DE2109854B2 - 7beta-(D-5-Amino-5-carboxy valeramido)-3-(carbamoyloxymethyl>7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und deren Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und solche Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung sind 7/J-(D-5-Amino-S-carboxyvaleramidoVS-fcarbarnoyloxyrnethyl^-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und deren Salze. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind wirksam gegen gramnegative und grampositive Bakterien.

Abgesehen von der antibiotischen Wirksamkeit sind diese erfindungsgemäßen Verbindungen auch Zwischenprodukte bei der Herstellung der entsprechenden 3-Hydroxy-, 3-Acyloxy- und Carbamoyloxy-Derivate. 7/3-(D-5-Amino-5-carboxyva!eramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure weist folaende Strukturformel auf:

OCH,

HOOC-CH-(CHj)₃-C-NH—

NH₂ N

CH₂OCNH₂

COOH

Im folgenden wird 7/J-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure als Antibiotikum 842A oder einfach mit 842A bezeichnet.

In der Verbindung wird für den S-Amino-S-carboxyvaleramidorest die /^-Konfiguration mit Bezug auf den Cephemkern nngenommen.

Zu den erfindungsgemäi3en Salzen gehören organische und anorganische Salze, z. B. Säureadditionssalze, Metallsalze, wie Alkali- und Erdalkalisalze, quaternäre Salze und Aminsalze, die sich von primären, sekundären und tertiären Aminen ableiten, beispielsweise von Monoalkylaminen, Dialkylaminen, Trialkylaminen, niedrigmolekularen Alkanolamine^ Di-niedrigmolekularen Alkanolamine^ niedrigmolekularen Alkylendiaminen, Ν,Ν-Diaralkyl-niedrigmolekular.-alkylendiaminen, Aralkylamine^ aminosubstituierten niedrigmolekularen Alkanolen, Ν,Ν-di-niedrigmolekular.-alkylaminosubstituierten niedrigmolekularen Alkanolen, amino-, polyamino- und guanidinosubstituierten niedrigmolekularen Alkansäuren und stickstoffhaltigen heterocyclischen Aminen. Zu typischen Beispielen dieser Salze gehören Salze, die sich von Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid oder Calciumcarbonat ableiten und Salze, die sich von Aminen, wie Tritriethylamin, Triäthylamin, Piperidin, Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Pro« in, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N'-Dibenzyläthyiendiamm, Diethanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, Theophyllin oder N-Methylglucamin, ableiten.

Die vorstehend erwähnte:). Salze können Monosalze sein, wiedasMononatriumsafz, oder gemischte Disalze, die durch Behandlung eines Äquivalents des Monosalzes mit einem Äquivalent einer abweichenden Base, erhalten wird. Diese Disalze können auch erhalten werden, indem ein Äquivalent einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wi-e beispielsweise Calciumhydroxid, mit einem Äquivalent des Antibiotikums 842A behandelt wird. Bevorzugt sind die Alkali- und Erdalkalisalze, besonders das Mono- und Dinatriumsalz.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden hergestellt, indem man Streptomyces lactamdurans NRLL 3802 in einem üblichen wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, dir Verbindung gemäß Anspruch 1 an einem lonenaustauscherharz isoliert und gewünschtenfalls in ein Salz überführt.

Kultur: Der das Antibiotikum 842A erzeugende Mikroorganismus ist ein bisher unbekannter Stamm der Actinomycetes. Das ursprüngliche Isolat wurde als eine Einzelkolonie aus Boden auf einer Agar-Schrägkultur erhalten und in einem Medium dei folgenden Zusammensetzung gezüchtet:

Hefeextrakt 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphat-Puffer*) 2,0 ml

MgSO₄ · 7 H₂O 0,05 g

Destilliertes Wasser pH 6,5 1000,0 ml

*) Phosphat-Puffer:

KH₂PO, 91,0 g

Na₁HPO₄ 95,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

Nach mehrtägigem Wachstum konnte keine Sporen bildung festgestellt werden. Der Mikroorganismu erzeugte ein Antibiotikum, das sich von bekanntet

Antibiotika auf Grund seines Profils in verschiedenen biologischen und chemischen Untersuchungen unterschied. Vergleiche dieser Daten mit solchen, die über bekannte Antibiotika erhalten wurden, ergaben, daß 842 A eine neue Verbindung ist.

Taxonomie: Per 842 A erzeugende Mikroorganismus (interne Bezeichnung Kultur MA-2908) wurde als ein neuer Actinomycet identifiziert. Die bei dieser Bestimmung verwendete Taxonomie ist in »Bergeys im allgemeinen breitgeformt und von etwa 0,9 · 1,7 μ Größe unterteilt waren.

Das Luftmycel ist kurz, gerade, wenig verzweigt. Es scheint etwa die gleiche Größe wie das vegetative Mycel aufzuweisen - 0,9 μ. Breite. Es ist hell, pulverförmig und leicht abkratzbar.

Das vegetative Mycel ist grampositiv, nicht säurefest. Es haftet fest an dem Agar und ist in einigen Fällen in den Agar eingebettet. Es besteht eine gewisse

Manual of Determinative Bacteriology«, V.Ausgabe io Aufspaltung zu Stäben bei der Schüttelkolbenzüchtung, und in »The Actinomycetes«, Bd. 2, »Classification, die jedoch nicht erheblich ist. Das vegetative Mycel Identification and Description of Genera and Species«, d iä Klb

S. A. VVaksman (1961), beschrieben. Unter Ver-

Wendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, daß die G S

auf den Schüttelkolben und den stationären Kolben (Impfmedium, 4 bis 6 Tage, 28° C) zeigte einige »Keime« und kurze, verdickte, fast knoten- oder keulenartige

g, d kze, verdie, g

Kultur zum Genus Streptomyces gehört und viele der 15 Segmente auf dem Mycel, jedoch waren diese nicht rib d bkt Si S b i

py g

Attribute der bekannten Species Streptomyces fradiae besitzt. Biochemisch stimmt sie vollständig mit letzterer übeiein. Morphologisch bestehen jedoch wesentliche Unterschiede. Beispielsweise ist die Farbe des Liiumycels von S.fradiae ein seemuschelfarbenes Rosa, während die Kultur MA-2908 gewöhnlich cremefarben ticiürbt ist. Auch zeigt das vegetative Wachstum in der ΜΛ-2908-Kultur Pigmentunterschiede auf verschiedenen \erwendeten Medien, und, wie vorstehend anatueben, wurde auf Standard-Taxonomie-Medium keine Sporenbildung wahrgenommen. Auf der Basis dieser Unterschiede wurde die Kultur als eine neue Species Streptomyces lactamdurans bezeichnet. Die folgende Tabelle ' beschreibt die biochemischen Eisen-

ld zahlreich und ihre Bedeutung, falls überhaupt, ist nicht bekannt.

