DE2931082C2

DE2931082C2 -

Info

Publication number: DE2931082C2
Application number: DE2931082A
Authority: DE
Inventors: David Huw Gawsworth Macclesfield Cheshire Gb Davies; Geoffrey Lightfoot Floyd Brereton Sandbach Cheshire Gb Norris
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mallinckrodt Veterinary Inc
Priority date: 1978-08-03
Filing date: 1979-07-31
Publication date: 1989-12-21
Also published as: US4279894A; PL130950B1; AU4919479A; FI792420A; FI66184C; CS221514B2; JPS5551097A; IL57919A; FR2433578B1; DE2954593C2; DK325179A; DE2931082A1; DK151257B; CH649780A5; AT367450B; JPS6254307B2; AT366892B; SE7906553L; IE791403L; IT1162363B

Description

Die Erfindung betrifft einen Metaboliten, M.139603, der durch aerobe Kultivierung von Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 erhalten werden kann, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung (vgl. die Patentansprüche).

Bei dem Metaboliten M.139603 handelt es sich um eine neue Verbindung der Formel C₃₅H₅₃O₈Na. M.139603 ist ein Natriumsalz. Die Erfindung betrifft jedoch auch die daraus erhältliche entsprechende freie Säure sowie die wiederum aus dieser leicht erhältlichen anderen Alkalimetallsalze.

Die Verbindungen sind dazu in der Lage, den Anteil an Methan, der bei der Fermentation im Rumen erzeugt wird, zu verringern und den Anteil an Propionsäure in der Rinderrumenflüssigkeit zu steigern, weshalb sie wachstumsfördernde Eigenschaften bei Wiederkäuern besitzen dürften, da es allgemein bekannt ist, daß andere chemische Verbindungen, welche den Anteil an Propionsäure in der Rumenflüssigkeit erhöhen, eine erhöhte Wachstumsgeschwindigkeit ergeben, wenn sie an Rinder oder Schafe verabreicht werden. Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen außerdem eine antibakterielle Aktivität gegenüber grampositiven Organismen. Schließlich besitzen sie auch bei einem in vitro-Test eine Anticoccidienaktivität gegen Eimeria tenella.

Gegenstand der Erfindung sind also die Verbindung M.139603, welche die folgenden Charakteristiken aufweist:

a) Molekularformel C₃₅H₅₃O₈Na, gemessen durch Massenspektrometrie, welche ein Molekularion, M⁺, mit der Masse 624,361 zeigt (berechnet für C₃₅H₅₃O₈Na=624,364), und durch Elementaranalyse: C=67,5, H=8,8% (berechnet für C₃₅H₅₃O₈Na-C=67,3, H=8,5 %);
b) Infrarotspektrum im Nujol-Mull, wie in Fig. 1 gezeigt, mit charakteristischen Absorptionen bei 3300, 1725, 1645, 1565 und 915 cm^-1;
c) magnetisches Protonenresonanzspektrum in Deuterochloroform wie in Fig. 2 gezeigt;
d) Ultraviolettspektrum in Methanollösung mit einer charakteristischen Absorption bei 234 nm (ε=12 900) und 272 nm (ε=10 800);
e) Schmelzpunkt 176-178°C;
f) (c = 0,2 in Methanol);

und die entsprechende "freie Säureform" dieser Verbindung mit der Molekularformel C₃₅H₅₄O₈, die gekennzeichnet ist durch R_F=0,55 (annähernd) bei Dünnschichtchromatografie auf Silicagel (Merck "Kieselgel 60F-254" - Warenzeichen), Dicke 0,25 mm, entwickelt mit einem Gemisch aus Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Vol.-Verhältnis 95 : 4 : 1; UV in Ethanol 274 nm (ε=13 900), breit; sowie die anderen davon ableitbaren Alkalimetallsalze.

Gemäß nachträglichen Untersuchungen der Anmelderin soll die Verbindung M.139603 die folgende Formel besitzen:

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Verbindung M.139603 besteht darin, daß man Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält, unter Schütteln und unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 22 und 32°C kultiviert; das erhaltene Fermentationsgemisch, das die Verbindung M 139603 enthält, wird zur Gewinnung der Verbindung M. 139603 mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel auf herkömmliche Weise extrahiert; durch Eindampfen des Lösungsmittels wird die Verbindung in reiner Form gewonnen; die auf diese Weise gewonnene Verbindung kann man auf herkömmliche Weise in die freie Säure überführen, die ggf. in ein anderes Alkalimetallsalz überführt werden kann.

Der die Verbindung M. 139603 bildende Stamm von S. longisporo flavus mit der Hinterlegungsbezeichnung NCIB 11426 ist ohne Beschränkung von der National Collection of Industrial Bacteria, Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Scotland, erhältlich und weist die folgende Beschreibung auf:

[Die verwendeten Medien wurden gemäß den Rezepten für das "International Streptomyces Project" (ISP) hergestellt und sind von Shirling E. G. & Gottlieb D. (International Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313-340, 1966) beschrieben].

Bedingungen für die Inkubation - ca. 25°C - Tageslicht ISP1 Trypton-Hefe (aber mit zugesetztem Agar)

5 Tage
- Dünn, etwas feucht, samtig, bräunlich.
- Unterseite ungefärbt.
13 Tage
- Dünn, samtig, etwas körnig, bräunlich.
- Unterseite ungefärbt.

ISP2 Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar

5 Tage
- Dünn, samtig, hellgrau.
- Unterseite sehr blaß, gelbbraun.
13 Tage
- Sauber, erhaben und gerunzelt, samtig, hellgelb/ braun/grau.
- Unterseite rehbraun.

ISP3 Hafermehl-Agar

5 Tage
- Spärlich bis dünn, samtig, hellgelb/grau.
- Unterseite nicht sichtbar.
13 Tage
- Dünn, etwas erhaben, samtig, hellgrau.
- Unterseite nicht sichtbar.

ISP4 Anorganische Salze/Stärke-Agar

5 Tage
- Dünn, bräunlich, etwas körnig.
- Unterseite ungefärbt.
13 Tage
- Dünn, etwas feucht, rehbraun.
- Unterseite mehr oder weniger ungefärbt.

ISP5 Glycerin/Asparagin-Agar

5 Tage
- Dünn, etwas körnig, bräunlich.
- Unterseite ungefärbt.
13 Tage
- Dünn, samtig, hellgrau.
- Unterseite ungefärbt.

ISP7 Tyrosin-Agar

5 Tage
- Spärlich bis dünn, etwas körnig, samtig, bräunlich/grau.
- Unterseite ungefärbt.
13 Tage
- Dünn, samtig, etwas erhaben, rehbraun.
- Unterseite rehbraun/grau.

Bei ISP7 wird beim Altern die Kultur im allgemeinen rötlichbraun, zeigt aber einige Bereiche dunklerer Färbung zusammen mit stärkerer Sporulation.

ISP9 Kohlenstoffausbeutungs-Agar

Einstufung
15 Tage - Kein Kohlenstoff - sehr spärlich, submers
-
- Glucose - Dünn, sauber, samtig, rehbraun	+
- Arabinose - Spärlich	±
- Fructose - Dünn, samtig, rehbraun	+
- Inosit - Sehr spärlich	-
- Mannit - Dünn, samtig	+
- Raffinose - Sehr spärlich	-
- Rhamnose - Spärlich	±
- Xylose - Spärlich	±

Allgemein

Es werden keine Melanie gebildet. An der Unterseite werden keine Pigmente gebildet. Es werden keine löslichen Pigmente gebildet. Die Sporen werden in offenen und dichten Spiralen erzeugt, die oftmals von der Hauptachse durch ein gerades Stück getrennt sind, das Hyphen oder u. U. Sporenketten trägt. Die Sporen selbst sind durch das normale Mikroskop schwierig zu sehen, da sie sehr dicht miteinander verbunden sind. Die Sporenwandungen (E. M. auf 4% Uranylacetatpräparat) sind glatt.

Für die Extraktion von M.139603 aus dem als erstes Produkt gebildeten Fermentationsgemisch eignet sich beispielsweise Ethylacetat als mit Wasser unmischbares organisches Lösungsmittel.

Die dem Natriumsalz, M.139603, entsprechende "freie Säure" kann dadurch erhalten werden, daß man eine Lösung von M.139603 ansäuert und die saure Lösung mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Andere Alkalimetallsalze können dadurch erhalten werden, daß man eine Lösung der "freien Säure" mit einem entsprechenden Alkalimetallhydroxid, wie z. B. Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Caesiumhydroxid oder Rubidiumhydroxid, behandelt. Wenn Natriumhydroxid verwendet wird, dann wird M.139603 regeneriert, was demonstriert, daß durch diese Reaktionen keine strukturellen Änderungen entstehen.

Wie oben bereits festgestellt, besitzen die Verbindungen die Wirkung, daß sie den Anteil an Propionsäure in der Rumenflüssigkeit und insbesondere den Anteil an Propionsäure auf Kosten von Methan und/oder Essigsäure steigern. Dies ist bekanntermaßen ein nützlicher Effekt bei der Wiederkäuerernährung, da Propionsäure ein wesentlich wirksamerer Vorläufer für Glucose ist, aus welcher das Tier seine Energie und sein Wachstum bezieht, als dies bei Essigsäure der Fall ist. Der Teil der Tiernahrung, der in Methan überführt wird, geht ganz einfach durch die Bildung von Blähungen verloren. Somit ist also die Änderung des Rumenstoffwechsels, der durch die erfindungsgemäßen Verbindungen erreicht wird, ein äußerst nützlicher Effekt. Es ist anzunehmen, daß hierdurch die Wachstumsgeschwindigkeit und die Nahrungsausnutzung bei Wiederkäuern erhöht werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der Verbindung M.139603, der daraus erhaltenen freien Säure oder eines anderen daraus erzeugten Alkalimetallsalzes oder eines Fermentationsgemischs oder Extrakts zur Zucht von domestizierten Wiederkäuern. Die Verbindung M. 139603 bzw. die davon abgeleiteten genannten Verbindungen werden dabei den Tieren in reiner Form oder in Form des Fermentationsgemischs oder Extrakts oral verabreicht (vgl. in diesem Zusammenhang den Patentanspruch 3).

Diese Verabreichung erfolgt vorzugsweise auf dem Wege einer Ergänzung zu deren normaler Nahrung, d. h. also in Mischung mit einer gewöhnlichen festen Nahrung, in Nahrungswürfeln oder in Salzlecksteinen, als Lösung im Trinkwasser oder, bei jungen Tieren, wie z. B. Lämmern oder Kälbern, als Lösung in Vollmilch oder Magermilch. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden in die Nahrung, die Nahrungswürfel, die Salzlecksteine, das Trinkwasser, die Vollmilch oder die Magermilch in einem solchen Ausmaß einverleibt, daß jedes behandelte Tier 0,01 mg/kg Körpergewicht bis 30 mg/kg Körpergewicht je Tag, vorzugsweise 0,01 mg/kg bis 10 mg/kg je Tag, einer erfindungsgemäßen Verbindung erhält.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können alternativ oral an Tiere in Form von intraruminalen Pellets oder Pillen mit langsamer Wirkstoffabgabe verabreicht werden, so daß das Tier eine ähnliche Menge je Tag der erfindungsgemäßen Verbindung aufnimmt.

Die Tiere können die erfindungsgemäßen Verbindungen während praktisch ihrer ganzen Wachstumsperiode oder nur während eines Teils ihrer Wachstumsperiode erhalten, beispielsweise während einer frühen Periode und/oder während einer Periode vor dem Schlachten. Die Zunahme der Wachstumsgeschwindigkeit, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht wird, ermöglicht es, Tiere auf Fleisch zu züchten, so daß sie in einer kürzeren Wachstumszeit auf Marktgewicht oder Schlachtgewicht als normal gebracht werden können. Das Verfahren ermöglicht es jedoch auch, schwerere Tiere am Ende einer normalen Wachstumsperiode zu erzielen. Die verbesserte Nahrungsausnützung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht wird, ermöglicht es, daß die behandelten Tiere ein bestimmtes Gewicht erreichen, während sie weniger Nahrung als unbehandelte Tiere, die auf das gleiche Gewicht gezüchtet werden, verbrauchen. Bei optimalen Wachstumsförderungskonzentrationen wurden keinerlei Anzeichen irgendwelcher giftigen Wirkungen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen beobachtet.

Ein für die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen geeignetes flüssiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel ist beispielsweise Trinkwasser, Vollmilch oder Magermilch.

Ein geeignetes festes, verzehrbares, nicht-giftiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel ist beispielsweise eine herkömmliche nährwertmäßig ausgewogene Wiederkäuernahrung, wie z. B. ein typische Rinder- oder Schafsnahrung, die aus Getreideprodukten, wie z. B. Gerstenmehl, Maismehl oder Weizenschrot, Nüssen und Samenprodukten, wie z. B. Kuchen aus dekortierten gemahlenen Nüssen oder Baumwollsamen oder extrahierten Baumwollsamen, gemeinsam mit kleineren Mengen von beispielsweise Federmehl, Seetangmehl, Knochenmehl, Kreide, Salz, Harnstoff, Molassen, Vitaminen und Spurenmineralien bestehen. Es kann sich aber auch um ein inertes festes Verdünnungsmittel oder Trägermittel ohne Nährwert handeln, wie z. B. Kaolin, Talkum, Calciumcarbonat, Fuller'sche Erde, Attapulgitton, gemahlene Austernschalen oder gemahlener Kalkstein. Es kann sich auch um Stärke oder Lactose handeln.

Die Verabreichung kann in Form einer Ergänzungsnahrung zum direkten Verfüttern an Tiere erfolgen, in welchem Fall sie 5 ppm bis 3000 ppm der erfindungsgemäßen Verbindung in Mischung mit einer herkömmlichen Wiederkäuernahrung enthält. Sie kann auch in Form eines konzentrierten Vorgemischs für die Verdünnung mit einer herkömmlichen Wiederkäuernahrung erfolgen, um eine ergänzte Nahrung herzustellen, die sich für das direkte Verfüttern eignet. Ein solches Vorgemisch wird 0,3 bis 50% (G/G) der erfindungsgemäßen Verbindung in Mischung mit entweder einer herkömmlichen, nährwertmäßig ausgewogenen Wiederkäuernahrung oder einem festen inerten Verdünnungsmittel ohne Nährwert, wie z. B. gemahlener Kalkstein, oder Stärke oder Lactose enthalten.

In allen oben beschriebenen Zusammensetzungen kann die erfindungsgemäße Verbindung natürlich durch das erfindungsgemäße Fermentationsgemisch oder durch einen erfindungsgemäßen Extrakt, der eine äquivalente Menge M.139603 enthält, ersetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise serienmäßig mit dem Verdünnungsmittel oder Trägermittel in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Stufen verdünnt, um ein gleichmäßiges Mischen sicherzustellen.

Wie oben bereits festgestellt, besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Aktivität gegen Coccidien. Diese wird durch einen Gewebskulturtest bei Hühnernierenzellen, die mit Sporozoiten von Eimerita tenella beimpft werden, durch das Standardtestverfahren, das in Journal of Parasitology, Bd. 58, S. 664-668 (1972) beschrieben ist, demonstriert. Bei diesem Test verhindert M.139603 das Wachstum der Sporozoiten bei einer Konzentration von 0,001 ppm. Außerdem zeigt M. 139603 toxische Wirkungen bei den Gastzellen nur bei einer Konzentration von 0,33 ppm.

Die Verbindung M.139603 besitzt außerdem grampositive antibakterielle Eigenschaften. Beispielsweise konnte gezeigt werden, daß sie das Wachstum von Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Clostridium welchii und Corynebacterium acne bei einer Konzentration von 10 µg/ml verhindert, weshalb sie als Wachstumsförderer bei Nichtwiederkäuern, wie z. B. Geflügel und Schweinen, verwendet werden kann.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Der Streptomycesstamm NCIB 11426 wurde in einem 500 ml-Erlenmayerkolben auf Typton/Hefe-Agar gezüchtet, der folgendes enthielt:

Trypton - "Oxoid" L42 (Warenzeichen)
0,5% G/V
Hefeextrakt - "Oxoid" L21 (Warenzeichen)	0,3% G/V

und der vorher in einem Autoklaven während 20 min bei Normaldruck vorsterilisiert worden war. Der pH des Mediums betrug annähernd 7,0. Der Kolben wurde 120 h lang auf einem Rotationsschüttler bei 25°C geschüttelt.

Der Inhalt des Kolbens wurde dann dazu verwendet, weitere 10 ähnliche Kolben zu beimpfen, von denen jeder 200 ml des folgenden Mediums enthielt:

Glucosesirup
3,0% G/V
Calciumcarbonat	0,25% G/V
Natriumchlorid	0,5% G/V
Magnesiumsulfat-heptahydrat	0,05% G/V
Spurenelementekonzentrat	0,1% V/V
Bakteriologisches Pepton ("Oxoid" L37 - Warenzeichen)	0,1% G/V
Rinderextraktpulver ("Oxoid" L29, "Lab Lemco" - Warenzeichen)	0,5% G/V
Entsalztes Wasser auf	100

Der pH wurde auf 7,2 eingestellt, und das Medium wurde in einem Autoklaven während 20 min bei 120°C vorsterilisiert. Die beimpften Kolben wurden bei 25°C 120 h auf einem Rotationsschüttler geschüttelt, und der Inhalt der Kolben wurde dann zusammengeschüttet und durch sorgfältige Zugabe von 0,1 n Salzsäure auf pH 3 eingestellt. Das Medium wurde 2mal mit 600 ml Ethylacetat extrahiert, die Extrakte wurden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei ein öliger Rückstand (290 mg) erhalten wurde.

Der Ethylacetatextrakt wurde durch präparative Dünnschichtchromatografie auf zwei Silicaplatten (Merck "Kieselgel" 60F-254 - Warenzeichen, 20 × 20 cm, 2 mm dick) unter Verwendung von Ethylacetat als Eluiermittel gereinigt. Die Bande bei R_F=0,39 (annähernd) wurde von den Platten abgekratzt und mit Etyhlacetat extrahiert, worauf das Lösungsmittel abgedampft wurde, so daß 21 mg eines viskosen Gummis erhalten wurden. Dieser zeigte in vitro eine antibakterielle Aktivität gegen S. aureus. Diese aktive Fraktion wurde weiter durch präparative Dünnschichtchromatografie auf Silicagelplatten (Merck "Kieselgel" 60F-254, 20 × 20 cm, 0,25 mm dick) unter Verwendung eines Gemischs aus Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Vol.-Verhältnis von 95 : 4 : 1 gereinigt. Die Bande bei R_F=0,55 (annähernd) wurde von der Platte abgekratzt und mit Ethylacetat extrahiert, wobei nach Abdampfen des Lösungsmittels 9 mg eines viskosen Gummis zurückblieben. Der Gummi wurde in das Natriumsalz, M.139603, überführt, indem eine Chloroformlösung mit einer Lösung von 0,1 m Natriumhydroxid geschüttelt wurde. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei 8 mg M.139603 als weißer Feststoff erhalten wurden, Fp 129-132°C. Das Infrarotspektrum (Fig. 1) zeigte die folgenden Maxima: 3300, 1725, 1645, 1565 und 915 cm^-1. Elementaranalyse: Gefunden C=67,5, H=8,8%; berechnet für C₃₅H₅₃O₈Na C= 67,3, H=8,5. Massenspektrum: M⁺=624,361, berechnet für C₃₅H₅₃O₈ · Na=624,364. R_F=0,39 (Dünnschichtchromatografie auf Merck 60F-254-Platten mit einer Dicke von 0,25 mm, entwickelt mit Ethylacetat, sichtbar gemacht als brauner Fleck nach Bespritzen mit 3 n Schwefelsäure und Erhitzen auf 100°C. Das magnetische Protonenresonanzspektrum in Deuteriochloroform ist in Fig. 2 angegeben.

Beispiel 2

Das Vermögen von M.139603, die Bildung von Methan im Rumen von Wiederkäuern zu inhibieren und den Anteil des Propionats auf Kosten des Acetats (Ac/Pr) in den gebildeten flüchtigen Fettsäuren (VFA) zu erhöhen, wird wie folgt demonstriert:

Rumenflüssigkeit wird in der üblichen Weise von zwei Stieren gesammelt, die mit der gleichen Heu-und-Konzentrat-Nahrung gefüttert werden. Die Probenzeit wird so weit wie möglich standardisiert, und die Flüssigkeit von den beiden Tieren wird auf einer 50/50-Basis vereinigt. Große teilchenförmige Stoffe werden durch Filtrieren der gesammelten Flüssigkeit durch vier Schichten eines Muslin-Tuchs entfernt. Das Filtrat wird dann im Verhältnis von 1 Volumen Filtrat zu 3 Volumina künstlicher Rumenflüssigkeit verdünnt (hergestellt nach der Vorschrift von G. L. Bales et al., Journal of Diary Science, 1976, Bd. 59, S. 1850, wobei jedoch die Essigsäure weggelassen wird), und der pH des Gemischs wird mit gesättigter wäßriger Natriumcarbonatlösung auf 6,9-7,0 eingestellt. Proben von 50 ml dieses Gemischs werden in konische 100 ml-Kolben, die 0,5 g getrocknetes gemahlenes Heu enthalten, abgegeben, und jeder Kolben wird dazu verwendet, eine Testverbindung bei einer bestimmten Konzentration zu testen.

Die Testverbindung wird dem konischen Kolben als Lösung in Ethanol zugegeben, der Kolben wird mit Kohlendioxidgas gespült, mit einer Suba-Dichtung zugestöpselt und 15-16 h bei 39°C inkubiert. Nach 1 h wird eine Nadel mit einer engen Bohrung durch die Suba-Dichtung eingeführt, um den Gasdruck wegzunehmen, worauf die Nadel 30 min vor Beendigung der Inkubation herausgezogen wird. Die Fermentation wird dann abgebrochen, indem der Kolben in Eis gestellt wird, und nach einer Kühlzeit von 15 min wird das Gas über der Flüssigkeit durch Gaschromatografie auf Methan analysiert. Die Kolbeninhalte werden dann durch einen vorher getrockneten gesinterten Glastrichter filtriert. Drei Proben des Filtrats werden durch Gaschromatografie auf VFA analysiert, und durch Vergleich mit den vor der Inkubation bestimmten VFA-Werten netto die VFA (Acetat und Propionat), die während der Inkubation gebildet werden, bestimmt.

Es wurden die folgenden Resultate erhalten, ausgedrückt als % von Vergleichswerten, die erhalten werden, wenn keine Testverbindung verwendet wird. Monensin, ein bekannter Wachstumsförderer, der aufgrund eines Effekts auf den Rumen wirkt, ist als positiver Vergleich beigeschlossen.

Beispiel 3

Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426 wurde auf Schrägkulturen auf ISP-7-Agar (45 ml) 7 Tage lang bei 30°C gezüchtet. Drei Schrägkulturen wurden einzeln in drei Kolben mit 100 ml sterilem Wasser gekratzt, und die so erhaltenen Suspensionen wurden dazu verwendet, drei 2 l-Kolben zu beimpfen, von denen jeder 1 l des folgenden Mediums enthielt:

Glycerin
3,0% G/V
Bakteriologisches Pepton ("Oxoid" L37 - Warenzeichen)	2,0% G/V
KH₂PO₄	0,024% G/V
MgSO₄ · 7H₂O	0,02% G/V
Spurenelementekonzentrat	0,1% V/V
Kreide	0,1% G/V
Entsalztes Wasser, auf	1 l

welches in einem Autoklaven bei Normaldruck während ½ h vorsterilisiert worden war, wobei der pH annähernd 6,7 betrug.

Die drei 2 l-Kolben wurden 3 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 30°C geschüttelt. Die Inhalte der drei Kolben wurden dann vereinigt und dazu verwendet, einen Fermentator aus rostfreiem Stahl, der 30 l eines sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt, zu beimpfen:

Glycerin
3,0% G/V
Sojamehl BSP 70	1,0% G/V
Kreide	0,25% G/V
Cerelose	3,0% G/V
NaCl	0,5% G/V
MgSO₄ · 7 H₂O	0,05% G/V
Spurenelementekonzentrat	0,1% V/V
Destilliertes Wasser, auf	30 l

Der Inhalt des Fermentators wurde 70 h bei 30°C gerührt, wobei eine Turbine mit 4 flachen Schaufeln verwendet wurde, die mit 350 U/m lief. Dabei wurde mit einer Geschwindigkeit von 15 l/min belüftet. Dem Gemisch waren vor der Behandlung im Autoklaven 30 ml "Silcolapse" (Warenzeichen), ein Silicon- Antischäummittel, zugegeben worden. Der pH der Ernte war 7,9, und das erhaltene Fermentationsgemisch (22 l) wurde mit einem gleichen Volumen Ethylacetat gemischt und geschüttelt. Nach 30 min wurde das Gemisch in einer Zentrifuge getrennt, worauf der Ethylacetatextrakt (annähernd 18 l) über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert wurde. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 10,7 g eines öligen Rückstands erhalten wurden.

M.139603 wurde aus dem obigen Konzentrat durch das folgende Verfahren erhalten:

Der ölige Rückstand (10,7 g) wurde in dem geringsten Volumen Ethylacetat aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde auf die Oberseite einer Kolonne von neutralem Aluminiumoxid (Woelm N, 200 g, 18 cm × 4 cm), die mit Ethylacetat vorbereitet worden war, aufgegeben. Die Kolonne wurde zunächst mit Ethylacetat, dann mit einem 50 : 50-Volumengemisch aus Ethylacetat und Methanol und schließlich mit Methanol eluiert. Es wurden die folgenden Fraktionen gesammelt, nachdem die Lösungsmittelfront aus der Kolonne ausgetreten war:

Von den Fraktionen 7-11 konnte durch Dünnschichtchromatografie auf Silicagel und bei Entwicklung mit 20% V/V Aceton in Petrolether (Kp 60-80°C) gezeigt werden, daß sie M.139603 (R_F ∼ 0,22) enthielten, weshalb sie vereinigt und eingedampft wurden, wobei 840 mg eines viskosen Gummis entstanden, der weiter durch präparative Dünnschichtchromatografie auf Silica (Merck "Kieselgel 60F250" - Warenzeichen, 40 cm × 20 cm, 2 mm dick) unter Verwendung eines Gemischs aus 20% V/V Aceton und Petrolether (Kp 60-80°C) als Eluiermittel gereinigt wurde. Die im UV sichtbare Bande bei R_F ∼ 0,22 (annähernd) wurde von den beiden Platten abgekratzt und mit Ethylacetat extrahiert, und der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft, wobei 240 mg eines viskosen Gummis erhalten wurden, der bei Zusatz von Petrolether (Kp 60-80°C) kristallisierte. Das Material wurde aus Petrolether (Kp 60-80°C) umkristallisiert, wobei M.139603 in Form farbloser Kristalle erhalten wurde, die nach dem Abfiltrieren und Trocknen 210 mg wogen und einen Fp von 176-178°C aufwiesen. Das UV-Spektrum in Ethanol zeigte Absorptionen bei 234 nm (ε=12 900) und 272 nm (ε=10 800). Das IR-Spektrum und das magnetische Kernresonanzspektrum waren mit denjenigen des Produkts von Beispiel 1 identisch.

Beispiel 4

40 mg M.139603 wurden in einem Gemisch aus 10 ml Aceton und 2 ml Wasser aufgelöst, 1 ml 2 n Salzsäure wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 5 min heftig gerührt. 20 ml destilliertes Wasser wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 2mal in 10 ml Dichloromethan extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit 2 n Salzsäure und dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Dichlormethanschicht wurde dann konzentriert, wobei 33 mg eines viskosen Gummis, der M.139603 entsprechenden "freien Säure", erhalten wurden. Elementaranalyse: Gefunden C=69,5, H=9,1; berechnet für C₃₅H₅₄O₈ C=69,8, H=9,0; IR-Spektrum in Nujol-Mull, wie in Fig. 3 gezeigt, enthielt charakteristische Absorptionen bei 3500, 1765, 1685, 1650, 1575 cm^-1. Das magnetische Protonenresonanzspektrum in Deuteriochloroform ist in Fig. 4 gezeigt.

Beispiel 5

30 mg der M. 139603 entsprechenden "freien Säure" wurden in einem Gemisch aus 7 ml Tetrahydrofuran und 1 ml Wasser aufgelöst. 2 ml eines 2n-Alkalimetallhydroxids, XOH, wurden dem wäßrigen Tetrahydrofurangemisch zugegeben, das dann 10 min heftig gerührt wurde. 10 ml Wasser wurden zugesetzt, und die Lösung wurde 2mal in 15 ml Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt und eingedampft, wobei das dem Natriumsalz M.139603 entsprechende Alkalimetallsalz erhalten wurde.

Wenn X für Kalium stand, dann wurde das Kaliumsalz erzeugt, Fp 146-150°C, Molekularformel C₃₅H₅₃O₈ · K, ermittelt durch Massenspektrometrie, welche ein Molekularion, M⁺, mit einer Masse von 640,335 zeigt (berechnet für C₃₅H₅₃O₈ · K= 640,338), und durch Elementaranalyse: Gefunden C=65,7%, H=8,5; berechnet für C₃₅H₅₃O₈ · K C=65,6%, H=8,3%).

Wenn X für Rubidium steht, dann wird das Rubidiumsalz gebildet, Fp 95-120°C, Molekularformel C₃₅H₅₃O₈ · Rb, ermittelt durch Massenspektrometrie, welche ein Molekularion, M⁺, mit einer Masse von 686,279 (berechnet für C₃₅H₅₃O₈ · Rb= 686,286) zeigt.

Beispiel 6

Das Vermögen von M.139603, den Anteil an Propionat auf Kosten von Acetat in der Rumenflüssigkeit eines Schafs zu erhöhen, wurde wie folgt demonstriert:

23 Schafe wurden einzeln gehalten und mit der gleichen Nahrung von 1 kg getrockneten Graswürfeln je Tier und je Tag, aufgeteilt in zwei Portionen je Tag, gefüttert. Die Tiere wurden willkürlich wie folgt zusammengefaßt: 13 als negativer Vergleich, 5 als positiver Vergleich unter Verwendung von Monensin, einem bekannten Rumenmanipulator, und 5 für die Dosierung mit M.139603. Die behandelten Tiere erhielten Monensin oder M.139603 oral in einer Rate von 0,5 mg/kg an einem jeden von vier aufeinanderfolgenden Tagen. Proben der Rumenflüssigkeit wurden durch Magenkanülen 6 h nach der Behandlung am 4. Tag gesammelt. Die Rumenflüssigkeitsproben wurden dann gemäß der Vorschrift von Beispiel 2 auf Acetat und Propionat analysiert. Die erhaltenen Resultate sind wie folgt:

Das Ansprechen im Hinblick auf Acetat durch M.139603 ist bei p < 0,02 gegenüber dem positiven Vergleich, Monensin, bemerkenswert, und das Ansprechen im Hinblick auf Propionat durch M.130603 ist bei p < 0,001 gegenüber dem positiven Vergleich, Monensin, bemerkenswert.

Claims

1. Die Verbindung M.139603, welche die folgenden Charakteristiken aufweist:

a) Molekularformel C₃₅H₅₃O₈Na, gemessen durch Massenspektrometrie, welche ein Molekularion, M⁺, mit der Masse 624,361 zeigt (berechnet für C₃₅H₅₃O₈Na=624,364), und durch Elementaranalyse: C=67,5%, H=8,8%);
b) Infrarotspektrum in Nujol-Mull, wie in Fig. 1 gezeigt, mit charakteristischen Absorptionen bei 3300, 1725, 1645, 1565 und 915 cm^-1;
c) magnetisches Protonenresonanzspektrum in Deuterochloroform wie in Fig. 2 gezeigt;
d) Ultraviolettspektrum in Methanollösung mit einer charakteristischen Absorption bei 234 nm (ε=12 900) und 272 nm (ε=10 800);
e) Schmelzpunkt 176 bis 178°C;
f) (c = 0,2 in Methanol);

und die entsprechenden "freie Säureform" dieser Verbindung mit der Molekularformel C₃₅H₅₄O₈, die gekennzeichnet ist durch R_F=0,55 (annähernd) bei Dünschichtchromatografie auf Silicagel (Merck "Kieselgel 60F-254" - Warenzeichen), Dicke 0,25 mm, entwickelt mit einem Gemisch aus Diethylether, Methanol und Ameisensäure im Vol.-Verhältnis 95 : 4 : 1, UV in Ethanol 274 nm (ε = 13 900), breit; sowie die anderen davon ableitbaren Alkalimetallsalze, wobei die Fig. 1 und 2 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces longisporoflavus NCIB 11 426 in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält, unter Schütteln und unter aeroben Bedingungen bei einer Temperaturen zwischen 22 und 32°C kultiviert, das so erhaltene Fermentationsgemisch mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel durch herkömmliche Maßnahmen extrahiert und das Lösungsmittel eindampft, worauf man ggf. durch herkömmliche Maßnahmen das Natriumsalz in die freie Säure überführt und die freie Säure ggf. in ein anderes Alkalimetallsalz überführt.

3. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder eines im Verfahren nach Anspruch 2 erhältlichen Fermentationsgemisches oder nach Eindampfen des Lösungsmittels erhältlichen Extrakts zur Zucht von domestizierten Wiederkäuern.