DE2903710A1 - Neue amylase-inhibitoren und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Neue amylase-inhibitoren und verfahren zu deren herstellung

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DE2903710A1 DE19792903710 DE2903710A DE2903710A1 DE 2903710 A1 DE2903710 A1 DE 2903710A1 DE 19792903710 DE19792903710 DE 19792903710 DE 2903710 A DE2903710 A DE 2903710A DE 2903710 A1 DE2903710 A1 DE 2903710A1
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amylase inhibitor
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Kunio Kangouri
Takatoshi Nagate
Shinjuro Namiki
Sadafumi Omura
Kazuhiko Sugita
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Taisho Pharmaceutical Co Ltd
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Description

PATENTANWÄLTE
DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DIPL.-I NG. W. EITLE · D R. RER. NAT. K. HOFFMAN N . DIPL.-ING. W. LEH N
DIPL.-ING. K. FO CH SLE . DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) . D-8000 MO NCH EN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATHE)
31. 676 o/wa
TAISHO PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO / JAPAN
Neue Amylase-Inhibitoren und Verfahren zu deren Herstellung
Oligosaccharidähnliche Amylase-Inhibitoren sind bekannt, z.B. Nojirimycin (Agr. Biol. Chem., 34, 966 (197O)), S-AI (Amylostatin)(US-PS 4 O1O 258), NCGAI (japanische Offenlegungsschrift 54 990/76) und Aminozuckerderivate (US-PS 4 062 950).
Die neuen olxgosaccharidahnlichen erfindungsgemässen Amylase-Inhibitoren TAI-A und TAI-B unterscheiden sich von Nojirimycin dadurch, dass sie keine Aktivität gegenüber oO-Glucosidase zeigen, gegenüber S-AI dadurch, dass sie von sauren und basischen
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Ionenaustauschharzen adsorbiert werden und dass sie keine Inhibierungsaktivität gegenüber einer bakteriellen Verflüssigung von ck-Amylase aufweisen, von NCGAI durch ihre optische Aktivität und dem Fehlen einer Inhibierungsaktivität gegenüber einer bakteriellen Verflüssigung von ck-Amylase und von den Aminozuckerderivaten gemäss US-PS 4 062 950 dadurch, dass sie keine Methylgruppe im Molekül haben.
Die Erfindung betrifft neue Amylase-Inhibitoren und ein Verfahren zu deren Herstellung. Sie betrifft insbesondere neue Amylase-Inhibitoren die als TAI-A und TAI-B bezeichnet werden und die von einem neuen Mikroorganismusstamm der Gattung Streptomyces calvus gebildet werden.
Die Erfindung bezweckt,neue mikrobische Produkte aufzuzeigen, die eine Inhibierungsaktivität gegenüber Amylase und Invertase aufzeigen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu zeigen, wie man die Amylase-Inhibitoren TAI-A und TAI-B herstellen kann.
TAI-A und TAI-B werden durch Kultivierung eines neu isolierten Mikrobenstammes der Gattung Streptomyces calvus gewonnen und sie sind in Form von amorphen Pulvern gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlich. Sowohl TAI-A als auch TAI-B sind oligosaccharidartige Amylase-Inhibitoren und sie sind geeignet zur Bekämpfung von Fettsucht, Diabetes, Prädiabetes, Gastritis, Magengeschwüren, Hyperglycämie, Hyperlipämie und dergleichen.
Der Mikrobenstamm, der TAI-A und TAI-B produziert, wurde von einer Bodenprobe isoliert und wurde mit Streptomyces calvus TM-521 bezeichnet (ATCC-Nr. 31 478).
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Fig. 1 zeigt das IR-Spektrum von TAI-A auf Tabletten von KBr;
Fig. 2 zeigt das IR-Spektrum von TAI-B auf Tabletten von KBr;
Fig. 3 zeigt das kernmagnetische Resonanzspektrum von TAI-A in D2O;
Fig. 4 zeigt das kernmagnetische ResonanzSpektrum von TAI-B in D2O;
Fig. 5 zeigt die Stabilität von TAI-A; und Fig. 6 zeigt die Stabilität von TAI-B.
Die neuen Amylase-Inhibitoren TAI-A und TAI-B können durch Kultivierung und durch kontrollierte Bedingungen eines neuen Stammes von Streptomyces calvus TM-521 gewonnen v/erden, der durch die bekannte ISP-(International Streptomyces Project)-Methode gemäss Gottlieb und Shirling identifiziert worden ist.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des neuen Stammes Streptomyces calvus TM-521 sind die folgenden:
(1) Allgemeine morphologische Beobachtungen
Das Mycel auf Succrosenitrat-Agar zeigt eine leicht gekrümmte Hyphe, wobei die Entwicklung eines äusseren Mycels schlecht ist.
Das äussere, oberirdische Mycel auf Hafermehl-Agar, Hefe, Malzextrakt, Agarextrakt und Glucose-Asparagin-Agar zeigt
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eine sehr starke Sporenbildung.
Mikroskopische Untersuchung der Kulturbrühe auf Hafermehl-Agar zeigt sehr starke Entwicklung von äusseren Mycelen und Sporenketten mit primitiven Spiralen. Eine ausgewachsene Sporenkette enthält durchschnittlich etwa 10 Sporen. Eine Elektronenaufnahme der Sporen zeigt, dass diese oval bis rund sind (0,7 bis 1,0 χ 1,0 bis 1,4 um) und eine haarige Oberfläche haben.