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Vegetatives Wachstum — Rückseite orange, eben, trockenes Aussehen, faltig.

Luftmycel — spärlich, creme-farben.

Kein lösliches Pigment.

Czapek-Dox Agar

Vegetativ — eben, tiefcreme-farben. Luftmycel — pulverförmig, creme-farben weiß.

Kein lösliches Pigment.

Glycerin-Asparagin-Agar

Vegetatives Wachstum — eben, Rückseite goldgelb bis

orange

schäften von Streptomyces lactamdurans und solche 30 Luftmycel — pulverförmig, creme-farben mit blaßdes bekannten Streptomycc-, fradi ;. Sämtliche Werte pfirsich-farbenen Tönungen, in Tabelle I wurden nach

wurden nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28 C ermittelt, ausgenommen i:ort, wo es anders vermerkt ist. Der pH-Wert des verwendeten Mediums bei diesen Untersuchungen war etwa neutral, nämlich 6.8 bis 7,2. Die physiologischen Versuche wurden nach Ablauf von 7 und 21 Tagen durchgeführt.

Tabelle 1
Biochemischer Vergleich

Versuch	Streptomyces lactamdurans	Streptomyces fradiae
Luftmycel ...	gerade, einige	gerade, Verzwei
	Verzweigungen	gungsfäden
Conidien	nicht ermittelt	stabförmig
Lösliches
Pigment	keines	keines
optimale
Temperatur ..	28X	25 C
Invertase	negativ	negativ
Reduktion
von Nitrat ...	negativ	negativ
Gelatine-
Verflüssigung .	positiv	positiv
Cellulose-
verbrauch ...	negativ	negativ
Lackmusmilch	alkalische	alkalische
	Peptonisierung	Peptonisierung

Lösliches Pigment — blaß-bernstein-farben.

Eialbumin-Agar

Vegetatives Wachstum — eben, creme-farben bis gelb.

Luftmycel — pulverförmig, creme-farben.

Kein lösliches Pigment.

Calcium-Malat-Agar

Vegetatives Wachstum — eoen, Ruckseite — gelb mit orange-farbenem Rand.
Luftmycel — pulverförmig, weiß bis creme-farben mit pfirsich-farbenem Rand.

Kein lösliches Pigment.

Tyrosin-Nähragar

Vegetatives Wachstum — eben, gelbbraun bis orange. Luftmycel — spärlich, creme-farben mit weiß.

Kein lösliches Pigment.

Tyrosin-Kristalle werden zersetzt.

Melasse — Hefe-Hydrolysat-Agar Vegetatives Wachstum — eben, Rückseite — orange. Luftmycel — pulverförmig, creme-farben weiß.

Kein lösliches Pigment.

Nähragar Vegetativ — eben goldgelb.

Luftmycel — pulverförmig, creme-farben. Kein lösliches Pigment.

Lackmusmilch

Spärliches Ringwachstum

Wachstum — kein Luftmycel.

Peptonisierung — alkalische Reaktion. pH 7,3 bis 7,4 (Vergleich pH — 6,7).

Entrahmte Milch

Spärliches Ringwachstum — gelbbraun bis orange.

Vegetatives Wachstum — kein Luftmycel, hell-gelbbraunes lösliches Pigment.

gelbbraunes, vegetative;

Morphologie: Sporophore wurden nicht ermittelt,
wenn die Kultur auf den bei der Beschreibung der
Kultureigenschaften aufgeführten Medium gezüchtet
wurde, selbst obgleich wiederholte Beobachtungen bis 65 Peptonisierung — alkalische Reaktion, zu 8 Wochen durchgeführt wurden. Jedoch zeigten pH 7,2 (Vergleich pH — 6,6). gefärbte Impressionsobjektträger lange Fäden, von h

denen viele in Untereinheiten verschiedener Größen

p (g

Magermilch-Agar Vegetatives Wachstum — eben, orange.

Luftmycel — mäßig, creme-farben bis blaß-korallenfarben, hell-gelbbraunes lösliches Pigment. Hydrolyse von Casein,
Gelatine-Ansatz

Spärliches, crerae-farbenes bis orange-farbenes, vegetatives Kolbenwachstum innerhalb des Rohrs suspendiert.

Kein lösliches Pigment.
Vollständige Verflüssigung.
Gelatine-Nähragar

Vegetatives Wachstum — eben, orange. Luftmycel — spärlich, pulverförmig creme-farben. Kein lösliches Pigment.
Verflüssigung von Gelatine.
Stärke-Nähragar

Vegetatives Wachstum — eben, orange-farben. Luftmycel — spärlich, pulverförmig, rosa-farben bis creme-farben.
Kein, lösliches Pigment.
Mäßige Hydrolyse der Stärke.
Synthetischer Stärkeagar

Vegetatives Wachstum — eben, Rückseite — cremefarben mit orange-farbenem Rand. Luftmycel — pulverförmig, weiß mit pfirsich-farbenem Rand.

Kein lösliches Pigment.
Mäßige Hydrolyse der Stärke.
Löffler's BIutserum-Agar

Vegetatives Wachstum — creme-farben bis orange. Luftmycel — keines.
Kein lösliches Pigment.
Keine Verflüssigung.
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar
Vegetatives Wachstum — creme-farben. Luftmycel — spärlich, weiß.
Kein 'ösliches Pigment.
Mikroaerophiles Wachstum

(Hefeextrakt — Dextrose-Stichkultur — 40 mm Tiefe des Stichs).

Gutes Oberflächenwachstum längs des oberen ¹J₄ der Stichlinie.

Temperatur — Hefeextrakt-Dextrose-Schrägkulturen Gutes Wachstum bei 28⁰C.
Spärliches Wachstum bei 37° C.

Kein Wachstum bei 50⁼C,
Hefeextrakt — Dextroseagar
Vegetatives Wachstum — eben, goldgelb.
Luftmycel — pulverförmig, creroe-farben bis blaßfleisch-farben rosa.
Kein lösliches Pigment,
Kartoffelschnitt

Vegetatives Wachstum — trocken, eben, creme-farben bis orange.

ίο Luftmycel — spärlich, creme-farben.
Kein lösliches Pigment.
Reduktion von Nitraten — negativ.

