DE2109854A1 - Cephalosporin-Derivate - Google Patents

Description

Die Erfindung umfasst 7ß-(D-5~Amino-5-carboxyvaleramido.)~ 7-meth.o3cy-3-cep]ieia-4-carbonsäuren, die in der J-Stellung des "Cephem"-Kerns durch eine Vielzahl von Alkyl-, Halogenalky I- oder Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoff-haltige Substituenten substituiert sind, und deren Salze, Ester und Amid-Lerivate. Bestimmte dieser Produkte werden durch Fermentation erhalten und andere werden auf synthetischem Weg erhalten. Die Produkte sind wirksam gegen gram^negative und gram/poeitive Bakterien.

Die Erfindung betrifft eine neue Klasse antibiotischer Substanzen und ein Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere sind diese neuen Antibiotika Produkte vom Cephalosporintyp, die einen Methoxy-Substituenten in der 7-Stellung des "Cepheaⁿ-Kerns enthalten. Sie sind strukturell mit der Cephalosporin-Reihe von Verbindungen verwandt, jedoch anders als Cephalosporin C, das lediglich eine D-^-Amino^-carboxyvaleramido-Einheit in der 7-Stellung enthält, enthalten die vorliegenden Produkte auch

— Λ —

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einen 7-Methoxy-Substituenten} und während Cephalosporin C durch Acetoxymethyl in der ^-Stellung des Rings substituiert ist, können die Produkte der Erfindung ausser Acetoxymethyl eine grosse Vielzahl anderer Substituenten aufweisen. Beispiele dieser Substituenten sind Methyl-, Halogenmethyl-, Hydroxymethyl-Substituenten, ein Acyloxymethyl-Anteil der aliphatischen, acyclischen und aromatischen Arten, Carbamoyloxymethyl-, N-substituierte und N,N-disubstituierte Carbamoyloxymethyl-, Alkylthiomethyl-Substituenten, heterocyclisch-substituierte Thiomethyl-, {Drialkylammoniummethyl-, Pyridiniummethyl-Substituenten, kernsubstituierte Pyridiniummethyl-, Thiouroniummethyl-, Amidinothiomethyl-Substituenten, in denen die beiden Stickstoffatome mit 1 bis 5 Alkylresten substituiert sein können, Aminothiocarbonylthiomethyl-Substituenten, II-substituierte Aminothiocarbonylthiomethyl-, Aroylthiomethyl-_} Oxythiocarbonylthio-methyl-, Alkarylsulfonylmethyl-, Azidomethyl-, Aminomethyl-, Amidomethyl-, PoIyhydroxybenzyl-, N-niedrig-Alkyl-indol-3-ylmethyl- und ©liocyanatomethyl-Substituenten. Diese Produkte können v;ie folgt wiedergegeben werden;

Q OCH

I t

HOOO-CH-(CH₂) -C-HH-^^

worin E ein Wasserstoffatom, einen Halogenrest, beispielsweise Chlor, Brom, Pluor oder Jod und dgl., einen Hydroxyrest, Acyloxyrest, z. B. einen niederen Alkanoyloxyrest, wie beispielsweise Acetoxy-, n-Propionyloxyaeest und dgl.,

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einen mononuklearen und binuklearen aromatischen Carbonyloxyrest, beispielsweise Benzoyloxy-, Naphthoyloxyrest und dgl., heterocyclischen Carbonyloxyrest, worin der Heterocyclus ein 6-gliedriger stickstoffhaltiger Heterocyclus ist j wie beispielsweise 4-Pyridylrest und dgl., Aralkanoyloxyrest, wie beispielsweise Phenacetyloxy-, 3-^enylpropionyloxy-, 2-Naphthylacetoxyrest oder Hydrocinamoyloxyrest und dgl., Cycloalkancarbonyloxyrest mit 5 bis 6 Ringkohlenstoff atomen, beispielsweise Cyclopentancarbonyloxyrest oder Cyclohexancarbonyloxyrest und dgl., oc-Methoxypj-sulfooxycinnamoyloxy- oder oc-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxyrest und dgl., einen Carbamoyloxyrest der Formel: -00CIiR¹R², worin R¹ und R² Wasserstoff atome, niedere Alkylreste, beispielsweise Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, tert.-Butylreste und dgl., Halogen-niedrig-alkylreste, wie beispielsweise Chlormethyl-, 2-Chloräthyi- oder Chlor-tert.-butylreste und dgl., niedere Alkoxycarbonylreste, wie beispielsweise Äthoxycarbonylreste und dgl., Arylreste, beispielsweise mononukleare und binukleare Arylreste, wie beispielsweise Phenyl-, Naphthylreste und dgl., Alkarylsulfonylreste, beispielsweise mononukleare Alkarylsulfonylreste, wie beispielsweise p-3?olylsulfonylreste und dgl., und Benzhydrylreste bedeuten oder H und R zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, unter Bildung eines mononuklearen Heterocyclus, wie beispielsweise Pyrrolidinyl-, Piperidino- oder Morpholinoring, verbunden sein können; einen Thiorest der !Formel* -SR^, worin R^ einen niederen Alkylrest, beispielsweise einen Methyl-, Äthyl-, n-Propylrest und dgl., einen stickstoffhaltigen Heterocyclus, wie beispielsweise Pyridylrest, z« B. 2-, 3- oder 4-Pyridylrest, einen niederen alkylsubstituierten Ihiazolylrest, wie beispielsweise 4-Methylthiazol-2-yl- oder 4-Äthylthiazol-2-ylrest und dgl., 1,3,4-0}hiadiazol-2-ylrest, einen niedrig-alkylsubstituierten Ijjj^-Thiadiazol-2-ylrest, wie beispielsweise 5-Methyl-1,3,^t-thiadiazol-2-

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ylrest und dgl., 2-Benzothiazolylrest, einen 4—niedrig-Alkylpyrimidinylrest, wie beispielsweise 4-Methylpyrimidin-2-ylrest bedeutet; einen Ammoniumrest, beispielsweise einen Tri-niedrig-alkylammoniumrest, wie beispielsweise Trimethylammoniumrest oder Triäthylammoniumrest und dgl., oder einen Pyridiniumrest der Formel:

worin X ein Wasserstoffatom, einen Halogen-, Trifluormethyl-, Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkyl- und N,N-Di-niedrig-alkylsubstituierten Carbamoylrest, wie beispielsweise N-Methylcarbamoyl-, N-Äthylcarbamoyl-, N,N-Dimethylcarbamoyl-, Ν,Ν-Diäthylcarbamoyl- oder N,N-Diisopropylcarbamoylpest, Carboxymethylrest, niedrig-Alkanoylrest, wie beispielsweise Acetyl- oder Propionylrest und dgl., niederen Alkylrest, beispielsweise Methyl-, Äthyloder n-Propylrest und dgl., Hydroxymethylrest oder SuIforest, d. h. -SCUCOH) bedeutet; einen Thiouroniumrest der Formel: -._v

NH₂

einen Amidinothiorest der Formel: -S-

4· 5 6
worin E , E^ und E , die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome oder niedere Alkylreste, wie beispielsweise Methyl-, Äthyl-, n-Propylreste und dgl, bedeuten; einen Aminothiocarbonylthiorest der Formel:

.7*8

-SCBE
_ /j. _

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7 ·8
worin R' und R , die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome, niedere Alkylreste, z. B. Methyl-, Äthyl-, n-Propylreste und dgl., Hydroxy-niedrig-alkylreste, beispielsweise 2-Hydroxyäthylrest und dgl., Di-niedrig-alkylamino-niedrig-alkylreste,wie beispielsweise 2-(Dimethylamino)-äthyl-, 2-(Mäthylamino)-äthyl-, 2-(Di-n-propylamino)-äthyl~ oder 5-(Diäthylamino)-propylres"te und dgl., morpholinosubstituierte. niedrige Alkylreste, z. B. 2-Morpholinoäthylrest und dgl., N-Aryl-N-niedrig-alkylaminoalkylrest, beispielsweise 2-(N-Phenyl-IT-methylamino)-äthylrest bedeuten oder die Reste R' und R zusammengenommen mit dem Stickstoffatom, an das sie gefunden sind, unter Bildung eines Morpholine-, Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder Piperazinorestes der Pormel:

worin R^ einen Alkylrest, beispielsweise einen Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Amyl-, n-Octyl-, Decylrest und dgl., oder einen Phenylrest bedeutet, verbunden sein können; einen Aroylthiorest, beispielsweise einen mononuklearen Aroylthiorest, z. B. einen Benzoylthiorest; einen Oxythiocarbonylthiorest der Pormeli

ΊΟ
worin E einen niederen Alkylrest, beispielsweise einen Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, n-Hexylrest und dgl., oder einen niederen Cycloalkylrest, d. h. einen Cycloalkylrest mit 5 bis 6 Ringkohlenstoffatomen, wie beispielsweise Cyclopentyl- und Cyclohexylrest; Alkarylsulfo-

— 5 — 109839/ 1836

nylrest, beispielsweise einen mononuklearen Alkarylsulfonylrest, z. B. p-Iolylsulfonylrest und dgl.} einen Azidorest; einen Aminorest, einen Amidorest der Formel:

-HHR¹¹ ,

worin R einen Acylrest, beispielsweise einen niederen Alkanoylrest, wie beispielsweise Acetyl- oder Propionylrest oder Aralkanoylrest, z. B. einen mononuklearen Aralkanoylrest, wie beispielsweise 2-Phenylacetylrest und dgl.; einen Polyhydroxyphenylrest, z. B. Dib.ydroxyph.enylrest, wie beispielsweise 2,4-Dihydroxyphenylrest oder einen N-niedrig-Alkylindol-5-ylrest, z. B. N-Methylindol-3-ylrest und dgl., oder einen Thiocyanatorest bedeutet. Ferner Bind die pharmakologisch verträglichen Salze Ester und Amide der vorliegenden Produkte umfasst. Dazug gehören organische und anorganische Salze, z. B. Säureadditionssalze, Metallsalze, quaternäre Salze und Aminsalze, die sich von tertiären organischen stickstoffhaltigen Basen ableiten. Zu geeigneten Ester- und Amid-Berivaten gehören die Mono- und Di-ester, s. B. solche, die sich von Alkanolen, Cycloalkanolen, aromatischen Alkoholen und Aralkanolen ableiten und Mono- und Di-amide, die sich beispielsweise von Ammoniak, niederen Alky!aminen, Di-niedrig-alkylaminen, Aralkylaminen und heterocyclischen Aminen ableiten. Beispiele dieser Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in dem mit synthetischen Methoden bezeichneten Unterabschnitt aufgeführt.

Antibiotikum 81QA: Im wesentlichen umfassen die Produkte der vorstehenden Formel I zwei Gruppen von Fermentationsprodukten. Eine dieser Gruppen besteht aus einem Gemisch von Verbindungen, woraus zwei deutliche Produkte isoliert und identifiziert worden sind. Diese beiden Produkte sind durch das Vorhandensein einer a-Methoxy-p-sulfooxycinn-

- 6 109839/1836

H₅O₅ ²¹⁰⁹⁸⁵<

amoyloxy- oder einer α-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxy-Einheit in der 3-Stellung des Cephem-Kerns gekennzeichnet und entsprechen der folgenden Strukturformel:

HOOC-CH-(CH₂), NH₂

Ia

1?
worin R einen Hydroxy- oder SuIfooxyrest, d. h. -OSO,H bedeutet. Diese Produkte werden durch Kultivierung eines neuen Stamms von Actinomycete, bezeichnet als MA-2837, der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, unter geregelten Bedingungen gleichzeitig erzeugt. Eine Probe dieser Kultur wurde auch auch zur dauernden Niederlegung in die Kulturensammlung der Northern Utilization Research and Development Branch of the U. S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, gebracht, und erhielt die Kultur-Nummer NRRL 3851. 25 andere Kulturen' wurden gleichfalls als Erzeuger dieses Antibiotikumgemischs (Ia) identifiziert, und diese zusammen mit der Kultur MA-2837 werden im folgenden in dem mit die Microorganismen bezeichneten Abschnitt beschrieben. Im folgenden wird das Antibiotikümgemisch (Ia), das diese beiden Produkte aufweist, als Antibiotikum 810A oder einfach mit 810A bezeichnet.

Antibiotikum 84-2A; Die zweite Gruppe der Fermentationsprodukte umfasst 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (folgende Formel (Ib)) und deren Salze. Diese Verbindung

— 7 —

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14305

weist folgende Strukturformel auf:

HH,

OCH

COOH

Dieses Produkt (Ib) wird auch durch einen neuen Stamm von Actinomycete erzeugt, und eine Probe dieses Mikroorganismus, bezeichnet mit MA-2908, wurde in der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, New «Jersey, aufgenommen. Eine Probe dieser Kultur wurde auch zur dauernden Hinterlegung bei der Kulturensammlung der Northern Utilization Research and Development Branch of the U.S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, gebracht. Diese Kultur erhielt die Kultur-Nummer NERL 3802. Zusätzlich zu seiner antibiotischen Wirksamkeit ist dieses Produkt (Ib) auch ein Zwischenprodukt bei der Herstellung der entsprechenden 3-Hydroxy-, 3-Acyloxy- und Carbamoyloxy-Derivate. Das Verfahren zur Herstellung dieser Derivate ist in dem mit synthetische . Methoden bezeichneten Unterabschnitt beschrieben. In der folgenden Beschreibung wird das Produkt Ib, d. h. 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4--carbonsäure als Antibiotikum 842A oder einfach mit 84-2A bezeichnet.

Wirksamkeit

Eine HauptSchwierigkeit bei der antimikrobiellen Therapie ist die Empfindlichkeit der meisten Antibiotika gegenüber enzymatischem Abbau. Beispielsweise ist Penicillin G wirk-

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sam gegen eine grosse Vielzahl gram .positiver und gramnegativer Mikroorganismen, jedoch wird es in Gegenwart von Penicillinase zu einer Form abgebaut, die gegenüber den meisten Pathogenen unwirksam ist.

Ein Versuch zur Bewältigung dieses Problems bestand in der Entwicklung neuer Antibiotika, welche die "Cephem"-Kerneigenschaft von Cephalosporin C aufweisen. Cephalosporin C besitzt eine ihm eigene Beständigkeit gegenüber Penicillinase und ist wirksam sowohl gegen gram^-tiegative als auch grammpositive Bakterien; jedoch ist es nur massig wirksam, und es gibt andere Enzyme als Penicillinase, welche seine Wirksamkeit zerstören. Diese Enzyme werden mit Cephalosporinasen bezeichnet. Die erfindungsgemässen Produkte (I) liefern nicht nur Beständigkeit gegenüber Penicillinase, sondern gleichfalls gegenüber den Cephalosporinsen. Sie liefern Wirksamkeit sowohl gegen gram/negative als auch gram/positive Bakterien, jedoch ist das Ausmass der Aktivität und der Bereich von Organismen, gegen die sie wirksam sind, nicht identisch.

Antibiotikum 842A ist durch eine gesteigerte Wirksamkeit gegenüber granL-negativen Mikroorganismen gekennzeichnet. Anders als Cephalosporin C, das eine relativ geringe antibakterielle Wirksamkeit besitzt, übt dieses Produkt einen erheblichen gramxnegativen Effekt in vivo mit einer Wirksamkeit aus, die im allgemeinen grosser als Cephalothin ist. Zu dieser Wirksamkeit gehören die Wirksamkeit in vivo gegenüber Proteus morganii und eine Wirksamkeit gegenüber den folgenden gram/negativen Bakterien: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus morganii, Salmonella schottmuelleri, Klebsiella pneumoniae AD, Klebsieila pneumoniae B und Paracolobactrum arizoniae.

Antibiotikum 8A-2A stellt eine bevorzugte Ausfuhrungsform der

— Q _ 109839/1836

Erfindung dar. Ausser einer allgemein gesteigerten grains · negativen Wirksamkeit und einer erhöhten Wirksamkeit im Vergleich zu Cephalothin und einer grösseren Beständigkeit gegenüber Cephalosporinasen zeichnet sich 842A durch ein geringeres Ausmass an Toxizität aus und erzeugt rasche Werte im Blut. Innerhalb von 6 Stunden nach Verabreichung sind etwa 100 % im Urin beseitigt. Ferner ist es beständiger gegenüber enzymatischem Abbau als Cephalosporin C und Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum entwickelt sich langsam, und es wirkt bakterizid. Bei oraler Verabreichung schützt es gegen Infektionen auf Grund von Paracolobactrum arizoniae 3270, Proteus vulgaris 1810 und Salmonella schottmuelleri 3010; und bei subkutaner Verabreichung ist as 2- bis 10mal wirksamer als Cephalothin gegenüber den gleichen Infektionen.

Antibiotikum 810A ist ein Mttel mit breitem Wirkungsspektrum, das eine etwa ausgeglichene gramxnegative und graia.-positive Wirksamkeit entfaltet. Dazu gehören die Wirksamkeit in vivo gegenüber den folgenden gram/negativen Organismen: Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella pullorum, Escherichia coli und Xlebsialla pneumoniae und in vivo Wirksamkeit gegen die folgenden gram-rpositiven Organismen: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und Diplococcus pneumoniae.

Von· den verschiedenen Produkten, die das Antibiotikum 810A ausmachen, stellt die 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-( a-methoxy-p-sul f ooxy-cinnamoy loxym ethyl)-7-m e thoxy-3-cephem-4~carbonsäure-Art entsprechend der obigen Formel Ia, worin E einen Sulfooxyrest bedeutet und deren Salze, wie beispielsweise das liatriumsalz, eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Dieses Produkt besitzt folgende Strukturformel:

- 10 10983 9/1836

O NH₀ O₁

Ii I ² fl

HOC-Ch-CH₂-CH₂-CH₂-C-HH-

OCH

Ic

Diese Verbindung besitzt eine grössere Beständigkeit gegenüber Cephalosporinasen als Cephalothin und ist durch ein geringeres Ausmass an Toxizitat bei Mäusen gekennzeichnet. Ferner ist es beständiger gegenüber enzymatischem Abbau als Cephalosporin C und es wirkt bakterizid. Bei oraler Verabreichung schützt es gegen Infektionen auf Grund von Proteus vulgaris und bei subkutaner Verabreichung ist es wirksam gegenüber einer Vielzahl von gram/negativen und gram./positiven Infektionen.

Die Mikroorganismen

810A Kulturen: Der Mikroorganismus, welcher das Antibiotikum 810A erzeugt-, wurde ursprünglich als Einzelkolonie aus Boden isoliert. Diese Kolonie wurde auf eine Strichplatte der folgenden Zusammensetzung gegeben:

Medium A:	10,0 g
Hefeextrakt	10,0 g
Dextrose	20,0 g
Agar	1000,0 ml
Destilliertes Wasser

Nach mehrtägigem Wachstum erzeugte der Mikroorganismus das Antibiotikum 810A. Dieses Antibiotikum wurde dann in Schüttelkolben reproduziert und von bekannten Antibiotika

- 11 109833/1836

auf Grund verschiedener biologischer und chemischer Untersuchungen differenziert. Ein Vergleich dieser Daten mit denjenigen, die über andere bekannte Antibiotika erhalten wurden, lieferte die Peststellung, das 810A eine neue Einheit ist.

810A Taxonoinie und Morphologie: Der Mikroorganismus (Kultur MA-2837)» welcher das Antibiotikum 810A produziert, wurde als Streptomyces griseus identifiziert. Die zu dieser Bestimmung verwendete Taxonomie ist in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe und in "The Actinomycetes", Band 2, von S. A. Waksman (1961 ) beschrieben. Unter Verwendung diese Verfahrens wurde festgestellt, dass die Kultur aus einem Stamm von Streptomyces griseus besteht, der hinsichtlich der Beschreibung, der Melanin-Erzeugung und des Kohlenstoff -Verbrauchs, dem Streptomyces griseinus sehr stark gleicht, wie in International Journal fo Systemic Bacteriology" 7· Ausgabe (1957) beschrieben, da die Gruppe von Streptomyces griseus-Kulturen 1959» zwei Jahre nach Veröffentlichung der Ausgabe, geteilt wurde. Jedoch sowohl in Waksman als auch in "International Journal of Systemic Bacteriology" wird Streptomyces griseinus als "grisein-erzeugender Stamm von Streptomyces griseus" oder als "grisein-erzeugende oder grisein-ähnliche Substanz" definiert. Streptomyces griseus (MA-28J7) ist ein Stamm, der sich von der klassischen Beschreibung in Bergey und in Waksman insofern unterscheidet, als er ein Luftmycel besitzt, das vorwiegend braungelb und auf einigen Medien grüngelb mit einem etwas·abweichenden Kohlenstoffverbrauchsmuster ist. Waksman beschreibt auf Seite 111 und 1JJ von "The Actinomycetes" diese Streptomyces griseus-Reihe als eine Eeihe, Vielehe viele verwandte Species und Stämme umfasst, was sich durch farbloses bis oliv-sandfarbenes Substratwachstum, Luftmycel, das gelblich mit einer grünlichen Färbung oder grünlich-grau oder gelb-verbrannt oder gras-

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grün bis grau ist, Melanin negativ ist, gerade oder biegsame und in Büscheln erzeugte Sphorophore und ovale Sporen kennzeichnet. Die folgenden Tabellen vergleichen die Eigenschaften der das Antibiotikum 810A erzeugenden Kultur mit den Streptomyces griseus und Streptomyces griseinus-Kulturen.

Die Charakterisierung des Ausgangsisolats MA-2837 im Vergleich mit in Bergey und Waksman beschriebenem Streptomyces griseus und auch die Charakterisierung von MA-2837

im Vergleich mit dem in Waksman beschriebenem Streptomyc griseinus sind in den Tabelle I und Ia aufgeführt.

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Tabelle 1

Vergleich der Kultureigenschaften von MA-2837 Kultur

to co ω to

MA-2837

Sporophoren sind monopodial verzweigt unter Bildung von Büscheln, mit geraden "bis etwas gebogenen Sporenketten. Sporen: kugelförmig bis oval, Durchmesser 0,9 ja bis 0,9 χ 1,2ja in Ketten von etwa 1Ό - 15
Sporen. Vegetative
Hyphen von 0,9 M Breite (Glyc erin-Asparaginagar-9702)

Streptomyces * griseus (Bergey ) Streptomyces ₂ griseus (Waksman )

. Luftmycel: Reichlich, pulverförmig, wassergrün. Sporophore erzeugt in Büscheln. Sporen kugelförmig bis ellipsoid, 0,8 χ 0,8 bis 1»7/u. Vegetatives Wachstum: Kolonien glatt oder gefältelt, farblos, später nach oliv bis sandfarben übergehend Gerade in Büscheln zeugte Sphorphore. Sporen kugelförmig bis oval, 0,8 χ 0,8 bis 1,7/i "

glatt '

er-

Oberfläche

Streptomyces griseinus (Waksman^)

Gerade Sporophore erzeugt in Klumpen oder Büscheln ohne Spiralen.

Sporen stabförmig, 1,0 bis 1,8 χ 0,8 bis 1,0 μ

Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe (1957) Waksman, S.A., "The Actinomycetes", Band 2 (1961)

(JD OO

Tabelle la'

Vergleich der Kultureigensciiaften von MA-2857 Kultur

Medium

MA-2837

S. griseus
(Bergey)

S. griseus
(Waksman)

Tomatenpaste Hafermehl-Agar

CO

OO

to

Glyc erin-Asparaginagar

Czapek-Doxagar
(Sacharosenitrat·
agar)

Vegetatives Wachstum: Rückseite braun, eben, sich verbreitend,

Luftmycel: Mitte gelbbraun bis graugelb

Kante bräunlich-gelb

Lösliches Pigment: gelbbraun

Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun, eben, sich verbreitend, Luftmycel: pulverförmig, gelbbraun bis gelb Lösliches Pigment: hell, gelbbraun-gelblieh

Vegetatives Wachstum: Rückseite gelblichorange, eben, sich verbreitend,

Luftmycel: pulverförmig gelbbraun bis gelb (verschiedene Schattierungen, jedoch vorwiegend Rand gelbbraun-gelblich) leichtes Wachstum im Mittelpunkt und stärkeres an den Rändern,

Lösliches Pigment: hell, Selbbraun-gelblich

vn

S. griseinus (Waksman)

O CD OO

Wachstum spärlich, sich verbreitend, farblos, wird οIivbis sandfarben,
Luftmycel dick,
pulverförmig,
Wasser grün,
Pigment unlöslich

Sub stratwachstum faltig, Rückseite ererne-färben bis ^r bräunlich, Luftmycel: weiss bis creme-färb en mijb hellgrün-Ii chCTj^ Stich, Kein !etliches "Pt o-mf»n-h —

OO

cn

!Tabelle Ia (Fortsetzung)

Medium

MA-2837

OD CO OJ CD ^ I

CO ι

Bahragar

Agar

S. griseus
(Bergey)

S. griseus
(Waksman)

S. griseinus (Waksman)

Ei alb uminagar

Vegetatives Wachstum: Eückseite gräulich gelbbraun, eben, sich ausbreitend
Luftmycel: Gelbbraun bis gelblich mit grünlicher Schattierung, Rand gelbbraun gelblich, geringes Wachstum im Mittelpunkt, stärkeres Wachstum längs der Bänder

Lösliches Pigment: hell gelbbraun gelblich

Vegetatives Wachstum: Eückseite bräunlichgelb Luftmycel: Samtig, gelbbraungelb, Eand gelbbraun gelb

Lösliches Pigment: hell braun

reichliches,
cremefarbenes fast
transparentes Wachstum,

Luftmycel pulverförmig,
weiss bis hellgrau,
kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, fast transparent, creme-färben.
Luftmycel pulverförmig, weiss bis hellgrau, kein lösliches Pigment

O CD OO CJl

Tabelle la (Fortsetzung)

Medium

MA-2837

Syntheti scher
Agar

Gelatine-Ansatz

ITährgelatine-

agar

Lackmusmilch

S. griseus (Bergey)

S. griseus
(Waksman)

S. griseinus (Waksman)

Spärliches sich ausbreitendes farbloses Wachstum, das oliv bis sandfarben wird Luftmycel: dick, pulverförmig, wassergrün

Flockiges creme-färbenes Wachstum setzt sich am Boden des Eohrs ab. Vollkommene Verflüssigung

Vegetativ Wachstum: creme-färb en
Luftmycel: blass, gelbbraun gelb
Lösliches Pigment: keines

Verflüssigung der Gelatine : gut

Teilweiser Hing, Vegetatives Wachstum: bräunlich

Luftmycel: gering, weiss-Ii ch

Peptonisierung wird alkalisch

Grünlich gelbes
oder creme-farbenes Oberflächenwachstum mit bräunlichem Stich. Easche Verflüssigung

Wachstum cremefarben mit bräunlichem Stich -Luftmycel: fehlt oder spärlich, weiss.

Easche Verflüssigung

Creme-färb ener
Eing, Koagulierung mit rascher
Peptonisierung,
wird alkalisch

Wachstum cremefarben.

Coagulierung und Peptonisierung

Tabelle la (Fortsetzung)

Medium

MÄ.-2837

S. griseus
(Bergey)

S. griseus
(Waksman)

S. griseinus (Waksman)

Entrahmte Mich

Magermi 1 chagar

Glucοse-agar

Glueoseflüssigkeit

3?eilweiser Hing Vegetatives Wachstum:

Bräunlich

Luftmycel: keines Loslich.es Pigment:

hellbraun

Peptonisierung wird

alkalisch

Vegetatives Wachstum: ererne-färben, eben, sich ausbreitend Luftmycel: spärlich, gelblichweiss bis cremefarben Lösliches Pigment: sehr hellbraun Hydrolyse von Casein

Im Mittelpunkt verstärktes Wachstum
s trahlenförmig _?
creme-farben bis
orange, Rand gezackt

ReichliciLe, gelbliche Haut mit
grünlichem Stich.,
stark gefältelt

{Tabelle Ia (Fortsetzung)

Medium

MA-2837

Stärke-Agar

Nährstärkeagar

VJD

Kartoffelsclmitt

Vegetatives Wachstum: creme-färben Luftmyc el: "bla s s gelbbraun gelb Lösliches Pigment: keines
Hydrolyse gut

Vegetatives Wachstum:

hellbraun

Luftmycel: massig,

braungelb

leichtes Bräunlichwer-

de/n der Kartoffel

S. griseus
(Bergey)

S. griseus
(Waksman)

Dünnes» sich aus- Dünnes Wachstum,

breitendes trans- sich ausbreitend,

parentes Wachstum, transparent,

Stärke ist hydro- starke Hydrolyse
lysiert

Gelbliches, gefal- Bunzliges faltitetes Wachstum_? ges Wachstum,
bedeckt mit veis- gelblich bis
sem, pulferförmi- bräunlich, begem Luftmycel deckt mit weis-

sem, pulverförmigem Luftmycel

S. griseinus (Waksman) ^

Farbloses bis creme-farbenes Wachstum, Luftmycel: grauolive

Paltiges gelblieh weisses Wachstum
Luftmycel gräulich-weiss mit olive-färbenem Stich

Medium

Calciummalatagar

Tyr ο sin-Nahragar

MA.-2837

Tabelle la (Fortsetzung)

S. griseus
(Bergey)

Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend durchscheinend und farblos an den Rändern opak und creme-färben im Mittelpunkt. Luftmycel: Massig, cremefarben bis gelb, Bänder gelbbraun gelb Lösliches Pigment: keins

Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, creme-farben
Luftmycel: gelblich braungelb mit grünlicher Schattierung, Ränder gelbbraun-gelb

Lösliches Pigment: sehr hellbraun

Tyrosin-Kristalle zersetzen sich ,

Pepton-Eisen-Hefe- Vegetatives Wachstum:

Extraktagar creme-efärben

Luftmycel: keins Lösliches Pigment: keines Melanin negativ

S. griseus
(Waksman)

Grünes oder gelbes lösliches
Pigment, das auf
dem Calciummalat
und Succinatmedium erzeugt
wird

Häufig erzeugtes
dunkles Pigment

S. griseinus
(Waksman)

4* VJi

Keine löslichen Pigmente auf Calciummalat oder
Succinatmedium

Kein erzeugtes Pigment

Tabelle Ia (Portsetaung)

Medium

M/L-2837

Erzeugung von ELS

Loeffler's Blutserum-Schrägkultüren

Temperaturbereich

(Hefeextrakt-

Dextrose-Salz-

agarschrägkultu-

ren)

Mikroärophiles
VactLstum (Hefeextrakt-I) extr ο s e-SaIze-Ansatz
mm Tiefe)

Reduktion von
Nitraten zu Nitriten

S. griseus
(Bergey)

S. griseus
(Vaksiaan)

Negativ

Vegetatives Wachstum: gelbbraun

Luftmycel: hellgelblich

Lösliches Pigment: bräunlich

Vollkommene Verflüssigung

28° C gutes Wachstum 37~ C gutes Wachstum C kein Wachstum

Di e Oberfläche bedekkendes und längs der gesamten Ansatzlinie verlaufendes gutes Wachstum

Negativ

Negativ

S. griseinus (Waksman)

Negativ

Optimalt emp eratür
370 C

Positiv

Positiv

Positiv

Diese Beobachtungen erfolgten nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28° C, falls nicht anders vermerkt ist. Der pH-Wert des bei diesen Untersuchungen verwendeten Mediums war etwa neutral, d. h. 6,8 bis 7j2. Die physiologischen Versuche wurden nach Ablauf von 7 und 22 Tagen durchgeführt. Die zur Beschreibung verwendeten Farben entsprechen den Definitionen von "Color Harmony Manual", 4. Ausgabe, 1958» Container Corporation of America.

81QA Kohlehydrat-Verwendung:

Die Streptomyces griseus-Kultur (MA-2837) wurde auch hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Verwendung oder Assimilierung verschiedener Kohlehydrate durch das Wachstum des Mikroorganismus in synthetischem Ausgangsmedium (T. G. Pridham aüd D. Gottlieb, 1948), das 1 % des Kohlehydrats bei ^υ28° C während 3 Wochen getestet. Die folgende Tabelle II gibt den Verbrauch oder die Assimilation dieser Kohlehydratquellen durch die Streptomyces griseus Kultur (MA-2837) wieder. Die Erklärung der Zeichen in Tabelle II sind wie folgt: + bedeutet gutes Wachstum, + bedeutet schlechtes Wachstum und - bedeutet kein Wachstum auf dem speziellen Kohlehydrat.

Tabelle II

Kohlehydrat	MA-2837	Kohlehydrat	MA-2837
	Kultur		Kultur
Glucose	+	Lactose	+
Arabinose	+	Inosit	+
Xylose	+	Saccharose	+
Maltose	+	ßhammose	+
Mannose	+	Raffinose	+
Fructose	-	Cellulose	-
Mannit

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109833/1 836

Die in den Tabellen I, Ia und II beschriebenen Eigenschaften wurden zur Herabsetzung der Streptomyces griseus Kultur (HA.-2837) auf eine Klassifikation einer Species über den in "Bergeys's Manual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe, Seiten 694- - 829 (1957) und in "The Actinomycetes", Band 2, Seiten 61 - 292 (1961) beschriebenen Schlüssel verwendet. Ein Vergleich der Kultur (HA-2837) ^m^ bekannten Species zeigt, dass sie dem Streptomyces griseus ähnlich ist. Es bestehen morphologische Unterschiede, wie beispielsweise hinsieht der Farbe des Luftmycels, das bei Streptomyces griseus vorwiegend gelbbraum-gelb und grünlich-gelb ist, jedoch im Einblick auf die erhebliche Anzahl von Ähnlichkeiten und lediglich geringen Unterschieden ergibt sich keine Berechtigung für eine neue Species-Bezeichnung. Der Mikroorganismus (MA-2837), der clas Antibiotikum 810A produziert, wurde somit als ein Stamm von Streptomyces griseus identifiziert.

Zusätzlich zu der vorstehenden Kultur (MA-2837) wurden 25 weitere Kulturen als Erzeuger des Antibiotikums 810A identifiziert. Dazu gehören: drei Kulturen von Streptomyces griseus, elf Kulturen von Streptomyces viridochromogenes, fünf Kulturen von Streptomyces fimbriatus, drei Kulturen von Streptomyces halstedii, eine Kultur von Streptomyces rochei, eine Kultur von Streptomyces cinnamonensis und eine Kultur von Streptomyces chartreusis. Diese Streptomyces-Stämme werden als die folgenden Kulturen in der Kulturensammlung von Merck & Co., Ine, Rahway, New Jersey, identifiziert: MA-4160, MA-4174, MA-4171, MA.-4177, MA-4178, MA.-4180, MA.-4164, MA-4-165, MA-4-166, MA-4-167, MA-2892, MA-3265, MA-4-162, MA-4-163, MA-4-159, MA-4169, MA-4170, MA-4-179, MA-4-161, MA-^168, MA-4175, M-4181, MA-2938, ΜΑ-^-176 und MA-4173. Diese Kulturen wurden zur dauernden Hinterlegung bei der Kulturensammlung der Northern Utilization Research and Development Branch of the U.S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt.

- 23 -

1 0 S S i : / ' 8 3 6

Div- zugeeilten Kiüii-Kultiir-Beseiclinüngen eiiid wie folgt; Streptomyces R-risetisi

Mi-4160	MRRL 3951
MA.-4174	IJRRL 3953
MA-4171	MRRL 3952
Streptomyces viridochromogenes:
MA-4177	KRRL 3970
MA.-4178	NRRL 3971
MA.-4180	NRRL 3972
HA.-4164	NRRL 3966
MA-4165	NRRL 3967
MA.-4166	NRRL 3968
HA-4167	NRRL 3969
MA.-289 2	NRRL 3962
MA-3265	IiRRL 3963
MA-4-162	NRRL 3964
MA.-4163	NRRL 3965
Streptomyces fimbriatus:
MA.-4159	NRRL 3954
MA-4169	NRRL 3956
MA.-4170	NRRL 3957
MA.-4179	NRRL 3958
MÄ.-/+161	NRRL 3955
Streptomyces halstedii:
MA-4168	NRRL 3959
MA.-4175	NRRL 3960
MA-4181	NRRL 3961
Streptomyces rochei:
MÄ-2938	NRRL 3973
Streptomyces cinnamonesis:
MA.-4-176	NRRL 3974

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1098 3 3/1836

«505 ■ „ 210985.»

Streptomyces chartreusiss

MA-4173 HEEL

Die Charakterisierung der vorstehend erwähnten Isolate im Vergleich mit Streptomyces griseus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei, Streptomyces cinnamonensis und Streptomyces chartreusis sind in den folgenden !Tabellen 11a bis He wiedergegeben. *

109839/1836

Tabelle Ha

KuI tureigenschaf tender das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämme von

Streptomyces griseus

Medium MA-4160 MA-4174-

Morphologie Sporophore bilden Büsche mit geraden bis leicht gewundenen Sporenketten«

Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 μ Durchmesser bis 0,9 μ x 1,2/, in Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen ' ' '

Tomatenpaste- Vegetatives Wachstum: gut, eben, sich ausbreitend- ——-—=-■·■■

Hafermehlagar gelbbraun

Luftmycel: Luftmycel: pulver- Luftmycel:

pulverförmig, gelbbraun förmig, gelbbraun pulverförmig, gelbbrairi

' mit grünlicher Schat- mit stark grüner stark grüner Übertönung;

ro tierung Übertönung

Lösliches Pigments hellbraun — ———~—«—

Glycerin- Vegetatives Wachstum: gut, eben, gelbbraun

oSE^ tuftmycel: pulverförmig, gelbbraun mit grünlicher Schattierung und ^aßar - Vektoren

Lösliches Pigment: hellbraun

Csapek-Dox Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, transparent ——».-.-.-..-

^gar Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel:

massig, gelbbraun massig, gelbbraun massig, gräulich

oq Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: Lösliches Pigment

:?, ro

co ■ ' ■ ' '■'^!

m „ ,,

Tabelle IIa (Fortsetzung) Medium MA-4-160

Eefeextrakt - egetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, gelbbraun

Dextrose + Luftmycel: gut, pulverförmig, beige ——-———————·■

Salzagar

Lösliches Pigment: hellbraun = ————

Lösliches

Pigment auf . _{kein kein kein}

ο Pepton-Eisen-

co Hefe-Extrakt

ro agar

(.i'S UD

CD CO CXI

Tab ell e Ht

Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyces virido- ο

chromogenes ^

Medium

MA-2892

-3265 MA-4162'

Morphologie

Tomatenpaste-Hafermehlagar

Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen

auftreten.

Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 bis 1,2 ia Durchmesser und 0,9 bis 1,2 χ

1~,2 bis 1,7yU, Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen.

