Lösung wurde dann noch 30 min bei 180'000 g zentrifugiert und das so erhaltene Material 70 Std. bei 4°C gegen destilliertes Wasser dialysiert. Während der Dialyse wurde die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt. Das Dialysat wurde dann zur Entfernung von Niederschlag bei 65'000 g zentrifugiert. Nach Zugabe von Ammoniumsulfat zu der erhaltenen Lösung bis zu einer Konzentration von 2 m wurde die Lösung 10 min bei 65'000 g zur Gewinnung des Niederschlages zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst und die Lösung 72 Std. gegen destilliertes Wasser dialysiert. Während der Dialyse wurde die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt.
Das so erhaltene Sarcoma-180-Antigen wurde zur Bildung der Affinitätschromatografiesäule wie folgt verwendet:
Zunächst wurde zu einem mit Wasser auf 20 ml Volumen gequollenem Agarose-Gel («Sepharose 4B», Produkt der Firma Pharmacia Japan Co., Ltd.) ein gleiches Volumen einer wässrigen Bromcyanlösung mit einer Konzentration von 1 g/ml zugegeben. Nach 8 min Umsetzung unter Konstanthaltung des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf 11,0 wurde die Mischung zur Gewinnung des Niederschlages mit einem Glasfilter filtriert und der Niederschlag auf dem Filter mit eiskaltem destilliertem Wasser und eiskalter, wässriger 0,5 m Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Unmittelbar nach dem Waschen wurde der Niederschlag in wässriger 0,1 m Natriumbicarbonatlösung suspendiert. Die obige Lö-
Die in Tabelle II zusammengestellten Ergebnisse zeigen die Verminderung der Toxizität gegenüber den Milzzellen und die verstärkte Aktivität gegen die Sarcoma-180-Zellen des Antikörpers als Folge der Reinigung des Antikörpers durch die Methode (1) und verdeutlichen die hervorragende Reinigung des Antikörpers nach dieser Methode.
1-5. Bindung des Anti-Sarcoma-180-Antikörpers an Antitumorsubstanz:
Jeder der nach den Abschnitten 1-1. und 1-3. hergestellten Anti-Sarcoma-180-Antikörper von Kaninchen wurde jeweils nach Reinigung durch die oben angegebenen Methoden mit einer Antitumorsubstanz, wie Mitómycin C, Dauno-rubicin, Bleomycin, Actinomycin D, Sarcomycin und Doxorubicin-hydrochlorid zu erfindungsgemässem Wirkstoff umgesetzt. Als Beispiel wird die Umsetzung des in Abschnitt sung des gereinigten Antigens wurde zu der Suspension zugegeben und die Mischung über Nacht zur Umsetzung gerührt. Das Produkt wurde mit einem Glasfilter filtriert und zunächst mit wässriger 0,1m Natriumbicarbonatlösung, 5 dann mit destilliertem Wasser und schliesslich mit wässrigem Phosphat/Natriumchlorid-Puffer (0,85%, pH 7,0) gewaschen. Das so erhaltene Reaktionsprodukt wurde in ein Glasrohr mit 13 mm Innendurchmesser und einer Länge von 15 cm als Säule für die Affinitätschromatografie eingefüllt, io 3 ml der Lösung des Antikörpers (IgG), hergestellt nach dem Verfahren gemäss Abschnitt 1-1., jedoch ohne Bindung der Sarcoma-180-Zellen, wurde in die Kolonne gegossen, worauf eine wässrige 5 mM Phosphat/Natriumchlorid-Pufferlösung (0,85%, pH 7,0) durch die Kolonne geführt wurde, bis 15 im abfliessenden Material kein Protein mehr nachgewiesen werden konnte. Dann wurde eine mit wässriger 50 mM Gly-cinhydrochlorid-Pufferlösung versetzte wässrige 0,5 m Kochsalzlösung durch die Kolonne geführt, um die Fraktion als Eluat zu gewinnen. Das Eluat wurde rasch mit Natrium-20 bicarbonat neutralisiert und das neutralisierte Material gegen wässrige Phosphatpuffer/Kochsalzlösung (0,85%, pH 7,0) 72 Std. dialysiert. Die Aussenflüssigkeit wurde alle 24 Std. ausgewechselt. Das so erhaltene Dialysat war eine wässrige Lösung eines durch Säulenaffinitätschromatografie 25 gereinigten Antikörpers gegen Sarcoma-180.
1-4. Cytotoxizitätstest gegen Tumorzellen und normale Zellen:
Nach der in Absatz 1-2. beschriebenen Methode wurde 30 die Cytotoxizität des nach Absatz 1-3. erhaltenen Antikörpers getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
10 100 1000
+++ ++ -+++ ++ +
1-1. hergestellten Antikörpers mit Mitómycin C beschrieben:
55 Einer wässrigen Lösung, die den gereinigten Kaninchen-Anti-Sarcoma-180-Antikörper in einer Konzentration von 10,4 mg/ml enthielt, wurden 13,0 mg Mitómycin C zugegeben. Unter Rühren und Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf 4,75 wurden 3,7 mg l-Ethyl-3-(3-dimethylamino-60 propyl)-carbodiimid-hydrochlorid zugegeben und die Reaktion während der in Tabelle III angegebenen Zeitspanne laufen gelassen. Dann wurde die Umsetzung durch Zusatz von 2 ml einer wässrigen Pufferlösung aus Essigsäure und Na-triumacetat von pH 4,70 abgebrochen. Nach Dialysieren der 65 Reaktionsmischung gegen 5 Liter destilliertes Wasser bei 4 C während 72 Std. (dreimaliger Wechsel der Aussenflüssigkeit während des Dialysierens) wurde die Innendialyse-flüssigkeit eingeengt und durch eine mit einem Dextranderi-
TABELLE II Zellmortalität
Verdünnungsgrad
Zellen*
1
Lösung des Antikörpers nach
A
+ + +
Reinigung gemäss Methode (3)
B
+
Lösung des Antikörpers nach
A
+ + +
Reinigung gemäss Methode (1)
B
—
Kontrollversuch
A
—
(nur Eagle-MEM)
B
-
* A=Sarcoma-180-Zellen; B=Milzzellen von Mäusen
vat («Sephadex» G-25 der Farmacia Japan Co.) gefüllte Säule geführt, um die niedermolekularen Substanzen zur Reaktionsmischung vollständig in der Kolonne zu adsorbieren. Die Kolonne hatte einen Durchmesser von 1,5 cm und eine Höhe von 55 cm.
Das aus der Kolonne erhaltene Eluat wurde bei —20 °C zur Gewinnung des Produktes gefriergetrocknet. Die Menge des an den Antikörper gebundenen Mitómycin C wurde laufend durch UV-Absorptions-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.
TABELLE III Anteile des an den Antikörper gebundenen Mitómycin C
Reaktionsdauer Menge an Mitómycin C/Antikörper
(min) (Mikrogramm/mg)
10 4,2
30 8,4
60 10,0
Die eine Komponente des pharmazeutischen Wirkstoffes ist ein modifiziertes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 150'000, das in Wasser löslich und in organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Aceton, Methanol und dergleichen, unlöslich ist. Diese Verbindung zeigt ein IR-Absorptionsspektrum wie es in Fig. 1 dargestellt ist. Das UV-Absorptionsspektrum zeigt spezifische Absorptionsspitzen bei 280 und 360 nm.
Nach den oben beschriebenen Arbeitsweisen wurde der gereinigte, von Kaninchen stammende Anti-Sarcoma-180-Antikörper (10 mg) mit Doxorubicin-hydrochlorid, Dauno-rubicin und Actinomycin D umgesetzt, wobei jeweils die entsprechenden gebundenen Verbindungen in Mengen von
7 mg erhalten wurden. Die Anteile an Doxorubicin-hydro-chlorid, die an jeweils 1 mg des Antikörperproteins gebunden waren, betrugen 4,1 Mikrogramm bzw. 9,0 Mikrogramm für Reaktionszeiten von 10 bzw. 30 min. Gleiche Ergebnisse wurden bei Verwendung von IgG-Antikörper erhalten.
Ferner wurde der gemäss Abschnitt(l-3) von Kaninchen gewonnene gereinigte Anti-Sarcoma-180-Antikörper unter gleichen Bedingungen wie oben mit Mitómycin C zur Bildung einer Verbindung umgesetzt, die nahezu die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie die oben erwähnten Verbindungen zeigte. Weiterhin wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben nach der beschriebenen Methode die jeweils an Daunorubicin, Bleomycin, Actinomycin D, Sarco-mycin und Doxorubicin-hydrochlorid gebundene Verbindungen hergestellt.
Beispiel 2
2-1. Herstellung eines Antikörpers zu Tumorzellen und Reinigung des Antikörpers:
Aszites-Typ Sarcoma-180-Zellen, die sukzessiv unter Verwendung von ICR-Mäusen gezüchtet und durch Mitómycin C ihrer Proliferationsaktivität beraubt worden waren, wurden intraperitoneal ICR-Mäusen einmal pro Woche mit einer Dosierung von 107 Zellen pro Tier insgesamt viermal injiziert. Am 7. Tag, dem Tag der letzten Injektion, wurde den anästhesierten Tieren die Bauchhöhle aufgeschnitten und das Blut aus der grossen Abdominalvene entnommen. Aus diesem Blut wurde Antiserum in einer Menge von 35 ml
7 655 010
aus 100 Tieren gewonnen. Die Gewinnung des Antikörpers aus dem Antiserum und die Reinigung des Antikörpers erfolgten nach der Arbeitsweise von Beispiel 1, Absatz 1-1 wobei nach der Absorption durch die Erythrozyten der s Mäuse abgebrochen wurde.