Sämtliche Werte wurden nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28 ⁰C genommen, ausgenommen, wo es anders vermerkt wird. Physiologische Versuche erfolgten nach 7 und 21 Tagen.

Die morphologischen Unterschiede zwischen Streptomyces lactamdurans und Streptomyces fradiae sind in der folgenden Tabelle Il aufgeführt. Die Beobachtungen erfolgten auf den in Tabelle II angegebenen Medien in Wachsintervallen von 1 Woche, 3 Wochen und 8 Wochen. Das Luftmycel von S. lactamdurans ist kurz und gerade mit wenig Verzweigung. Es scheint etwa die gleiche Größe wie das vegetative Mycel aufzuweisen, d. h. 0,9 μ Breite. Es ist hell, pulverförmig und leicht abkratzbar. Das vegetative Mycel ist grampositiv; es ist nicht säurefest. Es haftet fest an einigen Medien und ist in Agar eingebettet. Es besteht eine gewisse Aufspaltung in Stäbe bei Schüttelkolben-Wachstum, jedoch ist dies nicht erheblich. Das vegetative Mycel aus Schüttelkolben und stationären Kolben (Impfmedium während 6 Tagen, 28 ⁼ C) zeigt einige »Keime« und kurze, verdickte, fast keulenförmige Segmente auf dem Mycel, jedoch waren diese nicht zahlreich. Sämtliche Werte in Tabelle II wurden nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28 C genommen, ausgenommen dort, wo es anders vermerkt ist. Der pH-Wert des zu diesen Untersuchungen verwendeten Mediums war etwa neutral, d. h. 6,8 bis 7,2. Die physiologischen Versuche erfolgten nach Ablauf von 7 und 21 Tagen. Die zur Beschreibung verwendeten Farben stehen in Übereinstimmung mit den Definitionen nach »Color Harmony Manual«, 4. Ausgabe, 1958; Container Corporation of America.

Tabelle II
Morphologischer Vergleich von Streptomyces lactamdurans und Streptomyces fradiae

Medium

Streptomyces lactam ^J.urans Streptomyces fradiae

Czapek-Dox-Agar
Nähragar

Glycerin-Asparaginagar

Hefeextrakt-Dextroscagar

Vegetatives Wachstum: eben, tief-creme-farben Luftmycel: pulverförmig, creme-farben-weiß Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum: eben, creme-farben bis

goldgelb

Luftmycel: pulverförmig, creme-farben Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum: eben,

Rückseite — goldgelb bis orange Luftmycel: pulverförmig, creme-farben mit

blaß-pfirsich-far'oener Tönung Lösliches Pigment: blaß-bernstein-farben

Vegetatives Wachstum: eben, goldgelb Luftmycel: pulverförmig, creme-farben bis

blaß-fleischrosa Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum, farblos
Luftmycel: Muschelschalenrosa

Vegetatives Wachstum: orange bis
gelb

Vegetatives Wachstum: sand-farben

Vegetatives Wachstum: sand-farben

Fortsetzune Tabelle II

Medium

Strcplomyces lactnmdurnns Streptomyces fradiac

Synthetischer
Stürkeagar

KartolTelschnitt

Gcliitincstich

.ackmusmilch

Vegetatives Wachstum", eben,

Rückseite —- creme-farben mit orangefarbenen Rändern

Luftmycel: pulverförmig, weiß mit pfirsichfarbenen Rändern

Lösliches Piement: mäßige Hydrolyse der Stärke

Vegetatives Wachstum: trocken, eben,

creme-farben bis orange Luftmycel: spärlich, creme-farben Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum: spärliche, creme-farbene bis orange-farbene Flocken suspendiert in dem Rohr

Luftmycel:

Kein lösliches Pigment

Vollständige Verflüssigung

Vegetatives Wachstum: gelbbraun, spärlicher

Wuchsring Luftmycel: keines Peptonisieruna: alkalische Reaktion,

pH 7,3 bis 7,4 (Vergleich pH - 6.7) Vegetatives Wachstum: farblos
Luftnivccl: Seemuschclrosa

Vegetatives Wachstum: orange

Vegetatives Wachstum: cremefarben bis braun

Vegetatives Wachstum: cremefarben

Kohlehydrat-Verwertung: Die Streptomyces lactam-Jin.ns Kultur (MA-290S) wurde auch hinsichtlich ihrer Fähigkeit, verschiedene Kohlehydrate zu verwerten, oder zu assimilieren, untersucht, indem der Mikroorganismus in einem synthetischen Grundinedium ~ (T. G. P r i d h a ni und D. G ο 111 i e b, I¹MS). das 1°,; des Kohlehydrats enthielt, bei 28⁰C wahrend 3 Wochen gezüchtet wurde. Tabelle IiI gibt die Verwertung oder Assimilation dieser Kohlehydratquellen durch "die Streptomyces lactamdurans Kultur (ΜΛ-29Ο8) wieder. Die Erklärung der Zeichen in Tabelle III sind wie folgt: + bezeichnet gutes Wachstum, ~- bezeichnet geringes Wachstum und — bezeichnet kein Wachstum auf dem speziellen Kohlehydrat.

	Tabelle	III	MA-2908 Kultur
Kohlehydrat	MA-2903 Kultur	Kohlehydrat
Glucose	_1_ I	Rhamnose	—
Arabinose	I	Cellulose	4z
Maltose	_	Fructose	—
Raffinose	4-	Inosit	4;
Saccharose	—	Acetat	ι
Xylose	4-	Citrat	—
Mannit	4-	Paraffin	_!_
Lactose	—	Glycerin
Mannose	—

Die in den Tabellen I bis III beschriebenen Eigenschaften wurden zur Zurückführung der Streptomyceslactamdurans-Kultur (MA-2908) auf eine Species-Klassifikation über die in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Ausgabe, S. 694 bis 829 (1957) und in »The Actinomycetes«, Bd. 2, S. 61 bis (1961) beschriebenen Schlüssel verwendet. Ein Vergleich der detaillierten Eigenschaften der Streptomyces-lactamdurans-Kultur mit bekannten Species zeigt, daß die Kultur biochemisch Streptomyces fradiae ähnlich ist. Jedoch bestehen, wie oben angegeben, bedeutende morphologische Unterschiede, beispielsweise hinsichtlich der Farbe des Luftmycels von S. fradiae, die seemuschelrosa-farben ist, im Vergleich zur Creme-Farbe der Kultur. Auch wurde, während das vegetative Wachstum bei S. fradiae keine Pigmentunterschiede auf verschiedenen Medien ergibt, keine Sporenbildung bei der Kultur festgestellt. Auf der Basis dieser Unterschiede und der in den vorangehenden Tabellen beschriebenen Eigenschaften, wurde der das Antibiotikum 842 A (MA-2908) erzeugende Mikroorganismus als neue Species Streptomyces lactamdurans bezeichnet.