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstun

Glycerinasparaginagar

Eückseite braun

Luftmycel: samtig, dunkelgrau und weiss

Lösliches Pigment: hellbraun turn: Rückseite turn: Eückseite
gelbbraun dunkelbraun
Luftmycel: samtig, Luftmycel:
hellgrau und weiss samtig, bläulich-

grau und weiss

Lösliches Pigment: Lösliches Pigment
keines hellbraun

Eückseite braun

Luftmycel: samtig, mittelgrau und weiss

Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum:

Eückseite dunkelbraun turn·: Eückseite dunkelbraun
Luftmycel: hellgrau

und creme-

farben

Lösliches Pigment: hellbraun turn: Eückseite
dunkelbraun
Luftmycel:
creme-färben und
hellgrau

Lösliches Pigment: Lösliches Pigment:

hll

keines hellbraun

Bückseite braun

Luftmycel:

creme-färben und grau

Lösliches Pigment: hellbraun

Tabelle Hb (Fortsetzung)

Medium

MA-2892

MA-3265

MA-4162

ΜΑ-Λ163

Czapek-Dox Agar

CX? U5 CD

Hefeextrakt Dextros eagar

Vegetatives Wachstum : dunkelbraun

Luftmycel: seta? spärlich

Lösliches Pigment: dunkelbraun

Vegetatives Wachstum : dunkelbraun

Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: dunkelbraun

Luftmycel:
hellgrau und weiss

Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachs-

t um: Rucks ei s e

braun

Luftmyc el: hellgrau

Lösliches Pigment: keines

Lösliches Pigment auf Pep ton-Eisen-Hefe extraktsgar

Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmycel: sehr spärlich Lösliches Pigment: hellbraun Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmycel: sehr sparsam Lösliches Pigment : hellbraun

Vegetatives Wachstum: gelbbraun

Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigments hellbraun

Vegetatives Wachstums dunkelbraun

Luftmycel: sehr spärlich Lösliches Pigments hellbraun

dunkelbraun

CO OO CP

Medium

CO OO U)

Glycerin-Asparagin- agar

OO

on

Czapek-Lox Agar

MA-2892

Tabelle lib(Portsetzung)

U 3265 MA-4-162

Morphologie

Tomatenpaste Hafenn ehlagar

Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 bis 1,2 μ Durchmesser imcl 0,9 - 1,2 χ 1,2 - 1,7 JU , Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen

- Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun —-~™.-=,,-.,~=

Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel:

samtig, bläulich- samtig, mittel- samtig, mittelgrau samtig, dunkelgrau grau und creme- grau und creme- und creme-färb en und creme-färb ti.·::. farben farben

Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun

Luftmycel: dunkelgrau und cremefarben

Vegetatives Wachstum: braun

Luftmyc el: s ehr spärlich

Lösliches Pigment: braun

Lösliches Pigments hellbraun

Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum: Rückseite turn: duiikelgrau dunkelbraun

Luftmycel:
mittelgrau und
creme-färben

Luftmycel: spärlich gräulich

Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum: Rückseite turn: braun
braun .

Luftmycel: hell- Luftmycel: sehr

grau und creme- spärlich

farben Lösliches Pigment:

Lösliches Pigment: braun
hellbraun

Vegetatives Wa turn: Rückseite braun

Luftmye el s iiei und

Vegetative» U.v. ■·. turn: gelbbrat;»

Luftmycel: sera:· spärlich Lösliches Tigpiu hellbraun

Medium

Hefeextrakt-Dextrose- agar

Lösliches Pigment auf Pept/.on- Eisen-He fe extraktagar

Tabelle Hb (Fortsetzung)

MA-4-165

MA.-4-166

MA-A--1S?

Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmycel: sehr sparsam ■Lösliches Pigment: hellbraun

dunkelbraun

Tabelle Hb (Portsetzung)

OO Ca)

Medium

Morphologie

Tomatenpas teil aferm ehl a gar

Glycerin-

Asparaginagar

Czapek-Dox Agar

MA-4177

MA-4178 MA-4180

Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 bis 1,2 a Durchmesser und 0,9 bis 1,2 χ 1,2 bis 1,7 ü in Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun Rückseite braun

Luftmycel: samtig, dunkelgrau und weiss

Luftmycel: samtig, dunkelgrau Vegetatives Wachstum:
Rückseite braun

Luftmycel: samtig,
dunkelgrau und cremefarben

-Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Rückseite braun Rückseite dunkelbraun

Luftmycel: dunkelgrau

Luftmycel: dunkelgrau Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun

Luftmycel:

Gemisch aus hell und

dunkelgrau

■ Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: gelbbraun dunkelbraun gelbbraun

Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigment: hellbraun

Sabelle lib (Fortsetzung)

-a V>4 00 ι

Medium

Lösliches Pigment auf P ep t on-Ei s en-Hefeextrakt-

agar

MÄ.-4177

MA-4178

MA-4-180

Hefeextrakt Dextroseagar

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: dunkelbraun braun braun

Luftmycel: spärlich-gräulich

Luftmycel:
sehr spärlich

Luftmycel:
sehr spärlich

Lösliches Pigment: hellbraun

dunkelbraun

T a b e 1 1 e Hc

Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyceg

fimbriatus

Medium

MA-4169 MA-4-170

MA-A-179

MA-4161

Morphologie Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen und einige Schleifen, die Sporophorö sind als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind kugel- kurze Halcaa und förmig bis oval - 0,9 ja Durchmesser und 0,9 χ 1,2 η mit Ketten von Schleifen, öle &1& etwa 10 bis 15 Sporen' ^f Seitenzweige auf

Luftmycel auftreten. Spox/e/i Ia. Ketten von v.^w.w-' als 10 Sp^Ai^.iV

oval,
messer

₁S /! '1.-.V?"..! und 0,4 χ

Tomatenpaste Hafeaehl- agar

Vegetatives Vegetatives Wachs-Wachstum: Rück- turn: Rückseite seite gelbbraun gelbbraun Luftmycel: Luftmycel: massig, massig, hellgrau hellgrau Vegetatives Vegetatives
Wachstum: Wachstum:
Rückseite gelb-Rückseite gelb

braun
Luftmycel!
massig, hellgnra und cremefarben

braun
Luftmyc el
spärlichgräulich

turn: gelbbraun

Luf tmy ce¹.;¹. spärlich.·, ^,v-l-u

Glycerin-

Asparaginagar Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachs- Vegetatives Vegetatives
turn.: dunkelbräun- Wachstum: Wachstum:

Vegetatives

Wachstum: dun-

kelbräunlichtis lieh bis grau dunkelbräun- dunkelbräun-

grau lieh bis grau lieh bis grau

Vegetatives Wach tum: Kückueite gelbbraun mit rö tli ch ^el Velrtos: or."

Tabelle Hc ( Ports etz α ag )

Medium

MA-4-I7O

MA-4-179

IU-4-161

Czapek-Dox
Agar

CO
CO
CO
CO

Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich bis grau

Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigment ί braun

Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum: dunkelbräun- turn: dunkelbräunlieb, bis grau lieh bis grau

Luftmycel: massig, Luftmycel: massig,

grau grau

Lösliches Pigment: Lösliches Pigment:

braun braun

Vegetatives ·
Wachstum: dunkelbräunlich
bis grau

Luftmycel:
sehr spärlich

Lösliches

Pigment:

braun

Hefeextrakt Vegetatives Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachs- Vegetatives

Dextrose + Wachstum: turn: dunkelbräun- turn: dunkelbräun- Wachstum: dun-

dunkelbräun- lieh bis grau lieh bis grau kelbräunlich

lieh bis grau bis grau

Luftmycel: sehr spärlich

vwi* Salz-Agar

Vegetatives

Wachstum;

gelbbraun

Luf tmy c el s spärlich

Lösliches Pigment:
hellbraun

Vegetatives

Wachstum:

braun

Lösliches Pigment: braun

Lösliches
Pigment auf
Pepton-Eisen-"
Hefeextrakt-

Agar

dunkelbraun

!Tabelle lld

co cn u-

Xulturexgenscliaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Str'eptomyces halsteäii

Medium

Morphologie

Tomatenpaste Hafsrmehlagar

Glyc erin-Asparagin-Agar

MA-4168 MÄ.-4181

Sporophore sind lange, lose Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 M Durchmesser und 0,9 χ 1,2 ja. - in Ketten von mehr als 10 Sporen '

Vegetatives Wachstum: Bückseite braun

Luftmycel:

pulverförmig, dunkelgrau

Vegetatives Wachstum: Eückseite braun bis dunkelbraun

Luftmycel:

pulverförmig, dunkelgrau und weiss Vegetatives Wachstum: Eückseite gelbbraun

Luftmycel:

dunkeigrau und weiss, pulverförmig

Vegetatives Wachstum: Eückseite braun

Luftmycel: dunkelgrau und weiss

Lösliches Pigment: keines '

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:

Eückseite gräulich

Luftmycel:

pulverförmig, vorwiegend dunkelgrau gemischt mit hellgrau und weiss

Lösliches Pigment: keines

Eückseite gräulich

Luftmycel:

dunkelgrau, pulverförmig

Tabelle Ild (Fortsetzung)

Medium

Gzapek-Dox

Agar

Hefeextrakt Dextrose + SaIζ-Agar

Losliches 0⁵^ Pigment auf Pepton-Eisen-Eefeextrakt- Agar

MA.-4-168 MA-4-181

Vegetatives Vaclistum: creme-färben

Luftmycel: gräulich cremefarben

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum;

Rückseite rötlich- creme-färben

braun

Luftmyc el: Luftmyc el:

gräulich creme-farben sehr spärlich

Vegetatives Wachstum: gelbbraun

Luftmycel: gräulich, spärlich Lösliches Pigment: keines

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: gelbbraun braun

Luftmycel:
spärlich, gräulich

Lösliches Pigment: keines

keines

Luftmycel:
spärlich, gräulich

„λ

Tabelle lie

Kuitureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Streptomyces Species Medium MA-2938 MA-4-176 MA-4-173

Morphologie

(O
CO
CO
CO

Somatenpaste -

Eafermehl-Agar

GIyc erin-Aspa-

ragin-Agar

Streptomyces rochei Sporophore bilden kompakte Spiralen,die als Seitenketten von etwa 10 - 15 Sporen kugelförmig bis oval, 0,9 >u Durchmesser und 0,9 x 1,2 u auftreten

Vegetatives Wachstum: Rückseite rötlich bis

: mittel

grau

Lösliches Pigment: keines

Vegetatives Wachstum: Rückseite rötlich bis braun

Luftmycel:
mittelgrau

Lösliches Pigment: keines

Streptomyces^cinnamonesis
Sporophore sind Haken,
Schleifen und einige lose
Spiralen, die als Seitenzweiße auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind
in Ketten von mehr als
10 Sporen, kugelförmig
bis oval, 0,9 <u Durchmesser und 0,9 x'1,2 n.

Vegetatives Wachstums
gelbbraun

Luftmycel: beige mit
rosa Färbung, samtig

Lösliches Pigment:
braun

Vegetatives Wachstum:
Rückseite dunkelrötlich
bis braun

Luftmycel: beige mit
rosa färbung

Lo ε I ;i, c h e s Pi gia e nt ι
braun

Streptoayces chartreusis Sporophoren sind korapak'öe Spiralen, die als Seitenzvi ei ge auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind in Ketten von mehr al::: 10 Sporen, kugelförmig bl? oval, 0,9 bis 1,2ja Durchmesser und 0,9 bis i_t2 ::, 1,2 bis 1,7 ja

Vegetatives Wachstums hellbraun mit orange "bis braunen Vektoren Luftmycel: pulverförmig, dunkelgrau mit blau-grüner I'ärbung Lösliches Pigment: ti . ί:.

Vegetatives Wachstum: braun

Luftmycel: sehr spärlich

Ifö s 1 i c h e s Pi gm en 11 hellbraun

■ '-λ ν ■■■

Tabelle He (Fortsetzung)

ο co co ω

Medium

Czapek-Dox Agar

Hefeextrakt Dextrose + SaIz-Agar

Lösliches Pigment auf Pepton-Eisen-Hefeextrakt- Agar

MA-2958

Vegetatives Wachsturn: rötlichbraun

Luftraycel: sehr sparsam

Lösliches Pigment: keines

Vegetatives Wachstum: gelbbraun

Luftmycel: gräulich

Lösliches Pigment: hellbraun

keines Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun

Luftmycel: massig,beige mit rosa Färbung

Lösliches Pigment:
braun

Vegetatives Wachstum: braun

Luftmycel: spärlich, creme-färben bis weiss

Lösliches Pigment:
hellbraun

dunkelbraun

MA-4173

Vegetatives Wachstums orange- bis braun

Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigments heilbraun

Vegetatives Wachstum.· braun

Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigment: braun

dunkelbraun

ο co oo cn

Die vorstehende Beschreibung der das Antibiotikum 810A erzeugenden Mikroorganismen dient einfach zui¹ Erläuterung der verwendbaren Arten von Stämmen und nicht zur Begrenzung der Erfindung auf einen Organismus, der die Merkmale dieser speziellen Beschreibung erfüllt. Die Erfindung umfasst die Verwendung anderer Mikroorganismen einschliesslich Stämme von Actinomyceten, die aus der Natur isoliert oder durch Mutation erhalten werden, beispielsweise solche, die durch natürliche Auswahl erhalten werden oder solche, die durch Mutationsmittel, beispielsweise Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, Ultraviolett-Bestrahlung, Stickstoffsenfgase und dgl., die unter geeigneten Bedingungen ein identisches Antibiotikum ergeben, erhalten werden»

842A Kultur: Der das Antibiotikum 842A erzeugende Mikroorganismus ist ein bisher unbekannter Stamm von Actinomycete. Das ursprüngliche Isolat wurde als eine Einzelkolonie aus Boden auf einer Agar-Schrägkultur erhalten und in einem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:

Medium B:

Hefeextrakt 10,Og

Glucose 10,0 g

# Phosphat-Puffer 2,0 ml

MgSO₄-7H₂O 0,05 S

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

pH 6,5

* Phosphat-Puffer:

KH₂PO₄ 91,0g

Na₂HPO₄ 95,0 6

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

Es wurde festgestellt, dass nach mehrtägigem Wachstum keine Sporenbildung festgestellt werden konnte. Der Mikroorganismus erzeugte ein Antibiotikum, das sich von bekannten Antibiotika auf Grund seines Profils in verschiedenen biologischen

10 9 8 3 9/1836

und chemischen Untersuchungen unterschied» Vergleiche dieser Daten mit solchen, die über bekannte Antibiotika erhalten wurden, ergaben, dass-842A ein neuer Körper war.

Taxonomie: Der 842A erzeugende Mikroorganismus (Kultur MA-29O8) wurde als ein neues Actinomycete identifiziert. Die bei dieser Bestimmung verwendete Taxonomie ist in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7» Ausgabe und in "The Actinomycetes", Band 2, "Classification, Identification and Description of Genera and Species", S. A. Waksman (196"O beschrieben. Unter Verwendung dieses Verfahrens, wurde festgestellt, dass die Kultur zum Genus Streptomyces gehört und viele der Attribute der bekannten Species Streptomyces fradiae besitzt. Biochemisch stimmt sie hauptsächlich vollständig mit letzterer überein. Morphologisch bestehen jedoch wesentliche Unterschiede. Beispielsweise ist die Farbe des Luftmycels von S. fradiae ein seemuschelfarbenes Eosa, während die Kultur MA-2908 gewöhnlich cremefarben gefärbt ist. Auch zeigt das vegetative Wachstum in der MA-2908-Kultur Pigmentunterschiede auf verschiedenen verwendeten Medien, und, wie vorstehend angegeben, wurde auf Standard-Taxonomie-Medium keine Sporenbildung wahrgenommen. Auf der Basis dieser Unterschiede wurde die Kultur als eine neue Species: Streptomyces lactamdurans bezeichnet. Die folgende Tabelle III beschreibt die biochemischen Eigenschaften der Streptomyces lactamdurans-Species und solche der bekannten Streptomyces fradiae. Sämtliche Werte in Tabelle III wurden nach 3 wöchiger Inkubierung bei 28° C ermittelt, ausgenommen dort, wo es anders vermerkt ist. Der pH-Wert des verwendeten Mediums bei diesen Untersuchungen war etwa neutral, nämlich 6.8 bis 7»2. Die physiologischen Versuche wurden nach Ablauf von 7 und 21 Tagen durchgeführt.

1098 39/1836

ΐ a >:< e j, I e

842A biochemischer Vergleich

7ersuch	Streptomyces lactaradurans	Streptomyces fradxaa
Luftmycel	gerade, einige Verzw ei gung en	gerade, Verzweigimgs- fäden
G oni dien	nicht ermittelt	stabförmig
Lösliches Pigment	keines	keines
optimale Tempe ratur	28° C	25° C
Invertase	negativ	negativ
Reduktion von Nitrat	negativ	negativ
Gelatine-Ver flüssigung	positiv	positiv
Oellulose- verbrauch	negativ	negativ
Lackmusmilch	alkalische Pep t oni si er ung	alkalische Peptoni si erung
842A Morphologie:

ßporophore wurden nicht ermittelt, wenn die Kultur auf den bei der Beschreibung der Kultureigenschaften aufgeführten Medium gezüchtet wurde, selbst obgleich wiederholte Beobachtungen bis zu 8 Wochen durchgeführt wurden. Jedoch zeigten gefärbte Impressionsobjektträger lange Fäden, von denen viele in Untereinheiten verschiedener Grossen im allgemeinen breitgeformt und von etwa 0,9 x 1,7/U Grosse unterteilt waren.

Das Luftmycel ist kurz, gerade, wenig verzweigt. Es scheint etwa die gleiche Grosse wie das vegetative Mycel aufzuweisen 0,9 XL Breite. Es ist hell, pulverförmig und leicht abkratzbar.

109839/1836

Bas vegetative Mycel ist grammpositiv, nicht säurefest. Es haftet fest an dem Agar und ist in einigen Fällen in den Agar eingebettet. Es besteht eine gewisse Aufspaltung zu Stäben bei der Schüttelkolbenzüchtung, die jedoch nicht erheblich ist. Das vegetative Mycel auf den Schüttelkolben und den stationären Kolben (Impfmedium, 4 bis 6 Tage, 28° C) zeigte einige "Keime" und kurze, verdickte, fast knoten- oder keulenartige Segmente auf dem Mycel, jedoch waren diese nicht zahlreich und ihre Bedeutung, falls überhaupt, ist nicht bekannt.'

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite orange, eben, trockenes Aussehen, faltig

Luftmycel - spärlich, creme-farben ICein lösliches Pigment

Czapek-Dox Ap;ar

Vegetativ - eben, tiefcreme-farben Luftmycel - pulverförmig, creme-farben weiss Kein lösliches Pigment

Glyc erin-Asparap:in-Ap;ar

Vegetatives Wachstum - eben, Rückseite goldgelb bis orange Luftm5^Tcel - pulverförmig, creme-farben mit blasspfirischfarbenen Tönungen
Lösliches Pigment - blass-bernstein-farben

Eialbuniin-Agar

Vegetatives Wachstum - eben, creme-farben bis gelb Luftmycel - pulverförmig, creme-farben Kein lösliches Pigment

Calcium-Halat-Aftar

Vegetatives Wachstum - eben,Rückseite - gelb mit orange-

- 45 10 9 8 3 9/1836 , :

färb en ein Rand Luftmycel - pulverförmig, weiss bis creme-farben mit pfirsich-färbenem Hand Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum - eben, gelbbraun bis orange Luftmycel - spärlich, creme-farben mit weiss Kein lösliches Pigment .!yrosin-Kristalle werden zersetzt

Melasse - Hefe-Hydrolysat-Ap-ar

Vegetatives Wachstum - eben^Rückseite - orange Luftmycel - pulverförmig, creme-farben weiss Kein lösliches Pigment

NähraRar

Vegetativ - eben goldgelb Luftmycel - pulverförmig, creme-farben Kein lösliches Pigment

Lackmusmilch

Spärliches Ringwachstum - gelbbraunes, vegetatives Wachstum kein Luftmycel Peptonisierung: alkalische Reaktion pH 7,3 bis 7,4 (Vergleich pH - 6,7)

Entrahmte Milch

Spärliches Ringwachstum - gelbbraun bis orange Vegetatives Wachstum - kein Luftmycel hell-gelbbraunes lösliches Pigment Peptonisierung - alkalische Reaktion PH 7,2 (Vergleich pH - 6,6)

Magernd lch-Agar

Vegetatives Wachstum - eben, orange

- 44 -

109033/1836

Luftmycel - massig, ererne-färben bis blass-korallen-farben hell-gelbbraunes lösliches Pigment
Hydrolyse von Casein

Gelatine-Ansatz

spärliches, creme-färbenes bis orange-farbenes, vegetatives Kolbenwachstum innerhalb des Rohrs suspendiert
Kein lösliches Pigment
Vollständige Verflüssigung

Gelatine-Nähragiar

Vegetatives Wachstum - eben, orange Luftmycel: spärlich, pulverförmig creme-farben Kein lösliches Pigment Verflüssigung von Gelatine

Stärke-ÜTähragar

Vegetatives Wachstum - eben, orange-farben
Luftmycel - spärlich, pulverförmig, rosa-farben bis cremefarben

Kein lösliches Pigment Massige Hydrolyse der Stärke

Synthetischer Stärkeagar

Vegetatives Wachstum - eben, Rückseite creme-farben mit

orange-färbenem Rand

Luftmycel - pulverförmig, weiss mit pfirsich-färbenem Rand

Kein lösliches Pigment Massige Hydrolyse der Stärke

Löffler's Blutserum-Agar

Vegetatives Wachstum - creme-farben bis orange Luftmycel - keines Kein lösliches Pigment Keine Verflüssigung

- 45 -

1098 3 9/1836

^r%° t# 21 O 9 η 5 ΐ

FsOton-Eiaen-Esfeextrair-t-Aprar

Vegetatives Wachstum - creme-färben Luftmycel - spärlich, weiss Kein lösliches Pigment

itLkroaerophiles Wachstum

(Hefeextrakt - Dextrose-Stichkultur - 40 mm Tiefe des Stichr-) Gutes Oberflächenwachstum längs des oberen 1/4 der Stichliriis

Temperatur ~ Hefeextrakt-Dextrose-Schräprkulturen

Gutes Wachstum bei 28° C Spärliches Wachstum bei 37° ^c Kein Wachstum bei 50° C.

Hefe extrakt - Dextroseap;ar

Vegetatives Wachstum - eben, goldgelb

Luftmycel - pulverförmig, creme-farben bis blas fleisch-farbsn

Kein lösliches Pigment

Kartoffelschnitt

Vegetatives Wachstum - trocken, eben, creme-färben bis orange Luftmycel - spärlich, creme-färben
Kein lösliches Pigment

Reduktion von Nitraten - negativ.

Sämtliche Werte wurden nach 3 wöchiger Inkubierung bei 28° G genommen, ausgenommen, wo es anders vermerkt wird. Physiologische Versuche erfolgten nach 7 and 21 Tagen.

Die morphologischen Unterschiede zwischen Streptomyces lactamdurans und Streptomyces fradiae sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt. Die Beobachtungen erfolgten auf den in Tabelle IV angegebenen Medien in Wachsintervallen von

10 9 8 3 9/1836

1 Woe 1:2, 3 Voolien and 8 Wochen. Das Luftmycel von S„ Iac ü»>.— cLurar-s Ist kurz und gerade mit wenig Verzweigung. Es scheint etwa die gleiche Grosse wie das vegetative Mycel aufzuweisen, α» h. 0,9 /U Breite, Es ist hell« pulverförmig und leicht abkratzbar. Das vegetative Hycel ist gram positiv; es'ist nicht säurefest. Es haftet fest an einigen Medien und ist in Agar eingebettet. Es besteht eine gewisse Aufspaltung in Stäbe bei Schüttelkolben-Wachstum, jedoch ist dies nicht erheblich. Das vegetative Mycel aus Schüttelkolben und stationären Kolben (Iiapfmedium "währexid 6 !Tagen, 28° C) zeigt einige "Keime" und kurze, verdickte, fast keulenförmige Segmente auf dem Mycel, jedoch waren diese nicht zählreich. Sämtliche Werte in Tabelle IV wurden nach 3wöchiger Inkubierurin; bei 28° C genommen, ausgenommen dort, wo es anders vermerkt ist. Der pH-Wert des zu diesen Untersuchungen verwendeten Mediums war "etwa neutral, d. h. 6,8 bis 7,2. Die physiologischen Versuche erfolgten nach Ablauf von 7 und 21 Tagen. Die zur Beschreibung verwendeten Farben stehen in Übereinstimmung mit den Definitionen nach "Color Harmony Manual", 4·. Ausgabe, 1958; Container Corporation of America.

109839/1836

S? a

belle

842Α Morphologischer Vergleich von Streptomyces lactamdurans und Streptomyces fradiae Medium Streptomyces lactamdurans Streptomyces fradiae

Czapek-Dox
Agar

Eahragar

GIyc erin-Asparagin-

Vegetatives Wachstum: eben, tief-cremefarben Luftmycel: pulverförmig, creme-farben-

weiss
Kein Lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum: eben, creme-far-

fen bis goldgelb

Luftmycel: pulverförmig, creme-farben Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum: eben, Rückseite

goldgelb bis orange 'Vegetatives Wachstam: farblos Luftmycel: Muschelschalenrosa

Vegetatives Wachstum: orange bis gell)

- Vegetatives Wachstum: sand-farben

Luftmycel: pulverförmig, creme-farben mit blass-pfirsich-farbener Tonung

Lösliches Pigment: blass-bernstein-far-

Td en

Vegetatives Wachstum: eben,.goldgelb

Luftmycel: pulverförmig, creme-farben bis blass-fleischrosa

Kein lösliches Pigment

Synthetischer Vegetatives Wachstum: eben, Rückseite

creme-färben mit orange-färbenen Rändern Luftmycel: pulverförmig, veiss- mit

pfirsich-färbenen Rändern Lösliches Pigment:
Massige Hydrolyse der Stärke

Hefeextrakt
JDextrose-

y
Stärkeagar

Vegetatives Wachstum: sand-farben

Vegetatives Wachstum: farblos Luftmycel: Seemuschelrosa

Tabelle IY (Fortsetzung)

fco σ>

Medium

Kartoffel-

schnitt

Gelatinestich

Lackmusmilch

Streptomyces lactumdurans

Vegetatives Wachstum: trocken, eben,

creme-farben bis orange

Luftmycel: spärlich, creme-farben

Kein Lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum; spärliche, cremefarbene bis orange-färbene Flocken suspendiert in dem Rohr

Luftmycel:

Kein lösliches Pigment

Vollständige Verflüssigung

Vegetatives Wachstum: gelbbraun, spärlicher Wuchsring

Luftmycel: keines

Peptonisierung: alkalische Reaktion,

pH 7,3 bis 7,4-(Vergleich pH- 6,7) Streptomyces fradiae

Vegetatives Wachstum: orange

Vegetatives Wachstum: creme-färben bis

braun

Vegetatives Wachstum: creme-farben

14303

210985*

Kohleh.yd.rat-Verwertong: Die Söreptcruj/ces

Kultur (MA-2908) wurde auch hinsichtlich ihrer !'ähißkeiu, verschiedene Kohlehydrate zu verwerten, oder zu assimilieren, untersucht, indem der Mikroorganismus in einem synthetischen Grundmedium (T. G. Pridham und D. Gottlieb, 194-8)? das 1 % des Kohlehydrats enthielt, bei 28° C während 3 Wochen gezüchtet wurde. Tabelle V gibt die Verwertung oder Assimilation dieser Kohlehydratquellen durch die Streptomyces lactamdurans Kultur (MA-2908) wieder. Die Erklärung der Zeichen in Tabelle V sind wie folgt: + bezeichnet gutes Wachstum, - bezeichnet geringes V/achstum und - bezeichnet kein Wachstum auf dem speziellen Kohlehydrat.

Tabelle V

Kohlehydrat

Glucose Arabinose Maltose Eaffinose Saccharose Xylose Mannit Lactose Mannose

MA-2908 Kultur

Kohlehydrat

Rhamnose Cellulose Fructose Inosit Acetat Citrat Paraffin Glycerin

MA-2908 Kultur

Die in den Tabellen III, IV und V beschriebenen Eigenschaften wurden zur Zurückführung der Streptomyces lactamdurans Kultur (MA-2908) auf eine Species-Klassifikation über die in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe, Seiten 694 bis 829 (1957) und. in "The Actinomycetes", Band 2, Seiten 61 bis 292 (1961) beschriebenen Schlüssel verwendet. Ein Vergleich der detailierten Eigenschaften der Streptomyces lactamdurans Kultur mit bekannten Species zeigt, das«

109839/1836

Ύ 210985

d;.e Ä'ulfcur biochemisch. Streptcrcyces fradiae ähnlich ist* Jsdoch "bestehen, \äe oben angegeben, bedeutende morphologische Unterschiede, beispielsweise hinsichtlich der Farbe des Luftoycels von S. fradiae, die seemuschelrosa-farben ist im Vergleich zur Creme-Farbe der Kultur. Auch wurde, während das vegetative Wachstum bei S. fradiae keine Pigmentunterschiede auf verschiedenen Medien ergibt, keine Sporenbildung bei der Kultur festgestellt. Auf der Basis dieser Unterschiede und der in den vorangehenden Tabellen beschriebenen Eigenschaften, wurde der das Antibiotikum 84-2A (MA-2908) erzeugende Mikroorganismus als neue Species Streptomyces lactamdurans bezeichnet.

Die vorangehende Beschreibung des Mikroorganismus, welcher das Antibiotikum 84-2A erzeugt, dient lediglich zur Erläuterung des Art von Stämmen der Mikroorganismen, die verwendet v/erden können, und nicht zur Begrenzung auf Mikroorganismen, welche diese spezielle Beschreibung erfüllen. Die Erfindung schliesst die Verwendung anderer Mikroorganismen ein, einschliesslich Stämme von Actinomyceten sowohl isoliert aus der Natur als auch durch Mutation erhalten, beispielsweise liefern solche, durch natürliche Auswahl solcher durch Mutationsmittel, wie beispielsweise Röntgenctrahl-Bestrahlung, -Ultraviolett-Bestrahlung, Stickstoffsenfgase und dgl., erhaltene Stämme unter geeigneten Bedingungen das Produkt 842A.

In vitro und in vivo Untersuchungen

Antibiotikum 81QA, in vitro: Die biologische in vitro Charakterisierung des Antibiotikums 810A erfolgte durch, die Petri-Schalen-Agar-Diffusionsmethode. Diese Versuche wurden so durchgeführt, dass mit der Antibiotikumlösung angefeuchtete 7 mra-Scheiben auf die Oberfläche von Petri-Schalen gebracht wurden, die mit 5 ml Difco-Nähragar und 0,2%igex Hefeextrakt begossen wurden, der mit 5 oder 10 ml Impfstoff

109839/1836

21Π9854

je 150 ml Medium beimpft vrar, und bei 25° C oder 37° C 16 Stunden inkubiei-t wurde. Die Methode und Abhandlung über diese Versuche sind in der Veröffentlichung: "Cross Resistance Studies and Antibiotic Identification", applied Microbiology, Band 6, Seiten 392 bis 398 (19^0) beschrieben. Die folgenden Tabellen VI, VlI und VII geben die Ergebnisse dieser Versuche hinsichtlich der antibakteriellen und Kreuzungsresistenz wieder und führen die verwendeten Versuchsorganisnien und die angewendeten Bedingungen auf*

-52-108833/ 1836

Tabelle VI

Iestorganismus

Eschericnia coli Bacillus species Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Sarcina lutea Stphylococcus aureus (Streptomycin-Streptotnricinresistent)

Streptococcus faecalis Alcaligenes faecalis Bruceila Dronchiseptica Salmonella gallinarum Vibrio percolans Xanthcmonas vesicatoria

eriell	es Spektrum, in vitro	ml , !Temp. C	Wirksamkeit
Sestbedingungen	25	Inhibierungszone,
	25	Durchmesser
	37	mm *
	25	810A
	25	5 mg/ml
Impfstoff** Inkubigrung	25	15
ml7i5O	25	22
5	25	29
5	37	7
5	37	7
LfN	37	26
5	37	33
5	25	26
5	27	19
5	25	7
LA	25
15	21
5	15
10	36
10	15
10
5

VM O VJl

7 mm = Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet)

Übernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 am auf dem Lumetron-Colorimeter

UJ LTl

Tabelle VII 810A Kreuzungsbeständigkeit, in vitro Untersuchung

Escherichia coli - Stamm**

Unt ersuchungsbedingungen

CO OO OJ CO

CO CaJ

Sensitiver Ausgangsstamm Streptomycin-resistent Streptothricin-resistent OJAI iYC IK- r e s i s t en t Pieojiidiii-resistent CLlcraiuphenicol-resistent Chlortetracyclin-resistent G^ytetracyclin-resistent Nsonycin-resistent üetracyclin-resistent Vioraycxn-resistent P

yp Grisein-resistent

Impfstoff***	Inkubierung
ml/150 ml	Temp. 0C
5	25
	.25
10	25
10	25
10	57
10	25
10	25
10	25
10	57
10	25
10	57
10	25
VJi	25

Inhibi erungss one Durchmesser

Π1ΠΓ

mg/ml

15

15

17

10

17 15 15

7 mm = Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet)

Versuche gegenüber einer Seihe von Stämmen von E. coli^isoliert aus der gleichen Ausgangskultur durchgeführt und anschliessend gegenüber den einzelnen Antibiotika ausgesetzt

übernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 diai auf dem Lunetron-Colorimetei?

Tabelle VIII 810A spezielles Virkungsspektral, in vitro Untersuchung

Escherichia coli W-MB-60 (mit speziellen Zusätzen wie angegeben)

Vergleich (keine Zusätze) 0,1 Hol. Phosphat-Puffer - JpH 0,1 mol, Phosphat-Puffer - pH 0,1 mol.Phosphat-Puffer - pH Menschliches Blutplasma 20 % Kationen-Austaucchharz (Dow ET 91-1%» Agar-Konzentration

auf 1 % nur für die Harzplatte

herabgesetzt)

Testb edingungen	Inkubierung Temp. C	Inhibi erungss one Durchmesser
Impfstoff* ml/150 ml	25	öl OA 5 mg/ml
VJl	25	13
5	25	13
5	' 25 '	16
5	25	18
5	25	15
5	12

* 7 nim Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet) '* tJbernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 au auf dem Lumetron-Colorimeter

Antibiotikum 810Α,, in vivo: Die biologische in vivo Charakterisierung ergibt₅ dass 810A ein Antibiotikum mit breitem VirkungsSpektrum ist, das gegen Infektionen mit drei Species γόη Proteus, zwei von Salmonella, einem Stamm von Escherichia coli, zwei von Klebsialla unddrei gram-positive Organismen: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und Diplococcus pneumoniae schützt.

Methode: Die zu dieser Charakterisierung verwendete Methode ist wie folgt: Weisse, weibliche Schweizer Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 20 bis 33 g wurden intraperitoneal mit dem 3- bis 20fachen der Anzahl an Organismen infiziert, die als lethal für 50 % der infizierten Kontrolltiere berechnet wurde (LD^-Dosis 3 bis 20). Zum Zeitpunkt der Infektion und wiederum 6 Stunden später, wurde über den bezeichneten Weg Therapie angewendet. Kontrollen der Virulenz der Kultur und der Toxizität des Antibiotikums für nichtinfizierte Mäuse wurden in die Versuche eingeschlossen. 7 Tage nach der Infektion wurde der Versuch als beendet erachtet, und die Menge des Antibiotikums (I), die zum Schutz von 50 % der infizierten und behandelten Tiere notwendig ist, wurde nach der Methode von Knudsen und Curtis, J. Amer. Stat. Assoc, Band 42, Seite 282 (1947) berechnet.

Ergebnisse: Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle IV aufgeführt. Diese Daten zeigen, dass das aus der Kultur MA-2837 erhaltene Antibiotikum 810A ein Mittel mit breitem Virkungsspektrum ist, das sowohl gegen gram-positive als auch gram.-negative Organismen schützt.

Obgleich Wirksamkeit bei oraler Verabreichung (p.o.) erzielt wurde, erhielt man die besten Ergebnisse über den subkutanen (s.c.) oder intraperitonealen (i.p.) Weg. Das antibiotische Gemisch tötete keine nichtinfizierten Mäuse, wenn zwei Dosierungen, die jeweils 1 mg des Produktes enthielten _y

- 56 10S839/ 1836

14305

intraperitoneal verabreicht wurden, oder wenn zwei Dosierungen von jeweils 18 mg subkutan oder oral verabreicht wurden.

Tabelle IX

810A in vivo	Testorganismus	Wirksamkeit	33 500 12100 200 5000
Proteus vulgaris Proteus mirabilis		419 9000
Salmonella schottmuelleri	EI) Therapie- 50 in Mikrogramm weg x zwei Dosierungen	3750
Escherichia coIi	i.p. S.C. Ρ·ο. i.p. p.o.	1330
Escherichi coIi	i.p. S.C.	2500
Klebsiella pneumoniae	i.p.	1670
Salmonella gallinarum	i.p.	625'
Salmonella pullorum	i.p.	258
Diplococcus pneumoniae	i.p.	927
Staphylococcus aureus	i.p.	625
Streptococcus pyogenes	i.p.	Die biologische in vitro
Antibiotikum 842A, in vitro:	i.p.
i.p.

Charakterisierung erfolgte nach der Scheibenplatten-Agar-Diffusionsmethode. Dieser Versuch wurde so durchgeführt, dass 7 mm Scheiben, die mit der Antibiotikumlösung angefeuchtet waren, auf die Oberfläche von Petri-Schalen gebracht v/urden, die mit 5 ⁿⁱl Difco Nähragar und 0,2 % Hefeextrakt, die mit 5 oder 10 ml Standard-Zellsuspension (OD = 0,22 bei 660 mu) je 150 ml Medium beimpft waren, Übergossen wurden und bei 25° C oder 37° C 16 Stunden wie angegeben inkubiert wurde. Die Methode und Abwandlung dieser Versuche sind in der Veröffentlichung: "Cross Resistance

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109839/1836

2109-

Btuoi.es and Antibiotic Identifies ti on"» Applied Band 6, Seiten $92 bis 598 (1958) beschrieben. Die folgenden Tabellen geben die Ergebnisse dieser Versuche bezüglich iztantibakteriellen Spektrums und der Kreuzungsresistenz wieder und führen dj.e angewendeten Testorganismen und die νervjendet en Bedingungen an.

- 58 -

109839/1836

Tabelle X

842A antibakterielles Spektrum, in v:^! tro Wirksamkeit

Testorgani smus

Testbedingunpren

Escherichia coli Bacillus sp. Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Sarcina lutea Staphylococcus aureus (Streptomycin-Strepto-

thricin-resistent) Streptococcus faecalis Alcaligenes faecalis Brucella bronchiseptica Salmonella gallinarum Vibrio percolans Xanthomonas vesicatoria

lDXDfstoff	±nkubierung
ml7i5O ml	Temp. 0C
5	25
VJl	25
VJl	37
VJl	25
5	25
VJl	25
VJl	25
VJi	25
VJl	37
15	37
5	37
10	37
10	25
10	27

20	18
8	7
22	24
7	7
7	7
7	7
13	18
10	9
11	10
7	7
27	η
24	26
21	25
30	38

25 I.nhibierunRszone, Durchmesser,, msr Hohes 842A (Ib) i'rei"e Saure~" KatriumsaIz mg/ml 166 ug/ml 192/Ug/ail

16

7 21 7 7

7 16 9 7

22

28 20 37

12 19

7 mm β Scheibengrösse (keine Inhi bi erungszone beobachtet)

to a> co co

Tabelle XI
84-2A Ereuzungsbeständigkeit, in vitro Untersuchung

Escherichia coli-Stamm* *

VersuchsbedinKunpien

Impfstoff ml/150 ml

Sensitiver Ausgangsstamm
Streptomycin-resistent
Streptothricin-reistent
OXMYCIN-resistent
Pleocidin-resistent
Chloramphenicol-resistent
Chlortetracycline-resistent Oxytetracyclin-resistent
Neomycin-resistent
Tetracyclin-resistent
Viomycin-resistent
Polymycin-resistent
Grisein-resistent

5 5

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 5

Inkubierung Temp. ° C ■

25 25 25 25 37 25 25 25 37 25 37 25 25 InhibierunRszone, Durchmesser, mm* Kohes 84-2A (Ib) Freie Natriumsaü* mg/ml Säure 192 ug/al

»g/ml ^x

16

13
13
15
13
21
20
18
16
15
23
18

20

19 14

13 18

17 20

23 17 20 16 21 21

18 16 18 17 17 16

23 24-

17 20

30

16

** Die Versuche wurden gegenüber einer Reihe von Stämmen von E. ccli, die aus der gleichen
Ausgangskultur isoliert würden, und nachfolgende Aussetzung gegenüber den einzelnen Anti
biotika durchgeführt

* 7 &^m = Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet)

a b e 1 1 e XIa ^

842A spezielles Wirkungsspektrum, in vitro Untersuchung

. Escherichia coli W-MB-60 Versuchbedingungen Inhibierungszone, Durchmesser, mm*'

(mit speziellen Zusätzen Impfstoff inkubierung- Hohes 84-2A (Ib) Freie Säure Natriumsalz wie angegeben) ml/150 ml Temp. oC 8 mg/ml 166 ng/ml 192 ng/ml

Vergleich (keine Zusätze) 5 25 16 20 18

0,1 riol, PhosTDhat-Puf f er
-* pH 5 " 5 25 19 20 15

ίο 0,1 raol-Phosphat-Puff er

co pH 7 5 25 22 29 25

^ 0,1 Bjo 1. Phosphat-Puffer

js pH9 5 25 21 22 24

j£ Menschliches Blutplasma 20% 5 25 17 22 21

*** * Eationenaustauschharz

^m (Dow ET 91) 1 % 5 25 20 21 18

* (Agar-Konzentration auf
1 % nur für Earzplatte
herabgesetzt

fr ^

842A, in vivo

Wenn 842A subkutan an Mäuse verabreicht wird, ist es im allgemeinen" stärker wirksam als Cephalothin und etwa gleicia -;:.r sam wie Cephaloridin, Ampicillin und Chlormycetin hinsichtlich des Schutzes gegenüber Infektion durch gram-·negative Organismen. Es ist bemerkenswert nicht toxisch und wird rasch im Urin ausgeschieden, wobei etwa 79 % des subkutan injizierten 842A innerhalb von 4 Stunden gewonnen werdenr

Bei in vivo Untersuchungen schützt das Antibiotikum 842a gegen Infektionen mit drei Species von Proteus, zwei von Salmonella, einen Stamm von Escherichia coli, zwei von Kleb» sialla und auch gegen paracolobactxmia arizoniae, Aerobacter aerogenes, Pasteurella multocida und Diplococcus pneumonise E400.