2-2. Reinigung eines Antikörpers durch Affinitätschromatografie:
io Zu 30 mg gefriergetrockneten Sarcoma-180-Zellen vom Aszites-Typ, die sukzessiv unter Verwendung von ICR-Mäusen gezüchtet worden waren, wurde eine wässrige 3-mo-lare Kaliumchloridlösung gegeben, die mit wässriger 5 mM Kaliumphosphatpufferlösung auf pH 7,4 gepuffert war, um is das Antigen während 20 Std. zu extrahieren. Der Extrakt wurde 10 min bei 65'000 g zur Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dann nochmals während 30 min bei 180'000 g zentrifugiert. Dieses Material wurde gegen destilliertes Wasser bei 2o 4 °C 72 Std. dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt wurde.
Die Affinitätschromatografie des so erhaltenen Antigens von Sarcoma-180 wurde wie folgt durchgeführt:
20 ml von Wasser angequollenem Agarose-Gel («Sepha-rose» 4B, Farmacia Japan Co., Ltd.) wurden mit 20 ml einer wässrigen Bromcyanlösung bei einer Konzentration von 1 g/ ml gemischt, wobei der pH-Wert der Mischung zum Bewirken der Umsetzung 8 min auf 11,0 gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann durch einen Glasfilter filtriert. Der Filterrückstand wurde auf dem Filter mit eiskaltem destilliertem Wasser und eiskalter wässriger 0,5 m Natriumbi-carbonatlösunq gewaschen und sofort in einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonatlösung suspendiert, worauf die oben erwähnte gereinigte Antigenlösung zu der Suspension zugegeben und das Ganze zur Umsetzung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das Produkt wurde mit einem Glasfilter filtriert und in der Folge mit wässriger 0,1 m Natriumbicarbonatlösung, mit destilliertem Wasser und schliesslich mit wässriger Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (0,85%, pH 7,0) gewaschen. Das gewaschene Produkt wurde zur Bildung einer Säule für die Affinitätschromatografie in ein Glasrohr mit 13 mm Innendurchmesser und einer Höhe von 15 cm eingefüllt.
45 3 ml des nach der Arbeitsweise von Absatz 2-1. hergestellten Antiserums (das einen Antikörper enthielt) wurden durch die Affinitätschromatografiekolonne geführt, worauf eine wässrige 5 mM Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (0,85%, pH 7,0) durch die Kolonne geführt wurde, so bis im abfliessenden Material kein Protein mehr erkennbar war. Dann wurde eine wässrige 0,5 m Natriumchloridlösung, die mit wässriger 5 mM Glycin-Salzsäure-Pufferlösung (pH 4,0) versetzt worden war, durch die Kolonne zur Gewinnung der Eluatfraktion geführt. Die Eluatfraktion wurde 55 nach Neutralisieren mit Natriumbicarbonat einmal gegen wässrige Phosphatpufferlösung mit Natriumchlorid (0,85%, pH 7,0) während 72 Std. dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt wurde. Auf diese Weise wurde eine durch Affinitätschromatografie gereinigte wässrige Lö-60 sung eines Antikörpers zu Sarcoma-180 erhalten.
2-3. Cytotoxizitätstest gegen Tumorzellen und normale Zellen:
65 Die Cytotoxizität des so erhaltenen Sarcoma-180-Anti-körpers von Mäusen wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.
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TABELLE IV Zellmortalität
Verdünnungsgrad des Antikörpers Zellen*
1
10
100
1000
Antikörperlösung vor Reini- A
gung gemäss Metode ( 1 ); 2-1. B
Antikörperlösung nach Reini- A gung gemäss Methode (1); 2-2. B
Kontrolle A
(Eagle-MEM) B
+ + + + + +
+ + + + +
+ +
+
* A = Sarcoma-180-Zellen, B=Mäusemilzzellen
Aus Tabelle IV ist zu erkennen, dass die Aktivität gegen Sarcoma-180-Zellen durch Affinitätschromatografie in bemerkenswerter Weise verstärkt wird.
2-4. Binden von Anti-Sarcoma-180-Antikörper von Mäusen mit Antitumorsubstanz:
Nach den obigen Abschnitten 2-1. bzw. 2-2. gewonnene Antikörper wurden nach der in Abschnitt 1-5. von Beispiel 1 beschriebenen Methode durch Amidobindung an Mitómycin C gebunden. In gleicher Weise wurde der Antikörper auch durch Amidobindung an Doxorubicin-hydrochlorid, Bleomycin, Daunorubicin, Acetinomycin D und Sarcomycin gebunden. Die so erhaltenen pharmazeutischen Mittel zeigten fast die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie die entsprechenden gemäss Abschnitt 1-5. erhaltenen Verbindungen.
Im folgenden werden die nach den Abschnitten 1-5. bzw. 2-4. erhaltenen repräsentativen Wirkstoffe auf ihre Antitumoraktivität geprüft.
Wirkungsprüfung (A)
Antitumoraktivität der Wirkstoffe gegen festes Sarcoma-180:
Zellen von Sarcoma-180 von Mäusen, die sukzessiv unter Verwendung von ICR-Mäusen kultiviert worden waren, wurden subkutan in die Achseln jeder Gruppe der als Versuchstiere verwendeten ICR-Mäuse transplantiert. Die Versuchsgruppen bestanden jeweils aus 10 Tieren und die Verabreichungsdosis betrug 1x10® Zellen pro Tier. 24 Std.
nach dem Transplantieren wurde den Versuchstieren das zu testende Mittel jeweils jeden zweiten Tag insgesamt zehnmal intraperitoneal injiziert. 5 Tage nach der letzten Injektion wurden alle Versuchstiere getötet und die Tumoren ausgeschält. Das durchschnittliche Gewicht der Tumoren (T) wurde mit dem Tumorgewicht (C) von 10 Mäusen verglichen, denen anstelle des Testmittels eine wässrige physiologische Kochsalzlösung verabreicht worden war. Die Berechnung erfolgte gemäss folgender Formel und zeigt das Mass der Inhibierung der Wucherung des Tumors (Sarcoma-180) durch das Mittel:
(1 ) x 100
C
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen V, VI, VII und VIII zusammengestellt. Als Behandlungsmittel im Test wurden verwendet: (1) Antikörper, (2) handelsübliche Antitumorsubstanzen, (3) Wirkstoff aus Anti-Sarcoma-180-Antikörper von Kaninchen, gebunden an jeweils eine der üblichen Antitumorsubstanzen und (4) Wirkstoff aus Anti-20 Sarcoma-180-Antikörper von Mäusen, gebunden an jeweils eine der handelsüblichen Antitumorsubstanzen. In den folgenden Tabellen V bis VIII sind die mit den verschiedenen Antitumorsubstanzen, die durch Bindung dieser Substanzen an Antikörper bzw. die mit Antikörpern allein erzielten Re-25 sultate zusammengestellt. In den Tabellen bedeutet: AK= Antikörper aus Kaninchen AM= Antikörper aus Mäusen
(Aj) bzw. (A3): Antikörper-Affinitätschromatografie gemäss Methode (1) oder Methode (3)
30
TABELLEV Mitómycin und Wirkstoff hiervon mit Antikörpern
Test an Dosis (mg/kg) Wucherungs gesamt MMC- hemmung (%) 40 Anteil
Mitómycin C
( = MMC) 1
Wirkstoff AK 5
45 aus MMC AK(A3) 5
und: AK(Aj) 5
AM 5
AM (Ai) 5
50
TABELLE VI Bleomycin und Wirkstoff hiervon mit Antikörpern
Test an Dosis (mg/kg) Wucherungs gesamt BMC- hemmung (%) so Anteil
Bleomycin
( = BMC)
0,5
0,5
45
Wirkstoff
AK
5
0,05
36
65 aus BMC
AK(A3)
5
0,05
42
und:
AK (A,)
5
0,05
45
AM
5
0,05
44
AM (A,)
5
0,05
45
1
40
0,05
32
0,05
37
0,05
40
0,05
39
0,05
40
TABELLE VII Doxorubicin-HCl und Wirkstoff hiervon mit Antikörpern
Test an Dosis (mg/kg) Wucherungs gesamt DOC- hemmung (%) Anteil
Doxorubicin-HCl
(=DOC)
2
2
50
Wirkstoff
AK
20
0,2
40
aus DOC
AK(A3)
20
0,2
47
und:
AK (Aj)
20
0,2
50
AM
20
0,2
49
AM (Aj)
20
0,2
50
TABELLE VIII Antikörper
Dosis (mg/kg) Wucherungshemmung (%)
AK
5
4
(A3)
5
5
(a,)
5
5
AK
20
5
(a,)
20
5
(a,)
20
5
AM
5
6
(Aj)
5
7
AM
20
7
(Ai)
20
7
Aus den obigen Tabellen V bis VII ist zu erkennen, dass das Mass der Inhibierung der Proliferation (Wucherungs-hemmung) von Sarcoma-180 mit erfindungsgemässen Wirkstoffen in der gleichen Grössenordnung liegt, wie das der bekannten kommerziell erhältlichen Antitumorsubstanzen, jedoch bei fünf- bis zehnmal grösseren Dosierungen der bekannten Antitumorsubstanzen. Diese Tatsache zeigt, dass die Antitumoraktivität des Antikörpers selbst offenbar nicht substantiell ist, was an sich der Natur der Dinge entspricht. Die charakteristischen Eigenschaften erfindungsgemässer Wirkstoffe ergibt sich klar, wenn man die verabreichte Menge an bekannter Antitumorsubstanz mit dem mengenmässi-gen Anteil der bekannten Antitumorsubstanzen als Komponenten der erfindungsgemässen Wirkstoffe betrachtet. Obwohl nämlich die Menge des letzteren nur Vio oder V20 der entsprechenden Wirkungsmenge an Antitumorsubstanz entspricht, sind in beiden Fällen die Inhibierungseffekte nahezu gleich. Aus dieser Tatsache kann der Schluss gezogen werden, dass der eine Komponente der erfindungsgemässen Wirkstoff darstellende Antikörper die geringe Menge an Antitumorsubstanz, die als Komponente des erfindungsgemässen Wirkstoffes verwendet wird, an die Tumorstelle transportiert.