Fermentation: Das Antibiotikum 842A wird durch aerobe Fermentation geeigneter wäßriger Nährmedien unter geregelten Bedingungen durch Beimpfen mit dem Organismus Streptomyces lactamdurans erzeugt. Im allgemeinen können zahlreiche Kohlenstoff- und Stickstoffquellen eingesetzt werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie Zucker, z. B. Glucose, Arabinose, Maltose, Xylose und Mannit, und Stärken, wie Getreide, z. B. Hafer, Reis, Maisstärke und Maismehl. Beispiele für Stickstoffquellen sind Hefehydrolysate, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl, Hydrolysate von Casein, Maisquellflüssigkeit, lösliche Destiilationsriickstände oder Tomatenpaste. Die genaue Menge der Kohlehydrat- und Stickstoffquellen hängt von den anderen im Fermentationsmedium enthaltenen Bestandteilen ab, jedoch liegt im allgemeinen die Kohlehydratmenge gewöhnlich bei 1 bis 6 Gewichtsprozent des Mediums und die Menge an verfügbarem Stickstoff, entweder allein oder in Kombination liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 6 Gewichtsprozent des Mediums. Die verschiedenen, im folgenden beschriebenen Medien dienen zur Erläuterung von Medien, die zur Herstellung des Antibiotikums 842 A geeignet sind.

409 539/368

9 10

Medium IX und die Temperatur bei etwa 28'C gehalten wird

... ,. .... ,,.,, Durch Vc rändern η ü der lintwickliina des Inoculums

Autolvsieile Brauereihete Π'.Ο g , ,, .. , '" , „ , , .. " ,·

. .. .. ·. ,. . .... , .. . iixn ^l|nd Vcrandcrunizcn des Produktionsmediums ist es

I osliche Braiierci-KucKsiande .... -0.0 u , .. . . , . . , , in

. 100" ^ilLlcn '^⁰"!"·"'¹· ^Clile mehrfache Verbesserung der Pro-

. " '⁽'^sc ' ','. .,„„,'.. ~ ι 5 duklion und eine Steiucruim der Wirksamkeit dieses

Desiimerle··. W .i^or K)OO.0 ml . ^₁ ¹-

, Ii - . Antibiotikums zu erreichen.

... ,. Isolierung und Rcinisunn: Has Antibiotikum 842 Λ

.. · , , ,, -If_1n wird durch Ac sorption an einem Ionenaustauschharz.

Soi.ibolinenmehl 30.0 a , . . , . ' . ,.

, ... ... ■ ι, ■· ι ,·■ ι 7 ς , wie beispielsweise an Harzen, die aus quatcrnaren

I osliche Braiicrei-Ruckslaiide .... 7.3 ü , / . ., _1P .. . . ' ,. _P

,.. _ 20 0u ¹⁰ A'^{11171011111111}" oder Sulfonsaure-Austaiischmedien auf-

' ₍^|^OSL 2^c gebaut sind, gereinigt. Das adsorbierte Antibiotikum

υπ.", (nachherpH-VVert auf 7.0)' 1θ!θ g ^wf ^{alls dem} Harzadsorbat mit wäßrigen Lösungen

Destilliertes Wasser 1000.0 ml ^{oder mit el}"^e[ waßngen alkoholischen Losung eines

Me Turn Xl geeigneten Salzes, z. B. Ammoniumchlond oder Na-

Aulolysierte Brauereihefe' 10,0g ¹⁵ jriumchlorid, eluiert. Zu geeigneten, verwendbaren

Lösliche Brauerei-Rückstände .... 20,0 g lonenaustauschharzen gehören beispielsweise d.e PoIy-

Destillier.es Wasser 1000,0 ml styrolharzc m.t im Kern befindlichen Sulfonsaure-

,. η _n gruppen (45 oder 53 „ Wasser) oder Polystyroltn-

' ' methylbenzylammoniumharze (43"-,', Wasser). Gege-

Die F'crmcntation wird bei Temperaturen im Bereich 20 benenfalls kann das nach dem vorstehenden Verfahren

von etwa 20 bis 37 C durchgeführt, vorzugsweise bei erhaltene Eluat durch eine zweite und dritte Adsorp-

etwa 24 bis 32 C. Der pH-Wert der für das Wachstum tions- und EluierungssUife weiter gereinigt werden.

der Streptomyces lactamdurans Kultur (MA-2908) und Zubereitungen: Das Antibiotikum 842A und seine

zur Erzeugung des Antibiotikums 842 A geeigneten Salze können in Kapselform oder als Tabletten, Pulver

Nährmedien soll im Bereich von etwa 6.0 bis etwa 8.0 25 oder flüssige Lösungen oder als Suspensionen oder

liegen. Elixiere verwendet werden. Sie können oral, intravenös

Eine Fermentation des Antibiotikums 842A in oder intramuskulär verabreicht werden. Im allgemci-

kleincm Maßstab wird in einfacher Weise durch Be- nen besteht eine tägliche Dosis aus etwa 15 bis 175 mg.

impfen eines geeigneten Nährmediums mit der das vorzugsweise 40 bis 80 mg aktivem Bestandteil je kg

Antibiotikum erzeugenden Kultur durchgeführt, wo- 30 Körpergewicht.

bei man die Fermentation bei einer konstanten Tem- Die Zubereitungen enthalten je Einheitsdosierung,

peratur von etwa 28°C während mehrerer Tage auf gleich ob flüssig oder fest, im allgemeinen etwa 15 bis

einer Schüttelvorrichtung fortschreiten läßt. Nach etwa 700 mg aktivem Bestandteil, bezogen auf das

Beendigung des Inkubierungszeitraums wird das Mycel Gesamtgewicht der Zubereitungen, bevorzugt 80 bis

entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wird unter- 35 320 mg.

sucht. Eine Schwierigkeit bei der Anwendung der Anti-

In der Praxis erfolgt die Fermentation in einem biotika ist die Empfindlichkeit der meisten Antibiotika

sterilisierten Kolben über eine ein-, zwei-, drei- oder gegenüber enzymatischem Abbau. Beispielsweise ist

vierstufige Keimentwicklung. Das Nährmedium für Penicillin G wirksam gegen zahlreiche grampositive

die Keimstufe kann irgend eine geeignete Kombination 40 und gramnegative Mikroorganismen, jedoch wird es

vor Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein, beispiels- in Gegenwart von Penicillinase zu einer Form abge-

weise eines der vorstehend beschriebenen Medien I bis baut, die gegenüber den meisten pathogenen Erregern

