DE2513855C2 - Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

2. Verfahren zur Herstellung der Substanz MM und ihrer Salze nach Anspruch I durch Züchten von Streptomyces olivaceus ATCC 21 379, ATCC 21 380, ATCC 21 38!, ATCC 21 382 oder ATCC 31 126 und Bildung des MM 4550-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des MM 4550-Komplexes chromatographisch in Fraktionen unterteilt und aus den ein ausgeprägtes UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm zeigenden reinen Fraktionen die Substanz MM 4550 oder ihre Salze isoliert.

3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Substanz M 4550 oder durch Salze nach Anspruch 1.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an Penicillin oder Cephalosporin.

Nach den Ausführungen in der GB-PS 13 63 075 kann man wertvolle β Lactamase-Hemmstoffe durch Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces olivaceus erhalten. Bisher hat man angenommen, daß das in dieser GB-PS 13 63 075 beschriebene Produkt im wesentlichen rein ist. Es ist jedoch gefunden worden, daß dies nicht der Fall ist, und daß man aus diesem Produkt in geringer Menge einen Bestandteil isolieren kann, der eine außerordentlich starke /3-Lactamase-Hemmwirkung besitzt. Diese neue Substanz wird als »MM 4550« bezeichnet, und man nimmt an, daß sie größtenteils für die jJ-Lactamase-Hemmwirkung bei dem Produkt gemäß der GB-PS 13 63 075 verantwortlich ist, obwohl die Substanz nur zu einem sehr geringen Teil für die antibakterielle Wirksamkeit verantwortlich ist, die dieses Produkt zeigt. Selbstverständlich umfaßt die vorliegende Erfindung nichts, was in der GB-PS 13 63 075 hinsichtlich des dort genannten Produkts beansprucht ist. Es sind auch andere ^-Lactamase-Hemmstoffe bekannt, die durch Streptomyces-olivaceus-Stämme erzeugt werden, wie sie z. B. in der DE-OS 23 40 005 beschrieben sind, jedoch weisen diese bekannten Substanzen keine starke /J-Lactamase-Hemmwirkung wie die praktisch reine Substanz MM 4550 aui.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist nun diese Substanz MM 4550 und ihre Salze mit den kennzeichnenden Merkmalen, daß

a) die feste Carbonsäure M 4550 in Form ihres praktisch reinen Natriumsalzes die folgenden Eigenschaften besitzt:

aa) leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform. Diäthyl äther und Kohlenwasserstoffen;

ab) in wäßriger Lösung ein Ultraviolett-Spektrum mit Absorptionsmaxima bei etwa 238 nm und etwa287 nm;

ac) zu 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch zubereiteten KBr-Platte ein Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u. a. bei etwa 3450. 2950. 1765, 1695, 1510. 1390 und 1260cm-'; nach etwa 1 Woche seit der Herstellung der KBr-Platte ist das zuvor breite Maximum bei etwa 1765cm ■' beträchtlich abgebaut oder verschwunden;

ad) aufgenommen in deuteriertem Wasser, zeigt das NMZ-Spektrum ein Paar Niederfeld-Dubleiten mit ihrem Zentrum bei etwa 2.45 r und 3.6) r mit Kopplungskonsianten bei etwa 15 Hz. ein Dublett mit dem Zentrum bei etwa

8,55 τ und ein scharfes Singulett bei etwa 7,95 r;

ae) die Aminosäuren-Analyse zeigt, daß die Substanz kein Polypeptid ode- Protein ist; nach saurer Hydrolyse findet man keine a-Aminoadipinsäure;

af) die Substanz reagiert mit einem Reagens der folgenden Zusammensetzung: 300 mg 4-Dimethylaminobenzaldehyd gelöst in einem Gemisch von 54 ml n-ButanoI, 9 ml Äthanol und 9 ml konzentrierter Salzsäure, wobei eine blaue Farbe auf dem Papierchromatogramm und auf den Folien des Dünnschichtchromatogramms erzeugt wird;

ag) die Substanz ist kein allgemeines Enzymgift und hemmt nicht die nachstehenden Enzyme bei Konzentrationen, die höher sind als zur Hemmung der /?-Lactamase von Escherichia coli, durch Monoamininoxidase, Carbonsäureanhydrase, Dopadecarboxylase, Trypsin, Chymotrypsin oder Urease erforderlich ist, und

3) das reine Dinatriumsalz

ba) bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit den nachstehenden Lösungsmitteln die Rf-Werte aufweist:

Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7 :7 : 6. Ri = 0,6;

Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7 :3, Rf = OJ;

n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumenverhältnis? :7 :6. Rt = 0,7;

n-Propanol/Wasser im Volumenverhältnis 4 : Keinen Ri = 0,6;und

bb) die wäßrige Lösung Ultraviolett-Absorptionsmaxima bei etwa 238 und bei etwa 287 nm aufweist.

Bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel (»Merck F. 254«) weist das Dinatriumsalz der Substanz MM 4550 bei den nachstehenden Lösungsmittelsystemen die angenäherten Ri-Werte auf:

(e) n-Propanol/0,l-m Phosphatpuffer vom pH 7 im Volumenverhäitnis 7 : 3 einen Ri-Wert von 0,6 und

(f) n-Butanol/Methanol/Wasser im Volumenverhältnis 4 : 1 : 2 einen Ri-Wert von 0,6.

Das praktisch reine Dinatriumsalz der Substanz MM besitzt den (nachstehend näher beschriebenen) lio-Wert von unter 0,0001 μg/ml gegenüber der j3-Lactamase von Escherichia coli B11.

Man kann die Substanz MM 4550 auch als Schwefel enthaltende Substanz mit /ü-Lactamase-Henmwirkung charakterisieren, die durch Züchten von Streptomyces olivaceus ATCC 21 379, 21 380, 21 381. 21 283 oder 126 erzeugt wird.

Für das als MM 4550 bezeichnete Antibiotikum konnte nachträglich die nachstehende Formel Il gesichert werden:

CH,

HO.SO

O T	H /	-C	O-	CH,
S^	/ \
	VNH

Cf)-H

In der Zeichnung bedeutet

Fig. 1 das UV-Spektrum des Dinatriumsalzes der Substanz MM 4550 in wäßriger Lösung;

Fig.2 das IR-Spektrum des Dinatriumsalzes der Substanz MM 4550;

Fig.3 das NMR-Spektrum des Dinatriumsalzes der Substanz MM 4550.

Das Dinatriumsalz der Substanz MM 4550 besitzt eine antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche Spezies, u. a. gegen Stämme von Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescens und Shigella sonnei.

Wenn die Substanz mit Ampicillin vermischt wird, weist sie eine synergistische Wirksamkeit gegen i^rj Organismen auf, wie Stämme von Escherichia coli, Kiebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Staphylococcus aureus Rüssel:

Die Substanz MM 4550 neigt zur Instabilität, wenn sie in Form der freien Säure vorliegt. Demgemäß sind die Salze der Substanz MM 4550 bevorzugt. Zweckmäßigerweise sind die Salze der Substanz MM 4550 dibasische Salze. Am gebräuchlichsten werden diese Salze mit pharmakologisch verträglichen ionen, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium-, in üblicher Weise substituierten Ammoniumionen, und dergleichen, gebildet. Besonders bevorzugte Salze sind die Alkalimetallsalze, wie die Natrium- und Kaliumsalze, z. B. das Dinatrium- oder das Dikaliumsalz.

Zweckmäßigerweise weist ein Präparat mit der jo Substanz MM 4550 und ihren Salzen gemäß vorliegender Erfindung einen Reinheitsgrad von mindestens 50 Prozent, besser von mindestens 70 Prozent auf und vorzugsweise von mindestens 80 Prozent, z. B. von 90 bis 100 Prozent auf.

i-i Einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung bilden Arzneimittel, die durch einen Gehalt an der erfindungsgemäßen Substanz MM 4550 oder deren Salzen gekennzeichnet sind. Gegebenenfalls können sie zusammen mit pharmakologisch verträglichen Träger- ·»<> stoffen und/oder Verdünnungsmitteln eingesetzt werden.

Am zweckmäßigsten enthalten die erfindungsgemäßen Arznemiiuel das Natrium- oder Kaliumsalz der Substanz MM 4550, z. B. das Dinatrium- oder das ·>"' Dikaliumsalz der Substanz MM 4550.

Derartige Arzneimittel können in Form zu einer oralen, lokalen oder parenteralen Anwendung vorliegen, z. B. können sie als Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupe, rekonstituierbare Pulver und in sterilen Formen "'" für Injektions- oder Infusionszwecke verwendet werden. Derartige Arzneimittel können übliche pharmakologisch vertragliche Substanzen, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Farbstoffe, Geschmackstoffe, Konservierungsmittel, Zerfallsmittel und dergleichen in Über-"'"' einstimmung mit der üblichen pharmazeutischen Praxis in der bei der Formulierung von Antibiotika, wie Penicillinen und Cephalosporine!!, bekannten Art und Weise enthalten.

Die Substanz MM 4550 oder ihre Salze können in den b" Arzneimitteln vorliegender Erfindung als einziger Wirkstoff oder auch zusammen mit einem /?-Lactam-Antibioiikum vorliegen. Geeignete ß-\ .actam-Antibiotika umfassen solche bekannte Substanzen, die gegenüber , ;i-Lactamasen emplindlich sind und auch eine gewisse ¹^ eigene Widerstandsfähigkeit gegen /M.actainasen besitzen. Beispiele derartiger /M.actam-Antibiotika sind Ampicillin. Amoxicillin. Benzylpenicillin. Plicni'\\me-(II) thylpeiiieilliii. Propicillin. Cephaloridin. Cefoxitin, Ce-

phaloihin, Cephalexin, Carbenicillin, Ticarcillin und in vivo hydrolysierbare Ester solcher Verbindungen, wie die Phenyl-, ToIyI- oder lndanylester von Carbenicillin oder Ticarcillin oder die Acetoxymethyl-, Trimethylacetoxymethyl- oder Phthalidylester von Ampicillin, Benzylpenicillin, Amoxycillin, Cephaloridin, Cephaloglycin und dergleichen.

Das Verhältnis der Substanz MM 4550 oder ihre Salze zu dem ^-Lactam-Antibiotikum liegt normalerweise zwischen 10:1 und 1 : 10, z. B. zwischen 3 : 1 und 1 : 3.

Die Gesamtmenge der antibakteriellen Mittel in beliebigen Einzeldosierungen liegt normalerweise zwischen 50 und 1500 mg und gewöhnlich zwischen 100 und 1000 mg.

Bevorzugte Einzcldosicrungcn nach vorliegender \'> Erfindung können einmal oder mehrere Male täglich, z. B. 2 bis 4mal täglich, zur Behandlung von Erkrankungen der Harnwege, der Atmungswege, der Weichteile und dergleichen, verabreicht werden. Die Arzneimittel können zur Behandlung von Erkrankungen, wie Bronchitis, Gonorrhoe, Mittelohrenentzündung, Brustentzündungen und dergleichen, verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Substanz MM 4550 und ihrer Salze durch Züchten von Streptomyces olivaceus ATCC 21 379, ATCC 23 180, ATCC 21 381, ATCC 21 382 oder ATCC 31 126 unter Bildung des MM 4550-Komplexes, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung des MM 4550-Komplexes chromatographisch in Fraktionen unterteilt und aus den ein Jo ausgeprägtes UV-Absorptionsspektrum bei etwa 285 nm zeigenden reinen Fraktionen die Substanz MM 4550 oder ihre Salze isoliert.