Die erfindungsgemässen Wirkstoffe zeigen wegen der oben beschriebenen Funktion unter Verminderung der verabreichten Menge an handelsüblicher Antitumorsubstanz, die für sich ausserordentlich starke Nebenwirkungen auslöst, auf Vio bis V20 der üblichen Verabreichungsmenge den gleichen Grad an Tumorinhibierungsaktivität.
Ausserdem ist zu bemerken, dass, obwohl der Ursprung des Antikörpers offenbar in keiner Beziehung zur Wachstumshemmwirkung auf den Tumor steht, bei Verwendung
9 655 010
von Kaninchen für die Herstellung des Antikörpers, mit welchem die Antitumorsubstanz gebunden wird, und üblicher Reinigung des Antikörpers bei Verabreichung an 10 Mäuse, etwa 3 Tiere allgemeine Krampferscheinungen und Verstei-s fungen, d.h. Anzeichen für anaphylaktischen Schock zeigten, während bei Verabreichung von erfindungsgemässem Wirkstoff der durch Binden des durch Affinitätschromatografie gereinigten Antikörpers an die Antitumorsubstanz erhalten war, in viel geringerem Masse Anzeichen für anaphy-
10 laktischen Schock auftraten. Wird die Antikörperkomponente des Wirkstoffes aus Mäusen gewonnen, in üblicher Weise gereinigt und dann an die Antitumorsubstanz gebunden, so tritt relativ selten anaphylaktischer Schock auf.
Wenn der Antikörper aber weiter durch Affinitätschromato-
15 grafie gereinigt wurde, konnten niemals Anzeichen für anaphylaktischen Schock beobachtet werden.
Beispiel 3
3-1. Herstellung eines Antikörpers und dessen Reinigung 20 unter Anwendung der Affinitätsfällung:
Zellen von Yoshida-Sarcoma, die sukzessiv unter Verwendung von Donryu-Ratten kultiviert worden waren, wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und die Mischung nach Zusatz von 50 Mikrogramm/ml Mitómycin 25 C 30 min bei 37 °C inkubiert und darauf zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die Zellen wurden dreimal mit wässriger physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die auf diese Weise ihrer Wucherungsaktivität beraubten Yoshida-Sarcoma-Zellen wurden mit FCA (kom-30 plettes Adjuvans nach Freund) vermischt und die Mischung subkutan in die Fussohlen von Kaninchen mit Körpergewichten von 2,9 kg bei einer Dosierung von 108 Zellen pro Tier injiziert. Zwei Wochen nach der ersten Injektion wurde den Kaninchen in ähnlicher Weise eine zweite Injektion mit 35 den Zellen verabreicht, diesmal jedoch durch intravenöse Injektion. Eine Woche nach der letzten Injektion wurde den Versuchstieren über eine in die Halsschlagader eingeführte Kanüle das gesamte Blut abgenommen. Das aus dem Blut hergestellte Antiserum wurde in folgender Weise gereinigt: "o 100 ml Antiserum wurden in einer Menge entsprechend 20-30% des Sättigungsgewichtes mit Ammoniumsulfat zum Aussalzen versetzt. Die ausgesalzene Fraktion wurde wieder in 20 ml Wasser gelöst und die so gebildete Lösung gegen wässrige 10 mM Phosphatpufferlösung mit Natriumchlorid « (im folgenden als PBS bezeichnet) mit pH von 7,0 bei 4 °C 72 Std. dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt wurde. Eine gleiche Menge an Erythrocyten von normalen Donryu-Ratten wurde dreimal mit wässriger Kochsalzlösung gewaschen, dann zur Absorption 30 min bei so 4 °C stehengelassen und schliesslich zur Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Diese Absorptionsbehandlung wurde viermal wiederholt, d.h. es wurde insgesamt fünfmal absorbiert. Der so erhaltene Antikörper wird als vorgereinigter Antikörper (meist als IgG bezeichnet) an-55 gesehen.
Im nächsten Schritt wurde das IgG weiter nach folgender Methode gereinigt: Die fünfmal der Absorptionsbehandlung unterzogene überstehende Flüssigkeit wurde mit einer gleichen Menge Zellen von Yoshida-Sarcoma vermischt und die so Mischung zur Bindung des Antikörpers gegen Yoshida-Sarcoma an die Zellen von Yoshida-Sarcoma 30 min bei 4 CC stehengelassen. Dann wurde die Mischung zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Der Niederschlag wurde mit einer wässrigen Glycinhydrochlorid-65 Pufferlösung von pH 3,0 zur Freisetzung des Antikörpers versetzt. Diese Mischung wurde dann zur Gewinnung der den Antikörper enthaltenden überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert, die so erhaltene Flüssigkeit mit wässriger 0,1 m
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Natriumhydroxidlösung bis nahezu Neutral eingestellt und dann 24 Std. bei 4 °C gegen PBS dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 8 Std. gewechselt wurde. Das so erhaltene Dialysat ist eine wässrige Lösung des von Kaninchen gewonnenen Anti-Y oshida-Sarcoma-Immunoantikörpers.
3-2. Cytotoxizitätstest gegen Tumorzellen und normale Zellen:
Die Cytotoxizität des gemäss Abschnitt 3-1. erhaltenen Antikörpers für Zellen in Gegenwart eines Komplements (Meerschweinchenserum) wurde wie folgt geprüft: Die wässrige Lösung des Antikörpers mit zehnfacher, hundertfacher und tausendfacher Verdünnung wurde jeweils mit einer Suspension von Yoshida-Sarcomazellen oder einer Suspension der Milzzellen normaler Donryu-Ratten vermischt. Für beide Suspensionen wurde Eagle-MEM als Medium verwendet und die Zellkonzentration betrug jeweils 5+10® Zellen/ml. Das Verhältnis betrug 100 Mikroliter: 100 Mikroliter und die Mischung wurde 15 min stehengelassen, so dass der Antikörper von den Zellen absorbiert wurde. Die erhaltenen Mischungen wurden mit 100 Mikroliter Merrschweinchense-
10
rum, das mit Eagle-MEM zweifach verdünnt worden war (das verdünnte Serum wird als Komplement bezeichnet) vermischt und die erhaltene Mischung 30 min bei 37 °C inkubiert und darauf zentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag s wurde einmal mit Eagle-MEM gewaschen und nach Zusatz von Trypanblau-Lösung wurde die Mortalität der Zellen in dem gewaschenen und gefärbten Niederschlag mikroskopisch untersucht.
Die Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX zu-io sammengestellt. Aus dieser Tabelle ist zu erkennen, dass bei Klassifizierung der Zellmortalität (Zellstörungsaktivität) in drei Wertgruppen die mit +, -I- + bzw. + + + bezeichnet sind (Fehlen von Zelltod durch «—» angegeben), beobachtet werden konnte, dass, obwohl die Toxizität des nach der Reils nigung des Antiserums gewonnenen Antikörpers für Zellen von Yoshida-Sarcoma sich nicht erheblich von der Toxizität des ohne Reinigung des Antiserums gewonnenen Antikörpers unterschied, die Toxizität des ersteren für die Milzzellen von normalen Donryu-Ratten ausserordentlich niedrig war. 2o Dies deutet daraufhin, dass diese Reinigung des Antiserums für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
TABELLE IX Zellmortalität
Verdünnungsgrad
Zellen
1
10
100
1000
Lösung des Antikörpers vor Y
Reinigung gem. Methode (3) Z
Lösung des Antikörpers nach Y
Reinigung gem. Methode (3) Z
Kontrolle Y
(Eagle-MEM) Z
+ + + + + + + + +
+ + + + + + +
+ + +
Y=Yoshida-Sarcomazellen; Z=Rattenmilzzellen
Die für diese Versuche verwendeten Rattenmilzzellen waren in analoger Weise gewonnen, wie die oben erwähnten Mäusemilzzellen.