III. Der Keimkolben wird in einer bei konstanter unwirksam ist.

Temperatur von etwa 28 C gehaltenen Kammer Cephalosporin C besitzt Beständigkeit gegenüber Pe-

1 bis etwa 3 Tage geschüttelt, und der erhaltene Wuchs 45 nicillinase, wird jedoch von Cephalosporinasen ange-

wird entweder zur Beimpfung einer zweiten Keim- griffen. Es ist außerdem nur mäßig wirksam, Ar.ti-

stufe oder des Produktionsmediums verwendet. Falls biotikum 842A ist nicht nur beständig gegenüber Pe-

Zwischenstufen-Keimkolben verwendet werden, wer- nicillinase, sondern gleichfalls gegenüber den Cepha-

den diese in praktisch der gleichen Weise entwickelt, losporinasen.

d. h., der Inhalt des Kolbens wird zur Beimpfung des 50 Antibiotikum 842A hat in vielen Fällen eine größere

Produktionsmediums verwendet, die beimpften KoI- Wirksamkeit gegenüber gramnegativen Mikroorga-

ben werden bei einer konstanten Temperatur mehrere nismen als Cephalosporin C, Cephaloridin und Ce-

Tage geschüttelt, und nach Beendigung des Inkubie- phalotin. Zu den gramnegativen Bakterien gehören:

rungszeitraumes wird der Inhalt der Kolben zur Ent- Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis.

fernung des Mycels zentrifugiert. Die überstehende 55 Proteus morganii. Salmonella schottmuelleri, Kleb-

Flüssigkeit oder Brühe wird dann konzentriert und siella pneumoniae AD, Klebsieila pneumoniae B und

unter Erhalt des Antibiotikums 842A gereinigt. Paracolobactrum arizoniae.

Beim Arbeiten in größerem Maßstab wird es bevor- Das Antibiotikum 842 A zeichnet sich außerdem

zugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzu- durch eine sehr geringe Toxizität aus und erzeugt

führen, die mit einem Rührwerk und einer Einrichtung 60 rasche Werte im Blut. Innerhalb von 6 Stunden nach

zur Belüftung des Fermentationsmediums versehen Verabreichung sind etwa 100 % im Urin ausgeschieden, sind. Nach dieser Methode wird das Nährmedium in

den Tank gebracht und durch Erhitzen auf Tempera- Beispiel 1

türen bis zu etwa 120⁰C sterilisiert. Nach dem Kühlen Antibiotikum 842A

wird das sterilisierte Medium mit der Produktions- 65 η j n.·

kuHur beimpft, und man läßt die Fermentation einige ^{Stufe A:} Schuttelkolben-Produktion

Tase, beispielsweise 2 bis 4 Tage, fortschreiten, wäh- Ein lyophilisiertes Röhrchen mit Streptomyces-lac-

1 -nd'das Nährmedium bewegt und/oder belüftet wird tamdurans-Kultur (MA-2908) wurde aseotisch eeöff-

icl. Diis Röhrchen wurde dann zum Beimpfen eines mil Unterteilungen versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 50 ml Nährmedium V enthielt, indem das Röhrchen in steriler Gaze zerbrochen wurde und der Klumpen aseptisch in den Kolben überführt wurde. Das Medium V besaß die folgende Zusammensetzung:

Medium V

Hefc-Autolysat 10,0 g

Glucose 10.0 g

Phosphatpuff er*) 2,0 ml

MgSO₁ · 7 H,O 0,05 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

pH 6,5

*) Phosphatpuflcr:

KH₂PO₁

Na₂HPO₄

Destilliertes Wasser

91.0 g

95,Og

1000,0 ml brauchte Lösung wurde in 500-ml-Fraktionen gesammelt. Die Harzkolonnc wurde mit Wasser gewaschen und mil 3ⁿ,,igem NH₁CI in 90"„igem Methanol eluicrt. Das Eluat wurde in 100-ml-Fraktionen gesammelt.

Scheibcn-Plalienvcrsuche gegen Vibrio percolans (MB-1272) wurden bei sämtlichen Fraktionen durchgerührt: die Zonendurchmesser sind in der folgenden Tabelle aufceführt:

Dieser Keimkolben wurde bei 28C auf einem Rotationsschüttler bei 220 Upm mit einem Hub von 5 cm 3 Tage geschüttelt. Aliquote Mengen von 5 ml (10% Inoculum) dieses Wuchses wurden dann unter Verwendung steriler Pipetten in vier Keimkolben der zweiten Stufe von der gleichen Größe überbracht, welche das gleiche Medium wie vorstehend beschrieben enthielten, und diese Kolben wurden dann in der oben angegebenen Weise geschüttelt. Die Keimkolben der zweiten Stufe wurden dann in einen Kolben aseptisch zusammengegeben und zur Beimpfung von 11 mit Unterteilungen versehenen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 350 ml Medium IX mit 2 bis 3% Inoculum enthielten, unter Verwendung steriler Pipetten beimpft. Das Medium IX hatte die folgende Zusammensetzung:

Medium IX

Autolysierte Brauereihefe 10,0 g

Lösliche Brauereirückstände 20,0 g

Dextrose 10,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

pH 7,0

Die Produktionskolben wurden dann bei 28⁰C auf einem Schüttler bei 145 Upm mit einem Hub von 5 cm 4 Tage geschüttelt. Nach Beendigung des Inkubierungszeitraums wurde der Inhalt von 10 derartigen Kolben vereinigt, und eine Probe wurde zur Entfernung des Mycels zentrifugiert.

Das Vorhandensein des Antibiotikums 842 A in der Brühe wurde durch Agar-Diffusionsversuche bestimmt, die mit 13-mm-Filterpapierscheiben durchgeführt wurden, welche in der Brühe getränkt wurden und auf die Oberfläche der Versuchsplatten gebracht wurden, die 10 ml Medium aus Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt enthielten, und mit dem Bakterieninoculum geimpft war. Die Inhibierungszonen wurden nach Übernacht-Inkubierung bei 28° C in mm gemessen. Die Untersuchungen der nach 4tägiger Fermentation gesammelten Brühe zeigte eine Inhibierungszone von 31,5 mm Durchmesser auf mit Vibrio percolans (MB-1272) beimpften Platten.