Das bei diesen Untersuchungen angewendete Verfahren ist das gleiche wie vorstehend mit Bezug auf die in vivo Charakterisierung von 810A beschriebene. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle XIb wiedergegeben;

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21098F4

T a b e 1 1 e

in vivo Wirksamkeit

TestOrganismus

₁Q auf subkutanem Wege χ zwei Dosierungen

Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morganii 3202 Salmonella schottmuelleri · Klebsiella pneumoniae AD Klebsiella pneumoniae B Paracolobactum ariaoniae Escherichia coli Aerobacter aerogenes Pasteurella multocida Salmonella typhosa Diplococcus pneumoniae E4-00

51/ig 276/ig 276 yig 103

125/ig

125

200

49 /ig

57/ig

3^/ig

566 /ig

Die Antibiotika

81OA Fermentation: Das Antibiotikum 810A wird während der aeroben Fermentation geeigneter, wässriger Kährmedieii unter geregelten Bedingungen über die Beimpfung mit der Streptomyces griseus Kultur MA.-2837 erzeugt. Wässrige Medien, wie sie beispielsweise zur Herstellung anderer Antibiotika verwendet werden, sind gleichfalls zur Herstellung des Antibiotikums 810A geeignet. Derartige Medien enthalten durch den Ilikroorgani smus assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze.

Im allgemeinen können Kohlehydrate, wie beispielsxtfeise Zukker, z. B. Glucose, Arabinose, Maltose, Xylose, Mannit und dgl., und Stärken, wie Getreide, z. B. Hafer, Heis, Maisstärke, Maismehl und dgl., entweder allein oder in Kombination als

- 63 -

109839/1836

14305

assimilierbare Kohlenstoffquellen in dem Nährmedium verwendet werden. Die genaue Menge der verwendeten Kohlehydratquelle oder -quellen in dem Medium hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab, Jedoch im allgemeinen variiert die Menge an Kohlehydrat gewöhnlich zwischen etwa 1 und 6 Gew.% des Mediums. Diese Kohlenstoffquellen könen einzeln verwendet werden^oder es können verschiedene derartiger Kohlenstoffquellen in dem Medium kombiniert werden. Im allgemeinen kann irgendein proteinhaltiges Material als eine Stickstoffquelle in dem Fermentationsprozess eingesetzt werden. Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise Hefehydrolysate, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl, Hydrolysate von Casein, Maisquellflüssigkeit, lösliche Destillationsrückstände oder Tomatenpaste und dgl. Die Stickstoffquellen werden entweder allein oder in Kombination in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.% des wässrigen Mediums verwendet. Typische Medien, die zur Herstellung des Antibiotikums 810A geeignet sind, sind die im folgenden aufgeführten. Diese Medien und andere in den folgenden Beispielen beschriebene. Medien dienen lediglich zur Erläuterung einer grossen Vielzahl von Medien, die eingesetzt werden können und dienen nicht zur Begrenzung.

Medium I:

Difco-Hefeextrakt Glucose * Phosphateuffer

g_{41 2} Destilliertes Wasser Difco-Agar

*Phosphatpuffer: KH PO NaJHPÜ Destilliertes Wasser

Medium II:

Rindsextrakt * NZ Amin Dextrose NaCl

Destilliertes H~0 pH auf 7,2 mit KaOH eingestellt

*ein enzymatisch abgebautes Casein

- 64 -

10,0	6	ml
10,0	S	g
2,0	ml	ε
0,05 g	S
1000,0	ml
25,0	g
91,0	g
95,0	ε
1000,0	g
3,0	ml
10,0
10,0
5,0
1000,0

1098 3 9/1836

14305

Medium III:

Dextrose Asparagin KHPO

MgSO₄ .

Hefeextrakt * Spurenelementgemisch Nr.'2 Destilliertes H₂O pH auf 7,2 mit NaOH eingestellt

Spurenelementgemisch Nr. 2: · 7H₂O

• H₂O

* 2H₂O

(NH₄)₆M0_?0_2i ZnSO₄ · 7H₂O Destilliertes

MnSO^ CuCl, CaCl!

10,0 g 1,0 g 0,1 g

o,5 g

0,5 g 10,0 ml 1000,0 ml

1,0 g 1,0 g 25,0 mg 100,0 mg 56,0 mg 19,0 mg 200,0 mg 1000,0 ml

Medium IV:

V8 Saft Staley's 4S Sojabohnenmehl Dextrose Agar

Destilliertes H₀O pH 7,9 - 8,0 ^d

Medium V:

100,0 ml 20,0 g 2,0 g 25,0 g auf 1000,0 ml

Hefe-Autolysat (Ardamin) Glucose * Phosphatpuffer MgSO₄- 7H₂O Destilliertes H₂O

pH - auf 6,5 unter Verwendung von NaOH eingestellt

*PhosOhatpufferlösung: KHJO

Na₂HPO₄ Destilliertes H₀O 10,0 g 10,0 g 2,0 ml 0,05 g

1000,0 ml

91,0 g 95,0 g 1000,0 ml

- 65 -

10983 9/1836

14J05

Medium VI:

Maisguellflussigkeit (au: Dextrose	E" feuchter Ba	tsisj	OTOT OTOT	40,0 g 20,0 g 2,5 ε ο,5 ε	bezogen auf das Volumen (zu federn Kolben ein zein zuge geben)	OTOTOTOtOtOt
Polyglykol 2000 Destilliertes H2O			ε	0,25 %, 1000,0 ml		ε
pH - auf 7,0 mit NaOH	eingestellt		ε			ε
Medium VII:			ε		Produktion	ε
	Impfung	ε		5,0 4,0 2,0 1,5 5,0 2,0	ε
L-Asparagin Ij-Fi s ti din DL-Phenylalanin Mononatrium-glutamat NaCl	5,0 4,0 5,0 2,0	ε	0,4	ε
CaCl2 · 2H2O	0,4	ε ε ml	0,1	ε ε ml
MnSO4 · H2O	0,1	0,1
FeSO4 . 7H2O	0,1	0,05
ZnSO.. . 7H0O	0,05	1,0
MgSO4 * 7H2O	1,0	20,0 2,5 **1000,0
Glycerin Saccharose Destilliertes H0O	20,0 2,5 *1000,0

* pH auf 7,0 mit NaOH eingestellt ** pH auf 7,1 mit NaOH eingestellt

Medium VIII:

Flei schextrakt NaCl
NZ Amin Dextrose pH 7,0

0,3 %

0,5 % 1 % 1 %

- 66 -

109839/1836

Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 "bis 37° C, jedoch wird es zur Erzielung optimaler Ergebnisse "bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 22 bis 30° C durchzuführen. Der pH-Wert der für das Wachstum der Streptomyces griseus Kultur (MA. 2837) -und zur Erzeugung des Antibiotikums 810A geeigneten Mhrmedien soll im Bereich von etwa 5,5 "bis 8,0 liegen.

Ein kleiner Fermentationsansatz des Antibiotikums 810A erfolgt in einfacher V/eise durch Beimpfung eines geeigneten Eänrmediums mit der das Antibiotikum erzeugenden Kultur, wobei man die Fermentation bei einer konstanten Temperatur von etwa 24 bis 28° C auf einem Schüttler über einen ausgedehnten Zeitraum, wie beispielsweise mehrere Tage, fortschreiten lässt. Nach Beendigung des InkubierungsZeitraums wird das Mycel entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wird untersucht.

In Praxis wird diese Fermentation in einem sterilisierten Kolben über eine ein-, zwei-, drei- oder vierstufige Keimentwicklung durchgeführt. Das iiährsiedium für die Impfctufe kann irgendeine geeignete Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein, wie beispielsweise irgendeines der vorstehend unter I bis VIII beschriebenen Medien. Der Impfkolben wird in einer konstanten Tesperaturkammer bei etwa 28° C während eines Zeitraums von 1 bis etwa 5 Tagen geschüttelt, und die erhaltene Kultur wird zur Beimpfung entweder eines Zweistufen-Impfmediums oder des Produktionsmediums verwendet. Wenn Zwischenstufen-Impfkolben verwendet werden, werden diese in praktisch der gleichen Weise entwickelt, d. h., der Inhalt des Kolbens wird zur Beimpfung des Produktionsmediums eingesetzt, die beimpften Kolben werden bei einer konstanten Temperatur mehrere Tage geschüttelt, und am Ende des Inkubierungszeitraums wird der Inhalt des Kolbens zum Entfernen des Mycels zentrifugiert. Die überstehende Flüssig-

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,keit oder Brühe wird dann konzentriert und unter Herstellung des Antibiotikums 810A gereinigt.

Für ein Arbeiten im grösseren Masstab wird es bevorzugt, die Fermentierung in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einem Rührwerk und einer Vorrichtung zur Belüftung des Fermentationsmediums versehen sind. Nach, dieser Methode wird das Nährmedium in den Tank gebracht und durch Erhitzen auf Temperaturen von bis zu etwa 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit der erzeugenden Kultur geimpft, und man lässt die Fermentation während eines Zeitraums von mehreren Tagen, beispielsweise von 2 bis 4 Tagen, fortschreiten, während das Nährmedium gerührt und/oder belüftet wird und die Temperatur bei etwa 24- bis 28° C gehalten wird. Durch Veränderungen der Impfstoffentwicklung und Veränderungen des Produktionsmediums ist es möglich, eine mehrfache Verbesserung hinsichtlich der Produktion und eine Steigerung der Wirksamkeit des Antibiotikums zu erhalten.

810A Versuchsverfahren unter Verwendung von Proteus Vulfcaris:

Das Antiobiotikum 810A wurde in einfacher Weise durch ein Scheiben-Platten-Verfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 (ATCC 21100 und MHHL B-3361) unter Beibehaltung als eine Schrägkultur auf Nähragar (Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) als Testorganismus untersucht. Die beimpften Schrägkulturen wurden bei 37° C während 18 bis 24 Stunden inkubiert und bei Kühlschranktemperaturen gelagert, bis sie verwendet wurden, wobei frische Schrägkulturen jede Woche hergestellt wurden.

Der Impfstoff für die Versuchsplatten wird täglich durch Beimpfung eines 250 ml Erlenmeyer-KoIbens, der 50 ml Nährbrühe (Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) enthält, mit einem Abstrich der Schrägkultur hergestellt. Der Kolben wird bei

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57° ^c auf einer Schuttelmaschine während 18 bis 24- Stunden inkubiert. Die Flüssigkeitskultur wird dann auf 40%ige Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 ma unter Verwendung eines Bausch & Lomb Spectronic-20 Geräts durch Zugabe einer 0,2%igen Hefeextraktlösung zu der Kultur eingestellt. Nichtbeimpfte Flüssigkeit wird als Blindversuch für diese Bestimmung verwendet. Die eingestellte Brühe (30 ml) wird zur Beimpfung von 1 1 Medium verwendet.

Nähragar (Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) werden als Versuchsmedium eingesetzt. Dieses Medium wird hergestellt, durch Autoklavieren sterilisiert, und man lässt es auf 50° C abkühlen. Nachdem das Medium beimpft ist, wird zu jeder der verschiedenen sterilen Petri-Schalen 10 ml zugegeben, und das Medium kann sich verfestigen.

Es wurden Versuche an diesen Platten nach dem Scheiben-Platt en- Verfahr en unter Verwendung von 15 M Filterpapier-Scheiben durchgeführt. Die Versuchsplatten wurden 20 bis 24 Stunden bei 37° C inkubiert. Die Auswertungen wurden als mm Durchmesser der Inhibierungszone ausgedrückt. Sie wurden zur Bestimmung der relativen Wirksamkeiten oder, wenn sie mit einem gereinigten Bezugsstandard verglichen wurden, der Wirksamkeit in Aig/ml verwendet. Wenn ein derartiger Versuch quantitativ durchgeführt wird, können 2 bis 4- Jtig/ml Antibiotikum ermittelt v/erden.

810A Versuchsverfahren unter Verwendung von Vibrio percolans: Es vmrden auch Versuche bezüglich 810A nach dem Scheiben-Platten-Verfahren gegen Vibrio percolans (MB-1271) unter Verwendung von 13 mm Filterpapierscheiben durchgeführt. Die Versuchsplatten wurden unter Verx^endung von Difco Nähragar plus 2,0 g /1 Difco Hefeextrakt mit 10 ml je Platte hergestellt. Eine Ubernachtkultur des Versuchsorganismus, Vibrio percolans (MB-12?2) in Nährflüssigkeit plus 0,2 % Hefeextrakt

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wurde in steriler Salzlösung auf eine Suspension mit 40%iger Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 mu verdünnt. Diese Suspension wurde mit 20 ml/1 Medium vor dem Begiessen der Platten zugegeben.

Die Versuchsplatten wurden bei 4° C gehalten, bis sie verwendet wurden (maximal 5 Tage). Nach der Aufbringung der mit Antibiotikum gesättigten Versuchsscheiben wurden die Platten bei 28° C während eines Zeitraums von 8 bis 24 Stunden inkubiert. Inhibierungszonen wurden als mm Durchmesser abgelesen.

Bakterialle Inaktivierung mit 810A: Ein in vitro Versuch diente zur Bestimmung der Resistenz des Antibiotikums 810A gegenüber bakterieller Inhibierung im Vergleich mit Cephalosporin C, Cephaloridin und Cephalothin. Diese Untersuchung zeigte, dass das Antibiotikum 810A beständiger als letzteres gegenüber bestimmten Mikroorganismen ist.

Das in diesem Versuch verwendete abbauende Bakterium war ein Organismus, von dem bekannt ist, dass er Cephalosporin C vollständig inaktiviert, nämlich Alcaligenes faecalis (1ΊΒ-9).

(a) Herstellung von Bakterienzellen: Alcaligenes faecalis (MB-9)-Zellen wurden wie folgt hergestellt: Der Inhalt eines L-Rohrs wurde mit einigen ml Nährflüssigkeit, die 0,2 °/o Hefeextrakt enthielt, vermischt. Eine schleifevoll Aufschlämmung wurde über die Oberfläche einer Nähragar-Schrägkultur verteilt und 18 Stunden bei 37° C inkubiert. Sämtliche Schrägkulturen wurden bei 5° ^c aufbewahrt und innerhalb 1 V/oche nach der Inkubierung verwendet. Eine schleifevoll des Oberflächenwachsturns aus jeder Schrägkultur wurde askeptisch in 50 ml Nährbrühe, die 0,2 % Hefeextrakt enthielt, überführt und 18 Stunden bei 28° C unter Schütteln inkubiert. Die Kultur wurde dann bei 4000 Upm 10 Minuten zentrifugiert. Das üb einstehende Ma-

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terial vmrde abdekantiert, und der restliche Zellklumpen wurde zweimal mit sterilem 0,1 m-Phosphatpuffer, pH 7»5 (6,8 g Kaliumphosphat und 7»1 6 Natriumhydrogenphosphat je Liter destilliertes Wasser) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden dann in einem Zehntel des Originalvolumens einer 4 mg/ml Antibiotikumlösung in 0,1 m-Phosphatpuffer wieder suspendiert. Das Versuchsgemisch wurde dann ohne Schütteln in einem auf 37° C eingestellten Wasserbad eis zu 4- Stunden inkubiert. Die Versuchsgemische wurden dann bei 2000 Up:n 10 Minuten -zentrifugiert, wobei sich ein klares überstehendes Material bildete, das in sterila Reagensgläser dekantiert wurde und unmittelbar in Trokkeneis gefroren wurde, bis es zur biologischen Bestimmung bereit war, gewöhnlich innerhalb von 5 Stunden. Vergleichsproben wurden in genau der gleichen Weise Jedoch ohne Zellen inkubiert.

(b) Ausnass der Inaktivierung des Antibiotikums 810A: Die überstehenden Flüssigkeiten wurden hinsichtlich ihrer antibakteriellen Wirksamkeit in folgender Weise getestet: Papierscheiben von 6,4- am wurden mit den überstehenden Flüssigkeiten angefeuchtet und auf die Oberfläche von Nähragar-(G,2 ^c/o) Eefeextrakt-Platten gebracht, die vorher mit dem entsprechenden Testorganismus beimpft worden waren. B. subtilis (HB-964-)-Versuchsplatten wurden in folgender Weise beimpft: 5 ml einer Suspension von gewaschenen Sporen in 0,9 % Salzlösung wurden zu jeweils 150 ml Nähragar-(0,2 ^c,o) Hefeextrakt zugegeben, wovon 5 ^ml dann in Petri-Schalen von 15 x 100 m verteilt wurden. Sämtliche Versuchsplatten wurden bei 5° C gelagert und innerhalb von 5 Tagen verwendet. Die Versuchsplatten wurden übernac ht bei 25° C inkubiert, bevor Inhibierungszonen rund um die Testscheiben gemessen wurden.

Zellfreie Kontrollproben jedes Antibiotikums wurden in

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Verdünnungen von 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8,1 :16 und 1 : J2 untersucht, um eine Standard-Bezugskurve zu erhalten. Lösungen der Testantibiotika wurden bei voller Stärke nach Inkubierung in Gegenwart der gewaschenen Bakterienzellen untersucht. Sämtliche Proben wurden dreifach gefahren.

(c) Erprebnisse: Die prozentuale Inaktivierung wurde berechnet, indem der Mittelwert der aus jedem Versuch erhaltenen drei Iniiibierungszonen genommen wurde und die Menge an verbleibendem Antibiotikum in der Testlösung bestimmt, wie sich aus der Standardkurve ergibt. Dieser Wert wurde dann von der Ausgangskonzentration (4 mg/ml) subtshiert und der Rest durch die Ausgangskonzentration geteilt und mit 100 multipliziert, wobei die vorhandene Inaktivierung erhalten würde. Die folgenden Tabellen XII und XIII geben die erhaltene Inaktivierung für Cephalosporin C, Cephalothin und das Antibiotikum 810A unter den oben beschriegenen Bedingungen wieder.

Ta b e 1,1 .e XII

Prozentuale Inaktivierung nach Inkubierung mit gewaschenen

Bak t eri enz el 1 en (bestimmt auf B. subtilis (iiB-964) Platten)

Antibiotikum 3 Stunden Inkubierung mit

Alcaligcnes faecalis

810A 0

Cephalosporin C 99+

Cephalothin 62,5

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Tabelle ΣΙΙΙ

Prozentuale Inaktivierung nach Inkubierung mit gewaschenen

Bak t eri enz e 11 en (bestimmt auf V. percolans (MB-1272) Platten)

Antibiotikum 3 Stunden Inkubierung mit

Alcaligenes faecalis

810A 0

Cephalosporin C 99+'

Cephalothin 50

Die Fähigkeit des Antibiotikums 810A und von Cephalosporin C, dem Abbaueffekt der Aerobacter cloacae (MB-2646)-Kultur zu widex^stehen, wurde ebenfalls bestimmt. Diese Kultur ist gram.«-negativ und gegenüber Cephalosporin C resistent. Bei Durchführung des Versuchs wurden Proben der einzelnen Gemische der Organismen und eine Probe des Antibiotikum-Gemischs nach 2stündiger Inkubierung entnommen und auf die verbliebene antibiotische. Wirksamkeit untersucht. Das Verfahren ist die gleiche Untersuchungsmethode, wie oben für Algaligenes faecalis beschrieben. Die Quelle der Inaktivierungssubstanz ist eine 1 : 160-Verdünnung des Piltrats einer bei 37° C während 18 Stunden durchgeführten Schüttelkultur von Aerobacter cloacae MB-2646 in Nährbrühe, die 0,2# Hefeextrakt enthielt. Die folgende Tabelle XIV gibt die prozentuale Inaktivierung von Antibiotikum 810A, Cephalothin, Cephaloridin und Cephalosporin C auf Vibrio percolans (MB-1272) gemäss dieser Methode wieder:

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Tabelle XIV

Prozentuale Inaktivierung nach. Inkubierung mit ζ ellfrei ein.

Extrakt
(bestimmt auf V. percolans (MB-1272) Platten)

Antibiotikum

810A

Cephalothin Cephaloridin Cephalosporin C

2stündige Inkubierung mit Aerobacter cloacae

16 66 96 96

Unter Verwendung des gleichen Versuchsablaufs v«^Tie obon beschrieben, gibt die folgende 'Tabelle XV die relative Beständigkeit des Antibiotikums 810A gegenüber enzymatischer

Inaktivierung durch Aerobacter cloacae wieder. Die Ausgangskonzentration beträgt 250 Hg/ml. Die Ergebnisse sind in ug/ml ausgedrückt.

Tabelle XV

Verbleibende, antibiotische Wirksamkeit (ug/ml) (Ausgangskonzentration = 250 ug/ml)

Antibiotikum

Versuchsorganismüs

2stündige Inkubierung mit Aerobacter cloacae *

810A	B.	subtilis 964	190
Cephalothin		Il	140
Cephaloridin		Il	<10
810A	V.	percolans 12 72	210
Cephalothin		It	85
Cephaloridin		Il	<10

* Zeilfreier Extrakt

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^2109804

Im Hinblick auf die vorstehenden Daten ist das Antibiotikum 810A offensichtlich beständiger als Cephalosporin C, Cephalothin und Cephaloridin gegen Inaktivierung durch Aerobacter cloacae.

842A Fernientaticn; Das Antibiotikum 84-2A wird während der aeroben Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien unter geregelten Bedingungen durch Beimpfen mit dem Organismus Streptouiyces lactamdurans erzeugt. Im allgemeinen können viele Medien, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle darstellen, zur Herstellung von 84-2A eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind die oben in Verbindung mit der Fermentation von 810A beschriebenen, wässrigen Medien und Kohlehydrat- und Gtickstoffquellen. Die genaue Henge der Kohlehydrat- und Stickstoffquellen hängt von den anderen im Fermentationsmediuni enthaltenen Bestandteile ab, jedoch liegt im allgemeinen die Kohlehydratmenge gewöhnlich bei 1 bis 6 Gew.% des Mediums und die Menge an verfügbarem Stickstoff, entweder allein oder in Kombination liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 0,2/ό bis etwa 6 Gew.% des Medi uras. Die verschiedenen, im folgenden beschfiebenen Medien dienen zur Erläuterung von Medien, die zur Herstellung des Antibiotikums 842A geeignet sind. Diese Medien sind lediglich Beispiele verwendbarer Medien und dienen nicht zur Begrenzung.

Medi U": IX:

Amber-Hefe ITr. JOO ' 10,0 g

Lösliche Brauerei-Bückstände 20,0 g

Dextrose 10,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml pK 7,0

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Medi am X: ft

Staley's 4-S-Sojabohnenmehl 30?° S

Lösliche Brauerei-Sückstände 7,5 ε

Cerelose ' 20,0 g

NaCl 2,5 g

GaGO₃ (nachher pH-Wert auf 7,0) 10,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

Medium XI:

Amber-Hefe Nr. 300 10,0 g

Lösliche Brauerei-Rückstände 20,Og

Destillisiertes Wasser 1000,0 m. pH 7,0

Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 37° C durchgeführt, jedoch wird es zur Erzielung optimaler Ergebnisse bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 24 bis 32° C durchzuführen. Der pH-Wert der für das Wachstum der Streptomyces lactamduraiis Kultur (MB-2908) und zur Erzeugung des Antibiotikums 842A geeignetenNährmedien soll im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 8,0 liegen.

Eine Fermentation des Antibiotikums 84-2A in kleinem Masstab wird in einfacher Weise durch Beimpfen eines geeigneten
Nährmediums mit der das Antibiotikum erzeugenden Kultur
durchgeführt, wobei man die Fermentation bei einer konstanten Temperatur von etwa 28° C während mehrerer Tage auf einer Schüttelvorrichtung fortschreiten lässt. Nach Beendigung des Inkubierungszeitrauns wird das Mycel entfernt, und die
überstehende Flüssigkeit wird untersucht.

In der Praxis erfolgt die Fermentation in einem sterilisierten Kolben über eine ein-, zwei-, drei- oder vierstufige Keimentwicklung. Das Nährmedium für die Keimstufe kann irgend eine geeignete Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoff quellen sein, beispielsweise irgendeines der vorstehend unter IX bis XC beschriebenen Medien. Der Keimkolben wird

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in einer bei konstanter Temperatur von etwa 28° G gehaltenen Kammer während eines Zeitraums von 1 "bis etwa 3 Tagen geschüttelt, und der erhaltene Wuchs wird entweder zur Beimpfung einer zweiten Keimstufe oder des Produktionsmediums verwendet. Falls Zwischenstufen-Keimkolben verwendet werden, werden diese in praktisch der gleichen Weise entwickelt, d. h., der Inhalt des Kolbens wird zur Beimpfung des Produktionsmediums verwendet, die beimpften Kolben werden bei einer konstanten Temperatur mehrere Tage geschüttelt, und nach Beendigung des Inkubierungszeitraums wird der Inhalt der Kolben zur Entfernung des Mycels zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit oder Brühe wird dann konzentriert und unter Erhalt des Antibiotikums 84-2A gereinigt.

Beim Arbeiten in grösserem Masstab wird es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einem Rührwerk und einer Einrichtung zut Belüftung des Fermentationsmediums versehen sind. Nach dieser Methode wird das Nährmedium in den Tank gebracht und durch Erhitzen auf Temperaturen bis zu etwa 120° C sterilisiert. Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit der Produktionskultur beimpft, und man lässt die Fermentation während eines Zeitraums von einigen Tagen, beispielsweise 2 bis 4 Tage, fortschreiten, während das Nährmedium bewegt und/oder belüftet wird und die Temperatur bei etwa 28° C gehalten wird. Durch Veränderung der Entwicklung des Inoculum's und Veränderungen des Produktionsmediums ist es auch möglich, eine mehrfache Verbesserung der Produktion und eine Steigerung der Wirksamkeit dieses Antibiotikums zu erreichen.

842A Versuchsverfahren unter Verwendung; von Vibrio percolans: Es wurden Versuche nach dem Scheiben-Platten-Verfahren unter Verwendung von 13 mm Filterpapierscheiben durchgeführt. Diese Versuchsplatten wurden unter Verwendung von Difco Nähragar plus 2,0 g/l Difco Hefeextrakt bei 10 ml je Platte her-

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gestellt. Ein Übernachtwuchs des Versuchsorganismus Vibrio percolans (MB-1272) in Fährbrühe und 0,2 % Hefeextrakt wurde in steriler Salzlösung auf eine Suspension mit 40%iger Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 mn verdünnt. Diese Suspension wurde in 20 ml/1 Medium vor dem Begiessen der Platten zugegeben.

Die Versuchsplatten wurden bei 4-° C gehalten, bis sie verwendet wurden (maximal 5 Tage). Nach dem Aufbringen der mit Antibiotikum gesättigten Versuchsscheiben wurden die Platten bei 28° 0 während eines Zeitraums von 8 bis 24· Stunden inkubiert. Die Inhibierungszonen wurden als mm Durchmesser abgelesen. Sie wurden zur Bestimmung der relativen Wirksamkeiten oder, wenn sie mit einem reinen Bezugsstandard verglichen wurden, der Wirksamkeit in üg/ml verwendet. Wenn ein derartiger Versuch in quantitativer Weise durchgeführt wird, können 1 bis 2 iig/ml Antibiotikum festgestellt werden.

Bakterielle Inaktivierung: mit 842A: Eine Untersuchung in vitro diente zur Bestimmung der Beständigkeit des Antibiotikums 842A gegenüber bakterieller Inaktivierung im Vergleich mit Cephalosporin C, Cephaloridin und Cephalothin. Diese Untersuchung zeigte, dass das Antibiotikum 842A beständiger als letztere gegen bestimmte Kikroorganismen ist.

Die bei dem Versuch verwendeten, abbauenden Bakterien waren zwei Organismen, von denen bekannt ist, dass sie Cephalosporin C vollständig inaktivieren, nämlich Alcaligenes faecalis (MN-9) und Alcaligenes viscosus (MI3-12).

(a) Herstellung von Bakterienzellen: Alcaligenes viscosus (ΙΊΝ-12) und A. faecalis (MB-9) Zellen wurden wie folgt hergestellt: Der Inhalt eines L-Rohrs wurde mit einigen ml Nährbrühe, die 0,2 % Hefeextrakt enthielt, vermischt. Eine schleifevoll Aufschlämaiung wurde über die Oberfläche

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einer Näliragar-Schrägkultur verteilt und 18 Stunden bei 37° C inlcubiert. Sämtliche ßchrägkulturen wurden bei 5° C aufbewahrt und innerhalb 1 Woche nach Inkubierung verwendet. Eine schleifevoll des Oberflächenwachstum aus Jeder Sc_2irägkultur wurde aseptisch in 50 al Nährbrühe, die 0,2 % Hefeextrakt enthielt, überführt und 18 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln inkubiert. Die Kultur wurde dann 10 Minuten bei 4000 Upm zentrifugiert. Me überstehende !Flüssigkeit wurde dekantiert und der restliche Zellklumpen v;urde zweimal mit steriTem 0,1 m-Phosphatpuffer, pH 7*5 (6,8 g Kaliumphosphat, d. h. KH^PO^ und 7^1 g Hatriumhydrogenphosphat je Liter destilliertes Wasser) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden dann in einem Zehntel des Originalvolumens einer 4 mg/ml-Lösung des Antibiotikums in 0,1 m-Phosphatpuffer resuspendiert. Das Versuchsgemisch wurde dann ohne Schütteln in einem auf 37° C eingestellten Wasserbad während 4 Stunden inkubiert. Die Versuchsge-Ed.sehe wurden dann bei 2000 Upm 10 Minuten zentrifugiert, und dabei wurde eine klare übex'stehende Lösung erzeugt, die in sterile Reagensgläser dekantiert wurde und unmittelbar in Trockeneis gefroren wurde, bis sie zur biologischen Bestimmung bereit war, gewöhnlich innerhalb von 3 Stunden. Versuchsproben wurden in genau der gleichen Weise mit Ausnahme der Abwesenheit von Seilen inkubiert.

(b) Auslass der Inaktivierung des Antibiotikums 842A; Die überstehenden Flüssigkeiten wurden auf ihre antibakterielle Wirksamkeit in der folgenden Weise getestet: 6,5 mm Papierscheiben wurden mit den überstehenden Flüssigkeiten angefeuchtet und auf die Oberfläche von Ilähragar-0,2 % Hefeextrakt-Platten gebracht, die vorher mit dem entsprechenden Testorganismus beimpft worden waren. B. subtilie (MB-964) Versuchsplatten wurden in der folgenden Weise beimpft: 5 ml einer Suspension von gewaschenen Sporen in 0,9 % Salzlösung wurde zu jeweils 1'50 ml eines

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0,2 % Nähragar-Hefeextraktes ( 45° C) zugegeben, wovon 5 ml dann in Petri-Schalen von 15 x 100 mm verteilt wurden. Sämtliche Versuchsplatten wurden bei 5° C gelagert und innerhalb von 3 Tagen verwendet. Die Versuchsplatten wurden übernacht bei 25° C vor der Messung der Inhibierungszonen rund um die Testscheiben inkubiert.

Zellfreie Kontrollproben jedes Antibiotikums wurden in Verdünnungen von 1:1,1:2,1:4,1:8,1:16 und 1 : 32 untersucht, um eine Standard-Bezugskurve zu erhalten. Lösungen der Testantibiotika wurden bei voller Stärke nach Inkubierung in Gegenvrart der gewaschenen Bakterienzellen untersucht. Sämtliche Proben wurden dreifach gefahren.

(c) Ergebnisse: Der Prozentgehalt der Inaktivierung wurde berechnet, indem der Mittelwert der drei aus jedem Versuch erhaltenen Inhibierungszonen genommen wurde und die Menge an in der Testlösung verbleibendem Antibiotikum, wie sich durch die Standardkurve ergibt, ermittelt wurde. Dieser V/ert wurde dann von der Ausgangskonzentration (4mg/ml) subtrahiert und der Sest durch die Ausgangskonzentration dividiert und mit 100 multipliziert, um die prozentuale Inaktivierung zu erhalten. Die folgende Tabelle XVI gibt die erhaltene Inaktivierung für Cephalosporin C und das Antibiotikum 842A unter den oben beschriebenen Bedingungen wieder.

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Tabelle XVI

Prozentuale Inaktivierung nach Inkubierung mit gewaschenen

Bakterienzellen

(bestimmt auf B. subtilis (MB-964) Platten)

Abbauender 4stündige Inkubierung

Organismus Ceph C Antibiotikum

Alcaligenes faecalis

MB-9 99+ O

A. viscosus MB-12 99+ 5^»^

Die Fähigkeit des Antibiotikums 84-2A und von Cephalosporin C, der abbauenden Wirkung von vier anderen Kulturen zu widerstehen, wurde gleichfalls bestimmt. Diese Kulturen sind: Escherichia coli 236, Proteus morganii 251 j Proteus morganii 356 und Proteus mirabilis 241. Jede ist gram/negativ und gegen Cephalosporin C resistent. Bei Durchführung der Untersuchung !wurden Proben der Einzelgemische der Organismen und eine Probe des Antibiotikums nach 4stündiger Inkubierung entnommen und. hinsichtlich der verbliebenen antibiotischen Wirksamkeit untersucht. Das Verfahren ist die gleiche Untersuchungsmethode wie oben gegen Alcaligenes faecalis MB-9 und

A. viscosus MB-12 beschrieben. Die folgende Tabelle gibt die prozentuale Inaktivierung von Cephalosporin C und 842A auf

B. subtilis (MB-964) nach dieser Methode wieder:

	236 251 356 241	Tabelle	XVII
Kultur	Ceph C	Antibiotikum 842A
Escherichia coli Proteus morganii Proteus morganii Proteus mirabilis	>99 >99 >99 72	38 80 69 5

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Die vorangehenden Daten zeigen, dass das Antibiotikum 842A offensichtlich gegenüber Inaktivierung durch A. faecalis, A. viscosus, Escherichia coli 236, Proteus morganii 251» Proteus morganii 236 und Proteus mirabilis 241 beständiger ist als Cephalosporin G.

Das nach dem vorliegenden Ifermentationsverfahren erhaltene Antibiotikum 842A ist eine amphotere Verbindung mit einem scheinbaren i so elektrischen Punkt von etwa pH 3*5; sie ist bei einem pH-Wert oberhalb von 9»0 instabil, jedoch bei pH 1,5 relativ stabil.

Da die Antibiotika 810A und 842A und deren Salze das Wachstum verschiedener Species von Salmonella in wirksamer Weise inhibieren, können sie als Desinfektionsmittel zu verschiedenen Haushaltszwecken und industriellen Zwecken verwendet werden. Beispielsweise ist 810A wirksam gegen Salmonella schottmuelleri und S. gallinarum, und 842A ist wirksam gegen Salmonella schottmuelleri 3010, S. gallinarum und S. typhosa, und diese Eigenschaft zeigt deren Brauchbarkeit als sanitäre Mittel für Haushaltszwecke und industrielle Zwecke an.

Isolierung und Reinigung

Antibiotikum 810A: Das Antibiotikum 810A kann durch Adsorption an ein Ionenaustauschharz, beispielsweise an synthetische Anionaustauschharze, die sich von Dextrose oder Acryl-Copolymeren ableiten oder nicht-ionische, vernetzte Polymere gereinigt werden. Das adsorbierte Antibiotikum wird aus dem Harz oder Polymeradsorbat mit V/asser oder mit einer wässrigen, alkoholischen Lösung eines geeigneten Salzes, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Natriumchlorid und dgl., eluiert. Beispiele für verwendbare Ionenaustauschharze und Polymere,sind die DEAE-Sephadex A-25-, Amberlite IKA-68 und Amberlite XAD-2-Medien, die im folgenden beschrieben sind. Gegebenenfalls

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kann das nach dem vorstehenden Verfahren erhaltene Eluat durch eine zweite und dritte Adsorptions- und Eluierungsstufe gereinigt werden. Es werden dann Konzentrate sämtlicher Eluate erhalten, um das gereinigte Produkt zu ergeben.

BIOA-Komponenten: Das Antibiotikum 810A kann in seine Komponenten, 7ß-(I⁾-5-Amino-5~carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-sulfooxj^rcinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-5-cephem-4-carbonsäure und 7ß-'(^-5-Amino*-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsaure durch Chromatographie getrennt werden. Dazu gehören:

(1) Chromatographie auf einem stark-hydrophilen Anionenaustauschhars, wie beispielsweise *DEAE Sephadex A-25? entwickelt mit einem Ammoniumbromid-Ameisensäure-System. Es können verschiedene Konzentrationen dieses Systems .verwendet werden, jedoch wird in der Praxis eine Lösung aus 0,5 m-Animoniumbromid und 0,1 m-Ameisensäure bevorzugt.

(2) Chromatographie auf einem schwach-basischen Anionenaustauschharz, wie beispielsweise **Amberlite lKA-68. Dies ist eine Gruppenabtrennung, wobei Material in roher Form bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 3,5 aufgegeben wird und zunächst rat einer Säure bei einem pH-Wert von etwa 2 und dann mit NaCl/HCl bei einem pH-Wert von etwa 1 elu-

dert wird.

(3) Chromatographie nach einem nicht-ionischen, vernetzten Polystyrol-Polymerisat, wie beispielsweise ***Amberlite XAD-2. Die Eluierung erfolgt mit einem geeigneten, wässrigen System, jedoch ist es im allgemeinen am günstigsten, ein Gemisch aus Wasser und einem niederen Alkylketon zu verwenden. Typische verwendbare Eluiermittel sind beispielsweise 10 % Methanol in V/asser und anschliessend

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50 % Methanol in Wasser. Anstelle der 50%igen Methanolin- Wasser- Lösung kann 20 % Aceton-in-Wasser verwendet Vi erden.