3-3. Reinigung eines Antikörpers durch Affinitätschromatografie (1):
Folgende Reinigung eines Antikörpers wurde durch Affinitätschromatografie unter Verwendung einer Kolonne mit einem Träger durchgeführt, an welchen ein Tumorantigen gebunden ist. Zunächst wird das Antigen selbst wie folgt hergestellt: Tumorzellen von Yoshida-Sarcoma, die sukzessiv unter Verwendung von Donryu-Ratten kultiviert worden waren, wurden gefriergetrocknet. 30 g dieser Zellen wurden mit einer wässrigen Lösung von 3 m Kaliumchlorid, die mit wässriger 5 mM Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,4) gepuffert worden war, vermischt, um das Antigen innerhalb eines Zeitraumes von 20 Std. zu extrahieren. Die Extraktflüssigkeit wurde 10 min bei 65'000 g zur Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert und diese Flüssigkeit dann nochmals 30 min bei 180'000 g zentrifugiert. Diese Flüssigkeit wurde dann 70 Std. bei 4°C dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt wurde. Das Dialysat wurde zur Entfernung von Niederschlag bei 65'000 g zentrifugiert und nach Zugabe von Ammoniumsulfat zur überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Konzentration von 2 m wurde die Mischung dann 10 min bei 65'000 g zur Gewinnung von Niederschlag zentrifugiert, der in destilliertem
Wasser gelöst wurde. Diese Lösung wurde 72 Std. gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt wurde.
45 Mit dem so erhaltenen Antigen von Yoshida-Sarcoma wurde die Kolonne für die Affinitätschromatografie wie folgt hergestellt:
20 ml von mit Wasser angequollenem Agarose-Gel («Se-pharose» 4H, Firma Farmacia Japan Co., Ltd.) wurden mit 50 20 ml einer wässrigen Bromcyanlösung in einer Konzentration von 1 g/ml versetzt und der pH-Wert der Mischung 8 min bei 11,0 gehalten, um die Komponenten miteinander zur Umsetzung zu bringen. Die Reaktionsmischung wurde dann durch ein Glasfilter filtriert. Der auf dem Filter zu-55 rückbleibende Niederschlag wurde mit eiskaltem destilliertem Wasser und dann mit eiskalter wässriger 0,5 m Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Der so gewaschene Niederschlag wurde in einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonatlö-sung dispergiert.
Die oben genannte wässrige Lösung des gereinigten Antigens wurde zu der Dispersion zugegeben und die beiden Komponenten durch Rühren der Mischung über Nacht bei Raumtemperatur zur Umsetzung gebracht. Das durch ein 65 Glasfilter filtrierte Produkt wurde zuerst mit wässriger 0,1 m Natriumbicarbonatlösung, dann mit destilliertem Wasser und schliesslich mit wässriger Phosphatpuffer/Natriumchlo-rid-Lösung (0,85%, pH 7,0) gewaschen.
Das so gewaschene Reaktionsprodukt wurde zur Bildung einer Kolonne für die Affinitätschromatografie in ein Glasrohr mit 13 mm Durchmesser und 15 cm Höhe eingefüllt. In diese Kolonne wurden 3 ml Lösung des Antikörpers (IgG) eingebracht, die nach Abschnitt 3-1. (ausser der Bindung mit den Yoshida-Sarcomazellen) hergestellt worden war. Dann wurde eine wässrige 5 mM Phosphatpuffer/ Natriumchlorid-Lösung (0,85%, pH 7,0) in die Kolonne eingeführt, bis im ausfliessenden Material kein Protein mehr erkennbar war. Dann wurde eine wässrige 0,5 m Natriumchloridlösung mit einer wässrigen 50 mM Glycin/Salzsäure-Pufferlösung (pH 4,0) in die Kolonne eingeführt und eine Abflussfraktion gesammelt, die sofort mit Natriumbicarbo-nat neutralisiert wurde. Das neutralisierte Material wurde
655 010
gegen eine wässrige Phosphorsäurepuffer/Natriumchlorid-Lösung (0,85%, pH 7,0) 72 Std. dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt wurde. Auf diese Weise wurde die wässrige Lösung des durch Kolonnen-Affinitäts-s chromatografie gereinigten Antikörpers gegen Yoshida-Sarcoma erhalten.
3-4. Cytotoxizitätstest gegen Tumorzellen und normale 10 Zellen:
Die Cytotoxizität des gemäss Abschnitt 3-3. erhaltenen Antikörpers wurde nach der in Abschnitt 3-2. genannten Methode geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle X zusammengestellt.
11
TABELLEX Zellmortalität
Verdünnungsgrad des Antikörpers Zellen
1
10
100
1000
Lösung des Antikörpers nach Y
Reinigung gem. Methode (3) Z
Lösung des Antikörpers nach Y
Reinigung gem. Methode (1) Z
Kontrolle Y
(Eagle-MEM) Z
+ + + +
+ H- +
+ + + + + +
+ + + +
+
Y=Y oshida-Sarcomazellen; Z=Rattenmilzzellen
Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität des Antikörpers gegen die Yoshida-Sarcomazellen erheblich verstärkt war, wohingegen die Aktivität des Antikörpers gegen die Rattenmilzzellen als Folge der Reinigung durch Affinitätschromatografie in der Kolonne vermindert war, und dass die Reinigung durch Affinitätschromatografie hervorragende Ergebnisse liefert.
3-5. Binden von Anti-Yoshida-Antikörper an eine Antitumorsubstanz vom Typ der Alkylierungsmittel: Anti-Yoshida-Sarcoma-Antikörper von Kaninchen, hergestellt und gereinigt gemäss den obigen Abschnitten 3-1. und 3-3., wurden mit einem der folgenden kommerziellen Antitumormittel umgesetzt, und zwar Chlorambucil, Mel-phalan (Phenylalaninsenf), ACNU, Uramustin und Cyclo-phosphamid. Auf diese Weise wurden die entsprechenden gebundenen Mittel hergestellt.
Im folgenden werden Synthese-Beispiele gegeben.
Synthese-Beispiel 1 Umsetzung des Antikörpers mit Chlorambucil:
10 ml einer wässrigen Lösung, die den gereinigten, von Kaninchen gewonnenen Antikörper gegen Yoshida-Sarcoma, hergestellt gemäss Abschnitt 3-1., in einem Anteil von 10,0 mg/ml enthielt, wurden 40 mg Chlorambucil zugesetzt und der pH der Lösung unter Rühren mit Salzsäure auf 4,75 eingestellt. Ferner wurden 25,2 mg l-Ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid zugegeben und die Mischung 40 min umgesetzt. Die Umsetzunq wurde durch Zugabe von 20 ml einer wässrigen, mit Natriumacetat gepufferten Essigsäurelösung mit pH 4,75 abgebrochen.
Dann wurde die Reaktionsmischung während 72 Std. bei 4 C gegen 5 Liter destilliertes Wasser dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit dreimal gewechselt wurde. Nach dem Kondensieren bzw. Einengen der Innendialyseflüssigkeit wurde das Material durch eine mit einem Dextranderivat 35 («Sephadex» G-200, der Firma Farmacia Japan Co., Ltd.) gefüllte Kolonne von 3 cm Durchmesser und 65 cm Höhe geführt, um die hochmolekularen Substanzen und die niedermolekularen Substanzen in der Lösung völlig zu trennen. Der Kolonnenablauf wurde 60 min bei 40'000 g ultrazentri-40 fugiert und die überstehende Flüssigkeit bei —20 °C zur Gewinnung der Zielsubstanz gefriergetrocknet. Der Proteingehalt des Produktes wurde durch die Methode von Copper-Folin unter Verwendung von Albumin als Bezugssubstanz bestimmt. Ferner wurde der gebundene Anteil des Alkylie-45 rungsmittels nach der Methode von Epstein (J. Anal. Chem. 27,1423,1955) bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass der erhaltene Wirkstoff 10 Mikrogramm Chlorambucil gebunden an 1 mg des Antikörpers enthielt.
50 Synthese-Beispiel 2
Umsetzung des Antikörpers mit Melphalan:
In der in Synthesebeispiel 1 beschriebenen Weise, jedoch unter Verwendung derselben Menge Melphalan anstelle von Chlorambucil und weiter unter Verwendung von 5 Litern 55 PBS anstelle des destillierten Wassers in der Dialyse, wurde von Kaninchen gewonnener gereinigter Antikörper an Melphalan gebunden, was einen Wirkstoff ergab, in welchem 10 Mikrogramm Melphalan an 1 mg des Antikörpers gebunden waren.
60
Synthese-Beispiel 3 Umsetzung des Antikörpers mit Uramustin:
In der in Synthese-Beispiel 1 beschriebenen Weise, jedoch unter Verwendung von 40 mg Uramustin anstelle von Chlor-ss ambucil, wurde der gereinigte Antikörper mit dem Uramustin umgesetzt. Dabei wurde jedoch festgestellt, dass das Uramustin nicht im wesentlichen Masse an den Antikörper gebunden wurde. Deshalb wurde das Uramustin in einem
655 010
12
weiteren Versuch zur Erhöhung seiner Reaktionsfähigkeit mit Chloressigsäure in folgender Weise umgesetzt: In 10 ml Methanol wurden 500 mg Uramustin und 139 mg Kalum-methoxid gelöst. Dann wurden 188 mg Chloressigsäure zur Lösung gegeben und das Ganze 60 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde aus Methanol und Chloroform umkristallisiert, was 215 mg (Ausbeute 35%) kristalline Substanz ergab, welche die im folgenden angegebene Struktur eines Uramustinderivates besass:
.An
HN Ii
N »
/CH2ch2ci
\
ch2ch2ci
(Zersetzung bei etwa 200°C)
ch,
—cooh
Elementaranalyse:
gefunden: C% 38,50 H% 4,00 N% 13,30 berechnet: C% 38,70 H% 4,19 N% 13,54
Das so erhaltene Uramustinderivat wurde dann wie in Synthese-Beispiel 1 mit dem gemäss Abschnitt 3-1. erhaltenen Antikörper gegen Yoshida-Sarcoma von Kaninchen zu einem erfindungsgemässen Wirkstoff umgesetzt, in welchem 10 Mikrogramm Uramustin an 1 mg Antikörper gebunden waren.