(2) Kultureigenschaften
Einige der Kultureigenschaften von Streptomyces calvus TM-521 werden in Tabelle 1 gezeigt.
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Tabelle 1
KULTUREIGENSCHAFTEN VON STREPTOMYCES CALVUS TM-521
Medium Wachstum äusseres
My eel		 lösliches
Pigment
Sucrosenitrat-
Agar
(27°C)		 schlecht, weiss
bis gelblich-
weiss		 schlecht,
zum Teil
weis		 keines
Glucosenitrat-
Agar
(27OC)		 schwach, kleine
Kolonie gelb
lich weiss		 keines keines
Glycerinnitrat-
Agar
(27°C)		 gelblich-weiss
bis gelblich
braun, zum Teil
gelb-braun		 weiss bis
milchweiss		 keines
Stärkenitrat-
Agar
(27OC)		 gelblich-weiss
bis gelb		 pulverig,
weiss		 schwach gelb
Glucoseaspara-
gin-Agar
(27°C)		 gut, grau-weiss
bis gelblich-
weiss, wird spä
ter gelb-braun		 weiss bis
grau-weiss,
zum Teil
weiss oder
grau
GIycerinaspa-
ragin-Agar
(27OC)		 gut, grau-weiss
bis gelb-weiss		 weiss keines
Salz-Stärke-
Agar
(27°C)		 gut, gelblich-
weiss bis gelb
braun		 grau-weiss
bis milch
weiss-, wird
später
braun-weiss		 keines
Nähragar
(27°C)		 schlecht, gelb
lich-weiss		 keines keines
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Fortsetzung Tabelle 1
Medium Wachstum äusseres
My eel		 lösliches
Pigment
Hefeextrakt-
Malzextrakt-
Ag ar
(27OC)		 gut, gelblich
weiss bis gelb
lich braun		 weiss bis
grau-weiss		 keines
Hafermehl-
Agar
(27°C)		 gut, grau-weiss
bis grau-gelb
wird später
gelb-braun		 weiss bis
grau-weiss		 keines
Tyrosin-
Ag ar
(27°C)		 gut, gelblich
weiss bis
gelblich braun,
wird später
braun		 weiss bis
milchweiss
wird spä
ter grau-
weiss		 schwach milch
weiss bis
gelb
Blut-
Agar
(37OC)		 schlecht, feucht
grau		 keines keines
Entrahmte
Milch
(37°C)		 schwach, weiss keines keines
Gelatine-
boullion
(27°C)		 schwach, gelb
lich weiss		 keines keines
Physiologische Eigenschaften
Die physiologischen Eigenschaften dieses Stammes sind die folgenden :
Wachstumstemperaturbereich: 20 bis 45°C auf Hafermehl-Agar; optimale Wachstumstemperatur: 30°C?
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Sauerstoffbedarf: wächst nicht unter anaeroben Bedingungen; Stärkehydrolyse: positiv;
Zellulosezersetzung: negativ;
Koagulierung mit entrahmter Milch: schwach positiv; Peptonisierung von entrahmter Milch: negativ; Verflüssigung von Gelatine: schwach positiv; Verflüssigung von Löffler's koaguliertem Serum: negativ; Bluthämolyse: positiv;
Tyrosinase-Reaktion: negativ;
Melanin-Bildung: negativ;
Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ; Reduktion von Nitrat: negativ.
Der Test über die Kohlenstoffquellenausnutzung gemäss Pridham und Gottlieb zeigt, dass dieser Stamm teilweise oder ganz D-Glucose, D-Xylose, L-Arabinose, Stärke, Lactose, D-Fructose, D-Mannit, Succrose und Raffinose ausnutzt, aber nicht Innosit, L-Rhamnose, Mannose, Galactose und Zellulose, verwertet.
Aus diesen Ergebnissen kann man die mikrobiologischen Eigenschaften des TM-521-Stammes wie folgt zusammenfassen:
Der Stamm TM-521 bildet oberflächliche Mycele mit primitiven Spiralen und die Oberfläche der Sporen ist haarig.
Das Wachstum auf verschiedenen synthetischen Medien ist im allgemeinen weiss bis gelb-weiss und das Mycel ist im allgemeinen weiss bis grau-weiss. Lösliche Pigmente werden im allgemeinen nicht beobachtet, mit Ausnahme der Kultur auf Stärkenitrat-Agar, wo ein schwach gelbes Pigment gebildet wird. Vegetative Mycele auf organischen Medien zeigen gutes Wachstum mit gelblich weiss bis gelblich brauner Farbe und eine sehr starke Entwicklung eines Oberflächenmycels, das weiss bis grau-weiss ist.
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Lösliche Pigmente werden auf den meisten organischen Medien nicht gebildet, mit Ausnahme von Tyrosin-Agar.
Diese Eigenschaften des Stammes TM-521 sind sehr ähnlich denen der "grau gefärbten" Serie der ISP-klassifizierten Streptomyces. Unter diesen Spezies dieser Reihe ist Streptomyces calvus (Antibiotics and Chemotherapy 7, 532-540, (1957)) dem TM-521-Stamm am ähnlichsten hinsichtlich vieler Eigenschaften, einschliesslich der sporenbildenden Hyphe und der Oberflächen der Sporen. Der Stamm unterscheidet sich jedoch gegenüber Streptomyces calvus hinsichtlich der geringen Produktion von Pepton auf entrahmter Milch, der starken Verwertung von Innosit und L-Rhamnose und der schwachen Verwertung von L-Arabinose.
Der Stamm kann deshalb zu einer Abart von Streptomyces calvus eingeordnet werden und er wurde bezeichnet mit Streptomyces calvus TM-521.
Dieser Stamm wurde im Fermentation Research Institut Agency of Industrial Science and Industry, Japan, mit der FERM-P Nr. 41JItJ hinterlegt und beim American Type Culture Collection, Rockwell, Maryland mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31 478.
Die Amylase-Inhibitoren TAI-A und TAI-B erhält man, indem man Keime des Stammes Streptomyces calvus TM-521 in ein wässriges Nährmedium inokuliert und dieses nach einer Schüttel- oder Tauchkulturmethode unter Belüftung kultiviert, und dann die gebildeten Amylase-Inhibitoren TAI-A und TAI-B aus der Kulturbrühe abtrennt.
Als Quelle für assimilierbarne Kohlenstoff sind verschiedene
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Kohlehydrate, wie lösliche Stärke, Maisstärke, Kartoffelstärke, Amylopeptin und Hafermehl besonders geeignet. Bevorzugte Quellen für assimilierbaren Stickstoff schliessen eine grosse Anzahl Verbindungen ein, wie Pepton, Aminosäuren, Casein, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Hefeextrakt und zahlreiche andere stickstoffhaltige Substanzen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs. Chemikalien, wie Harnstoff, Nitrate und Ammonium-Verbindungen können auch als Stickstoffquellen dem Nährmedium zugegeben werden. In einigen Fällen können wichtige Mineralsalze, wie Natriumchlorid,und Antischaummittel, z.B. Siliconöle, dem Nährmittel zugegeben werden. Das Nährmittel kann 1 bis 10 %, vorzugsweise 2 bis 5 %, der Kohlenstoffquelle, 0,1 bis 4 %, vorzugsweise 0,5 bis 2 %, der Stickstoffquelle, und 0,1 bis 1 % der Mineralien, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthalten.
Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert des Mediums auf 5,5 bis 8,0, vorzugsweise 6,6 bis 7,0, eingestellt. Die Kultivierung wird bei einer Temperatur von 20 bis 40°C während bis 5 Tagen, vorzugsweise bei einer Temperatur von 27 bis 35°C während etwa 3 Tagen, vorgenommen. Die Kultur entwickelt sich verhältnismässig schnell unter geeigneten belüfteten Tauchbedingungen und die aktiven Substanzen werden in der Kulturbrühe schon nach 12 Stunden festgestellt. Die jeweilige maximale Produktion von TAI-A und TAI-B wird im allgemeinen nach 60-bis 72-stündiger Fermentation in einem Gefäss erreicht. Die aktivien Substanzen TAI-A und TAI-B können in folgender Weise aus der Kulturbrühe isoliert werden:
Nach der Kultivierung wird die Brühe durch Zentrifugieren gesammelt, um die Mycele zu entfernen. Dann gibt man Aktivkohle zu der Brühe in einer Konzentration von 1 %, um die aktiven Substanzen zu adsorbieren. Nach 1-stündigem Rühren
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wird die Mischung filtriert und die Kohle wird mit einem
wässrigen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol
oder Äthanol, behandelt, um die Mischung von TAI-A und TAI-B zu eluieren. Die wässrige organische Lösung wird im Vakuum
konzentriert. Die erhaltene Lösung kann dann einer kombinierten Säulenchromatografie unterworfen werden unter Verwendung von Ionenaustauschharzen, wie Amberlite IR-120 (H-Form), Amberlite IR-45 (OH-Form) und SP-Sephadex C-25 (H-Form),
Zellulose-Säulenchromatografie und Gelfiltration über Sephadex G-15 und man erhält dabei jeweils TAI-A bzw. TAI-B. Eine bevorzugte Isoliermethode ist die folgende: Man gibt eine
wässrige Lösung auf eine Säule aus Amberlite IR-120 (H-Form). Die Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit 0,1 η wässriger Salzsäurelösung eluiert. Das Eluat wird mit 2 η wässrigem Natriumhydroxid neutralisiert und durch Säulenchromatografie über Aktivkohle entsalzt. Die erhaltene Zubereitung wird durch zusätzliche Säulenchromatografie über SP Sephadex C-25 (H-Form) gereinigt. TAI-A und TAI-B werden aus der rohen Lösung durch Eluieren mit 0,02 η wässriger Salzsäurelösung abgetrennt. TAI-A und TAI-B werden dann mit dem 3,5- bis
4,5-fachen der Fraktionen bzw. dem 5- bis 6-fachen des Volumens der Säule eluiert- Das Eluat wird über eine Säule aus
Amberlite IR-45 (H-Form) gegeben. Das gereinigte TAI-A und
TAI-B erhält man dann durch Lyophilisierung in Form eines weissen Pulvers.
TAI-A und TAI-B haben die folgenden physiko-chemischen und
biologischen Eigenschaften:
(a) Elementaranalyse
TAI-A: C 41 ,44 % H 6 ,27 % N 1 ,32
TAI-B: C 42 ,20 % H 6 ,47 % K 2 ,08
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(b) Molekulargewicht
Die Molekulargewichte von TAI-A und TAI-B betragen 950 bis 1050 bzw. 650.bis 700 nach Bestimmung durch Gelchromatografie über Sephadex G-15, das mit M/20 Phosphatpuffer, enthaltend 0,1 m Kaliumchlorid, pH 6,8, eingestellt worden war.
Maltooligosaccharide (G3-G1Q) wurden als Standard verwen det.
(c) Spezifische optische Drehung
TAI-A: /Ö^7d3 + 157,3° (c=0,5 %, Wasser) TAI-B: I^L/q3 + 142° (c=0,5 %, Wasser)
(d) Infrarot-Absorptionsspektrum
Die IR-Spektren von TAI-A unter Verwendung von KBr-Tabletten zeigten charakteristische Banden bei 3360, 2900, 1635, 1410, 1365, 1230, 1150, 1075, 1020, 925, 850, 760, 700, 570 und 520 cm"1 (Fig. 1).
Die IR-Absorptionsspektren von TAI-B unter Verendung von KBr-Tabletten zeigten charakteristische Banden bei 3360, 2920, 1630, 1410, 1365, 1250, 1150, 1075, 1020, 925, 890, 850, 750, 700, 570 und 515 cm"1 (Fig. 2).
(e) Kernmagnetisches ResonanzSpektrum
Das kernmagnetische Resonanzspektrum von TAI-A und TAI-B bei 60 MHz in D3O wird in Fig. 3 bzw. 4 gezeigt.
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(f) Löslichkeit
TAI-A ist in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich und unlöslich in Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Pyridin.
TAI-B ist in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich, schwach löslich in Methanol und Pyridin, und unlöslich in Äthanol, Äthylacetat, Chloroform und Aceton.
(g) Farbreaktion
Sowohl TAI-A als auch TAI-B zeigen positive Reaktionen beim-Molisch- und Anthron-Test und die Säurehydrolysate reagieren positiv mit Ninhydrin.
(h) pKa
TAI-A: 4,2 (in Wasser), basisch.
TAI-B: 4,5 (in Wasser), basisch
(i) Aussehen
Sowohl TAI-A als auch TAI-B sind weisse Pulver.
(j) Rf-Wert
Die Rf-Werte von TAI-A und TAI-B bei der Dünnschichtchromatografie (Kieselgel 6OF254 (Merck)) und Papierchromatografie (Nr. 50 (Toyo Roshi Co., Ltd.)) werden in Tabellen 2 und 3 gezeigt.
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Tabelle 2 (TAI-A)
Rf-Wert - Rf-Wert
0,40
0,21		 Papierchromatografie 0,16
0,42
Dünnschichtchromatografie Lösungsmittel-
system
Lösungsmittel-
system		 65 % n-Propanol
Pyridin:n-Propanol:
Essigsäure:Wasser
(10:15:3:12)
65 % n-Propanol
n-Butanol:Pyridin
Wasser
(6:4:2,5)
Tabelle 3 (TAI-B)
Dünnschichtchromatografie Papierchromatografie
Lösungsmittel- Rf-Wert
system
65 % n-Propanol 0,46
n-Butanol:Pyridin:
Wasser 0,32
(6:4:2,5)		 Lösungsmittel- Rf-Wert
system
65 % n-Propanol 0,28
Pyridin:n-Propanol:
Essigsäure:Wasser 0,53
(10:15:3:12)
Ultraviolett-Absorptionsspektren
Jeweils 1 %-ige wässrige Lösungen von TAI-A und TAI-B zeigen keine charakteristische Absorption im Ultraviolettbereich der Wellenlänge 210 bis 360 nm.
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23Ö371Ö
(1) Schmelzpunkte
TAI-A hat keinen klaren Schmelzpunkt, sondern zersetzt sich bei 137 bis 142°C:
TAI-B zeigt keinen klaren Schmelzpunkt, sondern zersetzt sich bei 169 bis 174°C.
(m) Komponenten
TAI-A und TAI-B enthalten zwei oder mehr Glucose-Einheiten bzw. eine basische Substanz, welche ein Aminozucker zu sein scheint.
(n) Amylase-Inhibierungsaktivität
Tabelle 4 zeigt den Grad der Inhibierungsaktivität von TAI-A und TAI-B gegenüber verschiedenen Amylasen.
In dieser Tabelle wird die Amylase-Inhibierungsaktivität gegenüber Glucoamylase, der bakteriellen Verzuckerung von ^--Amylase und ß-Amylase in folgender Weise bestimmt:
Eine Mischung aus 50 ul der zu prüfenden Amylaselösung in M/20 Acetatpuffer (pH 5,0) und 50ul Wasser wird 10 Minuten bei 40 C vorinkubiert und dann zu 400 ul einer 1 %-igen Lösung von löslicher Stärke in M/20 Acetatpuffer (pH 5,0) gegeben. Nach 10-minütigem Inkubieren bei 40°C werden 100ul der Reaktionsmischung abgezogen und der freigewordene reduzierende Zucker wird nach der Somaguyi-Nelson-Methode bestimmt. Eine Einheit der Amylaseaktivität entspricht der Menge an
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Enzym, die erforderlich ist, um 0,1 mg Glucose pro Minute in dem Reaktionsgemisch bei 40 C frei zu machen.
Diese Verfahrensweise wird dann nochmals durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 50 ul einer wässrigen Inhibitorlösung anstelle von 50 ul Wasser verwendet werden. Eine Einheit Amylase-Inhibierungsaktivit (IU) wird definiert als die Menge an Inhibitor, die benötigt wird, um zwei Einheiten der Amylaseaktivität unter den oben genannten Bedingungen um 50 % zu inhibieren.
Der Prozentsatz der Inhibierungsaktivität wird durch folgende Gleichung ausgedrückt:
χ loo
worin A die Amylaseaktivitätseinheit der Reaktionsmischung in Abwesenheit des Inhibitors und B die Amylaseaktivitätseinheit der Reaktionsmischung in Gegenwart des Inhibitors ist.
Weiterhin wurde die Amylase-Inhibierungsaktivität bei humaner Speichel-öO -amylase und Schweinepancreasamylase bestimmt^· in der vorerwähnten Verfahrensweise, mit der Ausnahme, dass eine 1 %-ige Lösung von löslicher Stärke in M/15 Phosphatpuffer, enthaltend 0,1 m Natriumchlorid (pH 7,0) anstelle der 1 %-igen Lösung löslicher Stärke in M/20 Acetatpuffer verwendet wird, und die Inhibierungsaktivität gegenüber der bakteriellen Verflüssigung von ^-Amylase und Takaamylase wird durch die Dextrinisierungsaktivität nach dem Verfahren von Wohlgmuth, modifiziert von Tsujisaka, bestimmt und die Inhibierungsaktivität gegenüber Pullulanase nach der Kobayashi-Methode. Die in der nachfolgenden Tabelle gezeigten Aktivitäten sind bei Konzentrationen von 2 ug/ml TAI-A bzw. lOug/ml TAI-B im Reaktionsgemisch bestimmt worden.
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Tabelle
Amylase Intensität TAI-B
bakterielle Verflüssigung von
φ-Ämylase		 TAI-A -
bakterielle Saccharifizierung
von φ-Ämylase		 - +
Taka-amylase + -
humane Speichel-φ -ämylase + +
Schweinepancreas- cLi -ämylase + +
Glucoamylase (Rhizopus niveus) + +
ß~Amylase (Sojabohnen) + -
Pullulanase (Aerobacter aeroge-
nes)		 - -
-
-: O bis 50 % der Amylase-Inhibierungsaktivität +: mehr als 50 % der Amylase-Inhibierungsaktivität
Wirkung auf Stärkehydrolyse von Glucoamylase
Die Inhibierung von TAI-A und TAI-B ist keine konkurrierende Reaktion.
Stabilität
Die Stabilität von TAI-A und TAI-B in wässriger salzsäurer Lösung und wässriger Natriumhydroxidlösung wird bei 100°C
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durch die Restaktivität (%) der Glucoamylase-Inhibierungsaktivität bestimmt und die Ergebnisse werden in den Tabellen 5 und 6 gezeigt. Wie aus diesen Zahlen hervorgeht, sind TAI-A und TAI-B stabil und die Inhibierungsaktivität wird sogar bei 20-minütigem Erhitzen auf 100°C in 0,1 η wässriger Salzsäurelösung oder 0,001 η wässriger Natriumhydroxidlösung beibehalten.
(q) Toxizität
Die Toxizität von TAI-A und TAI-B ist ausserordentlich niedrig. Man bemerkt praktisch keine intravenöse akute Toxizität bei Mäusen bei Dosen von weniger als 1 g/kg Körper- gewicht. Es werden keine Nebenwirkungen bei einer oralen Verabreichung von 1 g/kg/Tag während 21 Tagen an Versuchstiere beobachtet.
(r) Aitiylase-Inhibierung bei Mäusen
Die Versuchsanordnung zum Zeigen der Amylase-Inhibierung bei Mäusen war die folgende: Um eine alimentäre Hyperglycämie zu erzeugen, wurden Gruppen von 6 ddY-Mäusen (20 bis 22 g) 24 Stunden fasten gelassen und dann wurden ihnen oral 1 g/kg gekochte Maisstärke als Suspension oder 2,5 g/kg Succrose in Lösung gegeben. Die andere Gruppe der 6 ddY-Mäuse (20 bis 22 g) erhielt oral die gleichen Kohlehydrate in gleichen Mengen und einen Inhibitor (200 IU/mg) gemäss der Erfindung in den angegebenen Mengen.
Das Niveau der Blutglucose wird in kurzen Abständen nach der Verabreichung unter Verwendung eines Autoanalysators (Hitachi 500) bestimmt.
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Tabellen 6 und 7 zeigen die Wirkung von TAI-A und TAI-B auf das Niveau der Blutglucose der ausgehungerten Mäuse, denen Stärke verabreicht worden war. Bei den Kontrollversuchen und bei den Mäusen, denen der Inhibitor verabreicht worden war, tritt im allgemeinen zunächst eine zeitweilige Hyperglycämie auf und das Blutglucoseniveau fällt im laufe einer Stunde ab. Die Hyperglycämie bei den Mäusen, denen der Inhibitor verabreicht worden war (200 bzw. 1000 IU) fällt langsamer ab als bei den Kontrollversuchen.
Tabellen 8 und 9 zeigen die Wirkung von TAI-A und TAI-B auf das Niveau der Blutglucose bei den ausgehungerten Mäusen, denen Sucrose verabreicht worden war. Eine zeitweilige Hyperglycämie hört nach 15 Minuten auf und das Blutglucoseniveau erholt sich langsam wieder und fällt auf den Anfangswert nach 2 bis 3 Stunden zurück. Die Verabreichung des Inhibitors (80 oder 2000 IU) gemäss der Erfindung schwächt die Intensität der Hyperglycämie.
Tabelle 6
Zeit nach der
Verabreichung der
Stärke		 Blutglucose (Mittelwert + ! TAI-A (
0,2		 mg/Maus)
1,0		 3D) mg/100 ml
5 (min) 0 190+31 169+14 5,0
15 234+28 189+17 143+8,2 136+23
30 220+16 167+21 139+19 132+4,6
60 183+6,8 135+16 123+17 130+1
160+21 130+5,7
Kontrollniveau: 132+16 mg/100 ml
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Tabelle 7
Zeit nach der
Verabreichung der
Stärke		 Blutglucose (Mittelwert + SD) mg/100 ml TAI-B (mg/Maus) 1,0 5,0
0,2 158+13 ■ 136+29
5 (min) O 202+9,1 138+8,5 128+19
15 248+27 178+22 134+21 130+11
30 218+31 158+10 132+14 128+7,2
60 178+8,6 130+16
162+13
Kontrollniveau: 130+8,2 mg/100 ml
Tabelle 8
Zeit nach der
Verabreichung der
Sucrose		 Blutglucose (Mittelwert + SD) mg/100 ml TAI-A (mg/Maus) 2,0 10,0
0,4 98+5,9 119+9,5
0 (min) 0 93+10 127+10 140+11
15 102+9,2 154+27 184+41 142+14
30 288+35 193+25 113+10 109+12
60 217+30 168+18 140+15 134+5,4
120 198+23 142+11 131+5,2 127+10
180 151+19 159+9,8
156+12
Kontrollniveau: 122+18 mg/100 ml
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29Q371Q
Tabelle 9
Zeit nach der
Verabreichung der
Sucrose		 Blutglucose (Mittelwert + SD) TAI-B (mg/Maus) 2,0 mg/100 ml
0,4 92+6,4·
0 (min) 0 89+5,3 123+9,8 10,0
15 98+8,9 142+8,5 172+11 94+7,2
30 276+22 194+23 123+22 118+12
60 208+19 172+18 134+12 140+17
120 188+17 136+12 142+35 108+10
180 162+23 152+35 128+7,8
140+19 134+19
Kontrollniveau: 126+ 21 mg/100 ml
Diese Eigenschaften zeigen, dass sowohl TAI-A als auch TAI-B zur Gruppe der oligosaccharidischen Amylase-Inhibitoren gehören und dass sie sich von bekannten Amylase-Inhibitoren unterscheiden. Sie unterscheiden sich von Nojirimycin, weil dies ein Molekulargewicht von 179 hat und eine Inhibierungsaktivität gegen ß-Glucosidase. S-Ai unterscheidet sich von TAI-A und TAI-B durch die starke Inhibierungsaktivität gegenüber einer bakteriellen Verflüssigung von öO-Amylase und weil es nicht von sauren und basischen Ionenaustauschharzen adsorbiert wird. TAI-A und TAI-B sind NCGAI-ähnlich. indem sie auch zu den Oligosacchariden, enthaltend Glucose, gehören und von stark sauren Ionenaustauschharzen adsorbiert werden. Dagegen unterscheidet sich TAI-A von NCGAI durch das Molekulargewicht, die optische Aktivität und gewisse biologische Eigenschaften. NCGAI hat ein Molekulargewicht von 600, ist nicht
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optisch aktiv und zeigt nur eine geringe Inhibierungsaktivität gegenüber humaner Speichel- oL-amylase und einer bakteriellen Verflüssigung von o^-Amylase. Andererseits hat TAI-A ein Molekulargewicht von etwa 1000 und es inhibiert stark humane Speichel- 0^-amylase, die bakterielle Saccharifizierung von ck-Amylase und von Schweinepancreas-o^-amylase und von Glucoamylase, aber es inhibiert nicht die bakterielle Verflüssigung von cJO-Amylase. Obwohl TAI-B nahezu das gleiche Molekulargewicht wie NCGAI hat, unterscheidet es sich on NCGAI in der optischen Aktivität und gewissen biologischen Eigenschaften. TAI-B ist optisch aktiv und zeigt keine Inhibierung der bakteriellen Verflüssigung von oO
Die Aminozuckerderivatartigen Amylase-Inhibitoren gemäss US-PS 4 062 950 besteht aus 4,6-Bisdesoxy-4-(iS-(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethylcyclohex-2-en-1-yl-amino)- cJj -D-glucopyranose und einer oder mehreren Glucoseeinheiten. TAI-A und TAI-B haben keine Methylgruppen in ihrem Molekül, wie aus den NMR-Spektren hervorgeht. Sie unterscheiden sich deshalb von den vorher erwähnten Aminozuckerderivaten.
TAI-A und TAI-B unterscheiden sich voneinander durch das Molekulargewicht und den Grad der Inhibierungsaktivität gegenüber humaner Speichel-ßO-amylase, Taka-amylase und Schwei nepancreas-fl(/-amylase.
Die erfindungsgemässen Amylase-Inhibitoren sind als Arzneimittel für folgende Indicationen bei Säugern geeignet: Fettsucht, Hyperlipidämie (Arteriosclerose), Diabetes, Prädiabetes, Agastitis, Magengeschwüre, Darmgeschwüre und Karies.
Die in die" Erfindung eingeschlossenen pharmazeutischen Formulierungen schliessen pharmazeutische Zusammensetzungen,
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die für orale und parenterale Verabreichung gedacht sind, ein, z.B. Tabletten, Pulver, Pillen, Dragees, Kapseln, Lösungen, Suspensionen, sterile injizierbare Lösungen, Suppositorien und dergleichen.
In den pharmakologischen Zusammensetzungen können bei der Herstellung von Tabletten, Dragees, Kapseln und Pillen gewöhnlich Verdünnungsmittel verwendet werden: Füller und Extender, wie beispielsweise Stärke, Zucker, Mannit und Kieselsäure; Bindemittel, z.B. Carboxymethylzellulose und andere Zellulosederivate, Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon; Befeuchtungsmittel, wie Glycerin,; Zerfallmittel, wie Agar-agar, Kaliumcarbonat und Natriumbicarbonat; lösungsverhindernde Mittel, z.B. Paraffin; Resorptionsbeschleuniger, z.B. quaternäre Ammoniumverbindungen; oberflächenaktive Mittel, z.B. Cetylalkohol, Glycerinmonostearat; adsorptive Träger, z.B. Kaolin und Bentonit; Gleitmittel, z.B. Talkum, Kalzium- und Magnesiumstearat und feste Polyäthylenglycole; sowie elastomere Binder, wie Pflanzengummi.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise etwa 0,1 bis 99,5, insbesondere etwa 0,5 bis 95,5 Gew.% des Inhibitors, bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung. Zusätzlich zu den erfindungsgemä-sen Inhibitoren können pharmazeutische Zusammensetzungen gemäss der Erfindung auch weitere pharmazeutisch aktive Verbindungen enthalten. Sie können eine Vielzahl von unterschiedlichen Inhibitoren gemäss der Erfindung enthalten. Spezielle Beispiele für andere pharmakologisch aktive Verbindungen sind orale Antidiabetesmittel, wie ß-cytotropische SuIfonylharnstoffderivate und Biguanidine, die das Blutzuckerniveau beeinflussen.
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Die bevorzugte Dosierungseinheit für die erfindungsgemässen Medikamente beträgt 10 bis 500 mg, vorzugsweise 20 bis 100 mg des Inhibitors. Die Dosierungseinheit kann bei Säugern einmal oder mehrere Male täglich oral verabreicht werden und zwar im allgemeinen bevor, während oder nach dem Essen.
Das Beispiel beschreibt die Herstellung des erfindungsgemässen Inhibitors.
Beispiel
Streptomyces TM-521, das auf einer Hafermehl-Agar-Schrägkultur aufbewahrt war, wird zur Herstellung einer Keimkultur zu 500 ml einer autoklavisierten Nährmittellösung, enthaltend 2 % Hafermehl (pH 6,8) in einen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Die Keimkultivierung wird unter Schütteln 48 Stunden bei etwa 30 C durchgeführt. 500 ml dieser Keime werden in einen 30-Liter-Fermentator, enthaltend 20 1 des gleichen wässrigen Mediums, das 30 Minuten bei 121°C sterilisiert worden war, gegeben. Die Kultivierung in dem Fermentator wird 65 Stunden bei 30 C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Kulturbrühe wird zur Entfernung der Mycele zentrifugiert.^' 15 1 der überstehenden Flüssigkeit, enthaltend 200 0OO IU/1 der Inhibierungsaktivität gegenüber Glucoamylase werden erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wird mit Aktivkohle bis zu einer Konzentration von 1 % (W/V) versetzt. TAI-A und TAI-B werden auf der Aktivkohle adsorbiert und anschliessend wird die Aktivkohle durch Filtrieren abgetrennt. Die Aktivkohle wird mit 6 1 Wasser gewaschen und mit 4 1 einer wässrigen 50 %-igen Acetonlösung eluiert. Die aktive Fraktion wird auf 1000 ml im Vakuum konzentriert. Doese Konzentration hat 1,5 χ 10 IU/ml. Zur weiteren Reinigung gibt man das
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Konzentrat auf eine Amberlite IR-120 Säule (H-Form, 4 χ 73 cm). Die Säule wird mit 3 1 Wasser gewaschen und mit einer 0,1 η wässrigen Salzsäurelösung eluiert. Doe aktive Fraktion wird mit 2 η wässriger.Natriumhydroxidlösung neutralisiert und
durch Säulenchromatografie über Aktivkohle entsalzt. Dann
wird die aktive Fraktion auf etwa 1000 ml im Vakuum konzentriert. Die Inhibitorlösung wird auf eine SP Sephadex C-25 (H-Form, 4 χ 73 cm) Säule gegeben. Dabei wird der Amylase;-Inhibitor, TAI-A und TAI-B adsorbiert. Die Säule wird mit 3 1 Wasser gewaschen und mit einer 0,02 η wässrigen Salzsäurelösung eluiert. TAI-A und TAI-B werden in den Fraktionen, die das 3,5- bis
4,5-fache bzw. das 5- und 6-fache des Volumens der Säule ausmachen, eluiert. Die Eluierungschromatogramme von TAI-A und TAI-B von der SP Sephadex C-25 Säule unterscheiden sich voneinander. Die aktiven Fraktionen von TAI-A und TAI-B werden jeweils über einer Amberlite IR-45 Säule (0H-Form) gegeben. Die jeweiligen aktiven Aluate werden auf 20 ml in einem Drehverdampfer konzentriert und Lyophilisiert.