* DEAE Sephadex A-25 ist ein synthetisches Anioiienaustauschharz, das sich von dem Polysaccharid, Dextran in seiner Chloridform ableitet, d. h. mit Chlorid-Gegenionen; Pharmacia Fine Chemicals, Inc., 800 Centenial Avenue, Piscataway, New Market, New Jersey 08854.

** Ein synthetisches Anionenaustauschharz; ein vernetztes Acrylcopolymerisat, das eine schwachbasische tertiäre Aminogruppe enthält; Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania 19105.

*** Ein nicht-ionischer, vernetzter Polystyrol-Polymersorbent; Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania 19ΊΟ5·

Die nach den obigen Methoden erhaltenen einzelnen Produkte können durch Rechromatographie gereinigt werden. So kann beispielsweise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(ccmethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyiaethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ic) gereinigt werden, indem dieses Produkt der in der obigen Methode 1 beschriebenen Reinigungsmethode unterzogen wird, mit nachfolgender Entsalzung auf Amberlite XAD-2-Ab sorb ent, und 7ß-(D-5-^ami^rio-5-carboxyvalerainido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methox5^r-3-cephem-4-carbonsäure kann durch Rechromatographie auf einem Sephadex-A-25 Anionenaustauschharz, das mit 0,5 m-Ammoniumbromid und 0,05 m-Essigsäure entwickelt wird, erneut gereinigt werden.

Antibiotikum 842A; Das Antibiotikum 842A kann durch Adsorption an einemIonenaustauschharz, wie beispielsweise auf Harzen, die aus quaternaren Ammonium- oder ßulfonsäure-Austauschmedien aufgetaut sind, gereinigt werden. Das adsorbierte Antibiotikum wird aus dem Harzadsorbat mit wässrigen Lösungen oder mit einer wässrigen, alkoholischen Lösung

- 84 109839/1836

eines geeigneten Salzes, z. B. Ammoniumchlorid, Natriumchlorid und dgl., eluiert. Zu geeigneten, verwendbaren Ionenaustauschharz en gehören beispielsweise die Polystyrolharze mit im Kern befindlichen Sulfonsäuregruppen (45 % oder 53 °/° Wasser) oder Polystyroltrimethylbenzylammoniumharze (43 % Wasser, die als Dowex 50 bzw. Dowex 1 bekannt sind. Gegebenenfalls kann das nach dem vorstehenden Verfahren erhaltene Eluat durch eine zweite und dritte Adsorptions- und Eluierungsstufe weiter gereinigt werden. Konzentrate sämtliche Eluate werden dann erhalten, um das gereinigte 842A-Produkt zu ergeben.

Zubereitungen

Das Antibiotikum 810A und seine einzelnen Bestandteile und das Antibiotikum 842A können allein oder in Kombination als aktiver Bestandteil in irgendeinem einer Vielzahl pharmazeutischer Präparate verwendet werden. Diese Antibiotika und ihre entsprechenden Salze können in Kapselform oder als Tabletten, Pulver oder flüssige Lösungen oder als Suspensionen oder Elixiere verwendet werden. Sie können oral, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Zu geeigneten in der Zusammensetzung verwendeten Trägern gehören beispielsweise Mannit, Saccharose, Glucose oder sterile Flüssigkeiten, wie ζ. B. Wasser, Salzlösung, Glykole und öle aus Erdölherkunft, tierischer, pflanzlicher oder synthetischer Herkunft, wie beispielsweise Erdnussöl, Mineralöl oder Sesamöl. Ausser dem Träger können die erfindungsgemassen Zubereitungen auch andere Bestandteile enthalten, wie beispielsweise Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Gleitmittel, Suspendierungsmittel, Viskositätsmittel, Geschmacksstoffe und dgl. Ferner können in den Zubereitungen auch andere aktive Bestandteile enthalten sein, um ein breiteres Spektrum antibiotischer Wirksamkeit zu liefern.

- "85 109839/1836

8(

Die zu verabreichende Dosis hängt weitgehendem Zustand des zu behandelnden Lebewesens und dem Gewicht des Wirts ab. Der ■- parenterale Weg wird für allgemeine Infektionen und der orale Weg für Intestinalinfektionen bevorzugt. Im allgemeinen besteht eine tägliche Dosis aus etwa 15 bis etwa 175 mg aktivem Bestandteil je kg Körpergewicht des Lebewesens in einer oder mehreren Anwendungen je Tag. Eine bevorzugte tägliche Dosis für das Antibiotikum 810A oder dessen Einzelkoiaponenten liegt im Bereich von etwa 20 bis 40 mg an aktivem Bestandteil je kg Körpergewicht. Die bevorzugte tägliche Dosis für das Antibiotikum 842A liegt im Bereich von etwa 40 bis 80 mg an aktivem Bestandteil je kg Körpergewicht.

Die vorliegenden Zubereitungen können in verschiedenen Einhe .tsdosierungsformen, beispielsweise in fester oder flüssiger, oral einnehmbarer Dosierungsforni, verabreicht werden. Die Zubereitungen enthalten je Einheitsdosierung, gleich ob flüssig oder fest, im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 700 mg aktivem Bestandteil, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitungen; jedoch wird es im allgemeinen bevorzugt, eine Dosierungsmenge im Bereich von etwa 80 mg bis 320 mg zu verwenden. Bei parenteraler Verabreichung ist die Einheitsdosierung gewöhnlich die reine Verbindung in einer sterilen Wasserlösung oder in Form eines löslichen Pulvers, das zur Auflösung bestimmt ist.

Eine typische Einheitsdosierungsform besteht im Vermischen von 120 mg Antibiotikum 810A oder 120 mg einer seiner Bestandteile oder eines Salzes mit 20 mg Lactose und 5 mg Magnesiumstearat und Einbringung des 145 mg Gemische in eine Gelatine-Kapsel Nr. 3. In ähnlicher Weise können unter Verwendung von mehr aktivem Bestandteil und weniger Lactose andere Dosierungsformen in Gelatine-Kapseln Nr. 3 eingebracht werden, und sollte es notwendig sein, mehr als 145 mg Be-

- 86 109839/1836

standteile zusammen zu vermischen, können grössere Kapseln verwendet werden. In ähnlicher Weise können andere Einheitsdosierungen, wie beispielsweise gepresste Tabletten und Pillen gleichfalls hergestellt werden. Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung:

Trockengefüllte Kapsel, die 120 mg 7ß-(D-5-amino-5-carboxyval eramido )- J- (cr-raethoxy-p- nul f ooxycinnamoyloxymethyl )-?- metlio2ry-3-(cephe^-4-carbonsäiLre(Ic; enthält

je Kapsel

7-ß- (D-5-Ainino-5-carbo:xyval eramido )-j-Ca-methoxy-p-sulfooxycinnaraoyl)-oxyra ethyl) -7-ni e thoxy- 3- c ephem-4- c arbonsaüre (Ic)

Lactose
Magz^Gsiumstearat

Kapselgrösse Kr. 3 Λ^ mg

120	mg
20	mg
5	mp;

Die 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyniethyl)-7-methoxy-3-cephein-4—carbonsäure (Ic) wird auf ein Pulver einer Korngrösse entsprechend einem Siebdurchgang durch ein Sieb mit 0,25 ¹^ (Nr. 60) zerkleinert und dann werden Lactose und riagnesiumstearat durch, ein Siebtuch jnit 0,25 e™ lichter Ha sch emv ei te (Nr. 60) auf das Pulver gegeben, und die vereinigten Bestandteile werden 10 Hinuten vermischt und dann in Gelatine-Kapseln Nr. 3 eingefüllt.

Indem 40 mg Antibiotikum 842A und 100 mg Lactose anstelle der 120 mg an aktivem Bestandteil und 20 mg Lactose in der vorangehenden Zubereitung eingesetzt werden, erhält man eine 145 ng Kapsel, die gleichfalls zur oralen Verabreichung geeignet ist.

-87 -

10 9 8 3 9/

250 mg 7ß-(D-5--Ä-niino-5-carboxyvaleramido)-3-(tt-methoxy-psulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-fflethox3''-3-cephem-4-carbon säure (Ic) enthaltende Tablette

je Tablette

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-

3-(<x-methoxy-p-sulfooxycinnamoyl-

oxymethyl)-7-m ethoxy- 5- c ephem-4-

carbonsäure (Ic) 250

Dicalciumphosphat, U.S.P. 192 mg

Magnesiumstearat 5 mg

Lactose, U.S.P. 65 mg

Der aktive Bestandteil wird mit dem Dicalciumphosphat und der Lactose vermischt. Das Gemisch wird mit 15%iger Maisstärkepaste (6 mg) granuliert und grobgesiebt. Es "wird bei 45 C getrocknet und wieder durch ein ßieb mit 1,2 mm lichter Maschenweite (Wr. 16) gesiebt. Das Magnesiumstearat wird zugegeben und das Gemisch zu Tabletten von etwa 13 mm Durchmesser gepresst.

7ß-(D-5-Amino~5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)~ ^-methoxy-J-cephera—^-carbonsäure (Ib) enthaltende Tablette

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvuleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-Biethoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ib) Maisstärke, U.S.P.
Di calci umpho sphat
Lactose, TJ.S.P.

Der aktive Bestandteil wird mit dem Dicalciumphosphat und der Lactose und etwa der Hälfte der Maisstärke vermischt. Das Gemisch wird dann mit einer 15%igen Haisstärkepaste (6 mg) granuliert und grobgesiebt. Es wird bei 45° C getrocknet und durch Siebe mit 1,2 mm lichte Haschenweite

- 88 1098 3 9/1836

je Tablette	mg
125	mg
6	mg
192	mg
190

(Nr. 16) gesiebt. Der Best der Maisstärke und das Magnesiumstearat v/erden zugegeben, und das Gemisch wird zu Tabletten mit einem Durchmesser von etwa 13 ^™-» cüe je 800 mg wiegen, verpresst.

500 mg 7ß-(I⁾-5--^Ä-niino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-psulfooxycinnamoyloxyinethyl)-7-ittethoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ic) enthaltende parenterale Lösung

Ampulle:

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycirmamoyloxyl)7hb

y)7y3p säure (Ic) . 5^{00 m}S

Ampulle:

Verdünnungsmittel: Steriles Wasser für -,

die Injektion 2 cm⁵

Die 7ß-(D-5--^A-^mii¹o-5-carboxyvaleramido)-3-(a-2iethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-iaethoxy-3-cephem-4-carbonsäüre (Ic) kann allein oder in Kombination mit anderen biologisch aktiven Bestandteilen verabreicht werden, beispiels weise mit anderen antibakteriellen Mitteln, wie beispielsweise Lincomycin, einem Penicillin, Streptomycin, Novobiocin, Gentamicin, Neomycin, Colistin und Kanamycin.

Durch Einsatz einer äquivalenten Menge -7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ib) anstelle der 500 mg 7ß-(^-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyme.thyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ic) in der vorangehenden Zubereitung kann auch eine zur parenteralen Verabreichung geieignete Zubereitung erhalten werden.

Synthetische Methoden

Ausser den vorstehend beschriebenen Fermentationsprodukten umfasst die Erfindung Derivate, in denen der 3-Carbamoyloxy

- 89 109839/1836

Anteil von 842A durch, eine grosse Vielzahl von Substituenten ersetzt ist. Im allgemeinen erfolgt dieser Ersatz oder diese Substitution durch einfache Behandlung von 842A mit einer.! Reagens, das zur Überführung des 3-Carbamoyloxy-Anteils in den gewünschten Substituenten R (siehe Formel I) befähigt ist. Jedoch ist es in der Praxis häufig notwendig, vor dem Ersatz des 3-Carbamoyloxy-Restes die freien Amino- und Carboxy-Gruppen durch Behandlung von 84-2A mit einem Stickstoff-Blockierungsmittel, wie beispielsweise einem IT-niedrig-Alkoxycarbonylphthalimid und einem Veresterungsiaittel unter Bildung des entsprechenden 7ß-(D-5-Phthaloyla:Lino-5-carboxyvaleramido )~$- ( cax-bamoyloxyniethyl )-7-methoxy- 3-cephem-4-carbonsäure-diesters (folgende Verbindung II) zu schützen. Zu geeigneten Veresterungsmitteln gehören Phenyldiazomethan od. jr Diphenyldiazomethari und dgl. Auch gehören zu anderen anstelle des N-niedrig-Alkoxycarbonylphthalimids verwendbaren Stickstoff-Blockierungsmitteln tertiäres Butyloxyazid oder Trihalogenäthoxycarbonylhalogenide, wie beispielsweise Trichioräthoxycarbonylchlorid und dgl. Die folgende Gleichung, in der das Stickstoff-Blockierungsmittel ein H-niedrifc-Allroxycarbonylphthalimid ist, erläutert diese Reaktion, jedoch sei darauf hingewiesen, dass andere Stickstoff-Blockierungsmittel, beispielsweise die oben erwähnten, anstelle dessen in einer sonst gleichen Reaktion eingesetzt werden können, um das entsprechende li-substituierte Derivat zu erhalten:

- 90 _

109839/1836

34

O OCH-

HOOC-CH-(CH

2' 3

L. \

NH-

Ib

COOH

I!

0 OCH₃

HOOC-CH- (CH₂) ₃-CNH~-

CO

COOH

I!

R¹³R¹⁴HCOOC-CH-(CH₀),-• j 2 3

O=C C=O -

II

0 OCH,

COOCHR¹³R¹⁴

worin Ii ^H C=ITp Diazomethan oder ein arylsubstituiertes Diazomethan ist, v;ie beispielsweise Phenyldiazonethan oder

Ί "5 Ί4-Diphenyldiaz03ethan und dgl., und K ^ und R V/asserstoff oder Phenylreste sind. Die auf diese Weise erhaltene Verbindung (II) ist das Ausgangsmaterial in den folgenden synthetischen Verfahren.

1 O S 8 3 9 / 1 8 3

14305

Das 3-Hydroxyinethylanaloge von 842A wird durch Behandlung der Verbindung II mit einem Nitrosyl¹ halogenid, beispielsweise Nitrosylchiοrid, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise lie thy 1 enchlpri d, erhalten. Die folgende Gleichung erläutert dieses Herstellungsverfahren:

O OCH-

R¹³R¹⁴HC-OOC-CII-- (CH₂) ₃~C-h

II

, .J-CH₂OCNII₂ COO-CIIR¹³R¹⁴

NOCl/CI^Cl

\l

O OCH-

R¹³R¹⁴HC-OOC-CH-(CH₂) ₃-C~miS

O=C

C=O

III

2^0H .00-CHR¹³R¹

-92-

109829/1836

¹⁴³⁰⁵

Ί4

worin R ^J und R die vorstellend angegebene Bedeutung besitzen. Der so erhaltene Diester, vorzugsweise der Di-benzylester (lila) kann dann in die entsprechende freie Aminosäure (IV) durch katalytische Hydrierung und Behandlung mit Hydrazinhydrat in einer basischen Lösung hergestellt werden. Die Deblockierung erfolgt nach dieser Methode am zweckmässigsten, wenn das Diester-Reaktionsmittel der Dibenzylester (lila) ist. Die folgende Gleichung erläutert dieses Herstellungsverfahren:

O OCH₃

-C-NH-f

IHa

COO-CH₂

K₂Pd

0 OCH₀

- Il f \

HOOC-CH- (Clip) --C-NH-f- f ^hs

■I

o=c c=o

N J

-CII₉OH

COOH

Biise

O OCH J

MOOC-CH-(CH₉) -C-NH-

IV

- 93

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wobei M das von einem Alkali- oder Erdalkalimetall abgeleitete Kation ist.

Die N-mono-substituierten und Ν,Ν,-disbustituierten J-Carbfcmoyloxyaiialogen von 842A werden in einfacher V/eise durch Behandlung des Diesters der 7ß-(D-5-ßithaloylamino-5-carboxyvalerai;iido)-3-(hydro>^^rraethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~cai-bon~ säure, vorzugsweise in Form ihres Dibenzhydryl esters (IHb), mit einem Carbony!halogenid, wie beispielsweise Carbonylchlorid (d. h. Phosgen) oder Carbonylbromid, und βηεοΙιϋοΞ-sende Reaktion des auf diese V/eise erhaltenen Bibenzhydrylesters der 7ß-(D-5-i^>hthaloyIamino-5-carboxyvaleramido)-3-(halogenformyloxymethyl)-7-methoxy~3~cepheia-4--carbonsäure (Yj mit dem entsprechenden rlono-niedrig-alkylamin, Diniedrig-alkylamin oder heterocyclischen Amin erhalten:

- 94 -

109839/1836

14305

9. ocii.

-cH- (cn) ₃-c-uH-|

IHb

-CH OH 2

COOCH-i^

COX-

C C

O OCIU

Il 4

C-KII

Ii

COOCHίζ

HNR¹⁵R¹⁶

O OCH.

VfCIl-OOC-CH- (CH₀) --C-NH--

^{2 3}

o=c c=o

/R^J-^J

15 ^CH₂OC^_r16

COO-CHf^ V>)

VI

worin COXp ein Carbonylnalogenia, beispielsweise Carbonylchlorid (ά. h. Phosgen) oder Carbonylbronid und X einen

Λ C /IC

Halogenrest, beispielsweise Chlor, Brom und dgl., HIiR -\R

- 95 39/1836

14305

ein primäres oder sekundäres Amiη aus Kono-niedrig-alkylaminen, Di-niedrig-alkylaminen und/oder heterocyclischen

Aminen und

und E niedere Alkylreste, wie beispielsweise

Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, n--Butylreste und dgl. bedeuten und R und R. zusammengenommen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, unter Bildung eines mononuklearen, heterocyclischen Amins aus Pyrrolidin, Piperidin und/oder Morpholin kombiniert sein können. Das so erhaltene Produkt (VI) kann dann in die entsprechende freie Aminosäure durch Behandlung mit Trifluoressigsöure in Xylol und darm mit Hydrazinhydrat in einer basischen Lösung überführt werden:

O OCH Il
-00C-CH-(CH₉)-,-

O-C C=O

\Z) ^vi

J]
HOOC-CH- (CII₉) .,-C-UH-

I ^J

O=C

Va

O OCH-, J] I ³

COOH

Base

O QCH₃ MOOC-CH-(CH₂J₃-C-NH-

109839/1836

1 5 16
worin M nnd R ^ und R die vorstehend angegebene Bedeutung

besitzen«.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung der N-monosubstituierten Derivate von 842A besteht in der Behandlung der Verbindung III oder eines Disalzes davon mit einem geeigneten Isocyanat. Diese Umsetzung wird besonders vorteilhaft in Gegenwart
einer starken organischen Base, beispielsweise Triäthylamin und in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, z. B. Dimethylformamid, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran oder Acetonitril , durchgeführt:

R¹³R¹⁴HCOOC-CII- (C

-N
O=C"

COOCIIR¹³R¹⁴

III

0 OCH _

Il ^rf

R¹³R¹⁴HCpOC-CII-(CH₀) ,-CNH-/ f-"^SN ' ₀

ί ^{2 3} Il

COOClIR¹³R¹⁴

-97 109839/1836

worin E ' einen niederen Alkylrest, halogensubstituierten niederen Alkylrest. z. B. ChIοrmethyl-, 2-Chloräthyl- oder Chlor-tert.-butylrest und dgl., niederen Alkoxycarbonylrest, beispielsweise einen A'thoxycarbonylrest und dgl. , mononuklearen und birxuklearen Arylrest, z. B. Phenyl-, liaphthyirest und dgl., mononuklearen Alkarylsulfonylrest, z. B. p-Tolylsulfonylrest und dgl. , od.er einen Benzhydrylrest bedeutet. Typische verwendbare Isocyanat-Reaktionsmittel (d. h. OC-KE ') sind beispielsweise Methylisocyanat, ilthylisocyanat, tert.-Butylisocyanat, Chlonaethylisocyanat, ß-Chloräthylisocyanat, Carbäthoxyisocyanat, PhenyIisocyanat und Benzhydryli so cyanat. Die nach diesem Verfahren erhaltenen Produkte können dann in die entsprechende freie Säure nach der vorherbeschriebenen Methode, d. h. durch Behandlung v±t Trifluoressigsäure in Xylol und anschliessende Umsetzung des erhaltenen Zwischenproduktes mit Hydrazinhydrat in basischer Lösung überführt werden.

Die 3-acylierten Derivate der Erfindung entsprechen der Formel I, worin E einen niederen Alkanoyloxyrest, aromatischen Carbonyloxyrest, Aralkanoyloxyrest oder Cycloalkancarbonyloxyrest bedeutet, werden in einfacher V/eise durch Behandlung des Dibenzhydryiesters der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3~ cephem-4~carbonsäure (IHb) mit einem geeigneten Acylhalogenid erhalten. Die folgende Gleichung erläutert dieses Herstellungsverfahren :

- 98 -

109839/1836

14-305 -

Il

OCH

CII-OC-CII- (CII₀) -.-C-NH-/ ι 2 3

O-C

C=O

HIb

XCR

18

O OCH.

(' V)CH-OOC-CH-(CH_n) -CNH-i——

HlC

NH- p\ ₀

J. J₁ J-CIT OCP¹⁸

COOClH ^ \\

18
worin R einen niederen Alkylrest, "beispielsweise einen Methyl-, ilthylrest und dgl., mononeklearen und binuklearen Arylrest, beispielsweise einen Phenylrest, einen mononuklearen, stickstoffhaltigen Heterocyclus, wie beispielsweise 4—Pyridylrest und dgl., Naphthylrest und dgl., mononuklearen und bi-nuklearen niederen Alkylrest, wie beispielsiveise Benzyl-, ilenapiithylrest und dgl., oder einen Cycloalkylrest mit 5 bis 6 Kernkohlenstoffatomen, ζ. B. Cyclopentyl- oder Cycloliexylrest und dgl. , bedeutet und X die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt. Das so erhaltene Produkt kann wiedei'um in die entsprechende freie Säure durch Behandlung mit Trifluoressigsäure in Xylol und anschliessende Umsetzung des erhaltenen Zwischenproduktes mit Hydrazinhydrat in einer basischen Lösung erhalten werden.

- 99 -

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Die 3-Methylanalogen von 84-2A werden in einfacher Weise durch Reduktion von S4-2A oder einem Salz davon, beispielsweise durch katalytisch^ Hydrierung des entsprechenden Alkalioder Erdalkalisalzes, erhalten. Zu Katalysatoren, die in diesem Verfahren verwendet v/erden können, gehören beispielsweise beliebige Metalle der Gruppe VIII des Periodischen Systems, beispielsweise Palladium, Platin oder Nickel. Die folgende Gleichung erläute3?t dieses Herstellungsverfahren:

1100C-CH-(CH₀) _-

ί ^{2 3} NIU

Il

CH₂OCKH₂

COOH

HOOC

-CH-* (CH ) -C-NH-^--—

COOH

Solche Derivate von 842A, die nicht nach den vorangehenden-Methoden hergestellt werden, können durch Behandlung eines 3-Acyloxymethylanalogen von 842A, beispielsweise dem 3-niedrig-Alkanoyloxymethylanalogen, z. B. 7ß-(D-5-Airiino-5-carboxyvalerani do)-J-(ac etoxymethyl)-7-Kethoxy-3-c ephem-4-carbonsäure, mit dem geeigneten Thioharnstoff oder li-substituierten Thioharnstoff, Thiol, Dithiocarbamat, Dithio-

- 100

10983971836

carboxylat, Amin, Pyridin, kernsubstituierben Pyridin, Alkalisulf inat, Az.id, Polyhydroxybenzol oder 11-niedrig-Alkylindol erhalten werden. Die sich ergebenden Produkte können dann durch übliche Mittel, z. B. durch Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln, wie beispielsweise Methanol und Wasser oder durch Fraktionierung durch ein geeignetes Ionenaustauschharz gereinigt werden.

Es wurde festgestellt, dass ausser dem 3-Acyloxymethylanalogen von 842A das 842A an sich als ein Ausgangsiaat'erial bei der Umsetzung mit Thioharnstoff und Alkaliaziden usw. verwendet v/erden kann. So kann beispielsweise 842A mit dem geeigneten Thioharnstoff, N-substituierten Thioharnstoff, Ν,ΐί-disubstituierten Thioharnstoff, Alkaliazid, Thiazol, Thiadiazol, Halogenierungsmittel oder Alkalithiocyarat unter Bildung der entsprechenden 3-Thiouroniumnethyl-, J-Azidomethyl-, 3-Thiazolylm-ercaptomethyl-, J-Thiadiazolylmercaptomethyl-, Ilalogenmethyl- und 3-Thiocyanatomethylanalogen von 842A behandelt \ferden. Im Prinzip ist es lediglich notwendig, die Ausgangsmaterialien zu vereinigen, um die Synthese herbeizuführen, jedoch ist es in der Praxis gewöhnlich zweckmässig, die Reaktion durch Anwendung von Wärme, beispielsweise durch Erhitzen auf Temperaturen im Bereich von etwa 45 bis 95° G während eines Zeitraums von etwa 2,5 Tagen bis einigen Minuten zu katalysieren. Eine bevorzugte Arbeitstemperatur liegt im Bereich von etwa 75 bis 80° C, und gute Ergebnisse wurden auch'nach Erhitzen der Eeaktionsteilnehmer bei 95° ^c während etwa 8 Minuten erhalten. In einigen Fällen ist es auch zweckmässig, die freie Amiriogruppe in der 5~ Amino-5-carboxyvaleramido-öeitenkette des 842A zu schützen, indem letztere mit tert.-Butoxycarboriylazid oder einem ähnlichen Blockierungsmittel behandelt wird. Die erhaltene 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylairiino-5-carbo3cyvaleramido)-3-carbamoy loxyrn.ethyl)-7-methoxy- J-c epheu-4- carbonsäure kann dann mit dem entsprechenden Thioharnstoff, Alkaliazid, Thia-

.-. 101 > 109839/ 1836

4Oi

zol, Thiadiazol, Halogenierungsmittel oder 'I'hiocyanat-Reaktionsmittel behandelt ν/erden, um den gewünschten Substituenten in der J-Stellung des 842A Kerns ohne die Gefahr irgendwelcher unpassenden Seitenreaktionen einzuführen. Das so erhaltene Zwischenprodukt kann dann durch Behandlung mit einem geeigneten Reagens, wie beispielsweise Trifluoressigsäure, unter Erzielung des gewünschten Produktes deblockiert Vi erden.

Bas nach dem vorangehenden Verfahren erhaltene 3-Azidomethyl-Deri vat von 84-2A wird in sein entsprechendes J-Aminomethylanaloges durch Reduktion überführt. Zu geeigneten Mitteln gehören beispielsweise molekulare Reduktion und Hydrierung über einem geeigneten Metallkatalysator, wie beispielsweise äi-i Metalle der Gruppe VIII des Periodischen Systems. Zu typischen verwendbaren Metallen gehören beispielsweise Platin, Palladium und Nickel und deren Kombinationen.

Die molekulare Reduktion des 3-Azidomethyl-Derivats wird am günstigsten durchgeführt, indem Zinkstaub zu einer sauren Lösung des J-Azidomethyl-Reaktionsmittels zugegeben wird. Die erhaltene Lösung wird dann mit Schwefelwasserstoff oder einem äquivalenten Material zur Entfernung des löslichen Zinks aus der Lösung in Form eines Niederschlags behandelt. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist das praktisch reine 3-Aminomethylanaloge von 842A.

Die erfindungsgemässen Produkte (I) bilden eine grosse Vielzahl pharmakologisch verträglicher Salze mit anorganischen und organischen Basen; dazu gehören beispielsweise Metallsalze, wie z. B. solche, die sich von Alkali- und ErdalkalihydiO-xiden, Carbonaten und Bicarbonaten ableiten und Salze, die sich von primären, sekundären und tertiären Aminen ableiten, wie beispielsweise Monoalkylamine, Dialkylamine, Trialkylaniine, niedere Alkanolamine, Di-niedrig-alkanolamine, niedere

- 102 109839/1836

Alkyl endiamine, IT, N-Diaralkyl-ni edri g-alkylendiamine, Aralkylamine, aminosubstituierte niedere Alkanole, N,N~di-niedrigalkylaminosubstituierte niedere Alkanole, amino-, polyamino- und guanidinosubstituierte niedere Alkansäuren und stickstoffhaltige heterocyclische Amine. Zu typischen Beispielen dieser Salze gehören Salze, die sich von Natriumhydroxid, Natriumcarbonat;, Katriumbicarbonat, Kaliuiacarbonat, Kali uinhydr oxid, Calciumcarbonat und dgl. ableiten und Salze, die sich von Aminen, wie beispielsweise Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin, Horpholin, Chinin,. Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Ethanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamiη, Ν,Ν¹-Dibenayläthylendiamin, Diethanolamin, Piperazin, Dimethylarninoäthanol, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Theophyllin und N-rlethylglucanin und dgl. , ableiten.

Die vorstehend erwähnten Salze können Monosalze sein, wie beispielsweise das Hononatriumsalz, das beispielsweise durch Behandlung eines Iquivaleriö Natriumhydroxid mit einem Äquivalent des Produktes (I) erhalten \irird, oder gemischte Disalze, die durch Behandlung eines Äquivalente des Monosalzes mit einem Äquivalent einer abweichenden Base, erhalten \*^rird. Diese Disalze können auch erhalten werden, indem ein Äquivalent einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie beispielsweise Calciumhydroxid, mit einem Äquivalent des Produktes (I) behandelt wird. Ferner kommen gemischte Salze und Ester,-wie beispielsweise solche, die durch Behandlung des Produktes (1) mit einem Äquivalent Natriumhydroxid und dann mit einem Äquivalent Milchsäure erhalten werden, in Betracht.

Die erfindungsgemässen Salze sind pharmakologisch verträgliche, nicht-toxische Derivate die als wirksamer Bestandteil in geeigneten pharmazeutischen Einheitsdosierungsformen verwendet werden können. Sie können auch mit anderen Arzneimitteln kombiniert werden, um Präparate mit einem breiten Virkungsspektrum zu ergeben. Ferner sind die erfindungsgemäs-

- 103 109 8 3 3/1836

O 1 η η ο r /

sen Salze und ebenfalls die entsprechenden Ester und Amid-Derivate brauchbar als Zwischenprodukte zur Herstellung des durch die Formel I wiedergegebenen Carbonsäure-Produktes. Die Salze können auch zur Herstellung anderer pharmazeutischverträglicher Salze verwendet werden.

Ausser in Salze können die erfindungsgemässen Produkte (I) auch in ihre, entsprechenden Mono- und Diester und Mono- und Diamide überführt werden, wie beispielsweise die PfrfiLoyloxymethyl- oder Dibenzhydrylester oder Alkyl-, Cycloalkyl.-, Aryl- oder Aralkylester, wie beispielsweise die Methyl-, Äthyl-, Cyclohexyl-, Phenyl- und Benzylester oder Amide, Diamide, N-niedrig-Alkylamide, Ιί,Π-Di-niedrigalkylamide, E-Aralky!amide, N,Ii-Diaralky!amide oder heterocyclische Amide, wie beispielsweise Η-Methyl- und B-Jithylamid, N,H-Dimethy1-amid, Ν,Η-Diäthylamid, Π-Benzylamid, Η,Ε-Dibenzylamid, Piperidid, Pyrrolidid oder Morpholid und dgl.

Zu Methoden zur Herstellung der vorstehend erwähnten Ester und Amid-Derivate gehören die Reaktion des Carbonsäure-Produktes (I) oder eines entsprechenden Säurehaiοgenids mit Methanol, Äthanol, Cyclohexanol, Phenol, Benzylalkohol oder Dibenzhydrol. In ähnlicher Weise können die Amid-Derivate erhalten werden, indem das entsprechende Säurehalogenid mit. Ammoniak oder mit dem entsprechenden Alkylamin, Dialkylamin, Aralkylamin oder heterocyclischen Amiη behandelt wird. Diese und andere übliche Methoden zur Herstellung dieser Ester und Amide sind dem Fachmann geläufig.

Die folgenden Beispiele erläutern die Verfahren, über die die erfindungsgeraässen Produkte erhalten werden können. Die Beispiele dienen jedoch lediglich zur Erläuterung, und es ist dem Fachmann klar, dass von der Erfindung andere funktionell-äquivalente Produkte und Verfahren zu ihrer Herstellung eingeschlossen sind. Daher ist jede Modifikation dieser

- 104- -

1098 3 S/183 6

14 305

Synthesen, die zur Bildung eines identischen Produktes führt, als analoge Methode anzusehen. Das beanspruchte Verfahren unterliegt weitgehender Variation und Kodifikation, und daher wird Jede geringe Abweichung oder Ausdehnung als im Rahmen der Erfindung liegend betracht.

Beispiel 1 Antibiotikum 81OA

Ein lyophilisiertes Reagensglas mit Streptomyces griseus Kultur (MA-2837) wurde aseptisch geöffnet» Der Inhalt wurde zur Beimpfung von vier ßchrägkulturen eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Medium I;

Difco-Hefeextrakt 10,0 g

Glucose 10,0 g

* Phosphatpuffer 2,0 ml

MgSO₄ · 7H₂O 0,05 g

Destilliertes Wasser · 1000,0 ml

Difco-Agar 25,0 g

* Phosphatpuffer

91,0 g

₂₄ 95,Og

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

Die Schrägkulturen wurden durch Verteilung von 14 ml/ 22 χ 75 mm Kulturreagensglas hergestellt. Das Reagensglas wurde mit V/atte verstopft, 15 Hinuten auf 120° G zur Sterilisierung erhitzt, und man liess das Medium in schräger Anordnung verfestigen. Die beimpften Schrägkulturen wurden bei 28° C 1 Woche inkubiert und dann bei 4° C bis zur Verwendung gelagert. Die Kultur auf einer dieser Schrägkultu-· ren wurde dann zur Beimpfurig v_n mit Unterteilungen ver—

- 105 - · 109839/1836

sehenen 250 ml Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 50 ml Medium II enthielten, indem 5 ml steriles Medium zugegeben wurden, die Schrägkultur-Oberfläclie gekratzt wurde,um das Wachstum zu unterbrechen und 1 ml in jeden der drei Keimkolben aseptisch pipettiert wurde. Das Medium II besass die folgende Zusammensetzung:

Medium II;

Rindsextrakt . 3,0 g

* NZ Amin 10,Og

Dextrose 10,0 g

NaCl . 5,0 g

Destilliertes V/asser 1000,0 ial pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt

* Ein enzymatisch abgebautes Casein

Der Keimkolben wurde auf einem Rotationsschüttler bei 220 Upm mit einen Hub von 5 cm 3 £"age geschüttelt. Die Keiiakolbenkultur wurde dann zur Beimpfung von 11 mit Unterteilungen versehenen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 350 ml Medium III enthielten, wobei 2 bis 3 °/° Inoculum verwendetwurde. Medium III besass die folgende Zusaramens etzung:

Medium III:

Dextrose Asparagin

Hefeextrakt * Spurenelement gemi sch ITr. 2 Destilliertes Wasser

pH mit ITaOH auf 7,2 eingestellt

10,0	6
1,0	ε
0,1	S
0,5	ε
0,5	g
10,0	Eil
1000,0	ml

- 106 -

109839/1836

¹⁴³⁰⁵

* 7H

Gpurenelementgemisch Hr. 2:

7H₂O 1,0 g

H₂O 1,0 g

CuCl₂ · 2E₂O 25,0 mg

CaCl₂ 100,0 mg

56,0 mg

• 4H_o0 19,0 mg

ZnSO_{4 β} 7H₂O 200,0 mg

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

Die ICoIl)en wurden dann auf einem Schüttler "bei 135 150 Upm. mit einem Hub von 5 cm 4 Tage bei 28° C geschüttelt Kac.li BeendiGizrig des Inkubationszeitraums wurde der Inhalt der 11 Kolben vereinigt und untersucht. Die Untersuchung der kombinierten, zentrifugierten Brühe zeigte eine Inhibier ungßζoixu von 22 mm (13 mm-Scheiben) gegen Proteus vulgariy auf einer Standard-Versuchsplatte. Dieses Antibiotikum, wurde als 810A identifiziert, d. h. ein Antibiotikumgemisch, das 7ß-(D~5-Amino-5-carboi:yvaleramido)-3-(aiaeth.o3^-p-suli"ooxycinnainoyloxyrtethyl)-6-m.ethoxy-3-ceph.em-4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carbocyvaleramido)-3-(a-

carbonsäure (xa) enthält.
Beispiel 2

Antibiotikum 81QA

Ein lyophiliciertes Reagensglas mit Streptomyces griseus (ΓΙΑ-2837) wurde aseptisch geöffnet, und der Inhalt wurde zur Beimpfung der als Medium I in Beispiel 1 beschriebenen Nährmedium-Schrägkulturen verwendet. Diese Schrägkulturen wurden bei 28° C 1 Woche .inkubi-ort, wonach sie bei 4° C gelagert wurden. Ein Teil der Kultur auf einer dieser Schrägkulturen wurde dann zur Beimpfung eines mit Unterteilungen

- 10=7 109839/1836

versehenen 250 ml-Iinpf-ErleiiPieyer-Kolbens, der 50 als Medium Il in Beispiel 1 beschriebenen Mediums enthielt, verwendet. Dieses beimpfte Hedium wurde bei 28° G 2 Tage auf einem Kotationsschüttler mit einem Hub von 5 cm bei 220 Upm inkubiert. !Das Inoculum wurde dann as ep ti sch unter Herunterz entri fungi c-ren den My c eis gewaschen, die'überstehende Flüssigkeit abgegossen, in einem gleichen Volumen Salzlösung resuspendiert, resentrifungiert und wieder in einer 0,9%igen Natriumchloridlösung resuspendiert. Das £ev.'aschene Hy eel wurde dann zur Beinrpfung (2 % Inoculum) von zwei mit Unterteilungen versehenen 250 ml-Erlenineycr-Koiben, die jeweils 50 ml eines chemisch bestimmten Produktiorunne-diums enthielten, das bei 120° C 15 Minuten steril!eiert worden war, verwendet. Das chemisch definierte Produkt!onsmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

Produktionsmedium:

L-Prοlin Glycerin Saccharose Mononatriumglutamat NaCl

CaCl₂

3 2 ZnCl₂

15,0	S
20,0	K
2,5	ε
1,5	6
5,0	S
2,0	6
0,4	g
0,1	g
0,1	ε
0,05	ε
1,0	6
1000,0	ml

Destilliertes Wasser

pH (nicht eingestellt) 7,1

Die Produktionskolben wurden dann bei 220 Upm auf einem Schüttler mit einem Hub von 5 cm 4 Tage bei 28° C geschüttelt. 'Es.wurden Versuche bei 3 und 4 Tagen durchgeführt. Proben"

- 108 -

109839/1836

14-305

wurden zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten nach dem Scheiben-Petri-Schalen-Verfahren untersucht. Unter Verwendung von 13 mm-ßcheiben ergaben diese Brühen Inhibierungszonen gegen Proteus vulgaris (MB-838) von 21 mm nach 3 Tagen und 26 LTiii nach M- Tagen. Das Produkt wurde als Antibiotikum 810A identifiziert.

Beispiel 3

Antibiotikum 81QA

Ein lyophilisiertes Reagensglas mit Streptomyces griseus (MA-4-I253.) wurde aseptisch geöffnet und der Inhalt in Schräg-' kulturen der folgenden Zusammensetzung überführt:

Medium IV:

V8-Saft 100 ml

Staley's 4S-So₁J abolin enm ehl 20,0 g

Dextrose 2,0 g

Agar · 25,0 g

Destilliertes Wasser bis 1000,0ml pH 7,9 his 8,0

Die so erhaltenen öchrägkulturen wurden dann zur Beimpfung verschiedener 250 ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 50 ml des folgenden Mediums V enthielten, verwendet.