Synthese-Beispiel 4 Umsetzung des Antikörpers mit einem Derivat von Melphalan:
Zunächst wurde ein Melphalanderivat aus Melphalan wie folgt hergestellt:
In 10 ml Dimethylsulfoxid wurden 200 mg des Silbersalzes von Melphalan gelöst und die Lösung mit 100 mg Chloressigsäure versetzt. Dann wurde das Ganze unter Lichtaus-schluss 64 Std. gerührt. Nach Entfernung des Niederschlages aus der Reaktionsmischung wurden das Dimethylsulfoxid und die Chloressigsäure unter vermindertem Druck auf dem Wasserbad bei Temperaturen von 80 °C abdestilliert.
Bei Zugabe von Wasser zum Rückstand und Abkühlen der Mischung schieden sich weisse Kristalle ab. Diese wurden unter vermindertem Druck getrocknet. Das so in einer Ausbeute von 40% erhaltene Melphalanderivat wurde zur Umsetzung mit dem gemäss Abschnitt 3-1. erhaltenen Antikörper in der in Synthese-Beispiel 2 beschriebenen Weise verwendet, um ein pharmazeutisches Mittel zu bilden, in welchem 16 Mikrogramm des Melphalanderivates an 1 mg Antikörper gebunden waren.
Synthese-Beispiel 5 Der von Kaninchen gewonnene Antikörper gegen Yoshi-da-Sarcoma, hergestellt und gereinigt gemäss Abschnitt 3-3., wurde nach der in Synthese-Beispiel 1 angegebenen s Weise mit einer der folgenden Verbindungen umgesetzt: Chlorambucil, Melphalan, Melphalanderivat gemäss Synthese-Beispiel 4 und Uramustinderivat gemäss Synthesebeispiel 3.
Die so hergestellten Wirkstoffe waren praktisch gleich io den in den oben erwähnten Synthese-Beispielen erhaltenen Produkten.
Beispiel 4
4-1. Herstellung und Reinigung eines Antikörpers gegen 15 Tumorzellen:
Yoshida-Sarcoma-Zellen vom Aszites-Typ, die sukzessiv unter Verwendung von Donryu-Ratten gezüchtet worden waren, wurden einmal wöchentlich und insgesamt viermal in die Magenhöhle einer Donryu-Ratte transplantiert. Sieben 20 Tage nach der vierten Transplantation wurde das Blut der anästhesierten Ratten unter Aufschneiden der Bauchhöhle aus der grossen Abdominalvene entnommen. Aus dem Blut wurde das den Antikörper enthaltende Antiserum gewonnen, und zwar in einer Menge von 70 ml aus insgesamt 100 25 Ratten. Die Herstellung des Antikörpers aus dem Antiserum und die Reinigung des Antikörpers wurden wie in Abschnitt 3-1. beschrieben durchgeführt, und zwar bis und mit der Absorption an Erythrozyten von Ratten.
4-2. Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschro-3Q matografie (1):
Zu 30 g gefriergetrockneten Zellen von Yoshida-Sarcoma, die sukzessiv unter Verwendung von Donryu-Ratten gezüchtet worden waren, wurde eine wässrige, mit wässriger 5 mM Kaliumphosphat gepufferte Kaliumchloridlösung mit 35 pH 7,4 gegeben und das Antigen während 20 Std. extrahiert. Die Extraktflüssigkeit wurde 10 min bei 65'000 g zur Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert und diese dann nochmals 30 min bei 180'000 g durch Zentrifugieren gereinigt. Die Flüssigkeit wurde 72 Std. bei 4°C gegen destil-40 liertes Wasser dialysiert und die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt.
Die an dem so erhaltenen Antigen von Yoshida-Sarcoma durchgeführte Affinitätschromatografie war praktisch gleich wie für Sarcoma-180-Antigen in Abschnitt 1-3. von Beispiel 45 1 beschrieben.
4-3. Störungstest gegen Tumorzellen und Normalzellen: Die durch von Ratten gewonnenen Antikörper gegen Yoshida-Sarcoma auftretenden Störungen wurden wie in Beispiel 3 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI zusammengestellt.
TABELLE XI Zellmortalität
Verdünnungsgrad der Antikörper- Zellen 1 10 100 1000
lösung
Antikörper vor Reinigung Y + + + ++ — —
durch Affinitätschromato- Z — — — —
grafie (1)
Antikörper nach Reinigung Y + + + + + + ++ +
durch Affinitätschromato- Z — — — —
grafie (1)
Kontrolle Y —
(Eagle-MEM) Z --
Y=Yoshida-Sarcomazellen; Z=Rattenmilzzellen
13
655 010
Wie aus Tabelle XI zu erkennen, ist die Aktivität des Antikörpers gegen die Yoshida-Sarcomazellen als Folge der Affinitätschromatografie (1) wie in den vorangehenden Beispielen erheblich erhöht.
4-4. Bindung von aus Ratten gewonnenem Antikörper gegen Yoshida-Sarcoma an Antitumorsubstanzen: Der nach der Arbeitsweise gemäss Abschnitt 4-1. und 4-2. gewonnene Antikörper von Ratten gegen Yoshida-Sarcoma wurde nach der in Abschnitt 3-5. beschriebenen Methode jeweils an Chlorambucil gebunden, um pharmazeutische Mittel mit Amidobindung zwischen den beiden Komponenten zu gewinnen. Durch Anwendung derselben Methode wurde jeweils das entsprechende Produkt aus Melphalan, einem Melphalanderivat und einem Uramustinderivat durch Bindung zwischen dem Antikörper und den genannten Antitumorsubstanzen durch Amidobindung erhalten.
Alle auf diese Weise gewonnenen pharmazeutischen Mittel zeigten nahezu die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie die entsprechenden, nach der Arbeitsweise 3-5. erhaltenen Mittel.
Wirkungsprüfung (B)
Antitumorwirkung gegen Yoshida-Sarcoma:
Zellen von Yoshida-Sarcoma, die sukzessiv unter Verwendung von Donryu-Ratten gezüchtet worden waren, wurden in die Magenhöhlen aller 10 Ratten in jeder Gruppe von Donryu-Ratten in einer Dosierung von 1 x 106 Zellen pro Tier transplantiert. 24 Std. nach der Transplantation wurde jeweils einer der folgenden Wirkstoffe intraperitoneal jeder Ratte der Gruppen einmal jeden zweiten Tag und insgesamt zehnmal injiziert. Nach Beobachtung der Mortalität der Ratten wurde das Mass der mit dem jeweiligen Wirkstoff erzielten Lebensverlängerung durch Berechnung festgestellt. Der entsprechende Wert wurde dadurch berechnet, dass die durchschnittliche Zahl der Überlebenstage der behandelten Ratten in einer Gruppe (T) durch den durchschnittlichen Wert der Überlebenstage der Kontrollgruppe (C) geteilt und das Resultat mit 100 multipliziert wurde, d.h. 100 x T/C. Die Ergebnisse der oben erwähnten Tests sind in den Tabellen XII bis XVI zusammengestellt, und zwar für Chlorambucil bzw. Chlorambucil plus Antikörper (Tabelle XII), Melphalan bzw. Melphalan und Antikörper (Tabelle XIII), Uramustinderivat bzw. Uramustinderivat und Antikörper (Tabelle XIV), Melphalanderivat bzw. Melphalanderivat und Antikörper (Tabelle XV) sowie für die Antikörper selbst (Tabelle XVI). In den Tabellen bedeuten:
KA = Antikörper von Kaninchen; RA = Antikörper von Ratten.
(Aj) = Reinigung durch Affinitätschromatografie, Methode
(i);
(A3) = Reinigung durch Affinitätsfallung, Methode (3).
TABELLE XII
Testagens
Dosis (mg/kg)
Lebensverlän
Agens
CB
gerung (%)
Chlorambucil (=CB)
1,0
1,0
259
Wirkstoff KA
10,0
0,1
230
aus CB KA (A3)
10,0
0,1
238
und KA (Aj)
10,0
0,1
240
RA
10,0
0,1
235
RA(Aj)
10,0
0,1
245
TABELLE XIII
Testagens
Dosis (mg/kg)
Lebensverlän
Agens
ML
gerung (%)
Melphalan (
= ML)
1,5
1,5
230
Wirkstoff
KA
15,0
0,15
230
aus ML
KA(A3)
15,0
0,15
237
und
KA(A,)
15,0
0,15
240
RA
15,0
0,15
230
RA (Aj)
15,0
0,15
245
TABELLE XIV
Testagens
Dosis (mg/kg)
Lebensverlän
Agens
Uramustin gerung (%)
Uramustinderivat
(=URD)
5
5
290
Wirkstoff
KA
50
0,5
260
aus URD
KA (A3)
50
0,5
264
und
KA (Ai)
50
0,5
265
RA
50
0,5
270
RA (Aj)
50
0,5
285
TABELLE XV
Testagens
Dosis (mg/kg)
Lebensverlän
Agens
ML
gerung (%)
Melphalanderivat
(MLD)
1,5
1,5
230
Wirkstoff
KA
15,0
0,24
260
aus MLD
KA(A3)
15,0
0,24
278
und
KA (Aj)
15,0
0,24
280
RA
15,0
0,24
270
i
RA (Aj)
15,0
0,24
290
TABELLE XVI
. Antikörper von
Dosis (mg/kg)
Lebensverlän
gerung (%)
Kaninchen
5
100
*
5
105
Kaninchen
20
105
)
*
20
105
Ratte
5
110
*
5
120
Ratte
20
120
*
20
120
55
* gereinigt durch Affinitätsreinigungsmethode (1) oder (3)
Aus den Tabellen XII bis XV ist zu ersehen, dass die Le-60 bensverlängerungsrate der Wirkstoffe bei Ratten praktisch dieselbe ist wie die von kommerziellen Antitumorsubstanzen bei Verabreichung in Dosen von fünf- bis zehnmal derjenigen von kommerziellen Antitumorsubstanzen, was der Erwartung entspricht und zeigt, dass die Tumorinhibierungs-65 aktivität des Antikörpers bei dem Grad der Dosierung (siehe Tabelle XVI) nicht festzustellen war. Die charakteristischen Eigenschaften der Wirkstoffe ergeben sich klar, wenn die Verabreichungsmenge der kommerziellen Antitumorsub-
655 010
stanz als Komponente des Wirkstoffes verglichen wird mit der Verabreichungsmenge einer derartigen Antitumorsubstanz selbst als Testagens. Obwohl die erstere nur Vi o oder V20 der letzteren beträgt, ergibt die erstere jedoch praktisch dieselbe Lebensverlängerung wie die letztere. Dies ist das Ergebnis der effektiven Translokation der kommerziellen Antitumorsubstanz zur Tumorstelle durch den Antikörper, welcher die andere effektive Komponente des erfindungsgemässen Wirkstoffes ist und diese Tatsache entspricht der Verwirklichung der der Erfindung zugrundeliegenden Vorstellung.
