DE2146400B2

DE2146400B2 - Neuer biosynthetischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Herstellung und diesen Wirkstoff enthaltende Arzneimittelpräparate

Info

Publication number: DE2146400B2
Application number: DE2146400A
Authority: DE
Inventors: Denis Redhill Butterworth; George Newboldt Newdigate Surrey Rolinson
Original assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Current assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date: 1970-09-17
Filing date: 1971-09-16
Publication date: 1981-06-19
Also published as: FR2106582A1; AU3358471A; DE2146400C3; BE772636A; DK130226B; GB1363075A; CH562320A5; DE2146400A1; NL7112650A; DK130226C; US3919415A; FR2106582B1

Description

25

30

55

Die Erfindung betrifft einen neuen biosynthetischen Wirkstoff (MM 4550) mit den nachstehenden Parametern:

(a) Säurefunktion,

(b) Hemmung der Penicilline und Cephalosporine abbauenden Wirkung von ß-Lactamase-Enzymen,

(c) Wasserlöslichkeit,

(d) Hemmung des Wachstums von Staphylococcus aureus- und Klebsiella aerogenes-Stämmen,

(e) bei der Elektrophorese Wanderung von 18 cm gegen die Anode auf einem 40 cm langen

60 Papierstreifen aus Whatman-3-MM-Papier unter Verwendung von mit Zellglas abgedeckten Papierdochten einer Gesamtlänge von 10 cm bei 25minütigem Anlegen einer Spannung von 3000 V und unter Verwendung eines Pyridin-Essigsäure-Puffers beim pH-Wert 5,3,

(0 bei der Dünnschichtchromatographie auf Zellglas-(Cellulose)-Blättern und Entwicklung mit einem Gemisch aus Aceton und Pyridin-Acetat-Puffer im Verhältnis 2:1 einen R_f-Wert von etwa 0,85,
(g) Blaufärbung mit Ehrlich'schen Reagens,
(h) synergistische Wirkung im Gemisch mit Ampicillin gegenüber Mikroorganismen von Stämmen von Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis und Staphylococcus aureus,

(i) kein allgemein wirksames Enzymgift und
(j) in Form des Bariumsalzes ein Infrarot-Absorptionsspektrum gemä£ der beigefügten Zeichnung, herstellbar

durch aerobes Züchten eines einen ß-Lactamasehemmstoff erzeugenden Stammes von Streptomyces olivaceus ATCC 21379 oder einer Mutante des Stammes.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen biosynthetischen Wirkstoffes, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Stamm von Streptomyces olivaceus ATCC 21379 oder eine Mutante desselben in einem Nährmedium gezüchtet wird, welches assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff liefernde Verbindungen sowie Mineralsalze enthält, und anschließend der Wirkstoff aus dem Medium abgetrennt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird mittels des Stammes von Streptomyces olivaceus ATCC 21379 durchgeführt. Dieser hinterlegte Stamm wird aus einer Erdprobe isoliert und als zur Gattung Streptomyces olivaceus gehörig identifiziert

Vorzugsweise wird die Züchtung des Mikroorganismus aerobisch bei Temperaturen zwischen 20 und 35° C und insbesondere bei Temperaturen von 30 bis 31°C in einem Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 7 durchgeführt. Die Züchtung dauert zweckmäßig bis zu etwa 7 Tagen und insbesondere bis zu etwa 2 Tagen.

Der Wirkstoff MM 4550 kann dann aus dem Fermentationsmedium durch Ionenaustauschverfahren, durch Chromatographie, durch Gelfiltration oder andere bekannte Abtrennungsmethoden isoliert werden.

Der vorstehend genannte hinterlegte Stamm mit der Kennummer ATCC 21379 wurde in den verschiedensten Nährmedien bezüglich seiner Wachstumseigenschaften, bezüglich der Melaninerzeugung, bezüglich seiner Sporenmorphologie und auch mittels physiologischer Teste geprüft, beispielsweise im Bezug auf die Stärkehydrolyse, die Gelatineverflüssigung und die Nitratreduktion. Auf Grund der dabei erzielten Ergebnisse wurde er einwandfrei als zur Gattung Streptomyces olivaceus zugehörig bestimmt

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung des neuen Wirkstoffes MM 4550 wird zunächst eine Kultur des Mikroorganismus auf einem geeigneten Nährmedium zwecks Sporenbildung gezüchtet Für Mikroorganismen der Spezies Streptomyces olivaceus hat sich insbesondere eine Hefeextrakt-Glucose-Agarmischung für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Nach der Beimpfung wird diese Kultur etwa 1 bis 2 Wochen lang bei 28° C bebrütet. Die gebildeten Sporen werden dann mittels

sterilen Wassers von dem Nährmedium abgespült und diese Sporensuspension wird zum Beimpfen eines wäßrigen Nährmediums verwendet, in welchem der Mikroorganismus weiter wächst und dabei den neuen biosynthetischen Wirkstoff MM 4550 erzeugt Das so erhaltene Mycel kann außerdem dazu benutzt werden, um eine zweite Menge eines flüssigen Fermentationsmediums zu beimpfen, wodurch erneut eier biosynthetische Wirkstoff erzeugt wird