Der Ausdruck »ein ausgeprägtes UV-Absorptionsspektrum bei etwa 285 nm zeigenden« bedeutet, daß entweder die einzige in dieser Lösung vorliegende antibiotische Substanz die Substanz MM 4550 oder deren Salze ist oder daß, wenn irgendeine andere antibiotische Substanz vorhanden sein soll, dann diese Substanz in einer geringeren Menge als die Substanz «o MM 4550 oder deren Salze vorhanden ist. Zweckmäßigerweise liegt die Substanz MM 4550 oder ihre Salze in einer Menge von 70 Prozent noch zweckmäßigerweise in einer Menge von 80 Prozent und vorzugsweise in einer Menge von 90 bis 100 Prozent in der Fraktion vor. Es ist gefunden worden, daß ein anwendbares Verfahren zur Bestimmung, welche Fraktionen hauptsächlich eine Lösung der Substanz MM 4550 oder deren Salz enthalten, in der Überwachung des UV-Absorptionsspektrums jeder Probe liegt. Derartige Fraktionen, die so ein UV-Spekirum ähnlich dem der F i g. 1 zeigen, enthalten normalerweise die Substanz MM 4550 oder deren Salze im wesentlichen frei von anderen antibiotischen Substanzen, wie der nachstehend beschriebenen Substanz MM 13 902. Gewöhnlich weisen diese Fraktionen die gewünschte Reinheit auf.

Normalerweise wird das Herstellungsverfahren zur Isolierung der Substanz MM 4550 als dibasisches Salz angewendet. Wenn man jedoch die Herstellung eines monobasischen Salzes der Substanz MM 4550 oder gar die freie Säure wünscht können diese Verbindungen durch Ansäuern des dibasischen Salzes der Substanz MM 4550 hergestellt werden, da gewöhnlich die monobasischen Salze der Substanz MM 4550 und die freie Säure der Substanz MM 4550 nicht in ausreichen- *>5 dem Maße stabil sind, um aus den Gemischen wie der nachstehend beschriebene MM 4550-Komplex isoliert zu werden. Diese monobasischen Salze und die freie Säure sind wegen ihrer geringen Stabilität nicht leicht erhältlich.

Wie bereits ausgeführt worden ist, wird angenommen, daß die chromatographische Isolierung der Substanz MM 4550 am besten unter Verwendung eines Salzes der Substanz MM 4550, wie des Dinatriumsalzes, durchgeführt wird. Die Salze der Substanz MM 4550 sind in wäßrigen Lösungsmittelsystemen löslicher als in stark lipophilen Lösungsmitteln, und demzufolge bevorzugt man die Verwendung wäßriger Lösungsmittelsysteme bei der chromatographischen Reinigung gemäß vorliegender Erfindung.

So haben sich annähernd neutral gepufferte wäßrige Lösungen von Elektrolyten als zweckmäßig zur Verwendung in Verbindung mit polaren Trägcrmaterialien, wie basischen lonenaustauscherharzen, gezeigt. Demzufolge kann eine mittels eines üblichen Puffers, wie einem Phosphatpuffer, auf einen ungefähren pH-Wert von 7 gepufferte wäßrige Lösung von Natriumchlorid in Verbindung mit Trägermaterialien verwendet werden, die tertiäre Aminogruppen oder quartäre Ammoniumgruppen enthalten. Es ist gefunden worden, daß basische Celluloseaustauscher und basische Austauscher auf Basis vernetzter Dextrane als Trägermaterialien zweckmäßig sind, insbesondere ein vernetztes Dextran, das unter der Bezeichnung »QAE-Sephadex A 25« bekannt ist, wenn das Lösungsmittelsystem aus einer 0,7-m Natriumchloridlösung in einem Phosphatpuffer vom pH 7 beseht.

Es haben sich auch Lösungsmittelsysteme, die aus Gemischen von Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie niederen Alkoholen, bestehen, als anwendbar in Verbindung mit inerten Trägermaterialien, wie Silikagel oder Cellulose, erwiesen. Ein besonders zweckmäßiges Lösungsmittelsystem zur Verwendung mit Cellulose ist ein Gemisch aus Wasser und Isopropanol, nämlich ein solches aus 7 Teilen Isopropanol und 3 Teilen Wasser.

Das Produkt nach den vorgenannten Verfahren unter Verwendung von lonenaustauscherharzen enthält jedoch häufig einen sehr hohen Anteil an Natriumchlorid, so daß es vorteilhaft ist, die vereinigten Lösungen zu entsalzen. Das Entsalzen kann dadurch bewirkt werden, daß man die Lösung durch eine Säule leitet, die ein lipophiles Material, an das die Substanz MM 4550 absorbiert wird, enthält, doch die nicht Natriumchlorid adsorbiert. Zweckmäßige Säulenmaterialien sind Polystyrole, wie »Aberlite XAD 4«. Gegebenenfalls kann eine Gelfiltration unter Verwendung von Filtrierhilfsmitteln angewendet werden, wie vernetzte Dextrane (»Sephadex G-25«), und rüiyäCTyiäitiiugcic v»L>iOg£i P2«). Aus diesen Säulen können die Antibiotika unter Verwendung von Wasser, wäßrigem Methanol oder dergleichen, eluiert werden.

Wenn die gewünschten Lösungen nach dem vorgenannten Verfahren erhalten werden, kann man die dibasischen Salze der Substanz MM 4550 in fester Form durch Entfernen des Lösungsmittels unter milden Bedingungen erhalten. Es wurde gefunden, daß ein geeignetes Verfahren zum Erhalten der festen Substanz im Eindampfen unter vermindertem Druck und Gefriertrocknen der vereinigten, die Substanz MM 4550 enthaltenen Fraktionen besteht

Gewünschtenfalls kann das Herstellungsverfahren in zwei oder mehreren Stufen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Lösung des MM 4550-Komplexes in Fraktionen aufgeteilt werden, die die Substanz MM 4550 oder deren Salze enthalten, welchletztere mit bis

zu ihrem eigenen Gewicht mit anderen Antibiotika verunreinigt sind. Die Fraktionen können gefriergetrocknet werden, um ein Material zu liefern, das z. B. zu 50 bis bO Prozent die Substanz MM 4550 oder deren Salz enthält, die man dann nochmals Chromatographien, um ein Material zu erhalten, das zu 90 bis 100 Prozent die Substanz MM 4550 oder deren Salze enthält.

In vorliegender Beschreibung wird der Ausdruck »MM 4550-Komplex« verwendet, um eine Substanz zu beschreiben, die ursprünglich als Substanz MM 4550 in der GB-PS 13 63 075 bezeichnet worden ist. Der MM 4550-Komplex, wie er bei der Wiederholung des Beispiels der GB-PS 13 63 075 erzeugt worden ist, ist ein unreines Material, das in unterschiedlichen Anteilen Saize von fvirvi ί3 902 (wie zuvor angegeben) und Saize der Substanz MM 4550 sowie erhebliche Mengen anderer Substanzen enthält. Der MM 4550-Komplex zeigt nicht das charakteristische UV-Spektrum der Substanz MM 4550. Der nachstehend erläuterte Uo-Wert des bei der Wiederholung des Beispiels der GB-PS 13 63 075 hergestellten MM 4550-Komplexes liegt gewöhnlich unter 0,0004 μg/ml. Das Verhältnis der Salze von MM 4550 zu den Salzen der Substanz MM 13 902 in dem MM 4550-Komplex scheint in hohem Maße variabel und deshalb abhängig von solchen Faktoren zu sein, wie dem verwendeten Organismusstamm und/oder den angewendeten genauen Isolationstechniken, doch ist im allgemeinen gefunden worden, daß der Komplex mehr MM 4550 als die Substanz MM 13 902 enthält. Die Herstellung des MM 4550-Komplexes wird nachstehend auch angegeben.

In der Beschreibung wird der Ausdruck »MM 13 902« zur Beschreibung der im wesentlichen reinen Substanz verwendet, die eine starke antibakterielle Wirksamkeit besitzt und die auch zu einem gewissen Grad eine /?-Lactamase-Hemmsubstanz ist. Die Eigenschaften von MM 4550 sind nachstehend näher erläutert.

Ein besonders bevorzugter Organismus zur Verwendung beim Verfahren vorliegender Erfindung ist Streptomyces olivaceus ATCC 31 126.

Der hier verwendete Ausdruck »züchten« bedeutet sorgsames aerobes Wachsen des Organismus in Gegenwart assimilierbarer Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Mineralsalzquellen. Ein derartiges aerobes Wachsen kann auf oder in einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Medium stattfinden, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Das Züchten kann auf einer aeroben Oberfläche oder submers stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammengesetzt sein oder kann chemisch definiert vorliegen. Es wurden Medium gefunden, die komplexe Nährstoffe enthalten, wie Hefeextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen, die besonders zweckmäßig sind. Es ist ferner gefunden worden, daß der Zusatz von Kobaltionen, Sulfationen und Calciumcarbonat vorteilhaft ist

Es ist gefunden worden, daß das Züchten bei einer Temperatur von 28 ± 2°C annehmbare Ausbeuten an dem Antibiotikum ergibt und daß man nach 2 bis 3 Tagen nach Beginn der Fermentation die Züchtung gewinnen kann.

Es ist gefunden worden, daß die Bestrahlung von Kulturen von Streptomyces olivaceus ATCC 21 379 mit anschließender Isolierung des erhaltenen Stammes, der die ausgedehnteste Aktivitätszone bei der nachstehend beschriebenen KAG-Probe zu erzeugen scheint, zur Isolierung von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 führte, der der bevorzugte Stamm zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung ist.

Für gewöhnlich sollen alle, zum Erhalten der gewünschten Antibiotika angewendeten Isolierungsund Reinigungsverfahren bei nicht erhöhten Temperatüren, z. B. unter 20⁰C und noch zweckmäßiger nicht oberhalb 12"C, stattfinden.

Die gewünschte Substanz wird gewöhnlich in der Hauptsache aus dem Kuliurfiltrat erhalten, so daß die bevorzugte Anfangsstufe bei dem Isolierungsverfahren

ίο im Entfernen festen Materials aus der Fermentationsbouillon, z. B. durch Filtrieren, ist.

Eine mit Verunreinigungen vermischte Zubereitung der Substanz MM 4550 oder deren Salze kann aus dem geklärten Kulturfiltrat erhalten werden, indem man die

is Substanz MM 4550 oder derer, Salze ar, ein aktives Material, wie Aktivkohle oder dergleichen, adsorbiert und danach die gewünschte Substanz von dem aktiven Material unter Verwendung eines Lösungsmittels, wie wäßriges Aceton, eluiert. Üblicherweise wird das Verfahren bei einem dibasischen Salz der Substanz MM 4550 durchgeführt.