Erfindungsgemässe Wirkstoffe zeigen wegen der oben erwähnten Funktion den gleichen Grad von Tumorinhibie-rungswirkung, obwohl die Verwendung der üblichen kommerziellen Antitumorsubstanz auf Vio bis V20 vermindert worden ist, wobei die Nebenwirkungen der üblichen kommerziellen Antitumorsubstanzen ausserordentlich stark sind.
Ausserdem ist besonders zu bemerken, dass das Auftreten von anaphylaktischem Schock, wie er bei Verabreichung eines Wirkstoffes festzustellen ist, welches aus Antikörper von Kaninchen, Reinigung in üblicher Weise und Bindung an kommerzielle Antitumorsubstanz erhalten ist, sehr stark vermindert wird, wenn der Antikörper erfindungsgemäss praktisch rein ausweislich Affinitätschromatografie ist. Eine derartige Verminderung des Auftretens von anaphylaktischem Schock wurde bereits im Fall des Antikörpers gegen Sarcoma-180 gemäss Wirkungsprüfung (A) festgestellt und der vorteilhafte Effekt der Affinitätsfällung oder -chromato-grafie wurde auch im Fall von Antikörper zu Yoshida-Sarcoma festgestellt. Bei Herstellung des Antikörpers unter Verwendung von Mäusen und Reinigung durch Affinitätschromatografie führte die Verabreichung des erfindungsgemässen Wirkstoffes mit diesem Antikörper bei Ratten nicht zu anaphylaktischem Schock.
Beispiel 5
5-1. Herstellung und Reinigung eines Antikörpers gegen Tumorzellen:
Einem männlichen Patienten mit einem Alter von 50 Jahren, der an Rectalkrebs litt, wurden 50 ml Blut abgenommen und aus diesem 20 ml eines Antiserums gewonnen, das einen Antikörper enthielt.
5-2. Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatografie (1):
Der dem obigen Patienten bei Operation entnommene gefriergetrocknete Tumor wurde zur Extraktion des Anti-
14
gens 20 Std. mit 50 ml 3 m Kaliumchloridlösung behandelt, die mit einer 5 mM Kaliumphosphatpufferlösung auf pH 7,4 gepuffert worden war. Nach dem Zentrifugieren der Extraktflüssigkeit während 10 min bei 65'000 g wurde die über-5 stehende Flüssigkeit gesammelt und 72 Std. bei 4 °C gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt wurde. Die Affinitätschromatografie des so erhaltenen Antigens zum Tumor des Patienten wurde im wesentlichen in gleicher Weise durchgeführt wie in Ab-10 schnitt 1-3. von Beispiel 1, wobei lediglich die Lösung des Antiserums, welche den gemäss Abschnitt 5-1. vom Patienten gewonnenen Antikörper enthielt, anstelle des von einer Maus gewonnenen Antikörpers verwendet wurde.
Der so erhaltene Antikörper war ebenfalls in Wasser lös-
15 lieh, jedoch in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Aceton und Benzol, unlöslich und zeigte das in den Fig. 2 bzw. 3 dargestellte IR- bzw. UV-Absorptionsspek-trum. Der Antikörper hatte ein Molekulargewicht von 150'00 und zeigte bei Scheibenelektrophorese einen Rf-Wert
20 von 0 bis 0,1.
Beispiel 6
6-1. Herstellung und Reinigung eines Antikörpers durch 25 Affmitätsfällung (3):
Zellen von Aszites-Typ P-388-Tumor, die sukzessiv unter Verwendung von DBA/2-Mäusen gezüchtet worden waren, wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, mit 50 Mikrogramm/ml Mitómycin C versetzt und nach 30 min 30 Inkubieren der Mischung bei 37 °C von der überstehenden Flüssigkeit abzentrifugiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit wässriger physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.
Die Beimpfung von Kaninchen mit den auf diese Weise ihrer Wucherungsaktivität beraubten P-388 Tumorzellen so-35 wie die anschliessenden Schritte zur Gewinnung der wässrigen Lösung des von Kaninchen gewonnenen Antikörpers gegen P-388 Tumor waren im wesentlichen gleich wie in Abschnitt 1-1. von Beispiel 1.
40 6-2. Cytotoxizitätstest gegen Tumorzellen und normale Zellen:
Die Cytotoxizität des so erhaltenen Antikörpers für Zellen wurde in Gegenwart eines Komplements (Meerschweinchenserum) durch die in Abschnitt 1-2. von Beispiel 1 be-45 schriebene Methode untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XVII zusammengestellt.
TABELLE XVII Zellmortalität
Verdünnungsgrad der Antikörperlösung
Zellen
1
10
100
1000
Antikörperlösung vor Reini- TZ
gung durch Affinitätsfällung (3) MZ
Antikörperlösung nach Reini- TZ
gung durch Affinitätsfällung (3) MZ
Kontrolle TZ
(Eagle-MEM) MZ
+ + + + + + + + +
+ + + + + + +
+ + +
TZ=P-388-Tumorzellen; MZ=Rattenmilzzellen
15
655 010
Ausserdem wurden die Milzzellen von DBA/2-Mäusen als typisch für Normalzellen in gleicher Weise wie in Abschnitt 1-2. von Beispiel 1 behandelt.
6-3. Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatografie (1):
Der aus Mäusen gewonnene Antikörper zu P-388 Tumor wurde mit einer Kolonne und einem Träger gereinigt, an welchen ein P-388 Tumorantigen gebunden worden war. Die Arbeitsweise war dabei analog wie in Abschnitt 1-3. von Beispiel 1 mit der Abänderung, dass die sukzessiv unter Verwendung von DBA/2-Mäusen gezüchteten P-388 Tumorzellen anstelle der entsprechenden Sarcoma-180 Zellen vom Aszites-Typ aus ICR-Mäusen verwendet wurden.
s 6-4. Cytotoxizitätstest gegen Tumorzellen und normale Zellen:
Die Cytotoxizität, welche durch den von Kaninchen gewonnenen Immunoantikörper zu P-388 Tumor bedingt ist, wurde wie in Abschnitt 6-2. beschrieben untersucht. Die Erio gebnisse sind in der folgenden Tabelle XVIII zusammengestellt.
TABELLE XVIII Zellmortälität
Verdünnungsgrad der Antikörper- Zellen 1 10 100 1000
lösung
Antikörperlösung nach Reini- TZ + + + + + + ++ —
gung durch Affinitätsfällung (3) MZ + — — —
Antikörperlösung nach Reini- TZ + + + + + + ++ +
gung durch Affinitätsfallung (1) MZ — — — —
Kontrolle TZ -
(Eagle-MEM) MZ - -
TZ=P-388-Tumorzellen; MZ=Mäusemilzzellen
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität des Antikörpers gegen P-388-Tumorzellen erheblich erhöht war und dass die Toxizität des Antikörpers für Milzzellen durch die Reinigung mittels Affinitätsmethoden vermindert war, wie im Falle der oben erwähnten Antikörper, was wiederum die hervorragende Wirkung der Affinitätsmethode (1) zeigt.
6-5. Bindung des Anti-P-388-Tumor-Antikörpers an Anti-tumor-Antimetaboliten:
Die gemäss Abschnitt 6-1. und 6-3. hergestellten gereinigten Antikörper wurden mit folgenden Antitumorsubstanzen vom Antimetabolit-Typ umgesetzt: Cytarabin, Methotrexat und 5-Fluoruracil. Hierdurch wurden Verbindungen erhalten, die zwischen dem Antikörper und dem Antimeta-boliten eine Amidbindung besassen. Im folgenden werden Beispiele für das Erzielen dieser Bindung gegeben.
