DE1929355C3 - Thiopeptin-Antibiotika und deren Verwendung in Futtermittelzusätzen - Google Patents
Thiopeptin-Antibiotika und deren Verwendung in FuttermittelzusätzenInfo
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Description
ein Molekulargewicht von 1637, bestimmt nach der Dampfdruckmethode, woraus sich die folgende
angenäherte Summenformel errechnen läßt
20
K)
einen Schmelz- oder Zersetzungspunkt zwischen etwa 223 und etwa 226° C,
eine optische Drehung [oc] 'J von —71° (c= 1, in Chloroform),
eine optische Drehung [oc] 'J von —71° (c= 1, in Chloroform),
einen Rf-Wert von 0,78 in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform und Methanol im
Volumenverhältnis 10 :1,
ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß F i g. 2,
ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum gemäß F i g. 5,
ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß F i g. 2,
ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum gemäß F i g. 5,
eine Löslichkeit in Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform und
3 η Salzsäure, eine geringe Löslichkeit in Methanol, Aceton und Äthylacetat und eine
Unlöslichkeit in Äther, Benzol, n-Hexan, Petroläther und Wasser und
eine Aminosäurezusammensetzung bei Hydrolyse mit 6 η Salzsäure bei 110°C während 24 jr>
Stunden, bezogen auf 2 Mol Alanin, von 0,93 Mol Threonin, 1,01 Mol Valin und 0,91 Mol
Cystein.
2. Antibiotikum Thiopeptin Aj, eine schwach gelbe
kristalline Substanz, gekennzeichnet durch
eine Elementaranalyse mit folgenden Werten: C 48,45; H 5,11; N 14,46; S 12,09%,
ein Molekulargewicht von 1972, bestimmt nach der Dampfdruckmethode, woraus sich die
folgende angenäherte Summenformel errechnen läßt:
C79 80H100-101N20-21O24-25S7-8
3»
einen Schmelz- oder Zerselzungspunkt zwischen etwa 232°C und etwa 236°C,
eine optische Drehung [α] % von - 10,8° (c= 1, in Chloroform),
eine optische Drehung [α] % von - 10,8° (c= 1, in Chloroform),
einen Rf-Wert von 0,60 in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform und Methanol im
Volumenverhältnis 10:1,
ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß F i g. 3,
ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß F i g. 3,
ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum
gemäß F i g. 6,
eine Löslichkeit in Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform und
3 η Salzsäure, eine geringe Löslichkeit in Methanol, Aceton und Äthylacetat und eine
Unlöslichkeit in Äther, Benzol, n-Hexan, Petroläther und Wasser und
eine Aminosäurezusammensetzung bei Hydrolyse mit 6 η Salzsäure bei 110°C wahrend 24 Stunden, bezogen auf 2 Mol Alanin, von 0,94 Mol Threonin, 1,01 Mol Valin und 0,98 Mol Cystein.
eine Aminosäurezusammensetzung bei Hydrolyse mit 6 η Salzsäure bei 110°C wahrend 24 Stunden, bezogen auf 2 Mol Alanin, von 0,94 Mol Threonin, 1,01 Mol Valin und 0,98 Mol Cystein.
3. Antibiotikum Thiopeptin B, eine schwach gelbe kristalline Substanz, gekennzeichnet durch
eine Elementaranalyse mit folgenden Werten: C 48,73; H 4,87; N 14,30; S 11,04%,
ein Molekulargewicht von 1942, bestimmt nach der Dampfdruckmethode, woraus sich die folgende
angenäherte Summenformel errechnen läßt:
einen Schmelz- oder Zersetzungspunkt zwischen etwa 219°C und etwa 222°C,
eine optische Drehung \pi\" von —80° (c= 1, in Chloroform),
eine optische Drehung \pi\" von —80° (c= 1, in Chloroform),
einen Rf-Wert von 0,!9 in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform und Methanol im
Volumenverhältnis 10 :1,
ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß F i g. 4,
ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum gemäß F i g. 7,
ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß F i g. 4,
ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum gemäß F i g. 7,
eine Löslichkeit in Dioxan, Dimelhylsulfoxid,
Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform und 3 η Salzsäure, eine geringe Löslichkeit in
Methanol, Aceton und Äthylacetat und eine Unlöslichkeit in Äther, Benzol, n-Hexan,
Petroläther und Wasser und
eine Aminosäurezusammensetzung bei Hydrolyse mit 6 η Salzsäure bei 110°C während 24 Stunden, bezogen auf 2 Mol Alanin, von 0,99 Mol Threonin, 1,03 Mol Valin und 0,97 Mol Cystein.
eine Aminosäurezusammensetzung bei Hydrolyse mit 6 η Salzsäure bei 110°C während 24 Stunden, bezogen auf 2 Mol Alanin, von 0,99 Mol Threonin, 1,03 Mol Valin und 0,97 Mol Cystein.
4. Thiopeptinantibiolikakomplex, erhältlich durch Kultivieren von Streptomyces tateyamensis ATCC
21389 in einem üblichen Nährmedium und Extrahierung des durch Filtration der Kullurbrühe erhaltenen
Mycelkuchens mit Aceton.
5. Thiopeptin-Mycelkuchen, er.hältlich durch Kultivieren von Streptomyces tateyamensis ATCC
21389 in einem üblichen Nährmedium und Filtration der Kulturbrühe.
6. Verwendung von Antibiotika Thiopeptin Ai, Thiopeptin A3, Thiopeptin B, von Thiopeptin Antibiotika-Komplex
und/oder von Thiopeplin-Mycelkuchen in Futtermittelzusätzen.
Die Erfindung betrifft die neuen Antibiotika Thiopeptin Ai, Thiopeptin A3, Thiopeptin B, einen
neuen Thiopeptin-Antibiotika-Komplex und einen neuen Thiopeptin-Mycelkuchen mit einer antibakteriellen
Aktivität gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen sowie deren Verwendung in Futtermittelzusätzen.
Es sind bereits zahlreiche Antibiotika im Handel, die als Futtermittelzusätze verwendet werden, z. B.
Flavomycin, Tylosin, Siomycin und Thiostrepton, von denen Flavomycin eines der bekanntesten ist.
Weitere Antibiotika, die als Futtermittelzusätze verwendet werden, sind Peptiomycin, Sulfomycin, Thermothiocin
und Sporangiomycin (vgl. »The Journal
of Antibiotics«, Band XXIII (1970), S. 113-119).
Voraussetzung für die Eignung eines Antibiotikums ais Futtermittelzusatz ist jedoch ein ausgeprägter Effekt
auf die Gewichtszunahme des Tieres, dem es verabreicht wird, während es gleichzeitig nicht in der Humanmedizin
verwendet werden darf, keine Kreuzresistenzprobleme bestehen sollen und das Antibiotikum vom
Magen- und Darmtrakt kaum oder überhaupt nicht resorbiert werden darf. Diese Kombination von Eigen- '
schäften wird jedoch von keinem der bisher auf dem Markt befindlichen Antibiotika erfüllt. So weist beispielsweise
Flavomycin nur eine unzureichende Aktivität gegenüber Mycoplasma, das für Geflügel und
Schweine pathogen ist, auf, während Tylosin zwar eine ausreichende Aktivität gegenüber Mycoplasma besitzt,
bei seiner Verwendung treten jedoch Kreuzresistenzprobleme gegenüber anderen Antibiotika, wie z. B.
Erythromycin, auf, während beispielsweise Siomycin und Thiostrepton bei ihrer Verwendung als Futterzusatz
einen derart geringen Effekt ergeben, d?ß sie in der
Praxis nicht eingesetzt werden. Andere der obengenannten Antibiotika haben wiederum den Nachteil,
daß sie vom Magen- und Darmtrakt des Tieres, dem sie verabreicht werden, in unerwünschter Weise resorbiert
werden, so daß im Fleisch und in den Organen des 2ϊ
geschlachteten Tieres unzulässig hohe Rückstände an diesen Antibiotika enthalten sind.
Aufgabe der Erfindung war es daher, neue, als Futtermittelzusatz
verwendbare Antibiotika zu entwickeln, welche die Nachteile der bisher bekannten Antibiotika jo
nicht besitzen und die Forderungen, die an ihre Eigenschaften gestellt werden, besser erfüllen als die bisher in
der Praxis eingesetzten Antibiotika.
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe gelöst werden kann mit den Antibiotika Thiopeptin Ai. Ai und π
B sowie dem entsprechenden Thiopeptin-Antibiotika-Komplex und Thiopeptin-Mycelkuchen, wie sie in den
vorstehenden Patentansprüchen 1 bis 5 charakterisiert sind.
Die erfindungbgemäßen Antibiotika, nachfolgend der w
Einfachheil halber als »Thiopeptin(e)« bezeichnet, werden gebildet von einem neuen Mikroorganismus der
Gattung Streptomyces tateyamensis, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die in Tateyama, Toyama
Prefecture, Japan, entnommen wurde. Das erfindungsgemäße Thiopeptin wird durch Kultivieren dieses
Mikroorganismus Streptomyces tateyamensis ATCC 21389 (Proben der hinterlegten Kultur können nach
Maßgabe der gellenden Rechtsvorschriften von der Hinterlegungsstelle bezogen werden) in einem üblichen w
Nährmedium gewonnen und in Futtermiüelzusätzen verwendet. Es bietet gegenüber den bisher verwendeten
bekannten Antibiotika die folgenden Vorteile: es treten keine Kreuzresistenzprobleme gegenüber anderen
Antibiotika auf, es wird vom Magen- und Darmtrakt des ri5
Tieres, dem es verabreicht, kaum oder überhaupt nicht resorbiert und es weist eine deutlich verbesserte
Aktivität gegenüber Mycoplasma, das insbesondere für Geflügel und Schweine pathogen ist, auf. Es ruft bei den
Tieren, denen es als Zusatz zu den Futterrationen beigemischt wird, ein wesentlich beschleunigtes
Wachstum hervor, ohne daß irgendwelche unerwünschten Nebeneffekte bei diesen Tieren auftreten. Darüber
hinaus wird es innerhalb kurzer Zeit nach der Verabreichung praktisch vollständig von den Tieren wieder f>5
ausgeschieden, so daß die Resorption durch den Magen- und Darmtrakt minimal ist. Ferner bewirken sie, daß das
Futter, dem sie zugesetzt werden, wesentlich besser ausgenutzt wird als bei Verwendung der bekannten
Futtermiuelzusätze.
Die Morphologie einer Streplomyces tateyamensis-Kultur
wurde mikroskopisch auf Bennet's-Agar beobachtet Dabei zeigte sich, daß die Mycelfäden dieser
Kultur dick und gerade sind und Büschel bilden. Das Konidium mit der glatten Oberfläche ist verhältnismäßig
groß und länglich-rund. Es sind aber auch einige rechteckige Konidien zu beobachten.
Streptomyces tateyamensis ATCC 21389 hat die
folgenden Kulturmerkmale, wenn es auf den nachfolgend genannten Medien 10 bis 14 Tage lang bei 50°C
wachsen gelassen wird. Lediglich bei der Gelatinestichkultur wurde eine Ausnahme hinsichtlich des
Wachstums gemacht, in dem die Beobachtung nach 20tägiger Aufbewahrung bei Zimmertemperatur durchgeführt
wurde.
Czapek's Agar:
schwache ; Wachstum, farblos; kein Luftmycel; kein lösliches \ igment
Stärke-Ammonium-Agar:
reichliches Wachstum, gelblich-braun am Rand, weiß im Zentrum; Luftmycel, dick, bräunlich-weiß,
pulverig, kein lösliches Pigment.
Bemerkung: Die Stärke wird lebhaft hydrolysiert.
Bemerkung: Die Stärke wird lebhaft hydrolysiert.
Glucose-Asparagin-Agar:
flaches Wachstum, dunkelbraun; Luftmycel, sich ausbreitend, weiß, pulverförmig; kein lösliches
Pigment.
Calciummalat-Agar:
flaches Wachstum, schwach braun; Luftmycel, weiß, pulverförmig; kein lösliches Pigment.
Tyrosin-Agar:
schwaches braunes Wachstum; Luftmycel, sich ausbreitend, schwach bräunlich-weiß, pulverförmig;
kein lösliches Pigment.
Bouillon-Agar:
schlechtes Wachstum, farblos; kein Luftmycei; kein lösliches Pigment.
Bennett's Agar:
schwaches braunes Wachstum; Luftmycel, schwach gräulich-weiß, pulverförmig, sich ausbreitend; kein
lösliches Pigment.
Bemerkung: Ziemlich schlechtes Wachstum bei 37°C.
Gelatinestich:
schwaches Wachstum; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment.
Bemerkung: Geringe Verflüssigung.
Bemerkung: Geringe Verflüssigung.
Glucose-Czapek's Lösung:
kleine weiße Kolonien ausgefällt; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment.
Bemerkung: Keine Nitrite werden gebildet.
Glucose-Bouillon:
schwache graue Kolonien wachsen auf der Oberfläche; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment.
Bemerkung: Der pH-Wert wechselt leicht zum sauren Bereich.
Bemerkung: Der pH-Wert wechselt leicht zum sauren Bereich.
Milch:
schwache graue Kolonien wachsen auf dei Oberfläche; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment.
Bemerkung: Peptonisation und Koagulation negativ.
Bemerkung: Peptonisation und Koagulation negativ.
Kartoffelplug:
schwaches braunes Wachstum, runzelig; kein Luftmycel;
kein lösliches Pigment.
Cellulose:
kein Wachstum.
Die Kohlenstoffverwendung von Streptomyces lateyamensis wurde nach der von Pridham und Gottlieb
beschriebenen Methode bestimmt. In der nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse des Kohlenstoffverwendungs-Versuchs
wiedergegeben. Die darin zur Bezeichnung des Wachstums angewandten Symbole haben
die folgenden Bedeutungen:
( + ) = wahrscheinlich Verwendung
( —) = Verwendung fraglich
( —) = Verwendung fraglich
Tabelle I | ( + ) |
Kohlenstoff Verwendungs-Übersicht | ( + ) |
tateyamensis | (-) |
Arabinose | ( + ) |
Fructose | (_) |
Glucose | (_) |
Inosit | (_) |
Lactose | (_) |
Mannit | (-) |
Mannose | ( + ) |
Raffinose | (-) |
Rhamnose | (-) |
Salicin | |
Sucrose | |
Trehalose | |
Xylose | |
für Streptomyces
Hinsichtlich der Herstellung von Thiopeptin sei darauf hingewiesen, daß dieses nicht nur aus Streptomyces
tateyamensis, sondern auch aus Mutanten, die durch Mutationsmittel, wie Röntgenstrahlen, Ultraviolett-Bestrahlung,
Behandlung mit Phagen und Stickstofflost, auj> diesem Mikroorganismus erhalten werden
können, gewonnen werden kann.
Thiopeptin kann durch Züchtung von Streptomyces tateyamensis in einem wäßrigen Nährmedium unter
submersen aeroben Bedingungen erzeugt werden. Das zur Züchtung von Streptomaces tateyamensis brauchbare
Nährmedium zur Herstellung von Thiopeptin enthält sowohl eine Kohlenstoffquelie, beispielsweise
ein assimilierbares Kohlehydrat, als auch eine Stickstoffquelle, beispielsweise eine assimilierbare Stickstoffverbindung
oder ein proteinhaltiges Material. Beispiele für brauchbare Kohlenstoffquellen sind Stärke,
Glucose. Sucrose und Glycerin. Beispiele für brauchbare Stickstoffquellen sind Fleischextrakt, Pepton, Glutinmehl,
Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, trockene Hefe. Hefeextrakt, Ammoniumsulfat,
Natriumnitrat, Casaminosäure und Harnstoff. Es können auch Kombinationen dieser Kohlenstoff-
und/oder Stickstoffquellen in vorteilhafter Weise verwendet werden. Anorganische Salze, die zur Bildung
von Ionen befähigt sind, wie Kalium. Natrium. Calcium. Phosphat und Sulfat, können dem Kulturmedium zugesetzt
werden. Spurenelemente, wie Magnesium, Mangan. Zink und Eisen, können ebenfalls dem Kulturmedium
zugefügt werden. Derartige Spurenmetalle können als Verunreinigungen beiläufig mit der Zugabe
der Bestandteile des Mediums geliefert werden. Es ist deshalb darauf hinzuweisen, daß die Zugabe von solchen
Spurenmetallen oder anorganischen Salzen effektiv erfolgt, wenn der das Antibiotikum produzierende
Mikroorganismus sie als Komponente des Kulturmediums benötigt, Vitamine, wie Inosit, Vitamin B12,
Isoascorbinsäure und Biotin, können dem für die Züchtung verwendeten Medium ebenfalls zugesetzt
werden.
Zur Gewinnung einer möglichst hohen Ausbeute an
Zur Gewinnung einer möglichst hohen Ausbeute an
to Thiopeptin aus dem vorstehend beschriebenen Medium ist die Verwendung von Schwefelverbindungen organischer
oder anorganischer Art bevorzugt. Beispiele für solche Schwefelverbindungen sind N-Acetyl-DL-methionin.
Methionin, 2-Naphlhol-6,8-disulfonsäure. Natriumsulfosalicylat, Natriumcetylsulfat, Taurin, Thionin,
Methylorange und Natriumsulfat. Die bevorzugten Schwefelverbindungen sind N-Acelyl-DL-methionin
und Natriumsulfat Aus wirtschaftlichen Gründen wird jedoch Natriumsulfat bevorzugt verwendet.
Optimale Ausbeuten an Thiopeptin werden erhalten, wenn die Züchtung bei einer Temperatur durchgeführt
wird, die ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus zur Folge hat und zwischen etwa 24"C und
etwa 37°C. vorzugsweise zwischen etwa 27°C und etwa
r> 32°C, liegt wobei die Züchtungsdauer etwa 2 bis etwa 6
Tage beträgt.
Nachdem die Züchtung durchgeführt worden ist kann eine Vielzahl von Verfahren zur Isolierung unu
Reinigung von Thiopeptin angewendet werden. Geeignete Verfahren sind beispielsweise die Lösungsmittelextraktion,
die Chromatographie und die Kristallisation aus Lösungsmitteln.
Nach einem bevorzugten Gewinnungsverfahren wird das Thiopeptin aus der gesamten Fermentationsbrühe
dadurch gewonnen, daß der Mycelkuchen nach konventionellen Verfahren, z. B. durch Filtration oder
Zentrifugieren, abgetrennt und dann einer Extraktion mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels,
wie Aceton oder Methanol, unterworfen wird.
4(i Aceton ist das bevorzugte Extraktions-Lösungsmittel.
Der erhaltene Extrakt kann nach üblichen Verfahren konzentriert werden, wobei ein Rückstand erhalten
wird, der wiederum einer Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat
oder Chloroform unterworfen wird. Eine unreine kristalline Masse von Thiopeptin kann dadurch erhalten
werden, daß der erhaltene Extrakt zu einem Rückstand konzentriert wird, der dann auf Zimmertemperatur abgekühlt
wird. Die unreine kristalline Masse von Thiopeptin kann auch dadurch erhalten werden, daß der
erhaltene Extrakt zu einem Rückstand konzentriert wird, der dann wiederum in einem organischen Lösungsmittel
wie n-Hexan oder Petroiather gelost wird,
um dann eine Fällung zu bewirken.
Es sei darauf hingewiesen, daß Thiopeptin ein Komplex ist der aus einem Hauptfaktor und zwei
Nebenfaktoren besteht Die Bestimmung wurde durch Analyse mittels Dünnschicht-Chromatographie der
unreinen kristallinen Thiopeptinmasse durchgeführt
bo wobei als Entwicklungsmittel ein Lösungsmittelsystem
aus Chloroform und Methanol (10 :1 bezogen auf das Volumen) verwendet wurde. Von den drei Komponenten
wurden willkürlich die zwei Nebenkomponenten als Thiopeptin Ai und Thiopeptin A3 und die Hauptes
komponente als Thiopeptin B bezeichnet Aus dieser Dünnschicht-Chromatogramm-Analyse, die in F i g. 1
wiedergegeben ist wurden die Rf-Werte der drei Faktoren wie folgt bestimmt:
Rf-Werte der Thiopeptin-Komponenten
Komponenten
Rf-Werte
Thiopeptin Ai
Thiopeptin A3
Thiopeptin B
Thiopeptin A3
Thiopeptin B
0,78
0,60
0,19
0,60
0,19
Diese den Thiopeptinantibiotika-Komplex bildenden Komponenten können dadurch voneinander getrennt
werden, daß die unreine kristalline Zubereitung, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, in einem geeigneten
organischen Lösungsmittel wie Chloroform gelöst und die Lösung dann der Kolonnenchromatographie
mit einem geeigneten organischen Lösungsmiltelsyslem unterworfen wird, wobei Chloroform und
Methanol bevorzugt verwendet werden. Die drei Komponenten können in Form der Felder der drei
absorbierten Bänder identifiziert werden, die in der Silica-Gel-Kolonne erscheinen. Die Isolierung der
beiden Thiopeptin Α-Komponenten kann unter Verwendung von Chloroform und Methanol in einem
Volumenverhältnis von etwa 20 :1 bis etwa 50 :1 durchgeführt
werden. Um die zwei Thiopeptin A-Komponenten voneinander zu trennen, ist eine Änderung des
Lösungsmittelsystems nicht erforderlich. Die Komponenten können dabei in die einzelnen Thiopeptin-Komponenten
aufgetrennt werden, indem die erscheinenden Bänder kontinuierlich unter Verwendung
des gleichen Lösungsmittelsystems entwickelt werden. Nach der Eluierung der Thiopeptin A-Komponenien
kann eine Änderung des Volumenverhältnisses des genannten Lösungsmittelsystems zur Eluierung der
Thiopeptin B-Komponente führen. Das bevorzugte Volumenverhältnis liegt bei etwa 4:1 bis etwa 9:1.
Obwohl, wie oben angegeben wurde, die zuerst erfolgende Eluierung der zwei Thiopeptin A-Komponenten
bevorzugt durchgeführt wird, ist auch eine Umkehrung der Eluierungs-Reihenfolge möglich.
Die beiden Thiopeptin Α-Komponenten können voneinander dadu' --h getrennt werden, daß die Eluate in
Frak.ion η aufgi."'eilt und dann die Rf-Werte dieser
Fraktionen bestimrit werden. Alle Thiopep.tir A-Verbindung;n
könner. -urch Konzentrationer. v.Vr abgetrennten
Fraktiontr l nd anschließendes Aul ösen des
Konzentrates in Aceton kristallisiert ν erden. Im Gegensatz zu diesen beiden Α-Komponenten bildet die
B-Komponente kein kristallines Material bei Durchführung des gleichen Verfahrens. Diese Fraktion wird
wiederum in einer Kieselsäure-Kolonne chromatographiert, wobei Chloroform und Methanol als Lösungsmitteisystem
(vorzugsweise in einem Voiumenverhältnis von 50 :1 bis 20 :1) verwendet werden. Die Kristallisation
von Thiopeptin B kann dadurch durchgeführt werden, daß das erhaltene Eluat zu einem Rückstand
eingeengt wird, der dann in warmem Aceton aufgelöst wird. Die Kristallisation kann durch Abkühlen der
Lösung auf unter 100C bewirkt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung einer Impfkultur, die Bildung von Thiopeptin und die
Isolierung der Thiopeptin-Komponenten.
Beispiel 1
Herstellung einer Impfkultur
Herstellung einer Impfkultur
Das Inokulum, das zur Herstellung der Impfkultur verwendet werden solL wurde durch 4tägiges
Wachstum von Streptomyces tateyamensis ATCC 21389 auf einer Agar-Platte bei 300C erhalten. Die
Impfkultur kann dadurch hergestellt werden, daß das erzeugte Inokulum in eine Bennett's-Agar-Schrägkultur
■> überimpft wird und diese Agar-Kultur dann 7 Tage lang
bei 300C bebrütet wird. Diese Impfkultur wurde für das nachstehend beschriebene Fermentationsverfahren verwendet.
ίο B e i s ρ i e 1 2
Bildung von Thiopeptin
A. Fermentation
1. Eine Impfkultur von Streptomyces tateyamensis, wie sie in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde auf ein
steriles Medium überimpft, das in 100 ml Wasser die folgenden Bestandteile enthielt:
Kartoffelstärke 2,0%
Baumwollsamenmehl 2,0%
Maisquellwasser 1,0%
Calciumcarbonat 0,3%
Kaliumdihydrogenphosphai 2,18%
,r Dinatriumhydrogenphosphat · 12 HiO 1,43%
Die geimpfte Brühe wurde 2 Tage lang bei 300C
inkubiert. Diese Kultur wurde dann in einen 30-1-Fermentationsapparat
aus rostfreiem Stahl gegeben, der 20 I des erwähnten Mediums enthielt. Der sterile Fermentationsapparat
vurde 48 Std. lang bei 300C inkubiert, wobei 20 1 sterile Luft pro Minute durchgeleitet
wurden. Es wurde auf einem Ro'.ationsschüttelapparat
mit 300 UpM gearbeitet. 2. Die Fermentation wurde unter den gleichen Bedingungen und nach dem gleichen Verfahren wie im
Abschnitt 1 beschrieben durchgeführt, wobei jedoch ein steriles Medium verwendet wurde, das in 100 ml Wasser
die folgenden Komponenten enthielt:
Kartoffelstärke 4,0%
Baumwollsamenmehl 2,0%
Maisquellwasser 1,0%
Trockene Hefe 1,0%
Calciumcarbonat 0,3%
Kaliumdihydrogenphosphat 2,18%
Dinatriumhydrogenphos- 1,43% phat · 12H2O
N-Acetyl-DL-methionin 0,17%
so 3. Die Fermentation wurde wiederum unter den gleichen Bedingungen und nach der gleichen Verfahrensweise
wie im obigen Abschnitt 1 durchgeführt, wobei jedoch ein Medium verwendet wurde, das in
100 ml Wasser die folgenden Komponenten enthielt:
Kartoffelstärke
Baumwollsamenmehi
Maisquellwasser
Trockene Hefe
Calciumcarbonat
Kaliumdihydrogenphosphat
Dinatriumhydrogenphosphat
Natriumsulfat
12H2O
2,0%
2,0%
1.0%
1,0%
0,3%
2,18%
1,43%
0,5%
B. Gewinnung von Thiopeptin
1. Die Gewinnung von Thiopeptin wurde dadurch erzielt, daß die Kulturbrühe filtriert und 1,8 kg des
erhaltenen Mycelkuchens mit 7 1 eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (2:1, bezogen auf das
Volumen) extrahiert wurden, wobei das Gemisch aus 50°C erwärmt wurde. Dieses Extraktionsverfahren
wurde dreimal wiederholt, und die vereinigten Extrakte wurden filtriert. Dann wurde das Filtrat zur Trockne
eingeengt und der Rückstand wurde in 200 ml Chloroform gelöst. Bei Zugabe von 200 ml Benzol
bildete sich ein Niederschlag, der durch Filtration aus dem Lösungsgemisch entfernt wurde. Der durch
Einengen des erhaltenen Filtrats zurückgebliebene Rückstand wurde in der etwa zehnfachen Menge /;-Hexan
gelöst, um ein kristallines Material, bestehend aus den drei Thiopeptin-Komponenten, zu bilden.
2. Thiopeptin wurde erhalten durch Filtration der Kultur-Flüssigkeit und durch Extraktion des so
erhaltenen Mycclkuchens mit Aceton. Der Acetonextrakt wurde zu einem Rückstand konzentriert, der
wiederum mit Äthylacetat extrahiert wurde. Das rohe kristalline Thiopeptin wurde dadurch erhalten, daß der
erhaltene Extrakt eingeengt und das Produkt abgekühlt wurde.
Beispiel 3
Isolierung des Thiopeptin A-Komplexes
Isolierung des Thiopeptin A-Komplexes
Das rohe Thiopeptin wurde in einer Silicagel-Kolonne Chromatographien, wobei ein Lösungsmittelsystem
aus Chloroform und Methanol (50 :1, bezogen auf das Volumen) verwendet wurde. Das Eluat wurde
zur Trockne eingedampft, und der Thiopeptin A-Komplex wurde als braunes Pulver erhalten, indem das
Konzentrat in Aceton gelöst und das Gemisch auf unter Zimmertemperatur abgekühlt wurde.
Beispiel 4
Isolierung von Thiopeptin Ai
Isolierung von Thiopeptin Ai
Das in Beispiel 3 erhaltene unreine Pulver wurde in einer Silicagei-Chromatographiekolonne absorbiert.
Nachdem mit Chloroform gewaschen worden war, wurde mit einem Chloroform-Methanol-Lösungsmittelsystem
im Volumenverhältnis 50 :1 eluiert. Das Eluat wurde zu einem Rückstand eingeengt, der in Aceton
gelöst wurde. Wenn die Lösung unter Abkühlen stehengelassen wurde, kristallisierte das Thiopeptin Ai
aus. Es wurde durch Filtration gesammelt.
Beispiel 5
Isolierung von Thiopeptin A3
Isolierung von Thiopeptin A3
Das Thiopeptin A3 wurde nach dem gleichen Verfahren
kristallisiert, das in Beispiel 4 angewandt wurde.
Beispiel 6
Isolierung von Thiopeptin B
Isolierung von Thiopeptin B
Nachdem der Thiopeptin Α-Komplex mit einem 50 :1 Lösungsmittelsystem eluiert worden war, wurde
das Volumenverhältnis des gleichen Lösungsmitlelsystems geändert, um das absorbierte Band von Thiopeptin
B zu entwickeln. Es wurde ein Volumenverhältnis von 9 :1 angewandt. Thiopeptin B wurde
dadurch gewonnen, daß das erhaltene Eluat zu einem Rückstand eingeengt wurde, der in Chloroform gelöst
und nochmals Chromatographien wurde in einer Kolonne unter Verwendung von Kieselsäure. Als
Lösungsmittelsyslem wurde Chloroform: Methanol
(50:1, bezogen auf das Volumen) verwendet. Das kristalline Thiopeptin B, das durch Einengen des
Eluats zu einem Rückstand erhalten wurde, wurde in Aceton gelöst. Die Lösung wurde auf weniger als
100C abgekühlt, um eine Auskristallisation zu bewirken.
Das erhaltene Thiopeptin B wurde durch Filtration gesammelt.
Die so erhaltenen Thiopeptin-Komponenten besitzen alle im wesentlichen gleiche chemische und physikalische
Eigenschaften. Diese Thiopeptin-Komponenten sind jeweils löslich in Dioxan, Dimethylsulfoxid,
Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform und 3 η
2(i Salzsäure; wenig löslich in Methanol, Aceton und
Äthylacetat; unlöslich in Äther, Benzol, n-Hexan, Petroläther und Wasser. Sie zeigen eine positive
Reaktion im Permanganat-Test und eine negative Reaktion im Ninhydrin-, Biuret-, Fehling-, Ferrichlorid-,
Ehrlich- und Dragendorff-Test. Die Thiopeptin-Komponenten sind alle stabil bei 6O0C für einen
Zeitraum von einer Stunde bei einem pH-Wert von etwa 2,0 bis etwa 8,0. Die folgenden chemischen
und physikalischen Eigenschaften von Thiopeptin Ai, Thiopeptin A3 und Thiopeptin B werden zusätzlich
genannt.
Thiopeptin Ai
Thiopeptin Ai ist eine schwach gelbe kristalline Substanz mit einem Schmelz- oder Zersetzungspunkt
zwischen etwa 223° C und etwa 226° C. Die optische Drehung dieser Substanz ist: [&] ■;;■ = -71° (c=l,0, in
Chloroform). Es hat das Molekulargewicht 1637, bestimmt nach der Dampfdruckmethode. Die folgenden
Werte für die Elementaranalyse wurden gefunden:
C = 49,38; H =4,93; N = 14,22; S = 11,72%.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Thiopeptin Ai in Methanol zeigt Vorsprünge bei 230 bis 250 nm,
295 nm und 305 nm, wie aus F i g. 2 ersichtlich ist. Aus F i g. 5 ist ersichtlich, daß das Infrarotspektrum in
Nujol Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenzahlen zeigt: 3400, 3330, 3150, 1718, 1655, 1585, 1508,
1492,1338,1305, 1275,1245, 1205,1160,1135,1123,1113,
1092, 1065, 1028, 1002, 973, 950, 923, 893, 850, 820, 805,
765, 723 cm-'. Es wurde festgestellt, daß das mit 6 η Salzsäure bei 100°C hydrolysierte Thiopeptin Ai als
Aminosäurekomponenten beispielsweise Valin, Cystein. Threonin und Alanin enthält was durch den Ninhydrin-Test
festgestellt wurde.
Thiopeptin A3
Thiopeptin A3 ist eine schwach gelbe kristalline Substanz mit einem Schmelz- oder Zersetzungspunkt
zwischen etwa 232° C und etwa 236° C. Es zeigt die folgende optische Drehung: [a]f = -10,8° (c=l, in
Chloroform). Das Molekulargewicht dieser Substanz beträgt 1972, bestimmt nach der Dampfdruckmethode.
Bei der Elementaranalyse wurden die folgenden Werte gefunden:
C=48,45;
= 14,46; S = 12,09%.
Fig.3 zeigt ein Ultraviolettabsorptionsspektrum
dieser Substanz in Methanol, wobei Vorsprünge bei 235 bis 255 nm, 285 bis 300 nm und 302 bis 310 nm erscheinen.
Fig.6 zeigt das InfraiOtabsorptionsspektrum in
Nujol mit Banden bei 3386, 3320, 1725, 1655, 1583, 1518,
1490,1305, 1210,1160, 1130, 1115, 1090, 1070, 1028, 1000,
945, 920, 890, 860, 765, 720, 710cm-'.
Thiopeptin B
Thiopeptin B ist eine Hauptkomponente einer schwach gelben kristallinen Substanz, die einen
Schmelz- oder Zersetzungspunkt zwischen etwa 219°C und etwa 2220C hat. Die optische Drehung beträgt;
[«];,'= -80° (c=l, in Chloroform). Das Molekulargewicht beträgt 1942, bestimmt nach der Dampfdruckmethode.
Bei der Elementaranalyse wurden die folgenden Werte erhalten:
C = 48,73; H =4,87; N = 14,30; S = 11,04%.
Das Ultravioiettabsorptionsspektrum von Thiopeptin B in Methanol ist in Fig.4 dargestellt und zeigt
Vorsprünge bei 230 nm bis 250 nm, 295 und 305 nm. Fig.7 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum dieser
Fraktion in Nujol; es weist maximale Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenzahlen auf: 3400, 3300,
3160, 1735,1685, 1660, 1650,1640,1585,1510,1485, 1335,
1305, 1270, 1250, 1240, 1205,1165, 1130, 1120,1110, 1095,
1070, 1025, 1005, 975, 950, 930, 895, 820, 765, 725, 705 cm -'.
Die antibiotische Wirksamkeit von Thiopeptin Ai, Thiopeptin A3 und Thiopeptin B wurde untersucht. Bei
diesen Versuchen, deren Ergebnise in Tabelle HI zusammengestellt sind, wurde die Aktivität der Verbindungen
ausgedrückt als die minimale Hemmkonzentration (MIC). Die MIC wurde nach der üblichen Agar-Verdünnungsmelhode
gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen bestimmt. Die MlC-Werte werden angegeben als die Konzentration der Verbindung in
μg/ml, welche das Wachstum des Mikroorganismus
verhinderte.
MIC der Thiopeptin-Komponenten
Mikroorganismus:
Thio- Thio- Thio
peptin peptin peptin A1' A3 B
Staphylococcus 0,10 0,25 0.10
aureus 209 P
Bacillus subtilis 0,10 0,25 0,05
Bacillus megaterium 0,10 0,25 0,05
Sarcina lutea 0,05 0.Q6 0,025
Corynebacterium 0,05 0.25 0,01
xerosis
Escherichia coli > 100,0 > 100,0 > 100,0
Proteus vulgaris > 100,0 > 100,0 > 100,0
Pseudomonas > 100,0 > 100,0 > 100,0
aeruginosa
Mycobacterium 2:100,0 8,0 50,0
SP-607
Mycobacterium phlei 50,0 32,0 50,0
Mycobacterium phlei 50,0 32,0 50,0
Um 2OI zeigen, daß die minimale Hemmkonzentration
(MIC) der erfindungsgemäßen Thiopeptine gegenüber Mycoplasma besser ist als diejenige von Flavomycin,
wurden weitere Vergleichsversuche durchgeführt
Die
Materialien und Verfahren
minimale Hemmkonzentration (MIC) der
minimale Hemmkonzentration (MIC) der
Thiopeptine und von Flavomycin gegenüber drei Stämmen von Mycoplasma von Hühnern wurde unter
Verwendung eines normalen Agar-Verdünnungsverfahren bestimmt.
Teststämme:
Mycoplasma gallisepticum PG-31 tATCC 19 610)
isoliert aus Hühner, die an chronischen Atmungskrankheiten leiden;
Mycoplasma gallisepticum 1 RF
isoliert aus Hühnern, die an chronischen Atmungs- |Λ> krankheiten leiden;
isoliert aus Hühnern, die an chronischen Atmungs- |Λ> krankheiten leiden;
Mycoplasma synovieae WVU-1853 (ATCC 25 204) isoliert aus Hühnern, die an Luflsacculitis und
Synovitis leiden.
Kulturmediui. :
Für die ersten beiden Stämme:
1,47 g PPLO-Brühc (dehydratisiert) wurden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und in an sich
bekannter Weise sterilisiert. Zu der Lösung wurden 20 ml Pferdeserum, 10 ml getrockneter Bäcker
hefeextrakt, hergestellt durch Extraktion von 500 g getrockneter Bäckerhefe mit 1500 ml Wasser, 1 ml
10%iges Ampicill η und 0,5 ml 10%iges Thallium-
jo acetat zugegeben.
Für den letzten Stamm:
2,25 g Mycoplasma-Grundbrühe und 1 g Agar wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und
in an sich bekannter Weise sterilisiert. Zu der
Lösung wurden 20 ml Pferdeserum, 1 ml Nicotinamid-adenindinucleotid und 1 ml 1 %iges
L-Cysteinhydrochlorid zugegeben.
Inokulumgröße:
0,01 ml Brühe, die etwa 105 CFU (koloniebildende
Einheiten) Mycoplasma/ml enthielten.
Kultürbedingungen:
Die Kultur wurde 4 Tage lang bei 37°C in einer Atmosphäre durchgeführt, die 10% Kohlendioxid
enthielt.
Ergebnisse:
Tabelle IV
Tabelle IV
j5 Mycoplasmastämme
MIC (Rg/ml)
Thiopeptin
B A3
B A3
Flavomycin
M.gaffisepticum PG 31 0,39 0,10 >100
Mgallisepticum IRF 0,20 OUO >100
Msynoviae WVU-1853 0,78 0,78 >100
ι ·
Die obigen Versuche zeigen, daß die, eifindungsgemäßen
Thiopeptine hinsichtlich ihfcr Aktivität gegenüber Mycoplasma, das bekanntlich bei Ceflügel
und Schweinen pathogen ist, dem Vergleichsprodukt Flavomycin eindeutig überlegen sind, d_ h. wenn man die
erfindungsgemSßen Thiopeptine enthaltendes Futter
an Geflügel und Schweine verfüttert, wird der Lebensraum des Geflügels oder der Schweine frei von
Mycoplasma gehalten.
Das erfindungsgeiY-aße Thiopeptin B weist auch keine
Kreuzresistenz gegenüber Penicillin-G, Aminobenzylpenicillin.
Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Leucomycin, Erythromycin und Kanamycin auf. Bei
intraperitonealer Verabreichung von 500 mg/kg Thiopeptin B an Mäuse trat zwei Wochen nach der
Injektion kein toxisches Symptom auf (vgl. »The Journal of Antibiotics«, Band XXIlI (1970), Seiten 113
bis 119). Auch gegenüber dem Antibioticum Tylosin, das gegenüber Mycoplasma wirksam ist, ist das erfindungsgemäße
Thiopeptin überlegen, weil es keine Kreuzrestistenzen mit anderen Antibiotika, beispielsweise
mit Erythromycin, aufweist (vgl. die obengenannte Literaturstelle in Verbindung mit »Antibiotics
and Chemotherapy«, Band 11 (1961), Seiten 320 bis 327).
Zur Bestimmung der akuten Toxizität der Thiopeptin-Komponenten
bei der Maus wurde eine 5°/oige Suspension des Antibiotikums in Natriumcarboxymethylcellulose
mit destilliertem Wasser verdünnt und intraperitoneal den Mäusen verabreicht. Die LD50-Werte
von Thiopeptin Ai, Thiopeptin A3 und Thiopeptin
B wurden mit > 500, > 250 bzw. > 250 mg/kg er· mittelt.
Das die obigen Eigenschaften aufweisende Thiopeptin kann vorteilhaft als wachstumsfördernder
Zusatz in Tierfutter für beispielsweise Schweine und Geflügel verwendet werden. Für eine solche Verwendung
können die als Bestandteil von Tierfutter eingesetzten Thiopeptin-Verbindungen vorzugsweise in
weniger reiner Form angewandt werden. Beispielsweise können diese Komponenten auch in Form des
getrockneten, rohen Thiopeptin-haltigen Mycelkuchens verwendet werden, der durch Abfiltrieren des Mycels
aus dem den Fermentationsapparat entnommenen Flüssigkeitsgemisch erhalten wurde. Der Thiopeptinhaltige
Mycelkuchen kann so trocken als möglich aufbewahrt werden, um seine Aktivität zu bewahren.
Wenn er mit geeigneten Mengen an Nährmitteln vermischt wird, sollten diese Nährmittel einen
möglichst geringen Wassergehalt besitzen. Es können natürlich auch die drei Thiopeptin-Komponenten
alleine oder in Kombination als Zusatzstoffe für Tierfutter verwendet werden. Die Thiopeptin-Komponenten
alleine oder deren Kombination(Komplex) oder die Form des Mycelkuchens können mit den Rationen
vermischt werden, die üblicherweise zur Tierfütterung verwendet werden. Der Anteil dieses Antibiotikums,
der Tierfutter-Mischungen zugefügt werden kann, lann in weiten Grenzen schwanken in Abhängigkeit u. a. von
dem beabsichtigten Wachstum der Tiere, den Eigenschaften des Antibiotikums und den gewünschten
Eigenschaften der erhaltenen Mischungen. Wenn das Antibiotikum an Geflügel oder Schweine in Mengen
zwischen etwa 0,1 ppm und etwa 100 ppm bzw. zwischen etwa 10 ppm und etwa 500 ppm verfüttert
wurde, konnten keine Antibiotikum-Rückstände im Serum oder im Gewebe der untersuchten Tiere
festgestellt werden. Wenn auch Spurenmengen der Antibiotikum-Rückstände innerhalb der Analysengrenzen
in der Bauchhöhle vorhanden sein könnten, ist doch festzustellen, daß im Hinblick auf die Tatsache,
daß die Antibiotikumrückstände nicht im Fleisch der Tiere gefunden werden konnten und feststellbare
Mengen von aktiven Antibiotikum-Rückständen im Fleisch der mit den Antibiotikum-Zusätzen gefütterten
Tiere schnell verschwanden, wenn die Antibiotikum-Verfütterung einige Tage vor dem Schlachten eingestellt
worden war, die Antibiotikum-Rückstände nicht zu irgendwelchen ungewünschten Effekten beim
Menschen führen. Es sei auch bemerkt, daß diese antibiotischen Zusatzstoffe, wenn sie in den richtigen
Mengen den Futter-Rationen beigemischt werden, keine unerwünschten Effekte bei den Tieren hervorrufen
und ein erhöhtes bzw. beschleunigtes Wachstum
ίο bewirken.
Versuche haben gezeigt, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum Thiopeptin bei der Verabreichung an
Hühner innerhalb von 48 Stunden nach der Verabreichung mit den Exkrementen der Versuchstiere
ausgeschieden und von dem Gewebe nicht absorbiert wird. Auch bei der Verabreichung an Schweine tritt
eine praktisch vollständige Wiederausscheidung auf.
10 Landrace-Schweine mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 53 kg wurden in zwei Gruppen
aufgeteilt. Einer Gruppe wurde an 54 aufeinanderfolgenden Tagen eine 500 g des erfindungsgemäßen
Thiopeptins pro Tonne Futter enthaltende Futterration verabreicht. Die 5 Schweine der Kontrollgruppe
erhielten das Basal-Futter. Das Körpergewicht und der Futterverbrauc! wurden jede Woche aufgezeichnet.
Am Ende des Versuchs wurden alle Schweine getötet und einer makroskopischen Untersuchung unterzogen.
Zur Bestimmung der Rückgewinnungsrate von Thiopeptin aus Tiergewebe wurde das Thiopeptin dem Blut,
Leber- und Muskel-Homogenaten von Geflügel und Schweinen in einer Menge von 0,02 μg pro g Probe
verabreicht bzw. es wurde dem Eigelb und dem Eiweiß in einer Rate von 0,1 ng/g verabreicht. Jede dieser
Proben wurde gründlich durchgemischt und anschlie-
3) ßend einer Extraktion und einer Analyse unterzogen.
Zur Durchführung der Geweberückstandsuntersuchung wurden 10 Hähnchen mit einem durchschnittlichen
Körpergewicht von 1,2 kg oral 100 mg Thiopeptin pro Versuchstier in Gelatinekapseln verabreicht.
4» Zwei Hähnchen wurden 2, 4, 8, 24 und 48 Stunden nach
der Verabreichung getötet. Der gesamte Gastrointestinaltrakt mit seinem Inhalt, die Fäkalien und andere
wichtige Organe (Blut, Herz, Lungen, Leber, Milz, Nieren, Pankreas und Schlegelmuskel) wurden ge-
41) sammelt und untersucht.
Die in beiden Versuchen erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefaßt.
Tabelle V | Gewebe | Gewebe | 0,02 μg/g Gewebe |
Thiopeptin-Rückgewinnung (%) bei Verabreichung von |
96 102 110 |
||
Blut Leber Muskel |
0,1 μg/g Gewebe |
96 96 96 |
|
Thiopeptin-Rückgewinnung (%) aus dem | Blut Leber Muskel |
NT*) NT NT |
NT NT |
Versuchstier | Eiweiß Eigelb |
NT NT NT |
|
98 63-83 |
|||
Geflügel | |||
Schweine | |||
Eier |
*) NT= Nicht untersucht.
Verteilung von Thiopeptin in Geflügel nach Verabreichung einer einzelnen Thiopeptin-Dosis
von 100 mg pro Versuchstier
Organ | Thiopeptin-ROckgewinnung (%) nach | 4 Std. | 8 Std. | 24 Std | 48 Std. |
2 Std. | 6,0 | Spuren | 0 | 0 | |
Proventriculus- | 11,2 | ||||
Gizzard-Kropf | 47,8 | 20,0 | 0 | 0 | |
Dünndarm | 70,9 | 29,1 | 55,3 | Spuren | 0 |
Dickdarm | 15,2 | 18,2 | 24,5 | 98,5 | 101,0 |
Fäkalien | 2,9 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Blut | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Herz | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Lungen | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Leber | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Milz | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Nieren | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Pankreas | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Schlegelmuskel | 0 | 101,1 | 99,8 | 98,5 | 101,0 |
Gesamt (%) | 100,2 |
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß bei Verabreichung einer einzigen Dosis von Thiopeptin von
100 mg pro Versuchstier innerhalb von 48 Stunden mit
den Fäkalien nahezu 100% des verabreichten Thiopep- jo
tins wieder ausgeschieden wurden, so daß keine Spur von Thiopeptin in den untersuchten Hauptorganen
nachgewiesen werden konnte.
Die folgenden Beispiele erläutern die Wirkung der Thiopeptin A-Komponenten und des Thiopeptins B auf
das Wachstum und die Futterausnützung bei Geflügel.
Hühner wurden zu fünf Gruppen von je 40 Hühner <to
mit jeweils gleichem Gewicht zusammengestellt. Die Einzelgewicht ι und der Futterverbrauch pro Gruppe
vurc'en alle zwei Wochen gemessen. Die sechs behandelten C-uppen bestanden aus zwei Kontrollgrunpen
und vier Versuchsgruppen. Dt Kontrollgruppen
wurdsn nit der Basal-Ration iefüttert. Die
vier Versuchsgruppen wurden mit der Basal-Ration gefüttert, der jeweils 5 g der Thiopeptin A-Komponenten
bzw. 20 g Thiopeptin B pro t beigemischt worden waren. Als Thiopeptin A-Komponenten wurde so
das in Beispiel 3 erhaltene Produkt verwendet. Das Thiopeptin B war das in Beispiel 6 erhaltene Produkt.
Sowohl die Thiopeptin A-Komponenten als auch das Thiopeptin B alleine waren wirksam hinsichtlich der
Förderung des Wachstums und der Erhöhung der Gewichtszunahme und der Verbesserung der Futterverwertung.
Die Versuchsergebn sse sind in den weiter unten folgenden Tabellen VIl und VIII zusammengestellt.
Das folgende Beispiel erläutert die Wirkung von Thiopeptin als Kombination der Thiopeptin A-Komponenten
und des Thiopeptins B und in Form des Mycelkuchens bei der Behandlung von Geflügel.
Hühner wurden zu fünf Behandlungsgruppen von jeweils 36 Hühnern mit jeweils gleicher Gewichtsbasis zusammengestellt. Die Einzelgewichte und der
Futterverbrauch pro Gruppe wurden alle zwei Wochen gemessen. Voi. den fünf behandelten Gruppen wurde
die eine mit d.'r Basal-Ration aileine als Kontrolle
gefüttert. Die anderen Gruppen erhielten das Futter mit dem Thiopeptin-Komplex in einer Menge von 2,5 g bzw.
10 g pro t der Basal-Ration sowie mit 2,5 g bzw. 10 g des
Mycelkuchens pro t der Basal-Ration.
Die Beimischung dei Thiopeptin-Kombination sowie des Mycelkuchens zur Ration führte zu einer Erhöhung
der täglicheil Gewichtszunahme und einer Verbesserung der Futterverwertung während der Versuchsperiode. Die Ergebnisse sind in der weiter unten
folgenden Tabelle IX zusammengestellt.
Das folgende Beispiel erläutert die Wirkung von Thiopeptin in Form der Kombination der Thiopeptin-Komponenten
bei Schweinen.
Schweine wurden zu drei Versuchsgruppen von je 6 Schweinen mit jeweils gleichem Gewicht zusammengestellt.
Die Einzelgewichte und der Futterverbrauch wurden alle zwei Wochen ermittelt. Die Versuchsgruppen erhielten ein Futter, dem alle Thiopeptin-Komponenten
in einer Menge von 20 g bzw. 100 g pro t beigemischt waren. Die Versuchszeit betrug 6 Wochen.
Die Zugabe der Thiopeptin-Komponenten bewirkte eine Verbesserung der täglichen Gewichtszunahme und
der Futterverwertung während der 6-Wochen-Periode. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle X zusammengestellt.
Basal-Ration
Thiopeptin A
(5 ppm) (20 ppm)
Durchschnittl.
Anfangsgewicht (g)
Anfangsgewicht (g)
36,80 36,80
36,80
130 232/4
18
Fortsetzung
Basal-Ration
Thiopeptin A
(5 ppm) (20 ppm) Basal-Ration
Thiopeptin B
(5 ppm) (20 ppm)
Durchschnittl.
Endgewicht (g)
Endgewicht (g)
Durchschnitt].
Gewichtszunahme in
Gewichtszunahme in
0—2 Wochen (g)
2—4 Wochen (g)
Gramm verfüttert/
Gramm Zunahme
in 0—4 Wochen
2—4 Wochen (g)
Gramm verfüttert/
Gramm Zunahme
in 0—4 Wochen
627,08 666,66 659,57
201,05
389,23
389,23
1,82
237,85
398,97
1,80
213,40
409,37
1,78
10
15
Durchschnittl. 37,00
Anfangsgewicht (g) Durchschnittl.
Endgewicht (g) Durchschnittl.
Gewichtszunahme in 0-2 Wochen (g) 200,85 2-4 Wochen (g) 376,78
Gramm verfüttert/ 1,80
Gramm Zunahme in 0—4 Wochen
37,00 37,00
614,63 629,16 637,50
215,29
376,87
1,74
217,79
382,71
1,79
Basal-Ration Thiopeptin A+ B
(2,5 ppm) (10 ppm)
Mycelkuchen
(2,5 ppm) (10 ppm)
Durchschnittl. Anfangsgewicht (g) 37,7 37,7 37,7 37,7 37,7
Durchschnittl. Endgewicht (g) 549,3 583,4 580,7 577,1 579,6
Durchschnittl. Gewichtszunahme in
0-2 Wochen (g) 193,9 195,9 199,0 204,4 199,0
2-4 Wochen (g) 307,7 349,8 344,0 334,7 342,9
Gramm verfüttert/Gramm Zunahme in 1,97 1,89 1,89 1,88 1,87
0—4 Wochen
Basal-Ration Thiopeptin A +B (20 ppm) (100 ppm)
Durchschnittl. 19,75
Anfangsgewicht (kg)
Durchschnittl. 44,42
Endgewicht (kg)
Durchschnittl.
Zunahme (kg) in 0-4 Wochen 15,72
4-6 Wochen 8,92
kg verfüttert/ 2,91
kg Zunahme in
0-6 Wochen
19,75 19,75
45,70 47,27
15,65 17,67
9,60 9,85
2,83 2,61
Hierzu 7 IiIuIl Zeichnungen
Claims (1)
- Patentansprüche:!.Antibiotikum Thiopeptin Ai, eine schwach gelbe kristalline Substanz, gekennzeichnet durcheine Elementaranalyse mit folgenden Werten: C 49,38; H 4,93; N 14,22; S 11,72%
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