Gegebenenfalls kann man eine verunreinigte Zubereitung der Substanz MM 4550 oder deren Salze aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion unter Verwendung eines lipophilen Ammoniumsalzes und eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels erhalten. Dies ist häufig wirkungsvoller als das zuvor beschriebene Verfahren. (Die Substanz MM 4450 kann auch als substituiertes Ammoniumsalz durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhalten werden.) Vorzugsweise wird dann die Ausgangslösung des substituierten Ammoniumsalzes der Substanz MM 4550 unter Verwendung einer Lösung eines Alkalimetalljodids, wie Natriumjodid, in die wäßrige Phase zurückextrahiert. Diese letztgenannte Verfahrensvariante führt im allgemeinen zur Herstellung einer wäßrigen Lösung eines unreinen dibasischen Salzes der Substanz Streptomyces olivaceus und verwandte Organismen besitzen die nachstehenden Haupteigenschaften:

(a) Sporenbildende Luftmycele entweder in der Grau-Reihe oder in der Gelb-Reihe;

(b) die Morphologie eines Sporenträgers entweder mit rektiflexiblen Sporen oder mit Spiralen;

(c) oberflächlich glatte Sporen und

(d) keine Melanin-Bildung.

Einige diese vorstehenden Eigenschaften besitzende Spezies sind in den Tabellen V bis IX aufgeführt.

Die zuvor beschriebeneu verunreinigten Formen der Substanz MM 4550 oder deren Salze werden gewöhnlich der vorgenannten Chromatographie unterworfen, um die reine Substanz zu erzeugen.

Iso-Bestimmung

Der Iso-Wert ist diejenige Menge an Substanz, die erforderlich ist, um eine 50prozentige Hemmung der Hydrolyse von Ampicillin durch das 0-Lactamase-Enzym von Escherichia coli B11 zu erzeugen, einem Organismus, der den die J3-Lactamase steuernden R-Faktor enthält Diese /J-Lactamase wird als Enzym vom Typ IHa gemäß der Klassifikation von Richmond and Sykes klassifiziert (vgl. Adv. in Microbiol. Physiol. 9 (1973). S. 31>

Die Geschwindigkeit der 0-Lactamase-Hydrclyse von Ampicillin zu seiner Penicillansäure kann mittels der Jodstärke-Probe verfolgt werden, bei der man die

Geschwindigkeit der Bildunp von Penicillansäure durch Entlernung des Jodstärke Komplexes mißt. Dieses Verfahren und die Herstellung der ß-Lactamase sind beschrieben in dem Aufsatz von M. Cole, S. Elson und P.D. Fullbrook in »Biochemical Journal« 127 (1972), S. 295 bis 308. Es wird eine geringfügige Modifikation des vorgenannten Verfahrens angewendet, indem eine Probe des Inhibitors mit dem Enzym 15 Minuten bei 37°C vorbebrütet wird, bevor es dem Ampicillinsubstrat zugegeben wird. Das Verfahren ist wie folgt:

Reagentien

Puffer

0,05-m Kaliumphosphaipuffer vom pH 7;

jodstärke-Lösung

hergestellt gemäß Novick in »Biochemical journal« 83 (1962), S. 236;

Substrat

40 μg/ml Ampicillin in der Pufferlösung;

jS-Lactamase-Enzym

hergestellt aus Escherichia coli BU gemäß CoIe

ίο

und Mitarbeiter »Biochemical Journal« 127 (1972). S. 295. Ein Verdünnen der Enzymzubereitung in der Pufferlösung erfolgt derart, daß man einen Abfall der optischen Dichte-Einheiten von etwa 0,3 auf 100 Sekunden bei der ungehemmten Reaktion erhält. Andere 0-Lactamase erzeuger,de Stämme von Eschierchia coli können verwendet werden, insbesondere solche, die den R-Faktor enthalten. z. B.»RTEM«.

Bedingungen

Die Reaktionen werden in einer 1 cm-Cuvette bei 37⁰C in einem »SP 800-Pye-UnicamM-Spektrophotometer durchgeführt. Dieses Instrument kann 4 Probecuvetten und die entsprechenden Cuvetten für Blindversuche tragen. Die erste Cuvette wird zur Kontrollreaktion verwendet und enthält keinen Inhibitor. Die zweite, dritte und vierte Cuvette werden mit verschiedenen Verdünnungen des Inhibitors eingesetzt.

Reagentien

Probe	Blindversuch
1,0 ml	1,0 ml
0.1 ml	-
0.3 ml	0.4 ml
0,1 ml	0.1 ml
1,0 ml	1,0 ml

Jodstärke-Reagens

E. coli-je-Lactamase

Puffer

Inhibitor des Puffers

Substrat (nach 15minütigem Bebrüten des vorstehenden Gemisches bei 37°C zugegeben)

Im Anschluß daran folgt die Aufzeichnung der Änderung der optischen Dichte bei 590 nm durch Messen der Geschwindigkeit der Reaktion als Änderung der optischen Dichte je 100 Sekunden während eines 3- bis 6minütigen Intervalls. Die Inhibitorprobe wird verdünnt, bis man eine Verdünnung erreicht, die 50 Prozent der bei der keinen Inhibitor enthaltenden Blindprobe gesehenen Reaktionsgeschwindigkeit entspricht.

Die KAG-Probe
(Klebsieila aerogenes-Penicillin G-Probt)

Die KAG-Probe ist eine Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von jS-Lactamase-lnhibitor in Fermentationsbouillons oder während der Isolierungsstufen. Der geschmolzene Nähragar wird bei 45°C mit einem geeigneten p-Laciamase ericugciiücn Sianim von Klebsiella aerogenes beimpft und dann mit einer ausreichenden Menge einer sterilen Lösung von Penicillin G vermischt, so daß man eine Konzentration von 6 μg/ml Penicillin G in dem Agar erhält. Der Agar wird dann in eine Petrischale gegossen. Nach seiner Verfestigung werden unter Verwendung eines Metallbohrers in gleichen Abständen zylindrische Bohrungen in die Schicht gebohrt. Dann werden in die Bohrungen die zu untersuchenden Lösungen eingebracht. Die Schale wird dann bei konstanter Temperatur zwischen 27 und 37°C bebrütet. Während der Bebrütungsdauer diffundieren die Inhibitoren in der zu untersuchenden Lösung aus den Bohrungen in den Agar und hemmen dort die Wirkung der durch die Klebsiella-Zellen erzeugten /Ϊ-Lactamase. Somit wird das Penicillin G vor dem Abbau durch J?-Laciamase geschützt und liegt in ausreichender Konzentration vor. um das Wachstum von Klebsiella zu verhindern. In denjenigen Teilen des Agars, in die der Inhibitor nicht in ausreichender Konzentration diffundiert ist. wird das Penicillin G durch die /J-Lactamase abgebaut, wodurch sich ein dichtes Wachstum von Klebsiella entwickelt. Es bilden sich somit klare Ringzonen einer Hemmung des Klebsiella-Wachstums um die den Inhibitor enthaltenden Bohrungen, wobei die Größe jeder Zone von der Inhibitorkonzentration in der zu untersuchenden Lösung abhängt. Die Stärke der Prüflösungen (in beliebigen Einheiten je ml) wird unter Bezugnahme auf die Standardlinie des Logarithmus der Inhibitorkonzentration gegenüber dem Zonendurchmesser erhalten.

Diese Versuchsanordnung kann auch für eine Bioautographie verwendet werden.

Herstellung des MM 4550-Komplexes, der mit dem
in der G B-PS 13 63 075 vergleichbar ist

Man züchtet Steptomyces olivaceus ATCC 21 379 7 Tage lang bei 28° C auf einem festen Schrägagar in einer Roux-Flasche. Der Agar hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile

Menge (g/Liter)

Hefe-Extrakt
^bD Glucose-monohydrat
Agar
Leitungswasser

10,0

10,0

15,0

ad 1 Liter

Zur Sterilisation wird das Medium auf pH 6,8 eingestellt. 50 ml steriles entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,02 Prozent eines Polyoxyäthylen-Sorbiian-Monooleats werden in die Roux-Flasche mu der ZüL-htung gegeben und dann die Sporen durch Schütteln suspendiert. Diese Sporensuspension wird dafn als Impfstoff zu 75 Liter eines sterilisierten Nährmediums in einem 100 Liter fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben. Das Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile

Menge (g/Liter)

Sojabohnenmehl

Glucosc-rnonohydrat

Leitungswasser

10,0

ad 1 Liter

Zur Steuerung des Schäumens werden 50 ml eines 10 Volumenprozent eines Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymerisats enthaltenden Sojabohnenöls vor der Sterilisation dem Fermentationsmedium zugesetzt.

Das Medium wird dann in dem Fermenter 20 Minuten bei 120⁰C durch Dampf sterilisiert. Die Nährlösung wird mit 340 UpM mittels eines Leitschaufelrührers mit 21,6 cm Durchmesser gerührt und durch eine offenendige Sprüheinrichtung mit 150 Liter steriler Luft/Minute versorgt. Das Züchtungsgefäß ist mit Prallblechen ausgerüstet. Die Temperatur wird auf 28°C eingeregelt. Nach einer 45stündigen Bebrütung unter diesen Bedingungen werden 7,5 Liter dieser Züchtungslösung als Impfstoff zu 150 Liter eines sterilen Fermentationsmediums in einen 300 Liter-Fermenter aus rostfreiem Stahl überführt. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile

Menge (g/Liter)

Sojabohnenmehl 10,0

Glucose-monohydrat 20,0

Kreide (gefälltes Calciumcarbonat) 0,2

Kobaltchlorid (CoCl₂ · 6 H₂O) 0,001

Leitungswasser ad ! Liter

Zur Schaumverhinderung werden 300 ml des 10 Volumenprozent des vorgenannten Blockpolymerisats enthaltenden Sojabohnenöls zugegeben. Die Fermentation wird nach 48 Stunden gewonnen und durch Zentrifugieren geklärt. Die geklärte Bouillon liefert eine 50prozentigc Hemmung bei der Enzymprobe bei einer Verdünnung von 1 in 100 000. 100 Liter der geklärten Bouillon werden mit 12 kg einer Ionenaustausch-Cellulose in der Acetatform, feucht berechnet, verrührt, wobei die Cellulose eine mikrokristalline Cellulose mit Diäthylaminoäthyl-Gruppen ist

Nach dem Filtrieren der Aufschlämmung wird der MM 4550-Komplex mittels 12 Liter einer 0,5-m Kaliumsulfatlösung aus dem Austauscher eluiert Das Eluat wird in einem aufsteigendem Filmverdampfer unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30° C auf 6 Liter eingeengt Durch eine Zugabe von 12 Liter Aceton wird der größte Teil des Kaliumsulfats ausgefällt Die Lösung wird filtriert und durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 200 ml eingeengt Das Konzentrat wird auf eine Säule von 76 mm · 2 m, die mit einem nichtionischen Polystyrolharz beschickt worden ist, aufgegeben und mit entsalztem Wasser eluiert. Das Eluat wird in 140 ml-Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen, die mittels der KAG-Probe festgestellt werden, werden gesammelt (2,2 Liier) und auf 275 ml durch Ultrafiltrieren mittels einer »Amicon UM-05«-Membrane von 150 mm Durchmesser unter einem Stickstoffdruck von 4,20 kg/cm² eingeengt. Das Konzentrat wird gefriergetrocknet. Man erhält 2,2 g

ίο eines braunen Pulvers vom U₀-Wert 0,004 μg/ml.