Synthese-Beispiel 6 Eine wässrige Lösung, die 10,0 mg des von Kaninchen gewonnenen gereinigten Anti-P-388-Tumorantikörpers pro ml enthielt, wurden 20,0 mg Cytarabin zugesetzt und dann 30 mg l-Ethyl-3-(3-diemethylaminopropyl)-carbodii-mid zugesetzt. Das Ganze wurde während der unten angegebenen Zeitspannen umgesetzt, worauf die Reaktion durch Zugabe von 2 ml einer wässrigen Essigsäure/Natriumacetat-Pufferlösung abgebrochen wurde. Die Reaktionsmischung wurde gegen 5 Liter destilliertes Wasser bei 4°C während 72 Std. dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt wurde. Nach dem Konzentrieren der Innenflüssigkeit wurde diese durch eine mit einem Dextranderivat («Se-phadex» G-25, Farmacia Japan Co., Ltd.) gefüllte Kolonne mit 1,5 cm Durchmesser und 55 cm Höhe zur Absorption der niedermolekularen Substanzen der Reaktionsmischung am Füllmaterial durch die Kolonne geführt und das abflies-sende Material bei —20°C zur Gewinnung der Zielsubstanz gefriergetrocknet. Die jeweils gebundene Menge Cytarabin 35 als Funktion der Reaktionsdauer entsprechend den jeweils einzeln durchgeführten Versuchen ist in der folgenden Tabelle XIX zusammengestellt.
TABELLE XIX
Reaktionsdauer (min) Cytarabin (ng/mg Antikörper)
10 4,8
« 30 8,2
60 11,0
Synthese-Beispiel 7 so In eine wässrige Lösung, die 10 mg des von Kaninchen gemäss Abschnitt 6-1. von Beispiel 6 erhaltenen und gereinigten Antikörpers gegen P-388 Tumor pro ml enthielt, wurden 6,0 mg Methotrexat zugegeben. Unter Einstellung des pH-Wertes der Lösung durch Zugabe von Salzsäure unter 55 Rühren auf 4,75 wurden 2,5 mg l-Ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid zugegeben, um die Umsetzung gemäss den im folgenden angegebenen Reaktionszeiten durchzuführen. Die Umsetzung wurde dann durch Zugabe von 2 ml einer wässrigen Essigsäure/Natrium-60 acetat-Pufferlösung abgebrochen. Die Reaktionsmischung wurde gegen 5 Liter destilliertes Wasser bei 4 °C während 72 Std. dialysiert, wobei die Aussenflüssigkeit alle 24 Std. gewechselt wurde.
Die dialysierte Innenflüssigkeit wurde wie in Synthese-65 Beispiel 6 zur Gewinnung des gewünschten pharmazeutischen Mittels behandelt. In der folgenden Tabelle XX ist die Menge des gebundenen Methotrexates als Funktion der Reaktionsdauer dargestellt.
655 010
16
TABELLE XX
Reaktionsdauer (min)
Methotrexat (ng/mg Antikörper)
10 30 90
3,6 6,5 15,0
Synthese-Beispiel 8 Bindung von 5-Fluoruracil an den Antikörper:
Der gemäss Abschnitt 6-1. von Beispiel 6 hergestellte und gereinigte, von Kaninchen gewonnene Antikörper gegen P-388 Tumor wurde mit 34,7 mg 5-Fluoruracil in analoger Weise wie in Synthesebeispiel 7 beschrieben umgesetzt. Das so erhaltene Produkt enthielt praktisch keine 5-Fluor-uracil-Anteile. Dann wurde nach Einführung einer Carboxylgruppe in das 5-Fluoruracil nach der im folgenden ange gebenen Arbeitsweise die Bindungsreaktion in gleicher Weise wie in Abschnitt 6-1. von Beispiel 6 durchgeführt. Das auf diese Weise durch Bindung erhaltene pharmazeutische Mittel enthielt pro mg Antikörper 10 Mikrogramm 5-Fluorura-s eil.
Das carboxylierte 5-Fluoruracil wurde in folgender Weise gewonnen:
10 ml Methanol, 500 mg 5-Fluoruracil und 86mg Kaliumhydroxid wurden mit 3 ml destilliertem Wasser ver-io mischt. Die so gebildete transparente Flüssigkeit wurde mit 145 mg Chloressigsäure auf einmal versetzt und die Mischung dann 60 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck konzentriert, der Rückstand aus i5 Ethanol und Chloroform umkristallisiert und ergab 495 mg (Ausbeute 49%) von weissen Kristallen, die durch IR-Spek-troskopie und Elementaranalyse als Verbindung der folgenden Formel identifiziert wurden:
• KCl (F 160-165 C, Zersetzung)
CH2—COOH
Elementaranalyse:
gefunden: C% 27,40 H% berechnet: C% 27,43 H%
2,00 1,91
N% N%
10,30 10,66
Synthese-Beispiel 9 Der gemäss Abschnitt 6-3. von Beispiel 6 aus Kaninchen gewonnene und gereinigte Antikörper gegen P-388 Tumor wurde jeweils mit einer der folgenden Verbindungen umgesetzt: Cytarabin, 8-Azaguanin, Methotrexat, Aminoputerin-natrium und 5-Fluoruracil-Derivat (siehe Synthese-Beispiel 8). Auf diese Weise wurden die entsprechenden Wirkstoffe erhalten, die den nach den Synthese-Beispielen 6-8 gewonnenen sehr ähnlich waren.
Beispiel 7
7-1. Herstellung und Reinigung eines Antikörpers zu Tu-morzellen:
Aszites-P-388-Tumorzellen, die sukzessiv unter Verwendung von DBA/2-Mäusen kultiviert worden waren und mit Hilfe von Mitómycin C ihrer Wucherungsaktivität beraubt worden waren, wurden zur intraperitonealen Impfung von DBA/2-Mäusen verwendet, und zwar durch einmalige Be-impfung pro Woche mit einer Dosis von 107 Zellen pro Versuchstier. 7 Tage nach der vierten Beimpfung wurde den anästhesierten Versuchstieren aus der aufgeschnittenen Bauchhöhle durch die grosse Abdominalvene das Blut entnommen und aus diesem Blut das den Antikörper enthaltende Antiserum hergestellt. Aus 100 Mäusen wurden insgesamt 53 ml Antiserum gewonnen. Herstellung und Reini-35 gung des Antikörpers aus dem Antiserum wurden wie in Abschnitt 6-1. von Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
7-2. Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatografie:
40 Die gefriergetrockneten Zellen von Aszites-P-388-Tumor wurden in gleicher Weise behandelt wie die Yoshida-Sarco-ma-Zellen in Abschnitt 3-3. von Beispiel 3, jedoch unter Weglassung des Aussalzens mit Ammoniumsulfat und der folgenden Zentrifugierung. Es wurde eine wässrige Lösung 4J des durch Affinitätschromatografie gereinigten Antikörpers gegen Aszites-P-388-Tumor erhalten.
7-3.
Störungstest mit Tumorzellen und normalen Zellen:
Die durch den gemäss Abschnitt 7-2. aus Mäusen erhal-so tenen Antikörper gegen Aszites-P-388-Tumor bewirkte Störung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XXI zusammengestellt.
TABELLE XXI Zellmortalität
Verdünnungsgrad der Antikörper- Zellen 1
lösung
10
100
1000
Antikörper vor Reinigung TZ
durch Affinitätschromatografie MZ
(1)
Antikörper nach Reinigung TZ durch Affinitätschromatografie MZ
(1)
Kontrolle TZ
(Eagle-MEM) MZ TZ=P-388-Tumorzellen; MZ=Mäusemilzzellen
+ + +
+ + +
+ +
+ + +
+ +
+
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655 010
Wie Aus Tabelle XXI zu erkennen, war die Aktivität des Antikörpers gegen P-388-Tumorzellen wie in den vorangehenden Beispielen durch die Affinitätschromatografie erheblich erhöht.
7-4. Bindung des von Mäusen gewonnenen Antikörpers gegen P-388-Tumor an Antitumorsubstanzen vom Typ der Antimetaboliten:
Der nach den Abschnitten 7-1. und 7-2. gemäss Beispiel 7 aus Mäusen gewonnene Antikörper gegen P-388-Tumor wurde jeweils an einen der folgenden Antimetaboliten gebunden: Cytarabin, Methotrexat, Aminopterin-natrium, 8-Azaguanin und 5-Fluoruracil. Die Bindungsreaktion wurde wie in Abschnitt 6-5. von Beispiel 6 durchgeführt und es wurden Wirkstoffe erhalten, in welchen der Antikörper durch Amidobindung an den Antimetaboliten gebunden ist. Diese Wirkstoffe zeigten nahezu die gleichen psysikochemi-schen Eigenschaften wie die nach Abschnitt 6-5. von Beispiel 6 erhaltenen entsprechenden Wirkstoffe.