Ausbeute: 400 mg TAI-A als weisses Pulver mit 1300 IU/mg;
300 mg TAI-B als weisses Pulver mit 1900 IU/mg.
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eerse
it

Claims (2)

HOFFMANN · EITIVJu & PAHTNER 23037 1 Ö PATENTANWÄLTE DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPL.-I NG. W.EITLE · D R. RER.NAT. K. HOFFMANN · Dl PL.-ING. W. LEHN Dl PL.-1 NG. K. FOCHSLE . DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) . D-80Q0 MDN CH EN 81 · TELEFON (069) 9Π087 · TELEX 05-29Ä19 (PATH E) 31 676 o/wa TAISHO PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO / JAPAN Neue Amylase-Inhibitoren und Verfahren zu deren Herstellung PA TENTANSPRÜCHE
1. Amylase-Inhibitor TAI-A, charakterisiert durch folgende Eigenschaften:
weisses amorphes Pulver, Zersetzungstemperatur 137 bis 142°C, Kohlenstoffgehalt: 41,44 %, Wasserstoffgehalt: 6,27 %, Stickstoffgehalt: 1,32 %; optische Drehung Ick/p3 = + 157,3° (c=0,5 % Wasser); pKa-Wert 4,2 (in Wasser); Molekulargewicht 950 bis 1050 (bestimmt durch Gelfiltration über Sephadex G-15); löslich in Wasser und Dimethylsuifoxiä und unlöslich in Methanoi, Pyridin, Äthanol, Äthylacetat, Chloroform und Aceton; Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig. 1; kernmagnetisches Resonandspektrum gemäss Fig. 3; mit positiver Reaktion gegenüber Molisch und Anthron; mit positiver Reaktion des
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Säurehydrolysats gegenüber Ninhydrin und mit Rf-Werten bei Dünnschichtchromatografie (Kieselgel 6OF254 (Merck)) und Papierchromatografie (Nr. 50 (Toyo Roshi Co. Ltd.)) wie folgt:
Dünnschichtchromatografie Papierchromatografie Lösungsmittel- Rf-Wert
system
65 % n-Propanol 0,40
n-Butanol:Pyridin:
Wasser 0,21
(6:4:2,5) Lösungsmittel- Rf-Wert
system
65 % n-Propanol 0,16
Pyridin:n-Propa
nol: Essigsäure: 0,42
Wasser
(10:15:3:12)
2. Amylase-Inhibitor TAO-B mit folgenden Eigenschaften:
weisses amorphes Pulver, Zersetzungstemperatur 169 bis 174°C, mit einem Kohlenstoffgehalt von 42,20 %, Wasserstoff gehalt von 6,47 % und einem Stickstoffgehalt von
— —20 ο 2,08 %; optische Drehung (_q}j_/' = +142 (c=0,5 % Wasser); pKa-Wert 4,5 (in Wasser); Molekulargewicht 650 bis 700 (bestimmt durch Gelfiltration über Sephadex G-15); löslich in Wasser und Dimethylsulfoxid, schwach löslich in Methanol und Pyridin und unlöslich in Äthanol, Äthylacetat, Chloroform und Aceton; mit Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig. 2 und mit einem kernmagnetischen ResonanzSpektrum gemäss Fig. 4; mit positiven Reaktionen gegenüber Molisch und Anthron; mit positiven Reaktionen des Säurehydrolysats gegenüber Ninhydrin und mit Rf-Werten bei Dünnschichtchromatografie (Kieselgel 6OG254 (Merck))
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und Papierchromatografie (Nr. 50 (Toyo Roshi Co. Ltd.)) wie folgt:
Dünnschichtchromatografie Papierchromatografie Lösungsmittel- Rf-Wert
system
65 % n-Propanol 0,46
n-Butanol:Pyridin:
Wasser 0,32
(6:4:2,5) Lösungsmittel- Rf-Wert
system
65 % n-Propano-1 0,28
Pyridin:n-Propa-
nol:Essigsäure: 0,53
Wasser
(10:15:3:12)
Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors TAI-A gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man Keime des Stammes Streptomyces calvus TM-521 in ein wässriges Nährmedium gibt, dass man dieses durch eine Schüttel- oder Tauchkultur unter Belüftung kultiviert und dass man den gebildeten Ämylase-Inhibitor TAI-A aus der Kulturbrühe abtrennt.
Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors TAI-B gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass man Keime des Stammes Streptomyces calvus TM-521 in einem wässrigen Nährmedium inokuliert, dass man das Nährmedium einer Schüttel- oder Tauchkultivierung unter Belüftung unterwirft, und dass man den gebildeten Amylase-Inhibitor TAI-B aus der Kulturbrühe abtrennt.
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