1 g dieses Pulvers wird in 1 Liter einer 0,2-m Natriumsulfatlösung gelöst und mit 1 Liter einer 2gewichtsprozentigen Tetra-n-butylammonium-hydrogensulfat-Lösung in Dichlormethan vermischt. Die Dichlormethan-Phase wird durch Absitzenlassen abgetrennt, auf —70°C gekühlt, zur Entfernung von Eis filtriert und dann durch Eindampfen auf 20 ml eingeengt. Zu dem Konzentrat werden 400 ml Petroläther vom Siedebereich 40 bis 60°C gegeben. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, in 10 ml Dichlormethan wieder aufgelöst und mit 10 ml Wasser, das 80 mg Bariumjodid und 70 mg Bariumcarbonat enthält, extrahiert. Die Phasen werden getrennt, wobei die wäßrige Phase filtriert und auf pH 6,5 eingestellt wird. Die Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält ein gelbes Pulver. Das Pulver wird mit Aceton gewaschen, um überschüssiges Bariumjodid auszuwaschen. Der blaßgelbe Feststoff wird wiederum durch Zentrifugieren gewonnen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute beträgt 13 mg und der I₅₀-Wert 0,0004 Rg/ml.

Darlegung der Adsorption des Kulturfiltrats
an Kohle, das zur Gewinnung des in der

GB-PS13 63 075
beschriebenen Materials vorteilhaft ist

Das nach der vorstehenden Beschreibung erhaltene Kulturfiltrat liefert einen Zonendurchmesser von 17 mm bei einer aktibakteriellen Diffusionsprobe mit Bohrungen in einer Agarplatte gegenüber Klebsiella aerogenes,

to einen Zonendurchmesser von 38 mm bei der KAG-Probe und einen Uo-Wert bei einer Verdünnung von 1 in 100 000. 170 Liter des geklärten Kulturfiltrats werden bei 5°C mittels eines aufwärts gerichteten Stroms durch eine Säule von 22,9 cm Durchmesser, die bis zu einer Höhe von 40,6 cm mit Aktivkohle (einer Korngröße von 0,17 bis 0,25 mm Durchmesser und vorgewaschen mit η-Salzsäure und mit Phosphatpuffer auf pH 6 eingestellt) gefüllt ist, bei einer Fließgeschwindigkeit von 800 bis 1000 ml/Minute perkoliert. Die Brühe wird von der Aktivkohle mit 10 Liter entsalztem Wasser ausgewaschen, und die Säule wird bei 20°C mit 20 Prozent Aceton eiuieri Die in einer Menge bis zu i0 Liter anfallenden aktiven Fraktionen werden durch Eindampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatür unter 30° C auf 6 Liter eingeengt und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 282 g eines rohen MM 4550-Komplexes mit einem Iso-Wert von 0,05 μg/ml. Die Hemmwirkung des gewonnenen Enzyms beträgt 22 Prozent

Anstelle der aktivierten Kohle liefern auch andere Aktivkohlen die gleichen Ergebnisse.

Darstellung der Chromatographie
des Kulturfiltrats an einem Ionenaustauscherharz,
das zur Gewinnung des in der GB-PS 13 63 075
beschriebenen Materials vorteilhaft ist

Eine Säule mit 1 cm Innendurchmesser wird bis zu einer Höhe von 6 cm iBettvolumen 4.7 ml> mit einem

lonenaustauscherharz in der Chloridform und einem Teilchendurchmesser von 0,3 bis 0,82 mm gefüllt Das ionenaustauscherharz L.i ein Polystyrol-Divinylbenzol-Harz mit basischen Gruppen. Das Harzbett wird dann 4mal mit etwa 4,7 ml 5prozentigem wäßrigen Methanol und anschließend einmal mit etwa 4,7 ml destilliertem Wasser gewaschen. Es werden hauptsächlich 2 Liter Kulturfiltrat wie in der »Beschreibung 3« beschrieben und auf die Säule angewendet erhalten. Das Harz wird dann mit 50prozentigem wäßrigen Methanol zum Entfernen der Verunreinigungen gewaschen.

Der MM 4550-KompIex wird vom Harz mit 5 Prozent Natriumchlorid enthaltendem 50prozentigen Methanol eluiert. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die erhaltenen Ergebnisse in Wirkungseinheiten. Der MM 4550-Komplex-Gehalt des Kulturfiltrats wird willkürlich mit

8 Einheiten/ml festgesetzt Die aus der Säule eluierten Fraktionen werden unter Anwendung der antibakteriellen Diffusionsmethode gegenüber KJebsiella aerogenes geprüft Die Aktivitätseinheiten werden unter Bezugnahme auf die Standardlinie berechnet die durch Aufzeichnen des Zonendurchmessers gegen die Einheiten/ml für verschiedene Verdünnungen des Kulturfiltrats ermittelt worden ist d. h. daß das Kulturfiltrat als Standard verwendet worden ist

Es ist ersichtlich, daß die Säule einen wirksamen Weg zur Konzentrierung des MM 4550-Komplexes darstellt. Die Fraktionen 2 bis 5 enthalten 60 Prozent der Aktivität in einem Gesamtvolumen von nur 37 ml. Das Gesarnttrockengewicht dieser Fraktionen beträgt etwa 210 mg, während 35 g Feststoffe auf die Säule gegeben worden sind.

Tabelle I

Ergebnisse der Chromatographie an einem basische Gruppen enthaltenden Polystyrol-Divinylbenzol-Harz

Probe	pH	Volumen	Einheiten	Insgesamt:	Gesamteinheiten
		(ml)	(ml)
Kulturfiltrat	6,5	1 970	8	15 760
Perkolat 1	6,9	550	<1	<100
Perkolat 2	7,0	525	<1	<100
Perkolat 3	7,0	595	<1	<100
Perkolat 4	7,0	300	<1	<100
Eluat 1	7,8	7,0	84	588
Eluat 2	7,8	7,0	328	2 296
Eluat 3	7,7	8,5	440	3 740
Eluat 4	7,7	10,0	320	2 200
Eluat 5	7,6	11,5	160	1 840
Eluat 6	7,5	11,0	80	880
Eluat 7	7,6	14,2	66	937
Eluat 8	7,6	20,0	33	660
			13 141

Darstellung der lonenpaar-Extraktion

eines Kulturfiltrats, das zur Gewinnung des

in der GB-PS 13 63 075 beschriebenen Materials

vorteilhaft ist

248 g Natriumsulfat werden zu 10 Liter eines geklärten Kulturfiltrats gegeben, das wie vorstehend angegeben, hergestellt worden ist. Die Lösung wird unter 30minütigem Rühren mit 10 Liter 2 Prozent Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfat enthaltendem Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und auf 2°C gekühlt. Eine geringe Menge suspendierten Wassers wird durch Filtrieren durch ein »Whatmann No. l-PS«-Papicr entfernt. Dann wird die Dichlormethan-Lösung durch Eindampfen unter vermindertem Druck und einer Temperatur unter 30⁰C auf 20 ml eingeengt. Nach Zugabe von 400 ml eines Petroläthers vom Siedebercich 40 bis 60"C fällt eine gummiartige Substanz aus, die den MM 4550-Komplex enthält.

Die gummiartige Substanz wird abzentrifugiert, in 50 ml Dichlormethan wieder gelöst und mit 50 ml Wasser, das 1 g Bariumjodid und 1 g Bariumcarbonat enthält, durch 2minütiges Schütteln extrahiert. Die vorhandenen Feststoffe werden abfiltriert, und die beiden Phasen aufgetrennt. Die wäßrige Phase mit dem MM 4550-Komplex als Bariumsalz wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und gefriergetrocknet. Man erhält 317 mg des rohen MM 4550-Komplexes mit einem hd-Wert von 0,001

Herstellung eines teilweise gereinigten

antibiotischen Komplexes mit einem Gehalt an

MM 4550 und MM 13 902 unter Verwendung von

Telra-n-butyl-ammonium-hydrogensiilfat

12,5 g eines wie vorstehend angegeben hergestellten rohen MM 4550-Komplexes werden in 125 ml Wasser wieder aufgelöst und mit 125 ml Dichlornieihan mit einem Gehalt von 10 Gewichtsprozent Tcira-n-biitylammonium-hydrogensulfat extrahiert. Die Dichlorme-

than-Phase wird abgetrennt und nochmals mit 100 ml Wasser, das 190 mg Natriumiodid enthält, bei 2°C unter langsamen Rühren und Einstellen der wäßrigen Phase mittels 2prozentiger Natriumbicarbonatlösung auf pH 6,4 extrahiert Die Lösung wird gefriergetrocknet Der trockene Feststoff wird mit Aceton gewaschen. Die Ausbeute beträgt 88 mg der gemischten Natriumsalze von MM 4550 und MM 13 902 mit einem Iso-Wert von

0,0002 μg gegenüber der Escherichia coli-0-Lactamase. Die Gewinnung der Antibiotika beträgt 70 Prozent

Die antibakterielle Wirksamkeit von Gemischen aus Ampicillin und der nach diesen Angaben hergestellten Substanz wird mittels der Reihenverdünnungsmethode in einem Nähragar bestimmt Die erhaltenen Mindesthemmkonzentrationen sind in der Tabelle II angegeben.

Organismus

Ampicillin (allein)

Ampcillin + MM 4550-Komplex bei

0,1

10 μΕ/ml

E. coli B 11
E. coli JT417 E. coli JT39 Shigella sonnei S 239
KJebsiella aerogenes A
Klebsiella aerogenes IP282
Proteus mirabilis 889
Proteus mirabilis 247
Proteus morganii F
Proteus rettgeri RIlO
Staph.aureus (Russell)
Staph. aurues (Rüssel H)

>500
250

>500

125

125

50

>500

>500

50

250

250

>500

>500

250

>500

125

25

50

>500

125
50

125

125

500
250
500 125

5*)
12,5
50
5,0
25
25*)

50 50 25*) 25*) <0,l*)

0,5*)

0,5

0,5

0,5

0,25*)

0,25

·) teilweise Hemmung durch den MM 4550-Komplex allein bei diesen Konzentrationen.

Ähnliche synergistische Wirkungen werden bei Gemischen von Amoxycillin und dem MM 4550-Komplex beobachtet.

Herstellung eines teilweise gereinigten
antibiotischen Komplexes mit MM 4550 und MM 13 902

unter Verwendung von
Cetyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid

Das vorstehend aus der Aktivkohlesäule mit Aceton und Wasser eluierte gefriergetrocknete Produkt mit dem Iso-Wert von 0,02 μg/ml wird in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 13 mg/ml gelöst. Die Lösung wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.

100 ml dieser Lösung werden mit dem gleichen Volumen Dichlormethan mit einem Gehalt von 0.1 Prozent Cetyl-dimethyl-benzyl-amnioniumchlorid extrahiert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren gelrennt. Die organische Phase wird nochmals mit 100 ml einer 0,05prozentigen Natriumjodidlösung extrahiert. Die Phasen werden aufgetrennt, und Dichlormethan in der wäßrigen Phase wird entfernt, indem die Lösung 10 Minuten umer vermindertem Druck gehalten wird.

Die wäßrige Lösung wird gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt wird 3mal mit je 50 ml Aceton gewaschen. Das mit Aceton gewaschene Produkt wird unter vermindertem Druck im Trockenschrank getrocknet. Man erhält 4,3 mg eines schwachbraunen Pulvers mit einem I₅₁₁-Wert von 0,002 μg/ml.

Herstellung eines teilweise gereinigten
antibiotischen Komplexes mit einem Gehalt an

MM 4550 und MM 13 902
unter Verwendung der Gelfiltration

1 g des vorstehend hergestellten rohen MM 4550-Komplexes mit dem !--,n-Wert von 0.2 ^ig/rnl wird an einem vernetzten Dextran Chromatographien und unter Verwendung eines Gemisches von Aceton und Wasser im Volumverhältnis von 4 :6 eluiert. Die Säulenabmessungen betragen 2,5 cm ■ 32 cm Die Eluierung wird mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/Minute durchgeführt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30°C eirgeengt und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 22 mg eines amorphen gelbbraun gefärbten Feststoffes mit einem ho-Wert von 0.005 μg/ml. Die Ausbeute beträgt 88 Prozent und die Reinigung 40fach.

Herstellung eines gereinigten antibiotischen
Komplexes mit MM 4550 und MM 13 902 unter

Anwendung einer Chromatographie an Celulose

610 mg des vorstehend hergestellten MM 4550-Komplexes werden an einer Säule von 2,5 cm · 32 cm mit einer Füllung von Cellulose vom Typ »Whatmann CC

μ 31« Chromatographien. Die Säule wird mit einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis von 7:3 mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/Minute eluiert. Die antibakteriell wirksamen Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 40 mg eines amorphen braunen Feststoffes eines antibiotischen Komplexes mit einem Iso-Wert von 0,00007 μ£/ιη1. Der sehr kleine I₅₀-Wert zeigt an, daß die aktive Substanz eines

hfi verbesserte Reinheit besitzt.

Bei einer Wiederholung der Verfahrensschritte erhält man eine Substanz mit einem Iw-Wert von 0001 ng/ml. Diese Substanz besitzt eine antibakteriell Wirksamkeit gemäß der Tabelle 111, wenn sie mittels der Standard-

tii Mikrotiter-Methode in einer Oxoid-Rmpfindlichkcits-Bouillon unter Verwendung schwacher Impfstoffe (1 Prozent einer über Nacht stehengelassenen Bomllon) bestimmt wird.

Tabelle III

Antibakterielle Wirksamkeit eines Gemisches von
MM 4550 und MM 13 902 mit einem I₅₀-Wert von
0,001 μΕ/ml

Organismus

Mindesthemmkonzentralion
in ug/ml

Staphylococcus aureus (Oxford) 7,5

Staphylococcus aureus (Russell) 7,5

Streptococcus faecalis 125

Baciüus subtilis 0,9

Escherichia coli (10 418) 3,7

Escherichia coli (B 11) 15

Klebsiella aerogenes 1,8

Enterobacter cloacae 62

Proteus mirabilis 7,5

Providentia stuartii 7,5

Acinetobacter anitratus 0,9

Pseudomonas aeruginosa 250

Serratia marcescens 7,5

Salmonella typhimurium i5

Shigella sonnei 7,5

Die Substanz MM 13 902

Die Substanz MM 13 902 kann durch ihre nachstehenden Eigenschaften erkannt werden:

Die Substanz MM 13 902 ist ein saurer Feststoff, der in Form des Natriumsalzes die folgenden Eigenschaften aufweist:

(1) es ist leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen;

(2) in wäßriger Lösung besitzt es ein charakteristisches Ultraviolett-Spektrum mit Absorptionsmaxima, von denen eins bei etwa 305 nm liegt;

(3) bei einer Menge von 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch hergestellten KBr-Platte ein charakteristisches Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u.a. bei 3450, 2950, 1750, 1620, 1510, 1400 und 1260 cm-';

(4) ein charakteristisches NMR-Spektrum in deuteriertem Wasser mit u. a.

(a) einem Paar Niederfeld-Doubletten mit ihrem Zentrum bei etwa 2,85 τ und 4,00 τ mit Kopplungskonstanten (J) von etwa 14 Hz,

(b) mit einem Doublett mit dem Zentrum bei etwa 8,55 r und

(c) mit einem scharfen Singulett bei etwa 8,00 r;

(5) eine antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche Spezies u. a. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhi und Pseudomonas aeruginosa;

(6) im Gemisch mit Ampicillin eine synergistische Wirksamkeit gegenüber Organismen, wie Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Staphylococcus aureus Russell.

Das reine Dinatriumsalz der Substanz MM 13 902 hat den vorstehend näher erläuterten Iso-Wert zwischen 0.0Ό1 μ£/πι1 und 0,0001 u.g/ml gegenüber der 0-Lactarnase von Escherichia coli BI1.

Wenn das reine Dinatriumsalz der Substanz MM 13 902 der Dünnschichtchromatographie an Cellulose unterworfen wird, weist es die annähernden Rf-Werte bei den nachstehenden Systemen auf:

ίο (a) bei n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis 7:7:6 einen Ri-Wert von 0,72;

(b) bei Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis 7 :3 einen Rf-Wert von 0,85;

(c) bei n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumverhältnis 7:7:6 einen R₁-Wert von 0,81 und

(d) bei n-Propanol/Wasser im Volumverhältnis von 4 :1 einen R_f-Wert von 0,75.

Beispiel 1

Herstellung des MM 4550-Komplexes und Auftrennung in die Substanzen M M 4550 und M M 13 902

Die vorstehend im einzelnen ausgeführten Isolierungsverfahren können bei ihrer Anwendung in verschiedener Weise aufeinanderfolgen. Eine besonders zweckmäßige Reihenfolge ist die Adso-ption an Kohle, die lopenp.iar-Extraktion und die Chromatographie an Cellulose, wie es nachstehend beschrieben wird:

340 Liter des vorstehend erhaltenen Kulturfiltrats

JO werden in aufsteigender Richtung mit einer Geschwindigkeit von 800 bis 1200 ml/Minute durch eine Säule von 22,9 cm Durchmesser und 53,3 cm Höhe, die mit Aktivkohle gefüllt war, perkoliert. Die Aktivkohle ist zuvor zur Adsorption des MM 4550-Komplexes

i"> verwendet worden und anschließend durch Waschen mit folgenden Reagentien regeneriert worden:

0,5-n Natronlauge;

0,2-n Natronlauge/Aceton im Verhältnis 3 : 2;
ίο Wasser;

n-Salzsäure;

Wasser;

Phosphatpufferlösung vom pH 6 und

Wasser.

Die Säule wird mit 20 Liter Wasser gewaschen, um

das Kulturfiltrat zu verdrängen, und dann durch Abstrom mit einem Gemisch von Aceton und Wasser im Volumenverhältnis 2 :8 mit einer Geschwindigkeit von 200 bis 250 ml/Minute eluiert. Das Eluat wird in

1 Liter-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen mit einem Gehalt an dem MM 4550-Komplex, der durch die antibakterielle Diffusions-Probe unter Verwendung von Klebsiella aerogenes bestimmt worden ist, werden vereinigt (11 Liter) und durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf ein Volumen von 5,5 Liter eingeengt. Die Gewinnung an MM 4550-Komplex bei dieser Stufe beträgt 20 Prozent.

^b0 Das Konzentrat wird auf 2'C gekühlt und dann mit 5,5 Liter Dichlormethan mit einem Gehalt von 2 Gewichtsprozent Tetra-n-butylammonium-lndrogcnsulfat bei -5'¹C versetzt. Die beiden Phasen werden

2 Minuten miteinander vermischt. Dann wird die ^ Diehlormcthan-Phase abgetrennt und bei 0 C /u I l.Mer einer O.bprozentigcn Natriumjodidlösung gegeben. Die beiden Phasen werden langsam miteinander verrührt.. und die wäßrige Phase wird allmählich mittels einer

2prozentigen wäßrigen Bicarbonatlösung auf einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 eingestellt Die wäßrige Phase wird abgetrennt und gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit Aceton extrahiert, um überschüssiges Natriumiodid zu lösen. Das Aceton wird vom unlöslichen Rückstand unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält 1,1 g eines gelbbraun gefärbten Pulvers. Die Gesamtausbeute an dem MM 4550-Komplex in dieser Stufe betrag'. 10 Prozent, Die auf die gelösten Gesamtfeststoffe berechnete Reinigung bei dem Kulturfiltrat ist 125fach.

Eine Säule von 2,5 cm Durchmesser wird mit pulverförmiger Mikrocellulose in einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis von 7 :3 bis zu einer Höhe von 32 cm beschickt. 500 mg des gelbbraunen Pulvers werden in 2 ml eines Gemisches von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis 7 :3 gelöst und unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute Chromatographien. Es werden 3 ml-Fraktionen aus der Säule gesammelt. Diejenigen mit einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm werden vereinigt, eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält den MM 4550-Komplex. Frühere Untersuchungen haben ergeben, daß die bei 285 nm absorbierenden Fraktionen eine enzyminhibierende, antibakteriell wirksame Substanz enthalten. Die Ausbeute an dem gefriergetrockneten MM 4550-Komplex beträgt 35 mg, der ein amorphes braunes Aussehen und einen I_5o-Wert von 0,0001 μ^/ΐηΐ besitzt. Die Gewinnung der aktiven Substanz bei dieser Stufe beträgt insgesamt 3 Prozent und die Reinigung insgesamt ist 600fach.

Die antibakterielle Wirksamkeit dieser Substanz wird mittels der Standard-Mikrotiter-Methode bei der Oxoid-Empfindlichkeits-Testbouiilon unter Verwendung eines schwachen Impfstoffes bestimmt. Die erhaltenen Mindesthemmkonzentrationen sind denjenigen in der Tabelle Hl beschriebenen ähnlich.

Eine Analyse der Substanz mittels Dünnschichtchromatographie an Cellulose, wobei mit einem Gemisch von n-Butanol-lsopropanol-Wasser im Volumverhältnis

ίο 7:7:6 entwickelt wird, liefert eine Auftrennung in zwei aktive Substanzen, von denen die eine einen Rf-Wert von annähernd 0,58, der die Substanz MM 4550 anzeigt, und die andere mit einem Rf-Wert von annähernd 0,72 aufweisen, was die Substanz MM 13 902 anzeigt. Diese beiden Substanzen werden durch Bioautographie an verschiedenen Organismen bestimmt, z. B. Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (penicillinresistent), Escherichia coli (penicillinempfindlich und penicillinresistent), Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Klebsiella aerogenes. Einige der erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle IV zusammengefaßt.

Bei einem weiteren Versuch werden die beiden Substanzen auf einer Cellulosedünnschicht getrennt, die

2ϊ mit einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Verhältnis 8 :2 entwickelt worden ist. und dann aus der Cellulose mittels Phosphatpuffer extrahiert. Jeder Extrakt wird au^f eine /J-Lactamase-Hemmung geprüft. Beide Substanzen zeigen, daß sie Inhibitoren der

»ι Escherichia coli-ß-Laciamase sind. Beide Substanzen zeigen auch, daß sie mit Benzylpenicillin gegenüber Klebsiella aerogenes synergistisch wirken.

Tabelle IV

Antibakteriell Wirksamkeit von MM 4550 und MM 13 902, bestimmt durch Bioautographie (Dünnschichtchromatographie mit Cellulose und Butanol/Isopropanol/ Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6)

Organismus

Zonendurchmesser bei Bioautographie

MM 455n-Zone in MM 13 902-Zone in
mm bei R, = 0,58 mm bei R, = 0,70

Klebsiella aerogenes
Proteus mirabilis
Proteus morganii
Salmonella typhi
Escherichia coli 10 418
Escherichia coli B 11
Enterobacter aerogenes
Staphylococcus aureus (Oxford)
Staphylococcus aureus (Russell)
Bacillus subtilis

20,0 mm	20,0 mm
17,5 mm	13,5 mm
16,0 mm	9,5 mm
19,5 mm	21,0 mm
20,0 mm	13,5 mm
17,5 mm	10,5 mm
6,5 mm	keine Zone
13,0 mm	4,0 mm
12,0 mm	4,0 mm
24,0 mm	15,0 mm

Beispiel 2

I Ic ist el Iu ng des MM 4 5 50-Komplex es

und Auftrennung in die Substanz
MM 4550 und in die Substanz MM 1 3 902

1100 Liter Kulturfilirat aus der Fermentation von Streptoimces olivaceus ATCC 31126 werden bei einem pH vim 6.¹J und bei 5 C mit einer Geschwindigkeit von 3,2 l.iiei'Mmute durch eine mit granulierter Aktivkohle

W) gefüllten Säule von 0,3 · 1 m perkoliert. Die Aktivkohle ist bereits einmal zur Adsorption des MM 4550-Kompn_\es verwendet, aber vor Anwendung durch Waschen mit den nachstehenden Mitteln regeneriert worden:

ίί 0,5-n Natronlauge;

0,2-n eines Gemisches von Natronlauge

und Aceton im Verhältnis 3 : 2;
Wasser;

10

η-Salzsäure;

Wasser;

Phosphatpuffer vom pH 6 und Wasser.

Die Säule wird mit 60 Liter Wasser gewaschen, um das Kulturfiltrat zu verdrängen, und dann mit einem Gemisch aus Aceton und Wasser im Volumenverhältnis 2 :8 bei 30⁰C mit einer Geschwindigkeit von 1,1 Liter/ Minute eluiert. Es werden 60 Liter aufgefangen, gefolgt von 5 10-Liter-Fraktionen. Diese Fraktionen, die den MM 4550-Komplex enthalten, wie sich mittels der antibakteriellen Diffusions-Probe unter Verwendung von Klebsiella aerogenes bestimmen läßt, werden vereinigt (40 Liter) und unter verminderiem Drück und bei einer Temperatur unter 3O⁰C auf 32 Liter eingeengt. Die Gewinnung des MM 4550-Komplexes in dieser Stufe beträgt 15 Prozent.

Das Konzentrat wird auf 5⁰C gekühlt und dann bei 5°C mit 16 Liter Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,2 Prozent Cetyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid versetzt. Die beiden Phasen werden 5 Minuten miteinander vermischt. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und bei 5°C mit 3,75 Liter einer Natriumjodidlösung versetzt. Die beiden Phasen werden 5 Minuten miteinander vermischt. Dann wird die wäßrige Phase abgetrennt und gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit wasserfreiem Aceton extrahiert, um überschüssiges Natriumiodid herauszulösen. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,87 g eines gelbbraun gefärbten Pulvers. Die Gesamtausbeute an dem MM 4550-K.omplex dieser Stufe beträgt 6 Prozent. Die auf die gelösten Gesamtfeststoffe berechnete Reinigung bei dem Kulturfiltrat ist 160f ach.

Eine Säule mit 63 mm Durchmesser wird mit Mikrocellulosepulver in einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser im Volumenverhältnis 7 :3 bis zu einer Höhe von 300 mm gefüllt. 2,0 g des gelbbraun gefärbten Pulvers werden in 5 ml eines Gemisches von lsopropanol und Wasser im Volumenverhältnis 7 :3 gelöst und dann in dem gleichen Lösungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute Chromatographien. Die Fraktionen, die den MM 4550-Komplex enthalten, wie durch eine Probe gegenüber Klebsiella aerogenes bestimmt worden ist, werden vereinigt, durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 207 mg eines braunen Feststoffs.

Die Gewinnung des MM 4550-Komplexes in dieser Stufe beträgt 51 Prozent, und die Reinigung im jfach.

Eine Säule mit 16 mm Durchmesser wird mit pulverförmiger Mikrocellulose in einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 :1 bis zu einer Höhe von 300 mm gefüllt. Dann werden 198 mg des braunen Feststoffes in einem Gemisch von Wasser und n-Propanol im Volumenverhältnis 1 :1 gelöst und in einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis von 4:1 mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute Chromatographien. Es werden 6-ml-Fraktionen gesammelt, die gegen Klebsiella aerogenes geprüft werden. Es werden auch bei jeder Fraktion die UV-Spektren gemessen. Die Fraktionen Nr. 23 bis Nr. 28 mit einem UV-Maximum bei etwa 305 nm enthalten das Dinatriumsalz der Substanz MM 13 902. Diese Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 30 mg eines Feststoffes. Diese Substanz

20

25

30

35

40

45

50

60

65 zeigt lediglich eine einzige Zone von antibiotischer Wirksamkeit bei einem R_f-Wert von 0,77 bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Celluloseplatten mit einem Gemisch aus n-Propanol und Wasser im Volumen verhältnis 4:1. Die Zone wird mittels Bioautographie an Bacillus subtilis bestimmt. Die Fraktionen Nr. 29 bis Nr. 40 mit einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm enthalten die Substanz MM 4550. Diese Fraktionen werden ebenfalls vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 53 mg eines Feststoffes, der ein Salz der Substanz MM 4550 enthält, das mit einer geringen Menge des Salzes der Substanz MM 1392 verunreinigt ist.

Organismen

Die Eigenschaft, den MM 4550-Komplex zu erzeugen, ist zuerst in den Kulturen der Stämme ATCC 21 379, ATCC 21 380, ATCC 21 381 und ATCC 21 382 festgestellt worden, die aus Bodenproben isoliert worden sind, die man aus Spanien, Neuseeland, Südafrika und Israel erhalten hat. Im Laboratorium scheinen diese Kulturen identisch zu sein, und sie wurden sämtlich als Streptomyces olivaceus identifiziert, wobei die 1967 weltweit anerkannte Klassifikation von Hütter (»Systematik der Streptomyceten«, S. Karger, Basel, S. 382 ff) verwendet worden ist. Eine MM 4550-Erzeugung ist bisher bei anderen Streptomyces-Spezies gefunden worden, wie dies aus Tabelle IV ersichtlich ist.

Streptomyces olivaceus ist zuerst von Waksmann 1919 beschrieben worden (vgl. »Cultural Studies of Species of Actinomyces« Soil. Sei. 8 S. 71 bis 215). Anschließend hat im Jahre 1960 eine Gruppe von russischen Forschern eine Spezies mit sehr ähnlichen Eigenschaften beschrieben, doch ist sie als Actinomyces (Streptomyces) fulvoviridis bezeichnet worden (vgl. Kuchaeva und Mitarbeiter, Trud. Inst. Mikrobiol., Akad. Nauk. SSSR. 8 (1960), S. 226 bis 253).

Die Mikroorganismen der Gattung Streptomyces sind außerordentlich variabel in ihren morphologischen und physiologischen Eigenschaften in Abhängigkeit von den Bedingungen, unter denen sie wachsen. Beschreibungen von zahlreichen Spezies sind veröffentlicht worden, bevor die Existenz dieser außerordentlichen Veränderlichkeit erkannt worden ist, mit der Folge, von Duplikationen und Synonyma. Hütter (1967) führt 25 Spezies auf, die mit Streptomyces olivaceus synonym sind, einschließlich Streptomyces fulvovoridis. Um diese Verwirrung bei der Nomenklatur und der Klassifikatior zu !ösen, ist !962 ein »International Streptomyce: Project« begonnen worden (vgl. Shirling und Mitarbeiter, lnLj.System.Bacteriol.18 (1968), S. 69 bis 189) Mitarbeiter an diesem Projekt haben eine Reihe vor Studien durchgeführt, die bei der Erstellung genauei Beschreibungen der Spezies von Streptomyces untei Standardbedingungen hilfreich sind. In diesem Schenu sind Standardbeschreibungen von typischen Stämmer von über 400 benamten Spezies aufgenommen worden einschließlich Streptomyces olivaceus und Streptomy ces fulvoviridis. .

Die I.S.P.-Beschreibung von Streptomyces ohvaceu und Streptomyces fulvoviridis unterscheidet sich nur π zwei Eigenschaften:

(a) In Form der Sporenträger und

(b) der Fähigkeit, Inosit als einzige Kohlenstoffquell· zu spalten.

Streptomyces olivaceus wird wie folgt beschrieben:

Sporenkettenmorphologie: Sektion Spiralen, mit offenen Spiralen, die allmählich in gekrümmte Sporenketten übergehen, die Sektion rektiflexible Sporen andeutend. Die reifen Sporenketten sind gewöhnlich lang, häufig mit über 50 Sporen je Kette.

Kohlenstoffquellen: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, l-lnosit, D-Mannit, D-Fructose und Rhamnose werden für das Wachstum benötigt. Auf Saccharose und Raffinose findet kein Wachstum oder nur ein spurenweises Wachstum statt.

Streptomyces fulvoviridis wird wie folgt beschrieben:

Sporenkettenmorphologie: Sektion rektiflexible Sporen. Die reifen Sporenketten sind mäßig kurz mit 10 mit 50 Sporen je Keue. KohiensiüffqueHen: D-Giucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Mannit, D-Fructose und Rhamnose werden für ein Wachstum benötigt. Die Spaltung von Saccharose ist zweifelhaft. Auf l-lnosit oder Raffinose findet kein Wachstum oder nur spurenweises Wachstum statt.

Die Charakterisierung einer Anzahl von Kulturen, die als Streptomyces olivaceus oder Streptomyces fulvoviridis und andere verwandele Spezies benannt oder damit synonym sind, werden unter Anwendung von Standardmethoden und Mitteln, wie sie in dem »International Streptomyces Project« (I. S. P.) empfohlen worden sind, bestimmt (vgl. Shirling und Mitarbeiter, Int. J. Syst. Bacteriol. 16(1966), S. 313 bis 340).

Die Kulturen leiten sich von verschiedenen Quellen ab. Die Stämme ATCC 21 379,21 380, 21 381 und 21 382 wurden aus ^Bodenproben auf der Basis isoliert, den MM 4550-Komplex zu erzeugen. Die anderen Stämme wurden aus zahlreichen Kultursammlungen für Vergleichszwecke erhalten.

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Erzeugung des MM 4550-Komplexes, der Farbe des Luftmycels, die Gestalt der Sporenträger, die Farbe des Mycelsubstrats, lösliche Pigmenterzeugung, Melaninerzeugung und Spaltung von Kohlenstoffquellen sind in den Tabellen IV bis VIII angegeben. Bei allen Stämmen ist die Sporenoberfläche bei Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop glatt.

Aus der I. S. P.-Beschreibung ist es offensichtlich, daß das Spiralenwachstum des Sporenträgers bei Streptomyces olivaceus von unterschiedlichem Charakter ist. Echte Spiralen werden mit unterschiedlicher Häufigkeit bei dem typischen Spezies von Streptomyces olivaceus beobachtet, nämlich bei ATCC 3335. Die Mehrzahl der Sporenträger ist lang. Keine echten Spiralen werden bei Kulturen der Spezies ATCC 21 379, 21 380, 21 381 oder 21 382 beobachtet, obwohl die Sporenträger lang sind und die Neigung zu Spiralen bei einem Hintergrund der rektiflexiblen Arten zeigen. Jedoch bei zwei Streptomyces olivaceus-Stämmen, nämlich NCIB 8238 und NCIB 8509, ist die Mehrzahl der Sporenträger von der rektiflexiblen Art. Beim Stamm NCIB 8230 sind sie mäßig lang, während sie beim Stamm NCIB 8509 lang sind.

Die bei dem Stamm ATCC 15863 beobachteten Sporenträger, einer typischen Spezies von Streptomyces fulvoviridis, sind kürzer als die von den isolierten Stämmen ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382 und 31 126 und stellen lediglich rektiflexible Arten dar. Im Hinblick auf diesen Charakter entsprechen deshalb die isolierten Stämme ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382 und 31 126 ziemlich gut, jedoch nicht genau der Beschreibung von Streptomyces olivaceus.
Die reinen Stämme ATCC 21 379, 21 380, 21 381,

ίο 21 382 und 31 126 zeigen eine gewisse Variabilität im Hinblick auf die Inositspaltung die ein anderes Unterscheidungsmerkmal gemäß den I. S. P.-Typenbeschreibungen der Spezies zwischen den Spezies Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis sind (vgl. Tabelle Viii). Die Stämme ATCC 31 126 und ATCC 21 380 spalten Inosit, was für Streptomyces olivaceus charakteristisch ist, während die anderen Stämme eine zweifelhafte oder eine negative Spaltbarkeit zeigen. Es wird jedoch nicht als allgemein zufriedenstellend betrachtet, eine Spezies aufgrund seiner Fähigkeit, ein einzelnes Kohlehydrat zu spalten, auseinanderzuhalten. Solch ein Unterschied kann durch eine einzige Genmutation hervorgerufen werden und wird häufig lediglich als Stammsignifikanz betrachtet.

Der Unterschied bei der Zuckerspaltbarkeit bei den Streptomyces olivaceus-Stämmen NCIB 8138, NCIB 8509, ATCC 21 549, ATCC 12 019 und ATCC 3335 deutet darauf hin, daß zahlreiche Fachleute sie nicht als signifikantes Merkmal dieser Spezies betrachten.

Demzufolge werden die Stämme ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382 und 31 126 mit Recht als Streptomyces olivaceus bezeichnet.

Die Untersuchung der Kuliurfillraie der Stämme von Streptomyces olivaceus und der verwandten Spezies hinsichtlich der Erzeugung des MM 4550-Komplexes kann wie folgt durchgeführt werden:

Kulturfiltrate der aufgeführten Stämme werden auf Papierstreifen (Whatman No. 1) in einer Menge von 20 μ Liter je Ausgangslösung getüpfelt und über Nacht

■to in der Kälte mit einem Gemisch von n-Butanol/lsopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 Chromatographien. Ein anderer Satz Streifen wird ebenfalls über Nacht in der Kälte mit einem Gemisch von n-Butanol/ Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis 12:3:5 chromatographiert. Gleichzeitig läuft eine teilweise gereinigte Probe des MM 4550-Komplexes in den beiden Systemen als Markierungsmittel mit.

Es ist gegebenenfalls möglich, 25 ml der geklärten Bouillon mit 12,5 ml Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,2 Prozent Cetylbenzyl-ammoniumchlorid zu exifähieien, die Phasen tu irenneri, die organische Phase beizubehalten und diese mit 2,5 ml einer 0,5prozentigen Natriumjodidlösung zu versetzen, die Lösung zu schütteln, in Phasen aufzutrennen, die wäßrige Phase beizubehalten und diese chromatographisch zu verwenden, indem z. B. 5 μ auf die Dünnschichtchromatographie-Streifen getüpfelt werden, und diese sich in einem Gemisch von n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 entwickeln.

Tabelle V

Vermögen der Kulturen von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies, den MM 4550-Komplex zu erzeugen

Kultur

MM 4550-Komplex-Erzeugung

Streptomyces olivaceus

ATCC 21 379

	Fortsetzung	25 13 855	26
25	Kultur
		MM 4550-K.omplex-
Streptomyces olivaceus		Erzeugung B
Streptomyces olivaceus		+ Il
Streptomyces olivaceus	ATCC 31 126	+ 11
Streptomyces olivaceus	ATCC 21 380	+ 11
Streptomyces olivaceus	ATCC 21 381	+ Il
Streptomyces olivaceus	ATCC 21 382	+ 11
Streptomyces favovirens	NClB 8 238	+ Ii
Streptomyces flavus	NCIB 8 509	+ Ii
Streptomyces fulvoviridis	ATCC 3 320	+ 8
Streptomyces argenteolus	ATCC 3 369	+ Ui
Streptomyces sioyaensis	ATCC 15 863	+ 1
Streptomyces lipmanii	ATCC 11 009	+ Il
ATCC 13 989	+ ■
NRRL 3 584

(Streptomyces olivaceus ATCC 21549, ATCC 12019 und ATCC 3355 erzeugen keinen MM 4550-Komplex; der Stamm ATCC 15 863 wird auch als hinterlegter Stamm RIA 660 bezeichnet.)

Tabelle Vl

Farbe und Morphologie des reifen sporenbildenden Luftmycels von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies auf ISP-Medien nach 14tägigem Wachstum

Kultur	SS	YM	GA	OM	Morphologie des
					Sporenirägers
					(mittlere Größe)
ATCC 21 379	grau	grau	grau-weiß	grau	lange RF
ATCC 31 126	grau-braun	grau-braun	grau	grau	lange RF
ATCC 21 380	grau	grau	grau	grau	lange RF
ATCC 21 381	grau	grau	blaß-grau	grau-weiß	lange RF
ATCC 21 382	grau-weiß	grau	grau	grau	lange RF
NCIB 8 238	grau-weiß	grau	grau	grau	mittlere RF
NCIB 8 509	grau	grau	grau	grau	lange RF
ATCC 21 549	grau	grau	grau	grau	lange S
ATCC 12 019	grau	grau	grau	grau	lange RF/S
ATCC 3 335	grau	grau	grau	grau	lange RF/S
ATCC 15 863	grau-weiß	grau	grau-weiß	grau	mittlere RF
ATCC 3 320	grau-blau	grau	grau-grün	grau	lange RF
ATCC 3 369	grau	grau	grau	blaß-grau-braun	mittlere RF/RA
ATCC 11009	blaß-grau	grau-braun	grau-weiß	grau-grün	mittlere RF/RA
ATCC 13 898	weiß-grau	weiß	weiß-gelb	grau-weiß	kurze S

SS = Anorganische Salze - Stärkeagar (ISP-Medium Nr. 4).

YM = Hefe-Extrakt - Malz-Extrakt-Agar (ISP-Medium Nr. 2).

GA = Glycerin - Asparaginsäure-Agar (ISP-Medium Nr. 5).

OM = Hafermehi-Agar (ISP-Medium Nr, 3).

RF = rektiflexible Sporen.

RA = retinaculiaperte Sporen.

S = Spiralen.

27

28

Tabelle VH

Farbe des Substrats und des Mycels von der Rückseite gesehen von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies

kullur

SS

YM

GA

OM

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

ATCC

21 379 31 126 21 380 21 381 21 382 8 238 8 509

21 549 12019 3 335

15 863 3 320 3 369

11009 13 989

oliv	olivbraun	grau-braun	olivgrün
olivbraun	olivbraun	braun	olivbraun
oliv	olivgrün	olivbraun	olivgelb
dunkelbraun	dunkelbraun	olivgrün	olivgrün
oliv	oliv	braun	olivgrün
braun	oliv-brBun	braun	oüvgeib
braun	oliv	olivbraun	olivgelb
braun-gelb-schwarz	braun-schwarz	braun-schwarz	braun-gelb-grau
braun-gelb	braun-gelb	braun-gelb	braun-gelb
braun	braun	braun	grau
braun-grau	dunkelbraun	olivbraun	olivgelb
gelb-braun	oliv-braun	oliv-braun	orange-braun
braun-gelb-grau	gelbbraun	braun-gelb-grün	gelb
schwarz	schwarz-gelb	schwarz-gelb	grau-grün
orange	gelb	gelb	farblos

Tabelle VIII

Erzeugung von Pigmenien in Kulturmedium durch Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Spezies

Kultur

Lösliche nichl-melanoide Pigmente SS YM

GA

OM

Melanin-Erzeu gung*)

ATCC 21 379

ATCC 31 126 ATCC 21 380 ATCC 21 381 ATCC 21 382 NCIB 8 238

NCIB 8 509 ATCC 21 549

ATCC 12 019 ATCC 3 335 ATCC 15 863 ATCC 3 320

ATCC 3 369 ATCC 11009

ATCC 13 989

schwach gelb

schwach braun

schwach braun schwach braun

— _u

schwach gelb

ο^Κκ/ογ*!-» Kriiin Ci-KtIfO₁-K rotkronn coKwo^K hroiin

schwach rosa

schwach braun

schwach orange

+ = Pigment erzeugt - = Pigment nicht erzeugt

*) Untersucht auf einem Pepton-Hefe-Eisen-Agar (ISP6), Tyrosin-Agar (ISP17) und in einer Trypton-Hefe-Kulturlösung (ISPl).

29

Tabelle IX

Spaltung von Kohlen?tolFquellen durch Streptomyces olivaceus, Streptomyces fiilvoviridis und verwandte Spezie

Kultur

Rhamnose

Raffi-

nose

Sucrose Inosit Glucose Xylose Fructose Mannit Arabinose

ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC NCIB NCIB ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC

21379 31 21380 21381 21382 8 8

21549 12019 3

15 3 3

11 13

35

+ = die Verbindung wird gespalten; - = die Verbindung wird nicht gespalten; ± = die Spaltung ist zweifelhaft oder sehr schlecht.

Beispiel

Das bevorzugte Isolierungsverfahren zur Herstellung der Substanz MM 13

Ein Vorrat von Sporen von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 wird in Röhrchen mit trockenem Boden in einem geschlossenen Behälter mit einem Trockenmittel *o bei einer Temperatur von 20° C auf Lager gehalten. Eine geringe Menge der Bodenprobe (etwa 20 mg) wird aseptisch in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt, der 100 mg des folgenden Mediums enthält:

45

Bestandteile

Menge (g/Liter)

Glucose-monohydrat Sojabohnenmehl Entsalztes Wasser

20,0

10,0

ad 1 Liter

50

Vor dem Sterilisieren wird der pH auf 6,5 eingestellt.

Der Kolben wird etwa 30 Stunden bei 28° C auf einem Rotationsschüttler, der sich mit 240 UpM dreht, bebrütet. 2 ml der erhaltenen vegetativen Anzucht werden dann zur Überimpfung auf einen festen Schrägagar in einer Roux-Flasche verwendet. Der Schrägagar hat die folgende Zusammensetzung: f>o

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 6,0 eingestellt.

Die Beimpfung erfolgt über die gesamte Agaroberflä ehe durch Schütteln der Flasche, die dann aufgerichte bei 3O⁰C bebrütet wird. Nach 2tägiger Bebrütung wird überstehende Flüssigkeit der Flasche mittels einer Pipette abgezogen und die Bebrütung weitere 4 Tage fortgesetzt.

Es ist früher gefunden worden, daß eine Entwicklung von Actinophagen in der Schrägkultur unterdrückt wird, wenn man sich dieses Herstellungsverfahren der Kultu in der Roux-Flasche zu eigen macht.

Zu der Kultur in der Roux-Flasche werden dann 50 ml sterilisiertes, entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,02 Prozent eines Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat zugegeben. Die Sporen werden durch Schütteln suspendiert. Diese Sporensuspension wird dann al Impfstoff zu 75 Liter eines sterilisierten Nährmedium in einem 100-Liter-Fermentor aus rostfreiem Stah gegeben. Die Zusammensetzung des Nährmedium lautet wie folgt:

Bestandteile

Menge

Gemüsesaft

Agar Entsalztes Wasser

20,0 ml 20,0 g ad 1 Liter Bestandteile

Menge (g/Liter

Sojabohnenmehl

Glucose-monohydrat

Leitungswasser

10,0

20,0

ad 1 Liter

Zur Steuerung des Schäumens werden 50 ml Soja bohnenöl mit einem Gehalt von 10 Volumprozent de bereits genannten Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpo lymerisats zu dem Fermentationsmedium vor einen Sterilisieren gegeben.

Das Medium wird 20 Minuten bei 120⁰C in dem Fermenter mit Dampf sterilisiert. Die Nährlösung wird mit 140 UpM mittels eines Leitschaufelrührers von 19 cm Durchmesser gerührt und durch einen offenendigen Zerstäuber mit 75 Liter je Minute steriler Luft belüftet

Die Temperatur wird auf 28°C eingeregelt. Nach 48stündiger Bebrütung unter diesen Bedingungen wird der Inhalt des Fermenters als Impfstoff zu 1500 Liter eines sterilen Fermentationsmediums in einem 2000 Liter fassenden, voll mit Prallblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile	Menge (g/Liter)
Sojabohnenmehl	10,0
Glucose-monohydrat	20,0
Kreide (gefälltes Calciumcarbonat)	0,2
Kobaltchlorid (CoCl2 · 6 H2O)	0,001
Natriumsulfat (wasserfrei)	1,0
Leitungswasser	ad 1500 Liter

Vor einem Sterilisieren wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 6,0 eingestellt. Zur Verhinderung eines Schäumens werden ebenfalls vor einem Sterilisieren 3 Liter Sojabohnenöl mit einem Gehalt an 10 Volumprozent des bereits genannten Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymerisats gegeben. Nach dem Sterilisieren wird der pH-Wert wiederum mit einer sterilen Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt. Die Fermentationslösung wird mit 106UpM gerührt. Der Rührschaft ist mit 2 Leitschaufeln mit 48,3 cm Durchmesser ausgerüstet. Die Temperatur wird auf 30⁰C und der Luftstrom auf 1200 Liter/Minute eingestellt. Nach 60 Stunden wird die Fermentation gesammelt und durch Zentrifugieren geklärt.

Das vorstehend erzeugte Produkt wird willkürlich mit einer Aktivität von 340 Einheiten je ml bezeichnet. Die Proben werden wie vorstehend beschrieben bestimmt.

1050 Liter des Kulturfiltrais mit 340 Einheiten je ml werden bei 10⁰C und einem pH-Wert von 8 mit 310 Liter Dichlormethan von 10⁰C extrahiert, das 1200 g Cetyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid enthält, indem die beiden Flüssigkeiten bei vorbestimmten Fließgeschwindigkeiten durch Vermischen in den Rohrleitungen gepumpt werden. Die Phasen werden in einer kontinuierlichen Zentrifuge nach vorherigem, etwa 2minütigen Vermischen getrennt. Die Dichlormethan-Phase (300 Liter) wird mit wäßrigem Natriumjodid nochmals extrahiert. Die abermalige Extraktion wird in 4 Ansätzen unter Verwendung von insgesamt 7 Liter Wasser mit einem Gehalt von 210 g Natriumjodid durchgeführt. Die Phasen trennen sich aufgrund der Schwerkraft. Die wäßrige Phase wird mittels Salzsäure vom pH 7,7 auf pH 7,0 eingestellt und filtriert. Der Natriumjodid-Extrakt (7 Liter) enthält 21 900 Einheiten je ml.

Es wird eine lonenaustauschersäule vorbereitet, indem sie mit vernetztem Dextran in einer 0,05 -m Phosphatpufferlösung vom pH 7 mit einem Gehalt von 0,3 m-Natriumchlorid beschickt wird. Die Glassäule hat einen Durchmesser von 10 cm und eine Höhe von 40 cm. Der Natriumjodid-Extrakt (7 Liter) wird bei 5° mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/Minute durch den Ionenaustauscher perkoliert. Die Säule wird mit einer 0,05-m Phosphatpufferlösung ebenfalls vom pH 7 mit einem Gehalt von 0,7-m Natriumchlorid bei 5°C und einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/Minute eluiert 2 Liter des Eluat«. werden verworfen und 90 Fraktionen zu 100 ml gesammelt Die Fraktionen werden in einem Ultraviolett-Spektrophotometer genau untersucht, und diejenigen Fraktionen, die ein Absorptionsmaxima bei etwa 305 mn zeigen, werden gesammelt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt Es handelt sich hierbei um die Fraktionen Nr. 5C bis 62, die nach Vereinigen ein

ίο Volumen von 1440 ml und eine Wirksamkeit von 71 000 Einheiten je ml haben. Es ist zuvor gezeigt worde.r, daß diese Fraktionen mit einem Maximum in diesem Bereich die Substanz MM 13 902 enthalten.

Zu den vereinigten Fraktionen wird Natriumchlorid

t5 (5 g je 100 ml) gegeben. Die Fraktionen werden bei 5° C mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/Minute durch eine Säule von 63 cm perkoliert, die bis zu einer Höhe von 30 cm mit »Amberlite XAD 4«-Harz beschickt ist Unter diesen Bedingungen adsorbiert die Substanz MM 13 902 an das Harz, während dies anorganische Verunreinigungen nicht tun. Die Substanz MM 13 902 wird bei Raumtemperatur mit 200 ml destilliertem Wasser und anschließend 50prozentigem wäßrigen Methanol eluiert. Das Eluat (1 Liter) wird unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30°C auf 70 ml eingeengt, auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und gefriergetrocknet. Man erhält 2,18 g eines braunen Feststoffes, der das teilweise gereinigte Salz der Substanz MM 4550 mit einer Aktivität von 3100 Einheiten je mg darstellt.

0,55 g des teilweise gereinigten Dinatriumsalzes der Substanz MM 4550 werden an einer Säule von 4,5 · 29 cm mit einer Beschickung von Mikrocellulose Chromatographien und dann mit einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis von 4 :1 mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/Minute eluiert. Die ersten 135ml/Eluat werden verworfen und dann 15 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, die das Dinatriu.nsalz der Substanz MM 4550 enthalten, wie

•»ο durch IV-Absorption festgestellt worden ist, werden vereinigt (90 ml), zum Entfernen des n-Propanols bei einer Temperatur unter 30⁰C und unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 87 mg eines gelblichen Pulvers mit einer Aktivität von 6600 Einheiten je mg.

Die vorgenannte Substanz zeigt ein UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm mit einer Extinktion u"_mvon etwa 240. Diese Substanz besitzt ein Infrarot- und NMR-Spektrum, wie es aus den F i g. 2 und 3 ersichtlich ist. Die antibakterielle Wirksamkeit der Substanz ist in Tabelle X angegeben. Die Elementaranalyse der Substanz läßt erkennen, daß sie u. a. Stickstoff, Schwefel und Natrium wahrscheinlich in einem Verhältnis von N : S : Na wie 2:2:2 besitzt. Die positiven und negativen Maxima der kreisförmigen Dichroismus-Kurven für das Dinatriumsalz der Substanz MM 4550 werden auf einem »Cary-eiK-Aufzeichungsspektropolarimeter bei Konzentrationen von 0,37 mg/ml bei einer Lauflänge von 1 cm bestimmt. Man erhält folgende

bo Ergebnisse:

/ (nm)

A E/_m

185
207
259
290

+2,4 χ 10
-1,22 χ 10
-2,20 χ 10
-1,89 χ 10

34

Tabelle X

Antibakterielle Wirksamkeit des Dinatnumsalzes der Substanz MM 4550 (Mikrotiter-Methode: starker Impfstoff, 1 Prozent einer über Nacht stehengelassenen Bouillon)

Organismus	Mindesthemm-	Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
	konzentration
	^g/ml)
Bacillus subtilis A	25
Staph. aureus Oxford	20
Staph. aureus Russell	20
Strep, faecaüs	100
Enterbacter cloacae N 1	100
Kleb.aerogenes A	2,5
Proteus mirabilis 13	10
Proteus vulgaris WO 90	5
Prov. stuarti i	5
Ps. aeruginosa A	>100
Salmonella typhimurium CTlO	5
Serratia marcescens US 39	20
Shigella sonnei	5

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Substanz MM 4550 und ihre Salze, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die feste Carbonsäure MM 4550 in Form ihres praktisch reinen Natriumsalzes die folgenden Eigenschaften besitzt;

aa) leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen;

ab) in wäßriger Lösung ein Ultraviolett-Spektrum mit Absorptionsmaxima bei etwa 238 nm und etwa 287 nm;

ac) zu 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch zubereiteten KBr-Pla'.te ein Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u. a. bei etwa 3450, 2950, 1765, 1695, 1510, 1390 und 1260 cm-'; nach etwa 1 Woche seit der Herstellung der KBr-Platte ist das zuvor breite Maximum bei etwa 1765 cm-' beträchtlich abgebaut oder verschwunden;

ad) aufgenommen in deuteriertem Wasser, zeigt das NMR-Spektrum ein Paar Niederfeld-Dubletten mit ihrem Zentium bei etwa 2,45 τ und 3,65 τ mit Kopplungskonstanten bei etwa 15Hz, ein Dublett mit dem Zentrum bei etwa 8,55 r und ein scharfes Singulett bei etwa 7,95 τ;

ae) die Aminosäuren-Analyse zeigt, daß die Substanz kein Polypeptid oder Protein ist; nach saurer Hydrolyse findet man keine Λ-Aminoadipinsäure;

af) die Substanz reagiert mit einem Reagens folgender Zusammensetzung: 300 mg 4-Di- ^ methylaminobenzaldehyd gelöst in einem Gemisch von 54 ml n-Butanol, 9 ml Äthanol und 9 ml konzentrierter Salzsäure, wobei eine blaue Farbe au^f dem Papierchromatogramm und auf den Folien des ^4Ü Dünnschichtchromatogramms erzeugt wird;

ag) die Substanz ist kein allgemeines Enzymgift und hemmt nicht die nachstehenden Enzyme bei Konzentrationen, die höher sind als zur Hemmung der /J-Lactamase von Escherichia coli durch Monoaminoxidase, Carbonsäureanhydrase, Dopadecarboxylase, Trypsin, Chymotrypsin oder Urease erforderlich ist, und ^r>(>

b) das reine Dinatriumsalz

ba) bei der Dünnschichtchromatrographie an Cellulose mit den nachstehenden Systemen die Rr-Werte aufweist:

Butanol/lsopropanol/Wasser im Volumen- ⁵^ verhältnis 7 : 7 :6, Rr = 0,6;
Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7 : 3, Ri = 0,7;

n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumenverhältnis 7 : 7 : 6, R_f = 0,7; ·><> n-Propanol/Wasser im Volumenverhältnis 4 : 1,Ri = 0,6;

bb) die wäßrige Lösung Ultraviolett-Absorptionsmaxima bei etwa 238 nm und bei etwa 287 ηm aufweist. ^Μ