Stufe B: Adsorption an ein Anionenaustauschharz

Die nitrierte Brühe wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 7,0 eingestellt, und 2900 ml wurden auf 100 ml eines starkbasischen Anionenaustauschharzes mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix {Chloridzyklus) bei 10 ml/min, adsorbiert. Die ver-

Filtriert	: Brühe	Verbtauchte Fraktion	Zonen größe	Eluatfraktion	Zonen größe
Ver dünnung	Zoncn- größc mm	Fraktion	0	Fraktion	25
keine	26,5	1.	16	1.	29
1 :2	24	2.	23	2.	29
1 :4	20	3.	25	3.	26,5
		4.	27	4.	22
		5.	27	5.	18
		6.		6.	15
				7.	0
			8 bis 10.

Diese Versuche zeigen, daß etwa 60% der Wirksamkeit in der verbrauchten Fraktion und etwa 18% in den Eluaten vorliegen. Ferner zeigen sie an, daß die Harzkapazität lediglich zwei Fraktionen oder 10 Säu-

3υ lenvolumen Brühe beträgt. Die Eluatfraktionen 1 bis 4 wurden kombiniert und unter Entfernen des Methanols konzentriert. Die verbrauchten Fraktionen 3 bis 6 wurden unter Erzielung von 1960 ml Lösung kombiniert. Ein 1860-ml-Anteil der Lösung wurde mit verdünntem Natriumhydroxid von pH 7,2 auf 8,0 eingestellt und an ein starkbasisches Anionenaustauschharz mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix (Chloridzyklus) bei 14 ml/min, adsorbiert. Die verbrauchte Lösung wurde in vier gleichen Fraktionen gesammelt, und Versuche ergaben, das 5% der Wirksamkeit vorlag. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und mit 5%igem, wäßrigem Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde in 50-ml-Fraktionen gesammelt und untersucht. Die Untersuchungen zeigten, daß 90% der Wirksamkeit in den Schnitten 3 bis 16 vorlag, so diese kombiniert wurden.

Stufe C: Adsorption an ein Kationenaustauschharz Ein 50-ml-Anteil eines gemäß Stufe B hergestellten Konzentrats, wurde auf 500 ml verdünnt, der pH-Wert von 8,8 auf 2,0 mit verdünnter Salzsäure eingestellt und an 25 ml eines starksauren Kationenaustauschharzes vom Sulfonat-Typ mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix (Wasserstoffzyklus) bei 2,5 mlj min adsorbiert. Die Kolonne wurde mit 25 ml Wassei gewaschen, dann mit 2 %igem Pyridin eluiert, bis dei pH-Wert des Kolonnenauslaufs auf 7 anstieg (54 ml) Untersuchungen der verbrauchten Fraktionen unc des Eluats zeigten 9% der Wirksamkeit in der ver brauchten Fraktion und 90% im Eluat an. Das Elua wurde als das Pyridiniumsalz des Antibiotikums 842/ identifiziert.

Das Produkt ist amphoter mit. einem scheinbare! isoelektrischen Punkt bei etwa pH 3,5. Das Produk ist oberhalb pH 7 instabil, jedoch bei pH 1,5 stabil Das so erhaltene Eluat wurde auf pH 8,0 mit verdünn ter Natriumhydroxidlösung eingestellt und unter Va kuum zur Entfernung des Pyridine konzentriert. Da

13 14

so erhaltene Produkt wurde als das Mononatriumsalz men zu verhindern. Der Ansatz wurde gewonnen unc des Antibiotikums 842 A identifiziert. Das Molekular- die Wirksamkeit durch Scheibcn-Plattenversuche er gewicht beträgt 468. bezogen auf die empirische Formel. mittclt. Die Fcrmcnlationsbrülie wurde dann durcl

Diatomeenerde bei einem pH-Wert von 7.8 filtriert Analyse fur C₁₆II₂₁N₁SO₀Na: _{5 und c|as so erha}|_tenc p_roclukt wurde als 842Λ identi

Berechnet C 41,0%; H 4.5",,: N 12,0%; fiziert. Scheiben-Plattenversuche einer I : lO-Vcrdün

S 6,8%; 0 30.8%; Na 4,9%; nung ergaben eine Inhibierungs/.onc von 21,5 mn

gefunden C 39,31 "„; H 4,76".,,: N 11,16%; gegen Vibrio percolans (MB-1272).

S 6.46%; 0 34.12",,; Na 4,19%.

„·.,-, ¹⁰ Beispiel 3

B e ι s ρ ι e 1 2

Antibiotikum 84⁷A Mononatriumsalz der 7/9-(D-5-Amino-5-carboxyvaler

amido)-3-(carbamoyloxymethyI)-

Stufcl: Ein lyophilisiertes Röhrchen von Strepto- 7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

myces lactamdurans Kultur (MA-2908) wurde zur Be- ,,,·,-

impfung von 50 ml sterilem Medium V in einem unter- "^{5 Aas}™P^u™ an Kohle: V.er Icrmentat.onsansatze, du teilten 200-ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet. gemäß Beispiel 1 gewonnen wurden, wurden jeweil:

an 100 ml eines starkbasischen Anionenaustausch

Medium V harzes mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix (Chlorid

_inri zyklus) adsorbiert und mit 1 %igem. wäßricem Na

hefe-Autolysat υ,υ g _{20 tril},_{mch]oritl e}|_{uiert- Das E}|_{llat wurde in} 50-ml-Frak

Glucose ······ o'_n ⁸i tionen gesammelt und untersucht. Eluatfraktioner

S⁰C⁵A itr\ ^} η ns" ^von sämtlichen vier Ansätzen wurden aut einen pH

MgbO_? · / H₂O u,UD g _{Wert voiT 5 mjt verdünnter} salzsäure eingestellt unc

Destilliertes Wasser 1000,0 ml _{umer Erzjc}, _{von mQ m}, _{Lösune vereiri}j_{2L 4200 m}

pH unter Verwendung von NaOH _{25 djeser Lösung wurden mjt 42 g} ,^ ^ s_{tllnde ge}

auf 6,5 eingestellt _{rührt Djc Kohle wurde abflItrierl lmd mit Wassei}

*) l'hosphatpufTer: gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung zeigtet

N^²MPO 950g keine Aktivität. Der Kohlekuchen wurde zweimal ml·

DcstillicrteswässeV ""!!!""!.'"" lOOoioml einer I-Liter-Menge 60%igem, wäßrigem Aceto·

3° eluiert, indem das Gemisch '/2 Stunde gerührt unc

Der beimpfte Kolben wurde auf einem Rotations- jeweils filtriert wurde. Die Eluate wurden unter Va schüttler bei 220 Upm mit einem Hub von 5 cm ge- kuum auf 108 mi bzw. 100 ml konzentriert. Versuche bracht und 72 Stunden bei 28° C inkubiert. zeigten, daß das erste Eluat 76% der Aktivität enthielt

Stufe 2: Ein Inoculum von 10,0 ml des erhaltenen, ISmal so wirksam wie das Ausgangsmaterial war unc vegetativen Wuchses wurde dann zur Beimpfung eines 35 daß das zweite Eluat 17% der Wirksamkeit enthieli unterteilten 2-Liter-Erlenmeyer-Kolbens, der 50 ml und 14mal so wirksam wie das Ausgangsmaterial war des oben beschriebenen sterilisierten Mediums V ent- Die beiden Kon/Anträte wurden vereinigt und weitei hielt, verwendet. Der beimpfte Kolben wurde dann auf 61 ml konzentriert und von pH 4 auf pH 5 mil auf einen Rotationsschüttler bei 220 Upm gebracht verdünnter Natriumhydroxidlösung eingestellt. Diese; und 48 Stunden bei 28' C inkubiert. 40 Konzentrat enthielt 40 mg/ml trockene Feststoffe unc

Stufe 3: Der Inhalt des Inoculum-Kolbens wurde ergab eine 25-mm-Zone gegen MB-1772 bei einer Verdann zur Beimpfung eines 190 1 rostfreien Fermenta- dünnung von 1 : 100 (400 mcg/ml). DaJ Produkt wurde tionsbehälters, der ΓόΟ Liter des vorstehend beschrie- als das Mononatriumsalz der 7^-(D-5-Amino-5-carb· benen Mediums V enthielt, verwendet. Das beimpfte oxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-Medium wurde bei 28⁰C 48 Stunden unter Bewegung 45 S-cephem^-carbonsäure identifiziert, inkubiert, während eine Luftströmung von 85 l/min

durch die Fermentationsbrühe beibehalten wurde. Beispiel 4

Während des Fermentationszeilraums1 wurden kleine _{Mononatrjumsalz der 7}/?-(D-5-Amino-5-carbox_yv_aler. Mengen Polypropylene^! (MG 2000) zur Regelung amido)-3-(carbamoyloxym_ethviy

der Schaumung zugegeben. ⁵° T-methoxy-S-cephemVcarbonsäure

Stufe 4: Ein Inoculum von 43 Liter des erhaltenen ' ^K

Wuchses wurde dann zur Beimpfung eines 750 1 Fer- Adsorption an Gel: Ein 22-ml-Antei! des ober

mentationsbehälters aus rostfreiem Stahl verwendet, gemäß Beispiel 1, Stufe B, erhaltenen Eluats wurde der 467 Liter eines sterilen Mediums XI der folgenden mit verdünntem Natriumhydroxid auf einen pH-Wer Zusammensetzung enthielt: 55 von 7,0 eingestellt und auf einer 388 ml eines Gel-

mediums aus kugelförmigem Polyacrylamid, das mi Medium XI Methylen-bis-acrylamid versetzt ist, enthaltenden Ko

Autolysierte Brauereihefe 10,0 g lonne Chromatographien. Die Kolonne wurde mi

Lösliche Brauereirückstände 20,0 g Wasser entwickelt, das ausströmende Gut mit einen·

Destilliertes Wasser 1000,0 ml ^6o Differential-Refraktometer aufgezeichnet und 5-ml

pH 7,0 Fraktionen automatisch gesammelt und biologiscr

untersucht. Die biologische Wirksamkeit trat in der

Man ließ die Fermentation bei einer Temperatur Fraktionen 47 bis 63 auf, während Natriumchlorid ir von 28° C unter Bewegung fortschreiten, während eine den Fraktionen 62 bis 72 auftrat. Die Fraktionen 5( Luftströmung von 280 l/min während 72 Stunden bei- ⁶5 bis 60 wurden zusammengegeben, wieder untersuch behalten wurde. Während der Fermentation wurde und zur Trockne eingeengt, wobei 10,8 mg Rückstanc ein Antischaummittel, Polypropylenglykol (MG 2000), erhalten wurden, der als das Mononatriumsalz dei in kleinen Mengen zugegeben, um übermäßiges Schau- 7/?-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyl

15 16

oxymethyi)-7-rnethoxy-3-ceph8m-4-carbonsäureid8nti- mungsmittel. Das Medium wird mit einer geringen

fiziert wurde. Nach Untersuchung mit Vibrio percolans Menge konzentrierter NaOH-Lösung auf einen pH-

ergab dieses Produkt eine 25-mm-Zone bei 8 mcg/ml. Wert von 7,0 eing8Stellt, in Erleruneyer-Kolben ver-

1,0 g des so hergestellten Mononatriumsalzes der teilt und 15 oder 20 Minuten bei X2l°C autoklaviert.

7/HD-5-Amino-5-carbßxyvaleramido)-3-(carbamoyl- 5 Nach Abkühlen erhielt das Medium ein 2,5%iges

oxymetbyl^-methoxy^-cephem-^carbonsäure wur- Inoculum der in Stufe B erhaltenen Keimkultur. Die

den in 20 ml 1 %igem, wäßrigem, n-Butanol gelöst und Inkubationszeit kann zwischen etwa 50 Stunden und

auT eine Kolonne Chromatographien, die 2530 ml 100 Stunden variieren, jedoch wird ein Inkubations-

eines modifizierten Dextrangels in Perlenform enthielt. Zeitraum von etwa 72 Stunden bevorzugt. Das Vo-

Die Kolonne wurde mit 1 %igem, wäßrigem n-Butanol io lumen des Mediums in jedem Kolben kann zwischen

bei 10 ml/min entwickelt, und 10,5-ml-Fraktionen 30 und 50 ml variieren, jedoch wurden routinemäßig

wurden automatisch gesammelt. Die ausströmende 40 ml verwendet. Das Ausmaß an Inoculum kann

Flüssigkeit wurde mit einem Registrier-Refraktometer zwischen 1 bis 5 % variieren, jedoch wird in der Praxis

aufgezeichnet, und die Fraktionen wurden biologisch im allgemeinen ein Betrag von 2,5% verwendet,
untersucht. Die biologische Wirksamkeit trat in den 15

Fraktionen 99 bis 122 auf, und diese wurden zusam- ^{Stufe D:} Untersuchung

mengegeben und zur Trockene eingeengt, wobei Nach beendeter Fermentation wurden die Zellen

670 mg Produkt erhalten wurden, das vorwiegend das abzentrifugiert und die Brühe mit Phosphatpuffer.