Wirkungsprüfung (C)
Antitumorwirkung von Wirkstoffen gegen P-388-Tumor:
Die durch sukzessive Züchtung unter Verwendung von DBA/2-Mäusen gewonnenen Zellen von P-388 Tumor wurden in die Magenhöhle von DBA/2-Mäusen (jeweils 10 Mäuse pro Gruppe) in einer Dosierung von 1x10® Zellen pro Tier transplantiert. 24 Std. nach dem Transplantieren wurde eine wässrige Lösung eines der im folgenden angegebenen Antitumormittel intraperitoneal verabreicht, und zwar einmal täglich während 5 aufeinanderfolgender Tage, d.h. insgesamt fünfmal. Nach Beobachtung der Mortalität der Mäuse wurde der durchschnittliche Wert der Überlebensdauer in Tagen der behandelten Tiere (T) und derjenige der Kontrollgruppe (transplantiert, jedoch ohne Verabreichung des Wirkstoffes) (C) ermittelt und daraus die Lebensverlängerungsrate (100 x T/C) berechnet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen XXII bis XXVI zusammengestellt, wobei die Tabelle XXVI die Ergebnisse der Verabreichung des Antikörpers allein darstellt. Die in dieser Prüfung verwendeten Substanzen sind die folgenden:
(1) Antimetabolitische Antitumorsubstanzen: Cytarabin, Methotrexat, Aminopterin-natrium und 5-Fluoruracil;
(2) Wirkstoff aus von Kaninchen gewonnenem Antikörper, ohne Reinigung durch Affinitätsmethoden und einer der oben genannten antimetabolitischen Antitumorsubstanzen,
(3) Wirkstoff aus dem von Kaninchen gewonnenen Antikörper, gereinigt durch Affinitätschromatografie (1), und einer der oben genannten antimetabolistischen Antitumorsubstanzen,
(4) Wirkstoff aus dem von Mäusen gewonnenen, nicht durch Affinitätschromatografie gereinigten Antikörper und einer der oben genannten antimetabolitischen Antitumorsubstanzen, und
(5) Wirkstoff aus dem von Mäusen gewonnenen, durch Affinitätschromatografie (1) gereinigten Antikörper und einer der oben genannten antimetabolitischen Antitumorsubstanzen.
In den Tabellen bedeutet:
KA = den von Kaninchen gewonnenen Antikörper, MA = den von Mäusen gewonnenen Antikörper, (Ai) = Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatografie (1).
TABELLE XXII
Testagens
Dosis (mg/kg)
Lebensverlän
Agens
CT
gerung (%)
Cytarabin (
= CT)
20
20
220
Wirkstoff
KA
200
2
200
aus CT
KA(A,)
200
2
210
und:
MA
200
2
210
MA (Aj)
200
2
215
TABELLE XXIII
Testagens
Dosis (mg/kg)
Lebensverlän
Agens
MT
gerung (%)
Methotrexat (=MT)
3
3
250
i Wirkstoff
KA
30
0,3
190
aus MT
KA (Aj)
30
0,3
210
und:
MA
30
0,3
230
MA (Aj)
30
0,3
240
25
TABELLE XXIV
Testagens Dosis (mg/kg) Lebensverlän-
30 Agens APN gerung (%)
Aminopterin-natrium
(=APN)
3
3
270
Wirkstoff
KA
30
0,3
240
35 aus APN
KA (Aj)
30
0,3
245
und:
MA
30
0,3
250
MA (A!)
30
0,3
260
40
TABELLE XXV
Testagens Dosis (mg/kg) Lebensverlän-
Agens FCD gerung (%)
45
5-Fluoruracil-Derivat
(=FCD)
50
50
185
Wirkstoff
KA
500
5
160
aus FCD
KA (Aj)
500
5
170
so und:
MA
500
5
165
MA (Aj)
500
5
180
55
TABELLE XXVI
Antikörper Dosis (mg/kg) Lebensverlän gerung (%)
60
KA(At)
5
100
5
105
KA (AJ
20
105
20
105
65 MA (A,)
5
110
5
120
MA (A,)
20
120
20
120
655 010
Das charakteristische Merkmal erfindungsgemässer Wirkstoffe zeigt sich zunächst, wenn die Verabreichungsmenge der kommerziellen Antitumorsubstanz selbst mit der Verabreichungsmenge derselben Antitumorsubstanz als Komponente des Wirkstoffes verglichen wird. Trotz der Tatsache, dass die letztere nur Vio bis V20 der ersten beträgt, ist die mit dem Wirkstoff erzielte Lebens verlängerungsrate nahezu gleich wie die mit der Antitumorsubstanz erzielte Rate. Diese Tatsache ist eine Folge des Phänomens, dass der Antikörper die kommerzielle Antitumorsubstanz mit vorteilhafter Wirkung an die Tumorstelle im Tierkörper überträgt und stellt eine hervorragende Verwirklichung der erfindungsgemässen Idee dar. Der Wirkstoff zeigt aufgrund der oben beschriebenen Funktion eine Antitumoraktivität gleichen Grades wie die kommerzielle Antitumorsubstanz, die starke Nebenwirkungen auslöst, wobei gleichzeitig die Verwendung der kommerziellen Antitumorsubstanz auf Vio bis V20 vermindert wird. Ausserdem ist besonders daraufhinzuweisen, dass dann, wenn der unter Verwendung von Kaninchen her18
gestellte Antikörper an jede der kommerziellen Antitumorsubstanzen gebunden und an Mäuse verabreicht wird, bei etwa drei von zehn Mäusen anaphylaktischer Schock, wie allgemeine Krampferscheinungen und Versteifungen, festzu-5 stellen ist. Wenn jedoch der Wirkstoff, der durch Binden derselben Antitumorsubstanz an die unter Verwendung von Kaninchen hergestellten und durch Affinitätschromatografie gereinigten Antikörper hergestellt ist, verwendet wird, treten praktisch keine derartigen anaphylaktischen Schockerschei-10 nungen auf. Die durch Binden des unter Verwendung von Mäusen hergestellten und durch Affinitätsmethoden gereinigten Antikörpers an die gleiche kommerzielle Antitumorsubstanz zeigte niemals irgendwelche anaphylaktischen Schockwirkungen. Diese Befunde wurden bereits in den obi-15 gen Wirkungsprüfungen (A) und (B) festgestellt und auch hier ist Grund für die vorteilhafte Erscheinung die Wirksamkeit der Affinitätsmethoden für die Entfernung des Grundes für derartige anaphylaktische Schockwirkungen.
25
30
35
40
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50
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60
65
s
4 Blatt Zeichnungen

Claims (16)

655 010
1. Pharmazeutischer Wirkstoff mit Antitumoraktivität, dadurch gekennzeichnet, dass er als Molekülbestandteile
(a) eine von einer Antitumorsubstanz hergeleitete Gruppe, wobei die Antitumorsubstanz im freien Zustand mindestens eine Amino- oder Carboxylgruppe oder eine Gruppe der Formeln-(CH2)„COOH oder-OC(CH2)nNH2 aufweist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet, und
(b) eine von einem Antitumor-Antikörper hergeleitete Gruppe enthält, wobei die beiden Gruppen durch mindestens eine Amidbindung verbunden sind, und der Wirkstoff weder Pyrexie noch Anaphylaxie erzeugt.
2. Wirkstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die von einem Antitumor-Antikörper hergeleitete Gruppe eine solche ist, die von Immunoglobulin G-Fraktio-nen hergeleitet ist.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Wirkstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die von einem Antitumor-Antikörper hergeleitete Gruppe eine solche ist, die von einem Antitumor-Allo-antikörper hergeleitet ist.
4. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die von einer Antitumorsubstanz hergeleitete Gruppe von einer antibiotischen Substanz, einer an-timetabolitischen Substanz oder einem Alkylierungsmittel hergeleitet ist.
5 nitätschromatografie oder Affinitätsfallung gereinigter Anti-tumor-Alloantikörper verwendet wird.
5. Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffes nach Anspruch 1, wobei die Antitumorsubstanz durch Amidbindung an den Antitumor-Antikörper gebunden wird, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Antitumor-Antikörper durch Affinitätschromatografie oder Affinitätsfällung reinigt und den erhaltenen gereinigten Antitumor-Antikörper, der zur Bildung von Amidgruppen befähigte Substituenten aufweist, durch Amidbindung an eine Antitumorsubstanz bindet, die mindestens eine Amino- oder Carboxylgruppe aufweist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Antitumor-Antikörper wirksame Immunoglobulin G-Fraktionen mittels Affinitätschromatografie oder Affinitätsfällung reinigt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man einen als Antitumor-Antikörper wirksamen Alloantikörper durch Affinitätschromatografie oder Affinitätsfallung reinigt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Antitumorsubstanz eine antibiotische Substanz, eine antimetabolitische Substanz oder ein Alkylierungsmittel verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Affinitätschromatografie oder Affinitätsfällung ein Träger verwendet wird, an welchen die Moleküle eines Tumorantigens des Antitumor-Antikörpers gebunden sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in eine Kolonne gepackt ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffes nach Anspruch 1, wobei die Antitumorsubstanz über eine Amidbindung an den Antitumor-Antikörper gebunden wird, dadurch gekennzeichnet, dass man die Antitumorsubstanz, die mindestens eine Amino- oder Carboxylgruppe aufweist, mit einer Verbindung der Formel X(CH2)„COOH bzw. NH2(CH2)nCOX oder einem entsprechenden Säureadditionssalz umsetzt, wobei X das Chlor- oder Bromatom und n eine Zahl von 1 bis 3 ist, und das erhaltene Produkt mit einem durch Affinitätschromatografie oder Affinitätsfällung gereinigten Antitumor-Antikörper, der zur Bildung von Amidgruppen befähigte Substituenten aufweist, umsetzt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Antitumor-Antikörper mittels Affinitätschromatografie oder Affinitätsfallung gereinigte Immunoglobulin G-Fraktionen verwendet werden.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Antitumor-Antikörper ein durch Affi-
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Antitumorsubstanz eine antibiotische Substanz, eine antimetabolitische Substanz oder io ein Alkylierungsmittel verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Affinitätschromatografie oder Affinitätsfallung ein Träger verwendet wird, an welchen die Moleküle eines Tumorantigens des Antitumor-
is Antikörpers gebunden sind.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in eine Kolonne gepackt ist.
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