Die betreffenden Fermentationsmedien müssen Verbindungen enthalten, welche assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff sowie anorganische Salze liefern. Geeignete Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff sind Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Baumwollsaatmehl, bei der Malzdestillation anfallende getrocknete lösliche Rückstände, einzelne Aminosäuren, Proteinhydrolysate sowie Ammoniumverbindungen und Nitrate. Geeignete Kohlenstofflieferanten sind Glucose, Lactose, Maltose, Stärke und Glycerin. Die Ausbeute an dem gewünschten neuen Wirkstoff kann durch Mitverwendung verschiedener Metallsalze in dem Fermentationsmedium erhöht werden, beispielsweise Mangansalze oder Kobaltsalze sowie Kalk (ausgefälltes Calciumcarbonate

Nachdem man die Fermentation bis zu etwa 7 Tagen hat fortschreiten lassen, wird das Fermentationsmedium vom Mycel befreit und der neue Wirkstoff MM 4550 wird dann aus der Fermentationsflüssigkeit extrahiert. Die Fermentation kann selbstverständlich auch mittels eines kontinuierlichen Strömungsverfahrens durchgeführt werden.

Es hat sich gezeigt, daß der neue Wirkstoff MM 4550 zur Hauptsache in der Fermentationsflüssigkeit enthalten ist, und daß nur sehr wenig in den Zellen des Mikroorganismus zurückgehalten wird. Nach Abtrennung des Mycels aus der Fermentationsflüssigkeit nach Beendigung der eigentlichen Züchtungsperiode, beispielsweise durch Filtration, kann der Wirkstoff MM 4550 in einem wesentlichen Ausmaß dadurch gereinigt werden, daß man beispielsweise die den Wirkstoff enthaltende Fermentationsflüssigkeit mit einem Anionenaustauschermaterial, beispielsweise einer ionenaustauschenden Cellulose, behandelt und anschließend die absorbierte Wirkstoffsubstanz eluiert Die so erhaltene Lösung kann dann durch weitere lonenaustauscherbehandlungen auch entsalzt werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, zunächst die Fermentationsflüssigkeit an einer Säule aus Cellulose oder an einer Säule aus einem Kationenaustauscher, wie Amberlite CG 50, chromatographisch zu behandeln, da der Wirkstoff MM 4550 schneller durch eine solche Trennsäule hindurchgeht als die Verunreinigungen. Ein gewisses Ausmaß an Reinigung kann auch dadurch erzielt werden, daß man die Fermentationsflüssigkeit einer Gelfiltration mittels beispielsweise Sephadex G 15 oder G 25 unterwirft.

Nach Durchführung einer oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Reinigungsmaßnahmen kann die dabei erhaltene wäßrige gereinigte Fraktion einer Gefriertrocknung unterworfen werden. Auf diese Weise erhält man den neuen Wirkstoff MM 4550 in Form eines festen Präparates. Dieses Präparat sowie auch gereinigte und gegebenenfalls aufkonzentrierte Fermentationsflüssigkeiten können mittels der verschiedensten Extraktionsmethoden noch weitergehenden Reinigungen unterworfen werden. Es hat sich gezeigt, daß der biosynthetische Wirkstoff MM 4550 bei saurem und neutralem pH-Wert in der vom Mycel befreiten Fermentationsflüssigkeit relativ stabil ist. Bei den teilweise gereinigten wäßrigen Fraktionen ist jedoch die Stabilität des Wirkstoffes wesentlich geringer und darüber hinaus zersetzt sich der Wirkstoff während der Verdampfung bei vermindertem Druck oder bei der

Gefriertrocknung in einem gewissen Ausmaß.

Demzufolge sind die mittels solcher Maßnahmen erhaltenen festen Präparate mit Zersetzungsprodukten des aktiven Wirkstoffes verunreinigt Durch Zusatz eines Borats läßt sich jedoch die Stabilität der Wirkstoffpräparate während ihrer Reinigung und sonstigen Handhabung verbessern.

Die Tatsache, daß sich der Wirkstoff MM 4550 einer Gelfiltration unterwerfen läßt und daß er durch eine Dialysemembrane hindurchgeht, weist daraufhin, daß

is der Wirkstoff ein relativ niedriges Molekulargewicht aufweist

Bei Durchführung einer Elektrophorese während 25 Minuten bei einer angelegten Spannung von 3000 Volt (etwa 60 Volt/cm) und unter Verwendung eines Pyridin-Essigsäurepuffers bei einem pH-Wert von 5,3 wandert der neue Wirkstoff auf einem 40 cm langen Papierstreifen aus Whatman 3MM Papier unter Verwendung von, mit Zellglas abgedeckten Papierdochten einer Gesamtlänge von etwa 10 mm insgesamt etwa 18 cm in Richtung auf die Anode. Der dabei verwendete Puffer besteht aus einer 0,067 molaren Essigsäurelösung, welche mittels Pyridin auf einen pH-Wert von 53 eingestellt worden ist Bei Durchführung einer Dünnschichtchromatographie auf aus Cellulose bestehenden Chromatogrammblättera, welche mit einer Mischung aus Aceton und dem bei der Elektrophorese verwendeten Pyridin-Acetatpuff er (Mengenverhältnis 2:1) entwickelt werden, zeigt der neue Wirkstoff WM 4550 einen Rf-Wert von etwa 035. Die Lage des neuen biosynthetischen Wirkstoffes auf den Chromatogrammen oder den Elektropherogrammen läßt sich mittels biologischer Auswertung oder durch Besprühen mit dem Reagens nach Ehrlich bestimmen. Dieses Reagens besteht aus einer Lösung von 300 mg 4-Dimethylamino benzaldehyd in 9 ml konzentrierter Salzsäure, 9 ml Äthanol und 54 ml n-Butanol. Der neue Wirkstoff ergibt dabei eine blaue Farbreaktion. Der neue Wirkstoff MM 4550 kann auch während der Fermentation und während der Isolierungsmaßnahmen durch den Loch platten-Diffusionstest bestimmt werden. Zu diesem Zweck wird eine geschmolzene Nähr-Agarmasse bei 45° C mit einem geeigneten 0-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsieila aerogenes beimpft und dann setzt man eine solche Menge einer sterilen Lösung von Penicillin G hinzu, daß die Penicillinkonzentration in dem Agar 10 μg/ml beträgt Die Agarmasse wird dann in eine Petrischale eingegossen und nach der Verfestigung werden unter Verwendung eines sterilen Metallschneiders in gleichmäßigen Abständen zylindrische Löcher in die Agarschicht eingestanzt Die zu prüfende Lösung wird dann in die Löcher eingefüllt Die Platte wird bei einer konstanten Temperatur im Bereich von 27 bis 37⁰C bebrütet Während dieser Bebrütungszeit diffundiert der Wirkstoff MM 4550, der in der Testlösung enthalten ist, in die Agarplatte hinein und inhibiert damit die Wirkung der /J-Lactamase, welche durch die in der Agarplatte vorhandenen Klebsiella-Zellen erzeugt wird. Das gleichfalls in der Agarplatte vorhandene Penicillin G wird dadurch vor einer

h5 Zerstörung durch die /?-Lactamase bewahrt und ist in ausreichenden Konzentrationen vorhanden, um ein Weiterwachsen von Klebsiella zu verhindern. In denjenigen Teilen der Agarplatte, in welche der neue

Wirkstoff MM 4550 nicht eindiffundiert ist oder keine ausreichende Konzentration aufweist, wird hingegen das Penicillin G durch die /?-Lactamase zerstört und daher entwickelt sich an diesen Stellen der Agarplatte ein dichtes Wachstum von Klebsieila. Infolgedessen bilden sich um diejenigen Löcher, welche den Wirkstoff MM 4550 enthalten, klare kreisförmige Zonen aus, in denen das Wachstum von Klebsiella verhindert ist. Die Größe einer jeden solchen Zone hängt von der Konzentration des neuen Wirkstoffes in der zu prüfenden Lösung ab.

Eine andere Möglichkeit zur Bestimmung der Menge und Aktivität des neuen Wirkstoffes MM 4550 in einer zu prüfenden Lösung besteht darin, das Ausmaß der Inhibierung einer durch 0-Lactamase hervorgerufenen Hydrolyse von Penicillin G festzustellen. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit wird dabei sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit des Prüfmaterials gemessen. Die Hydrolysegeschwindigkeit von Penicillin G läßt sich dabei durch mikrojodometrische Messung der gebildeten Penicilloinsäure ermitteln.

Die nachstehende Tabelle I belegt das breite Spektrum der antibiotischen Wirksamkeit des neuen Wirkstoffes MM 4550 gegenüber den verschiedensten klinisch bedeutsamen Erzeugern von 0-Lactamase. Für jedes Enzympräparat wird der Prozentsatz der Inhibierung einer Hydrolyse von Penicillin G angegeben, welche auf der Mitverwendung des neuen Wirkstoffes in dem betreffenden Enzympräparat beruht

Die Enzymmengen in den betreffenden Präparaten sind so gewählt, daß die Hydrolysegeschwindigkeit von Penicillin G unter den Versuchsbedingungen im Bereich von 0,1 bis 0,2 μg/ml/min liegt Die Enzympräparate werden unter Zusatz von insgesamt 10 μg/ml Penicillin G bei einem pH-Wert von 7,0 in einem m/20-Phosphatpuffer bei einer Temperatur von 37° C sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit des neuen Wirkstoffes bebrütet Die Konzentration des Wirkstoffes entspricht einer Verdünnung der geklärten Fermentationslösung im Verhältnis 1 :625.