Mononatriumsalz der 7/i-(D-5-Amino-5-carboxyvaler- pH-Wert 7,0, verdünnt. Die Konzentration an 7,Tf-(D-

amido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem- 20 S-Aminoö-carboxyvaleramidoVB-fcarbamoyloxyme-

4-carbonsäure enthielt. thyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure in der Fer-

Die Kolonne wurde anschließend durch Chromato- mentationsbrühe wurde nach der biologischen Stangraphie auf einem Gemisch von Dextran und Natrium- dard-Scheiben-Untersuchungsmethode bestimmt. Der chlorid unter identischen Bedingungen geeicht. Dex- verwendete Untersuchungsorganismus war Vibrio trän wurde in den Fraktionen 85 bis 93 und Natrium- 25 percolans (ATCC 8461). Filterpapierscheiben werden ch'orid in den Fraktionen 140 bis 155 ermittelt, was in die verdünnten Brühen eingetaucht und auf die anzeigt, daß das biologisch-wirksame Produkt von Oberfläche von Agar enthaltenden Petri-Schalen geVerunreinigungen dieser Art abgetrennt werden kann. bracht, die mit dem Versuchsorganismus Vibrio per-. 1- colans inokuliert worder waren. Auch wurden auf Beispiels ^₃₀ diese Petri-Schalen Scheiben gebracht, die vorher in 7tf-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyl- Standardlösungen getaucht worden waren, welche oxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure bekannte Konzentrationen an 842 A enthielten. Die „ Scheiben wurden über Nacht bei 28³C inkubiert und Stufe A: Schragkulturen _{die Durchmesser der} Inhibierungszonen aufgezeichnet.

Ein lyophilisiertes Röhrchen von Streptomyces- 35 Die Konzentrationenan842Ainderfermentierten Brühe

lactamdurans-Kultur (MA-2908) wurde aseptisch ge- werden durch Interpolieren aus der Standardkurve

öffnet und der Organismus in ein Medium der folgen- erhalten, die Zonendurchmesser mit den bekannten

den Zusammensetzung überführt: Konzentrationen der 842A-Standardlösungen in Be-

ziehune setzen. Nach diesem Verfahren wurde beMedium XIl 40 rechnet, daß Streptomyces lactamdurans MB-2908 1 % Restmelasse, 78,6 μg/ml 842 A in dem modifizierten Fermentations-1 % Brauereihefe, verfahren erzeuete.

2,5% Agar pH 7,0, Beispiele

Wasser zur Auffüllung des Volumens. Beispiele

45 für pharmazeutische Zubereitungen

Die Schrägkulturen wurden 7 Tage bei 28^CC inku- a) Trockengefüllte Kapsel

biert. Wenn sie in der Kälte gelagert wurden, waren ^Je Kapsel

die Schragkulturen mehr als 13 Wochen stabil. Antibiotikum 842 A 40 mg

_ . „ Lactose 100 mg

Stufe B: Keimstufen: Zweistufiges System _5<j Magnesiumstearat 5 mg

Erste Keimung: Die erste Keimkultur wird direkt I45 _m„
aus der Schrägkultur der Stufe A zu 40 ml 1 %iger

primärer, getrockneter Hefe, pH-Wert 7,0 in einen Das Antibiotikum 842A wird auf ein Pulver einer

unterteilten 250-ml-Erlcnmeyer-Kolben eingeimpft. Korngröße entsprechend einem Siebdurchgang durch

Die Kolben wurden dann auf einem Rotationsschütt- 55 ein Sieb mit 0,25 mm zerkleinert und dann werden

ler bei 220 Upm mit einem Hub von 5 cm bei 28⁰C Lactose und Magnesiumstearat durch ein Siebtuch

während eines Zeitraums von 2 bis 3 Tagen geschüttelt. mit 0,25 mm lichter Maschenweite auf das Pulver

Zweite Keimung: Ein 2,5%iges Inoculum aus der gegeben, und die vereinigten Bestandteile werden

ersten Keimstufe wurde in einen Kolben gegeben, der 10 Minuten vermischt und dann in Gelatine-Kapseln

ein 2%iges Hefeautolysat, pH-Wert 7,0, enthielt. Der 60 eingefüllt.

Wuchs in dieser Stufe ist in charakteristischer Weise b) Tabletten

hell, und die Inkubierung, die wie in der ersten Stufe Je Tablette

erfolgte, wurde nicht über 48 Stunden ausgedehnt. 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaler-

amido)-3-(carbamoyloxymethyl)-

Stufe C: Produktionsmedium ₆₅ T-methoxy-S-cephem-^carbonsäure 125 mg

Das Produktionsmedium enthielt je Liter destilliertes Maisstärke, U.S.P 6 mg

Wasser: 30 g lösliche Brauereirückstände, 7,5 g pri- Dicalciumphosphat 192 mg

märe, getrocknete Hefe und 0,25% V/V Entschäu- Lactose, U.S.P 190 mg

Der aktive Bestandteil wird mit dem Dicalciumphosphat und der Lactose und etwa der Hälfte der Maisstärke vermischt. Das Gemisch wird dann mit einer 15%igen Maisstärkepaste (6 rag) granuliert und grobgesiebt. Es wird bei 45^aC getrocknet und durch Siebe mit 1,2 mm lichte Maschenweite gesiebt, Der Rest der Maisstärke und das Magnesiumstearat werden zugegeben, und das Gemisch wird zu Tabletten

mit einem Durchmesser von etwa 13 mm, die je 800 mg wiegen, verpreßt,
c) Parenteral Lösung

.[e Ampulle

7/i-(D-5-Amino-5-carboxyvaIeraraido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure 170 mg Steriles Wasser für die Injektion "· —³

g 2 cm³

Claims (3)

1. Patentansprüche;

   1,7/J-(D-5-Amino-5-carboxyvaIeramido)-3-(carbamoyloxymethyO-T-methoxy-S-cephem-^-carbonsäure und deren Salze.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lactamdurans NRLL 3802 in einem üblichen wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, die Verbindung gemäß Anspruch 1 an einem Ionenaustauscherharz isoliert und gewünschtenfalls in ein Salz überführt,
3. 3. Arzneimittel, bestehend aus der Verbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen.