DE2404958C2 - Metabolit A-27106 und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

d) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform gemäß der anliegenden Zeichnung, die Bestandteil dieses Anspruchs ist,

e) ein Massenspektrum mit einem Molekularionenpeak bei mle 854,44630 und charakteristischen Peaks bei mle 836,44129, 779,44690 und 761,44740 sowie

0 einen Rf-Wert von 0,49 im Silicagel-Dünnschichtchromatogramm in Benzol/Metha^l (7 : 3),

und wobei dessen Säureform ein weißer Feststoff mit einem Molekulargewicht von etwa 832 und einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 7,2 ist.

2. Verfahren zur Herstellung des Metaboliten A-27106 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces candidus NRRL 5449 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält,

a) submers unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Glucose und Monensin so lange züchtet, bis das Monensin durch den Organismus in dem Kulturmedium in eine wesentliche Menge des Metaboliten A-27106 umgewandelt wurde, oder

b) submers unter aeroben Bedingungen züchtet, die Brühe vom Kulturmedium trennt, die Brühe lyophilisiert, die lyophilisierte Brühe in einem wäßrigen Puffermedium wieder aufbaut und diese wiederaufgebaute Brühe so lange mit Glucose und Monensin zusammenbringt, bis im Puffermedium eine wesentliche Menge an Metabolit A-27106 entstanden ist, worauf man den Metaboliten A-27106 aus dem Puffermedium gewinnt, oder

c) submers unter aeroben Bedingungen züchtet, die Zellen vom Kulturmedium trennt, die erhaltenen Zellen durch Beschallung, Zentrifugieren und Dialyse reinigt, das gereinigte Dialysat in einem wäßrigen Puffermediuffi mit Glucose und Monensin umsetzt, bis sich im Puffermedium eine wesentliche Menge an Metabolit A-27106 gebildet hat, und den Metaboliten A-27106 hieraus isoliert.

3. Verwendung des Metaboliten A-27106 gemäß Anspruch 1 in Geflügel- oder Wiederkäuerfutter.

Die Erfindung bezieht sich auf den Metaboliten A-27106 und auf ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung.

Gegenstand der Erfindung ist der Metabolit A-27106 oder seine Säure-, Ammonium-, Lithium-, Kalium-, Rubidium- oder Cäsiumformen, wobei dieser Metabolit (Na-SaIz) ein weißer kristalliner Feststoff ist, sich ver-

hältnismäßig gut in niederen Alkanolen löst, im allgemeinen jedoch unlöslich ist in niederen Altanen und folgende weitere Eigenschaften hat:

a) ein Molekulargewicht von 854, und zwar massenspektrometrisch bestimmt,

b) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 58,78% Kohlenstoff, 8,51% Wasserstoff, 27,85% Sauerstoff und 3,63% Natrium,

c) eine empirische Formel C₄₂H₇₁O₁₆Na entsprechend der Strukturformel in Anspruch 1,

d) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform gemäß der anliegenden Zeichnung,

ej ein Massenspektrum mit einem Molekularionpeak bei mle 854,44630 und charakteristische Peaks bei ml

e 836,44129, 779,44690, 761,44740 sowie
0 einen Rf-Wert von 0,49 im Silicagel-Dunnschichtchromatogramm in Benzol/Methanol (7 : 3),

und wobei dessen Säuteform ein weißer Feststoff mit einem Molekulargewicht von etwa 832 und einer trtrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 7,2 ist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des Metaboliten A-27106, das darin besteht, daß man Streptomyces candidus NRRL 5449 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anot^ainischen Salzen enthält, submers unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Glucose und Monensin so lange züchtet, bis das Monensin durch den Organismus in dem Kulturmedium in eine wesentliche Menge des Metaboliten A-27106 umgewandelt wurde.

Schließlich ist Gegenstand derEifindung die Verwendung des Metaboliten A-27106 in Geflügel- oder Wiederkäuerfutter. Dadurch erzielt man die Verhinderung oder Behandlung von Kokzidiose bei Geflüg/.'■-. sowie eine Erhöhung der Futterverwertung von wiederkäuenden Tieren, die eine entwickelte wiederkäuend? Funktion haben, wobei man solchen Tieren eine Propionat-erhöhende Menge des Metaboliten A-27106 verabreicht

Kokzidiose ist ein bekanntes Protozoenleidsn, das von einer Infektion durch eine oder mehrere Arten von Eimeria oder Isospora (siehe Lund and Farr in »Diseases of Poultry«, 5. Auflage, Biester and Schwarte, Eds., Iowa State University Press, Ames, Ia., Seiten 1056 -1096, herrührt Wegen der großen wirtschaftlichen Verluste durch Kokzidiose und der Schwierigkeiten bei der Anwendung einiger bekannter Mittel gegen Kokzidiose besteht immer noch ein Bedarf nach besseren Mitteln gegen Kokzidiose.

Wiederkäuer sind wirtschaftlich wichtige Tiere, und eine Erhöhung der Futterverwertung ist daher stets sehr erwünscht. Der Mechanismus der Verarbeitung des überwiegenden Nähranteils (Kohlenhydrate) von Wiederkäuerfutter ist bekannt. Mikroorganismen im Pansen des Tieres fermentieren Kohlehydrate unter Bildung von Monosacchariden und bauen dies«! Monosaccharide dann zu Pyranverbindungen ab. Die Pyruvate werden durch mikrobiologische Verfahren metabolisiert, wodurch Acetate, Butyrate oder Propionate entstehen, die man kollektiv als flüchtige Fettsäuren (VFA) bezeichnet.

Der durch Verwendung der flüchtigen Fettsäuren gegebene günstige Einfluß wurde bereits von McCullough, Feedstuffs, 19. Juni 1971, Seite 19; Eskeland et al., J. An. Sei. 33,282 (1971); sowie Church et al., »Digestive Physiology and Nutrition of Ruminats«, Band 2,1971, Seiten 622 und 625 diskutiert. Es werden zwar auch Acetate und Butyrate verwendet, der Einsatz von Propionaten ist jedoch im Vergleich dazu wirksamer. Falls zu wenig Propionat vorhanden ist, dann kann sich bei den Tieren darüber hinaus eine Ketosis entwickeln. Ein entsprechend günstiges Mittel sollte bei den Tieren daher eine Bildung von Propionaten aus Kohlehydraten anregen, wodurch die Kohlenhydrate besser ausgenützt werden und sich gleichzeitig der Befall an Ketosis verringert.

Monensin, aus dem der Metabolit A-27106 hergestellt werdtn kann, ist in US-PS 35 01 568 als Faktor A eines antibiotischen Komplexes A3823 beschrieben. Monensin ist ebenfalls ein Mittel gegen Kokzidiose.

Das erfindungsgemäße biologisch wirksame Mittel wird willkürlich als Metabolit A-27106 bezeichnet. Der Auauiutk Ä-27106 bezieht sieh dabei auf das Natriumsalz. Weitere Salze sind die Ammonium-, Lithium-, Kalium-, Rubidium und Cäsiumsa'ze, und auch die Säureform ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Ein Ausgangsmaterial zur Herstellung des Metaboliten A-27106 ist Monensin, dessen Natriumsalz folgende Formel I hat:

CH₃

CH₃

B O Na⁺ O E

/ OH CH₃ HOCH₂

50

60 65

Monensin in Form seines Natriumsatoes wird durch Streptomyces cinnamonensis gebildet, wie dies in US-PS 35 01 568 beschrieben ist.

Der Metabolit A-27106 entsteht entweder aus Monensin oder der Mycelkultur, in der Monensin gebildet wird, in Gegenwart von Glucose durch ein Enzym oder durch Enzyme, die durch einen neuen Stamm von Streptomyces candidus gebildet werden. Eine Kultur dieses neuen Stammes wurde ohne Beschränkung über ihre Verfügbarkeit bei der ständigen Kultursammluiig der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 hinterlegt, und zwar dort unter der Nr. NRRL 5449.

Wegen der Unsicherheit taxomischer Studien bei Organismen der Gruppe Streptomyces gibt es bei der KJassifikation eines neuentdeckten Organismus immer ein gewisses Moment der Unsicherheit. In den wichtigsten Eigenschaften scheint der Organismus NRRL 5449, der Monensin zum Metaboliten A-27106 umwandelt, jedoch Streptomyces candidus (Krassilnikov) Waksman 1953 am ähnlichsten zu sein. Die Art der Kultur wurde von S. A. Waksman in »The Actinomycetes«, Band II, Williams and Wilkins, Baltimore, 1961, Satz 187, beschrieben. Der vorliegende Organismus wird als neuer Stamm des beschriebenen Organismus angesehen. Obwohl S. candidus NRRL 5449 und der bekannte Stamm einander in der allgemeinen Mycelmorphologie und Farbe sowie im Aussehen der Sporen ähmeln, gibt es zwischen ihnen noch genügend Unterschiedlichkeiten, die die Bezeichnung des vorliegenden Organismus als neuen Stamm erforderlich machen. So bringt der publizierte Organismus beispielsweise Milch nicht iiurn Gerinnen, und er verflüssigt auch Gelatine nur langsam, während der neue Stamm nach 14 Tagen geronnene Milch bildet und Gelatine innerhalb von 21 Tagen nicht verflüssigt. Am wichtigsten ist jedoch, daß eine aus dem bekannten Stamm vermehrte Kulturprobe Monensin nicht zu Metaboiit Α-27Ί06 umwandelt.

Der Organismus, der Monensin zum Metaboliten A-27106 umwandelt, wurde aus einer am Berg Ararat in der Türkei gesammelten Bodenprobe isoliert.

Die taxonomischen Studien über S. candidus NRRL 5449 erfolgen nach den vom International Cooperative Project for Description and Deposition of Streptomycetes empfohlenen Methoden sowie nach den von Shirling und Gottlieb, »Methods für Characterization of Streptomyces Species«, International Bulletin of Systematic Bacteriology 16,313-340(1966) beschriebenen Verfahren, und z>?ar zusammen mit anderen ergänzenden Untersuchungen. Die am Anfang stehende Abkürzung »ICP« bezieht sich dabei auf Medien, wie sie von Shirling und Gottlieb beschrieben werden. Die restlichen Medien sind in der bereits angeführten Literatur von Waksman beschrieben. Die Zuordnung der Farbnamen erfolgt nach Kelly and Judd in »The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names«, U.S. Department of Commerce Circular 553,1955. Die in eckigen Klammern angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Farbskala von Tresner and Backus, nämlich »System of Color Wheels für Streptomyces Taxonomy«, Appl. Microbiol. 11, 335 (1963). Die Farbstreifenbestimmungen sind unterstrichen, und die Farbblöcke nach Maerz and Paul (»Dictionary of Color«, MacGraw-Hill, N.Y., 1950) sind in Klammern angegeben.

Die Sireptomycete NRRL 5449 ist gekennzeichnet durch gerade bis wellenartige Sporophoren und ovale bis

leicht zylindrische Sporen, die im Mittel 1,165 α xO,57 μ groß sind, und zwar in Ketten von 10 bis 50. Die Sporen sind elektronenmikroskopischer Beobachtungen zufolge glatt. Luftmycelien sind normalerweise weiß. Bei 26°C kommt es nur zu einem vegetativen Wachsen, und bei 45⁰C tritt überhaupt kein Wachsen auf. Zu maximalem Wachstum und maximaler Sporulation kommt es bei 30 bis 37°C.

Einer allgemeinen Praxis folgend wird das Wachsen des Mikroorganismus NRRL 5449 auf einer Reihe von Medien untersucht, die bei der Untersuchung der Actinomycetes anerkannt sind.

Die Kulturverfahren sind einheitlich und stellen Standardmethoden dar. Die verwendeten Medien und die beobachteten Kulturcharakteristiken sind wie folgt:

Gutes Wachsen, fahlgelb [1 ICl], keine Luftmycelien oder Sporen, kein lösliches Pigment.

Reichliches Wachsen, hellgelb [10J3], reichlich Luftmycelien und Sporen, (W) weiß a, kein lösliches Pigment.

Gutes Wachsen, fahlgelbgrün [lOCl], gut Luftmycelien und Sporen, (W) weiß a, kein lösliches Pigment.

Gutes bis reichliches Wachsen, mittelmäßig gelb [10H4], gut bis reichlich Luftmycelien und Sporen, (W) weiß a, braunes lösliches Pigment.

Reichliches Wachsen, mittelmäßig orangegelb [1016], reichlich Luftmycelien und Sporen, (Y) fahlgelb 2db, leicht braunes lösliches Pigment.

Gutes Wachsen, fahlgelbgrün [1OB Ij, gut Luftmycelien und Sporen, (W) weiß a, kein lösliches Pigment.

Glycerin-Glycin

Reichliches Wachsen, mittelbraun [11J4], reiche Sporulation und Luftmycelien, (W) weiß a und (Y) fahlgelb 2db, leicht hellbraunes lösliches Pigment.

Emer3on

Reichliches Wachsen, gräulich gelb [12H3J. keine Luftmycelien oder Sporen, kein lösliches Pigment.

Bennett

Gutes Wachsen, hellgelb [1112], spärliche Luftmycelien und Sporen, (W) weiß a, kein lösliches Pigment. 5

Czap»k

Reichliches Wachsen, mittelmäßig orangegelb [11J7J, reichlich Luftmycelien und Sporen, (W) weiß a, kein lösliches Pigment.

Glucose-Asparagin

Leidliches bis gutes Wachsen, fahlgelbgrün [10Bl], keine Luftmycelien oder Sporen, kein lösliches Pigment.

Calciummalat 15

Reichliches Wachsen, gräulich gelb [ 11E4], reichlich Luftmycelien und Sporen, (Y) fahlgelb 2ba, hellbraunes lösliches Pigment.

Nähragar

Gutes Wachsien, fahlgelbgrün [lOCl], keine Luftmycelien oder Sporen, kein lösliches Pigment. 20

Der Organismus wird hinsichtlich ausgewählter physiologischer Eigenschaften nach Standardverfahren untersucht. Die beobachteten Eigenschaften und hierfür gefundenen Charakteristiken sind wie folgt:

Beobachtete Eigenschaft Charakteristik

Wirkung auf entmhmte Milch Aufklaren, Gerinnung nach 14 Tagen

Ni'-.atreduktion positiv ³⁰

Melaninproduktion

Tryptonhefeextraktbrühe schwach

Tyrosinagar keine

Gelatineverflüssijsung keine nach 21 Tagen ³⁵

Temperaturerfordernisse 26=C - nur vegetatives Wachsen

30-37⁰C - gutes vegetatives Wachsen, gut Luftmyce-

lien und Sporen

43-55°C - kein Wachsen '°

Im folgenden w srden die Ergebnisse der Untersuchung des Kohleverbrauchs für den Organismus NRRL 5449 angeführt. Zur Kennzeichnung eines Wachsens werden folgende Symbole verwendet:

⁴⁵ + = Verbrauch - gutes Wachsen

[+] = möglicher Verbrauch - gutes bis leidliches Wachsen

[-] = fraglicher Verbrauch - schwaches oder überhaupt kein Wachsen

= kein Verbrauch - kein Wachsen 50

KohlenstoRquelle Beurteilung

des Wachsens

55

Raffinose +

D-Fructose [+]

Cellobiose [+]

L-Arabinose [+J ₆₀

D-Mannit [+]

Rhamnose [+]

Cellulose

Dextrose [+] bis [-]

D-Xy!ose [+]

Inosit +

-C (kein Kohlenhydrat) [-] bis [+]

Zum Wachsenlassen von S. candidus NRRL 5449 läßt sich irgendein Kulturmedium verwenden. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit, einer optimalen Ausbeute und einer leichten lujlierung des Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Bevorzugte Kohlehydratquellen für eine großtechnische Fermentation sind daher beispielsweise Invertzucker oder Maissirup, es lassen sich jedoch auch Glucose, Fructose, Maltose, Stärke, Inosit und dergleichen verwenden. Möchte man Monensin in den Metaboliten A-27106 in einer Fermentationsbrühe gleichzeitig mit dem Wachsen von S. candidus NRRL 5449 umwandeln, dann muß das Medium für eine ausreichende Umwandlung auch eine Glucosequelle enthalten. Läßt man S. candidus NRRL 5449 dagegen nur zur Bildung seines Enzymsystems wachsen, das man später zur Umwandlung von Monensin in den Metaboliten A-27 ICu verwendet, dann braucht Glucose während der Fermentation nicht unbedingt vorhanden zu sein.

ίο Bevorzugte StickstoiTquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl, Aminosäuregemische und dergleichen. Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien beigegeben werden können, gehören die üblicherweise löslichen Salze, die Eisen-, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen liefern. Essentielle Spurenelemente, die für das Wachsen und die Entwicklung des Organismus notwendig sind, soll ten ebenfalls im Kulturmedium vorhanden sein. Solche Spurenelemente kommen normalerweise als Verunrei nigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die für das Wachsen des Organismus ausreichen.

Der Ausgangs-pH-Wert des Kulturmediums läßt sich variieren. Vor einer Beimpfung mit dem Organismus sollte der pH-Wert des Kulturmediums zweckmäßigerweise jedoch auf etwa pH 5.7 bis etwa 7.5 eingestellt wer den, und zwar je nach dem jeweils verwendeten Medium. Wie bei anderen Actinomyceten wird das Medium auch im vorliegenden Fall mit fortschreitender Fermentation allmählich stärker alkalisch und kann von einem Ausgangs-pH-Wert von etwa pH 5,9 während der Wachstumsperiode des Organismus auf einen Wert von etwa pH 6,9 oder darüber ansteigen. Der End-pH-Wert wird zumindest teilweise durch den Ausgangs-pH-Wert des Mediums, die im Medium vorhandenen Puffer sowie die Zeitdauer, während der man den Organismus wachsen läßt, gesteuert. Der pH-Wert läßt sich zwar auch durch Zusatz einer Säure oder einer Base einstellen, zu guten Ergebnissen gelangt man jedoch ohne Einstellung des pH-Wertes.

Genauso wie andere Streptomyces-Stämme, so muß man auch den Organismus NRRL 5449 unter aeroben Bedingungen wachsen lassen. Eine Vermehrung bzw. ein Wachsen in kleinem Maßstab wird zweckmäßigerweise auf Schrägagar oder Agarplatten, in Schüttelflaschen oder Kolben vorgenommen. Für eine großtechnische Pro duktion bevorzugt man eine submerse aerobe Kultur in großen Tanks.

Das in einem sterilen Tank befindliche Fermentationsmedium kann man zum Starten der Fermentation mit einer sponilierten Suspension beimpfen. Da eine Beimpfung mit einer sporulierten Suspension ein Wachsen verzögert, bevorzugt man jedoch ein vegetatives Inokulum. Das vegetative Inokulum wird hergestellt, indem man ein kleines Volumen Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelfragmenten des Organismus be impft, um so zu einer frischen, aktiv wachsenden Kultur des Organismus zu gelangen. Das vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank übertragen. Zum Wachsen des vegetativen Inokulums läßt sich das gleiche

Medium verwenden wie später für die großtechnische Herstellung, man kann jedoch auch mit verschiedenen Medien arbeiten. Der Organismus S. candidus NRRL 5449 wächst in einem Temperaturbereich zwischen etwa 26⁰C und etwa

40⁰C. Zu maximalem Wachsen und maximaler Sporulation kommt es jedoch zwischen etwa 32 und etwa 37⁰C. Wie bei aeroben Submerskulturverfahren üblich, bläst man auch im vorliegenden Fall während der Fermentation durch das Kulturrwdium sterile Luft. Für ein ausreichendes Wachsen des Organismus und eine entsprechende Produktion an Metaboiit A-27106 sollte das bei einer großtechnischen Produktion der Substanz verwendete Luftvolumen über etwa 0,1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kulturmedium liegen. Optimale Ergeb- nisse hält man mit einem Luftvolumen von zumindest einem Drittel bis einem halben Volumen Luft pro Minute und pro Volumen Kulturmedium.

Die zur Umwandlung von Monensin in den Metaboliten A 27106 benötigte Fermentationszeit schwankt. Für die Umwandlung von Monensin in den Metaboliten A-27106 muß eine ausreichende Menge an Glucose vorhanden sein. Hat man genügend Glucose vsrfügbar und sind etwa 0,1 bis 1,0 g Monensin pro Liter Medium vorhan- den, dann verläuft die Umwandlung von Monensin zum Metaboliten Α-27ΊΟ6 praktisch vollständig innerhalb etwa 36 bis 72 Stunden. Eine optimale Umwandlung erfolgt in Gegenwart einer Monensinmenge von etwa 0,5 bis 0,7 Gramm pro Liter Medium. Eine ausreichende Menge Glucose liegt zwischen etwa 2,0 und etwa 2,5 Gewichtsprozent Glucose, auf das Gewicht des Mediums bezogen. Zur Überprüfung der jeweiligen Glucosekonzentration lassen sich entsprechende Glucosetestpapierstreifen verwenden. Fällt der Glucosegehalt auf unter etwa 2% ab, dann sollte man zur Aufrechterhaltung optimaler Konzentrationsspiegel Glucose zusetzen.

Verwendet man das Enzymsystem S. candidus für die Umwandlung von Monensin in den Metaboliten A-27106, dann muß die Enzymzubereitung nicht hochrein sein. Eine filtrierte Fermentationsbrühe kann man daher beispielsweise lyophilisieren und zumindest zwei Wochen lagern, bevor man sie mit einem wäßrigen Puffer wieder auffrischen muß, wozu man etwa ¹A des Volumens der ursprünglichen Brühe verwendet. Eine ausrei- chende Umwandlung erhält man nach etwa 72 Stunden, wenn man 2,5 g einer so lyophilisierten Zubereitung in Gegenwart von 25 mg Monensin wieder aufbereitet

Das aktive Enzymsystem ist sowohl in der filtrierten Brühe als auch den Zellen vorhanden. Eine Enzymzubereitung größerer Reinheit läßt sich aus den abgetrennten Fermentationszellen herstellen. Diese Zellen lassen sich in eingefrorenem Zustand wenigstens drei Monate lang lagern. Die aufgetauten Zellen kann man dann wie der zum Leben erwecken, indem man sie in einer Pufferlösung suspendiert. Die Pufferauspeniion IiSt «ich wei ter reinigen durch Beachallcn und Zentrifugieren. DIc so abgetrennten gereinigten ZellbruetutÜckc werden dann in einem Puffer resuspendiert und dialysiert. Unter Anwendung dieses Verfahrens erhält man aus 200 g Zellen aus dem Fermentationsmedium so viel gereinigtes Dialysat, das man dadurch Glucose u&i 25 mg

Monensin zum Metaboliten A-27106 umwandeln kann.

Das Fortschreiten der Umwandlung läßt sich dünnschichtchromatographisch verfolgen. Auf Silicagel (F-254) in Benzol/Metanol (7 : 3) beträgt der Rf-Wert für Monensin 0,62, und der Rf-Wert für den Metaboliten A-27106 liegt demgegenüber bei 0,49. Zur Detektion läßt sich ein Vanillin-Sprühreagens verwenden. Dieses Reagens wird hergestellt, indem man rauchende Salpetersäure (2 ml) zu einer Lösung von Vanillin (3 g) in absolutem Äthanol (100 ml) gibt.

Der Metabolit A-27106 ist sowohl in der Kulturbrühe als auch im Mycel vorhanden. Entsprechende Techniken zur Isolierung des Metaboliten A-27106 müssen daher so ausgelegt sein, daß sie eine maximale Gewinnung des Produkts aus beiden oben genannten Medien erlauben. Hierzu wird das Fermentationsmedium beispielsweise filtriert, worauf man sowohl das Filtrat als auch den Mycelkuchen mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert, um so zum Metaboliten A-27106 zu gelangen. Aus den zur Extraktion verwendeten Lösungsmitteln läßt sich das gewünschte Produkt anhand üblicher Verfahren gewinnen.

Wahlweise kann man die in der Kultur enthaltenen Feststoffe, unter Einschluß der Bestandteile des Mediums und des Mycels, als Quelle für den Metaboliten A-27106 verwenden, wobei man jedoch vorher das Wasser aus dem Mycel und dem Kulturmedium abtrennt. Das Kulturmedium läßt sich hierzu beispielsweise durch Lyophilisieren trocknen und mit einem Futter vermischen. Die Feststoffe lassen sich ferner ohne eine totale Wasserentfernung zu einem dünnen Schlamm verarbeiten, den man zu feuchtem Mengfutter und ähnlichen Futtermitteln zusetzen kann.

Ein Eiüzci-r.xifukiioris-isöiäiiünii-Verfahren ist nicht notwendig. Das Filtrieren des fertigen Kulturmediums mittels einer Filterhilfe reicht bereits aus. Der Filterkuchen läßt sich mit einem polaren Lösungsmittel, wie Methanol, «,strahieren. Der Methanolextrakt wird eingeengt und dann zu dem ursprünglichen wäßrigen Filtrat gegeben. Die so erhaltene vereinigte Lösung extrahiert man zweimal mit dem halben Volumen Chloroform. Die Chloroformextrakte werden unter Vakuum zu einem dunklen bernsteinfarbenen Öl eingeengt.

Das so erhaltene Ö! entfärbt main in einer mit Aktivkohle gefüllten Säule, und zwar unter Verwendung von Chloroform und etwa 20 g Aktivkohle pro Gramm Öl. Das Eluat wird erneut unter Vakuum eingeengt, wodurch man ein fahlgelbes bis farbloses Öl erhält. Dieses Öl löst man in der minimal erforderlichen Menge Chloroform und Chromatographien die Lösung dann auf einer Silicagelsäule, und zwar unter Verwendung von Äthylacetat als Lösungsmittel. Die Elution wird dünnschichtchromatographisch überwacht. Die Elution mit Äthylacetat-Methanol-Gemisch ergibt den Metaboliten A-27106.

Der Metabolit A-27106 (Natriumsalz) ist ein weißer kristalliner Feststoff, der unter Blasenbildung bei etwa 170 bis 175°C schmilzt. Der Metabolit A-27106 scheint sehr leicht ein Hydrat oder ein sonstiges Solvat zu bilden. Liegt der Metabolit A-27106 in hydratisierter oder solvatisierter Form vor, dann ändert sich auch sein Schmelzpunkt, und diese Verbindung schmilzt dann allgemein einige Grad unter dem oben angegebenen Wert.

Die Elementaranalyse des Metaboliten A-27106 ergibt folgende prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff 58,78, Wasserstoff 8,51, Sauerstoff 27,85 und Natrium 3,63. Diese Werte stimmen mit einer empirischen Formel C₄₂H₇)O₁₆Na überein, die folgende theoretische Zusammensetzung in Prozent hat: Kohlenstoff 59,00, Wasserstoff 8 37 Sauerstoff 29 94 und Natrium 2 42.

Der Metabolit A-27106 weist praktisch keine Ultraviolettabsorption oberhalb etwa 235 μΐη auf.

Das Infrarotspektrum des Metaboliten A-27106 in Chloroform kann der anliegende ι Zeichnung entnommen werden. Die unterscheidbaren Absorptionsmaxima des Spektrums sind wie folgt: 3,1,3,36,6,39,6,82,7,1,7,25, 7,9 (Schulter), 8,1,8,3,8,67,8,8 (Schulter), 9,04,9,22,9,51,9,66,10,03,10,26,10,66,11,23,11,47,11,83 und 12,15.

Das Massenspektrum des Metaboliten A-27106 zeigt folgenden Molekularionenpeak und die ferner angegebene Charakteristik.

m/e
berechnet

854,445230 836,45229 779,45490 761,44540

gefunden

854,44630 836,44129 779,44690 761,447740

Fragment

C₄₂H₇₁O₁₆Na
(M⁺)

C₄₂H₆₉O₁₅Na

(M⁺-H₂O)

C₄₀H₆₈O₁₃Na

(M⁺-[CH₃O + CO₂])

C₄₀H₆₆O₁₂Na

(M⁺-[CH₃O + CO₂ + H₂O])

Die obigen Werte bestätigen die angegebene empirische Formel und ein Molekulargewicht von 854 für das Natriumsalz des Metaboliten A-27106.

Im allgemeinen ist der Metabolit A-27106 leicht löslich in hochpolaren Lösungsmitteln, unlöslich in nichtpolaren Lösungsmitteln und verschiedenartig löslich in Lösungsmitteln mittlerer Polarität So löst sich A-27106 beispielsweise in niederen aliphatischen Alkoholen und teilweise in Phenol, Diäthyläther und Aceton, und er ist verhältnismäßig unlöslich in flüssigen niederen Alkanen.

Eine elektrometrische Titration des Metaboliten A-27106 in der Säureform in Wasser bei einem AusgangspH-Wert von 8 zeigt das Vorhandensein einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 7,2.

Die oben beschriebene Mononatriumform ist im allgemeinen die natürliche Form des Metaboliten A-27106. Die Säure läßt sich aus diesem Natriumsalz ohne weiteres herstellen. Aus der Säure lassen sich das Ammonium- und sonstige Alkalisalze herstellen. Die verschiedenen Metallformen verhalten sich etwa ähnlich wie Alkalicarboxylate und Chelate.

Zur Herstellung einer anderen Form wird der Metabolit A-27106 (die Natriumform) in einem wäßrigen Lösungsmittel, wie Methanol/Wasser, gelöst Die erhaltene Lösung versetzt man dann mit einer Säure, beispielsweise Salzsäure, um den pH-Wert auf 5 oder darunter zu erniedrigen. Sodann wird das Methanol unter Vakuum abgezogen, und das erhaltene wäßrige saure Produkt extrahiert man mit Chloroform. Der Chlorofonnextrakt wird getrocknet und zur freien Säureform eingedampft.

Die so erhaltene Säureform des Metaboliten A-27106 kann als solche verwendet werden, oder sie läßt sich weiter modifizieren, indem man sie mit einem wäßrigen Alkalihydroxid oder mit wäßrigem Ammoniak titriert, um auf diese Weise die entsprechenden Lithium-, Kalium-, Rubidium-, Cäsium- oder Ammoniumsalze herzustellen. Die Säure-, Ammonium- oder Alkaliformen des Metaboliten A-27106 sind alle biologisch aktiv.

Die exakte Struktur des Metaboliten A-27106 ist nicht bekannt. Man weiß, daß zur Umwandlung von Monensin zum Metaboliten A-27106 Glucose erforderlich ist und verbraucht wird, und zwar sogar in Abwesenheit metabolisierender Zellen von S. candidus. Das Molekulargewicht von A-27106 entspricht dem eines Glucosylmonensins.

Außer der in hohem Maß behinderten tertiären Hydroxylgruppe am Ring E müßten fünf Hydroxylstellen an einem Glucosylmonensin vorhanden sein, die sich einzeln oder insgesamt unter Bildung eines einfachen Esters, wie eines Acetats, verestern lassen sollten. Die Gegenwart all dieser fünf reaktionsfähigen Stellen ergibt sich durch Veresterungsversuche.

Aufgrund der oben angeführten physikalischen Eigenschaften läßt sich für den Metaboliten A-27106 folgende Struktur der Formel II vorschlagen:

O Na⁺ O E

CH₃
OH

O — (Glucose)

Nachdem die Struktur nur postuliert wird, sollte die oben angegebene Struktur selbstverständlich nur eine Arbeitshypothese bilden.

Der Metabolit A-27106 ist weniger toxisch als Monensin. Nach intraperitonealer Verabreichung des Metaboliten A-27106 an Gruppen aus jeweils 6 Mäusen verendet bei einer Dosierung von 50 mg/kg von sechs Mäusen jeweils ein Tier, und bei einer Verabreichung von 100 mg/kg verenden von sechs Tieren jeweils drei.

Bei ähnlichen Versuchen führt eine intraperitoneale Verabreichung von Monensin an Gruppen aus jeweils 6 Mäusen eine Dosis von 10 mg/kg zum Tod von einer Maus aus jeweils sechs Mäusen, und bei einer Dosis von 20 mg/kg zum Tod von drei Mäusen von insgesamt sechs.

Zur Verhinderung oder Behandlung von Kokzidiose beim Geflügel wird den Tieren eine nicht-toxische kokzidiostatische Menge an Metabolit A-27106 verabreicht, und zwar vorzugsweise oral auf täglicher Basis. Zur Bestimmung der geeigneten Konzentration an A-27106 muß man zwar eine Reihe von Faktoren beachten, die zu verabreichende Menge liegt jedoch im allgemeinen zwischen 0,005 und 0,05 Gewichtsprozent, bezogen aul nicht mit Wirkstoff versetztes Futter, und sie beträgt vorzugsweise zwischen 0,01 und 0,04 Gewichtsprozent. Dei Metabolit A-27106 kann in verschiedener Weise verabreicht werden, am einfachsten wird er jedoch mit einem physiologisch unbedenklichen Träger zugeführt, vorzugsweise mit dem den Tieren verabreichten Futter.

Der Metabolit A-27106 verbessert ferner die Futterausnützung bei Wiederkäuern, deren Pansenfunktion entwickelt ist. Junge Wiederkäuer, praktisch alle noch nicht entwöhnten Tiere, stellen monogastrische Tiere dar Sobald junge Wiederkäuer mit dem Fressen festen Futters beginnen, beginnt sich die Pansenfunktion zu entwik kein, und die mikrobiologische Population des Pansens erhöht sich. Nachdem das Tier eine gewinne Zeit feste: Futter gefressen hat, ist seine Pansenfunktion voll entwickelt und bleibt während des ganzen Tierlebens erhal ten. Einige wirtschaftlich wichtige Wiederkäuer sind Rinder, Schafe und Ziegen.

Der MeUbolit A-27106 erhöht die Futterausnutzung, wenn man ihn oral an Wiederkäuer in Mengen zwischer

etwa 0,05 mg/kg/Tag bis zu etwa 2,5 mg/kg/Tag verabreicht Die günstigsten Ergebnisse erhält man mit Mengen zwischen etwa 0,1 mg/kg/Tag und etwa 1,5 mg/kg/Tag. Ein bevorzugtes Verabreichungsverfahren für den Metaboliten A-27106 besteht darin, daß man ihn mit dem Tierfutter vermischt Der Metabolit A-27106 kann jedoch auch in anderer Form verabreicht werden, beispielsweise in Form von Tabletten, Tränken, BoIi oder Kapseln. Eine Formulierung dieser verschiedenen Dosierungsformen läßt sich nach in der Tierpharmazie üblichen Ver- 5 fahren erreichen. Jede einzelne Dosierungseinheit sollte eine solche Menge Metabolit A-27106 enthalten, daß sich dadurch direkt die geeignete Tagesdosis für das zu behandelnde Tier ergibt Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert

Beispiel 1 Herstellung von A-27106 aus Monensin über S. candidus

S. candidus NRRL 5449 läßt man auf aus Bennett Medium hergestelltem Schrägagar wachsen, wodurch man eine gut definierte Kolonie erhält Die Kolonie wird entfernt und mit sterilem deionisiertem Wasser (10 ml) auf- 15 geschlämmt.

Die oben erhaltene Aufschlämmung verteilt man auf vier 500-ml-Schüttelflaschen, die jeweils 100 ml vegetatives Medium folgender Zusammensetzung enthalten:

BisUndteile Menge Mais distillers' solubles 25,0 g

Lactose 10,0 g 25

Maltose 10,0 g

FeSO₄ · 7H₂O 0,01 g

MgSO₄ ■ 7H₂O 2,0 g

ICH₂PO₄ 2,0 g

CaCO₃ 2,0 g 30

deionisiertes Wasser bis zu 1,1 Liter

Dk; vier beimpften Flaschen werden bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute 24 Stunden lang inkubiert. Das so erhaltene vegetative Medium (10-ml-Anteile) verwendet man zum Beimpfen von insgesamt 15 Schüttelflaschen (500 ml), die 100 ml sterilisiertes Fermentationsmedium folgender 35 Zusammensetzung enthalten:

Bestandteile Menge

40

Rinderextrakt 5 g Casein-Fankreas-Hydrolysat-Pepton 5 g

NaCl 5 g

Glycerin 15 g 45

CaCO₃ 2 g

deionisiertes Wasser bis zu 1 Liter

Das Medium hat einen pH-Wert von 7,2, der nicht eingestellt ist. Das beimpfte Medium wird 72 Stunden wie oben beschrieben inkubiert. 50

In einem Fermenter mit 40 Liter Fassungsvermögen stellt man ein Produktionsmedium folgender Zusammensetzung her:

Bestandteile	Menge
Polysiloxane^ (Antischaummittel)	5g
Glycerin	375 g
Dextrose	625 g
Casein-Pancreas-Hydrolysat-Pepton	125 g
Rinderextrakt	125 g
NaCl	125 g
CaCO.,	50 g
deionisiertes Wasser	bis zu 24 Liter

Der ursprüngliche pH-Wert des Mediums beträgt 7,0. Das Medium wird dann durch Behandeln im Autoklaven bei 120⁰C während 30 Minuten bei einem Druck von 1,05 bis 1,41 bar/cm² sterilisiert. Nach der Sterilisation liegt der pH-Wert des Mediums bei 7,6.

Gereinigtes Monensin (25 g) löst man in Äthanol (200 ml) und gibt die erhaltene Lösung zu dem sterilisierten Medium, worauf man das aus der zweiten Stufe erhaltene, wie oben beschrieben hergestellte vegetative Inokulum (700 ml) zugibt

Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 Liter pro Minute belüftet und mit üblichem Rühren bei einer Rührgeschwindigkeit von 420 Umdrehungen pro Minute ,gerührt. Das beimpfte Medium züchtet man etwa 114,5 Stunden bei 30⁰C.

ίο Der Verlauf der Fermentation wird durch Dunnschichtchromatographie über Silicagel wie oben beschrieben verfolgt Im ersten Stadium der Fermentation ist nur Monensin vorhanden. Schrittweise zeigt dann ein zweiter Fleck die Gegenwart des Metaboliten A-27106 an, und am Ende sieht man nurmehr den Fleck für den Metaboliten A-27106.

Beispiel 2
Isolierung und Reinigung von A-27106

Die gemäß Beispiel 1 hergestellte Fermentationsbrühe wird unter Verwendung einer Filterhilfe filtriert. Den Mycelkuchen extrahiert man mit Methanol (etwa 5 Liter) bei Raumtemperatur. Der Methanolextrakt wird filtriert, worauf jnan das Filtrat unter Vakuum einengt das Methanol entfernt und so ein wäßriges Konzentrat erhält

Dieses wäßrige Konzentrat vereinigt man mit dem ursprünglichen Brühenfiltrat Die vereinigte Lösung (etwa 22 Liter) wird zweimal mit je 0,5 Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und unter Vakuum auf etwa 400 ml eines dunkel-bernsteinfarbenen Öls eingeengt.

Dieses Öl löst man in Chloroform, entfernt es in eineir mit 10 kg Aktivkohle (Pittsburg »12 x 40«) gefüllten Säule, die man mit Chloroform (etwa 5 Liter) eluiert. Das Chloroformeluat wird unter Vakuum eingedampft, wodurch man etwa 500 ml eines farblosen bis fahlgelben Öls erhält.

Das entfärbte Öl wird in einer minimalen Menge Chloroform aufgenommen, und man chromatographiert das Ganze dann in einer 25-kg-Säule aus Silicagel (Grace, Sorte 62) in Äthylacetat Die Eluierung wird dünnschichtchromatographisch wie oben beschrieben überwacht. Nach Entfernung der Verunreinigungen mit Äthylacetat eluiert man den Metaboliten A-27106 mit Äthylacetat-Methanol (19 :1) von der Säule. Die das A-27106 enthaltenden Fraktionen werden vereit: gt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man ein amorphes, fast weißes Produkt erhält. Das Produkt wird mit Hexan gewaschen und getrocknet, und man erhält so etwa 12,84 g Metabolit A-27106 (der iru Dünnschichtchromatogramm einen einzigen Fleck ergibt).

Beispiel 3
Herstellung von A-27106 über S. cinnamonensis und S. candidus

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung des Metaboliten A-27106 in einer Fermenterkultui wird wie folgt durchgeführt:

Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 läßt man in üblicher Weise in 55 ml Medium in einer 250-ml-Schüttelflasche und unter 47stündiger Bebrütung zu einem vegetativen Inokulum wachsen (siehe US-PS 35 01 568). Dieses vegetative Inokulum wird zu 220 ml eines in einer 1-Liter-Schüttelflasche befindlichen Mediums gegeben und 21 Stunden inkubiert, wodurch man das Saatinokulum für den Fermenter erhält.

Das so hergestellte Inokulum verwendet man als Einsaat für einen 40-Liter-Fermenter, der ein hitzesterilisiertes Medium folgender Zusammensetzung enthält:

Bestandteile Menge

j| Glucose 750,0 g

|| 55 Sojabohnenmehl 625,0 g

|$ Sojabohnenö! 500,0 g

'' Methyloleat 500,0 g

; ·; Polysiloxanöl (Antischaummittel) 5,0 g

Kaliumchlorid 2,5 g

iv 60 Dikaliumhydrogenphosphat 2,5 g

ρ Manganchloridtetrahydrat 15,0 g

$ wasserhaltiges Eisensulfat 7,5 g

% Calciumcarbonat 25,0 g

•5 deionisiertes Wasser bis zu 24 Liter

g; Das erhaltene Medium hat einen pH-Wert von 5,5, den man durch Zusatz von 1On Kaliumhydroxid (15 ml) auf

p\ pH 8,9 einstellt. Das inokulierte Medium inkubiert man 234 Stunden bei 32⁰C.

'=!-■ Nach 42 Stunden erhöht man die Belüftung von 9,9 Liter pro Minute aus 22,6 Liter pro Minute (0,35 auf

ίο

0,8 cubic feet) und die Ruhrgeschwindigkeit von 500 auf 700 Umdrehungen pro Minute. Nach 210 Stunden ist die Monensinbildung praktisch abgeschlossen, wie sich durch einen Dünnschichtbioversuch mit Bacillus subti-Hs ATCC 6633 als Detektionsorganismus ergibt

Nach 234 Stunden pasteurisiert man den Inhalt des Fermenters zum Inaktivieren von S. cinnamonensis. Der Fermenter wird dann mit den folgenden Nährstoffen versetzt:

Bestandteile Menge

Dextrose 750 g

Sojabohnenmehl 625 g

Manganchloridtetrahydrat 155 g

Calciumcarbonat 12,5 g

Eisensulfathexahydrat 7,5 g

Kaliumchlorid 2,5 g

Dikaliumhydrogenphosphat 2,5 g

Methyloleat - 250 ml

Sojabohnenöl 250 ml

deionisiertes Wasser bis zu 24 Liter

Sodann stellt man des pH-Wert durch Zugabe von 215 ml 5 η Natriumhydroxid auf pH 8,0 Ct-a und sterilisiert das Medium. Das Medium wird dann mit ',iner rasch wachsenden vegetativen Kultur von Strept&jiyces candidus NRRL 5449 beimpft und 137 Stunden bei 30⁰C bebrütet. Die Fermentation wird mit steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 9,9 Liter pro Minute belüftet. Das Fermentationsmedium rührt man mit üblichen ?.ührern, und zwar zuerst bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 120 Umdrehungen pro Minute, wobei man nach 16 Stunden auf 420 Umdrehungen pro Minute und nach 46 Stunden auf 500 Umdrehungen pro Minute geht. Nach 44,66,5,89,97,113 und 127 Stunden wird jeweils Dextrose (400 g) zugegeben. Ein Zusatz von Calciumcarbonat (175 g) erfolgt jeweils nach 72 und 99 Stunden.

Die Fermentation wird wie oben beschrieben dünnschichtchromatographisch überwacht. Nach 137 Stunden ist die Bildung des Metaboliten A-27106 praktisch beendet Die Aufarbeitung und Reinigung von A-27106 erfolgt nach der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise.

Beispiel 4
Herstellung von A-27106 durch eine körnige Enzympräparation von S. candidus

S. candidus NRRL 5449 läßt man wie in Beispiel 1 beschrieben in einem 100-Liter-Ansatz wachsen. Die Zellen werden durch Vakuumfiltration aus dem Fermentationsmedium abgetrennt, in jeweils 200 g Teilmengen aufgeteilt und zum Lagern eingefroren. Zwei dieser Teilmengen taut man bei Raumtemperatur auf und suspendiert sie in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 5,8) auf ein Endvolumen von 600 ml. Die so erhaltene Zellsuspension beschallt man 30 Minuten, und das nach Beschallung erhalten: Produkt wird 30 Minuten bei 10 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die erhaltenen Zellbruchstücke werden in 100 ml des oben erwähnten Puffers suspendiert. Die Suspension dialysiert man 18 Stunden mit 5 Liter abgeschrecktem Puffer der oben erwähnten Art. 50 ml des stückigen Dialysats versetzt man mit D-Glucose (120 mg) und Monensin (25 mg) in Äthanol (2 ml). Das Reaktionsgemisch wird 72 Stunden bei 30⁰C gerührt und dann filtriert. Das Filtrat extrahiert man mit Chloroform (100 ml). Der Chicroformextrakt wird unter Vakuum eingeengt, und das Konzentrat chromatographiert man auf einer Silicagelsäule (10 g). Nach Eluieren mit Äthylacetat erhält man nur eine Spur Monensin. Durch Eluieren mit Äthylacetat-Methanol (19: 1) erhält man 17 mg Metabolit A-27106, der mit dem gemäß Beispiel 2 erhaltenen Produkt identisch ist.

Beispiel 5
Steuerung von Kokzidiose mit dem Metaboliten A-27106

Für diese Untersuchung verwendet man 75 eine Woche alte, gesunde, in einem Brutkasten und einer Batttrie aufgezogene gekreuzte männliche Hühnchen vom Typ schwerer Brathühnchen. Die Hühnchen werden in fünf Gruppen mit jeweils 15 Tieren aufgeteilt, die man wiederum in drei Untergruppen mit je 5 Hühnchen aufteilt. Jede Untergruppe wird ohne Kontakt mit den anderen Untergruppen gehalten. Eine erste Gruppe hält man unter günstigen Bedingungen als Gesundheitsvergleich für unbehandelte Tiere. Eine zweite Gruppe wird wie die erste Gruppe behandelt, man beimpft sie jedoch mit Kokzidiose durch orale Verabreichung einer Dosis, die 10⁵ sponserte Oozyten von Eimeria tenella enthält. Die dritten, vierten und fünften Tiergruppen bebandelt man wie die zweite Gruppe, wobei man abweichend davon jedoch 24 Stunden vor der genannten 3?:impfung ihr Futter durch Zugabe von Metabolit A-27106 in Konzentrationen von 100, 150 und 200 ppm modifiziert

Sieben Tage nach Inokulation werden die Hühnchen gewogen, getötet und auf Anzeichen kokzidioser Schädigungen untersucht. Die kokzidiose Schädigung beurteilt man nach einer wihkürlichsn Skala zwischen 0 und 4. Die entsprechenden Schädigungszahlen geben die Tierzahl für jeden Wert an. Die Zahl »0« bedeutet, daß keine Schädigung durch Kof jzidiose erfolgt. Die Zahl »1« besagt, daß es sich dabei um die geringste, feststellbare Kokzidioseschädijgung handelt. Mit der Zahl »2« wird eine mittelmäßige Schädigung bezeichnet, mit nur geringer

oder überhaupt keiner Blutung und keinen ernsten Gewebeschäden. Die Zahl »3« bedeutet keine Blutung, die aus dem Caecum herausquillt und eine starke Gewebeschädigung. Der Wert »4« gibt eine Blutung an, die mit einem caecalen Kern an geronnenem Blut und zerstörten Epithelzellen. Tiere, die mit dem Wert »4« oder darunter beurteilt werden, können sich normalerweise wieder erholen, wenn sie nicht weiter mit Kokzidien infiziert werden.
Nach dem oben beschriebenen Verfahren gelangt man zu folgenden Ergebnissen:

10

15

20

30

35

Tier	Mit E. tenella	Metabolit	Mittlere	Beurteilung der Schädigung
gruppe	beimpft	A-27106	Gewichts
		(ppm)	zunahme	0 12 3 4
		im Futter	pro Tier
			mg

nein

ja

ja

ja

ja

100

ι cn

200

162 67

157 ι en

15	0	0	0	0
0	0	0	0	15
4	1	0	3	7
1		1	1	7

Die mit Wirkstoff behandelten Hühnchen mit hohen Schädigungswerten enthalten im Kot nur wenig oder überhaupt kein Blut und scheinen in guter Verfassung zu sein. Ihre gute Gewichtszunahme wird als vielsagender angesehen als die Schädigungswerte.

Nachdem Untersuchungen daraufhindeuten, daß der Metabolit A-27106 normalerweise E. tenella beim ersten Versuch eines Ausbreitens in der Wirtszelle tötet, bevorzugt man eine prophylaktische Behandlungsart.

Andere Untersuchungen mit dem Metaboliten A-27106 zeigen, «laß dieser von den Tieren besser vertragen wird und ferner weniger toxisch ist als Monensin.

Eine Reihe anderer Untersuchungen wird mit Metabolit A-27106 durchgeführt, und zwar sowohl allein als auch in Kombination mit Monensin. Diese Untersuchungen führen zu dem Ergebnis, daß A-27106 zwar keine größeren Gewichtszunahmen bei 0,04% ergibt als bei einer Dosierung von0,0i%, die höhere Dosis jedoch weniger caecale Schädigungen zur Folge hat. Bei der höheren Dosis zeigen sich keinerlei toxische Einflüsse.

Innerhalb des allgemeinen Wirksamkeitsbereiches ergibt eine kombinierte Verabreichung von Monensin und Metabolit A-27106 im Futter zumindest eine zusätzliche Wirksamkeit, jedoch keine Toxizitätserhöhung. Die Toxizität der Kombination ist niedriger als diejenige von Monensin allein, und zwar bei einer Dosis, die den kombinierten Einzeldosen entspricht.

40

45

50

55

Beispiel 6
Mit A-27106 modifiziertes Hühnchenfutter zur Steuerung von Kokzidiose

Zur Herstellung eines ausgewogenen, energiereichen Futtermittels, mit dem man Hühnchen unter rascher Gewichtszunahme füttern kann, geht man von folgenden Bestandteilen aus:

Bestandteile % kg

vermahlener gelber Mais

Sojabohnenmehl, mit Lösungsmittel extrahiert,

von den Hüllen befreit, fein vermählen, 50% Protein

Tierfett (Rindertalg)

getrocknetes Fischmehl mit solubles (60% Protein)

Distillers' solubles aus Mais

Dicalciumphosphat, für Futterzwecke

Cakiumcarbonat

Vitaminvorgemisch

(Vitamine A, D, E, K, und B₁₂,

Cholin, Hiacin, Pantothensäure,

Riboflavin, Biotin mit Glucose

als Füllstoff) Spurenmineralvorgemisch

(MnSO₄, ZnO, KJ, FeSO₄, CaCO₃) 2-Amino-2-hydroxybuttersäure (Hydroxyanalog von Methionin) Metabolit A-27106

50	454
31,08	281,7
6,5	59,0
5.0	45,4
4,0	36,3
1.8	16,3
C,8	7,26
0,5	4,54

0,2	1,81
0.1	0,907
0,02	0,181

12

Die oben angeführten Substanzen werden nach in der Futtermittelherstellung üblichen Techniken miteinander vermischt. Die mit einem solchen Futter gefutterten Hühnchen, denen man Wasser ad libitum gibt, sind gegen Kokzidiosc geschützt. Die damit erhaltenen Gewichtszunahmen sind vergleichbar mit denjenigen von kokzidiosefreien Hühnchen, denen man ein ähnliches, nicht mit Wirkstoff versetztes Futtermittel verfuttert.

Beispiel 7 Verbesserung der Futterverwertung durch A-27106

Zunächst gewinnt man Pansenflüssigkeit von einem Ochsen, und zwar mittels einer operativ in den Pansen eingelegten Fistula. Der Ochse wird mit einem stark getreidehaltigen Futter gefüttert, das folgende Zusammensetzung hat:

69,95%	grob gemahlener Mais
10%	vermählen« Maiskolben
8%	Sojabohnenmehl (50% Protein)
5%	Alfalfamehl
5%	Melasse
0,6%	1 » * _ rt* naiiiHUii
0,5%	Dicalciumphosphat
0,5%	Calciumcarbonat
0,3%	Salz
0,07%	Vitamin A und D2 Vorgemisch1)
0,05%	Vitamin E Vorgemisch')
0,03%	Spurenmincralvorgemisch3)

') Gehalt pro 454 g: 2 000 000 I.E. Vitamin A; 227 200 I.E. Vitamin D₂ und 385,7 g Sojabohnenfutter mit 1% Ölzusatz.

²) Distillers' solubles getrockneter Maiskörner, die 20 000 I.E. d-alpha-Tocopherylacetat pro 454 g enthalten.

³) Gehalt an Manganoxid, Kaliumiodid, Cobaltcarbonat, Kupferoxid und Zinksulfat.

30

E.iie Probe von Pansenflüssigkeit wird durch vier Schichten eines Seihtuchs gepreßt, und das Filtrat sammelt

man. Der vom Seihtuch zurückgehaltene körnige Rückstand wird in einer ausreichenden Menge eines physiolo- ;|

gischen Puffers resuspendiert, um ihn wieder auf das ursprüngliche Volumen der Pansenflüssigkeit zu bringen, vi

und diese Suspension wird erneut abgeseiht. Der verwendete Puffer hat folgende Zusammensetzung: j

35 %

g/Liter Bestandteile 4i

0,316 Na₂HPO₄

0,152 KH₂PO₄

2,260 NaHCO₃ ⁴^

0,375 KCl

0,375 NaCl

0,112 MgSO₄

0,038 CaCl₂

0,008 FeSO₄ ■ 7H₂O

0,004 MnSO₄

0,004 ZnSO₄ · 7H₂O

0,002 CuSO₄ · 5H₂O

0,001 CaCl₂

nach der Beschreibung von Cheng et al. in J. Dairy Sei. 38, 1225, (1955).

Die zwei Filtrate werden vereinigt, und man läßt sie so lange stehen, bis sich auf der Oberseite stückiges Material abscheidet. Die klare Schicht wird abgetrennt, mit dem gleichen Puffer (1:1) verdünnt, und dann auf pH 7,0 eingestellt.

Die verdünnte Pansenflüssigkeit gibt man in einen 25-ml-Kolben, und zwar zusammen mit 40 mg des oben beschriebenen Futters, weiteren 5 mg Sojabohnenprotein und der zu untersuchenden Verbindung. Jede Behandlung wird mit vier Kolben wiederholt Zum Vergleich werden auch zwei Ansätze mit je 4 Vergleichskolben durchgeführt Es wird ein Vergleich bei der Zeit Null und ein weiterer Vergleich nach lostündiger Bebrütung durchgeführt Alle Testkolben werden 16 Stunden bei 38°C bebrütet. Nach der Bebrütung mißt man den pH-Wert und versetzt jeden Kolben mit 25% Metaphosphorsäure (2 ml). Die Proben läßt man absetzen, und die überstehende Flüssigkeit wird gaschromatographisch auf Propionat-, Acetat- und Butyratverbindungen untersucht Durch aktive Verbindungen wird die Propionatproduktion gegenüber derjenigen der Vergleiche ziemlich stark erhöht.

Die mit der zu untersuchenden Verbindung erhaltenen Ergebnisse werden statistisch mit den Vergleichsergebnissen verglichen. Der folgenden Tabelle kann das Verhältnis der Konzentrationen an flüchtigen Fsttsäu- ren (VFA) in den mit Metabolit A-27106 behandelten Kolben gegenüber den Konzentrationen in den Vergleichskolben entnommen werden.

"β mg A-27106/ml verdünn- Propionat Butyrat Gesamtmenge

j| ter Pansenflüssigkeit an VFA

% 5 2,15 0,73 1,03

\i 1 1,42 0,96 0,98

fJ 0.7 1,02 0,91 1,07

ίί Beispiele

υ Mit A-27106 verbessertes Mastviehfutter

t„; Ein ausgewogenes Mastviehfutter mit hohem Korngehalt wird wie folgt hergestellt:

15 .[| Bestandteile Prozent kg pro Tonne

2Q i^uigciiiaiiiciici iviaia υ / ,ο 6/5

100 50 99,56

mit ϊ.ηςιιησ«ιτ»ϊτίι»1 p.Ytrahiprt S(W« Protein

Zuckerrohrmelasse 5 5

6 0,44

* α *·* 4VU4VI WIUWIlVJUUU^f AVtAAUItVIUHAt)A-TTVWVW V}^ J

5 3 0,3

IC T IMllllllI ΓΎ UUU J_/J ^T Wl ßSlHlOwli } V₁V/ \J^'

0,5 1,5

') Gehalt pro 454 g: 2 000 000 I.E. Vitamin A; 227 200 I.E. Vitamin D₂ und 385,7 g Sojabohnenfutter mit 1% Ölzusatz. 40 ²) Distillers' solubles getrockneter Maiskörner, die 20 000 I.E. d-alpha-Tocopherylacetat pro 454 g enthalten.

Das Futtergemisch w?rd zu Pellets verpreßt. Bei einer mittleren täglichen Verdauungsmenge von etwa 6,8 kg Futter pro Tier liefert dieses Futter etwa 300 mg A-27106 pro Tier und Tag.

Beispiel 9
Säureform des Metaboliten A-27106

Metabolit A-27106 (100 mg), hergestellt als Natriumform gemäß Beispiel 1 und 2, wird in 100 ml Methanol/ 50 Wasser (1:1) gelöst Die erhaltene Lösung titriert man durch tropfenweisen Zusatz von 1 η Salzsäure auf pH 3. Sodann wird das Methanol unter Vakuum abgezogen.

Die Lösung extrahiert man hierauf zweimal mit Chloroform (jeweils 100 ml). Der Chloroformextrakt wird getrocknet (MgSO₄) und unter Vakuum eingedampft, wodurch man 85 mg der Säureform des Metaboliten A-27106 erhält

55 Die Säureform von A-27106 ist ein weißer amorpher Feststoff, dessen Molekulargewicht etwa 832 beträgt. Die biologische Aktivität der Säureform entspricht etwa derjenigen der Natriumfonn.

60 Beispiel 10

Cäsiumform des Metaboliten A-27106

Die Säureform des Metaboliten A-27106 (97,3 mg), hergestellt nach Beispiel 9, wird in 100 ml Methanol/Wasser (1:1) gelöst Die erhaltene Lösung titriert man durch tropfenweise Zugabe von 1 η Cäsiumhydroxid auf 65 pH 7,1. Das Methanol wird dann unter Vakuum abgezoger. Die so erhaltene Lösung extrahiert man zweimal mit gleichen Volumina Chloroform. Der Chloroformextrakt wird getrocknet (MgSO₄) und unter Vakuum eingedampft, wodurch man einen weißen amorphen Feststoff erhält. Die Elementaranalyse zeigt die Gegenwart von etwa IVA Metall.

leingemahlener Mais	ö7,8
vermahlene Maiskolben	10
entwässertes Alfalfamehl, 17% Protein	5
von den Hüllen befreites Sojabohnenmehl,	9,956
mit Lösungsmittel extrahiert, 50% Protein
Zuckerrohrmelasse	5
Harnstoff	0,6
Metabolit A-27106	0,044
Dicalciumphosphat, für Fütterungszwecke	0,5
Calciumcarbonat	0,5
Natriumchlorid	0,3
Spurenmineralvorgemisch	0,03
Vitamin A und D2 Vorgemisch1)	0,07
Vitamin E Vorgemisch2)	0,05
Calciumpropionat	0,15

Beispiel 11 Lithiumform des Metaboliten A-27106

Die Arbeitsweise von Beispiel 10 wird wiederholt, wobei man anstelle von Cäsiumhydroxid jedoch Lithiumhydroxid verwendet. Die hierbei erhaltene Liihiumform von A-27106 stellt einen weißen Feststoff dar der eine 5 gewisse Kristallordnung aufweist, jedoch in der Röntgenstrahlenbeugung kein sauberes Muster ergibt.

Beispiel 12 Ammoniumform des Metaboliten A-27106 10

Das Verfahren von Beispiel 10 wird wiederholt, wobei man abweichend davon anstelle von Cäsiumhydroxid jedoch Ammoniumhydroxid verwendet und so zur Ammoniumform des Metaboliten A-27106 gelangt. Dieses Produkt hat die allgemeinen Eigenschaften und Fähigkeiten der anderen Formen.

15

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

15

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Metabolit A-27106 und seine Säure-, Ammonium-, Lithium-, Kalium-, Rubidium- oder Cäsiumformen, wobei dieser Metabolit (Na-salz) ein weißer kristalliner Feststoff ist, sich verhältnismäBig gut in niederen Alkanolen löst, im allgemeinen jedoch unlöslich ist in niederen Alkanen und folgende weitere Eigenschaften hat:

a) ein Molekulargewicht von 854, und zwar massenspektrometrisch bestimmt,

b) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 58,78% Kohlenstoff, 841% Wasserstoff, 27,85% Sauerstoff und 3,63% Natrium,

c) eine empirische Formel C₄₂H₇₁O₁₆Na, entsprechend der Strukturformel

CH₃ OH

Ö — (Gluer«)