Tabelle I

Inhibierung der Reaktionsgeschwindigkeit während der ersten 10 Minuten

unterschiedlicher Zeiträume durchgeführten Vorbebrütung des Enzyms mit dem Wirkstoff gemessen wird.

jff-Lactamase erzeugender Mikroorganismus

Inhibierung, %

Escherichia coli, Stamm BH 86

Escherichia coli, Stamm HS 23

Klebsiella aerogenes, Stamm Al 83

Proteus vulgaris, Stamm A 51

Pseudomonas pyocyanea, Stamm A 13

Bacillus cereus, Stamm B569/H 68

Staphylococcus pyogenes, Stamm A 0

Staphylococcus pyogenes, Stamm H 18

In jedem Fall ist die Inhibierung fortschreitender Art, d. h. sie nimmt mit der Zeitdauer der Einwirkung des Inhibitors auf das Enzym zu, wie sich insbesondere aus der nachstehenden Tabelle Π ergibt, in welcher der Prozentsatz der Inhibierung der anfänglichen Hydrorysegeschwindigkeit von Penicillin G nach einer während

	Tabelle Il	Dauer (Min.)	der Vorbebrütung	60 120
5		0	30	92
10		19	92	44
		21	43	39
	Fortschreitende Inhibierung von /7-Lactamase-En- zymen durch den Wirkstoff MM 4550 (in Prozent)	9	36	12
15	/S-Lactamase erzeugender Mikroorganismus	0	12	60 70
		0	26	40 60
	Escheria coli, Stamm BIl	0	30	20 30
20	Escheria coli, Stamm HS	0	-
	Klebsiella aerogenes. Stamm Al
25	Proteus vulgaris, Stamm A
Bacillus cereus, Stamm B569/H
Staphylococcus pyogenes, Stamm A
Staphylococcus pyogenes, Stamm H

Es hat sich auch gezeigt daß diese Inhibitorwirkung weder durch Zusatz von überschüssigem Substrat noch durch Dialyse umgekehrt wird. Diese irreversible und fortschreitende Wirkung der Inhibierung von 0-Lactamase, welche schon bei niedrigen Konzentrationen des Wirkstoffes MM 4550 auftritt ist vollständig neuartig und unterscheidet sich ganz wesentlich von der Inhibitorwirkung, weiche bei bestimmten Penicillinen zu beobachten ist Weitere Prüfungen haben bestätigt daß der Wirkstoff MM 4550 nicht ein allgemein wirksames Enzymgift ist

Der neue Wirkstoff MM 4550 in Form des besser gereinigten Bariumsalzes hat außer der Inhibitorwir kung gegenüber /J-Lactamase auch antibakterielle Eigenschaf tea Auch Rohpräparate des Wirkstoffes MM 4550 zeigen eine gewisse antibakterielle Aktivität, doch ist diese wesentlich schwächer als die Aktivität des gereinigten Bariumsalzes. Diese antibakterielle Aktivi tat konnte gegenüber Staphylococcus aureus Oxford und Klebsiella aerogenes gemessen werden.

Weiterhin zeigte sich ganz überraschend, daß ein antibakterieller Synergismus zwischen dem neuen Wirkstoff MM 4550 und Penicillinen besteht

so Demgemäß betrifft die Erfindung auch Arzneipräparate, welche durch einen Gehalt an dem Werkstoff MM 4550 sowie an einem Penicillin gekennzeichnet sind. Der Wirkstoff kann in diesen Arzneipräparaten auch in Form eines nicht-toxischen Salzes und gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch zulässigen Träger- und Verdünnungsmitteln vorliegen.

Bei dem in den Arzneipräparaten mitverwendeten Penicillin handelt es sich insbesondere um a-Aminobenzylpenicillin, Λ-Phenoxyäthylpenicillin und «-Phenoxy- propylpenicillin.

Falls die Arzneipräparate in Form von Tabletten oder als Kindermedizin in Form von Sirupen vorliegen, so können sie inerte Füllstoffe, Bindemittel und Schmiermittel enthalten. Für parenteral Präparate enthalten die Arzneipräparate steriles Wasser und außerdem können sie auch in Form von Gelatinekapseln vorliegen.

Der antibakterieOe Synergismus zwischen dem

erfindungsgemäßen neuen Wirkstoff und einem Penicfl-

Hn ergibt sich aus den in der nachstehenden Tabelle III angegebenen Versuchsdaten, welche die minimale Hemmkonzentration von Ampicillin allein und von Ampicillin in Kombination mit dem neuen Wirkstoff gegenüber den verschiedensten klinisch bedeutsamen pathogenen Bakterienarten zeigt.

Komponente

Menge (g/Liler)

Hefeextrakt

Glucose

Malzextrakt

4,0
20,0
10,0

Tabelle 111

Minimale Hemmkonzentration (
(ff-Aminobenzylpenicillin)

Ampicillin

Bakterienstamm

Ampicillin
allein

Ampicillin mit Wirkstoff
MM 4550*)

Klebsieila aerogenes A 100 2,5

Klebsielia aerogenes E70 250 10,0

Proteus mirabilis 8 1000 5,0

Proteus mirabilis 11 1000 2,5

Proteus mirabilis 889 1000 2,5

Staphylococcus aureus 500 2,5
Rüssel

Staphylococcus aureus H 500 2,5

Staphylococcus aureus 1517 1000 25

*) Der WirkstoffMM 4550 wird dabei in einer Konzentration verwendet, welche einem Zehntel der Konzentration des für den Versuch verwendeten geklärten Fermentationsmediums entspricht. Dieses Fermenlalionsmedium selbst zeigt keine antibiotische Aktivität, wenn es in der gleichen Konzentration gegenüber den acht untersuchten Bakterienstämmen allein geprüft wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Der Stamm Streptomyces olivaceus mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21379 wird 7 Tage lang bei 28°C in flachen Medizinflaschen von 250 ml Fassungsvermögen auf einer schräg geneigten Agarfläche gezüchtet Das Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Komponente

Menge (g/Liter)

Hefeextrakt

Glucose

10,0
10,0
15,0

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert des Nährmediums auf 6,8 eingestellt Durch Abspülen der Schrägkulturen mit 35 ml sterilem Wasser, welches 0,02 Prozent eines oberflächenaktiven Mittels enthält, wird eine Sporensuspension des genannten Bakterienstammes hergestellt Es werden 0,5 ml jeder Sporensuspension dafür verwendet, 20 ml eines sterilen Fermentationsmediums zu beimpfen, welches sich in einem Erlenmeyer-Kolben von 100 ml Fassungsvermögen befindet, der mit Gaze und Wattebäuschen verschlossen ist Dieses Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Der pH-Wert dieses Fermentationsmediums wird auf 8,0 eingestellt und dann wird es 15 Minuten lang im Autoklaven bei 12O⁰C sterilisiert. Nach der Beimpfung wird der Fermentationskolben 4 Tage lang bei einer Temperatur von 28°C auf einem rotierenden Rüttler bebrütet, welcher eine Umdrehungszahl von 240 UpM und eine Hubhöhe von 32 mm hat Anschließend wird die Fermentationsfiüssigkeit des Koibens durch Zentrifugieren vom Mycel befreit und dadurch geklärt und die überstehende Flüssigkeit wird mittels der vorstehend beschriebenen Lochplatten-Diffusionsmethode bezüglich der Aktivität und des Vorliegens des neuen biosynthetischen Wirkstoffes MM 4550 geprüft. Man erhält folgendes Ergebnis:

Mikroorganismus

Durchmesser der Inhibierungszone (mm)

ATCC 21379

17,0

Beispiel 2

Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird eine Sporensuspension des Stammes ATCC 21379 von Streptomyces olivaceus hergestellt. Mit der Sporensuspension werden wiederum 20 ml eines Fermentationsmediums beimpft, welches sich in Erlenmeyer-Kolben von 100 ml Fassungsvermögen befindet, wobei die Kolben durch Gaze und Wattepfropfen verschlossen sind. Dieses Fermentationsmedium A hat die folgende Zusammensetzung:

Fermentationsmedium A

Komponente

Menge (g/Liter)

L-Arginin-Monohydrochlorid	2,5
Lactose	20,0
K₂HPO₄	1,5
NaCl	3.0
MgSO₄ · 7H₂O	1,0
Fe₂(SO₄J₃	0,05
CuSO₄ · 5H₂O	0,003
ZnSO₄ ■ 7H₂O	0,003
MnSO₄ · 4H₂O	0,002

Der pH-Wert des Mediums wird auf 7,0 eingestellt und dann wird dieses 15 Minuten lang im Autoklaven bei einem Druck von 1,05 kg/cm² sterilisiert

Außerdem werden weitere Fermentationsmedien B, C und D hergestellt, bei denen jedoch an Stelle von L-Arginin-Monohydrochlorid die nachstehenden assimilierbaren Stickstoff liefernden Substanzen verwendet werden:

Medium B — L-Tyrosin Medium C — Natriumnitrat Medium D — Ammoniumsulphat

Die Bebrütung der Fermentationskolben wird 4 Tage lang bei einer Temperatur von 28° C auf einem rotierenden Schüttler (Umdrehungszahl 240 UpM, Hubhöhe 32 mm) durchgeführt. Anschließend werden die Fermentationsmedien vom Mycel befreit und geklärt und dann wird jedes Fermentationsmedium bezüglich des Vorliegens und der Aktivität des neuen biosynthetischen Wirkstoffes mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode geprüft:

Medium

Durchmesser der Inhibierungszone (mm)

A B
C
D

22,1
21,6 13,7 12,9

Beispiel 3

Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird eine Sporensuspension des hinterlegten Stammes ATCC 21379 von Streptomyces olivaceus hergestellt. Mit dieser Sporensuspension werden 20 ml eines sterilen Fermentationsmediums in Erlenmeyer-Kolben von 100 ml Fassungsvermögen beimpft. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Komponente

Menge (g/Liter)

L-Tyrosin
Glucose
K-.HPO4 Fe₂(SO₄)₃ CuSO₄·5H₂O MnSO₄ · 4H₂O

1,0

2.0

0,05

0,003

0,004

Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird auf 7,0 eingestellt und dann wird dieses Medium 15 Minuten lang im Autoklaven bei einem Druck von 1,05 kg/cm² sterilisiert Die Fermentationskolben werden bei einer Temperatur von 28° C auf einem rotierenden Schüttler (Umdrehungszahl 240 UpM, Hubhöhe 32 mm) bebrütet Nach Bebrütungszeiten von 20 Stunden bzw. 44 Stunden bzw. 68 Stunden werden jeweils zwei Fermentationskolben entnommen, vom Mycel befreit und dann wird das Fermentationsmedium bezüglich der Menge und Aktivität des neuen Wirkstoffes MM 4550 mittels der Lochplatten-Diffusionsrnethode untersucht Es werden die folgenden Ergebnisse erzielt:

Bebrütungsdauer (StG.)

Mittlerer Durchmesser der
Inhibierungszone (mm)

15,6 28,0
30,5

Beispiel 4

Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 1 stellt man von dem hinterlegten Stamm ATCC 21379 von Streptomyces olivaceus eine Schrägkultur auf einem Hefeextrakt-Glucose-Agar-Nährmedium her. Zu jeder Schrägkultur werden dann 50 ml steriles entionisiertes Wasser mit

0,02 Prozent eines oberflächenaktiven Mittels zugesetzt und die gebildeten Sporen werden durch Schütteln suspendiert. Diese Sporensuspensicn wird als Inoculum zu 75 Liter eines sterilisierten Fermi;ntationsmediums in einem Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl von 100 Liter Fassungsvermögen zugesetzt. Dieses Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Komponente

Menge (g/Liter)

Soyabohnenmehl
Glucose-Monohydrat

10,0
20,0

Als Schaumbremse werden vor dem Sterilisieren 50 ml einer lOvolumenprozentigen Lösung eines Polyoxy- alkylenglykols in Soyabohnenöl zugesetzt. Der Fermentationsbehälter wird 20 Minuten lang bei 120° C mit Dampf sterilisiert. Man rührt dieses Kulturmedium mittels eines mit Leitschaufeln besetzten Scheibenrührers von 19,05 cm Durchmesser mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 140 UpM. Dabei wird sterile Luft durch einen Verteiler mit offenem Verteilerkopf in einer Menge von 75 Liter/Minute zugeführt Der Fermentationsbehälter selbst ist mit Prallplatten ausgestattet. Die Bebrütung wird bei einer Temperatur von 28° C während 45 Stunden durchgeführt. Anschließend setzt man 2,5 Liter dieses Fermentationsmediums als Inoculum zu 50 Litern eines weiteren sterilen Fermentationsmediums in einem anderen Fermer.tationsbehälter aus rostfreiem Stahl von 90 Liter Fassungsvermögen hinzu.

Dieses weitere Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Komponente

Menge (g/Liter)

L-Tyrosin

Glucose-Monohydrat

K₂HPO₄

Fe₂(SO₄)J

CuSO₄ ■ 5H₂O

MnSO₄ · 4H₂O

1,0

2,0

0,05

0.003

0,05

Man stellt den pH-Wert des Mediums mittels einer verdünnten Salzsäurelösung auf 7,0 ein. Als Schaumbremse werden 100 ml einer lOvolumenprozentigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels in Soyabohnen öl zugesetzt Dieses Fermentationsmedium wird 20 Minuten lang bei 120° C mittels Dampf in dem Fermentationsbehälter sterilisiert Man rührt unter Verwendung eines mit Leitschaufeln ausgestatteten Scheibenrührers von 12,7 cm Durchmesser mit einer Geschwindigkeit von 430 UpM, wobei der Fermentationsbehälter selbst mit Prallplatten ausgestattet ist Ober einen Verteiler mit offenem Kopf wird sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 50 Liter/Minute eingeleitet und die Fermentationstemperatur wird auf 30° C gehalten. Unter diesen Bedingungen wird die Bebrütung des Fermentationsmediums 48 Stunden lang durchgeführt Zu verschiedenen Zeiten werden Proben des Fermentationsmediums abgezogen, das Mycel wird daraus entfernt und die geklärte Fermentationslösung wird bezüglich der Menge und der Aktivität des gebildeten biosynthetischen Wirkstoffes mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode geprüft Es werden dabei die folgenden Ergebnisse erzielt:

Bebrütungsdauer (Std.)

Durchmesser der Inhihicrungszone (mm)

14,9 23,5 24,5 26,7

Nach Beendigung der Bebrütung wird das Mycel aus der gesamten Fermentationslösung abgetrennt und zwar mittels Zentrifugieren. Die dabei erhaltene klare überstehende Flüssigkeit wird bei 5° C gelagert.

300 ml dieser geklärten Fermentationslösung werden mittels eines Drehverdampfers im Vakuum auf 30 ml eingeengt. Mit diesem Konzentrat beschickt man eine Kationenaustauschersäule von 5,08 cm Durchmesser und 2,44 m Höhe, welche mit dem Kationenaustauscherharz Amberlite IRC 50 gefüllt ist, das mit einem Natriumboratpuffer ins Gleichgewicht gesetzt worden ist (0,1 Prozent (Gewicht/Volumen) Na₂B₄O₇ · 10 H₂O, pH-Wert: 8). Diese Austauschersäule wird mittels des Boratpuffers eluiert und das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 25 ml gesammelt. Die gesamten aktiven Fraktionen werden vereinigt und die dabei erhaltenen 250 ml Flüssigkeit werden im Vakuum mittels eines Drehverdampfers bis auf 20 ml eingeengt Dieses Konzentrat wird an einer Ionenaustauschersäule (Amberlite XAD-I) von 2,54 cm Durchmesser und 45,7 cm Höhe entsalzt Beim Eluieren mit entionisiertem Wasser werden Fraktionen von jeweils 10 ml gesammelt und die aktiven Fraktionen werden vereinigt Man erhält so 80 ml Flüssigkeit Diese Flüssigkeit wird einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man 56 mg eines weißen Pulvers erhält Durch die vorstehend angegebenen Maßnahmen wird eine Reinigungswirkung erzielt, welche bezogen auf die Aktivität dem Fünffachen der Gesamtmenge an Feststoffen in der vom Mycel befreiten Fermentationslösung entspricht.

Beispiel 5

Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 4 züchtet man den hinterlegten Stamm ATCC 21379 von Streptomyces olivaceus unter Verwendung eines Fermentationsmediums der nachstehenden Zusammensetzung:

Komponente Menge (g/Liter)

Soyabohnenmehl	10,0
G lucose-Monohydrat	20,0
MnSO₄ ■ 4H₂O	0,05

Drehverdampfers bis auf 80 ml eingeengt, wobei eine große Menge des Natriumsulfats ausfällt. Das so erhaltene Konzentrat wird filtriert und dann an einer Ionenaustauschersäule (Amberlite XAD-2) von 2,54 cm

■> Durchmesser und 1,52 m Höhe behandelt. Man eluiert mit entionisiertem Wasser und sammelt das Eluat in Fraktionen von jeweils 20 ml. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und die dabei erhaltenen 500 ml Flüssigkeit werden durch Ultrafiltration bis auf 30 ml

ίο aufkonzentriert. Dieses Konzentrat ergibt beim Gefriertrocknen 100 mg eines weißen Pulvers, welches den Wirkstoff MM 4550 enthält, wobei die Aktivität etwa das 33fache derjenigen der gesamten in der geklärten Fermentationslösung enthaltenen gelösten Feststoffe beträgt.

Beispiel 6

Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 4 wird der hinterlegte Stamm ATCC 21379 vom Streptomyces olivaceus gezüchtet Das verwendete Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Nach 48 Stunden entfernt man das Mycel aus der Fermentationslösung und klärt diese durch Zentrifugieren. Bei Durchführung des Lochplatten-Diffusionstestes mit der geklärten Flüssigkeit erhält man eine Inhibierungszone von 28,6 nun. 10 Liter der geklärten Fermentationslösung werden mit 3 kg (Naßgewicht) einer ionenaustauschenden Cellulose in Acetatform verrührt Die gebildete Aufschlämmung wird filtriert und der Wirkstoff MM 4550 wird aus dem Ionenaustauscherharz unter Verwendung von 3 Liter einer 0,5 m Natriumsulfatlösung eluiert Man erhält so einen Extrakt des Wirkstoffes in einer Ausbeute von 80 Prozent Dieser Extrakt wird im Vakuum mittels eines

Komponente Menge (g/Liter) Soyabohnenmehl 10,0

G lucose-Monohydrat 20,0 Fällung von Calciumcarbonat 0,2

Kobaltchlorid (CoCl₂ · 6H₂O) 0,001

Als Schaumbremse werden 300 ml einer lOvolumenprozentigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels in Soyabohnenöl zugesetzt Die Bebrütungsdauer beträgt 48 Stunden. Anschließend trennt man das Mycei ab und klärt die Fermentationslösung durch Zentrifugieren. Die geklärte Lösung wird mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode untersucht und man erhält eine Inhibie- rungszone von 33,0 mm. 100 Liter der geklärten Fermentationslösung werden mit 12 kg (Naßgewicht) einer ionenaustauschenden Cellulose in der Acetatform verrührt Die gebildete Aufschlämmung wird filtriert und der neue Wirkstoff wird aus der Cellulose unter Verwendung von 12 Liter einer 0,5 m-Kaliumsulfatlösung eluiert Der dabei gewonnene Extrakt wird bei einer Temperatur unterhalb 30° C im Vakuum mittels eines steigenden Filmverdampfers bis auf 6 Liter aufkonzentriert Durch Zusatz von 12 Liter Aceton fällt

so der größte Anteil des Kaliumsulfats aus. Die Lösung wird dann filtriert und im Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 30⁰C durch Verdampfen bis auf 200 ml aufkonzentriert Dieses Konzentrat wird an einer Ionenaustauschersäule (Amberlite XAD-2) von 76 mm Durchmesser und 2 m Höhe behandelt Man eluiert mit entionisiertem Wasser und sammelt das Eluat in Fraktionen von jeweils 140 ml. Die aktiven Fraktionen (die Aktivität wird mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode festgestellt) werden vereinigt und die so

bo erhaltenen 22 Liter Flüssigkeit werden unter Stickstoffdruck von 4,20 kg/cm² mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran von 150 mm Durchmesser bis auf 275 ml Flüssigkeit aufkonzentriert Beim Gefriertrocknen dieses Konzentrats erhält man 22 g eines braunen Pulvers. 1 g dieses Pulvers (32 Aktivitätseinheiten/mg) werden in 1 Liter einer 0,2 m-Natriumsuifatlösung aufgelöst und dann mit 1 Liter einer 2prozentigen Lösung (Gewicht/Volumen) von Tetra-n-

butyl-ammonium-hydrogensulfat in Dichlormethan vermischt Unter der Einwirkung der Schwerkraft trennt sich die Dichlormethanphase ab und wird bis auf 20 ml aufkonzentriert Dann setzt man 400 ml eines Leichtbenzins (Siedebereich 40 bis 60⁰C) hinzu und trennt den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren ab. Dieser Niederschlag wird in 10 ml Dichlormethan aufgelöst und mit 10 ml Wasser extrahiert, welches 80 mg Bariumjodid und 70 mg Bariumcarbonat enthält Die sich ausbildenden Phasen werden voneinander getrennt und die wäßrige Phase wird filtriert und auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt Durch Gefriertrocknen dieser Lösung erhält man ein gelbes Pulver. Der so gewonnene Feststoff wird mit Aceton ausgewaschen, um überschüssiges Bariumjodid aufzulösen. Durch Zentrifugieren wird ein schwach gelb gefärbter Feststoff isoliert und im Vakuum getrocknet Man erhält auf diese Weise 13 mg eines Feststoffes mit eine: Aktivität von 320 Aktivitätseinheiten/mg.

Beispiel 7

(a) Eine Mischung aus 125 mg Ampicillin-trihydral und 125 mg des Wirkstoffes MM 4550 wird ir Gelatinekapseln für orale Verabreichung eingefüllt

(b) Entsprechende Mischungen des neuen Wirkstoffes werden unter Verwendung von α -Phenoxy äthylpenicil·

ίο lin und Λ-Phenoxypropylpenicillin in Form von Gelatinekapseln hergestellt

(c) Eine Mischung aus 250 mg des Natriumsalzes vor Ampicillin und 125 mg des Wirkstoffes MM 4550 wird unter sterilen Bedingungen in eine Ampulle abgerollt

is und diese wird verschlossen. Durch Vermischen des Ampulleninhalts mit sterilem Wasser erhält man eine Injektionsflüssigkeit für parenterale Verabreichung.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

10 Patentansprüche:

1. Biosynthetischer Wirkstoff (MM 4550) mit den nachstehenden Parametern:

(a) Säurefunktion,

(b) Hemmung der Penicilline und Cephalosporine abbauenden Wirkung von /J-Lactamase-Enzymen,

(c) Wasserlöslichkeit,

(d) Hemmung des Wachstums von Staphylococcus aureus- und Klebsieila aerogenes-Stämmen,

(e) bei der Elektrophorese Wanderung von 18 cm gegen die Anode auf einem 40 cm 'langen Papierstreifen aus Whatman-3-MM-Papier unter Verwendung von mit Zellglas abgedeckten Papierdochten einer Gesamtlänge von 10 cm bei 25minütigem Anlegen einer Spannung von 3000 V und unter Verwendung eines Pyridin-Essigsäure-Puffers beim pH-Wert 53,

(f) bei der Dünnschichtchromatographie auf ZeII-glas-(Cellulose)-Blättern und Entwicklung mit einem Gemisch aus Aceton und Pyridin-Acetat-Puffer im Verhältnis 2:1 einen Rf-Wert von etwa 0,85,

(g) Blaufärbung mit Ehrlich'schem Reagens,

(h) synergistische Wirkung im Gemisch mit Ampicillin gegenüber Mikroorganismen von Stämmen von Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis und Staphylococcus aureus,
(i) kein allgemein wirksames Enzymgift und
(j) in Form des Bariumsalzes ein Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß der beigefügten Zeichnung,

erhältlich durch aerobes Züchten eines einem jS-Lactamasehemmstoff erzeugenden Stammes von Streptomyces olivaceus ATCC 2137 P oder einer Mutante des Stammes.

2. Verfahren zur Herstellung des biosynthetischen Wirkstoffes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Streptomyces olivaceus ATCC 21379 oder eine Mutante desselben in einem Nährmedium gezüchtet wird, welches assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff liefernde Verbindungen sowie Mineralsalze enthält, — und anschließend der Wirkstoff aus dem Medium abgetrennt wird.

3. Arzneipräparate auf Basis von Penicillinen, insbesondere «-Aminobenzylpenicillin, «-Phenoxyäthylpenicillin und «-Phenoxypropylpenicillin, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem biosynthetischen Wirkstoff nach Anspruch 1.

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