Medium Vj_-

Hefe-Autolysat (Ardaain) 10,0 g

Glucose 10,0 g

* Phoßphatpuffer 2,0 ml

MgSO₄ * 7H₂O 0,05 g

Destilliertes Wasser - 1000,0 ml

pH-v/ert unter Verwendung von I¹IaOH auf 6,5 eingestellt.

- 109 10 9 8 3 9/1836

Phosphatpufferlösung:

91,0 g

₂₄ 95,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

Die Keimkorben wurden 1 Tag bei 28° C and 220 üpm geschüttelt.

Der Inhalt der Kolben wurde dan ζ ma Beimpfen von 59 250-ml-Erlenuieyer-Kolben ohne Unterteilungen, die 40 ml den Mediums VI enthielten, mit *>)5 ml Inoculum je Kolben verwendet.

Median VI:

Maisquellflüssigkeit (.feuchte Basis) 40,0 g

Dextrose 20,0 g

NaCl 2,5 g

MgSO₄ · 7H₂O 0,5 g

Polyglykol 2000 0,25

(zu ,jedem Kolben einzeln zugegeben) ·

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

pH-Wert mit EaOH auf 7,0 eingestellt.

Die Produktionskolben wurden auf eines Eotationsschüttler mit einem Hub von 5 cm bei 220 UpH und bei 24° C wehrend 40 Stunden geschüttelt, wonach die Kolben zusanmengcgeben wurden, eine aliquote Menge zur Untersuchung entnommen wurde und der Rest zu Extraktionsstudieii verwendet wurde. Die Probe zur Untersuchung wurde unter Verwendung von Chlorwasserstoff säure auf pH 4,0 angesäuert, filtriert, auf 1 : 4 in "Phosphatpuffer mit pH 5₅O verdünnt und auf Proteus vulgaris KB-838-Platten unter Verwendung von I5 ica Scheiben gebracht. Die Inhibierungszoiie betrug 26,5 m:a. Das Produkt vmi.i ?

- 110 -

10 9 8 3 9/18 3 6

14305

als Antibiotikum. 810A identifiziert, bestand jedoch vorwiegend aus 7ß-(B-5-Amino-5-carboxyvaleiⁱamido)~3-(a-methoxy-psul f ooxycinnamoyl oxymethy 1)- 7-m etlioxy- 3- c ep Ii em ~ 4- c arbonsä ure mit lediglich «Spurenmengen an 7ß-(D-5-Amino-5-carbox3^rvaler~ a:aido)-3-(a-metlio;c3'-p-hydroxycir-namoyloxyniethyl)-7-i'aethoxy-3-c ephem-4- carbonsäur e.

B e i η ρ i e 1 M-

Antibiοtikuai 810A

Eine V3 Nedium-Üchrägkultur der ütreptomyces griseus Kultur (I-IA-4125A) viurde zur Beinpfung von 50 ml Hediura V in einem
mit Unterteilungen versehen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verv.^Ten det.

e(IiUTi V:

Hefe-Autolysat (Ardamin)

Glucose

* Piiopphatpuffer

_{4 2}
Destilliertes V.^;asser

pH-V;ert mil; HaOH auf 6,5 eingestellt

* Pho sphatpuifer:

Destilliertes V/asser

10,0 g

1O₅O g

2,0 ml

0,05 g

1000,0 ml

91,0 g 95,0 g 1000,0 ml

Der Kolben wurde dann, auf einen Rotationsschüttler bei
220 Upiu 1 Sag bei 28° C geschüttelt. 3 e.1 dieses vegetativen Inocoluias vurden. zur Beimpfung eines Keinkolbens, der 50 ml des folgenden synthetischen Mediums (Medium VII) in einem
mit Unterteilungen versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben enthielt, verwendet.

- 111 -

109839/1836

14305

Medium VII:

L-Asparagin L-Histidin DL-Phenylalanin Mononatrium-glutamat NaCl

OaOl, MnSo' FeSO ZnSO

HpO

MgSO,, · 7E„0 Glycerin Saccharose Destilliertei

Wasser

Keimung	ε	Produktion	ε
5,0	S	5,0	e
4,0		4,0	S
—		2,0	ε
—	Z	1,5	e
5,0	ε	5,0	g
2,0	e··	2,0
0,4	ε	0,4	ε
0,1	ε	0,1	ε
0,1		0,1	S
0,05	ε	0,05	ε
1,0	e	1,0	ε
20,0	S	20,0	ε
2,5	ml		Eil
*1000,O	* * 1000,0

* υΗ mit HaOH auf 7,0 eingestellt
** pH mit HaOII auf 7,1 eingestellt

Der Keimkolben wurde wieder 1 Tag bei 28° C und 220 Upm geschüttelt. Dieses synthetische Keimaediun wurde dann zur Beimpfung verschiedener 250 ml-Erleraaeyer-Kolben ohne unterteilung, die ~$8 Eil des Procluktior-sraediuias VlI bei 1,5 ^ml
Inoculum je Kolben enthielten, verwendet. Die Produktionskolben wurden bei 220 Upm und 24° C geschüttelt, und ihre
Inhalte wurden dann ζ us aminen gegeben und bei 4- und 5täg^;.ger Alterung untersucht. Bei der Untersuchung wurde die gesarate Brülie auf pH 4,0 unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure angesäuert, und die Brühe wurde dann filtriert undaifi: 4 in Phosphatpuffer von pH 5,0 verdünnt. Die Untersuchung erfolgte auf Proteus vulgaris H3-838 unter Verwendung von 15 r;:ra-Sclieiben. Es wurde eine Inhibierungszone von 25,5 irj;i "bei
dieser I'erincntationsbrühe nach 4tl'giger Jiikubi&ruiiC¹; erhalten, und das auf diese V/eise erhaltene Produkt wurde als 81CA identifiziert.

- 112 109839/ 1836

Beispiel

443

Herstellung des Antibiotikums 810A und Trennung in seine Bestandteile

Stufe A:_ ffer/uentation

Stufe 1 : Der Inhalt eines lyophilisierten Röhrchens mit ßtreptomyces griseus (HA-2837) wurde in 2 ml Medium I (in Beispiel 1 beschrieben) suspendiert, und das erhaltene Inoculum wurde zur Beimpfung von Schrägkulturen des gleichen Medi.uias verwendet. Diese Schräglculturen wurden bei 28° C 5 Tage oder bis sie gut mit Sporen versehen waren, inkubiert, und dann wurden 10 ml Medium VIII zu den Schrägkulturen

zugegeben.

Medium VIII:

Fleiπchextrakt 0,3 %

HaCl 0,5 %

NZ Amin 1 % . .

Dextrose 1 % pH 7,0

Der Wuchs auf jeder Schrägkultur vmrde in Suspension gekratzt, und die Suspension wurde als Inoculunr'inN folgenden Stufe 2 verwendet.

Stufe 2: Die in Stufe 1 erhaltene Suspension wurde zur Beimpfung eines mit Unterteilungen versehenen 2^0 ml-Erlenmeyer-Kolbens, der 50 ml sterilisiertes Medium VIII ("beschrieben in Stufe 1) enthielt, verwendet. Der beimpfte Kolben wurde dan auf einen Eotationsschüttler bei 220 Upni gebischt und ^ιΥ'ύ Stunden bei 28° C inkubiert.

- 113

109839/183

14305

2109354

Stufe 5: Der Inhalt eines Impfkolbens aus Stufe 2 wurde zur Beimpfung eines mit Unter bei lung en versehenen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 500 nl des als Hediun VIII in Stufe 1 identifizierten Mediums enthielt. Der beimpfte Kolben wurde dann auf einen Rotationssehüttler bei 220 Upia gebracht und 48 Stunden bei 28° C ixikubiert.

Stufe 4: Ein Inoculum aus 500 ml des aus Stufe 3 erhalt-enen Wuchses wurde zur Beimpfung eines 750 Litex*-Feriaeritatioa'isbehälters aus rostfreiem Stahl, der 467 Liter eines sterilen Mediums YIII (in Stufe 1 beschrieben) enthielt, verwendet. Man Iiess die Fermentation bei einer Temperatur von 28° C unter Bewegung X"330 Upm) fortschreiten, während ein Luftstrom von 280 Ii (10 cfm) während 65 Stunden bei behälter! wurde. Während der Fermentation wurde ein Antischaummittel, PoIyglykol 2000, in kleinen Hengen zugegeben, usi übermäosiges Schäumen zu verhindern.

Stufe _5: Ein Inoculum aus J80 Liter (100 gallons) des erhaltenen Wuchses aus Stufe 4 wurde zur Beimpf ung eines 5700 Liter (15OO gallon) Fermentationsbehältero aus rostfreiem Stahl, der 4500 Liter (1200 gallons) des folgenden Mediums IX enthielt," verwendet.

Medium IZ:

Maisguellflussigkeit 4 %

Dextrose 2 %

pH-Wert nit ITaOII auf 7,2 eingestellt

Man liess die Fermentation bei einor Temperatur von 28° C unter Bewegung (120 Upm) fortschreiten, während ein Luftstrom von 1530 1 (55*3 cfra) während 30 "bis 35 Stunden beibehalten wurde. Während der Fermentation wurde 2000 in kleinen Mengen zugegeben, um überinässiges Schäunen zu verhindern. Der Ansatz wuroj/a gewonnen und die wiivrGaiu-

- 114 1 0S8JS/1836

keil, durch den Scheiben-Plattenversuch bestimmt. Unter Verwendung von 1;> ma (0,5 inch.) Scheiben ergab diese Brühe eine Irihibieruugszone von J2,5 nai gegen Proteus vuigaris MB-838, bei Gewinnung nach Jistiindiger Alterung.

Stufe B: Isolierung; des Antibiotikungemischs .81OA

Filtrierte Brühe 4050 1 (1075 gallons) aus Stufe A, Stufe 5, wurde nach 36 Stunden gewonnen und der pPI-Wert in den Ferment ation sb ehält er durch Zugabe von Phosphorsäure von 7 bis 8 auf 5jC¹ eingestellt, Das liycel wurde durch Durch!eiIen durch eine Filterpresse vom Platten-Siebtyp entfernt und verworfen. Die filtrierte Brühe wurde dann durch ein 380 1 (100 gallon) Bett aus Amberlite XAJJ-2 Adsorptionsharz mit einer Fliese-cesehwiiidigkeit von 58 1 (10 gallons) je Hinute gegeben. l)i - verbrauchte Brühe vrurde untersucht und verworfen, und. das Harsbott mit 2 Volumen Wasser¹ gewaschen. Das Antibiotikum v;uräe aus dem Harzbett rn.it einer GO^igen Lösung von I'Ietlianol uiid Wasser bei einer Jb'lieεsgeschwindigkeit λ^οη 19 1 (5 gallons) Je Hinute eluiert. ^L\O Fraktionen mit jevieilr. 19 1 (5 gallons) wurden gesanmelt und untersucht. Die Fraktionen 2 bis 40 wurden vereinigt und das Methanol durch Eindampfen im Vakuum entfernt. Das Endkonzentrat (158 1, 41,5 gallons) wurde durch Zugabe von Aunioniujiihydroxid auf j) H 3,5 eingestellt und gefror engehalten.

Proben wurden nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris biologisch untersucht.

Filtrierte 3τί"ΐβ: An 4000 1 (1060 gallons) filtrierter Brühe durchgeführte "versuche ergaben die folgenden Zonendurchmesser:

- 115 ~

10 9833/1836'

ORIGINAL

14305

Verdünnung

1 : 2 1 : 4 1 : 8

Filtrierte Brühe

/ionen trosse

26,8 Him 23,8 mm 21,1 mm -

Verbrauchte Brühe und Wanchlösun^: 10 Fraktionen von Je vielIs 380 1 (100 gallons) ergaben nach Untersuchung Null ohne Verdünnung. Das untersuchte Waschwasser ergab KuIl.

El uat f r akt i on en: _i Sämtliche Fraktionen \v*urden untersucht. Die Zcnendurchmesser sind ira folgenden tabellenmäcsig aufgeführ:

E El u atf rakti oji.ce

Fraktion	Zonengrosse
1	0
2	28 mm
3	35
4	34
5	36
6	36
7	36
8	38
9	38
10	36
11	36
12	38
13	40
14	37
15	36
16	37
17	38
18	36
19	36
20	35

Fraktion	Zonengröese
21.	33 ram
22	33
23	34
24	34
25	33
26	34
27	32
28	33
29	32
30	32
31	32
32	30
33	30
34	30
35	28
36	27
37
38	26
39	26
40	26

1098 39/1836

14505

Eluatziisainiaensetzunp· und Eluatkonzentrat: Es wurden ebenfalls Versuche an 740 1 (195 gallons) Eluatzusammensetzung und 1.58 1 (41,5 gallons) Antibiotikum 810A in Form von Eluatkonzentrat dui'chgeführt.

Eluatzusammensetzung Verdünnung Zonengrosse

Eluatkonzentrat 810A Verdünnung Zonengrosse

1 : 5	28,8	mm 1	gallons)	Eluatzusammen-	: 16 27,25 mm
1 : 10	27,0	mm 1 ;	3οrotion		:N52 24,5 mm
1 : 20	25,8	mm		Elusbkonz entrat
1 : 40	21,0	mm
Untersuchung d.er Gesamtfeststoffe:
illtrierte ]	119 kg
irühe
740 1 (195 gallons)	7,25 kg
setzung	7,20 kg
158 1 (41,5	an einem Anionenaustauschharz
Stufe C: Adf

Das Konzentrat auf Stufe B (78,5 I₁ 20,7 gallons) wurde mit Wasser auf 118 1 (3I gallons) verdünnt und an ein 22,5 1-Bett eines schwach-basisehen Anionenaustauschliarzes (Amberlite IEA-68-Harz, Chloridzyklus) bei pH 4,0 und einer Strömung von 7,6 1 (2 gallons) ,je Minute adsorbiert. Danach folgte eine Wäsche mit 45 1 Wasser, wonach das Harzbett mit einer Lösung aus 1 m-Natriumnitrat und 0,1 m-Ratriumacetat bei pH 7,5 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 l/min, eluiert wurde. Zehn 19 1 (5 gallons) Eluatfraktionen wurden dann gesammelt und dor pH-Wert mit der aufgefangenen Chlorwasserstoff säure auf pH 4 eingestellt.

Sämtliche Fraktionen wurden nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris biologisch wie folgt untersucht:

- 117 -

109839/1836

14305	Zonengrösse	El uat fraktionell	grosse	2109854	10	je
		Fraktion Zonen-	27 mm	, V er du nr. um? 1 :	Z 0 li en	mm
Beschickungslösunp;	28,5 mm		30 mm	Fraktion	gross	mm
Verdünnung	26,5 nun	1	28,5 mm		25	mm
	24 mm	2	26 mm	6	23	mm
1 : 10		3	7	22
1 : 20		4	8	21
1 : 40		9

5 26 mm 10 1715 m

Der verbrauchte Strom ergab nach Untersuchung 25 mm ohne Verdünnung und das Waschwasser ergab nach Untersuchung 23 mm ohne Verdünnung.

Stufe D: Adsorption an Arti onenaus tauschharz

Die Fraktionen 1 bis 1Ό aus Stufe C wurden kombiniert und einem 45' Liter-Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens bei pH 3,0 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 l/min, zugeführt. Das Harzbett wurde mit 90 1 Wasser bei der gleichen Geschwindigkeit gewaschen. Das Antibiotikum wurde dann aus dem Harz durch eine 25%ige Lösung aus Aceton und Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 l/min, eluiert. Sechzehn 19 1 (5 gallons) Fraktionen wurden gesammelt.

Sämtliche Fraktionen wurden nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris wie folgt untersucht: Die Beschikktfng (190 Liter) ergab die folgenden Zonendurchmesser:

Beschickunprslb'sung Verdünnung Zonengrösse

1:5 30 mm

1 : 10 27,5 mm

1 : 20 24,2 ram

- 118 -

109839/1836

Die Zonendurehmesser der Eluatfraktionen wurden in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

L'luatfraktlon

Eluatfrakti on

Fraktion Verdünnung Zonengrösse Fraktion Verdünnung Zonengrösse

1
2

5
6

7
δ

1
1
1
1
1
1
1
1

10 10 10 IO 10 10 10 10

20,5 mm

29

29

29

28

27 26

26

mm mm mm mm mm mm mm

1	: 10	25	,5	mm
1	: 10	26		mm
1	: 5	26		ram
1	! 5	28	,5	mm
1	! 5	27		mm
1	! 5	25		mm
si	. 5	25	,5	mm
1	VJl	24	mm

Die obigen Eluatfraktionen 2 bis 16 wurden kombiniert und das Aceton durch. Eindampfen im Vakuum auf ein Endvolumen von 17.^! liter entfernt. Das 17 j4 Lit er-Konzentrat wurde durch i.T.7-:ioniuinhydroxid auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und [rel'riergetrocknet, v,^robei 620 g Antibiotikum 810A, d. h. ein Gemisch, bestehend im wesentlichen aus 7ß-(D-5-Amiηο-5-c a-vboxyvnleraiui Uo)-^C a-nethoxy-p-sulf ooxy cinnamoyloxyinethyl)-7-iaet}io:-:y-J-ceplien-4-carbonsäure und 7ß-(I»-5-Amino-5-carbc::,vval erar^ido )- 5- ( a-niethoxy-p-hydro:-cy cinnainoyloxjrlaoth.;/!)-7-methoxy-J-cöpheat-4-carbonsäure erhalten wurde. läeses trockene rrodul-cc hatte eine Wirksamkeit auf Grund der biclc-giGchon Untersuchung von 520 scg/ml für eine

25 i:ni-Zone.

Stufe b: 7ß- (D-5-Anino-5-carboxyvaleraxido )-3- (α-metiioi";-4-carbonsäure

Ei.Ti(j Chromatographie-Kolonne von 2,5 cm Durchmesser wurde auf eine Betthöiie von 100 cm mit DJSAE Sephadex A-25 Anionenaustf-uschliarz in einera ö,5 m- Amiaoniumbromid und C,ü5 ;■;-Kgsigcluire enthaltenen bystera gepackt. Das in

- 119 109839/1836 .

BAD ORIGINAL

Stufe D erhaltene Gemisch des Antibiotikums 810A (10,0 g) wurde in 18 ml einer Lösung aus 0,5 m-Amraoniumbror.iid und 0,05 m-Essigsäure gelöst und in die Kolonne eingebracht. Die Eluierlösung wurde durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von 81 ml/h gepumpt, und es wurden.· 10 ml Fraktionen des Eluats maschinell gesammelt. Der Eluatstrom wurde durch ein Differential-liefraktometer überwacht. Die Refraktometer-Aufzeichnung zeigte Massenpeaks bei den Röhren I9, 36, 79, IO9 und 206. Scheiben-Platteriversuche gegen Proteus vulgaris (IIB-83S) wurden bei jeder dritten Fraktion unter Verwendung von bei pH 7?t) gepufferten 13 mm.-Scheiben durchgeführt. Die Zonendurchr-ie&ser sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: (Die Fraktionen 1 bis 66 ergaben auf Grund der Untersuchung Null).

Fraktion	Zonen	Fraktion	Zonen	Fraktion	Zonen-
	durch		dur ch-		durch-
	messer		messer		mes β er
69	- 18 mm	122	29	204	40 +
72	24	125	28	207	40 +
T?	26	128	27	210	40 +
78	51	131	26	213	40 +
81		124 .	24	216	40 +
83	35	137	21	219	40
86	37	140	20	222	38
89--	38	150	18	225	35
92	38	160	20	223	32
95	40 +	170	29	23I	31
98 ■	40 +	180	35	234	27
101	40 +	183	38	237	24
104	40 +	186	40	240	23
107	40 +	189	40 +	243	19
110	40 +	192	. 40 +	246	17
113	40	195	40 +	249	0
116	38	198	40 +	252	0
119	33	201	40 +

Die Fraktionen 80 bis 133 wurden kombiniert und die Frak tionen I70 bis 230 wurden kombiniert.

- 120 109839/1836

AJL 4

Eine Wiederholung des obigen Versuchs erfolgte,.und die Fraktionen 82 bis 130 wurden kombiniert und die Fraktionen 1SO bis 234 wurden kombiniert.

Die die erste aktive Komponente enthaltenden Fraktionen aus den obigen Versuchen wurden kombiniert und an ein 100 ml-Bett aus Amberlite XAD-2 Harz adsorbiert. Das Bett wurde mit 1 Volumen Wasser gewaschen und dann mit 3 Volumen einer 9OJkLgen Lösung aus Methanol und Wasser eluiert. Das Methanol wurde durch Verdampfen im Vakuum entfernt, und das wässrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 810 mg eines Produktes erhalten wurden, das als 7ß-(D-5-Amino-5-carboxy- · valeramido)-3-(oc-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure identifiziert wurde. Die biologische Wirksamkeit dieses Produktes, bestimmt nach der Scheiben-Plattenuntersuchungsmethode gegen Proteus vulgaris ' betrug 18 yig/ml und ergab eine 25 mm-Zone. Analyse auf Grund von Ultraviolett-Adsorption ergab die folgenden charakteristischen Daten:

UV-Adsorption in 0,1 n-HCl } nax 305 E^_cm 524 UV-Ads orp ti on in 0,1 n-Na0H^max 328 E^_cm 564

Stufe ff: 7ß-(D-5~^ino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy p-sulfoxycinnamoyloxymethyl)~7-methoxy-3-cephem 4-carbonsäure

Die Fraktionen aus den beiden Versuchen auf Sephadex A-25, welche die zweite aktive Komponente enthielten, wurden vereinigt und an ein 100 ml-Bett von Amberlite XAD-2 Harz adsorbiert. Das Bett wurde mit 1 Volumen V/asser gewaschen und dann mit 3 Volumen einer 90/&Lgen Lösung aus Methanol und Wasser eluiert. Die angereicherten Eluate wurden kombiniert, und das Methanol wurd durch Verdampfen im Vakuum entfernt.' Das wässrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet und ergab 720 mg '/ti-(D-5-Amino~5-carboxyvaleramido)-3·-(α-methoxy-p-

- 121 109839/1836

sulfooxycinnanioyloxyiiiethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carborxsäure (Ic). Analyse auf Grund von Ultraviolett-Absorption ergab die folgenden Kenndaten:

UV-Adsorption in 0,1 n-HCl ,\ max 287 mm E^ 432 UV-Adsorption in 0,1 n-iiaOH Λ max 280 mm S?? 432

Beispiel 6

Abtrennung der 7ß-(D-5-Aiiiino-5-carboxyvaleraruido)-3-(a-

me thoxy-p- s ul f ο oxy cinnamoy loxyai ethyl) - 7-me thoxy- 3- c ephem-4-

carbonsäure aus dem Antibiotikumgesisch 810A

Das 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(cc-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-i'iLethoxy-3-cephera-4-carbonsäure (Ic) und 7ß-(D-5-AmiriO-5~carboxyvaleraaido)-3-(a-methoi^7-phydroxycinnaraoyloxymethyl)-7-Hiethoxy"3-cepheia-4-carborLGäure enthaltende Antibiotikum^:episch 810A (20,0 g) aus Beispiel 5, Stufe D, wurde in 200 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung auf 3»5 eingestellt. Liese Lösung wurde durch ein 200 ml-Bett von Anberlite IEA-68 Anionenaustauschiiarz (Chloridzyklus) gegeben und anschliessend durch Zugabe von 300 ml V/asser gewaschen. Das Bett v/urde dann nit 1 Liter 1%iger (V/V) Ameisensäure in V/asser eluiert. Anschliessend wurden zwei Portionen verdünnte Chlorwasserstoffsäure (pH 0,95) zugegeben. Die Beschickungslösung, verbrauchte Lösung und Waschlösung und Eluate 1, 2 und 3 wurden durch Papier-Elektrophorese bei pH 4,0, durchgeführt während 1 Stunde bei 1000 Volt Gleichstrom, analysiert. Bas Papierchromatogramm wurde getrocknet, gegen Ammoniakdampf ausgesetzt u.m die Säure zu neutralisieren und auf einer ITähragar-Platte, die mit Proteus vulgaris (KB-838) beimpft war, inkubiert. Die überprüfung nach 17stündiger Inkubierung bei 37° C zeigte zwei Inhibierungsaonen in dem Bes hickungsmaterial (in der Richtung der Anode), lediglich eine Einselkoniponorito

- 122 109839/1836

(die langcinaere der beiden) in der verbrauchten Lösung und den A.'-ieisejjLGilure-riluaten und eine Einzelkomponente in dem zweiten Chlom-rasserstoff_.?;äureeluat, das der schnelleren Komponente in der Beschickung entsprach. Die folgende Tabelle zeigt den Gesanitfeststoff und die biologischen Versuchsdaten:

Masse Volumen Gesamte biologische Produkt(e)

Einheiten

Beschickung Verbrπuchte LOf-UIi₁": und

20

ι J. ο s uii iv 11,15 S

Aneiöonsö.ureeluat

Ersten ChlorwasserstoffsUui'eeJ.unt

Zv:oil-cε Ghlor-was£-v τ"?;"!;■ of Γ-säurscluat

200 ml 60 000 Einheiten

500 ml 7 500 "

4,52 g 1000 ml 20 000 "

500 ml 1 000 "

Ia und Ib

Ib Ib

2,10 g 500 ml 10 000

la

Diese Fraktionen wurden durch Adsorption an Amberlite ZA.B-2 Harz cevionnen, u^. 7'L-(B-5-A]nino-5-carboxy\^TaIeranido)-3-( a-ru c-:t]ioxy-p- suif ooxy ciimanoy 102-ym ethyl) - 7-in. ethoxy- 3- c epheni-4-cai"-bor.säure (Ic) abzutrennen, und diese wurde durch eine 50?uige Lösung \^?on liotliar.ol und Wasser eluiert, wobei im wesentlichen reines Produkt (Ic) erhalten wurde.

B e i s ν i e 1 £

Ab tr en^!i ung von 7-S (D- 5-Ami no- 5- c arb oxyval er aiii do ) - 5- ( α-π ethoxy ρ- sulf oo>:yciBz:3n;oylc3::;^T:;. o thy l)-7-^r'iethoxy-5-ccph.eai-4~ carbonsäure aus ce:n A:iti"bict;iku:u SIOA

Das antibiotisclie 81OA-Genisch aus 7ß-(D-5-Ai.iino-5-carboxyval eraai do ) - J- (α-aetlioxy-p- sul f ooxy cinnamoy 1 o^yiaethy 1) -7-metho^₁--3-ceene.u-4-carbonsäure (Ic) und 7ß-(D-5-Amino-5-carbox7^^roierani do )-5-(uL-iaethoxy-p-hj^Tdroxycinnainoylo3^nTi ethyl )-

- 123 109839/1836

14-505 . 210985

42*

~7-i2ethoxy-5-c.ephem-4-carboiisuu.r-e (5?O g) > das nach Beispiel 5? ktufe Ii, erhalten v/urde, wurde in 20 ml einer 20/oigen Lösung aus Aceton und Wasser gelöst und dt r· pH-Wert auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung vrurde auf ein Bett aun Anberlitc ZAD-2 Adsoroens voji 5 ^^m ivurciriCBser· χ 100 cjb. Höhe in 20/iiger Aceton- und V/aGserlÖGu:;£ gegeben.. Eine Löcurig aus 20 % Aceton und Wage-er wurde durch O.-^r-c Bett mit einer Geßohv.'indigkeit von 880 ral/h gopunipt, und 20 ml-Praktionen v;ux'ücn autoinatiecii gena^

Schcdben-Plattonuntersuchungen gegen Proteus vulgaric (MB-838) vmrden. "bei jeder dritten fraktion ujrGcr Vcrv/enduixg von 6s.ni-ijchei"bcn durchgeführt. Die Zonendurcl'üTiecser sind in der folgenden Tabelle aufgeführt;

1098 3 S /1836

BAD ORIGINAL

14305

Frakti or.	Zonen— J	hcr.ktior	Zonen-	Fraktion	Zonen
	durchmesser		durchmesser		durchmesser
1-41	0	131	0	221	18
44	12 ram	134	0	224	18
47	22	137	0	227	18
50	25	140	8	23Ö	17
53	2'i	14$	11	233	17
56	31	1-46	13	236	15
59	35	149	13	239	15
62	50	152	15	242	15
65	28	155	15	245	15
68	27	158	16	248	14
71	25	161	17	251	14
74	24	164	18	254	14
Ti	21	167	17	257	13
80	20	170.	18	260	13 ·
83	19	,173	20	263	12
66	16	176	21	266	12
89	14	179	21	269	12
O1O	13	182	21	272	11
95	13	185	21	275	11
98	13	188	22	278	10
101	13	191	23	281	10
104	14	194	2$	284	9
107	13	197	23	287	8
110	13	200	22	290	0
113	11	203	24	293 ·	0
116	10	206	24	296	0
119	9	209	24	299	0
122	8	212	24	302	0
125	8	215	24
128	8	218	19	330	0

Lie Fraktionen 44 bis 90 wurden vereinigt, Aceton wurde durch At'6'amp fen in V&kuurn entfernt < und das vc.ssrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 3?3 S rohe 7-&-(ß-5-A-iino-5-c arboxy vü^sl erani do ) - 3- (ct-:a etlioiry-p- s ul f ooxy cinna:noy 1-ϋΧ7πιοΐ1^⁷.ΐ)-7-Γ·ι6ΐ^οζ7,^τ-3-θ6ρίαβ·ίΐ-4-carbonsäure (Ic) erhalcen \«mrcien.

jjxe I''rr;2itionGB 150 bis 225 wurden vereinigt und ergaben bei f.;hr:Iiehe::· Behandlung 7OO rag 7ß~(-ü--5--Aniino-5-carbox:yvaler-

- 125 109838/183 6

BAD ORIGINAL

42b

Eine Wiederholung des obi gen Versuchs ex-gab 3,1 E rohe

cxycirmanioyloxyinefch3/l)-7-:iethcx3^T--3-ceph£;2-^—cai-L-oiisiiure (ic) und 4-00 mg 7ß-(^-5-"^sl"'-no-5-carbo::yvalera7.iido)-3-(a--Ket;rio:iyp-hydroxycinnamo7loii3^aothyl)-7-i'iOoh.oxy->-"&plic-a-ⁱ{—carbonsäure.

Die beiden !!engen an

4-carbonsäure (Ic), die nach, der vorangehenden Xethode erhalten wurden, wurden vereinigt, und die 6,^J! g Haterial v;urden in ein Bett aus Ar₁Tb erlite ZAD-2 Aisorfoens von 5 cn Durchmesser χ 100 era Höhe in einer 5^iG^en I-'Jcur jr aus Kothanoi und V/csser eingebracht. Eine 5^'-C-- Methanol- an-Ί V/csserlösung wurde durch das Bett rait einer lliessgericliv.'indi^lcoit von 880 ml/h gepuript und 20 ml Prakbios.cn i.":;r-dcn autc;.io.tiach gesammelt. 287 Fraktionen wurden ^rcsariiraelt, uiid _t1ede vierte I'raktion wurde nach der- Laheiben-riatten^vthodo ^j&rcen Protcj'-". vulgaric (riB-838) unter "verwendur.g vcn 6 irü »icjjsibon untersucht. Die Uiitersuchungsergebnisse sind in cer folgc-ndcn Q'abelle aufgeführt. Die Fraktionen 1 biß 50 murder, rieht untersucht.

JB'r akti on	Zonengrösse	Fraktion	Zonerg:
51	23 ii'ilü	115	20
55	26	119	20
59	23	123	19
63	18	127	Λ -J J S-J
67	12 .	131	19
71	0	155	16
75	0	139	17
79	0	143	15
83	7	147	16
87	9	151	15
91	13	155	15
95	19	159	11
99	21	1b3	q
103	22	167	0
107	22	171	0
111	21	287	O

- 126 -

109839/1836

«AD ORIöiNAL

Die I'x'alLtioTicJ-j 95 t>is 159 wurden vereinigt, Methanol wurde im Vacuum abrodaripft, und das wässrige Konsentrat wurde gefri eingetrocknet, wobei 700 mg 7ß-(D-5~^ⁱ'^r:i-^rxO~5~carboxyvai (-•raL'iido)-;-3-(a-metho>~>^r-p-sulfooxycinncaToylo2C3,TJoi;hyl)-7-iaethc'xy-J-ccpheri—^-carb-onsäure (Ic) erhalt&n wurden. Das Ultraviolett-iSpelitrum von 7ß-(ü-5~Amino-5-ca??bo:-ryvaler~ ami Uo)-J- (a-!,iei-ho::y-p-sulfoo::ycinj.anoylo;vy;r: ethyl )-7-™iethoxy-3-crpbein-4-carbonsäure (Ic) ergab die folgenden Adsorptionsdateri:

UV-A:".,norption in 0,1 ii-HCl ,7m->: 285 r^ 160 UV-Ac:sorption in 0,1 n-KaOH |::ax 277 ^_Ρ~ ^^&δ

J3ci Uj;terr.:ichUi!r: mit 1J ir-ja-bchei-bcn -räch c or Lchoit&n-Plattcji^othode {ζγ:£;λ:ώ. Proteus vulg^ris ex"£;at die 7ß~C^-^I3-Ar.ino- ^l)~ c ar :.;co:y va J. er; 'ini do ) - J- ( α-κι e thoi:y~p- guI Γ ο oxy cd nna:;.oy loxymethyl)-7-sicthox;v-5-cepl"ieai-4-carbonsäure (Ic)-i-roue eine 25 r.ii-Zone bei 88 ncg/nl und 7^-(2-5-Ar-iiriO-5-c

3-cepliL"i-'4-eai"bor:säure ergab eine 25 ra-Zone bei 167 mcg/r.l E e i β t> i e 1 8
AntibJotiku- V \2k

St t; Γc A; £>chii t r ellzo 1 b en-Prο aul: ti on

'£±n lyophilisiert.es Höhrchen mit Streptoruycec lactar.;duran& Kultur (rlA-£90c>) vrux^de aseptisch {reöf2?net. !Das rcoh.reh.en v;urde danr. sum ieir.pfen eines nit ünterteilunperi versehenen 250 r:l-ürleimeyer-Iiclbens verwendet, der 50 ml ITrüirmediurii V enthielt, inäer. das Röhrchen in steriler Gaze zerbrochen vjurde und der Klumpen aseptisch in den Kolben überführt wurde. Pas Heciun V besass die folgende Zusairinensetzung-

- 127 -

109839/1836

BAD OBiQiNAL

14-305

Medium V:

Hefe-Autolysat (Ardamin) Glucose *Phosphatpuffer MgSO,. ·7Η_ο0 Destilliertes V/asser pH 6,5 *"Phosphatpuffer-: KH₂PO₄

Destilliertes V/asser

10,0 s 10,0 g 2,0 ml 0,05 g 1000,0 ml

91,0 g

95,0 g

1000,0 ml

Dieser Keimkolben wurde bei 28° C auf einen Ro tat! ons schüttler "bei 220 Up in mit einem Hub von 5 cm 3 '-Page geschüttelt. Aliquote H eng en von 5 ml (10 °/o Inoculum) dieses Y/uchses vmrden dann unter Vervendung steriler lipetten in vier Keirakolben der zweiten Stufe von der gleichen Grosse überbracht, .v.^Telche das gleiche Medium wie vorstehend beschrieben enthielten, und diese Kolben wurden dann in der oben angegebenen V/eise geschüttelt. Die Keir.ikolben der zweiten Stufe vmrden dann in einen Kolben aseptisch zusammengegeben und zur Beimpfung von 11 mit Unterteilungen versehenen 2 Liter-Erlenmeyer-Eolben, die Jeweils 350 ml Medium IX mit 2 bis 3 % Inoculum enthielten, unter Verwendung sterilei¹ Pipetten beimpft. Das Medium IZ hatte die folgende Zusammensetzung:

Medium IX;

AiPber-Hefe Hr. 3OO Lösliche Brauereirückstände Dextrose

Destilliertes Wasser pH 7,0.

10,0 g 20,0 g 10,0 g 1000,0 ml

Die Produktionskolben vmrden dann bei 28° C auf einem Schüttler bei 14-5 Upra mit einem Hub von 5. cm 4- Tage geschüttelt. Nach Beendigung des InkubierungsZeitraums wurde der Inhalt von 10 derartigen Kolben vereinigt, und eine Probe

109839/1836

wurde zur Entfernung des Hycels zentrifugiert.

Das Vorhand ens ein des Antibiotikums 84-2A, d. h. des Produktes 7ß-(^-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbaaioyloxy- " methyl)~7-methoxy-3-cephe!n-4-carbonsäure (Ib) in der Brühe wurde durch Agar-Diffusionsversuche bestimmt, die mit 13 mm-Filterpapierscheiben durchgeführt wurden, welche in der Brühe getränkt wurden" und auf die Überfläche der Versuchsplatten gebracht würden, die 10 ml Medium aus Nähragar (Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) enthielten, und mit dem Bakterieninoculum geimpft war. Die Inhibierungszonen wurden nach Übernaclit-Inkubierung bei 28° C in mm gemessen. Die Untersuchungen der nach 4tägiger ü'erm ent ation gesammelten Brühe zeigte eine Inhibierungszone von 31,5 mm Durchmesser auf mit Vibrio percolans (MB-1272) beimpften Platten.

Stufe B: Adsorption an ein Anionenaustauschharz

Die filtrierte Brühe wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 7»0 eingestellt, und 2900 ml wurden auf 100 ml eines stark-basischen Anionenaustauschharzes mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix (Dowex 1x2 Harz, Chloridzyklus) bei 10 ml/min, adsorbiert. Die verbrauchte Lösung wurde in 500 ml-ffraktionen gesammelt. Die Harzkolonne wurde mit Wasser gewaschen und mit 3%igem UH^Cl in 90%igem Methanol eluiert. Das Eluat wurde in 100 ml-Fraktionen gesammelt.

Scheiben-Plattenversuche gegen Vibrio percolans (MB-1272) wurden bei sämtlichen Fraktionen durchgeführt; die Zonendurchmesser sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

- 129 -

109839/183 6

Filtrierte Brühe Yerbrauclrfce !fraktion JSlunt^rakfion

Verdünnung	^oneii- l'raictxon	1.	ZiOIi en-	jiraKtiiou i	1.	aoLeii-
	grösse	2.	grösse	£	2.	"1T1H c: 0 Λ _>X W O J^i V-·
keine	26,5 ram	3-	0	3.	25
1 : 2	24	4.	16	4.	29
1 : 4	20	5.	23	5-	29
		6.	25	6.	26,5
			27	7.	22
			27	8-10.	18
			15
			0

Diese Versuche zeigen, dass etwa 60 % der Wirksamkeit in der verbrauchten Fraktion und etwa 18 /» in den Eluaten vorliegen. Ferner zeigen sie ari, dass die Harzkapazität lediglich zwei Fraktionen oder 10 Säulenvolunen Brühe beträgt. Die Eluat-· fraktionen 1 bis 4 wurden kombiniert und unter Entfernen des Methanols konzentriert. Die verbrauchten Fraktionen 3 bis 6 wurden unter Erzielung von 1960 ml Lösung kombiniert. Ein 1860 ml-Anteil der Lösung wurde mit verdünntem Natriumhydroxid von pH 7»2 auf 8,0 eingestellt und an ein stark-basisches Anionenaustauschharz mit einer Styrol-Divinylbenzol-Hatrix (Dowex 1x2 Harz, Chloridzyklus) bei 14 nil/min. adsorbiert. Die verbrauchte Lösung wurde in vier gleichen Fraktionen gesammelt, und Versuche ergaben, das 5 % der Wirksamkeit vorlag. Die Kolonne wurde mit V/asser gewaschen und mit 5%ig^e31> wässrigen Uatriuiachlorid eluiert. Das Eluat wurde in 50 ml-Fraktionen gesammelt und untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass 90 % der Wirksamkeit in den Schnitten 3 bis 16 vorlag, so diese kombiniert wurden.

Stufe Ci Adsorption an ein Kation enaustauschharz

Ein 50 ml-Anteil eines gemäss Stufe B hergestellten Konzentrats, wurde auf 5OO ml verdünnt, der pH-Wert von 8,8 auf pH 2,0 mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure eingestellt und an 25 ml eines stark-sauren Kationenaustauschharzes vom Sulfonat-Typ mit einer Styrol-Idvinylbenzol-Matrix (Dowex 50

- 130 109839/1836

1*505 . .

χ 2 Harz, Wasserstoffz;/klus) bei 2,5 ml/min, adsorbiert. Die Kolonne wurde mit 25 κ.1 Wasser gewaschen, dann mit 2JkLgem Pyridin eluiert, bis der pH-Wert des Kolonnenauslaufs auf pH 7 anstieg (54 ml). Untersuchungen der verbrauchten Fraktion und des Eluats »zeigten 9 /^ der Wirksamkeit in der verbrauchten !Fraktion und 90 °/o im Eluat an. Das Eluat wurde als das Pyrldiniumsalz des Antibiotikums 842A identifiziert.

Dor; 84 2A--Produkt ist amphoter mit einem scheinbaren isoelektrischen Punkt bei etwa pH-3,5· Das Produkt ist oberhalb pH 7 instabil, jedoch bei pH 1,5 stabil. Das so erhaltene EIu:: t wurde auf pH 8,0 mit verdünntem !Natriumhydroxid eingestellt und unter.Vakuum sur Entfernung des Pyridins konzentriert. Das co erhaltene Produkt wurde als das liononatriumsalz des Antibiotikums, 842A identifiziert. Das Ko lekul ar gewicht beiträgt 4-68, bezogen auf die empirische Formel.

Analyse für C₁₆H₂₁H₄UU₀ITa:

ber.: C 41,0*>; H 4,5%; N 12,0 #· S 6,8;

0 30,8js>s ITa 4,9;ό

gef. : C 39,5^5 H 4,76^5 Ή 11,16^; S 6,46^;

0 34,12>α; ITa 4,19%.

Bei in vitro Untersuchungen inhibierte dieses Produkt, d. h. das Antibiotikum 842A, das Wachstum der folgenden, gramnegativen Bakterien: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Alcaligenes faecalis, Brucella bronchiseptica, Salmonella gallinarum, Vibrio percolans und Iianthoiaonas vesicatoria. Das I-2"odukt inliibiert auch das Wachstum der folgenden grampositiven Bakterien: Staphylococcus aureus, Sarcina lutea und Bacillus subtilis.

Auch bei in vivo Untersuchungen in Mäusen ergab das Antibiotikum 842-A. die folgenden V/irksamkeiten. Die Verabreichung erfolgte durch subkutane Injektion. Kach Beendigung des Test-

109839/1836

432,

Zeitraums, gewöhnlich 7 Tage nach Verabreichung, wurde die Menge des Produktes, die erforderlich war, um 50 % eier Mäuse vor der sonst tödlichen Injektion zu schützen (ED_nQ), berechnet:

EDj-_n auf subkutanem Wege

χ zwei Dosierungen

Proteus vulgaris Proteus mirabilis ¹ Proteus morganii 3202 Salmonella schottmuelleri IClebsiella pneuinoniae AD Klebsiella pneumoniae B Paracolobactrura arizoniae Escherichia coli Aerobacter aerogenes Pasteurella multocida Salmonella typhosa Diplococcus pneumoniae E400

276
276/Ug 103 /ig 125/G 125 ^E

125/ie 200 'ug

49 ^g

57 /B

34 UG

566 ng

* Cephaloridin und Cephalothin versagten hinsichtlich des Schutzes bei 4000 mg χ 2 Dosierungen

Ausser den vorstehend erwähnten in vivo Untersuchungen des Produktes wurde ein klinisches Isolat von Proteus norganii 356, das gegenüber Cephalosporine resistent ist und Cephalosporin C abbauen kann, in einem Häuse-Schutztest verwendet, der in der gleichen Weise wie oben angegeben, durchgeführt wurde. Die EDj-Q-V/erte für diese Versuche sind wie folgt:

132

1098 3 9/1836

Infektion Antibiotikum

Wege χ 2 Dosierungen

(Mittelwert von.zwei Versuchen)

Proteus morganii 356 84-2A 273 /ig

Proteus inorganic 356 Cephalothin 20 000 ug

Proteus morganii 356 Cephaloridin 9 270 .ug

Beispiel 9
Antibiotikum 842A

S chütt elkoIb cn-Prο duktion:■

Das Inoculum wurde wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt. Zwei Keimkolben der zweiten Stufe wurden ζusammer gegeben und die Brühe verwendet, um 62 250 ml-Erlenmeyer-Kolben (bei 1 ml/Kolben), die jeweils 50 ml Medium X enthielten, zu beimpfen. Das Medium X besass die folgende Zusammensetzung:

Medium Z:

Staley's 4S-Sojebohneniaehl 30,0 g

Lösliche Brauereirückstände 7>5 S

Cerelose 20,0 g

NaCl 2,5 g

CaCO₅ (nachher pH-Wert auf 7,0) 10,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

Die Kolben wurden bei 28° C auf einem Schüttler bei 220 Upm mit einem Hub von 5 cm 5 Tage geschüttelt. Nach Beendigung des Inkubationsseitraums wurde der Inhalt von 60 dieser Kolben vereinigt, und eine Probe zur Entfernung des Mycels zentrifugiert.

Das Vorhandensein des Antibiotikums 842A wurde gemäss dem

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in Beispiel 1 "beschriebenen Verfahren über Agar-Diffucionsuntersuchungen, die an 15 πιπί Eilterpapier-Versuehsscheiben durchgeführt wurden, bestimmt. ITach 4tägiger Inkubierung ergab die Untersuchung der Brühe eine Inhibierungszone von 53 inia gegen Vibrio percolans (KB-1272).

Bei s ρ i el 10

Antibiotikum 8*i-2A
Fera enta ti on:

Stufe 1: üin lyphilisiertes Köhrclien von ßtreptorayces lactamdurans Kultur (i-iÄ-2908) wurde zur Beiiapfung von 50 κιΐ cterilem Medium. V in einem unterteilten 200 ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet.

Medium V:

Hefe-Autolysat (Ardamin) 10,0 g

Glucose 10,0 g

*Phosphatpuffer 2,0 ml

MgSO₄ · 7H₂O 0,05 g

Destilliertes Wasser . 1000,0 ml

pH unter Verwendung von KaOH auf 6,5 eingestellt

*Phosphatpuffer:

KH₂PO₄ 91,0 _ß

Na₂HPO₄ 95,0 g

Destilliertes V/asser 1000,0 ial

Der beimpfte Kolben wurde auf eineniBotationsschüttler bei 220 Upm mit einem Hub von 5 era gebracht und 72 Stunden bei 28° C inkubiert.

Stufe 2: Bin Inoculum von 10,0 ml des erhaltenen, vcgeta-

_ 134 _

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t'iven Wuchses wurde dann zur B ei nip lung eines unterteilten 2 Liter-Erlenrieyer-ivolbens, der 50 ^l des oben b escliri ebenen steril! ei ex't en Iiediums V enthielt, verwendet» Der beimpfte Kolben wurde dann auf einen Hotationsschüttler bei 220 Upm gebi'acht und 48 Stunden bei 28° C inkubiert.

Stufe ⁷: Der Inhalt des Inoculuia-iLolbens wurde dann zur Beimpf ung eines 190 1 (50 gallons) rostfreien i'ermentaticnsbehälters, der 160 Liter des gleichen vorstehend beschriebenen Ilediuriö V enthielt, verwendet. Das beimpfte Kediuin wurde bei 20° C 48 Stunden unter Bewegung inkubiert, während eine Luftströmung von 85 l/min. (3 cfm) durch die Perm ent ationsbrühe "beibehalten wurde. Während des Fermentationszeitraums wurden kleine Mengen Polyglykoi 2000 zur Regelung der i'ig zugegeben.

^tufe__4: Ein Inoculum von 43 Liter des erhaltenen Wuchses wurde dann zur Beiiapfung eines 750 1 (200 gallons) i'ernentationsbehälters aus rostfreiem. Stahl verwendet, der 467 Liter eines sterilen Mediums XII der folgenden Zusammensetzung enthi elt:

Medi 1 in ,XI;

Amber-Hefe Kr. 300 _r 10,0 g

Lösliche Brauereirückstände 20,C g

Destilliertes Wasser 1000,0 m 7,0

Han Hess die Fermentation bei einer Temperatur von 28° C unter Bewegung fortschreiten, während eine Luftströmung von 280 1/nin. (10 ein) während 72 Stunden beibehalten wurde. Während der 5'ersientation wurde ein Antischaummittel, FoIyglykol 2000, in kleinen Mengen zugegeben, um übermässiges Schäumen zu verhindern. Der Ansatz wurde gewonnen und die Wirksamkeit durch Scheiben-Piattenversuche ermittelt. Die i^feriuentationsbrühe wurde dann durch Diatomeenerde bei einem

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Ai*

pH-Uert von 7?8 filtriert, und daß so erhaltene Produkt wurde als 842A nach, dein in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren identifiziert. Scheiben-Plattenversuclie einer 1 : 10-Verdünnung ergaben eine Inhibierungszone von 21,5 ^Ifim E^&S^en Vibrio percolans (MB-1272).

Beispiel 11

Reinigung, ilononatriumsalz der 7i~ amido)-5- (carbaraoyloxyiaethyl )-^r'/-iii

Adsorption an Kohle: Vier Peraentationsaucö-tze, die gemäss Beispiel 8 gewonnen wurden, wurde;, jeweils an 100 ml eines stark-basischen Anionenaustauschharzes mit einer fctyrol-Divinylbenzol-rlatrix (Dowex 1x2 Iferz, Chloridzyklua) adsorbiert und mit ifcLgem, wässrige:;: Katriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde in ^O lul-iraktionen gesammelt und untersucht. Eluatfraktiorieii von sämtlichen vier Ansätzen wurden auf pK 5 mit verdünnter ChloiT.^rai:serstol'fS'iure eingestellt und unter Erzielung von 4-500 ml Lösung vereinigt. 4-200 ral dieser .Lösung wurden mit 4-2 g Kohle (Darco G-60) 1/2 Stunde gerührt. Die Kohle wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Piltrat und die Vaschlösung zeigten keine Aktivität. Der Kohlekuchen wurde zweimal .mit einer 1 Liter-rler.ge 60/iLgcir., wässrigem Aceton eluiert, indem das Gemisch 1/2 Stunde gerührt und jeweils filtriert wurde» Die Eluate wurden unter Vaku-jr; auf 108 ml bzw. 100 ml konzentriert. Versuche zeigten, dass das erste Eluat 76 % der Aktivität enthielt, 18;:ial so v/irksam wie das Ausgangsraaterial war und dass das zweite Eluat 17 V° der Wirksamkeit enthielt und 14-r.al so wirksam wie das Ausgang smateri al war. Die beiden Konzentrate wurden voreinigt und weiter auf 61 ml konzentriert und von pH 4- auf pH 5 ^r-^;it verdünntem Hatriurahydroxid eingestellt. Dieses Konzentrat enthielt 40 mg/ml trockene Peststoffe und ergab eine 25 mm-Zone gegen HB-1272 bei einer Yerdünnurg von 1 : 100 (400 mcg/ml). Das Produkt wurde als das liononatx-iunsaiz der

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7ß-(D-5-Arnino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cepheni~4-carbonsäure (Ia) identifiziert.

Beispiel 12

Reinigung; Hononatriumsalz der 7-ß(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3~(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Adsorption an fiel: Ein 22 ral-Anteil des oben geinäss Beispiel 8, Stufe B, erhaltenen Bluats wurde mit verdünntem Natriumhydroxid auf pH 7>° eingestellt und auf einer 388 ml Biogel P-2 enthaltenden Kolonne Chromatograph!ert. Die Kolonne wurde' mit Wasser entwickelt, das ausströmende Gut mit einem Differential-Refraktometer aufgezeichnet und 5 ml Fraktionen automatisch gesammelt und biologisch untersucht. Die biologische Wirksamkeit trat in den Fraktionen 47 bis 63 auf, während Natriumchlorid in den Fraktionen 62 bis 72 auftrat. Die Fraktionen 50 bis 60 wurden zusammengegeben, wieder untersucht und zur Trockene eingeengt, wobei 10,8 mg Rückstand erhalten wurden, der als das Mononatriumsalz ' der 7ß-(^-5~ ALiino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ia) identifiziert wurde. Nach Untersuchung mit Vibrio percolans ergab dieses Produkt eine 25 mm-Zone bei-8 mcg/ml.

Beispiel 13

7ß-(D-5~Anino-^-carboxyvaleramido)~3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Modifiziertes Fermentationsverfahren: Btufe _i A: Schrägkul türen

Ein lyophilisiertes Röhrchen von Streptoniyces lactamdurans Kultur (M-2908) wurde aseptisch geöffnet und der Organismus

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AU

in ein Medium der folgenden Zusammensetzung überfuhrü:

Medium XII:

-1 % Eestmelasse

1 % Nationale Brauereihefe 2,5 % Difco-Agar pH 7,0 Wasser zur Auffüllung des Volumens

Die Schrägkulturen wurden 7 Tage bei 28° C inkubiert. Wenn sie in der Kälte gelagert wurden, waren die Schrägkulturen mehr als 13 Wochen stabil.

Stube B: Keirastufen: Zweistufiges S7/stern

Erste Keimung: Me erste Keiinkultur wird direkt aus der ßchrägkultur der Stufe A zu 40 ml 1%iger· primärer, getrocknet erliefe H.i'. , pH 7iO (von der Yeast Product Corporation erhalten) in einen unterteilten 250 ial-Erlenmeyer-Kolben eingeimpft. Die Kolben wurden dann auf einem Rotationsschüttler bei 220 Upm mit einem Hub von 5 cm bei 28° G während eines Zeitraums von 2 bis 3 Tagen geschüttelt.

Zweite Keimunp: Ein 2,5/*iges Inoculum aus der ersten Keinistufe wurde in einen Kolben gegeben, der ein 2%iges Fleischmann S-I50 Hefeautolysat, pH 7»0 enthielt. Der Wuchs in dieser Stufe ist in charakteristischer Weise hell, und die Inkubierung, die wie in der ersten Stufe erfolgte, wurde nicht über 48 Stunden ausgedehnt.

Stufe C: · Produktionsmedium

Das Produktionsmedium enthielt je Liter destilliertes Wasser: 30 g lösliche Brauereirückstände, 7?5 S Primäre, getrocknete Hefe N.i¹. und 0,25 % ^v/^v ftobilpar-S Entschäumungsmittel. Das Kedium wird mit einer geringen Kenge konzentrierter NaOH-

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Lösung auf pH 7»O eingestellt, in Erleruneyer-Kolben verteilt und 15 oiar 20 fänuten bei 121° C autoklaviert. Mach Abkühlen erhielt das Medium ein 2,5/ciges Inoculum der in Stufe B erhaltenen Keiiakultur. Die Inkubationszeit kann zwischen etwa 50 Stunden und 100 Stunden variieren, jedoch wird ein InkubationsZeitraum von etwa 72 Stunden bevorzugt. Das Volumen des Mediums in federn Kolben kann zwischen JO und 50 ml variieren, jedoch wurden routinemässig 40 ml verwendet. Das Aus-Dass an Inoculum, kann zwischen 1 bis 5 % variieren, jedoch wird in der Fx^axis im allgemeinen ein Betrag von 2,5 % verwendet.

Nach beendeter Keim entation wurden die Zellen abzentrifugiert und die LrUIie siit Phosphatpuffer, pH 7?^ verdünnt. Die lionz en tr a ti on an 7ß(D-5-^iiio-5-carboxyvaleraT.ido)-3- (carbamoyloxyiaeth7l)-7-iaethoxy-3-cephea-4--carbon.or.i ure i η der ¥ez'~ rieiLtr-tionsbrühe wurde nach der biologischen Standard-Scheiben-Untersuchungeinethods bestimmt. Der verwendete Untersuchungsorcanisraus war Vibrio percolaiic (ATCC 8461). Filterpapier scheiben werden in die verdünnten Brühen eingetaucht und auf die Oberfläche von A.gar enthalt end en Petri-Schalen gebracht, die mit der:i Versuchsorganismus Vibrio percolans (A¹TCC 8461) inokuliert worden waren. Auch wurden auf diese Petri-Schalen Scheiben gebracht, die vorher in otandardlösungen getaucht worden waren, welche bekannte Konzentrationen an 842A enthielten. Die Scheiben wurden Übernacht bei 28° C inkubiert und die Durchmesser der Inliibierungsaonen aufgezeichnet. Die Konzentration an 842A und die fermentierte Brühe werden durch Interpolieren aus der Star;dardkurve erhalten, die Zonendurchmesser mit den bekannten Konzentrationen der 842A Standardlösungen in Beziehung sets en. Ii ach diesen Verfahren wurde berechnet, dass Streptoinyces lactaradurans H3-2908 78»G Aig/ml 842A in dem inodifi ziert en i'ernentationeverfahren erzeugte.

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Beispiel 14 ή Hd^

Lina tri ums al ζ der 7-ß- ("^~ 5-^ffiino- 5- carboxy val er ami do ) - 5-(l<,II-dimet.hylcarbamoylox7/r;iethyl)-7-IHCtIiOXy-J-C ephem--4-carbonsäu2."e

fctufο ^_-; ?ß- ( D- 5-Hith.? loylamino-5- carboxyval crami do ) - J-( c arb anoy i ozyni e thy 3.) - 7-ra. e thoxy- >- c eph eru-4-carboncäure

2,005 g (4,27 lallol) 7Ir-(D-5~Aniino-5-carbo:-:yvalr;ra!:iido)-5-(carbamoylox7/metliyl)-7~iiietliory~3-ceplien-^-carl)oiieäure werden in einer Lösung aus 10bigem, wässrigem Likuliiu^aydrorr-ea·- phosphat (26 ial) gelöst. Lars Geraisch vrird dann filtriert und dor erhalten» Feststoff ait ΙΟ'/οϊ^ομ, uäcBrifjtm Ldl:aliunhydrogeripliofjpiiat (2 nl) £-;ev;anob.en.

Zu de';! FiItrat verdo:i 10 nl Aceton zu£eGr.bGn. Lie LcPjUn^ wird leicht wolkig und. bcsittt einen pli-We:-."·"!; von 8,45» ^u dieser Lösung v.'urde 50/"i^c-^f-;, Viässz'i^er. ^ri^lrikaliu:^phon:p}iat, eingestellt auf pH 9,16 2iun;ef:cben. 1,492 ΰ (C.69 m:io"'.) J'i-i.tho:^.-'-carbonylpiitii"liiuid in 5/-^; ^l Aceton vreraon o.ann über einer· Zeitraum von 5 ^i^uror zugeecuae, Ber i^il-V/ert värd duron Zu-fvobe von Anteilen 5^---iG^er;: ? wäs&ric;e^v:i 'l'riiraj.iur.p.-iorrpliat i;1 er die nächsten 1,5 .Stunäsn auf 9^1 oiri^tctellt. L'c-r; (ki-ürc^;: i;ird äonn 2,ur lintfemiinc; dee Acetons c-ir.red"."r,prt Vi.d. der τ.Γ).— V/ert mit 2,5 n-Chlorvicscerotoi'!'säure ruf 2 bi^; ?,5 c-ivjfjer-tell J)EiG G-enis2li wird mit vier \h:-_ ze hurten. :.-it Ithylaceüat (?5 -^J-) e;:.ti :-.hi ert, und di.o vc-reinicteii. blcrsreloen L:Li:rr;.l;to t-.^T erden mit £5 E-I Wasser ^Gv-:^£chen, ^r::it v/annci-froic^ i.atriorunrJ.ri:.i; übernacht getrocknet und ein^ed?Vipft., '.-roboi 2-,Vy^ r cineo gelben bchauris erhalten wurd'.-n. ϊ-err.: :·..■■ r, ο ti π el; e j-iesouariz lu. Elektrophorese bestätigen, dres das auf diene weite erhaltene Produkt 7ß-(L-5-Pht}:al07lc:nino-5-carbo^./v^lcrr"icx0-5~(carb« araoyloxynietiiyl)-7-i'iGtho:v^T-3-ocpher:i-4-carbon;:-:;ure ist.

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Stufe B; Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-Pb-thaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-metlioxy-5~cepb.em-4-carbonsäure

Eine Lösung aus 0,653 ^m5 7ß~(D-5
val er ami do ) - 3-( c arb amoy 1 o>^na. e thy 1) - 7-m ethoxy-3-c ephem-4-carbonsäure in Methanol wird mit einem geringen überschuss an frischhergestelltem Diphenyldiazomethan behandelt.· Nach Stehen übernacht bei Rauinteiaperatur wird die Lösung eingedampft; und man erhält 1,053 g Bückstand, der als der Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-Pkthaloylamino-5-carboxyvaleraBiido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-earbonsäure identifiziert wird.

Stufe G: Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5~Ph.thalQy lamina-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethy1)~7-methoxy-3-c ephem—'-l—carbonsäur e

0,5 g des in Stufe B erhaltenen Dibenzhydryiesters der 7ß-(D-5~Phthaloylamino-5-carboxyvaleraiaido)-3-(carbamoylo2cymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäui*e werden in 5 ⁿl gereinigtem Dioxan, das 1,5 Äquivalente Pyridin enthält, gelöst. Eine Lösung aus 1,3 Äquivalenten Nitrosylchlorid in Methylenchlorid wird zugegeben und die Lösung in einem Eisbad während 1 Stunde gerührt. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist eine Lösung des Dibenzhydrylesters der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-Diethoxy-3-cephein-4-carbonsäure, die direkt in der folgenden Stufe verwendet wird.

Stufe I): Dibenzhydry 1 ester der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-

5-carboxyvaleraraido)-3-(chlorcarbonyloxymethyl)-7"inetho:-ry~3--cephea-4-carbonsäure

Ein Überschuss an Phosgen v/ird in eine gerührte Lösung der in Stufe G erhaltenen 7ß-(D-5-Pli'fchaloylamirLO-5-carboxyvaler- · f₁mi do ) - 3- (hydroxyn ethyl) -7-'.ue thoxy- 3- c epb e:a-4— carbonsäur e

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eingeblasen, und man lässt das Gemisch Übernacht bei Raumtemperatur stehen. Das überschüssige Phosgen wird entfernt, indem trockener Stickstoff durch die Lösung wahrend mehrerer Stunden durchgeblasen wird. Das so erhaltene Produkt wird als der Dibenahydrylester der 7ß-(E-5-K¹khaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(chlorcarbonyloxymethyl)-7-methoxy-3-cepheiii-4~carbonsäure identifiziert.

Stufe E: Dibenzhydrylester der 7'ß~(D-5--Phtlialoylamino-5-carboxyvaleraraido)-3-(li?H~dimeth7/lcarbamo;yloxymethyl)-7-iüethoxy-3-cephea-^-carbonsäure

Der nach Stuf e D-erhaltene Dibenzhydrylester der 7-8-(^-5-Phthaloylamino-5-carboxy valeramido)-3-(chlor carbonyloirymethyl-7-niethoxy-3-cepheni-4-carbonG_! ^:J-ure wird in einem Eisbad gekühlt, und 2,5 Äquivalente Dimethylainin werden zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und das überschüssige Amin-hydrochlorid abfiltriert. Das so erhaltene Produkt wird als der Dibenzhydrylester der ^r/ß-(.l)-^~ Phthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(N,IT-öim.ethylcarbamoyloxymethyl)-7~methoxy-3-cephem-4-carbonsäure identifiziert.

Stufe ff; Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-5-csrboxyval eramido ) - 3- (N, N-dim ethylcarbaraoyloxynethj-l) -7~ methoxy-3-cephon-^zi~c&rbonsäure

Der in Stufe E erhaltene Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-5-carboxyvalerar:iido)-3-(li,IT-dimethylcarbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephera-4-carbonsäure wird in 3,5 dl Anisol gelöst und mit 10 mi Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 10 Minuten behandelt. Die ü'rifluoreasig'säure und das Anisol werden dann unter vermindertem Druck entfernt, während die Temperatur unterhalb von 40° 0 gehalten wird, und der Rückstand wird in 25 ml Chloroform aufgenommen und mit 20 ml Wasser, dae 0,120 g Hatriumbicarbonat enthält, behandelt. Das Gemisch wird 0,5 Stunden bei Raumtemperatur ge-

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14-305

rünrt und die organische Phase abgetrennt und mit Wasser gev-ar.chen. Lie kombinierte, wässrige Phase wird äann zweimal mit Methylcnchlorid gewaschen und lyophilisiert, wobei das LMnatriumεnlζ der ''/Ii-(D-^-PJithaloylamino^-cai-boryvaler-&:.·>!do)-3~(i« ,l^-air.iethylcarbaiiioyloxyiaethyl)-7-niethoxy-3-cephem t\-c.· rt cn rl" ure erhalten wird.

ptn/'o G_-: Hinatriuacals der 7^— (D-y-Amino-ß-y

ani do ) - 3- (^ i Ii-da.ir;ethylc arbancy 1 oxyn ethyl) -7 iii e thoxy- 3~ c cphe:n~}^L- c arbonsäuj¹ e

Las ii: btu^e ϊ e2?haltone Binai-riunisalü der

7-I-.C l;ho:-,.7.^r-^--cephe:.i-ⁱ';-c.'.rbon2^:Iure v;ird in V/ascex* gelöst. 1 j-c.uivricnt ilydrasinhydrat i;ird d^im. aurorebei:, und man l;'.r ■-.!:· öc.s Go:-inch bei Kaunl is'ir,eratur übcrnacht stehen. Die ν::=.;·¹ ·::■:■ ₍~g ->-öf \v. ^ v.'i^'i ^iit iitlrj lacctat vor dem Lyophilisierr'ßn e;-:ir./"·;-· ^:.wt, u";d nan erhalt c:a.· ianatrii-.^ftais der ^r ₍'ß~(D~5-AirJ rc— ^-c-'.r-boxyvalera:nido)->-(l',JT-dineG}i7lcarba"icylo3r5'n;ethTl)

i e 1

jJn - ntri'MJT.'ilz üct·· 7^-i3-5-^^ri^J1o~5-carbo:^.-v.'lera'i3 c1o)-5~ r L, cridinc :·arυο:"..7*.:.ο>ς;.':..ethyl )-7--ßtiio::y-3-ccpheui-^--carbon

7-r. r/i;r. o:c:- ^- c epho:::-A— carbon^" .ur -·ο-

Vrtcr I^rsatr: eir:a.v i:.ruiv:alcrLte:i rieiip'e i-iperidin cncteile des ÜT.'e'^-:yla~iii:3 ["eTiD.sc Eeispiel 14, Stufe E, und unter ICacL-aibc: tunr des dort beschrieb en en VerfFlireüs v.-ird somit der l-ibci:zh7'ärylestor der 7ß-(i^>-5-^-¹th.alcyla

'■}-c-rit οηε;iure erhalten.

_ λ L 7_V „

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BAD ORIGINAL

^14Ϊ05 AMH 21098 5 A

₁C₁ B_-:. DiIiο triurasal", der· ^r/P. -■■ (j.'- 5-Air.i11o~^-carbo;-,.,. v:· 1 er-

airii do ) - J- (pip cri. dir: ο c; ebony 102;v:,; ethyl) - V~^;-'^::: i-hory ·- 5-ccTilie:a-^y{—carbon "Vi¹. f/'i-;

u er Einsatz dos nach Stufe A erhalten cn JJiber..zhy aryl esters der 7ß-(D-5-W^vbhaloyliiriir;o-^-caT-":.joj'yvalcri;:"ido)-;> (piperidi·- nocarbony loxy:n ethyl) -'/-v, ethcxy-;. - c cph cm-''! - er :r'borin.^::' ure an c. t ei 1 dos in Beispiel "14, Stufe J?, an[v<-gebeten Libcη7.}C/-'·;^Γ1ο?^:tern d or V Ii ~ ( D-- 5ί-Κ ι tlia loy 1 a-:. in ο - 5™ c ar b ο xy ν a 1 ere,-. -. i do ) - Z-- (J· ·»1»'-

säure und unter liaoJiarbc-itun^: dc-r dort boychri^berie::: Knt~ veroßterungEinethode wird sorbit d-^r.a Jjiuatriu icalz d-?...-· 7^-(-^J-

} o:ry;n ethyl)-7-s etho::y- 5- c ephe:r ~>-\ - c °.r'bor. r:.üure crho 1 t on ,. das,

nach 13ehandlUi-[C mit Hydrar.inirydr·-rl gei.^cv der in -Jioinpiol 14. iStufe G, boscJ-x-iebenen re^uocle c^;as Dinatriuu'i.-ial" oor ^Γ/£>~(.ϊ:~ ^-Aininü-S-carbOy^'valcrarrjido)-^;- (}ripcridinocarbonylc::.yr; ethyl)-7~raetho2^-5-^f-eplie''a-4-carbonr-,;iuro oi'cibu.

!B e i π ρ i e 1 1G

Dinatri.unisalz; der ^r/B~(D-5-Amino-i>~cax^>bc::.yvalcrT.r:J.do)-3-(pyr r oi i diny 1 c ar D ony 1 ory rr. e thy 1) - 7 -^ etr. oxy— 5~ c ep V: cm -4- carb on-' säure

Stufe_A.£. DibenzLydrylenter der 7.7-(L-S-Pb bhal oyl a-:i-o-5-carbo::Tvalerai;.ido_/)-2~(pyrrolidir..7lca:-:-uonylo:-;ym ethyl) - 7-"ieth.oxy-· J- c ep;:¹- ci;:.-A — c ar^;b on.'.-ä ure

Unter Einsatz einer äquivalenten Henge Pyrrolidin oRctelle des Diraethylsruins ge^äcs Beispiel 14, Ltuf.c L·, und unner Nacharbeitung des dort beschriebenen Verfahrens wird somit der Dibenshydrylester der 7ß-(L-5-^ntni_;loylanino-!;--carbo:vyval er ami do ) - J- (pyr rolldiny !carbonyl o::₍-;. e bhy 1) - 7-Lie tho:cy- '$-· cephera-4-carbonsäure erhalten.

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ö_tufe_I3^ Dinatriumsa3 κ dor yß-(D-5-Arriino-5-carboxyvaleraiiiido)-5-(p,yrrolidiii7/icbltll)7th 3- c ophera—/-!— c a rbonsäur e

Unter Einsatz des nach Stufe Λ erhaltenen Dibenahydrylesters der 7ß~(O--5-PhtIialoylauiino~5-carbüxyvalci"^>amido)-3-pyriOlidinylcarbonylor,y:uothyl)-7-niethor.y-$-cepheni-4~carbonsäure anstelle den in Beispiel 14, Stufe 1·', angecebenen Dibenzhydi^lesters dor 7ß"(l⁾-i>-i⁾hthalo2'li_inijio-5-carboxyvaleraiiiido)--3-(N, Ιϊ-üimethylcarbamoyloxyiii ethyl )-7-iaethoxy-3-cophem-4-carbonsäure und unber ITachrrboitung der dort beschriebenen EntvereßtorLvagsniet.uode v/ird aora.it das Dinatriumsalz der 7-ß~(D-5-Ph ülia 1 oy 1 arai.no- 5- c arb oxy val er am i do ) - 3- (py rr oli diny 1 c arbony 1-oxyiiiethyl)~7-Taothoxy--3-ceijhei!i-4-carboneäure erhalten_} das , nach Behandlung mit Ir/dra^inhyar-at nach der in Beispiel 14, Stufe G, beschriebenen Methode das Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Amirjo-5-carboxyvalerGiiiiclo)~3-(pyrrolidinyicarbonylo5^yiaethyl)-7-Biethoxy-3~cophem-4-carbonsäure ergibt.

B e i G ρ i. e 1 1?

Dinatriurnsalz der 7ß- (i-'-^-Arnino-^- carbox3^3rvaleramido)-3-

CmoipholiriocRrbonyloxyioethyl)-7-raethoxy-3-cepheni-4-carbon-

säurc

Stufe A; Dibenzhycirclester der 7ß-(D-5-Phthaloylaiaino-5-

carbG;t7/Vc,lcraniido)--3-(iaorpholi.Docarbonyloxymethyl)-7-i>iüthox_ty-3~ccphein-^zi— carbonsäure

Unter Ersatz einer äquivalenten Menge Korpholin anstelle des Dimethylamine p:eniäss Beispiel 14, Stufe E, und unter Kacharbeitung des dort beschriebenen Verfahrens, wird somit der Dibenzliydryleator dor '~/il-(D-5-i^Jhthaloylfimino-5-carbox7/valeranido)-3-(worpliolinocr^j.rbon7/lo.-::yriLethyl)-7-riiethoxy-3-cepheiii-4-carbonsäurij erhalten.

- 145 -

109839/1836

14-305

Stufe B: Dinatriurisalz, der 7j^r-^;-(D-5-Ani57

ami do ) - J— ( ε ο it, ho 3. i.·; ο f. arc or.;/ J. ο xy:i c thy J.) - 7-·» £^:- fch ο iiy-3-c ep h evi ~ ·Ί - c a rb ο ι.: ε ? ΐ u r c

Unter Ersatz des nach Stufe A erhaltenen Dibenzhydrylouters der 7-ß- CD-5-Phthaloylam.Ko- 5-carboxyvaleramido)~3-mor .-;holinocarboiiy 1 oxy.".et.hy 1)-^r/-v.\cthe-xy-5-cephe:a-4»cατ·ΐ>oi-.ßllur·'? anstelle dec in Beispiel 1^¹I-, Stufe i', anccGeber.er. Liberiahydrylestors der 7^-(3-5-i^:hth:aloyleii.ixio-5-ci'.x-';.'Oxyvfilera_i ⁱ'i oo)

carbonsäure und unter llach^rboituriy der dort bt-'-jciirieb^rc^ Entvere3terurx{2E^vaev":.O'J-e viira somit dan Dir.atriurica.lv; aex¹

);r'^rr:iethyl)-7-rnetho:-:'^T~>-coT)hen-4~carboiL£.r.u.Te crli^li.

das, nach j3chs.nalur:g; aiit Ilydrasinhydrat nach dc:.i iii Beispiel 14, Stufe G, beschrieb on on "verfahren das liinatriunisalz der 7ß-(D-5-Amino-5~ carboxyvaleramido)-J-(norpholii ι ο c arbonyloxymethyl)-7-eethoxy-3-copheni-·'! — carbonsäure ei-rfht.

B e i s ρ i el 18

Dinatriumsalz der 7-3-(U-fJ-Anano-^-carbo^'valc??a:iido)-( ac etoxyraethy 1) -7-f- othoxy- 3~^ ephe.i-^z!· - carbonic, ur e

Stufe A; Dibenshydrylecter der 7ß-(lJ-5-Phthalcyl^!3.nino-5-carb oxy valer a::ii do ) - 3- ( ac etoxyiae thyl) -7-rae thoxy-

Ein überschuss an Acetyichlorid \tfird unter Hüha^en zu den in Beispiel 14·, Stufe C, erhaltenen Dibenahydryloster dex'

Kiethyl)-7~i7iethoxy-3-cephera-4-carboEBäui^ve zubegeben. Ilan lässt das Gemisch mehrere Stunden bei iiauiatcnperatur ste)ien Das Gemisch wird dann im Vakuum konzentriert, an überschüssiges Acetylchlcrid und Lösuitcsinittel zu entfernen. Der ;:o erhaltene Eückstand ist der Dibenshydrylecter der 7-^i-(^j"'~?~

- 146 -

109839/1836

BAD OBiGtNAl.

ϊ-h tr, -.1 ογ 1 "·:;ιζ Jio- 5~c arboxy val or ar iido ) - J- ( ac etorsyi iethyl) -7-ΐ:ΐϋι.ηο;:;7-;.-ο^'"ί:ο·ΐ:ί-''ί—c?:3'bon.Gt;ure.

box· Libcx:::r7,'cl.:?yloctcr der 7£-0)-i?-Hithaloyla:iiiiio-5-carbor,y-

cäure kam¹ auch durch Einsatz von Keton anstelle von Aeetyl ohlorio" und ini übrigen unter L'α einarbeitung des in Stufe A ViOr-CrLi¹IOi)OnCJ-' Verfahrens erhalten werden.

i-L·.!¹ "ϊλ-Ji¹ vi-"" ^J--.ri.ir:r.al:: der 7ß-('^--!3-i"¹hth.aloyla,r.ino-5~C''"-rbo;v λ a ] (.-..: τ.*·:ί cio ) -- 'j- (. ac e t ο;:;·,'':ΐ e thy 1) - 7 -m e th.ox;,⁷~ ''J-Q, eph cd Ab^:"

i-'c-T? :irj otui'c A erhalt one Dibensbydrvlenter der 7ß-oy^-'-vi/iC-^-oarbo^yvalcir^/iiflo)-^

cet^u:::i—/:-c:.3:bo;is^ure \;ira in l)io:ran f_t^flJ-öst, und das üer;ii.,:.ch νπ τύ der ir J-oir;piel Ί^;Ι-, btufe J¹', bcrcliriebeneri Jintop.terur.ce-7:iei.hc:,.O uiito.Vw'ori'eii. Auf dieco V/c-Imc wird ein ia'ickctand er-]iai;,e::, der dar. Linatriuaralr: der 7ß-(E-5-i'i-thalcyl'-.rii]".o-5-c£:r:·L;::i.yvalor·-·".j.do)-ί·- (aceto;;:yi.ict3:y 1)-7-nio tlio::y-Z— cei^he^i-^!- ciirV-oiicäure r.ui'v;oist.

§-t:lL'."iL.5i_ I-'ir: tri uncals dor 7ß-(^7.^t3-A:.d.rc-^-c£-.rbo::yvalera:;iioo)-J-( ac et οζγϊ.λ ethyl )-7-netIio::y~5-c e:phtr;;-^— c ar roiic"". u^e -----

Das in Gtufe B erhaltene Biiiatriunsals der 7^"(-^iJ-5--ⁱ-'--^"¹-sloyiaiuir o~ 5-corboxy val eraiuido )- 5- ( ac etcoiymeth;; Ί ) -7-"i6 tho^y-J-cer-hen-¹'.—carbonsäure wird in iiethylenchlorid gelöst und die 10.1'U-Vi-^ Liit 5;uiger I\atriunibicarbonatlösunr: extrahiert. Das erhaltene Gemisch wird dann- mit i3chv.^ref ölsäure auf pH 2 angesäuert "und nit J'lthylace tat extrahiert. Kach Trocknen, wird der Extrakt im Vakuum konzentriert und der Rückstand in Wasser gelöst. 1 äquivalent Hydrazinhydrat wird dann zugegeben, und nan lässt das Gemisch übernaeht bei Eausiteinperatur stehen. Die wässrige Lösung wird nit iithylacetat vor dem

1098 39/1836

BAD ORIGINAL

Lyophilisieren extrahiert, und man erhalt das liiina

der 7ß- ( ti " 5~Amino-5- carboxyva 1 er^{; ir}<ddo ) - 3~ ( a ο e tor.yrn ethyl) -7~

m e tlioxy- 3- c cph eifl-4- ccrb onsä ure .

In. {gleicher V/^ico wie der in Beispiel -'1C beschriebonen könne sän11 iohe *-■£c,y 1 ο:ry~gut.-ntituieri;en 1)eriν■ ν.e der Erfiηdtu.:{ν erhalten Vicrd.cn. So kenn cn "bei:;;;>iele^eir:c durcli i'rjnc.atz den ent r;p r ο ch en d en A c _ty 1ha 1 ο [: en ids c \ > c, t e 11 ο el c. ε A c e ty 1 e"u. 1 οri dε ßc-Til"on Bei ppi öl 18, Otufe A, una uirter L'.'.chnphei tur.'y des in den stufen A, B und C dieses Beispiels l;ef;chri eb er γϊι Verfahrens Eömtlicho entsprechender.! >".-'.iliano;;lo2.7- ·> 5-Aruriatir-chcarTjonvloxy-^ >-Aralk:-i:ioylcx,y- α:.ι>-; J-C-c] c-!'.liiiuicKrhori^loXysulxstituiertcn Derivate der Kivlnäun·; trL^lter. v/erdcai. Lie fol^er.ae Gleichung ur,.d 'Ja^ellc 1 v'Ill c^li-nteavi di cnea Verfahren und die dabei erhaltenen Produkte.

1 0 9 c .. .- / i 8 3 6

_BAD

-CH-(CH₀;

ι "

O=C

f»3 „

ν Λ

COOClI>«i-

.CIIOOC-CII-

O=C

ο e^cii3

) ,,-CHH—\-S

COOCH.

CF₃COOH

QCH₃

-CH-(CII₀)-,-CNIl

O=C.

COONa NH₂NH₃H₂O

NaHCO-

Il

NaoOC-CH-(CH₂)₃-CNH- h

Dl

O¹ cH₀OCR¹⁹

COON a

- 149 -

109839/1836

ORIGINAL INSPECTED

Beispiel
19

X
Cl

xyjIi

~^C2^H5

20 Br

21 Cl

22 Br

-CH:

23 Cl

-CH:

24 Cl

25 Cl

26 Cl

27 Br

- 150 -

109833/1836

4S4

c. i :: τ- -j e 1 28

L-:";.t.id L-:r;al7, der 7^J--~

P^/ilJLi. -iibf/ns^yclryJ este:\ der 7β-(·^--5-'^ΐ1'<--θ;7ΐαπι1υο--^-

li])(itlbit]

■.-.r.Q _r..„ ,}_o,. Di-ben.r;li;,-c1i7/loatorfj der 7^--(ΰ-5-^1;ίί^1θ7ΐ3::ιχ:ϋο»-5-· ί·.Γ:ι·. o::y-,·.· IcraMiao)-i>-(l:^dro;:;.methyl )--7-^Gtho:;y-p-cei)ii.or;·- ^/l.-c:\F~UG~rii:.l'.\ive ν/οΐ'άόη in 5 ^]r-- i'-'iif-etliyiroj'rnai.iid sUbpeiudi^rt. kic iceal.i.ioJir^err.ir.'Oi v/ird ur:ler oticusGOif {yc-lM-acht uud durch bli ■- "caaj.lv:olion lnv-v^regt. 0,20 v.l. !Triiithylaiiiiu ur..d C,625 J-I iit.-^i.rlif.ojyiii::.!' vcidon darm auccre'üe::, und rjach J.v.fIc£:ujjq· dos Gc-iccho 1;1;;gu .Ίαη c^a 0,5 Ktiixden stehen.

"JIt^yIiIti:!-τ wird zu dc-:i Geraisch zugegeben, und nach Zeritrii'urierer> wird der J-tliei¹ dekantiert. Zinc zusätzliche Hen^e i'%tLA lclbher wird zu dea öligen Rückstand sugercbev;, und die Yer.■?'':■£vi£ung den Produktes v.^rird durch Kratzen oeröx*dert. 13c;r crhrJ i;one iei:tstoiT viird aus eino::i heiosen Gordisch aus iietlia::Cil u;id Isopropoüol (180 ng) in ::;-.·ei Ausbeuten uinkristallii-ierb, ur.d die Kombination cicr.cx* "beidexi --UGbeuten vrerc'c:i v:iecrru:r. u^^ristallisiex-t, un ein Produ3:t i:u erhalten. a^r als der 'Dil-cnnhyärylooter der 7-ß-(·;--■ 5-^"^haloyla.-inc— ^lj-·

2-eop::c::i-^--carbo22ci/.ure ic"e^tifiriert wurde.

vil er ^r\';- i c c ) -'}- {Γ.-' \:- thy 1" ::.ΐ"·ΐ- ν :.C7*1 o::y.:: ethyl) -']-κ o'Gho^-y- p-c eplieri—'r—c ar b ν::.^ϊ ure

Der ir- Stare A erhaltene DibensLydryleHter der ?il-\ij-y-

lose;:/1836

2103854

methyl)~7-T.iεtlioxy-4; -c ephe.;i---'; — ca.rbon -^:' urc v.'ir d i η j>, 5 i··-1 Anisol gelöst und rut 10 ml Tj :i .Quo:?·'.-,-vifj.;::Aure bei Iiourctemperatur 10 Hinutun beh.aiio.el I, Die 'Vriiluoror::. ifräure und das Anisol werden dann unter ve;:^;:iii3df-:^!i1":c;n JJ:rucln i,^riti'ei'nt_} VfJhrGiid die Temperatur unLcrh^lb voü '.(j° C geL?.i ί;ο:ο. v.'ira, U]₁Ci der-Hückritr.-xd \rivd Ir- 2:^::> :..>- Ch lore J ^i='* ααΓρα.ο-ίι.ΓΌ.α und nit 20 iül \/acr;cr, de;; 0,120 {■ ".^t-ri'Ji'.Lir.arLor",', enthielt, bciif.iidclt. Das Gerd Geh vrirö OJ;; Ltundoü 'boi IiüL.-i^o.'.-pcro-iiUj· gerührt", η::ο die orj-j^r.-ircho 1-.^:.-..γ·.ο α1;{_·ο'(;Γο:·ιΐ:1; ur^ ;·.ι:^; t V/acocr Coun. c ch.cn. Lie lro^l'i..ioiⁱte, ^T..'i'; ,^rige 10·.-; mo vird d;;r,vi. r"/(,i;·.-iiiit i-ie'i;hvlf2-:chlorid r?cv.;oc chen i:'-,d l'/cob.i lirior-t, voboi da,.-; Linutriu^irül?: der ^r,'&~ (I'-^-In'vh-loyiai.iio-^-caarLo^^'Vi-lor-

car'bonsüurö iirlialtor. v/urdc ^ü_u/r_C: Di:-iRtriii:;r.-;l" öcr 7'--*— C^-!3·—--:-":"-:'-■ ο—f^—ο-·ο:·Τ.Γ-.;--;/ν?;!or-

Us η in Stufe E erLalteho i-iiVitr.i u:i;.a] ζ Λογ Vfi-ClJ-^-ih^La] oyl

Gph":n

^^pcü:?bcni;äuri v;ird in V.^!üi.;cf>r {^ol'Jryi. Ein iiouivGle:::t L^d^'a^inh^rirat v:i r-'i dr .un au'"or;cben, ur;d nan läc^ da« Gemisch ^-oi Kzii::.^J:.c-:.r)ev-:,O.r iibemaca^ £tf,hen. nie uäsüri GC Lösung vrird rnit Athylacc-tai; vor de^T: L--ürjhi Ii r.i er en c"ctrahiert, und nan erlialt dan Idj-\atriu:::^alz dei· 7^-(^-5~ Ardi: o-^-carboxy val era iido )- y- (λ-::: e tny 1 oarba.':i o-rln;;^ etiiyl) -

Unter hach.arbeitur.-j des in Beispiel 20 beschriebenen Verfahrene können cant Ii el. e 5~ ί--""-on o--substituier ten Carba'aoylo::v-

du2:.:h Eincatc des entsprechenden T-ncoy-n.-·^'jg ancoelle deo hetlpvlzsGcyanats P'enäec Beispiel 28, L;;';fe A, une u;iter ilaeharbeitunr" de^ in den Lzu^ori A_t 3 sn..ä CJ diecor; i-eispiels

- 152 1 O 9 3 ■: Γ /Ι δ 3 6

BAD ORIGINAL

4o J

"b'eschriebenen Verfahren sämtliche der entsprechenden J-car"ba:i;cyloxv;i crth^l-Eul:).,: ^!.;ituierten Derivate der Lr .findung synthetisiert- werden, nie fol^or.'de Gleichung erlaub er t die Uli: i3 et sun β ^e;" j; £.··." ijoii-pi«..·! SB, /Jbufon-A, B und G und erläutert zusammen nit i^belle 1;C die AuGnan^sinaterialien cji.e"es Verfahrens und die danach erhaltenen l-rodulits:

- 1:/'' 1093 ,3/ t 8 3 6

BAD ORiGiNAU

Ζ.——Λλ Il ζ'

[<ζ ^r-CHOOC-CH- (CH₉) ,-cnh4

I₉) -

c=o

^mJI

98«

^-J? UIa

^Χ2

OCH.,

-CHOOC-CH-(CH₀ 2 I

Ü ί

O=C C=O

rf^-^S

IiOOCCF₃

Base

O OCH.

MOOCrCB-(CH₂)₃-CÜH

0 CH₂OCNHR¹⁷

• NH.

COOM

- 154 -

109839/1838

ORIGINAL INSPECTED

Tabelle XIX

Bei spiel	O=C=NR3	R17	Base	M
29	0-C=NCH2CII2Cl	-CII2CH2Cl	NaHCO3	-Na
30	C=C=NCH2Cl	-CH2Cl	KHCO3	-K
31	O=C=NC(CH3) 3	-C(CII,),	NaFiCO3	-Na
32	O=C=NC2H5-	-C2H5	KHCO3	-K
33 .	O=C=NC(CH3)?CH2Cl	-C(CH3J2CH2Cl	NaIiCO3	-Na
34	O=C=NCOOC2H5*	-COOC2II5	NaIICO3	-Na
35	0-C=NSO2-^-CH3	-SO2^-CH3	NaHCO3	-Na
36	0=C=N-<£)	Ό	NaIICO3	-K
37	O=C=NCH -hQJL	-H-O)2	NaHCO3	-Na

-155 -

109839/1836

45 ί

BeisBJel 58

7ß-(D-5-Amino-5-carbo^valeraLiido)-3-(pyridiniuniniethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Eine Lösung aus 1,0 g 7ß-(D-5--^A-mino-5-carboxyvaleramido)-3-(acetoxyinethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure wird auf pH 2,5 gebracht. 8 ml Pyridin werden zugegeben, und die Lösung wird 2 Stunden auf 60° C erhitzt. Das Reaktionsge-· misch wird dann lyophilisiert und der !Rückstand in Wasser gelöst und durch ein PolystyioL-Trimetliylbenzylammoniuiii- -Anionenaustauschharz (43 % HpO) geleitet. Das erhaltene Gemisch der 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido*)-3-(pyridiniummethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wird mit Wasser verdünnt, und ausgewählte Fraktionen worden lyophilisiert, wobei praktisch reine 7-ß-(D-5-^Amino-5-carboxyvaleramido)-3"-(pyridiniummethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wird.

Unter Einsatz einer äquivalenten Menge Trimethylamin und Triethylamin anstelle von Pyridin in dem vorangehenden Verfahren und im übrigen unter liacharbeitung des dort beschriebenen Verfahrens wird somit 7ß-(D-5~^Aniino-5-carboxyvaleramido)-3-(trimethylammoniunuaethy 1 )-7-methyl-3-c ephem-4-carbonsäure und 7ß-(I^!-5--^A-niino-5--carboxyvaleramido)-3-('feriäthylammoniusimsthyl)-7-2iethoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten«

-¹- ^ "Ll, ^c 3-=ryriäi2Hömnietl3yl"Deri^/ate 4er Erfindung können C, * -1 ~ „idcr j ind^m das geeignete sononuklear-substi-

t -its ix. 1.-2. v-'-'-^rgehenden Beispiel

■' , ^[ρ v. läutern die-

OOC-CH- (CH₂) ₃-CNlI-NH,

COOH

O OCH, ι

HOOC-CH-(CH₀)

²

. NIU

Il \

₀) ,-CMII-⁴-^{2 3}

:h

COOH

Tabelle XX

Beisp.	χΐ	Belsp-·	3-COJi(C2H5) 2 3-CH2COOH 3-COCH3 4-COCH3 2-CH3 · 2-C0H5 3-CH3 4-C2H5 3-CH2OH " 4-CH2OH 4-CH2CH2CH3 3-SO3H 3-CN
39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51	3-F 3-C1 3-Br 3-1 4-CF3 3-COOH 4-COOH 3-CONH2 4-CONH2 3-CONHCH3 4-CONHC2Hs 4-CONHCH(CH3J2 4-CON(CH3)2	52 53 54 55 56 57 58 59 to 61 62 63 64

- 157 -

1Ü9833/1836

ORIGINAL INSPECTED

Λ5$

Beispiel 65

S-/?ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-3-cephem-3-yInethyl/-isothioharnstoff

Eine Lösung aus 1,0 g 7ß-(D-5-Ämino-5-carboxyvalera-ciido)-3-(acetoxy2iethyl)-7-metho^-5-cephem-4~carbons£lure und 1,0 g Thioharnstoff in 25 ml Wasser wird'5 iage bei 27° G gehalten. 200 ml Aceton werden zugegeben, und das Gemisch, wird in einen Msbad gekühlt. Das erhaltene Produkt wird darm filtriert und durch Polystyrol-i'rirtiethylbenzylar.nionion-Anionenaustauschharz (43 ?ό EUO) fraktioniert. Ausgewählte Fraktionen werden lyophilisiert, und das rohe Produkt wi-rd darm aus einem Gemisch aus Methanol und Wasser urakristallisiert, wobei praktisch reiner £-Z7ß-(D-5-^ino-5-cafboxyvaleräi:ja.do)-4-carboxy-7~aethoxy-3-cephem-2-ylmethyl/-isothioharnstoff erhalten wird.

Nach Ersatz einer äquivalenten Menge N-Methylthioharristoff, N-Ätiiylthioharnstoff, N-Propy!thioharnstoff, N,N-Dinethylthioharnstoff, N,N-l»iäthylthioharnstoff und N,N-Dipropylthioharnstoff anstelle des in dein vorangehenden Verfahren angeführten !Thioharnstoffe und im übrigen unter Nacharbeitung des dort beschriebenen Verfahrens wird auf diese Weise N-Methy1-S-Z^B-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-3-cephem-3-ylmethyl7~isothioharnstoff, N-Äthyl-S-/^ß-(D-5-aiaino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-'nethoxy- 3~cepheni-3-ylmethxl7-isothioharnstoff, iT-Propyl-S~Z7ß-(D-5-amii3io-5~carbo3qyvaleramido)-4-carbox7-7-niethoxy-3-cepheni-3- ylmethyl7-i so thioharnstoff, H,N-Dimethyl-S-r/?ß-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-Q ethoxy-3-c ephem-3-ylmethyi7-isothioharnstoff, K,K-Diäthyl-S-Z!?ß-(i-5-amino-5-carboxy val eramido )-4- carboxy- 7-m ethoxy- 3-cephe:u-3-y lnie thyl7-isothioharnstoff und N,N-Dipropyl~S-Z^!?ß-(l>-5-amino-5-carboxyvaleraniido)-4-carboxy-7-ciethoxy-3-cepheni-3--yliiiethyl7-iso thioharnstoff erhalten. - ·

- 158 109839/1836

Beispiel 66 ' 45" 9

7ß-(D-5-Amino-5-cart)oxyvaleraniido)-3-(äthylthiomethyl)-7-methoxy-3-cephe!n-4~carbonsäure

Ein Gemisch aus 0,654- g 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(aceto3cymethyl)-7-methoxy-J>~cephem-4-carbonsäure und 0,37 dl Athanthiol in einem Gemisch aus einem Teil Aceton und einem Teil Wasser (10 ml) wird bei Raumtemperatur gerührt und 2,0 ml einer 10$oi.gen ITatriumhydroxidiösung unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wird dann in einem verschlossenen Rohr 100 Stunden erhitzt und das erhaltene Gemisch im Vakuum konzentriert-- Der Rückstand wird in Wasser gelöst und durch ein Polystyrol-Trinethylbenaylammonium-Anionenaustauschharz (4-3" % HpO) fraktioniert. Ausgewählte Fraktionen werden kombiniert und lyophilisiert, wobei 7ß-(ü-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(äthylthiomethyl)-7-methoxy-3-cepheai-4-carbonsäure erhalten wird.

Unter Einsatz einer äquivalenten Menge Methanthiol, Propanthiol, Pyridin-2-thiol, Pyridin-J-thiol, Pyridin-4-thiol, Benzothiazol-2-thiol, 4-MetliylpyrdQidin-2-thi9l und 2-Methyl-3,4-thiadiazol-5-tfciol anstelle des in dem vorangehenden Verfahren angegebenen üthanthiols und im übrigen unter Nacharbeitung des dort beschriebenen Verfahrens, werden auf diese Weise 7ß-(D^l-5"Ai3iino-5-carbos7valeramido)-3-(iaethylthioinethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7-3-(D-5

carbonsäure» ?ß-(L^>-5-Aiaino-'5"^rcarboxyvaleraEiiclo)-3-(2-pyri-

carboxyvaleraraido)-3-(4-methylpyrimi din-2-ylthiom ethyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carbo:x:y valeramido)-3-(2-methyl~3,4-thiadiazol-5-ylthiociethyl)-7-methoxy-J-cephem-^-carbonsäure erhalten.

Beispiel 67

/p(55y)y7^ J-cephem-J-ylniethylJ-iTjIi-diEethyldithiocarbainat

Eine Losung aus 6,82 g 7ß-(fr-5-Amino-5-carboxyvalera:nido)-3-(acetoxymethyl)-7-niethoxy-3-ceplieni-4-carbonGäure und 2,86 g Natrium-N,E-dimethyldithiocarbamat in 60 ial Wasser wird 24 Stunden auf 50° C erhitzt. Das "Produkt wird lyophilisiert und dann -durch ein Polystyrol-Trirnethylbenzylainnoniurn-Anionenaustauschharz (43 % H₀O) fraktioniert. Ausgewählte Fraktionen werden dann lyophilisiert, wobei £-/7β-(ΰ-5-Aniino-5-'Carboxyvaleraniido)-4-carboxy-7-raethoxy-3-cephein-3-ylmethy_Jl7-N,N-dimethyldithiocarbainat erhalten wird.

Unter Einsatz einer äquivalenten Iienge der folgenden ßeaktionsmittels Katriam~ii-methyldithiocarbaniat, Natriuin-N,N-diäthylditniocarbamat, Ifetrium-NjN-di-n-propyldithiocarbamat, Natrium-N-methyl-N-(2~dimethylaminoäthyl)-cfchiocarbamat, Natrium-N-äthyl-li-(2-diäthylaminoäthyl)-dithiocarbaiaat, Natrium-N-(2-di-n-propylaminoäthyl)-dithiocarbamat, liatriualί-methyl-lί-(2-morpholinoäthyl)-ditl·liocarbanlat, Natrium-lfmethyl-lT~(3-diäthylaaiinopropyl)-dithiocarbaiiiat, Iiatrium-N-phenyl-K-(2-methylaminoäthyl)-dithiocarba:nat, Katriun-N,K-tetraBiethylendithiocarbamat, l»atrium-2T,N-pentamethylendithiocarbamat, Hatrium-N_>H-bis-(2-hydrcxyäthyl)-dithiocarbamät und das Katriunisalz von 4-Hethyl-piperazinodithiocarboxylat anstelle des in dem vorangehenden Verfahren angegebenen Eatriuffidimethyldithiocarbamate, wobei das NatriumbicarboiiÄt weggelassen wird, ,jedoch sonst das dort beschrie-

- 160 -

109839/1836

bene Verfahren nachgearbeitet wird, werden auf diese 'Weise S-/?ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-5-cepheri-4-ylmethyl7-N-^ethyldithiocarbamat, Ü-/7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-3-cepheni-3-ylmethyl7-H,N-diäthyldithiocarbaniat, b-/7ß-(U-5-Amino-5-carboxyval erami do )-4-carboxy-7-methoxy-5-cephein-3-ylwethyJ./ K ,N-di-n-propyldithiocarbaraat, S

methyl-l\^T-(2-dimethylaninoäthvl)-dithiocarbamat, £)-5-Amino-5-carboxy VaI erami do ) -4— c arboxy- 7-m e thoxy- 3- c eph e;:i-3-ylmetliyJ.7-N-äthyl-lI-(2-diäthylaüiirioätliyl)-dithiocarbaiiiat, S-/^ß-(L-5-Anino-5-carboxyvaleranido)-4~carboxy-7-iaethoxy-3-cephei;i-3-ylmetliyl7-^-(2-di-n-propylarninoätliyl)-dithiocarbamat, S-/¹?ß-(^-5-^ino-5-carbox3'valeramido)-4-carbox3/-7-iaeth.oxy-3-cephein-3-ylTaethyl7-N-raethyX-N-(2-morpholinoätliyl)-ditliiocarbainat, ü-r/Jß-(jJ-5-Aiaino-5-carboxyvaleramido)-4_c.arboxy-7-iaethoxy-3-cepheni-3-ylniethyl7-K-Diethyl-N-( J-diäthylaniinopropyl)-dithiocarbamat, S- /?ß-( ^- 5- Ami no- 5-carboxyval erami do )-4-carboxy-7-ni ethoxy-3-c eph,era- 3-ylniethyl7-N-phenyl-N-(2-methylaniinoäthyl)-dithiocarbaiaat, S-/pß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraaido)-4-carboxy-7-nietho:!:y-3-cephem-3-ylmetb.yl7-N,H-tetramethylendithiocarbamat_t S^-^?ß~(B-5-Amino-5-carboxy val erami do ) -4- carboy- 7-m ethoxy- 3- c ephem-3-ylmethyl7-N»N-pGntamethylendithiocarbamat, ii-/!?ß-(D-5-Amino-5-c arboxy val erami άο )-4-c arboxy-7~iii e thoxy-3-c ephem-3-ylaiethyi7-N,K-bis-(2-h.ydroxyäthyl)-dithiocarbamat und -(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-

erhalten.
Beispiel 68

7ß-(B-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(benzylthiomethyl)-7-methoxy-3-cepheni-4-carbonsäure

Ein Gemisch aus 0,654 g 7ß-(D-5-Anuno-5-carboxyvaleramido)-

- 161 -

109339/1836

41,2,

3-(acetoxyo.etiiyl)-7-methoxy-3-ccphoin-^— carbonsäure, 0,504 g Natriunbicarbonat und 0,414 g Thiobenzoesäure in 5ιό ml Wasser wird bei 50° C übernacht unter einer Gtickstoffatmosphäre erhitzt.Das Produkt wird durch Zugabe von Aceton ausgefällt und aus eineai Genisch aus Alkohol und Wasser kristallisiert, wobei 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramiäo)-3-(benzoylthiomethyl)-7-3iethoxy-3-cephea-4-carbonsäure erhalten wird.

Unter Einsatz e'iner äquivalenten Menge Kaliuiiäthylxarithat, Kalium-n-propylxanthat, Kalium! sopropylxanthat, Kaliua-nbutylxanthat, Kalium-n-he:rylxanthat, Kaliunicyclopentylxanthat und Kaliumcyclohexylxanthat anstelle, der in dem vorangehenden Verfahren angegebenen Thiobenzoesäure und sonst unter Nacharbeitung des dort beschriebenen Verfahrens, werden auf diese Weise 7ß~(D-5-Amino-5-carboxyvaleraiaido)-3-(äthoxytbiocarbonylthiomethyl)-7-methoxy-3-cephe;a-4-carbonsäure, 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerarsido)-3-(n-propoxythiocarbonylthiomethyl)-7-niethoxy-3-cepheni-4-carbonsäure, 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(isopropoxythiocarbonylthiomethyl)-7-niethoxy-3-cepheni-4-carbonsäure, 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(n-butoxythiocaiftionylthiomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(D-5-Araino-5-carboxyvaleramido)-3--(ii-iiexyloxythiocarbonylthioniethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(cyclopentyloxythiocarbonylthiomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und 7ß~(D-5-Aniino-5-carboxyvaleramido)-3-(cyclohexyloxythiocarbonylthiomethyl)-7-methoxy-3-cepheia-4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 69

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3"-(toluol-p-sulfonylmethyl)-7-niethoxy-3~cepheni-4-carbonsäuie

Ein Gemisch aus 0,654- g 7ß-(D-5-Anino-5-carboxyvaleramido-

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109839/1836

5-(acetoxyniethyl)-7-Eiethoxy-3-cepheni-4— carbonsäure und 1,0 g Katriumtoluol-p-sulfinat in 5i^ ml Wasser wird "bei 50° C 24- Stunden erhitzt. Das Gemisch wird im Vakuum konzentriert und aus einem Gemisch aus Methanol und Wasser kristallisiert, wobei 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(toluolp-sulfonylmethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wird.

Beispiel 70

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7Hnetlioxy-J-cephem-4-carbonsäure

Ein Gemisch aus 2,0 g 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraraido)-3-(acetoxyinethyr)-7-niethoxy-3-cepheia~^—carbonsäure und 1,0 g Natriurcazid v;ird in 10 ml Wasser gelöst und bei 50° C übernacht erhitzt. Das Gemisch wird dann lyophilisiert, und man erhält rohe 7ß~(D-5-Aciino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure .

Anstelle der Behandlung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(acetoxymethyl)-7-methoxy-3-Gephea-4»carbonsäure mit Natriumazid ist es auch möglich, 842A selbst dafür in einem sonst analogen Verfahren einzusetzen, um ein identisches Produkt zu erhalten. Das folgende Beispiel erläutert dieses Herstellungsverfahren:

100 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-nietJioxy-3-cephem-A«—carbonsäure in einer 0,5 m-Phosphatpufferlösung (S ml, durch Zugabe von 3»5 S Katriumdihydrogenphosphat und 3,4 g Dinatriumphosphat in 100 ml Wasser und anschliessende Zugabe einer ausreichenden Menge Chlorwasserstoffsäure, um den pH-Wert auf 5 zu bringen, hergestellt) wurden in Gegenwart von 20 mg Natriumazid bei ° C 8 flinutsn erhitzt. Präparat!ve Dünnschicht-Chromato-

- 163 1098 30/1 S3 6

14305

graphie ergab 20 mg 7ß-(D-5-Anir;o-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7-nietho:x.y-3-cephein—4-carbonsäure, was durch Infrarot- und kernmagnetische Piesonanz-LoGtimmung ermittelt wurde. Behandlung dieses Material mit 1,0 ml Trifluoressigsäure bei C⁰ C während 5 Minuten und anschliessendes Abschrecken in einem grossen Volumen Äther und Eina.aripfung dec Lösungsmittels ergab 15 rag 7^-(^-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonGäure in I'orm eines weissen Pulvers. Dieses Material besass biologische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Bakterienstämmen. Dieses Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert:

Dünnschicht-ühroiRatofrraphi e: durchgeführt auf Celluloseplatten in einem 75/oißem, wässrigem Acetonitril-Lösuiignniittel; der Rf-Weit für dieses Produkt betrug ü,7; der iif-Vert für das Dinatriumsalz von 8^-2A lag bei 0,J.

Ultraviolett-Bestiminun^: /\ Maxinum betrug 263 ilillinikrorx (mil); der molekulare Lxtinctionskoeffizient lag bei etwa 34-00 (theoretischer Wert: 8000); Infrarot-Bestimraung in Nujol lag bei 1780 cm , was die Anwesenheit eines ß-Lactam rings anzeigt; das Produkt ergab auch einen positiven I.inhydrintest, aer die Anwesenheit einer cc-Aniinoadipoyl-Seiten kette anzeigt.

Biologischer Versuch; Die Scheiben-Zonengrb'ssen in der folgenden Tabelle sind in mm für 100 γ/ml Antibiotikum ausgedrückt .

109939/1836

Organismus Dinatriumsalz 7ß-(D-5-Aiaino-5-carboxy-

von 642A valeraiaido)-3-(azidomethyl)-(100 γ/ml) 7-methoxy-3-cephem-4—

carbonsäure (100 γ/ml)

Escherichia

coli W-HB-60 18 21

Pseudocionas

srutzeri 1ΊΒ-1231 22 20

Vibrio percolans

MB-1272 18 16 (5 γ/πιΐ)

Beispiel 71

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(aminomethyl)-7-methoxy-3-c ephera-^J—carbonsäure

Die in Beispiel 70 erhaltene rohe Probe aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(azidoiaethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure wird über Flatinoxid in einer essigsäurenthaltenden Methanollösung hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung konzentriert. Eine Lösung des Hückstandes wird dann durch ein Polystyrol-Trimethylbenzylammonium-Anionenaustauschharz ( 43 % Hp/) fraktioniert, und ausgewählte Fraktionen werden vereinigt und IyophiIisiert, wobei *7ß-(D-5-Auiino-5-carboxyvaleramido)-3-(aminomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wird.

Die Acylierung der 7ß-(£-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(aminomethyl)-7-aiethoxy-3-cephein-4-carbonsäure mit Acetylhalogenid, Propionylhalogenid und 2-Pheny3acetylhalogenid ergibt die entsprechenden N-ac^ylierten Derivate: 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(acetamidoDiethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(ü-5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(propionamidomethyl)"7-in3thoxy-3-cepheni-4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Aaino-5-carboxyv!U.eraniido)-3-(2-phenylacetaaiidooethyl) -7-IDβthoxy-3-cepheπ3-4-carbonsäure.

-- 165 -

103839/1838

Anstelle des vorstehend angegebenen katalytischen Verfahrens kann 7ß-(^5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidonethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure auch zu dem entsprechenden Amin durch molekulare Hydrierung reduziert werden. Das folgende Beispiel erläutert dieses Herstellungsverfahren.

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(azidomethyl)-7-cietho:q/-3-cephem-4-carbonsäure wurde in einer Lösung von 90 % Essigsäure und 10 ^c/o Wasser gelöst. Das Gemisch wurde auf Ü bis 5° C gekühlt und 30 mg Zinkstaub wurden zugesetzt. Nach Minuten wurde das Gemisch filtriert und mit Schwefelwasserstoff behandelt, um lösliches Zink zu entfernen. Das erhaltene Gemisch wurde dann mit einem grossen Volumen Wasser verdünnt und lyophilisiert, wobei praktisch reine 7ß-(^-5-Amino-5-carbo>^raleramido)-3-(aminomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wurde. Dieses Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert:

Dünnschicht-Chromatoprraphie: durchgeführt auf Celluloseplatten in einer 75/'«igen, wässrigen Acetonitrillösung; der Rf-Wert für dieses Produkt lag bei 0,2; der Kf-Wert für das Dinatriumsalz von 84-2A lag bei 0,3.

Ultraviolett-Bestimmunp: /? Maximum betrug 263 nu; der molekulare Extinktions-Jcoeffizient lag bei etwa 3500 (theoretischer Wert: 8000); die Infrarot-Bestimmung in NuJoI ergab 1780 cm , was die Anwesenheit eines ß- Lactamrings anzeigt; das Produkt ergab auch einen positiven Ninhydrintest, der die Anwesenheit einer γ-Aminoadipoyl-Seitenkette anzeigt.

Biologischer Versuch: Die Scheiben-Zonengrössen sind in der folgenden Tabelle in mm für gleiche Konzentrationen des Antibiotikums ausgedrückt'

- 166

109839/1836

14305

Grganismus Dinatriunsalz 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaler-

von 842A amido)-3-(aminoniethyl)-7-

methoxy-3-cephem-4-carbonsaure

Vibrio perco-

lans MB-1272 18 20 (5 γ/ml)

Salmonella
gallinarum
HB-1287 27 21 (100 γ/ml)

Pseudomonas

MB-1231 21 21 (100 γ/ml)

Beispiel 72

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(2,4-dihydroxybenzyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Ein Gemisch aus 0,654 g 7ß-O)-5-Amina«-5-carboxyvaleramido)-3-(acetoxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 1,1 g Resorcin und 10 ml Wasser wurde 2 Tage bei 50° G erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird dann lyophilisiert, und man erhält rohe 7ß-(-ü-5-Amino-5-carboxyvaleramido)~3-(2,4-di-hydroxybenzyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure.

Beispiel 7? ·

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(N-niethylindol-3-ylmethyl)-7-niethoxy-3~cephem-4-carbonsäure

Eine Lösung aus 0,655 S N-Hethylindol in 5 ml Aceton wird au einer Lösung aus 0,654 g 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerajaido)-3-(acetoxyiaethyl)-7-methoxy-3-cepheni-4-carbonsäure in 5 ml Wasser bei 50° C gegeben. Das Gemisch wird 48 Stunden erhitzt, und das Lösungsmittel wird dann im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Äther angerieben, wobei rohe 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(N-methylindol-3-yljnethyl)-7~methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wird.

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109839/1836

Beispiel 74

Dinatriumsalz der 7ß-(l>-5-A:aino-5-carbGxyvaleramido)-3-(hydroxyme thy l)-7-iriethoxy-5-cephe;ii-4-carbonsäur ο

Stufe A: Dibenzylester der 7ß-(l⁾-5-£'h'khaloylamino-5-carboxyvaleramido)-5-(carbamoyloxynethyi;-7-naetiioxy-3-cepheni-4-carbonsäure

Eine Lösung aus 0,653 ^mG 7ß-(^-^-ihthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbaraoyloxymethyl)-7-methoxy-5-cephe:a~4--carbonsäure (Beispiel 14-, Stufe A) in Methanol wii'd mit einer geringen Menge frisch hergestelltem Phenyldiazomethan behandelt. Nach Stehen übernacht bei iiaumtemperatu^ wird die Lösung eingedampft, wobei 1,053 g Rückstand erhalten wurde, der als der Dibenzylester der 7ß~(l⁾--5-l^Jk'fchaloylaiuino-5-carboxyvalerarai do)-J-(carbamoyloxymethyI)-7-m ethcxy-3-c eph em-4-carbonsäure identifiziert wurde.

Stufe B: Dibenzylester der 7ß-(^-5-I^<ti'fchaloylaaino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydrc::ymethyl)-7-methoxy-3-cephera-4-carbonsäure

0,5 g dee in Stufe A erhaltenen Dibenzylesters der 7ß Phthaloylaroino-5~carboxyvalerainido)-3-(carbanioyloxyniethyl)-7~iaethoxy-5-cephem~4—carbonsäure werden in 5 &1 reinem Lioxaii, das 1,5 ü-quivaiente Pyridin enthält, gelöst. Eine Lösung aus Nitrosylchiοrid (1,3 Äquivalente) in Hethylenchlorid wird zugegeben und die Lösung in einem Eisbad während 1 Stunde gerührt. Das so erhaltene Produkt ist oine Lösung des laben zy!esters der 7ß-(I⁾-5-Phthal·oylaτnino-5-carbo>:yvalerami do)- 3- (fcydroxyniethyl)-7-iaetho:ry- 3- c eph er.i-4- carbonsäure, welche direkt in der folgenden Stufe verwendet wird.

- 168 -

103839/183

14305

Stufe C: Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Fhthaloylamino-5-

carboxyvaleraraido)-J-(iiydroxyniethyl)-7-peth.oxy-3-cephem-4-carbonsäure

Eine Lösung aus 0,5 E 10%igem Palladium-auf-Kohle wird zusammen mit 0,5 ml Eisessig zu den in Stufe B erhaltenen Dibenzylester der 7ß-(D-5-Hithaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-hydroxymethyl)-7-metho:-:y-3-cephera-4-carbonsäure zugegeben. Das Gemisch wird bei 2,8 kg/cir.'" (50 Ib. per square inch) unter Bewegen 2 Stunden hydriert, der Katalysator wird durch Diatoiaeenerde ab filtriert und das Lösungsmittel durch Konzentrierung im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Ilethylenchlorid gelöst und die Lösung mit einer ^%1 gen Natriumbicarbonatlösung e:-:brahiert. Das erhaltene Gemisch wird dann mit Schwefels' j j auf pH 2 ängesäuert und mit Äthylacetat extrahier^. Nach Trocknen wird der Extrakt im Vakuum konzentriert, wobei ein Rückstand erhalten wird, der als das Dinatriumsalz der 7ß-(^-5-I^;hthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-

cephem-4—carbonsäure identifiziert wird.

Stufe D; Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Das Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Hithaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-mefchoxy-3-cephem-4-carbonsäure, das in Stufe F erhalten wurde, wird in Wasser gelöst. Λ Äquivalent Hydrazinhydrat v/ird dann zugegeben, und man lässt das Gemisch übernacht bei Raumtemperatur stehen. Die wässrige Lösung wird mit Äthylacetat vor dem Lyophilisieren extrahiert-, und man erhält das Linatriucisalz der 7ß-(L-5-

cephea-4 -ccn'bonn-iare.

I ύ 3 J J 0 i' ] Q 3 6

BAD ORIGINAL

Beispiel 75

Reinigung: Mononatriumsalz der 7ß-(D-5-^Aaiino-5-carboxyvaleramido;-3-(carbanioyloxyniethyl)-7-Kethoxy-3-cephe:ti-4-carbori-

1,0 g des nach Beispiel 12 hergestellten Kononatriumsalzes der 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3~(carbanioyloxymethyl)-7-niethoxy-5-cepheni~4—carbonsäure wurden in 20 ml 1/üigem, wässrigem, n-Butanol gelöst und auf eine Kolonne chromatographiert, die 2550 ml Sephadex G-10 enthielt, ein modifiziertes Dextrangel in Perl en form. Die Kolonne v;urde mit 1%igem, wässrigem n-Butanol bei 10 ml/min, entwickelt, und 10,5 ml-Fraktionen wurden automatisch gesammelt. Die ausströmende Flüssigkeit wurde mit einem Registrier-.Refraktometer aufgezeichnet, und die Fraktionen, wurden biologisch untersucht. Die biologische Wirksamkeit trat in den Fraktionen 99 "bis 122 auf, und diese wurden ζusammengegeben und zur Trockene eingeengt, wobei 670 m. Produkt erhalten wurden, das vorwiegend das Mononatriumsalz der 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxyraethyl)-7-methoxy-3-cephea-4-•carbonsäure enthielt.

Die Kolonne wurde anschliessend durch Chromatographie auf einem Gemisch von Blue Dextran 2000 und Natriumchlorid unter identischen Bedingungen geeicht. Blue Dextran 2000 wurde in den Fraktionen 85 bis 95 und natriumchlorid in den Fraktionen 140 bis 155 ermittelt, was anzeigt, dass das biologisch-wirksame Produkt von Verunreinigungen dieser Art abgetrennt werden kenn.

Beispiel 76

7ß-(D-5-Amino-5-carbüxy val eraiiido")-3-'niefchyl-7-Eiethoxy-ίο ephem—^-carbonsäure

Ein -lO/üiger PalUtrUiim-auf-Kohle-X^talysator wur-i > Ln BO r.il

0 D a 3 9 / 1 i) J 8

14305

Wasser suspendiert und mit Wasserstoff "behandelt. Der Katalysator wurde dann filtriert und wiederum in 50 ^ml V/asser suspendiert, und zu 2,6? g dieses Gemischs wurden 1,0 g Nati-iumsalz von 84-2A in 10 ml Wasser gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 22 stunden box Raumtemperatur geschüttelt.

Der Katalysator wurde ab-filtriert und einmal mit 50 ml Wasser gewaschen.Die vereinigten Waschwässer und illtrate wurden dann zur Trockene eingeengt, und man erhielt ein" 52,8%ige Ausbeute an 7ß-(D-5-Aniino-5-carboxyvaleranido)-3-methyl-7-;.iethoxy-5-cephe:a—^-carbonsäure (528 mg).

Die so erhaltene 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalera:nido)-3-methyl-7-methoxy-3-cephe.ⁱn--<^/4~carbonsäure wurde mit Auagangsrnaterial unter Anwendung· von Dünnschicht-Chromatographie verglichen. Silicagel-Platten wurden verwendet, wobei die obere Phase aus vier Teilen n-Butylalkohol, einem Teil Essigsäure und vier Teilen Wasser bestand. Das Hydrogenolyseprodukt ergab zwei Flecken mit einer höheren Strömungsgeschwindigkeit (Rf-Wert) als das Ausgangsmaterial. Die Flecken wurden durch Ninhydrin und Ultraviolett-Fluoreszens ermittelt. Die folgende Tabelle gibt die beobachteten Unterschiede zwischen dem Natriuiasalz von 842A und dem 7-ß-(D-5-Amino-4-carboxyvaleramido)-3-methyl-7-niethoxy-5~cephem-4-carbonsäure-Produkt wieder.

109839/1836

Iiatriumsals von

Bi c X c ■ei "^ ciis Iv i x?l

SoH* »ν ΘΑ. w

--,/■ "".ρ ng/Fleck

'Xy* 9 ' JU O X S tj ^i

5 jag/'al ergab eine 25nna-Zcne g^gen Vibrio percolans (.I-IB-1272)

Rf 0,1 Ninhydrin (positiv) Ultraviolett (positiv)

A aax 266 mu , S^^ 7B-(D-5-AEino-5-carboxyvaleramido)-3-nieth.yl-7-iiiethoxy-5-ceph.ea-^z4—carboiisäure

Inaktiv bei pO ug/nl (< 2 % Aufanpsaktivität)

Sf 0,25 Ninliydrin (positiv) Ultraviolett (positiv)
Hf 0,55 NirJiydrin (positiv) Ultraviolett ()

max 2&5

Beispiel

S~Z?ß- (D-5~ Amino-^- carboxy vale rani do) ~^zt~carboxy-7-m etho xy-3-cepheui-3-yl-methyi7-t;hiouroniu;a

100 mg Antiobiotikun 842A wurden 8 Minuten nit 26 ng Thioharnstoff bei 95° G in 5 ml einer 0,5 m~Phosphatpufferlösung, die durch Eugabe von 5,5 g l'iatriumdihydrogenphosphat und 3,^ g Dinatriumphorjphat in 100 ::il Wasser und anschli ess ende Zugabe von ausreichender Chlorwasserntoffsäure, um den pH-Wert auf 5 ^su bringen, erhalten wurde, erhitzt. Elektrophorese der Lösung bei pH 7 ergab die Thiοuronium-Verbindung als nicht-bewegliche Linlieit, während 842A einen fif-Wert von etwa 0,2 b.esans. Las-Gemisch v;urde durch Absorption an ein Polystyrolkernsulfonsaure-Kationenaustauschharz ( Vasserstoffsyklus, Dowex 50) unter Entfernen des Phosphatpuffers gereinigt. Die Eluierung erfolgte unter Verwendung einer- 0,1 n-Fyridinlösung. Der pK-Wert wurde mit 1 n-Hatriumhydroxid auf 8 eingestellt und unter Vakuum eingedampft, um restliches Pyridin au entfernen. Lyophilisierung ergab ein gelbbraunes Pulver, das als S-/7ß-(l>-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4— carboxy-7-methoxy-3-ceph.em-3-yl-niethyJ₍7-thiouroniuiii identifiziert wurde. Dieses Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert:

Dünnschicht-ChroniatoKraphie: durchgeführt auf Cellulose-Platten in einem 22;igera, wässrigen Acetonitril-Lösungsmit- telj der Rf-V/ert für dieses Produkt lag bei 0,15; eier Rf-Wert für das Dinatriunsalz von 842A lag bei C,3.

Ultraviolett-3estiamlui^: ^Ilaximun betrug 263 nm; der molekulare E}:tinktionE_,lcoef fizi ent betrug etwa 5700 (theoretischer Wert: 8000) ι die Inf rarot-Bestiinniung in Nu j öl ergab

—1
1?βΟ esa , was die Anwesenheit eines ß-Lactanrings anzeigt; das Produkt er^ib aurh ¹⁵Lr. ei '.,sitiven i;inh /O.v ini, et; c, was

1 Q 9- - ? 3 / ' 3 3 8

BAD ORIGINAL

die Anwesenheit einer a-Aminoadipoyl-Seiter;kette anzeigt.

Elektrophorese: Die Einführung einer positiven Ladung in das Produkt vmrde durch Elektrophorese bei 1000 Volt unter Verwendung eines 0,05 m-lhosphatpuffers bei pH 7 bentvltifru ·, der Rf-Vert für das Produkt lag bei 0,01; der Rf-Wert für das Linatriumsalz von S42A lag bei 0,4.

BioIopasche Untersuchung:: Die Scheiben-Zongiigrossen rind in der folgenden Tabelle in mm bei gleichen Konsentrationen des Antibiotikums ausgedrückt.

Organismus l)inatriu:asalz 3

von 842A valeramido)-5-carbo:"7-7

(,1OO γ/ηίΐ; methoxy-;'-cephe:a-^-yi-

nethyly-thiouronium (100 γ/ial)

Vibrio percolans B-1272	>35
Salmonella galli- narum IiB-1287	27
Pseudomonas Stutzeri MB-1231	22
Proteus vulgaris MB-8J8	27
Beispiel 78

23 22

'17

7ß-(D-5-Aniiiio-5-carboxyval.era!aido)-3-(4-methylthiazol-2-ylmercaptomethyl)-7-niethoxy-$-cephera-4~carbonsäure

Stufe A: 7ß-(^-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbanioylo:cymethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure

1,0 g des DinatriumsalzeB von 8^2A wurden in 31»6 ml 5#igem di-basischem Natriuaiphosphat gelost, und 20,8 al Aceton wurden urifcer Rühren zugegeben. Ler pH-Wert; der Lösung

109839/1336

BAD

wurde dann mit Natriumhydroxid auf 9₅5 his 916 eingestellt und 1,0 ml tert.-Butoxycarbonylazid wurde unter Rühren zugegeben. Das Rühren wurde 4 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt, während der pH-Wert zwischen 9*0 und unter Zugabe von Natriumhydroxid beibehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann übernacht gerührt, wonach der pH-Wert auf 8,5 abgesunken war. Der pH-Wert wurde mit Natriumhydroxid wieder auf 9?6 eingestellt und das Rühren weitere 5 Stunden fortgesetzt, während der pH-Wert zwischen 9,0 und 9>6 gehalten wurde.

Das erhaltene Gemisch wurde dann mit einem halben Volumen Äthylacetat extrhiert und der Extrakt verworfen. Ein halbes Volumen Äthylacetat wurde zugegeben und die wässrige Schicht xtfurde mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf ρ H 2,5 iⁿ einem Eisbad eingestellt, um die Temperatur unterhalb von 5° C zu halten. Nach Abtrennung des Äthylacetats wurde die wässrige Lösung noch zweimal mit einem halten Volumen Äthylacetat bei pH 2,5 extrahiert. Auf Grund von Ultraviolett-Bestimiuungen lagen 50 % des Ausgangs-Ultra violett-Absorbens in den Extrakten vor und 22 % in der verbrauchten, wässrigen Phase. Die Extrakte wurden vereinigt und zur Trockene eingeengt, wobei 645 mg 7-ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure mit einem Zehntel der biologischen Wirksamkeit des Ausgangsmaterials erhalten wurde.

Dünnschicht-Ohr oma to grarnne wurden unter Verwendung von Analtech-Silicagel G.ϊ¹.-Platten und der oberen Phase aus einem 4 : 1 : 4 n-Butanol, Essigsäure, Wasser-Ly ε ten: durchgeführt. Das Produkt besass einen lif-Wert von O,5'4 auf Grund der Ultraviolett-Bestimaung und war Nirahy-drin-iie[·.:--- tiv« Das Aue£an£siaateriai besaes einen "Rf-Wert von- 0,1 und v;ar ultraviolett- und ninliydrin-positiv.

- 175 -

Das Entfernen der tert.-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe aus einer 10 mg-Probe der 7-ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4— carbonsäure wurde durch Auflösen des Materials in 0,2 ml Trifluoressigsäure und Stehenlassen der Lösung bei Eaumtemperatur xrährend 5 Minuten durchgeführt. Die Lösung wurde dann bei Eaumtemperatur zur Trockene eingeengt. Dünnschicht-Chromatographie, wie vorstehend beschrieben, ergab einen Fleck für dieses Produkt mit einem Rf-Wert von 0,1, der ultraviolett- und ninhydrin-positiv war.

Stufe B; 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(4--methylthiazol-2-ylDiercaptomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

100 mg 7ß-(H-5-N-tert.-Butoxycarbonylaiaino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsaure in 5 ml eines pH 7-Puffers (eine 0,5 m-Lösung eines Gemischs aus 3 »5 S Natriumdihydrogenphosphat und 3>4- g Dinatriumphosphat in 100 ml Wasser), der 50 mg 2-Mercapto-4~ methylthiazol enthielt, wird bei 95° C 8 Minuten erhitzt. Auf diese Weise wurde 7ß-(D-5-E-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(4—methyl thiazol-2-ylmercaptomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten, die nach Behandlung mit 0,2 ml Trifluoressigsäure 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(4--methylthiazol-2-ylmercaptomethyl)-7-methoxy-3-cepheia-4-carbonsäure lieferte. Dieses Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert:

Mnnschicht-Chromatographie: durchgeführt auf Cellulose-Platten in einem 25/^igen, wässrigen Acetonitril-Lösungsmittel; der Ef-Wert für dieses Produkt betrug 0,6; der Ef-Wert für das Dinatriumsalz von 842A betrug 0,3.

Ultraviolett-Bestimaunp:: J( rlaxiinum betrug 269 in. «.der molekulare Extinktions^koeffizient lag bei etwa 2000

- 176 -

1 0 9 r .-' : ' G 3 6

14-305

2109S54

(theoretischer Vert: 8000) j Infraro.t-Best-immung in Nujol ergab 1780 cm , was die Anwesenheit eines ß-Lactamrings anzeigt; das Produkt ergab auch einen positiven Ninhydrintest, der die Anwesenheit einer a-Amircadipoyl-Seitenkette anzeigt.

Biologische Untersuchung:; Die Scheiben-Zonengrössen in der folgenden Tabelle sind in mm für gleiche Konzentrationen an Antibiotikum ausgedrückt.

7ß-( D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(^zl—methylthi azo 1-2-y Im er cap torn ethyl )■ 7-m ethopcy- 3-c ephem-4-carbonsäure (100 γ/ml)

Organismus	1	Dinatrxumsalz von 842A (100 XVmI)	79
Pseudomonas stutzeri' MB-1231	22
Escherichia coli W-ME-60	18
Vibrio percolans MB-1272	23
B e i s ρ i e

13,5 20

7ß-(D-5-Amino-5-carbo3cyvaleramido)-3-(i ,3»^/<~thiadiazol-2-ylm ercaptomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Unter Ersatz von 2-Mercapto-1,3,4~thiadiazol anstelle des 2-Mercapto-4~methylthiazols gemäss Beispiel 78, Stufe B, und im übrigen unter Nacharbeitung des dort beschriebenen Verfahrens wird auf diese Weise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(i ,3>^zt~thiadiazol-2-ylmercaptomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure erhalten.

- 177 -

109?30/1836

Beispiel 80

7ß-( D-5-Amino-5-c arb oxy val erami do )-3-(tlii ο cy ana t om e thy 1)-7-m e thoxy- 3- c ephem-4- c arbonsä ur e

100 mg Antibiotikum 842A wurden zu 5 ml einer 0,5 m-Pufferlösung, bestehend aus 3>5 S Natriumdihydrogenphosphat und 3,4 g Dinatriumphosphat in 100 ml Wasser zugegeben und der pH-Wert des Gemische auf pH 5 durch Zugabe von Chlorwasserstoff säure gebracht.. 20 mg Natriumthiocyanat wurden zugegeben und das Gemisch wurde 8 Minuten auf 95° C erhitzt. Es wurde auf diese Weise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(thiocyanatomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 81

7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerami do )-3-( chlormethyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Stufe A: Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxy-

carbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Zu einer Lösung aus 15»° g 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-c arboxy val er ami do )-3-( carbamoy loxym e thy 1) - 7-me thoxy-3-cephem-4-carbonsäure in 500 ml Äthylacetat werden 5»5 S Diphenyldiazomethan in 70 ml Äther zugegeben. Das Gemisch wird unter Rühren auf 40° C erwärmt und dann nach 30 Minuten mit zusätzlichen 5i5 g Diphenyldiazomethan in 70 ml Ither behandelt. Nach 3 Stunden wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und durch ein Gemisch aus 500 ml Methanol und 20 ml Wasser ersetzt. Die Methanol-WasserlÖsung wird viermal mit Hexan extrahiert und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, wobei der Di-

- 178 109830/1836

benzhydrylester der 7ß-(D-i^-N-tert.~Butoxycarbonylamino~5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure erhalten wird.

Stufe B; Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino--5-carboxyvaleramido)-3-(chlormethyl;-7~ni ethoxy-3-c ephem-4—carbonsäure

ü'.mMol Dibenzhydryl ester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonyl amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4—carbonsäure wird in 5 &1 Methylenchlorid gelost und das Gemisch auf 0° G gekühlt. 1 mMol Collidin wird zugegeben, und anschliessend wird tropfenweise eine Lösung aus 0,6 mHol Phosphorpentachlorid in 5 ml Hethylenchlorid zugesetzt. Das Gemisch wird dann 1 Stunde in einem Eisbad bei 0° C gerührt und die erhaltene Lösung mit Natriumbicarbonat, verdünnter Chlorwasserstoffsäure und einer gesättigten Natriumchloridlösung extrahiert. Das Gemisch wird zur Trockene eingedampft und dann durch Chromatographie auf einer gekühlten Silicagel-Kolonne unter Verwendung von Chloroform als Eluiermittel isoliert. Das so erhaltene Produkt ist der Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(chlormethyl)-7-methoxy-3-cepheni-4--carbonsäure.

Stufe C: Trifluoressigsäuresalz der 7ß >.- ^ •

carboxj'valeramido)-3-( chlormethyl )-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure

Eine Lösung aus 1 mllol Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(chlormethyl)-7-methoxy-3-cepheni-4-carbonsäure in 13 ml Anisol wird auf 6,5 ml kalte (0° C) Trifluoressigsäure unter Rühren gegossen. Nach 5 Hinuten wird die Lösung unter Rühren in 1800 ml einer bei 0 C gehaltenen .ktherlösung gegossen. Der sich ergebende feste Niederschlag wird dann gesammelt

- 179 -109839/1836

und getrocknet, wobei 7ß-(^5-Aiaino-5-carboxyvaleramido)-3-(chlormethyl)-7Hnetho:^-3-cephem-4-carbonsäure-trifluoracetat erhalten wird.

Die neuen Verbindungen der Erfindung wurden als Verbindungen mit dem. 5-Amino-5-carboxyvaleramidorest in der ß-Konfiguration mit Bezug auf den Cephemkern beschrieben. Obgleich dies auf derzeit verfügbaren Informationen beruht und als richtig angenommen wird, sollen·die Verbindungen nicht auf diese spezielle Konfiguration festgelegt sein, falls sie auf Grund weiterer Erkenntnisse als unkorrekt nachgewiesen würde.

Die in der vorliegenden Beschreibung angeführten Organismen sind in der Kulturensammlung des American Type Culture Collection hinterlegt, wo sie unter den folgenden ATCC-Bezeichnungen verfügbar sind:

Escherichia coli W-MB-60 ATCC 9637

Proteus vulgaris MB-838 ATCC 21100

Alcaligenes faecalis MB ATCC 212

Alcaligenes viscosus HB-12 ATCC 337

Vibrio percolans HB-1272 ATCC 8461

Bacillus subtilis KB-964 ATCC 6633

Auch werden in der Beschreibung mehrere verwendete Materialien mit Handelsbezeichnungen bezeichnet. Diese weisen die folgende Zusammensetzung auf und sind von den folgenden Bezugsfirmen erhältlich:

Amber Yeast ITr. 3OO: Eine Fraktion autolysierter Brauereihefe; Aaber Laboratories, Juneau, Wisconsin.

Möbel par-S: Ein Entschäurnungsmittel auf Clbasis (Zusammensetzung unbekannt); Kobil CiI-Company, 150 E. 4-2nd Street, ITew York, New York.

- 180 -

0:^:

14305

Polyglykol 2000: Ein Entschäumungsmittel; Polypropylenglykol-Polymeres mit einem mittleren Molekulargewicht von 2000; Dow Chemical Company, Midland, Michigan.

Biogel P-2: Ein Gelfiltrationsmedium; ein kugelförmiges Polyacrylamid vernetzt mit Methylen-bis-acrylamid; Bio-rad Laboratories, Eichmond, California.

Dowex 50i Ein Polystyrol mit im Kern sulfonierter SuIf onsäure-Kationenaustauschharz; Dow -Chemical Company, Midland, Michigan.

Analtech G.3?. Plates: Silicagel mit Calciumsulfat-Binder und ein fluoreszierender Indikator, 250 Mikrometer Stärke; Analtech Inc., 100 South Justison Street, Wilmington, Delaware, 19801.

- 181 -

10 9 3 3 3/1836

Claims (1)

¹⁴³⁰⁵ An ²

Patentansprüche

7ß- (D-5-Amino-5-carboxyvaleramido )-3-methoxy-J-c ephem-4-carbonsäure, die in der 3-Stellung durch Methyl-, Halogenmethyl-, Hydroxymethyl-, Acyloxymethyl-, Carbamoyloxymethyl-, N-substituierteund Ν,ίΤ-disubstituierte Carbamoyloxymethyl-, Alkylthiomethyl-, heterocyclische Thiomethyl-, Trialkylammoniummethyl-, Pyridiniummethyl-, kernsubstituierte Pyridiniunmethyl-, Thiouroniummethyl-, Amidinothiomethylreste, in denen die beiden Stickstoffatome mit 1 bis 3 Alkylresten substituiert sein können, Aminothiocarbonylthiomethyl-, N-substituierte Aminothiocarbonylthiomethyl-, Aroylthiomethylreste, verschiedene Oxythiocarbonylthiomethyl-Einheiten, AIkarylsulfonylmethyl-, Azidomethyl-, Aminomethyl-, Amidomethyl-, Folyhydroxybßnzyl-, N-niedrig-Alkylindol-3-ylmethyl- oder Thiocyanatomethylreste substituiert ist.

2. Verbindung der Formel

HOOC-CH- (CH₂)J-CHH-

2 <f

COOH

worin R Wasserstoff, einen Halogen-, Hydroxy-, niederen Alkanoyloxy-, aromatischen Carbonyloxy-, heterocyclischen Carbonyloxy-, Aralkanoyloxy-, Cycloalkancarbonyloxy-, a-Methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxy-, α-i'Iethoxy-phydroxycinnamoyloxyrest; einen Carbamoyloxyrest der Pormel -00CIiR¹R², worin R*¹ und R² Wasserstoff, niedere Alkyl-, Halogen-niedrig-alkyl-, niedere Alkoxycarbonyl-,

- 182 -

109833/18 3.6

ORIGINAL INSPECTED

W05 210985 A

Aryl-, Alkarylsulfonyl-, Benzhydrylreste oder zusammen mit dem-Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Eeterocyclus aus Pyrrolidi "-.yl-, Piperidino- oder Morpholinoring bedeuten; einen 'Ihiorest der Formel -SE-', worin E* einen niederen Alkylrest oder einen Heterocyclus aus Pyridyl-, alky!substituiertem Thiazolyl-, 1,3,4-5Dliiadiazol-2-yl-, alkyl substituiert em 1,3,4-Thiadiazol-2-yl-, 2-Benzοthiazolyl- oder 4-niedrig-

darstellt^

Alky lpyrimi din-2-ylnngjxri-ni edrig-alkylammoniumrest;

einen Pyridiniumrest der Formel:

worin X ein Wasserstoffatom, einen Halogen-, Trifluor methyl-, Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkylcarbasioyl-, Ν,Ιί-Di-niedrig-alkylcarbamoyl-, Carboxymethyl-, niederen Alkanoyl-, niederen Alkyl-, Hydroxymethyl- oder Sulforest darstellt; Thiouroniumrest; einen Aniidinothiorest der Formel:

-S-C

worin E , E^ und E Wasserstoff oder niedere Alkylreste darstellen; einen Aminothiocarbonylthiorest der Formel

-SCNE⁷E⁸ ,

rp Q

worin E' und E V/asserstoffatome, niedere Alkyl-, Hydroxy-niedrig-alkyl-, Di-niedrig-alkylamino-niedrigalkyl-, Horpholino-niedrig-alkyl-, N-Aryl-iT-niedrig-

- 183 -

1 G & : ."./1836

alkylaminoaTEcyiN oder zusammen mit dem Stickstoffatom,
an das sie gebunden sind, einen Heterocycles aus
Morpholino-, Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder Piperazinorest der Formel^-darsteilen:

\J

worin E⁷ einen niederen Alkyl- oder Phenylrest darstellt; Aroylthiorest; einen Oxythiocarbonylthiorest der Formel:

-SCOR¹⁰ ,

10
worin E einen niederen Alkyl- oder niederen Cycloalkylrest darstellt; Alkarylsulfonylrest; Azidorest; Amino- oder einen Amidorest der Formel:

-EHE¹¹ ■ ,

worin E einen niederen Alkanoyl- oder Aralkanoylrest darstellt; Polyhydroxyphenylrest; N-niedrig-Alkylindol-3-yl- oder Thiocyanatorest bedeutet, und deren nichttoxische, pharmakologisch-verträgliche Salze, Ester und Amide, Honoalkylamide, Ilialkylamide, Aralkylamide und stickstoffhaltige, heterocyclische Amid-Derivate.

3· Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass R einen niederen Alkanoyloxy-, aromatischen Carbonyloxy-, 4-Pyridylcarbonyloxy-, Aralkanoyloxy-, Cyclopentancarbonyloxy-, Cyclohexancarbonyloxy-, a-Methoxy-psulfooxycinnamoyloxy- oder a-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxyrest bedeutet.

10983 3/1836

4-. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass

1 2
E einen Carbamoyloxyrest der Formel: -OQCNR¹R bedeutet,

1 2

worin R und R , die gleich oder verschieden sind, Wasserstoff ,niedere Alkyl-, Halogen-niedrig-alkyl-, niedere Alkoxycarbonyl-, Phenyl-, p-Tolylsulfonyl-, Benzhydrylreste oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie
gebunden sind, einen Heterocyclus aus Pyrrolidinyl-,
Piperidino-oder Morpholinrest darstellen.

5· Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass R einen Rest der Formel:

f/

bedeutet, worin X ein Wasserstoff atom, einen Halogen-,
Trifluormethyl-, Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkylcarbamoyl-, N,N-Di-niedrig-alkylcarbamoyl-, Carboxymethyl-, niederen Alkanoyl-, niederen Alkyl-,
Hydroxymethylrest oder Sulforest bedeutet.

6. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass R einen Rest der Formel:

-s-c

bedeutet, worin R , BS und R Wasserstoffatome oder
niedere Alkylreste darstellen.

7. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass .R einen Rest der Formel:

- 185 -

109839/1836

-SCKR'R^ö

rj ο

"bedeutet, worin E' und E Wasserstoffatome, niedere Alkyl-, Hydroxy-niedrig-alkyl-, Di-niedrig-alkylaminoalkyl-, N-Phenyl-N-niedrig-alkylaminoalkylreste oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus aus Morpholino-, Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder einem Piperazinorest der JFormel:

bedeuten, worin Ή/ einen niederen Alkyl- oder Phenylrest darstellt.

8. Verbindung nach Anspruch 2,der Formel:

HOOC- CH- ( CH₂ ) ₃- C-HH-

COOH

worin R einen Hydroxy-, niederen Alkanoyloxy-, Carbamoyloxy- oder !!,li-Di-niedrig-alkylcarbamoyloscyrest bedeutet, und deren Salze, Ester und Amid-Derivate.

9. Verbindung nach Anspruch 8, worin E einen Carbamoyloxyrest bedeutet und deren Alkali- und Erdalkalisalze.

10. Mononatriumsalz der Verbindung nach Anspruch 9·

- 186 -

10983 9/1836

11. Verbindung nach Anspruch 8, worin E einen N,N-Dimethylcarbamoyloxyrest bedeutet.

12. Verbindung nach Anspruch 8, worin R einen Hydroxyrest bedeutet.

13- Antibiotisches Gemisch, das durch Züchtung eines neuen Stamms von Streptomyces griseus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei, Streptomyces cinnamonensis oder Streptomyces chartreusis in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen erhalten wurde.

Antibiotisches Gemisch, gekennzeichnet durch 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoaloxymethyl )-7-methoxy-3-cephem-4—carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxyp-hy droxy cinnamoy loxym ethyl )-7-methoxy-3-c ephem-4-carbonsäure.

Verbindung nach Anspruch 2 der Formel:

0 OCH, - HOOC-CH-(CH₂)^-C-NH-

COOH

worin R einen Hydroxy-'oder Sulfooxyrest bedeutet, und deren nicht-toxische, pharmazeutisch-verträgliche Salze, Ester und Amid-Derivate.

12 16. Produkt nach Anspruch 15, worin R einen Sulfooxyrest bedeutet, und dessen Alkali- und Erdalkalisalze.

- 187 -

1 09833/1838

12 17· Produkt nach Anspruch 15? worin E einen Hydroxyrest "bedeutet, und dessen Alkali- und Erdalkali salze.

18. Natriumsalz der Verbindung nach Anspruch 16.

19. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt von 15 bis 700 mg einer Verbindung der folgenden Formel in einem pharmazeutisch-verträglichen Träger:

QCH₃

HOOC

- CH- ( CH₂ ) ₅- CEH-

COOH

worin E ein Wasserstoffatom, einen Halogen-, Hydroxy-, niederen Alkanoyloxy-, aromatischen Carbonyloxy-, heterocyclischen Carbonyloxy-, Aralkanoyloxy-, Cycloalkancarbonyloxy-, a-Methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxy-, a-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxyrest; einen Carbamoyl-

1 ? 1 2

oxyrest der Formel: -OOCNR R , worin E und E Wasserstoff, niedere. Alkyl-, Halogen-niedrig-alkyl-, niedere. Alkoxycarbonyl-, Aryl-, Alkarylsulfonyl-, Benzhydrylreste oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus aus Pyrrolidinyl-, Piperidino- oder Horpholinoresten darstellen; einen Thiorest der Formel: -SR-^, worin E^ einen niederen Alkylrest oder einen Heterocyclus aus Pyridyl-, alkylsubstituiertem Thiazolyl-, 1,3,4—Thiadiazol-2-yl-, alkylsubstatuiertem 1-3,4-Thiadiazol-2-yl-, 2-Benzothiazolyl- oder 4-niedrig-Alkylpyrimidin-2-ylrest darstellt; einen Tri-niedrig-alkylammoniumrest; einen Pyridiniumrest der Formel:

- 188 -

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/r *■

worin X Wasserstoff, einen Halogen-, Trifluormethyl-, Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkylcarbamoyl-, NjN-Di-niedrig-alkylcarbamoyl-, Carboxymethyl-, niederen Alkanoyl-, niederen Alkyl-, Hydroxymethyl- oder SuIforest darstellt; Ihiouroniumrest; einen Ami dinothior eist der Formel

worin E , E-⁷ und E Wasserstoff oder niedere Alkylreste darstellen; einen Aminothiocarbonylthiorest der Formel:

rp ο

worin E' und E Wasserstoff, niedere Alkyl-, Hydroxy-.niedrig-alkyl-, Di-niedrig-alkylaiaino-niedrig-alkyl-, Mo rpho Ii no-niedrig-alkyl- , N-Aryl-F-niedrig-alkylaminoalkylreste oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus aus Morpholino-, Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder einem Piperazinorest der Formel:

-N Y-E⁹

N /

worin e" einen niederen Alkyl- oder Phenylrest bedeutet, darstellen; Aroylthiorest; einen üxythiocarbonylthiorest der Formel:

- 189 109839/1836

ίο

worin R einen niederen Alkyl- oder niederen Cycloalkylrest darstellt} Alkarylsulfonylrest; Azidorest; Amino- oder einen Amidorest der Formel:

-KHR¹¹ ,

worin R einen niederen Alkanoyl- oder Aralkanoylrest darstellt; Polyhydroxyphenylrest; ΪΓ-niedrig-Alkylindol-J-yl^est oder Thiocyanatorest bedeutet, und/oder deren nicht-toxischen, phanaakologisch-verträglichen Salzen, Estern und Amiden, Mono-alkylamiden, Di-Alkylainiden, Aralkylamiden und stickstoffhaltigen, heterocyclischen Amid.-Derivaten.

20. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an etwa 15 bis 700 mg 7ß-(D-5-^Aniio-0-5-cart>oxyvaleramido)-7-methoxy-3-cephem-4--earbonsäure, die in der 3-S"fcellung durch eine Eydroxymethyl-, niederen Alkanoyloxyniethyl-, Carbamoyloxymethyl- oder einen NjN-Di-niedrig-alkylcarbamoyloxymethylrest substituiert ist, und/oder deren Salzen, Estern und Amid-Derivaten und einen pharmazeutisch-verträglichen Träger.

21. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 7ß-(I^5-Aiaino-5-carboxyvalerainido)-3-(carbamoyloxymethyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure oder deren Salz in einer Konzentration von wenigstens 1 bis 2-«-g/ml, bestimmt nach der Scheiben-Plattenuntersuchung mit Vibrio percolans, und einen pharmazeutisch-verträglichen Träger.

22. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen

- 190 -

109839/183

Gehalt von etwa 15 ^g bis 700 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxy valeranii do )-3- (α-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4— carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido )-3- (a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7~methoxy-3--cephem-4--carbonsäure oder einem Gemisch davon oder einem Salz, Ester und/oder Amid-Derivat dieser Verbindungen und einen pharmazeutisch-verträglichen Träger.

23· Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc~methoxyp-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure oder deren Salz bei einer Konzentration von wenigstens 2 bis 4 ^₁ g/ml, bestimmt nach der Scheiben-Plattenuntersuchung mit Proteus vulgaris, und einen pharmazeutisch-verträglichen Träger.

24. Verfahren zur Herstellung einer 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, dadurch gekennzeichnet, dass ein zur Entwicklung einer 7-Methoxy-3-cephem-4— carbonsäure befähigter Tükroroganismus in einem wässrigem liährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.

25· Verfahren nach Anspruch 24 zur Herstellung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, dadurch gekennzeichnet, dass ein zur Erzeugung des gewünschten Produktes befähigtes neues Actinomycet in einem wässrigen Fährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25* dadurch gekennzeichnet, dass als Actinomycet Streptomyces lactamdurans verwendet wird.

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27· Verfahren nach Anspruch 25? dadurch gekennzeichnet, dass ein wässriges Nährmedium verwendet wird, das zwischen etwa 1 und 6 Gew.% Kohlehydrat und zwischen etwa 0,2 und 6 Gew.% verfügbaren Stickstoff enthält.

28. Verfahren nach Anspruch 25? dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 37° ^c durchgeführt wird.

29· Verfahren nach Anspruch 25 ₅ dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des wässrigen Nährmediums im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 liegt.

30.. Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus 7-ß-(D~5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure und 7ß-(ß-5-Amidno-5-carboxyvaleramido)-3-(cc-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, dadurch gekennzeichnet, dass ein zur Erzeugung des gewünschten Produktes befähigtes Actinomycet in einem wässrigem lahrmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass als Actinomycet ein neuer Stamm von Streptomyces gri-

f seus, Streptomyces viridochroraogenes, Streptomyces

fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei, Streptomyces cinnamonensis oder Streptomyces chartreusis verwendet wird.

32. Verfahren nach Anspruch 3I, dadurch gekennzeichnet, dass als Actinomycet ein neuer Stamm von Streptomyces griseus verwendet wird.

33· Verfahren nach Anspruch $0, dadurch gekennzeichnet, dass

- 192 -

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A3

ein wässriges Uährmedium verwendet wird, das zwischen etwa 1 und 6 Gew.% Kohlehydrat und zwischen etwa 0,2 und 6 Gew.% verfügbaren Stickstoff enthält.

34. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei einer !Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 37° C durchgeführt wird.

35· Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des wässrigen Bährmediums im Bereich von •etwa 5,5 bis 8,0 liegt.

36. Verfahren zur Herstellung eines Salzes der 7ß

Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, dadurch gekennzeichnet, dass ein Biester der 7ß-(I⁾-5-Aniino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, in der die 5-Aminogruppe blockiert worden ist, mit einem Mtrosylhalogenid unter Herstellung des entsprechenden Diesters der 7ß-(D-5-Amino-5-cärboxyvaleramino)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure behandelt wird, die dann der katalytisehen Hydrierung und der Behandlung mit einem Entblockierungsmittel unter Erzielung des gewünschten Produktes unterworfen wird.

37· Verfahren zur Herstellung eines Salzes einer Verbindung der Formel:

HOOC-CH-(CH₂)₅-C-3m-( S N O

LK A. CHoOCN

ΝΗ_Λ jj* ^ sy* tL

- 193 -

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15 16
worin R ^ und R niedere Alkylreste oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen mononuklearen Heterocyclus aus Pyrrolidin, Piperidin oder Morpholin bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass ein Diester der 7ß-(D-3M^mino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4--carbonsäure, in der die 5--^A-minogruppe blockiert worden ist, mit einem Carbonylhalogenid und dann mit einem geeigneten primären oder sekundären Amin unter Erzielung des entsprechenden Diesters der 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-c ephem-4— carbonsäure behandelt wird, die nach Verseifung und Behandlung mit einem Deblockierungsmittel das gewünsche Produkt ergibt.

38· Verfahren zur Herstellung eines Salzes einer Verbindung der Formel:

COOH

17
worin R einen niederen Alkyl-, Halogen-niedrig-alkyl-, niederen Alkoxycarbonyl-, Aryl-, Alkarylsulfonyl- oder Benzhydrylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass ein Disalz oder Diester der 7ß-(D-5- Amino-5-carboxyval erami do )- 3- (hy dr oxymethy 1) - 7-m ethoxy- 3- c ephem-4-carbonsäure, in der die 5-^i¹¹⁰S¹¹¹PPe blockiert worden ist, mit dem entsprechenden Isocyanat behandelt wird, anschliessend das erhaltene Diester-Zwischenprodukt verseift wird und mit einem Deblockierungsmittel unter Erzeugung des gewünschten Produktes behandelt wird.

- 194 -

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39· Verfahren zur Herstellung eines Salzes einer Verbindung der Formel:

-C

OCH

HOOC-QH-(CH₂)x-CKH^

-CH^OCR

,18

COOH

worin E einen niederen Alkyl-, Arylrest, einen mononuklearen, stickstoffhaltigen Heterocyclus, einen Aralkyl- oder Cycloalkylrest darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass ein Diester der 7ß(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, in der die 5-Aminogruppe blockiert worden ist, mit dem entsprechenden Acylhalogenid behandelt wird, anschliessend das erhaltene Liester-Zwischenprodukt verseift wird und mit einem Entblockierungsmittel unter Erzielung des gewünschten Produktes behandelt wird.

40. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:

HOOC-CH-

HIL

QCH

COOH

- PO

in der ü einen Amidinothiorest der Formel:

-S-C

- 195 -

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in der R , R^ und R Wasserstoff oder niedere Alkylreste darstellen·, einen Thiorest der Formel: -SR , worin R·^ einen niederen Alkylrest oder einen Heterocyclus aus Pyridyl-, alkylsubstituiertem Thiazolyl-, 1,3,4-!Thiadiazol-2-yl-, alkylsubstituiertem 1,3i4— Thiadiazol-2-yl-, 2-Benzothiazolyl- oder 4~niedrigalkylpyrimidin-2-ylrest darstellt} einen Aminothiocarbonylthiorest der iOrmel:

worin R' und R Wasserstoff, niedere Alkyl-, Hydroxyniedrig-alkyl-, Di-niedrig-alkylamino-niedrig-alkyl-, Morpliolinot-niedrig-alkyl-, N-Aryl-N-niedrig-alkylaminoalkylreste oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus aus Horpholino-, Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder einem Piperazinorest der Formel:

/Λ 9

darstellen, worin B7 einen niederen Alkyl- oder Phenylrest bedeutet; Aroylthiorest; einen Oxythiocarbonylthiorest der Formel:

-SCOR¹⁰ ,

10
worin R einen niederen Alkyl- oder niederen Cycloalkylrest darstellt; Alkarylsulfonylrest; Azidorest; Polyhydroxypnionylrest; N-niedrig-Alkylindol-J-ylrest; Tri-niedrig-alkylammoniuni- oder Pyridiniunrest der Formel:

- 196 -

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worin X ein Wasserstoffatom, einen Halogen-, Trifluor- · methyl-, Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkylcarbämoyl-, IT, N- Di-niedrig- alkyl carbamoyl-, Carboxymethyl-, niederen Alkanoyl-, niederen Alkyl-, Hydroxymethylrest oder Sulforest darstellt, bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass 7ß(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(acyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure mit dem entsprechenden Thioharnstoff, N-substituierten Thioharnstoff, N,N-disubstituierten Thioharnstoff, Thiol, Dithiocarbamat, Thiobenzoesäure, Dithiocarbo-.xylat, Alkalisulfinat, Azid, Polyhydroxybenzol·,· 2T-niedrig-Alkylindol, Tri-niedrig-alkylamin oder Pyridin behandelt wird.

41. Verfahren nach Anspruch 39» dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial eine 7ß-(D-5-Amino-5--carboxyvaleramido)-3~(ni edrig-alkanoyloxymethyl)-7-methoxy-3-c ephem-4—carbonsäure verwendet wird.

42. Verfahren nach Anspruch 39·> dadurch gekennzeichnet, dass •als Ausgangsniaterial eine 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(acetoxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure verwendet wird.

43· Verfahren nach Anspruch 39» dadurch gekennzeichnet, dass die so erhaltene 7ß-(Ö-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure unter 'Bildung der entsprechenden 7ß-(D-5-Aniino-5-carboxyval erami do) - 3-( aminoniethyl)-7-Diethoxy-3-c ephem-4-carbonsäure reduziert wird.

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44. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der i'ornel:

HOOC-CH- (CH₂) ,-ClIB

45-

11
worin R einen niederen Alkanoyl- oder Aralkanoylrest darstellt» dadurch gekennzeichnet, dass eine 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(aminomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure mit dem entsprechenden Acylhalogenid behandelt wird.

Verfahren zur Herstellung von 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerami do )-3-niethyl-7-niethoxy-3-CePhCDi-^-CaTbOnSaUrO, dadurch gekennzeichnet, dass 7ß-(I⁾-5-^nii°.o-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure oder ein Salz dieser Säure reduziert wird.

46. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:

0 OCE₇₅ ' 3

HOOC-CH-

-CH-NH,

COOH

worin E einen Thiouronium-, Azido-, Thiazolylniercapto-, Thiadiazolylmercapto-, 3-^f^ki°cyanatorest oder einen Eest der JOnael:

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-S-C

darstellt» dadurch gekennzeichnet, dass ?ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3~(carbamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-cepheni~4—carbonsäure mit dem entsprechenden Thioharnstoff, Alkaliazid, Mercaptothiazol, Mercaptothia*- diazol, Alkalithioxyanat·, 2T-substituiert en Thioharnstoff oder N,N~disubstituierten Thioharnstoff behandelt wird.

47- Verfahren zur Herstellung von 7ß-(D-5~Aniino-5-carboxyvaleranido )-3-(aminomethyl)-7-niethoxy-3-cepheia-4-carbonsäure, dadurch gekennzeichnet, dass 7&-(B-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethy1)-7-methoxy-3"-cepheui-4-carbonsäure reduziert wird.

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