DE2509653C2 - Gegen Kokzidien wirksame Substanz und deren Herstellung durch Kultur eines Streptomyces - Google Patents

Description

[a]₃ ² ₆°5 = + 167° ± 2° beträgt;

beträgt; daß sie im Ultravioletten keine charakteristische Absorption aufweist;

daß Ihr Infrarot-Spektrum die folgenden Absorptionsbanden aufweist:

3430, 3180, 2970, 2935, 2925, 2880, 2825, 2600, 2060, 1945, 1850, 1760, 1730, 1630, 1590, 1450, 1398, 1380, 1372, 1362, 1350, 1335, 1298, 1292, 1260, 1238, 1220, 1200, 1190, 1185, 1170, 1152, 1140, 1115, 1108, 1092, 1090, 1072, 1065, 1040, 1018, 1000, 985, 968, 940, 928, 912, 890, 870, 852, 828, 815, 792, 788, 775, 765, 748, 705, 655, 635, 610, 590, 570, 565, 550, 535, 500, 482, 420,378,350 cm-¹;

daß sie bei der aufsteigenden Dünnschlcht-Chromatographle über Siltciumdloxydgel unter Verwendung eines Äthylacetat-Cyclohexan-Wasser-Butanol-Gemlsches (50/50/25/5 In Volumina) als Lösungsmittel einen Rf-Wert von 0,5 und unter Verwendung eines Methylenchlorld-Methanol-Gemlsches (94/6 In Volumina) als Lösungsmittel einen Rf-Wert von 0,7 aufweist und daß Ihre Aktivität gegenüber Kokzldlen sich beim Küken In minimalen Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,04 Gew.-96 In der Nahrung zeigt.

2. Verfahren zur Herstellung der Substanz

31 559 RP und von dessen Salzen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces hygroscoplcus NRRL 5787 aerob züchtet, die Kulturbrühe bei einem sauren pH-Wert filtriert, den Filtrationskuchen mit Methanol oder Methylenchlorid extrahiert, aus der Extraktionslösung nach einer alkallschen Behandlung das Natriumsalz durch Auskrtstalllsatlon nach Konzentration unter vermindertem Druck Isoliert und das Natriumsalz durch übliche Methoden reinigt.

3. Verwendung der Substanz 31 559 RP In Form der freien Säure oder kombiniert In Form des Metallsalzes oder des Salzes einer Stickstoffbase gemäß Anspruch 1 In einer Menge von 0,0001 bis 99,9 Gew.-96 zusammen mit von Tieren verzehrbaren Substanzen als Zusammensetzung für tierische Nahrungsmlttel.

C 96 = 63,2 H 96 = 8,8 O % = 24,3 Na 96 = 2,9.

Sein Neutraläquivalent (ermittelt durch Bestimmung des Natriumsalzes In essigsaurem Milieu durch Perchlorsäure) betragt 836.

Gemäß seiner Elementaranalyse und seiner Protonen- und "C-NMR-Spektren entspricht das Natriumsalz von 31 559 RP wahrscheinlich der ungefähren Formel

Andererseits gestatten es die Protonen- und nC-NMR-Spektren, die Anwesenheit von vier Methoxygruppen In dem Molekül zu erfassen.

Das Natriumsalz von 31 559 RP Ist außerdem durch die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften gekennzeichnet:

Aussehen: weißes mikrokristallines Pulver.

Löslichkeit: [Aufzeichnung gemäß der Pharmacopee Francalse, IX. Ausgabe, 2. Teil, Seite 13 (1972)].

Praktisch unlöslich In Wasser.

Wenig löslich In Hexan.

Löslich In Methanol, Aceton, In Dimethylformamid und Äthylacetat.

Leicht löslich In Methylenchlorid und Chloroform.

Schmelzpunkt (bestimmt auf dem Kofler-Block): 220° C (Zersetzung).

Drehwert: (c = 1,050 Methanol)

[α]²,? = + 51,2° ± Γ
[a]It = + 101° ± 1,5°

1 ²⁰

J 365

+ 167° ±2°

Ultravlolett-Spektrum: (Bestimmung ausgehend von einer Lösung mit 0,950 mg/ml In Äthanol) Keine charakteristische Absorption bis zu 210 nm. Infrarot-Spektrum: (Bestimmung ausgehend von Preßlingen Im Gemisch mit KBr) Dieses Spektrum Ist In Flg. 1 dargestellt. In der an den Abszissen einerseits die Wellenlängen, ausgedrückt In Mikron (obere Skala) und andererseits die Wellenzahlen In cm"¹ (untere Skala) und an den Ordlnaten die optischen Dichten angegeben sind.

In Tabelle I sind für dieses Produkt die Infrarot-Hauptabsorptlonsbanden ausgedrückt in Wellenzahlen (cm"¹) angegeben.

Tabelle II Tabelle I

3430	F	1372	ep.	1090	ep.	775	ep
3180	F	1362	ep.	1072	F	765	ep.
2970	tF	1350	ep	1065	ep.	748	m
2935	F	1335	ep.	1040	F	705	m
2925	ep.	1298	ep.	1018	F	655	ep.
2880	F	1292	m	1000	ep.	635	m
2825	m	1260	ep.	985	F	610	f
2600	ep.	1238	F	968	tF	59υ	tf
2060	tf	1220	ep.	940	F	570	ep-
1945	tf	1200	F	928	m	565	f
1850	tf	1190	ep.	912	F	550	f
1760	tf	1185	ep.	890	m	535	f
1730	tf	1170	F	870	F	500	tf
1630	ep.	1152	f	852	m	482	tf
1590	F	1140	ep.	828	m	420	m
1450	F	1115	F	815	ep.	378	f
1398	F	1108	ep.	792	ep.	350	m
1380	F	1092	tF	788	m
tF = m = tf =	sehr stark mittel sehr schwach		F = f = ep. =	stark schwach Schulter

untersuchte Bakterienorganismen

minimale bakteriostatische Konzentration (in μg/cm³)

ίο Staphylococcus aureus, Stamm 209 P - 0,S

ATCC 6538 P

Staphylococcus aureus, Stamm Smith 2,5

Sarcina lutea - ATCC 9341 1,9

Streptococcus faecalis - ATCC 8043 0,5

Streptococcus pyogenes hemolyticus, 0,8

Stamm Dig 7 (Pasteur-Institut)

Diplococcus pneumoniae, Stamm Til 0,2

(Pasteur-Institut)

Neisseria catarrhalis (A !52, Pasteur- 50

Institut)

Bacillus subtilis - ATCC 6633 0,8

Bacillus cereus - ATCC 6630 0,5

Mycobacterium species - ATCC 607 25

Escherichia coli - ATCC 9637 > 150

Shigella dysenteriae, Shiga L > 150 (Pasteur-Institut)

Salmonella paratyphi A (Stamm Lacasse, > 150 Pasteur-Institut)

Salmonella schottmuelleri (paratyphi B), > 150 (Stamm Fougenc, Pasteur-Institut)

Proteus vulgaris > 150

Pseudomonas aeruginosa > 150

Das Natriumsalz von 31 559 RP kann auch durch aufsteigende Dünnschichtchromatographie an Slliclumdloxydgel unter Verwendung von zwei Lösungsmlttelgemlsch-Systemen charakterisiert werden:

1. Äthylacetat, Cyclohexan, Wasser, Butanol (50/50/25/5 in Volumina): In diesem System besitzt das Natriumsalz von 31 559 RP einen Rf-Wert von 0,5.

2. Methylenchlorid, Methanol (94/6 In Volumina): In diesem System besitzt das Natriumsalz von 31 559 RP einen Rf-Wert von 0,7.

Bakterlostatlsche In vltro-Aktlvltät:

Das 31 559 RP zeigt eine bakterlostatlsche Aktivität, die sich Insbesondere auf bestimmte Bakterien, die die Gram-Färbung annehmen, auswirkt.

Die bakterlostatlsche Aktivität des Natriumsalzes von 31 559 RP In bezug auf eine bestimmte Anzahl an Keimen wurde durch eine der häufig für diesen Effekt verwendeten Verdünnungsmethoden bestimmt. Für jeden Keim bestimmte man die geringste Konzentration an Wirksubstanz, die unter definierten Bedingungen vollständig die sichtbare Entwicklung In einer geeigneten Nährbrühe verhindert. Die Ergebnisse der verschiedenen Bestimmungen sind In der nachstehenden Tabelle II angegeben. In der die minimalen bakterlostatlschen Konzentrationen In Mlkrogramm der Substanz je cm¹ des Versuchsmilieus angegeben sind.

Toxlzltät:

Beim Küken beträgt die zu 50% letale Dosis (DL_S0) des Natriumsalzes von 31 559 RP 150 mg/kg p. o. bei einer einmaligen Verabreichung.

⁴' Aktivität gegenüber Kokzldlen:

Die Aktivität gegenüber Kokzldlen des Natriumsalzes von 31 559 RP wurde beim Insbesondere durch Elmeria tenella und Elmeria acervulina Infizierten Küken bestimmt.

Die Aktivität gegenüber Kokzidien des In die Nahrung eingebrachten Natriumsalzes von 31 559 RP zeigt sich bei nichttoxischen Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,04 Gew.-9b des In der Nahrung enthaltenen Produktes.

Aktivität gegenüber Maleria:

Das Natriumsalz von 31 559 RP besitzt auch eine Aktivität gegenüber Malaria in bezug auf experimentelle Infektionen mit Plasmodium beim Küken und bei der Maus.

Der erfindungsgemäß eingesetzte Mikroorganismus ist ein Streptomycesstamm, der, ausgenend von einer Erdprobe, die In Indien entnommen wurde, Isoliert wurde und den man mit der Internen Nummer DS 24 367 bezeichnet hat. Eine Probe desselben wurde In dem Northern Regional Research Laboratory des US-Department of Agriculture In Peoria, IH. (USA) hinterlegt, wo er mit der Bezeichnung NRRL 5787 registriert wurde. Nach

Offenlegung der vorliegenden Anmeldung 1st der Mikroorganismus jedermann zugänglich.

Die Isolierung dieses Stammes wurde unter Befolgung der allgemeinen Methode durchgeführt, die darin besteht, eine geringe Menge der Erde in sterilem destilliertem Wasser zu suspendieren, die Suspension auf verschiedene Konzentrationen zu verdünnen und ein geringes Volumen jeder Verdünnung auf der Oberfläche von Petrlschalen, die ein Gelose-Nährmllleu enthalten, zu verteilen. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 25° C, die es den Mikroorganismen gestattet, sich zu entwickeln, werden die Kolonien, die man für die Untersuchung isolieren möchte, entnommen und In geneigte Gelose-Nährmedlen versetzt, um hieraus ergiebigere Kulturen zu erhalten.

Der Stamm Streptomyces DS 24 367 gehört der Species Streptomyces hygroscopicus an, deren wesentliche Eigenschaften von H. D. Tresner und E. F. Backus (Applied Microbiology, 4, 243 bis 250, 1956) und von S. A. Waksman (The Actlnomycetes, II, The Williams and Wllklns Company, Baltimore, 1961, Selten 230 bis 231) definiert sind und aus diesem Grunde wurde er auch mit der Bezeichnung Streptomyces hygroscopicus, Stamm DS 24 367 versehen.

S. hygroscopicus DS 24 367 besitzt In der Tat die drei folgenden Eigenschaften, die den drei Eigenschaften entsprechen, durch die H. D. Tresner und E. F. Backus sowie S. A. Waksman die Species S. hygroscopicus definieren:

a) Seine Sporophoren enden im allgemeinen in dicht gedrängten Spiralen mit einer Windung von mehreren Umdrehungen. Seine spiraligen Sporophoren sind üblicherweise an einem Faden entlang unter Bildung von mehr oder weniger langgestreckten Knäueln angeordnet.

b) Sein Sporen bildendes Luftmycel zeigt, wenn es auf einem guten Entwicklungsstadium angelangt Ist, eine dunkelgraue Färbung, die der von der Species S. hygroscopicus gezeigten entspricht.

c) Über bestimmten Kulturmilieus, die eine gute Entwicklung des Luftmycels gestatten, erscheinen durch Alterung an den Sporen bildenden Oberflächen schwarze glänzende Zonen von feuchtem Aussehen, die für die Species S. hygroscopicus charakteristisch sind.

Im Falle von S. hygroscopicus DS" 24 367 erfolgt die Bildung des Luftmycels häufig In einer nur wenig ergiebigen Welse, wobei über einer bestimmten Anzahl von Kulturmilieus sogar ein Fehlen festzustellen Ist. Tritt ein graues Sporen bildendes Luftmyce! auf, so erfolgt die Bildung von schwarzen Zonen durch Altern, wenn sie erfolgt, im allgemeinen nur ziemlich eingeschränkt und sie 1st auf bestimmte Stellen oder kleine Zonen, die sich mehr auf Stellen In dem Luftmycel als auf die gesamte Oberfläche verteilen, begrenzt. Indessen ist sie insbesondere über Hefeextrakt-Gelose von Prldham, über Hafermehl- und Tomatenextrakt-Gelose von Prldham und über Glucose-Asparagin-Gelose sichtbar und beobachtbar.

Der von S. A. Waksman in »The Actinomycetes« als Referenz genannte Stamm S. hygroscopicus zeigt über einigen Kulturmllleus, für die sein morphologisches Aussehen beschrieben Ist, einige geringe Unterschiede gegenüber dem Stamm DS 24 367, dessen wesentlichste darin bestehen, daß er ein Luftmycel über Saccharose-Nltrat-Gelose und über Nährgelose bildet, während über diesen beiden Milieus der Stamm DS 24 367 keine bildet. Überdies reduziert S. hygroscopicus über einem Milieu, das Saccharose als Kohlenstoffquelle enthält, nicht Nitrate, während unter den gleichen Bedingungen der Stamm DS 24 367 Nitrate stark zu Nitriten reduziert. Jedoch sind diese wenigen Unterschiede zu unbedeutend, um den Stamm DS 24 367 von der Species S. hygroscopicus, von der er Im übrigen die zu seiner Definition dienenden Hauptmerkmale besitzt, zu unterscheiden.

S. hygroscopicus DS 24 367 bildet Sporenketten, die Im allgemeinen In dichtgedrängten Spiralen mit einer beschränkten Anzahl von Umdrehungen, die selten mehr als 3 oder 4 betragen, enden, obwohl man gelegentlich Spiralen beobachten kann, die eine wesentlich höhere Anzahl von Umdrehungen bilden, oder auch einige Sporenketten, die einfach In Ihrem Endteil gekrümmt sind, ohne eine vollständige Umdrehung zu bilden, oder auch Spiralen, die mehr oder weniger locker und entrollt sind. Die Sporen tragende Komponente weist eine knäuelförmlge Struktur auf, wobei die spiraligen Sporophoren, die Ihrerseits einige Verzweigungen aufweisen können, an einem Hauptfaden entlang, der eine ziemlich große Länge erreichen kann, angeordnet sind. Die Sporen sind oval bis zylindrisch und besitzen Maßangaben von 0,8 bis Ι,Ομιη/0,6 bis 0,8 μηι. Die mikroskopischen Untersuchungen haben eine Identische Organisation der Sporen tragenden Vorrichtung über Gelose von Bennett und über Hafer-Tomaten-Gelose von Prldham gezeigt. Aufgrund seiner Art der Sporulatlon 1st S. hygroscopicus DS 24 367 in dem Abschnitt Spira der Klassifikation von Prldham einzuordnen.

S. hygroscopicus DS 24 367 entwickelt sich gut bei 25° C, etwas weniger gut bei 37° C und nicht be! 50° C. In den bei 25° C durchgeführten Kulturen besitzt er die folgenden biochemischen Eigenschaften:

Bildung von Melanin negativ

Bildung von HiS	negativ
Tyrosinase	negativ
Verflüssigung von Gelatine	positiv
Verwertung von Cellulose	positiv
Bildung von Nitriten, ausgehend von Nitraten	stark positiv
Hydrolyse von Stärke	positiv
Kultur über Milch	Peptonisation ohne Koagulation; geringe Änderung des pH während eines Monats

Die Kultureigenschaften von Streptomyces hygroscopicus DS 24 367 sind In der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Es handelt sich um Kulturen, die an einem guten Entwicklungsstadium angelangt sind, d. h. von ungefähr 2 bis 3 Wochen bei 25° C, sofern es nicht anders angegeben ist. Diese Eigenschaften wurden über Üblicherwelse zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Streptomyces-Stämmen verwendeten Nährgelosen und Brühen beobachtet, wobei die Kulturen über Gelose-Mlileus über geneigten Gelosen durchgeführt wurden. Eine bestimmte Anzahl von verwendeten Kulturmllleus Ist nach den In »The Actlnomycetes« (S. A. Waksman, Selten bis 193 bis 197, Chronlca Botanlca Company, Waltham, Mass., USA, 1950) angegebenen Vorschriften hergestellt worden. In diesem Fall sind sie durch den Buchstaben W, gefolgt von der Zahl, die ihnen In »The Actinomycetes« zugeteilt wurde, angegeben. Die Referenzen oder Zusammensetzungen der anderen Kulturmilieus sind die folgenden:

Ref. A - »Bennett's Agar« - S. A. Waksman - The Actlnomycetes, Bd. 2, S. 331 - No. 30 - The Williams and Wllklns Company, Baltimore,

1961
Ref. B - »Hlckey and Tresner's Agar« - T. G. Pridham et al - Antibiotics Annual, 1956 bis 1957,

S. 950
Ref. C - Zusammensetzung W-23 unter Zusatz von 2%

Gelose
Ref. D - »Yeast Extract Agar« - T. G. Pridham et al -

Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 950
Ref. E. - »Tomato Paste Oatmeal Agar« - T. G. Pridham et al - Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 950
Ref. F - »Melanin formation medium« - S. A. V/aksman - The Actlnomycetes, Bd. 2, S. 333 No. 42 - The Williams and Wllklns Company,

Baltimore, 1961
Ref. G - W. E. Grundy et al - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952

Ref. H - »Inorganic Salts Starch Agar« - T. G. Pridham

et al - Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 951
Ref. 1 = entspricht der Zusammensetzung W-I, In der 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt wurden Ref. J - entspricht der Zusammensetzung W-I, In der 30 g Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt wurden

Ref. K - entspricht der Zusammensetzung W-18, In der 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt wurden

Ref. L - entspricht der Zusammensetzung W-18, In der Saccharose unterdrückt und durch kleine teilweise In die Flüssigkeit eingebrachte Filterpapierstreifen ersetzt wurde

Ref. M - »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« - Society of American Bacteriologists, Genf, N. Y., II50-I8

Ref. N - »Plain Gelatin« - hergestellt gemäß den Angaben von »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« - Society of American Bacteriologists, Genf, N. Y., II_S0—18

Ref. P-Im Handel erhältliche pulverförmlge entrahmte Milch, die gemäß den Angaben des Herstellers wieder hergestellt wurde

Ref. Q - Für die Untersuchung der Bildung von H₂S von H. D. Tresner und F. Danga - Journal of Bacteriology, 76, 239-244, 1958 angegebenes Milieu.

Kulturmilieu

Entwicklungsgrad

vegetatives Mycel

lockere Bestandteile (enthaltend das gesamte Luftmycel und die gesamte Sporulation) Lösliches Biochemische Beobachtungen Pigment und Eigenschaften

Gelose von
Bennett
(Ref. A)

gut gelbbräunlich weißlich bis grau schwach

bis braungelb sehr schwach entwickelt braungelb

Gelose von	mäßig	braungelb	weißlich	schwach
Hickey und			in Form von Spuren	braungelb
Tresner
(Ref. 3)
Gelose von	gut	hellbraungelb	weißlich	keines oder
Emerson			in Form von Spuren	sehr
(Ref. C)				schwach
				bräunliches
Hefe	ziemlich	braungelb	weißlich bis grau
extrakt-	gut		sehr schwach entwickelt
Gelose von			Erscheinen von kleinen
Pridham			schwarzen für die Species
(Ref. D)			»S. hygroscopicus« cha
			rakteristischen Punkten
			durch Alterung
Hafermehl-	ziemlich	gelbbraun bis	weißlich bis grau	sehr
und Toma	gut	braungelb	sehr schwach entwickelt	schwach
tenextrakt-			Erscheinen von kleinen	bräunlich
Gelose von			schwarzen für die Species
Pridham			»S. hygroscopicus« cha
(Ref. E)			rakteristischen Punkten
			durch Alterung

sporentragender Bestandteil in Form von Knäueln —
Sporenketten, die in dichtgedrängten Spiralen enden. Ovale bis zylindrische
Sporen mit Maßangaben
von 0,8 bis 1,0 μπι/0,6 bis
0,8 μπι

Sporentragender Bestandteil in Form von Knäueln —
Sporenketten, die in dichtgedrängten Spiralen enden. Ovale bis zylindrische
Sporen mit Maßangaben
von 0,8 bis 1,0 μΐη/0,6 bis
0,8 um

10

Fortsetzung	Entwick lungsgrad	vegetatives Mycel	lockere Bestandteile (enthaltend das gesamte Luftmycel und die gesamte Spekulation)	Lösliches Pigment	Biochemische Beobachtungen und Eigenschaften
Kultur milieu	mäßig	graugelblich bis braungelb	weißlich in Form von Spuren	schwach gelbbräun lich bis schwach braungelb
Glucose- Pepton- Gelose (W-6)	mäßig	braungelb	keiner	keines
Nährgelose (W-5)	sehr schwach	braungelb bis braunorange	keiner	ins Violett gehende braun- gräulich	Bildung von Melanin: negativ (die Bestimmungen wurden gemäß den Empfeh lungen des Verfassers durch geführt)
Tyrosin- Hefe- extrakt- Gelose für die Bildung von Mela nin (Ref. F)	sehr schwach	farblos bis weißgräulich	keiner	keines	Auflösung von Calcium- malat: positiv, jedoch gering
Calcium- malat- Gelose von Krainsky (Ref. G)	sehr schwach	farblos bis weißgräulich	keiner	keines
Oval- bumin- Gelose (W-12)	mäßig	leicht grünlichgelb	weißlich bis grau sehr mäßig entwickelt Erscheinen von kleinen schwarzen Tür die Species »S. hygroscopicus« cha rakteristischen Punkten durch Altern	schwach gelb gräulich
Glucose- Asparagin- Gelose (W-2)	mäßig	schwach graugelblich bis gelb	weißlich bis gräulich in Form von Spuren	keines oder schwach bräunlich
Glycerin- Asparagin- Gelose (W-3)	mäßig	graugelblich bis braungelb	weißlich bis grau in Form von Spuren	keines oder sehr schwach bräunlich	Hydrolyse von Stärke: positiv
Stärke- Mineral- saize- Gelose von Pridham (Ref. H)	schwach	schwach graubräunlich	keiner	keines
Stärke nitrat- Gelose (W-IO)	schwach	sehr schwach graugelb bräunlich	keiner	schwach gelb bräunlich
synthe tische Gelose von Czapek aus Saccha- raose (W-I)

	Entwick lungsgrad	U	25 09 653	Lösliches Pigment	12
Fortsetzung	schwach			schwach gelb bräunlich
Kultur milieu	schwach	vegetatives Mycel	lockere Bestandteile (enthaltend das gesamte Luftmycel und die gesamte Sporulation)	schwach gelb bräunlich	Biochemische Beobachtungen und Eigenschaften
synthe tische Gelose von Czapek aus Glucose (Ref. I)	schwach	sehr schwach gelbbräunlich	keiner	keines
synthe tische Gelose von Czapek aus Glycerin (Ref. J)	schwach	schwach gelbbräunlich	keiner	keines
Stärke nitratbrühe (W-IO)	schwach	weißlich	keiner	keines	Bildung von Nitriten: stark positiv
synthe tische Brühe von Czapek aus Saccharose (W-18)	schwach	flockenartige weißliche Kultur	keiner	keines	Bildung von Nitriten: stark positiv
synthe tische Brühe von Czapek aus Glucose (Ref. K)	schwach	flockenartige weißliche Kultur	keiner	keines	Bildung von Nitriten: stark positiv
synthe tische Brühe von Czapek aus Cellulose (Ref. L)	sehr mäßig	flockenartige weißliche Kultur	grau sehr mäßig über aus der Brühe herausragendem Papier entwickelt	schwach grau bräunlich	Bildung von Nitriten: stark positiv Verwertung von Cellulose: positiv
Nitrat nährbrühe (Ref. M)	gut	braun gelblicher Ring	keiner	keines	Bildung von Nitriten: stark positiv
Kultur über Kar toffeln	gut	schwach grau bräunlich	weißlich in Form von Spuren
reine 12%ige Gelatine (Ref. N)	sehr mäßig	weißlich bis hellbräunlich	keiner	keines	positive Verflüssigung: gut
entrahmte Milch	weißgelblicher Ring, der nach einem Monat Kultur gelb bräunlich wird	keiner	Peptonisation ohne Koagula tion: keine bemerkenswerte Änderung des pH während eines Monats oder sehr geringe Ansäuerung
Gelose von Tresner und Danga	schwach braungelblich	keiner	Bildung von H2S: negativ (die Bestimmungen wurden gemäß Empfehluneen des

Die Befähigung von Streptomvces hygroscoplcus DS 24 367, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zur Sicherstellung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde gemäß dem Prinzip der Methode von Prldham und Gottlieb (J. of Bact. 56, 107-114, 1948) beschrieben. Der Entwicklungsgrad wurde nach einer angemessenen Inkubationszeit bei 25° C über dem durch die Autoren angegebenen Basenmilieu beobachtet, wobei man entweder die Glucose durch verschiedene jeweils untersuchte Kohlenstoffquellen oder (NH₄)jSO₄ durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzte. Die erhaltenen Ergebnisse sind In der nachstehenden Tabelle angegeben.

untersuchte
Kohleastoffquellen

Ver- untersuchte Stick- Verwertung stoffquellen . wertung

D-Xylose	positiv,	NaNO3	positiv	20
	jedoch
	langsam
L-Arabinose	positiv	NaNO2	positiv
L-Rhamnose	positiv	(NH4)2SO4	positiv	25
D-Glucose	positiv	(NH4)2HPO4	positiv
D-Galactose	positiv,	Harnstoff	positiv
	jedoch
	langsam			30
D-Fructose	positiv	L-Asparagin	positiv
D-Mannose	positiv,	Glucosamin	positiv
	jedoch
	langsam			35
L-Sorbose	negativ	Glycocoll	positiv
Lactose	positiv	Sarcosin	positiv
Maltose	negativ	DL-Alanin	positiv
Saccharose	positiv	DL-Valin	positiv	40
Trehalose	positiv	DL-Asparaginsäure	positiv
Cellobiose	positiv	L-Glutaminsäure	positiv
Raffinose	positiv	L-Arginin	positiv
Dextrin	positiv	L-Lysin	positiv	45
Inulin	positiv	DL-Serin	positiv
Stärke	positiv	DL-Threonin	positiv
Clycogen	positiv	DL-Methionin	negativ
Glycerin	positiv	Taurin	negativ	50
Erythrit	negativ	DL-Phenylalanin	positiv,

jedoch langsam

Adonit positiv L-Tyrosin positiv

Dulcit negativ DL-Prolin positiv

D-Mannit positiv L-Hydroxyprolin positiv D-Sorbit negativ L-Histidin positiv

Inosit negativ L-Tryptophan positiv,

jedoch langsam

Salicin negativ Betain negativ

60

65

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Substanz 31 559 RP und von dessen Salzen gemäß Patentanspruch 1 Ist dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces hygroscopikus NRRL 5787 aerob züchtet, die Kulturbrühe bei einem sauren pH-Wert filtriert, den Filtrationskuchen mit Methanol oder Methylenchlorid extrahiert, aus der Extraktionslösung nach einer alkalischen Behandlung das Natriumsalz durch Auskrlstalllsatlon nach Konzentration unter vermindertem Druck Isoliert und das Natriumsalz durch übliche Methoden reinigt.

Die Kultur von Streptomyces hygroscoplcus DS 24 367 kann nach jeder aeroben Kulturmethode auf der Oberfläche oder submers durchgeführt werden, wobei jedoch diese letztere aus Gründen der Einfachheit zu bevorzugen 1st. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Vorrichtungstypen, die In der Fermentationsindustrie· laufend Im Gebrauch sind.

Insbesondere kann man den folgenden Weg für den Ablauf der Verfahrensmaßnahmen anwenden:

Streptomyces hygroscoplcus DS 24 367 - Stammkultur

1
Kuitur über Gelose

1
Kultur in einem gerührten Fläschchen

1
Inokulations'-ultur in einer Fermentlervorrichtung

1
in der Fermentlervorrlchtupg gebildete Kultur

Das Fermentationsmilieu muß im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoff- und eine assimilierbare Stickstoffquelle, anorganische Elemente, Insbesondere Chloride und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, enthalten, wobei diese Elemente In Form von wohldefinierten Produkten oder durch komplexe Gemische, wie man sie bei biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, eingebracht werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlenhydrate, wie Glucose, die Dextrine, Stärke oder andere Kohlenwasserstoffsubstanzen, wie Zuckeralkohole (Glycerin) oder wie bestimmte organische Säuren, wie Milchsäure oder Citronensäure, verwenden. Bestimmte tierische oder pflanzliche öle, wie Schweinefett oder Sojaöl, können vorteilhafterweise diese verschiedenen Kohlenwasserstoffquellen ersetzen oder diesen zugefügt sein.

Geeignete assimilierbare Stickstoffquellen sind außerordentlich verschieden. Sie können seht einfache chemische Substanzen, wie die anorganischen oder organischen Ammoniumsalze, Harnstoff oder bestimmte Aminosäuren sein. Sie können auch durch komplexe Substanzen, die Im wesentlichen Stickstoff in protldlscher Form enthalten, eingebracht sein, wie Casein, Lactalbumln, Gluten und deren Hydrolysate, Soja-, Erdnuß- oder Fischmehl, Weinextrakte, Hefeextrakte, lösliche Destillationsrückstände und Maisquellwasser.

Unter den zugefügten anorganischen Elementen können bestimmte einen Pufferungseffekt aufweisen odei wie die Alkall- oder Erdalkallphosphate oder die Calcium- oder Magnesiumcarbonate neutralisierend wirken Andere, wie die Alkalt- oder Erdalkalichloride und -sulfate, gewährleisten das für die Entwicklung von Streptomyces hygroscoplcus DS 24 367 und die Bildung vor 31 559 RP erforderliche Ionische Gleichgewicht. Schließ Hch wirken bestimmte insbesondere als Aktivatoren füi die metabollschen Reaktionen von Streptomyces hygro scoplcus DS 24 367. Und zwar sind diese Zink-, Kobalt-Elsen-, Kupfer- und Mangansalze.

Die Wachstumsfaktoren sind vitaminische Naturpro dukte, wie Riboflavin, Folsäure und Pantothensäure.

Der pH-Wert des Fermentationsmilieus zu Beginn der Kultur muß zwischen 5,8 und 7,8 und vorzugsweise zwischen 6,2 und 7,4 liegen. Die für die Fermentation optimale Temperatur liegt zwischen 25 und 30° C, wobei eine zufriedenstellende Bildung bei Temperaturen zwischen 23 und 33° C erhalten wird. Die Luftzufuhr bei der Fermentation kann zwischen ziemlich breiten Weiten variieren. Es wurde jßdoch gefunden, daß Luftzufuhren von 0,3 bis 3 1 Luft je Liter Brühe und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an 31 559 RP wird nach 2 bis 8 Tagen der Kultur erhalten, wobei diese Zeit wesentlich vom verwendeten Milieu abhängt.

Aus dem Vorstehenden geht hervor, daß die allgemeinen Bedingungen für die Kultur von Streptomyces hygroscoplcus DS 24 367 zur Bildung von 31 559 RP Innerhalb eines breiten Bereiches variieren und den jeweiligen speziellen Erfordernissen angepaßt werden können.

Das 31 559 RP kann aus den Fermentationsbrühen auf die folgende Welse Isoliert werden.

Die Brühe wird bei einem sauren pH-Wert, der im allgemeinen zwischen 3 und 6 und vorzugsweise bei ca. 5 liegt, filtriert. Die In dem Filtrationskuchen zurückgehaltene Aktivität wird hieraus mit Hilfe von Methylenchlorid extrahiert.

Nach einer geeigneten alkalischen Behandlung kann 31 559 RP in Form des Natriumsalzes aus den vorstehend erwähnten Lösungen durch Kristallisationen nach Konzentration unter vermindertem Druck und gegebenenfalls anschließender Verdünnung durch ein NichtLösungsmittel oder ein schlechtes Lösungsmittel und Aufbewahren In einer Kältekammer Isoliert werden.

Das 31 559 RP oder dessen Natriumsalz können durch übliche klassische Methoden, wie Kristallisation, Chromatographie über verschiedenen Adsorptionsagenzien oder Gegenstromverteilung gereinigt werden.

Das folgende Beispiel zeigt, wie die Erfindung In die Praxis umgesetzt werden kann.

Beispiel
A) Fermentation

Man beschickt eine Fermentationsvorrichtung von 170 Litern mit:

Pepton 1200 g

Hefeextrakt 600 g

Glucose-monohydrat 1200 g

Gelose 240 g und
Leitungswasser aufgefüllt auf 110 I.

Der pH wird durch Zugabe von 70 cm¹ 10N-Natronlauge auf 7,30 eingestellt. Man sterilisiert das Milieu durch Einleiten von Dampf bei 122⁰C während 40MIn. Nach dem Abkühlen beträgt aufgrund der Kondensation des Dampfes während der Sterilisation das Volumen der Brühe 1201, und der pH hat einen Wert von 6,85. Man setzt dann mit 200 cm^! einer In einem Erlenmeyer gerührten Kultur von Streptomyces hygroscoplcus DS 24 367 an. Die Kultur wird bei 27° C während 25 Std. unter Rühren und unter Zufuhr von steriler Luft entwlkkelt. Sie Ist dann für das Ansetzen der produzierenden Kultur geeignet.

Die produzierende Kultur wird in einer Fermentationsvorrichtung von 800 I, beschickt mit den folgenden Substanzen, durchgeführt:

Natriumchlorid 2 kg

Kobaltchlorld-hexabydrat-Lösung

von 20 g/l 0,41 und

Leitungswasser aufgefüllt auf 365 I

Der pH des Milieus wird durch Zugabe von 200 cm¹ ION-Natronlauge auf den Wert 7,50 eingestellt, und man sterilisiert dann die Brühe durch Einleiten von Dampf von 122° C wShrend 40 Min. Nach Abkühlen beträgt aufgrund der Kondensation des Dampfes während der Sterilisation das Volumen der Brühe 3901. Es wird durch Zugabe von 101 steriler wäßriger Lösung, die Glucosemonohydrat In einer Menge von 4 kg enthält, auf 400 1 aufgefüllt.

Der pH des Milieus beträgt 6,65. Man setzt mit 40 1 der Inokulationskultur In der vorstehend beschriebenen Fermentationsvorrichtung von 170 1 an. Die Kultur wird bei 27° C während 113 Std. unter Rühren mit einer sich mit 205 Umdr./Mln. drehenden Turbine und unter Luftzufuhr mit einem Volumen an steriler Luft von 20 mVStd. entwickelt. Am Ende des Verfahrens beträgt der pH der Kultur 7,65 und das Volumen 380 I.

B) Extraktion

Lösliche Destillate
Bohnen In Körnern
Glycerin

2 kg

10 kg

6 kg

400 I der wie vorstehend angegeben erhaltenen Brühe werden durch Zugabe von 2,8 I einer 6N-Salzsäurelösung auf einen pH von 5 gebracht und dann während einer halben Stunde gerührt. Nach Zugabe von 20 kg Flltratlonsadjuvans wird die Brühe über einer Filterpresse flltrlert und der Filtrationskuchen über dem Filter mit 100 I Wasser, dessen pH durch eine 6N-Salzsäurelösung auf 5 eingestHlt ist, gewaschen. Das Flltrat und das Waschwasser werden entfernt.
Der Filtrationskuchen wird In 300! Methanol aufgeschlämmt. Die erhaltene Mischung wird durch Zugabe von 200 cm' 6N-Natronlauge auf einen pH von 7 eingestellt und während einer halben Stunde gerührt.

Die Mischung wird über einer Filterpresse filtriert und der Filtrationskuchen über dem Filter mit 80 1 Methanol gewaschen. Das Flltrat und das Waschwasser werden vereinigt und unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) zur Erzielung von 30 1 wäßrigem Konzentrat konzentriert. Dieses Konzentrat wird durch Zugabe von 290 cm^J 6N-Salzsäure auf einen pH von 3 eingestellt und dann während 10 MIn. In Gegenwart von 301 Methylenchlorid gerührt. Die beiden Phasen werden getrennt. Man extrahiert noch zweimal gemäß diesem Verfahren die wäßrige Phase mit jeweils 30 1 Methylenchlorid.
Die drei Methylenchloridextrakte werden vereinigt und mit 91 Wasser gerührt, wobei man bis zur Erzielung eines pH von 3 In der wäßrigen Phase (20 cm' 6N-SaIzsäure) ansäuert. Die organische Phase wird abgetrennt und mit 18 I Wasser gewaschen, Indem man bis zur Erzielung eines pH-Wertes von 9,5 in der wäßrigen Phase (20 cm¹ 6N-Natronlauge) Natronlauge zufügt.

Die Methylenchlorldphase wird unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis zur Erzielung eines Volumens von 1 I konzentriert.

C) Reinigung

Das vorstehend erhaltene Methylenchloridkonzentrat wird langsam bei Raumtemperatur In 101 Hexan gegossen.

Die Lösung wird filtriert. Man trennt so 63 g inaktiver Unlösllchkelten ab.

Das Flltrat wird unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis zur Erzielung eines Volumens von ca. 0,5 1 konzentriert. Diese Lösung wird während 2 Std. bei

einer Temperatur von 0° C gerührt, und man belaßt dann 24Std. bei+4° C.

Die erhaltenen Kristalle werden durch Zentrifugieren der Losung Isoliert und anschließend mit 250 cm³ Hexan von +4⁰C gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.

Man isoliert so 103 g des Natriumsalzes von 31 559 RP. D) Umkrlstalllsation

57 g des vorstehend erhaltenen Natriumsalzes von 31559 RP werden In 1,21 Aceton in Lösung gebracht und wahrend 15 Min. gerührt. Man fügt 2,5 g mit Salzsaure gewaschene Entfärbungskohle hinzu, rührt dann erneut wahrend einer halben Stunde und trennt schließlich die Entfärbungskohle durch Filtration ab.

Zu dem langsam gerührten Flltrat werden 750 cm³ destilliertes Wasser hinzugefügt. Das Natriumsalz von 31 559 RP kristallisiert langsam bei einer Temperatur von O⁰C.

Die Kristalle werden durch Filtration Isoliert, mit 150 cm³ eines Aceton/Wasser-Gemisches (50/50 in Volumina) gewaschen und unter vermindertem Druck bei 35° C getrocknet.

Man erhalt 35 g des Natriumsalzes von 31 559 RP.

Man erhalt durch Konzentration der Mutterlaugen auf die Hälfte Ihres anfanglichen Volumens und anschließendes Abkühlen auf 4⁰C erneut 13,2 g des Natriumsalzes von 31 559 RP.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Ist die Verwendung der Substanz 31 559 RP In Form der freien Saure oder kombiniert In Form des Metallsalzes oder des Salzes mit einer Stickstoffbase In einer Menge von 0,0001 bis 99,9 Gew.-9b zusammen mit von Tieren verzehrbaren Substanzen als Zusammensetzung für tierische Nahrungsmittel. Diese Zusammensetzungen sind gegen Kokzldlen wirksam, und man verwendet Insbesondere gemischte Nahrungsmittel für Tiere oder konzentrierte Mischungen für tierische Nahrungsmittel, die 31 559 RP oder dessen Metallsalze oder Salze mit Stick stoffbasen gegebenenfalls In Gegenwart eines weiteren Mittels gegen Kokzldlen enthalten. Diese Zusammensetzungen sind Insbesondere zur Bekämpfung von Kokzldlose von Vögeln und Insbesondere von Geflügel verwendbar.

Die zur Erzielung »Iner annehmbaren Wirkung erforderliche Dosis kann natürlich gemäß dem Wert der Nahrungsmittel selbst Innerhalb ziemlich breiter Grenzen variieren.

Im allgemeinen genügt es, daß die den Tieren zur Verfügung gestellten Nahrungsmittelmengen 0,005 bis 0,04 Gew.-9b von 31 559 RP oder dessen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen enthalten.

Das 31 559 RP oder dessen Metallsalze oder Salze mit Stickstoffbasen können In Form einer gleichförmigen Dispersion In den fertigen Nahrungsmittelzusammensetzungen In den vorstehenden Dosen verteilt werden.

Es kann auch in ergänzenden Nahrungsmitteln In einer Dosis von 0,025 bis 1% meistens mit weiteren Additive wie Vitaminen und Mineralsalzen verteilt werden. Diese ergänzenden Nahrungsmittel können entweder der Nah rungsmittelmenge zugemischt werden oder als solche verbraucht werden und weisen Im allgemeinen 5 bis 20% der Nahrungsmittelmenge auf.

Die für die Herstellung der fertigen Nahrungsmittelmengen oder der ergänzenden Nahrungsmittel verwendeten »Vormischungen« enthalten Üblicherwelse 0,05 bis 20% von 31 559 RP oder dessen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen, die durch einen Nahrungsmittelfüll-

stoff verdünnt sind. Sie stellen ein bequemes Zwischenprodukt dar, das die gleichförmige Verteilung des wirksamen Produktes In den Nahrungsmitteln erleichtert. Die Vormischungen selbst werden Im allgemeinen aus Konzentralen, die 99,9 bis 20% von 31 559 RP oder dessen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen unter Zusatz von verzehrbaren denaturierenden Agenzien, wie Nahrungsmittelfarbstoffen, geschmacksgebenden Komponenten, zerteilenden oder die Agglomerierung verhindernden Agenzien und Nahrungsmlltelfüllstoffen enthalten, hergestellt.

Die Konzentrate und Vormischungen sind im allgemeinen pulverförmig. Die ergänzenden Nahrungsmittel und die fertigen Nahrungsmluelzusammensetzungen können entweder pulverförmig oder in Form von gemälJ üblichen Techniken hergestellten Granulaten vorliegen.

Das folgende Beispie! erläutert eine erfindungsgemäße Zusammensetzung:

Beispiel A	der folgenden
an stellt ein Basls-Nahrungsmlttel
immensetzung her:	13.41%
Mehl aus Getreidekleie	13.41%
Gerstenmehl	13.41",
Malsmehl	31.32",
Weizenmehl	8.92",
Fischmehl	8.92",
Sojamehl	4.56",,
dehydratlslertes Futtermehl	2.33%
Hefeextrakte	2.68",,
pulverförmlge Trockenmilch	0.09",,
Natriumchlorid	0.89",
Calciumchlorid	0.06",.
anorganische Elemente
vitaminischer Komplex:	4000 1. E./kg
Vitamin A	1000 I.E./kg
Vitamin D1	11.5 mg/kg
Chollnchlorid	2.24 mg/kg
Riboflavin

Zu diesem Nahrungsmittel lügt und verleih man gleichmäßig 0.02% des Natriumsalzes von 31 559 RP.

Die Zusammensetzungen unter Verwendung der Substanz 31 559 RP können auch als Wachstumslaktor Tür Wiederkäuer (Rinder. Schale. Ziegen) und als MIttel zur Bekämpfung der Dysenterie von Schweinen verwendet werden.

Diese Zusammensetzungen bestehen aus gemischten Nahrungsmitteln für Wiederkäuer und Schweine und aus konzentrierten Mischungen für tierische Nahrungsmittel. die das Antibioticum 31 559 RP oder dessen Salz enthalten. Die zur Erzielung eines annehmbaren Effekts erforderliche Dosis kann natürlich entsprechend den tierischen Species und gemäß dem Nährwert der Nahrungsmittel selbst Innerhalb breiter Bereiche variieren.

Es Ist Insbesondere vorteilhaft, eine tägliche Menge an Antibioticum 31 559 RP zwischen 50 und 250 mg je Tier den Tieren zur Verfügung zu stellen.

Vorzugswelse wird das Antibioticum 31 559 RP in den ergänzenden Nahrungsmitteln, die von diesem 0.01 bis 0,1% meistens zusammen mit anderen Additiva. wie Vitaminen und Mineralsalzen, enthalten, verteilt. Die ergänzenden Nahrungsmittel können entweder der Nahrungsmittelmenge zugemischt werden oder als solche verbraucht werden und enthalten üblicherweise ca. 1 bis 10% der täglichen Nahrungsmittelmenge. Das 31 559 RP entspricht somit 0.0001 bis 0.01 Gew.-% der täglichen Nahrungsmittelmenge.

Die /ur Herstellung der fertigen Nahrungsmittelmengen oder der ergänzenden Nahrungsmittel verwendeten »Yormischungen« enthalten im allgemeinen 0,1 bis 5% Antibioticum 31 559 RP, das in einem Nahrungsmlttelfüllstof! verdünnt ist. Sie stellen eine bequeme Zwischenslufe dar. die die gleichmäßige Verteilung des Antibioticums 31 559 RP in den Nahrungsmitteln erleichtert. Die »Yorniischungen« selbst werden im allgemeinen, ausgehend von Konzentraten, die 99,9 b's 5% Antibioticum 31 559 RP unter Zusatz ven verzehrbaren denaturierenden Agenzien, wie Nahrungsmitteifarbstoffen, aromatisierenden Agenzien, disperglerenden oder die Agglomerierung verhindernden Agenzien und Nahrungsfüllsioffe enthalten, erhalten.

Die Konzentrate und »Vorniischungen« sind im augemeinen pulverförmig. Die ergänzenden Nahrungsmittel können entweder pulverförmig sein oder in Form von genial.) üblichen Techniken hergestellten Granulaten vorliegen. In diesen Zusammensetzungen können das Antibioticum 31 55V RP oder dessen Salze in Form von feinen freien oder mit einer Umhüllung bedeckten Partikeln vorliegen.

Das lolgende Beispiel zeigt die Verwendung des Antibioticums 31 559 RP als Wachstunistaktor.

Beispiel B

/wolf junge Rinder der Rasse Holstein werden in Ein-/el/ellen. deren durchschnittliche Fläche 48 nr beträgt, gebracht und dann gewogen.

Die /u untersuchenden Nahrungsmittel werden vom T ag 0 ab, d. h. vom Tag des Beginns des Versuches ab. verteilt. Die Rinder werden darauf nach 28 Tagen und dann nach 56 Tagen gewogen, und es wird das Gewicht der während dieses Zeitraumes verbrauchten Nahrungsmittel bestimmt

Es werden die durchschnittlichen Gewichtszunahmen und der durchschnittliche Nahrungsniilielumsaiz für jedes zu untersuchende Tier In Intervallen von 0 bis 28 Tagen und 28 bis 56 Tagen bestimmt.

Die Tiere erhalten ihre Nahrung zweimal je Tag. Die tägliche Nahrungsmlitelmenge wird derart bestimmt, daß die Rinder das Maximum an Nahrung aufnehmen, ohne hiervon etwas zurückzulassen.

In dem Versuch werden die jungen Rinder in drei Gruppen aufgeteilt. Jedes Tier erhält ein Baslsnahrungsmlttel, das aus Mais, Heu und einer Eiweißergänzung besteht.

Jedes Tier der Gruppe I erhält das Basisnahrungsmittel.

Jedes Tier der Gruppe II erhält das Basisnahrungsmittel, in dem die Eiweißergänzung 100 mg Antibioticum 31 559 RP enthält.

Jedes T.er der Gruppe IH erhält das Basisnahrungsmittel. In dem die Eiweißergänzung 200 mg Antibioticum 31 559 RP enthält.

Die durchschnittliche tägliche Nahrungsmittelmenge je Tier besitzt die folgende Zusammensetzung:

Gruppe 1 Gruppe II Gruppe 111

J5

Mais	8,86	kg	8,96	kg	8,91	kg
Heu	1,46	kg	1,45	kg	1,47	kg
Eiweißergänzung*)	0,49	kg	0.5	kg	0,51	kg
Antibioticum	0		1OO	mg	200	mg
31 559 RP

25

JO *) Die verwendete Eiweißergänzung ist unter der Bezeichnung »Pro Blend 50« von der Societe Landmarck. Inc.. im Hanüel erhältlich und enthält insbesondere:

Gesamtes Proteinäquivalent ü 50%

Lipide > 1%

Pflanzliche Fasern < 9%

Vitamin A > 65 000 Einheilen/kg.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen zusammengefaßt:

1 - durchschnittliches Gewicht in kg (je Tier)

am Tag 0 nach 28 Tagen nach 56 Tagen

4

Gruppe I	285,1	325,2	374,5
Gruppe II	284,9	325,2	381,1
Gruppe III	286,6	333	387

- Änderung des durchschnittlichen Gewichtes und Grad des Umsatzes

0-28 Tage 28 - 56 Tage

Gruppe I Gruppe 11 Gruppe III Gruppe I Gruppe Il Gruppe

0 - 56 Tage

Gruppe I Gruppe Il Gruppe

durchschnittliche 40,1
Gewichtszunahme
in kg je Tier

durchschnittliche 1,43
Gewichtszunahme
je Tag je Tier

durchschnittlicher 9,83
Verbrauch je kg
je Tag je Tier

Grad des
Umsatzes

6.86

40,3 46,4 49.3 55.9 54 89,4 96,2 100,4

1,44 1,65 1.76 1,99 1,93 1,59 1,72 1,79

9,76 9,84 11,78 12,5 11,94 10,81 10,9 10,89

6,77 5,94 6,70 6,04 6,19 6,77 6,34 6,08

So weisen während der ersten 28 Tage die Tiere, die 100 mg je Kopf und je Tag von 31 559 RP erhalten, eine Gewichtszunahme von 3% mehr und einen Umsatzgrad von 1,39b weniger als die Vergleichstiere auf, wobei diese Prozentsätze bei den Tieren, die 200 mg je Kopf und je Tag an 31 559 RP erhalten, 15,3% bzw. 13,4% betragen.

Während der zweiten Perlode (28 bis 56 Tage) überholen die Tiere, die 100 mg pro Tag von 31 559 RP erhalten, diejenigen, die die stärkere Dosis erhalten. Die Gewlchts-

zunahmen betragen 13,4% mehr und die Grade des Umsatzes 9,8% weniger als bei den Vergleichstieren mit einer Dosis von 100 mg je Tag, wobei diese Prozentsätze 9,6% bzw. 7,6% für die Dosis von 200 mg je Tag betragen. Über den gesamten Versuchszeltraum (56 Tage) sind die durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahmen um 7,8% und 12,2% und die Umsatzgrade um 6.4% und 10,2% In bezug auf die Verglelchstlere bei Dosen von 100 bzw. 200 mg pro Tag an 31 559 RP verbessert.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Antibakterielle und gegenüber Kokzldlen wirksame Substanz 31 559 RP, sowie deren Metallsalze und Salze mit Stickstoffbasen, deren Natriumsalz, die dadurch gekennzeichnet ist,
daß sie in Form eines weißen mikrokristallinen Pulvers, das in Wasser praktisch unlöslich, in Hexan wenig löslich, In Methanol, Aceton, Dimethylformamid und Äthylacetat löslich und leicht löslich in Methylenchlorid und Chloroform 1st;
daß Ihre prozentuale Zusammensetzung beträgt

C % = 63,2 H 96 = 8,8 0 96 = 24,8 Na 56 = 2,9;

daß ihr Schmelzpunkt 22O⁰C (unter Zusetzung) betragt;

daß <hr Drehwert (c = 1,05096 - Methanol) Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue antiblotlsche Substanz, die nachfolgend mit der Nummer 31 559 RP bezeichnet wird, deren Metallsalze und deren Salze mit Stickstoffbasen, deren Herstellungsverfahren und deren Verwendung (vgl. die Patentansprüche 1 bis 3). Das 31 559 RP besitzt infolge seiner Wirksamkeit gegen Kokzldien, die sich neben seiner antibakteriellen Wirksamkeit und seiner Wirksamkeit gegenüber Malaria äußert, ein spezielles Interesse. Ebenso Ist sie Insbesondere als Wachstumsfaktor für Wiederkäuer und als Mittel zur Bekämpfung von Dysenterie von Schweinen bekannt.

Das 31 559 RP kann ausgehend von geeigneten Kulturmilieus eines nachfolgend näher gekennzeichneten neuen Mikroorganismus, der der Gattung Streptomyces angehört und durch die Bezeichnung Streptomyces hygroscopicus NRRL 5787 gekennzeichnet Ist, erhalten werden.

Das 31 559 RP enthält Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff. Die Elementarzusammensetzung seines Natriumsalzes beträgt: