DE2652677A1 - Antibiotica 890a tief 1 und 890a tief 3 - Google Patents
Antibiotica 890a tief 1 und 890a tief 3Info
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Description
Patentanwälte: 9 R R ? R 7 7
B München 03, Pienzenauarstr. 28 .«.-,«
19, HOVEMBER 1976
15 745
MERCK & CO., INC. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.
Antibiotica 890A1 und 890A
Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaften
von Penicillin hat grosses Interesse auf diesem Gebiet wachgerufen, das zur Auffindung vieler anderer wertvoller antibiotischer
Stoffe geführt hat; solche Antibiotica sind z.B. andere Penicilline, Cephalosporine, Streptomycin, Bacitracin,
Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycine und dergleichen. Im allgemeinen erstreckt sich die antibakterielle Aktivität
eines jeden dieser Antibiotica nicht auf gewisse klinisch wichtige pathogene Bakterien. So wirken einige hauptsächlich
nur gegen gram-positive Arten von Bakterien. Im Verlaufe der weitverbreiteten Anwendung bisher bekannter Antibiotica zur
Behandlung von bakteriellen Infektionen hat die erworbene Resistenz zum Auftauchen schwieriger Resistenzprobleme geführt.
Daher haben die Mängel der bekannten Antibiotica eine weitere Forschung zur Auffindung anderer Antibiotica angeregt, die
gegen einen weiteren Bereich von Krankheitserregern sowie auch
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gegen resistente Stämme besonderer Mikroorganismen aktiv sind.
Die Erfindung betrifft neue antibiotische Mittel. Insbesondere
bezieht sich die Erfindung auf neue antibiotische Stoffe, die hier als 890A1 und 890A, bezeichnet werden. Die Erfindung umfasst
die Antibiotica in verdünnten Formen, als rohe Konzentrate und in reinen Formen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue und wertvolle Antibiotica zur Verfügung zu stellen,, die in hochgradig wirksamer
Weise das Wachstum verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hemmen. Eine andere Aufgabe der
Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen antibiotischen Stoffe durch Fermentation von Nährmedien mit
Species von Streptomyces zur Verfügung zu stellen.
Die neuen antibiotischen Stoffe gemäss der Erfindung werden
erzeugt, indem man unter gesteuerten Bedingungen neue Stämme von Streptomyces flavogriseus züchtet.
Auf Grund umfangreicher klassifizierender Untersuchungen wurde
festgestellt, dass die im Rahmen der Erfindung verwendeten Stämme von Mikroorganismen der Species Streptomyces flavogriseus
angehören, und diese sind in der Kultursammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., als MA-4434a und MA-4600a bezeichnet
worden. Eine Kultur eines jeden dieser Stämme ist permanent in der Kultursammlung der Northern Regional
Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of
Agriculture, Peoria, 111., niedergelegt worden und hat die Kennzeichnungsnummer NRRL 8139 bzw. 8140 erhalten.
Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 erzeugt beide Antibiotica ^ und 890A^, die in praktisch reiner Form aus der Fermen-
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tationsflüssigkeit isoliert werden. Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 erzeugt das Antibioticum 890A^ ohne nachweisbare
Mengen von 890A,.
Die charakteristischen morphologischen Merkmale und Kulturmerkmale
von Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 sind in der nachstehenden Übersicht zusammengestellt.
Morphologie - Die Sporophoren sind sich verzweigende, gerade
bis geschlängelte Sporenketten, die Büschel bilden. Die Ketten haben eine Länge von mehr als 10 Sporen. Die Sporen sind
kugelförmig bis oval - 0,9 u χ 1,2 ρ (bei 970facher Vergrösserung).
Hafermehl-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich,
pergamentartiges Wachstum;
Luftmycel - hellgrau mit mittelgrauem Rand Lösliches Pigment - keines.
Czapek-Dox-Agar (Saccharose-Nitrat-Agar)
Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun mit dunkelbraunem Rand;
Luftmycel - mittelgrau, samtartig; Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums.
Eieralbumin-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich
mit braunem Rand; Luftmycel - mittelgrau, gemischt mit gelblichgrau
(2dc) und graustichigem Gelb (2db);
Lösliches Pigment - hellgelblich-bräunlich.
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Glycerin-Asparagin-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich,
flach, sich ausbreitend;
Luftmycel - samtartig, hellgrau mit stark gelblichem Ton
Luftmycel - samtartig, hellgrau mit stark gelblichem Ton
bis grau (2dc); Lösliches Pigment - keines.
Anorganische Salze-Stärkeagar Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun;
Luftmycel - mittelgrau, samtartig; Lösliches Pigment - hellgelblich-bräunlich.
Hefeextrakt-Dextrose + Salzagar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun mit sehr dunkelbraunem Rand;
Luftmycel - dunkelgrau, gemischt mit hellgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines.
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun; Luftmycel - dunkelgrau, samtartig;
Lösliches Pigment - keines.
Magermilch-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - spärlich, gräulich; Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums;
Hydrolyse von Casein - gut.
Lackmusmilch
Vegetatives Wachstum - mäßiger Wuchsring, dunkelbräunlich;
Luftmycel - keines; Farbe - purpur;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung;
wird alkalisch, pH 8,2.
Magermilch
Vegetatives Wachstum - mäßiger Wuchsring, bräunlich; Luftmycel - keines;
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Lösliches Pigment - bräunlich;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung;
wird alkalisch, pH 8,0.
Tyrosin-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun; Luftmycel - dunkelgrau;
Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums; Zersetzung von Tyrosin - keine.
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar Vegetatives Wachstum - bräunlich;
Luftmycel - spärlich, gräulich; Lösliches Pigment - keines; Melanin - keines; HpS-Entwicklung - keine.
Nähragar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - hell gräulichbraun mit
dunklerem graubraunem Rand; Luftmycel - hellgrau mit dunkelgrauem Rand;
Lösliches Pigment - keines.
Nährstärke-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich mit grauem Rand; Luftmycel - mittelgrau mit dunkelgrauem Rand;
Lösliches Pigment - keines; Hydrolyse von Stärke - gut.
Nährgelat ine-Agar
Vegetatives Wachstum - farblos mit dunkelgrauem Rand; Luftmycel - gräulich-weiss;
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - gut.
Kartoffelpfropfen
Vegetatives Wachstum - gutes Wachstum, stark gerunzelt;
Luftmycel - grau bis grünlichgrau; Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums.
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Loefflersches Blutserum Vegetatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung - keine.
Senkrechtes Gelatinerohrchen Vegetatives Wachstum - rahmfarben;
Luftmycel - keines; Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - gut.
Alle oben angegebenen Merkmale wurden, falls nichts anderes gesagt ist, nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 C festgestellt.
Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8 bis 7,2). Die in der Beschreibung
verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen in "Color Harmony Manual", 4.Auflage (1958), herausgegeben
von der Container Corporation of America, Chicago, Illinois.
Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 wurde ferner auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder
zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus drei Wochen bei 28 C auf basalem synthetischem Medium
(Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das das betreffende Kohlehydrat in einer Konzentration von 1 % enthielt. Die bei diesen
Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH 6,8 bis 7,2). Tabelle I zeigt die Ausnutzung dieser Kohlehydrate
durch Streptomyces flavogriseus NRRL 8139, wobei + ein gutes Wachstum, - ein schlechtes Wachstum und - kein Wachstum
auf dem betreffenden Kohlehydrat bedeutet.
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Glucose + Maltose +
Arabinose + Mannit +
Cellulose - Mannose +
Fructose + Raffinose
Inosit - Rhamnose +
Lactose + Saccharose +
Xylose +
Für das Ausmaß des Wachstums mit Temperaturänderung und den Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus gilt folgendes:
Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salzagar); 28° C - gut
37° C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 50° C - kein Wachstum
Sauerstoffbedarf (Nadelimpfkultür in Hefeextrakt-Dextrose-
Salzagar);
aerob.
aerob.
Die charakteristischen morphologischen Merkmale und Kulturmerkmale
von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 sind in der nachstehenden Übersicht zusammengestellt.
Morphologie - Die Sporophoren sind sich verzweigende, gerade
bis geschlängelte Ketten von Sporen, die Büschel bilden. Ketten haben eine Länge von mehr als 10 Sporen. Die Sporen sind
rund bis oval - 0,9 u χ 1,2 u (bei 970facher Vergrösserung).
Hafermehl-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich mit
dunkelbraunem Rand;
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Luftmycel - hellgrau mit mittelgrauem Rand; Lösliches Pigment - keines.
Czapek-Dox-Agar (Saccharose-Nitrat-Agar)
Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun mit dunkelbraunem
Rand;
Luftmycel - mittelgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines.
Eieralbumin-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gräulich-bräunlich mit stark gelbbräunlichen Abschnitten;
Luftmycel - mittelgraue, gräulich-weisse und gelblichgraue (2dc) Abschnitte;
Lösliches Pigment - sehr hellbräunlich.
Glycerin-Asparagin-Agar Vegetatives Wachstum - gelblich-bräunlich;
Luftmycel - spärlich, gräulich; Lösliches Pigment - keines.
Anorganische Salze - Stärke-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gräulich-rahmfarben;
Luftmycel - mittelgrau, samtartig;
Lösliches Pigment - keines.
Lösliches Pigment - keines.
Hefeextrakt-Dextrose + Salz-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun; Luftmycel - dunkelgrau, gemischt· mit hellgrau, samtartig;
Lösliches Pigment - keines.
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun; Luftmycel - dunkelgrau, samtartig;
Lösliches Pigment - keines.
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar Vegetatives Wachstum, bräunlich; Luftmycel - keines;
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Lösliches Pigment - keines; Melanin - keines; HpS-Entwicklung - keine.
Nähragar
Vegetatives Wachstum - hellbräunlich; Luftmycel - keines; Lösliches
Pigment - keines.
Nährstärke-Agar
Vegetatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines; Lösliches Pigment - keines;
Hydrolyse von Stärke - gut.
Nährgelatine-Agar
Vegetatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines; Lösliches Pigment - keines;
Verflüssigung von Gelatine - gut.
Senkrechtes Gelatineröhrchen Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - vollständig.
Magermilch-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - keines; Lösliches Pigment - keines;
Hydrolyse von Casein - gut.
Lackmusmilch
Vegetatives Wachstum - bräunlicher Wuchsring; Luftmycel - keines; Farbe - bräunlich-purpur;
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Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung,
wird alkalisch, pH 8,0.
Magermilch
Vegetatives Wachstum - bräunlich, mäßiger Wuchsring; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - hellbraun;
Lösliches Pigment - hellbraun;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung,
wird alkalisch, pH 8,5.
Kartoffelpfropfen Vegetatives Wachstum - gut, bräunlich; Luftmycel - sehr spärlich, weisslich;
Lösliches Pigment - keines.
Loefflersches Blutserum Vegetatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung - keine.
Tyrosin-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums; Zersetzung von Tyrosin - sehr schwach.
Falls nichts anderes angegeben ist, wurden alle obigen Beobachtungen
nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 C durchgeführt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr
neutral (pH 6,8-7,2). Die in der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen in "Color
Harmony Manual", 4.Auflage (1958), Verlag Container Corporation
of America, Chicago, Illinois.
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Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 wurde ferner auf seine Fähigkeit
untersucht, verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus
drei Wochen bei 28 C auf basalem synthetischem Medium (Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das das betreffende Kohlehydrat
in einer Konzentration von 1 % enthielt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral
(pH 6,8-7,2)ο In Tabelle II ist die Ausnutzung dieser Kohlehydrate
durch Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 angegeben,
wobei + ein gutes Wachstum, - ein schlechtes Wachstum und - kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlehydrat bedeutet.
II
Glucose Arabinose
Cellulose Fructose Inosit Lactose Xylose
Maltose Mannit Mannose Raffinose
Rhamnose Saccharose
Für das Ausmaß des Wachstums bei Temperaturänderung und den Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus gilt folgendes:
Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salz-Agar);
28° C - gut
37 C- mäßiges vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 50 C- kein Wachstum
Sauerstoffbedarf
aerob.
aerob.
Hinsichtlich der Erzeugung der neuen Antibiotica ist die Erfindung
nicht auf den Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus
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oder auf Mikroorganismen beschränkt, die den obigen Wachstunismerkmalen
und mikroskopischen Merkmalen vollständig entsprechen. Die Erfindung umfasst vielmehr auch die Verwendung von
Mutanten, die aus den oben beschriebenen Organismen durch verschiedene Hilfsmittel, wie Röntgenstrahlen, ultraviolette
Strahlen, N-Senfgas, Einwirkung von Phagen und dergleichen,
erzeugt werden.
Die neuen Antibiotica 890A^ und 890A, gemäss der Erfindung
werden bei der unter gesteuerten Bedingungen durchgeführten aeroben Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien erzeugt,
die mit Stämmen des Organismus Streptomyces flavogriseus beimpft worden sind. Für die Herstellung von 890A^ und 890A,
eignen sich wässrige Medien, wie diejenigen, die auch zur Erzeugung anderer Antibiotica verwendet werden. Solche Medien
enthalten C-, N-Quellen und anorganische Salze, die von dem
Mikroorganismus assimiliert werden.
Im allgemeinen können Zucker, wie z.B. Dextrose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit und dergleichen,
und Stärken, wie Dextrin oder Getreide, z.B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, allein oder zusammen mit
anderen Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Die genaue Menge der Kohlehydrate in
dem Medium richtet sich teilweise nach den übrigen Bestandteilen des Mediums; im allgemeinen variiert jedoch die Menge
der Kohlehydrate zwischen etwa 1 und 6 Gewichtsprozent des Mediums. Diese C-Quellen können einzeln verwendet werden, oder
mehrere derartige C-Quellen können in dem Medium kombiniert werden. Im allgemeinen können viele Proteinstoffe als N-Quellen
bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete N-Quellen sind z.B. Hefehydrolysate, Primärhefe, Sojabohnenmehl,
Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maisquell-
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wasser, lösliche Schlempebestandteile oder Tomatenbrei und dergleichen.
Die N-Quellen werden allein oder in Kombination miteinander
in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gew.-% des wässrigen Mediums angewandt.
Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien zugesetzt werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-,
Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlor-, Carbonationen und andere Ionen liefern. Hierher gehören
auch Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen.
Die in den Beispielen beschriebenen Kulturmedien dienen nur zur Erläuterung; man kann die verschiedensten Medien verwenden.
Die Fermentation wird bei Temperaturen von etwa 20 bis 37 C durchgeführt; zur Erzielung der besten Ergebnisse führt man
die Fermentation jedoch vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 23 bis 28° C durch. Der anfängliche pH-Wert des Nährmediums
zur Züchtung von Stämmen der Kultur von Streptomyces flavogriseus
und zur Erzeugung der Antibiotica 890A^ und 890A,
kann im Bereich von 6,0 bis 8,0 variieren.
Die neuen Antibiotica 890A^ und 890A, können zwar sowohl in
Oberflächenkultur als auch in Submerskultur erzeugt werden; vorzugsweise wird die Fermentation jedoch in Submerskultur
durchgeführt.
Die Fermentation zur Erzeugung des Antibioticums erfolgt
zweckmässig in kleinem Maßstab durch Beimpfen eines geeigneten Nährmediums mit der das Antibioticum erzeugenden Kultur und
Fortführen der Fermentation nach der Übertragung auf ein Produktionsmedium über mehrere Tage hinweg in einer Schüttelmaschine
bei konstanter Temperatur von etwa 28° C.
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Man beginnt die Fermentation in einem mit Nährmedium beschickten sterilisierten Kolben über eine oder mehrere Stufen der
Impfgutentwicklung. Als Nährmedium für die Impfgutstufe kann
man jede geeignete Kombination von C- und N-Quellen verwenden. Der Impfkolben wird einen Tag in einer konstanten Temperaturkammer
bei etwa 28 C geschüttelt, bis die Kultur zufriedenstellend ist, und ein Teil der entstehenden Kultur wird verwendet,
um entweder ein zweitstufiges Impfgut oder das Produktionsmedium
zu beimpfen. Zwischenstufige Impfkolben werden, wenn sie verwendet werden, im wesentlichen in der gleichen
Weise entwickelt, d.ho ein Teil des Kolbeninhalts der letzten
Impfstufe wird verwendet, um das Produktionsmedium zu beimpfen.
Die beimpften Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt, und am Ende der Inkubationsperiode
wird der Kolbeninhalt zentrifugiert oder filtriert.
Für in grossem Maßstab durchgeführte Arbeiten erfolgt die Fermentation
vorzugsweise in geeigneten Fermentern, die mit einem Rührer und einer Anlage zum Belüften des Fermentationsmediums
versehen sind. Nach dieser Methode wird das Nährmedium in dem Fermenter angemacht und durch Erhitzen auf Temperaturen bis
etwa 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impfgut der Kultur
beimpft und die Fermentation eine Zeitlang, z.B. 1 bis 6 Tage,
unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von etwa 24 bis 28° C fortgeführt.
Diese Methode zur Herstellung der Antibiotica 890A1 und 890A-,
eignet sich besonders für die Herstellung grosser Mengen der Antibiotica.
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Physikalische und chemische Eigenschaften der Antibiotica 890A1 und 890A,
Eigenschaften des Antibioticums
Das Antibioticum 890A^ ist ein saurer Stoff, der bei der
Elektrophorese bei neutralem pH-Wert zum positiven Pol wandert.
Das Natriumsalz des Antibioticums 890A,. ist in der Form, in
der es durch Gefriertrocknen aus wässriger Lösung gewonnen wird, ein stark wasserlösliches weisses Pulver.
Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum (absorbance spectrum)
zeigt ein Xn bei 299,5 nm und ein A . bei 242 nm. Eine
max« min.·
Lösung des Natriumsalzes des Antibioticums 890A-] in Wasser bei
neutralem pH-Wert zeigt für eine reine Probe ein E% von 208
bei 300 nm; das Verhältnis der Extinktionswerte (absorbance values) bei 300 nm und 245 nm beträgt 4,25f und das Verhältnis
A300^A210 k^räSt 1»41. Mehr als 92 % der Absorption
(absorption) bei 300 nm können durch Reaktion mit Hydroxylamin vernichtet werden, und eine ähnliche Abnahme wird auch
bei Reaktion mit Cystein beobachtet.
Das Zirkulardichroismusspektrum von 89OA^ zeigt ein positives
Maximum bei 290,5 nm mit einer spezifischen Elliptizität von 5270 Grad.ml je dm.g, einen Nullpunkt der Elliptizität bei
250 nm und ein negatives Minimum bei 214 nm mit einer spezifischen
Elliptizität von -10 910 Grad.ml je dm.g.
In der folgenden Tabelle sind die 100 MHz-NMR-Signale für das
Natriumsalz von 890A^ in D2O in bezug auf Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat,
nachstehend als DSS abgekürzt, als inneren Standard angegeben, die chemischen Verschiebungen
sind in ppm und die Kupplungskonstanten in Hz angegeben; die
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scheinbaren Mehrfachwerte sind ebenfalls angegeben.
1,35 (d, J = 6,50; 1,98 (s); 3,63 (d von d, J = 5,2 und
J = 9,8); ^4,02-4,26 (m); 3,18 (d von d, J = ~11 und
J = 10); 3,41 (t, J = 6); 2,97 (d von t, J = 3,5 und J = 6).
Die antibiotische Stärke von 890A^, bestimmt an Vibrio
percolans ATCC 8461, ist zu 250 Einheiten Je HAEA,00-Einheit
definiert worden.
Eigenschaften des Antibioticums 890A,
Das Antibioticum 890A, ist ein saurer Stoff, der bei der
Elektrophorese bei neutralem pH-Wert zum positiven Pol wandert.
Das Natriumsalz ist in dem Zustande, in dem es durch Gefriertrocknen
aus wässriger Lösung gewonnen wird, ein weisses Pulver.
Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum (absorbance spectrum)
hat ein Maximum bei 300,5 nm und ein Minimum bei 243 nm. Eine Lösung des Natriumsalzes des Antibioticums 890A, in Wasser
bei neutralem pH-Wert zeigt ein E% von 375 bei 300 nm für eine reine Probe; das Verhältnis der Extinktionen (absorbances)
bei 300 nm und 245 nm beträgt 3,54« Mehr als 90 % der Absorption
(absorption) bei 300 nm können durch Reaktion mit Hydroxylamin ausgelöscht werden; eine ähnliche Abnahme wird
bei der Umsetzung mit Cystein beobachtet.
Das Zirkulardichroismusspektrum von 890A, hat ein positives
Maximum bei 294 nm mit einer spezifischen Elliptizität von 9127 Grad.ml Je dm.g, einen Nullpunkt der Elliptizität bei
249 nm und eine spezifische Elliptizität von -15 0.53 Grad.ml
Je dm.g bei 220 nm.
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In der folgenden Tabelle sind die 100 MHz-NMR-Signale für das
Natriumsalz von 890A^ in DpO in bezug auf DSS als inneren
Standard, ferner die chemischen Verschiebungen in ppm, die Kupplungskonstanten in Hz sowie auch die scheinbaren Mehrfachwerte angegebene
1,29 (d, J = 6,5); 1,98 (s); 3,42 (d von d, J = 5 und J = 2,4); ^4,01-4,28 (m); 3,14 (d von d, J = 5 und J =
9); 3,39 (t, J = 6,5); 2,92 (d von t, J = ^<4 und J = 6).
Die antibiotische Stärke von 89OA^5, bestimmt an Vibrio
percolans ATCC 8461, beträgt 31 Einheiten je
Massenspektralanalyse von 890A^ und 890A
Die Massenspektraldaten für 890A>, und 890A, werden an Trimethylsilylderivaten
bestimmt, die aus den Ammoniumsalzen der Antibiotica mit Bis-trimethylsilyltrifluoracetamid in Dimethylformamid
hergestellt werden. Die Umwandlung der Natriumsalze der Antibiotica in die Ammoniumsalze erfolgt unter Verwendung
des Ammoniumsalzes eines sauren Ionenaustauschharzes.
Bei der Trimethylsilylierung von 890A^ und 890A, bilden sich
drei verschiedene Derivate, nämlich ein Di- und ein Tri-trimethylsilylderivat
(Molekulargewichte 458 bzw. 530) und eine geringe Menge eines Tetra-trimethylsilylderivats eines hydrolysierten
Produkts (Molekulargewicht 620), bei dem der ß-Lactamring offen ist.
Nachstehend sind die Vierte der wichtigsten Massenspektrenfr
agmente angegeben:
Di-trimethylsilylderivat: 443,1495; 301,1034; 300,0962;
241,0590 und 86,0610.
- 17 709822/1030·
Tri-trimethylsilylderivat: 515,1931; 373,1422 und
158,1000.
158,1000.
Tetra-trimethylsilylderivat (man beobachtet nur ein Signal
von geringer Auflösung): 620 und 605.
Es wird angenommen, dass die Antibiotica 890A-1 und 890A-* Isomere
der folgenden Molekularstruktur sind:
CH--CH(OH) τ f \ 2
3 I \ S-CH2-CH2-NH-C-CH3
Die Antibiotica 890A^ und 890A-, sind ferner durch die folgenden
antibiotischen Spektrumprofile gekennzeichnet:
Die Prüfung zur Bestimmung des antibiotischen Spektrumprofils wird durchgeführt, indem man ein Tröpfchen von 0,015 ml auf
die Oberfläche einer 100 χ 15 mm messenden Petrischale aufbringt, die 5 ml beimpftes Nähragar und 0,2 % Hefeextrakt enthält. Das Antibioticum 890A1 wird in einer Konzentration von 33 r/ml und das Antibioticum 890A^ in einer Konzentration von 182 γ/ml untersucht. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchmesser der Hemmzone in Millimeter, finden sich in Tabelle III.
die Oberfläche einer 100 χ 15 mm messenden Petrischale aufbringt, die 5 ml beimpftes Nähragar und 0,2 % Hefeextrakt enthält. Das Antibioticum 890A1 wird in einer Konzentration von 33 r/ml und das Antibioticum 890A^ in einer Konzentration von 182 γ/ml untersucht. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchmesser der Hemmzone in Millimeter, finden sich in Tabelle III.
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Tabelle III
Antibakterielles Spektrumprofil (ASP) der Antibiotica 890A- und 890A, in vitro
Antibakterielles Spektrumprofil (ASP) der Antibiotica 890A- und 890A, in vitro
" Hemmzonendurchmesser, mm
^0 Mikroorganismus Merck Nr. ATCC Nr. 890A,, 890A,
Bacillus sp. MB-633 ~ 40 37
Proteus vulgaris MB-1012 — 21 24
Pseudomonas aeruginosa MB-979 — 0 0
Serratia marcescens — 990 26 28
Staphylococcus aureus — 6538 P 35 36
Bacillus subtilis — 6633 38 40
Sarcina lutea — 9341 38 44
Staphylococcus aureus MB-698 — 28 34
Streptococcus faecalis MB-753 —. 17 ^ 17
Alcaligenes faecalis — 213 27 34
Bruceila bronchiseptica — 4617 22 27
Salmonella gallinarum MB-1287 — 33 33
Vibrio percolans — 8461 34 40
Xanthomonas vesicatoria MB-815 — 26 26
Proteus vulgaris — . 21100 34 34 <J1
Escherichia coli MB-1418 — 27 32 cn
Pseudomonas stutzeri — 11607 10 ,32 -<j
Klebsieila pneumoniae MB-1264 — 27 33
CD Ca> O
l\3 O
Tabelle III (Fortsetzung) Antibakterielles Spektrumprofil (ASP) der Antibiotica 890A1 und 890A, in vitro
Mikroorganismus
Aerobacter aerogenes Erwinia atroseptica Pseudomonas aeruginosa
Corynebacterium pseudoidph.
Escherichia coli in synthetischem
Medium
Streptococcus faecium Streptococcus agalactiae
Vibrio percolans (resistent gegen Ceph. C)
Proteus vulgaris (Episom) Proteus mirabilis
Vibrio percolans + 2 χ 10^ Einheiten/ml Penicillinase
| Merck Nr. | ATCC Nr. | 890A1 |
| MB-835 | 26 | |
| — | 4466 | 20 |
| MB-2824 | -— | 0 |
| 9742 | 34 | |
| — | 9637 | 27 |
| MB-2820 | — | 18 |
| MB-2875 | — | 36 |
| MB-2566 | -— · | 15 |
| MB-2112 | -- | 32 |
| MB-3126 | 2'3 |
8461
890A,
10
30 30 32 36
29 24 30
34 38 30
35
■P-VJi
Das Antibioticum 89OA^ zeigt in vivo-Aktivität gegen gram-negative
und gram-positive Organismen und eignet sich daher zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei Tieren und Menschen.
Zur Bestimmung der in vivo-Aktivität wird das Antibioticum 890A1 in einer Lösung von 0,15-molar NaCl und
0,01-molar Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst
und mit dieser Lösung zu fünf vierfachen Konzentrationen des Antibioticums für die Untersuchung verdünnt. Weibliche weisse
Schweizer Mäuse mit einem durchschnittlichen Gewicht von etwa 21 g werden intraperitoneal mit dem in Fleischbrühe suspendierten
PrüfOrganismus infiziert. Die Anzahl der injizierten Organismen wird nach genormten Platten-Zählmethoden bestimmt.
Zum Zeitpunkt der Infektion und 6 Stunden später werden einige der Mäuse intraperitoneal mit dem Antibioticum behandelt. Für
jede Konzentration des untersuchten Antibioticums werden fünf Mäuse verwendet. Weitere zwei Mäuse, die nicht infiziert worden
sind, werden mit dem Antibioticum behandelt, um zu bestimmen, ob die Menge des injizierten Mittels toxisch war. Zu jedem
Test gehören Kontrollen von je fünf Mäusen für jede der verschiedenen Verdünnungen der infizierenden Kultur, um die
Anzahl der Organismen zu berechnen, die auf 50 % der infizierten, unbehandelten Mäuse lethal wirken (LDj-q). Diese Berechnung
wird auf Grund von Überlebensdaten am siebenten Tag nach der Infektion durchgeführt, und zu diesem Zeitpunkt wird auch
die Menge des Antibioticums berechnet, die 50 % der infizierten Mäuse schützen sollte (ED1-Q).
Alle so infizierten und nicht mit dem Antibioticum behandelten Mäuse sterben innerhalb 48 Stunden nach der Infektion. Die
Wirksamkeit des Antibioticums 890A1 mit einer Stärke von
5,5 Einheiten/r gegen Salmonella schottmuelleri MB-2837 ist nachstehend angegeben:
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709822/1030
ED1-Q x 2 Dosen
Dar- D
/ \ reichungs- Ver- /, \
Einheiten/ml^ ' art dünnung Einheiten/ml y^ '
908 ip 1:32 14 3
^ ' 1 Einheit/ml - diejenige Konzentration, die eine Hemmzone
von 25 mm gegen Vibrio percolans ATCC 8461 erzeugt.
^ ' Der y-Wert ist auf Grund der geplanten Reinheit von 890A-.
bei 5500 Einheiten/mg berechnet.
Die Antibiotica 890A1 und 890A, sind wertvolle Antibiotica,
die gegen die verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien aktiv sind und daher sowohl in der Humanmedizin
als auch in der Veterinärmedizin Verwendung finden. Die Verbindungen
gemäss der Erfindung können allein oder in Kombination miteinander als antibakterielle Arzneimittel zur Behandlung
von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien verursacht werden, z.B. gegen
Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter cloacae. Die antibakteriellen
Mittel gemäss der Erfindung können ferner als Zusatz zu Tierfutter, zum Konservieren von Nahrungsmitteln und als
Desinfektionsmittel verwendet werden. Zum Beispiel können sie in wässrigen Mitteln in Konzentrationen von etwa 0,1 bis
Teilen Antibioticum je Million Teile Lösung oder vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 1 bis 10 Teilen Antibioticum je
Million Teile Lösung verwendet werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf ärztlichen und zahnärztlichen Ausrüstungsgegenständen
zu zerstören und zu hemmen, sowie als Bactericide für technische Anwendungszwecke, z.B. in Anstrichfarben
auf wässriger Basis, in dem Siebwasser von Papierfabriken und zur Hemmung des Wachstums schädlicher Bakterien.
- 22 -
709822/1030 .
15745 % 2852677
Die Antibiotica gemäss der Erfindung können in den verschiedensten
pharmazeutischen Präparaten als alleinige Wirkstoffe oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Antibiotica
oder mit einem oder mehreren pharmakologisch aktiven
Stoffen verwendet werden. Als Beispiel für den erstgenannten Fall kann ein Aminocyclitol-Antibioticum, wie Gentamicin, mit
den Antibiotica gemäss der Erfindung gemeinsam dargereicht werden, um die Möglichkeit des Auftretens von resistenten Organismen
auf ein Minimum zu beschränken. Als Beispiel für den letzteren Fall kann man Diphenoxylat und Atropin in Dosisformen
für die Behandlung von Magen-Darmerkrankungen kombinieren. Die Antibiotica können in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern,
flüssigen Lösungen oder als Suspensionen oder Elixiere verwendet werden. Sie können oral, lokal, intravenös oder
intramuskulär dargereicht werden. Ferner können die Antibiotica 890A- und 890A^ in Kombination miteinander angewandt
werden.
Tabletten und Kapseln für die orale Darreichung können in Einheitsdosisform
vorliegen und herkömmliche Streckmittel, wie Bindemittel, z.B. Sirup, Akazienharz, Gelatine, Sorbit,
Tragantharz oder Polyvinylpyrrolidon, Füllstoffe, wie Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin,
Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol,
Siliciumdioxid, den Zerfall fördernde Mittel, z.B. Kartoffelstärke oder zulässige Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat,
enthalten. Die Tabletten können nach an sich bekannten Methoden beschichtet sein. Oral darzureichende flüssige Präparate
können in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren usw. vorliegen oder als
trockenes Produkt zum Anmachen mit Wasser oder anderen geeigneten Trägern vor der Verwendung hergestellt werden. Solche
flüssigen Präparate können herkömmliche Zusätze, wie Suspen-
- 23 -
709822/1030
diermittel, z.B. Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup,
Gelatine, Hydroxyätbylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder bydrierte geniessbare Fette,
Emulgiermittel, z.B. Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Akazienharz, nicht-wässrige Träger, wie geniessbare Öle, z.B. Mandelöl,
fraktioniertes Kokosnussöl, ölige Ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol, Konservierungsmittel, z.B. p-Hydroxybenzoesäuremethyl-
oder -propylester oder Sorbinsäure, enthalten. Zäpfchen enthalten herkömmliche Zäpfchenbasen, wie Kakaobutter
oder andere Glyceride.
Mittel für die Injektion können in Einheitsdosisform in Ampullen
oder in Mehrfachdosisform in Behältern unter Zusatz von
Konservierungsmitteln zur Verfügung gestellt werden. Die Mittel können die Form von Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in
öligen oder wässrigen Trägern aufweisen und Formulierungsmittel, wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel
enthalten. Der Wirkstoff kann auch in Pulverform vorliegen und vor der Verwendung mit einem geeigneten Träger, z.B. "
sterilem, pyrogenfreiem Wasser, angemacht werden.
Die Mittel können auch in für die Absorption durch die Schleimhäute der Nase und des Halses oder der Bronchialgewebe
geeigneter Form hergestellt werden, z.B. als Pulver oder flüssige Sprüh- oder Inhaliermittel, Pastillen, Rachenanstrichmittel
usw. Zur Behandlung der Augen oder Ohren können die Präparate als einzelne Kapseln, in flüssiger oder halbflüssiger
Form zur Verfügung gestellt oder als Tropfen usw. verwendet werden. Für die lokale Applikation können sie in hydrophoben
oder hydrophilen Basen als Salben, Cremes, Lotionen, Anstrichmittel, Pulver usw. vorliegen.
Ausser einem Träger können die Mittel gemäss der Erfindung andere
Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Oxidations-
- 24 709822/1030
verzögerer, Konservierungsmittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, die Viscosität beeinflussende Mittel oder Geschmacksstoffe und dergleichen, enthalten.
In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Hühnern, Kühen, Schafen, Schweinen und dergleichen, können die Mittel
z.B. als Präparate zum Injizieren in die Brust formuliert werden, die auf Langzeitwirkung abgestellt sind oder den Wirkstoff
schnell in Freiheit setzen.
Die darzureichende Dosis richtet sich weitgehend nach dem Zustand des zu behandelnden Tieres, dem Gewicht desselben und
der Art der Infektion, der Art und Häufigkeit der Darreichung, wobei die parenterale Darreichung bei allgemeinen Infektionen
und die orale Darreichung bei Darminfektionen bevorzugt wird.
Zur Behandlung von bakteriellen Infektionen beim Menschen werden die Verbindungen gemäss der Erfindung oral oder parenteral
nach herkömmlichen Methoden für die Behandlung mit Antibiotica in Mengen von etwa 2 bis 600, vorzugsweise etwa 5 bis 100
mg/kg/Tag dargereicht und vorzugsweise in Einzeldosen unterteilt, die z.B. drei- bis viermal pro Tag dargereicht werden.
Es können Einheitsdosisformen verwendet werden, die z.B. 25, 330, 400 oder 1000 mg Wirkstoff zusammen mit physiologisch
unbedenklichen Trägern oder Streckmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten liegen in Form von flüssigen Präparaten, wie Lösungen
oder Suspensionen, oder als feste Stoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die^ optimale Dosis richtet sich für jeden
einzelnen Fall nach Art und Schwere der Infektion, wobei für die Behandlung von Kindern kleinere Dosen angewandt werden;
alle derartigen Bemessungsregeln sind dem Fachmann bekannt.
Die Erfindung umfasst auch die nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Salze von 890A>] und 890A*, z.B. die pharmakolo-
- 25 709822/103 0
gisch unbedenklichen Salze, die mit anorganischen oder organischen
Basen entstehen. Hierzu gehören z.B„ Metallsalze, die von Alkali- oder Erdalkalihydroxiden, -carbonaten oder -bicarbonaten
abgeleitet sind, wie z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium- und Calciumsalze, sowie Salze von primären, sekundären
oder tertiären Aminen, wie von Monoalkylaminen, Dialkylaminen,
Trialkylaminen, niederen Alkanolaminen, niederen Dialkanolaminen,
niederen Alkylendiaminen, N,N-Diaralkyl-nied.-alkylendiaminen, Aralkylaminen, aminosubstituierten niederen
Alkanolen, durch niedere N,N-Dialkylaminogruppen substituierten
niederen Alkanolen, amino-, polyamino- und guanidinosubstituierten niederen Alkansäuren und stickstoffhaltigen heterocyclischen
Aminen. Typische Beispiele sind Salze, die von Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat,
Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimethylamine Triäthylamin, Piperidin, N-Äthylpiperidin,
Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin,
Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N'-Dibenzyläthylendiamin,
Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methylpropanol-(i), Theophyllin, N-Methylglucamin
und dergleichen abgeleitet sind.
Die Salze der Verbindungen gemäss der Erfindung können nach
bekannten Methoden hergestellt werden. So erhält man z.B. die Monosalze, wie das Mononatriumsalz, durch Umsetzung von
1 Äquivalent Natriumhydroxid, mit 1 Äquivalent des Produkts (I) in einem geeigneten Lösungsmittel. Auch Mischsalze mit zweiwertigen
Kationen können hergestellt werden, indem man 1 Mol einer zweiwertigen Base mit 1 Mol des Produkts (I) und
1 Äquivalent einer anderen Säure kombiniert. Salze können auch hergestellt werden, indem man 1 Äquivalent einer Base mit
einem zweiwertigen Kation, wie Calciumhydroxid, mit 1 Äquivalent des Produkts (I) umsetzt. Die Salze gemäss der Erfindung
sind pharmakologisch unbedenkliche, nicht-toxische Derivate,
- 26 -
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die als Wirkstoffe in geeigneten pharmazeutischen Einheitsdosisformen
verwendet werden können. Sie können auch mit anderen Arzneimitteln kombiniert werden, um Mittel mit einem
weiten Aktivitätsspektrum zu erhalten.
Die nach den erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten,
die die Antibiotica 890A^ und 890A^
enthalten, haben Aktivitäten im Bereich von etwa 2 bis 170 Einheiten/ml, wenn sie nach der Scheibendiffusionsmethode unter
Verwendung von Vibrio percolans (ATCC 8461) analysiert werden. Antibiotische Präparate von 890A^ und 890A-* mit einer Aktivität
von mindestens 5 Einheiten/mg können gereinigt und die Antibiotica nach verschiedenen Verfahren gewonnen werden.
Ein derartiges Verfahren besteht darin, dass man die Antibiotica 890A-. und 890A^ an stark basischen Anionenaustauschharzen
adsorbiert. Beispiele für solche stark basischen Anionenaustauschharze sind diejenigen mit einem Styrol-Divinylbenzolgerüst,
z.B. das im Polystyrolkern quaternisierte Ammoniumharz Dowex—1 χ 2 (hergestellt von der Dow Chemical Co.,
Midland, Michigan) in der Chloridform. Andere repräsentative Glieder dieser Klasse von stark basischen lonenaustauschharzen
sind: Duolite A-40, A-42, A-101, A-102 und A-114 (hergestellt
von der Chemical Process Co., Redwood City, California); Amberlite IRA-400, IRA-401 und IRA-410. Man kann auch schwach
basische Anionenaustauschharze, wie Amberlite IRA-68, verwenden.
(Die Amberlite-Harze werden von der Firma Rohm und Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania, hergestellt).
Das adsorbierte Antibioticum lässt sich leicht aus dem Anionenaustauschharz
mit wässrigen Salzlösungen eluieren. Das so erhaltene Eluat kann gegebenenfalls nach anderen Reinigungsverfahren
weiter gereinigt werden. So kann das Eluat gereinigt werden, indem man es durch eine Kolonne leitet, die mit einem
Acrylsaureesterpolymerisat von mittlerer Polarität beschickt
- 27 709822/1030
ist, wie XAD-7 oder 8, oder durch eine Kolonne, die mit einem unpolaren, hydrophoben, vernetzten Polystyrol-Divinylbenzolpolymerisat
beschickt ist, wie XAD-1, 2 und 4, vorzugsweise XAD-2. (XAD-1, 2, 4, 7 und 8 werden von der Firma Rohm und
Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania, hergestellt).
Durch dieses Verfahren werden die Antibiotica 890A>,
und 890A, teilweise getrennt. Die an 890A^ reichen Fraktionen
und die an 890A, reichen Fraktionen werden miteinander vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen können weiter gereinigt
werden.
Weiter gereinigte Antibiotica 890A^ und 890A, erhält man durch
Gelfiltration durch Polyacrylsäureamidgel mit einer Porengrösse, die Moleküle mit Molekulargewichten von mehr als 1800 ausschliesst,
wie Bio-Gel P-2 (hergestellt von Bio«Rad, Richmond, California). Zum Entsalzen können auch andere Gele, wie
Sephadex G-10, verwendet werden.
Das bevorzugte Verfahren, nach dem die Antibiotica 890A>, und
890A, in hochgradiger Reinheit aus einer Fermentationsflüssigkeit
gewonnen werden können, besteht im Abzentrifugieren oder Abfiltrieren der Feststoffe, der Adsorption und dem Eluieren
an bzw. von einem Anionenaustauschharz, wie Dowex-1 χ 2 in der
Chloridform,mit 3- bis 5-prozentiger Kochsalzlösung, wodurch das Antibioticum sowohl konzentriert als auch teilweise gereinigt
wird, dem Hindurchleiten durch eine Kolonne von in geeigneter Weise vorbereitetem XAD-2, wodurch die Antibiotica verzögert
und dadurch gereinigt werden und das Eluat von dem Dowex-1 χ 2 entsalzt wird. Ferner wird das Antibioticum 890A,
stärker als das Antibioticum 890A>, verzögert, so dass die beiden
Antibiotica teilweise voneinander getrennt werden. Die 890A1 und 890A, enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und
weiter gereinigt. Durch Chromatographie an Dowex-1 χ 2 (Teilchengrossen
unter 37 u) und Eluieren mit NaCl und/oder NH^Cl erhält man ein Produkt, das von den meisten UV-absorbierenden
- 28 709822/1030
Verunreinigungen frei ist (das NHaCI wird verwendet, um dem
Eluierungsmittel ein gewisses Pufferungsvermögen zu verleihen) ; und durch Entsalzung an Bio-Gel P-2 oder Sephadex G-10
wird das Salz entfernt, das bei der Chromatographie an Dowex-1 χ 2 eingeführt worden ist, und die Menge der übrigen
Verunreinigungen in den antibiotischen Präparaten wird weiter vermindert.
Wenn Fermentationsflüssigkeiten von geringer Stärke nach dem oben beschriebenen Verfahren behandelt werden, können bedeutende
Mengen (mehr als 50 %) an äusseren Verunreinigungen in dem Endprodukt verbleiben. Diese Verunreinigungen können
durch einen zusätzlichen Verfahrensgang der Chromatographie an Dowex-1 χ 2 (Teilchengrössen unter 37 p) und des Eluierens
mit einer Lösung vermindert werden, die natriumchlorid und 50 % Methanol enthält. Wenn das Antibioticum aus Fermentationsflüssigkeiten
von geringer Stärke isoliert wird, ist es ferner ratsam, eine zweite Stufe der Chromatographie an XAD-2
nachzuschalten. Hierdurch erzielt man eine zusätzliche Reinigung, Rückstandssalze werden entfernt, und die Antibiotica
890A-] und 890A, werden teilweise voneinander getrennt. Insbesondere
wird 890A^ später eluiert als 890A>., und die beiden
Substanzen können durch ihre unterschiedlichen Verhältnisse, von Bioaktivität zu HAEA^00 voneinander unterschieden werden.
Diejenigen Fraktionen, die ein Verhältnis von Bioaktivität gegen Vibrio percolans ATCC 8461 zu HAEA^00 von 250 aufweisen,
enthalten das Antibioticum 890A1, und diejenigen Fraktionen,
die ein Verhältnis der Bioaktivität gegen Vibrio percolans ATCC 8461 zu HAEA^00 von 31 aufweisen, enthalten
das Antibioticum
An dem Antibioticum 890A, reiche Fraktionen können mit
Penicillinase behandelt werden, um restliche Spuren des Antibioticums 890A1 zu entfernen, und durch Chromatographie an
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Dowex-1 χ 2 und Sephadex G-10 weiter gereinigt werden.
Beim Arbeiten im Laboratoriumsmaßstab (weniger als 20 1 Probenvolumen)
werden alle chromatographischen Verfahrensstufen mit Ausnahme der Chromatographie an XAD-2 in einem Kühlraum
bei 2 bis 5 C durchgeführt. Die Chromatographie an XAD-2
wird, falls nichts anderes angegeben ist, bei Raumtemperatur durchgeführt. Der pH-Wert der antibiotischen Lösungen wird
vor deren Lagerung durch sorgfältigen.Zusatz von verdünnter
Natronlauge oder Salzsäure auf 7 bis 8 eingestellt. Wässrige Lösungen werden im Kühlschrank oder vorzugsweise in Eiswasser
und 50-prozentige methanolische Lösungen bei -20 C gelagert.
Das Reinigungsverfahren für die Antibiotica 890A1 und 890A-*
wird durch die nachstehenden Fliessdiagramme 1 bzw. 2 erläutert.
- 30 -
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ο ca ο
Fliessdiagramm 1 Reinigung des Antibioticums
890A1 und 89OA, enthaltende
Fermentationsflüs sigkeit
(1) Kühlen
2) Zentrifugieren
3) Zusatz von EDTA
Zentrifugierte
Fermentations-
flüssigkeit
XAD-2-Eluat
CO (D
ω IhI Jh ,Gl
ω cti| χ) «η
\'f
(1) Konzentrieren
(2) Adsorbieren an XAD-2
(3) Eluieren mit Wasser
(1) Konzentrieren
(2) Adsorbieren an XAD-2
Eluat von Dowex-1 χ 2
(150-300 μ)
(3) Eluieren mit Wasser
Zweites
XAD-2-
Eluat
(1) Adsorbieren der 890A1-Fraktionen
an Dowex-1 χ A- (<37 μ)
(2) Eluieren mit 0,07-molar NaCl + 0,005-molar NH^Cl + 0,001-molar
(1) Adsorbieren an Dowex-1 χ 2
(150-300 u)
(2) Eluieren mit 5 % NaCl und
O,01-molar Tris-HCl
+ 25-umolar EDTA
+ 25-umolar EDTA
Die 890A,-Fraktionen werden vereinigt und nach
Fließschema 2 gereinigt
Fließschema 2 gereinigt
ro
cn cn
cn
to co ro ro
Nl
Dowex-1 χ 4-Eluat
Sephadex G-10-Eluat
Fliessdiagramm 1 (Fortsetzung)
(1) Konzentrieren
(2) Adsorbieren an Bio-Gel P-2
(3) Eluieren mit Wasser
1) Konzentrieren
2) Adsorbieren an Sephadex G-IO Bio-Gel P-2-Eluat
(3) Eluieren mit Wasser % CH3OH-
Eluat von
Dowex-1 χ 2
Dowex-1 χ 2
(1) Konzentrieren
(2) Gefriertrocknen
(1) Konzentrieren
(2) Zusatz von
1 Raumteil CTUOH
(1) Konzentrieren
(2) Gefriertrocknen
Adsorbieren an Dowex-1 χ 2 (<37 μ) Eluieren mit
0,05-molar NaCl + 0,005-molar NH^Cl
0,05-molar NaCl + 0,005-molar NH^Cl
+ 0,001-molar NH3 in 50
CH3OH
Anderes Verfahren '
Fliessdiagramm 2
Reinigung des Antibioticums 890A,
Reinigung des Antibioticums 890A,
Bei dem Verfahren gemäss Fliessdiagramm erhaltene, 890A, enthaltende,
vereinigte XAD-Fraktionen
(1) Adsorbieren an Dowex-1 χ 4 (<37
(2) Eluieren mit 0,07-molar NaCl
+ 0,005-molar NH^Cl + 0,0001-molar
Dowex-1 χ 4-Eluat
(1) Konzentrieren
(2) Adsorbieren an Bio-Gel P-2
(3) Eluieren mit Wasser
Sephadex G-10-Eluat
(1) Konzentrieren
(2) Adsorbieren an Sephadex G-10
(3) Eluieren mit Wasser + 0,02-mmolar NH, % CH3OH-
Eluat von
Dowex-1 χ 2
Dowex-1 χ 2
Bio-Gel P-2 Eluat
(1) Behandeln mit Penicillinase
(2) Adsorbieren an Dowex-1 χ 2 (<37 μ)
(1) Konzentrieren
(2) Gefriertrocknen
(3) Eluieren mit
0,05-molar NaCl
+ 0,005-molar NH^Cl
+ O,0001-molar NH, In 50 % CH3OH ^
cn ro cn
Analysenmethoden für die Antibiotica 890A1 und 890A^
I. Mikrobiologische Analyse
Eine Agarplatten-Scheibendiffusionsmethode wird angewandt, wobei entweder Vibrio percolans ATCC 8461 oder Salmonella gallinarum
MB-1287 als PrüfOrganismus verwendet wird. Eine gereinigte
Probe des Antibioticums 890A^ wird als Standard verwendet.
Platten, die Vibrio percolans ATCC 8461 enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Eine gefriergetrocknete Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in 15 ml eines sterilen Mediums suspendiert, welches
8 g/l Difco-Nährbrühe und 2 g/l Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält und als "Nährbrühe-Hefeextrakt" (nachstehend
als NBYE abgekürzt) bezeichnet wird. Die Kultur wird übernacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28° C inkubiert.
Diese Kultur wird verwendet, um die Oberfläche von Schrägröhrchen zu beimpfen, die 1,5'.%.Agar ".in* NBYE enthalten,
und die beimpften Schrägröhrchen werden Übernacht bei 28° C inkubiert und dann im Kühlschrank aufbewahrt.
Die aus einer einzigen gefriergetrockneten Kultur hergestellten
gekühlten Schrägröhrchen werden für einen Zeitraum bis zu 4 Wochen nach ihrer Herstellung folgendermaßen verwendet:
Eine Öse mit Impfgut aus dem Schrägröhrchen wird in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben in 50 ml NBYE dispergiert. Die Kultur
wird übernacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28° C
inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die eine 50-prozentige
Lichtdurchlässigkeit bei 660 nm ergibt. 33,2 ml dieser verdünnten Kultur werden zu einem Volumen von 1 1 NBYE zugesetzt,
das 15 g Agar enthält und auf 46° C gehalten wird.
- 34 -709 82 2/10 30
Das beimpfte, agarhaltige Medium wird in Petrischalen aus
Kunststoff von 100 χ 15 mm in Mengen von 5 ml je Schale gegossen,
gekühlt und bis zu einem Zeitpunkt von 5 Tagen vor der Verwendung auf 2 bis 4 C gehalten.
Die Salmonella gallinarum MB-1287 enthaltenden Platten werden
folgendermaßen hergestellt:
Ein verschlossenes Rohr, das gefrorene und gefriergetrocknete Zellen von Salmonella gallinarum MB-1287 in Magermilch enthält
und unter Vakuum verschlossen worden ist, wird geöffnet und auf 15 ml Hirn-Herz-Aufgussbrühe aufgeimpft. Man lässt die
Zellen ohne Schütteln bei 37 C Übernacht wachsen, und die
Kultur wird auf Schrägröhrchen aufgeimpft, die 0,8 % BBL-Nährbrühe
+ 0,2 % Difco-Hefeextrakt + 1,5 % Agar enthalten. Nach dem Wachstum Übernacht bei 37 C wird eine Öse der Kultur aus
dem Schrägröhrchen in einen Kolben übertragen, der 50 ml
0,8-prozentige Nährbrühe + 0,2-prozentigen Hefeextrakt enthält. Der Kolben wird übernacht geschüttelt, und 1 1 von 0,8 % Nährbrühe
+ 0,2 % Hefeextrakt + 1,5 % Agar, der zuvor sterilisiert
und auf 48 C gekühlt worden ist, wird mit 20 ml dieser Kultur beimpft. Das beimpfte NBYE-Agar wird sofort in Petrischalen
aus Kunststoff von 100 χ 15 mm (5 ml je Schale) gegossen, und
die Platten werden bis zur Verwendung auf 0 bis 3 C gehalten.
Filterpapierscheiben von 12,7 mm Durchmesser werden in die zu analysierende Lösung getaucht und auf das Agar aufgelegt. Nach
einer anderen Methode können die Scheiben beladen werden, indem man 0,1 ml der Lösung auf eine trockene Scheibe aufpipettiert
und die Scheibe dann auf das Agar auflegt. Nach geeigneter Inkubation (für Salmonella gallinarum MB-1287 9 bis 18
Stunden bei 37° C, für Vibrio percolans ATCC 8461 12 bis 24
Stunden bei 25 C) wird der Durchmesser der Hemmzone gemessen.
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Falls erforderlich, werden Verdünnungen der zu analysierenden Lösungen in 0,05-molarem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4; nachstehend
als KPB abgekürzt) oder in entmineralisiertem Wasser hergestellt.
Die Stärke wird folgendermaßen berechnet: Ein Gefälle wird bestimmt, indem man die Zonendurcbmesser einer Lösung des Antibioticums
890A1 oder 890A^ und einer vierfachen Verdünnung
dieser Lösung (in KPB) misst. Zwei Scheiben einer jeden Konzentration werden auf einer einzigen Platte analysiert, und
die mittlere Zonengrösse wird bei einer jeden Konzentration bestimmt. Das Gefälle ist gleich der Hälfte der Differenz der
Mittelwerte der Zonengrössen. Die Stärke wird dann nach der
folgenden Gleichung berechnet:
Stärke (Einheiten/ml)
'[D-D8] log 2
Gefälle (Stärke des Standards) χ Verdünnung χ 1θ'
In der obigen Gleichung bedeuten D den mittleren Durchmesser der von der unbekannten Probe gebildeten Zonen, D den mittleren
Durchmesser der Standardzonen und "Verdünnung" den Grad, zu dem die unbekannte Probe vor der Analyse verdünnt worden
ist. Wenn kein Standard verwendet wird, nimmt man Da als 25 mm
und die Grosse (Stärke des Standards) als 1 Einheit/ml an, wenn als Prüforganismus Vibrio percolans ATCC 8461 verwendet
wird. Es wird bestimmt, dass reines 890A1 eine Stärke von
250 Einheiten je Einheit der durch Hydroxylamin auslöschbaren Extinktion (absorbance) bei 300 nm hat, wenn es als Standard
verwendet wird. Dementsprechend beträgt die Stärke des Antibioticums 890A^5 31 Einheiten je Einheit der durch Hydroxylamin
auslöschbaren Extinktion (absorbance) bei 300 nm.
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Für Analysen auf Platten mit Salmonella gallinarum MB-1287
wird das Gefälle in der gleichen Weise wie mit Vibrio percolans
ATCC 8461 bestimmt. Wenn kein Standard verwendet wird, werden nur relative Stärken berechnet. Wenn kein Gefälle gemessen
wird, wird ein Wert von 2,3 mm angenommen. Die Stärkeberechnungen
werden, wie bei der Analyse mit Vibrio percolans ATCC 8461, durchgeführt» Wenn kein 890A-J-Standard verwendet
wird, kann man mit einer Kontrolle von Penicillin G bei 250 γ/ml arbeiten, um nachzuweisen, dass die Empfindlichkeit
der Organismen im normalen Bereich liegt.
II. Analysenmethode zur Bestimmung von "890-Analyseneinheiten"
Man arbeitet nach der herkömmlichen Scheiben-Plattenanalysenmethode
mit Scheiben von 12,7 mm Durchmesser. Man arbeitet mit routinemäßig vergossenen 10 ml pro Platte, beimpft mit Vibrio
percolans (ATCC 8461) und verwendet als Standard Cephaloridin. Vier Konzentrationen von Cephaloridin, nämlich 3,12, 6,25,
12,5 und 25 y/ml, bilden den Standard, wobei die Konzentration
von 12,5 7/ml als Bezugslösung verwendet wird. Die Zonendurchmesser
auf einer 5 ml-Platte für den Standard sind die folgenden:
3,12 16,8
6,25 22,3
12,5 25,0
~25~^ 29,6
Eine Einheit ist als diejenife Menge des Antibioticums definiert,
die auf einer 5 ml-Platte eine Hemmzone von 25 mm erzeugt. Daher wird bei dieser Analyse eine Konzentration an
Cephaloridin von 12,5 y/ml als einer Einheit von 890A äquivalent angesehen. Da das Gefälle der Linie für Cephaloridin 4,0
beträgt, werden die Berechnungen der Stärke einer Probe unter Verwendung eines Gefälles von 4,0 vorgenommen.
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III. Hydroxylamineaktion
Die beiden Antibiotica 890A1 und 890A* reagieren mit Hydroxylamin
unter Bildung eines Stoffes, der die Extinktion (absorbance) bei 300 nm stark vermindert. Dies liefert eine
Grundlage für die quantitative Analyse auf die Antibiotica 890A1 und 89OA3.
Die zu analysierende Lösung wird in einer Kaliumphosphatlösung (pH 7,4) auf 0,05-molar eingestellt, indem man 1/20 Raumteil
einer Lösung von 0,8-molar K2HPO^ und 0,2-molar KH2PO^+
zusetzt. Dann setzt man I/IOO Raumteil 1-molar Hydroxylaminhydrochlorid
zu und bestimmt in Zeitabständen von 1/2 bis 2 Minuten die Extinktion (absorbance) bei 300 nm. Die Umsetzung
wird bei 22 bis 28° C durchgeführt. Man nimmt eine kinetische Reaktion erster Ordnung an und bestimmt die Halbwertszeit aus
der Abnahme der Extinktion (absorbance) während der ersten 10 Minuten. Aus dieser Halbwertszeit wird der Zeitpunkt geschätzt,
über den hinaus keine weitere Abnahme der Extinktion
(absorbance) beobachtet werden sollte, und die Beobachtungen
werden über diesen Zeitpunkt hinaus fortgeführt. Wenn keine
weitere Abnahme über diesen Zeitpunkt hinaus beobachtet wird, wird die gesamte Abnahme der Extinktion (absorbance) (korrigiert
für den Verdünnungseffekt und die Extinktion (absorbance)
des Hydroxylamins) als "durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion (absorbance) bei 300 nm" festgesetzt (nachstehend abgekürzt
als HAEA,0Q). Wenn über diesen Zeitpunkt hinaus eine
Abnahme der Extinktion (absorbance) stattfindet, wird die Geschwindigkeit der Abnahme der Hintergrundextinktion berechnet
und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt für die Abnahme der Hintergrundextinktion korrigiert, wobei angenommen
wird, dass die Abnahme der Hintergrundextinktion linear mit der Zeit verläuft. Der korrigierte Wert wird dann als
verzeichnet.
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.1 der HAEA^QQ-Einheiten ist gleich d<
multipliziert mit dem Volumen in ml.
Die Anzahl der HAEA^00-Einheiten ist gleich dem Wert von
In den nachstehenden Beispielen werden Verfahren erläutert, nach denen die Produkte gemäss der Erfindung erhalten werden
können. Die Beispiele dienen jedoch nur zur Erläuterung; die Erfindung umfasst auch funktionell äquivalente Produkte und
Verfahren zu deren Herstellung. Daher ist jede Abänderung der hier beschriebenen Verfahren, die zur Bildung eines identischen
Produkts führt, als eine analoge Methode anzusehen. Die hier beschriebenen Verfahren können erheblich abgeändert werden,
und geringe Abweichungen fallen in den Rahmen der Erfindung.
Schüttelkolbenproduktion eines Gemisches, das die Antibiotica 890A1 und 890A^ enthält
Ein Teil einer Schrägröhrenkultur von Streptomyces flavogriseus
MA-4434a wird verwendet, um einen mit einem Umlenkorgan versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Impfkolben zu beimpfen,
der 50 ml Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium A
Dextrose 10,0 g
Hefeautolysat (Ardamine*, Type pH) 10,0 g MgSO4-7H2O 0,05 g
Phosphatpuffer** 2,0 ml
destilliertes Wasser 1000 ml
pH 6,5
* Ardamine: Yeast Products Corporation
** Phosphatpufferlösung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,Og
destilliertes Wasser 1000 ml.
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Dieser Impfkolben wird 2 Tage bei 28 C in einer mit
220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt,
worauf die Kultur zufriedenstellend ist-
Drei Erlenmeyerkolben zu 250 ml, die je 40 ml Medium B- der
folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium B
Tomatenbrei 20,0 g
Vollkornhafer (gemahlen) 20,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml pH mit NaOH auf 7,0 eingestellt,
werden je Kolben mit 2 ml (5 %) des Kulturmediums aus dem Impfkolben beimpft. Diese drei Produktionskolben werden bis
zu 4 Tage bei 28 C in einer mit 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine
(Hub 5,1 cm) geschüttelt. Nach 3 Tagen ergibt die von der Fermentationsflüssigkeit abzentrifugierte überstehende
Flüssigkeit eine Hemmzone von 22mm gegen Proteus vulgaris MB 838 und eine Hemmzone von 15 mm gegen Salmonella gallinarum
MB1287 bei Verwendung von 6,35 mm-Analysenscheiben auf
S tandardanalys enplatten.
Schuttelkolbenproduktxon eines Gemisches, das die Antibiotics 890A1 und 890A, enthält
Ein Teil einer Schrägröhrchenkultur von Streptomyces" flavögriseus
MA-4434a wird verwendet, um einen mit einem Umlenkorgan versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Impfkolben zu beimpfen,
der 50 ml Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium A
| Dextrose | Type pH) | 10,0 | g |
| Hefeautolysat (Ardamine*, | 10,0 | g | |
| MgSO4-7H2O | 0,05 | ε | |
| Phosphatpuffer** | 2,0 | ml | |
| destilliertes Wasser | 1000 | ml | |
| pH 6,5 | |||
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* Ardamine: Yeast Products Corporation
** Phosphatpufferlösung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,Og
destilliertes Wasser 1000 ml.
Dieser Impfkorben wird einen Tag bei 28 C in einer mit 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt,
worauf die Kultur zufriedenstellend ist. Die Kultur wird dann bis zur Verwendung 2 Tage auf 4 C gehalten.
Drei 2000 ml fassende Erlenmeyerkolben, die je 200 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium B
Tomatenbrei 20,0 g
Vollkornhafer (gemahlen) 20,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml pH mit NaOH auf 7,0 eingestellt,
werden je Kolben mit 7 ml (3,5 %) der Kultur aus dem Impfkolben
beimpft. Diese drei Produktionskolben werden 4 Tage bei 28° C in einer mit 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine
(Hub 5,1 cm) geschüttelt.
Die Analyse von zentrifugierten Anteilen unter Verwendung von
12,7 mm-Scheiben auf Standardanalysenplatten und die Messung der pH-Werte liefert die folgenden Ergebnisse:
V. percolans„ S. gallinarum Alter ATCC 8461 MB 1287 pH
3 Tage 22 mm 16 mm 6,1
4 Tage 26 mm 18 mm 7,5
Nach 4 Tagen werden die Kolben abgeerntet.
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15 745 Ηζ 265267?
Schüttelkolbenproduktion eines Gemisches, das die Antibiotica 890A1 und 890A^ enthält
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces
flavogriseus MA-4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt
in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält:
in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält:
Natriumeitrat 0,5 g
K2HPO4 7,0 g
KH2PO4 3,0 g
(NH4)2S04 .1,Og
MgS04-7H20 . . 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Diese Suspension wird verwendet, um Schrägröhrchen und Platten verschiedener Medien zu beimpfen. Von einer dieser Platten
wird ein natürliches Isolat ausgewählt und auf ein Schrägröhrchen mit Medium A der folgenden Zusammensetzung aufgestrichen:
wird ein natürliches Isolat ausgewählt und auf ein Schrägröhrchen mit Medium A der folgenden Zusammensetzung aufgestrichen:
Medium A
Dextrose . 10,Og :
Pepton 5,0 g
Hefeextrakt 3,0 g
NaCl 12,705 g
KCl 0,72 g
FeSO4.(NH4)2S04·6H2O 0,0351 g
MgCl2.6H2O 5,32 g
CaCl2«2H20 -. 0,728.g
destilliertes Wasser . 1000 ml
pH 7,4 (vor dem Sterilisieren) Agar 25,0 g
Dieses beimpfte Schrägröhrchen wird 7 Tage inkubiert, und" nach
der Sporenbildung wird eine Sporensuspension mit 0,8 ml sterilen Davis-Salzen hergestellt. Mit dieser Suspension werden
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vier Medium A-Schrägröhrchen der zweiten Generation beimpft.
Die beimpften Schrägröhrchen werden eine ¥oche bei 28 C inkubiert
und dann bei 4 bis 6 C aufbewahrt, bis sie 14 Tage später verwendet werden. Die Hälfte der Oberflächenkultur eines
dieser Schrägröhrchen der zweiten Generation wird verwendet, um mit Umlenkorgan versehene 250 ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen,
die je 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium B
Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g
Glucose 10(0 g
Phosphatpuffer** 2,0 ml
MgSO4.7H2O 50 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt
*Ardamine: Yeast Products Corporation
| ** PhosphatpufferIosung | 91,0 | g |
| KH2PO4 | 95,0 | S |
| Na2HPO4 | 1000 | ml. |
| destilliertes Wasser | ||
Drei Impfkolben werden so beimpft, dass man genügend Impfgut
für 12 Produktionskolben zu je 2 1 erhält, die in diesem Ansatz
fermentiert werden. Die Impfkolben werden einen Tag bei
28° C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Die Kolben werden aus der Schüttelmaschine
entfernt und einen Tag bei 4 C gelagert. Der Inhalt dieser Impfkolben wird verwendet, um 12 Erlenmeyer-Produktionskolben
ohne Umlenkorgane zu je 2 1 (8 ml Impfgut je Kolben)
zu beimpfen, die 250 ml Produktionsmedium C der folgenden
Zusammensetzung enthalten:
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15745 i^ 2657677
Medium C
Tomatenbrei 20,0 g
Vollkornhafer 20,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 7,0 eingestellt.
Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage bei 28 C unter Schütteln in einer mit 220 U/min arbeitenden
Schütte!maschine (Hub 5,1 cm) inkubiert. Sodann werden die
Kolben abgeerntet, und die Aktivität wird auf Analysenplatten gegen Salmonella gallinarum MB1287 und Vibrio percolans
ATCC 8461 unter Verwendung von 12,7 mm-Analysenscheiben bestimmt,
die in zentrifugierte Fermentationsflüssigkeitsproben getaucht werden.
| Kulturalter, h pH |
96 7,4 |
| Salmonella gallinarum | |
| Hemmzone, mm | 23 |
| Vibrio percolans ATCC 8461 | |
| Hemmzone, mm' | 29 |
Die Fermentationsflüssigkeit wird filtriert und der pH-Wert des Filtrats mit verdünnter Salzsäure von 7,7 auf 7,0 gebracht.
2,65 1 des so eingestellten Filtrats werden mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/min an 135 ml IRA68-Harz in der
Chloridform (schwach basisches, vernetztes Acrylsäurepolymerisat-Anionenaustauschharz,
hergestellt von der Firma Rohm und Haas Co., Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania) adsorbiert,
wobei der Ablauf als eine Fraktion aufgefangen wird. Das Adsorbat wird mit 250 ml Wasser gewaschen und in sechs
Fraktionen zu 100 ml mit 5 % NaCl eluiert. Alle Fraktionen werden nach der Scheiben-Plattenmethode mit Hilfe von Vibrio
percolans ATCC 8461 und Salmonella gallinarum MB1287 analy-
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siert. Diese Analysen zeigen, dass die Eluatfraktionen Nr. 1 bis 3 45 % der auf das Harz aufgegebenen Bioaktivität enthalten.
Die Eluatfraktionen Nr. 1 bis 3 werden zu 310 ml Lösung vereinigt.
Diese Lösung wird mit 15g Kochsalz versetzt und auf 2 C gekühlt. Die kalte Lösung wird mit HCl auf einen pH-Wert
von 3,0 eingestellt und sofort mit 150 ml n-Butylalkohol extrahiert.
Die Extraktion wird noch zweimal mit weiteren 150 ml n-Butylalkohol wiederholt. Die n-Butylalkoholphasen werden
nacheinander dreimal mit je 75 ml Wasser rückextrahiert. Bei der Extraktion werden die wässrigen Phasen durch Zusatz von
verdünnter Natronlauge auf einem. pH-Wert von 7 gehalten. Alle Fraktionen werden gegen Vibrio percolans ATCC 8461 und Salmonella
gallinarum MB-1287 analysiert; die Ergebnisse sind
nachstehend als Prozent der Ausgangsbioaktivität angegeben:
| Fraktion | Nr. | 1 | Gewinnung |
| Ausgangsgut | Nr. | 2 | 100 % |
| wässriger Ablauf | Nr. | 3 | 12 % |
| n-Butylalkohol-Ablauf | Nr. | 1 | 0 |
| Nr. | 2 | 0 | |
| Nr. | 3 | 0 | |
| wässriger RUckextrakt | 25 % | ||
| 37 % | |||
| 5 % | |||
Der erste und der zweite Rückextrakt werden einzeln gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Feststoffe werden miteinander vereinigt und ergeben 984 mg Produkt.
Herstellung eines Gemisches, das die Antibiotica 890A1 und 890A, enthält
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt
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in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung
der folgenden Zusammensetzung enthält:
Natriumeitrat 0,5 g
K2HPO4 7,0 g
KH2PO4 ■ .. 3,0 g
(NH4O2SO4 . 1,0 g
MgS04.7H20 ■ 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml.
Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen zu beimpfen,
die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium A
Dextrose 10,0 g Pepton 5*0 g
Hefeextrakt 3,0 g
NaCl 12,705 g KCl 0,72 g
FeSO4.(NH4)2S04.6H2O 0,0351 g
MgCl2-OH2O 5,32 g
CaCl2-2H2O 0,728 g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH 7,4 (vor dem Sterilisieren) Agar 25,0 g
Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Wocfte bei 27 bis
28° C inkubiert und dann bei 4 bis 6° C gelagert, bis sie 10 Tage später verwendet werden. Die Hälfte der Oberflächenkultur
eines dieser Schrägröhrchen wird verwendet, um mit Umlenkorgan
ausgestattete Erlenmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen zu beimpfen, die je 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung
enthalten:
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Medium B
Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g
Glucose 10,0 g
Phosphatpuffer** 2,0 ml
MgSO4-7H2O 50 mg
■destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit KCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt.
* Ardamine: Yeast Products Corporation
** Phosphatpufferlösung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,Og
destilliertes Wasser 1000 ml.
Drei Impfkolben werden so beimpft, dass man genügend Impfgut
für 12 Produktionskolben zu je 2 1 erhält, die in diesem Ansatz
fermentiert werden. Die Impfkolben werden einen Tag bei
28 C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Die Kolben werden aus der Schüttelmaschine
entfernt und einen Tag bei 4° C gelagert. Der Inhalt dieser Impfkolben wird verwendet, um 12 Erlenmeyer-Produktionskolben
ohne Umlenkorgane zu je 2 1 (7 ml Impfgut je Kolben)
zu beimpfen, die 250 ml Produktionsmedium C der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium C
Tomatenbrei 20,0 g
Primärhefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,0 g
entmineralisiertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 7,3 eingestellt.
Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage und
5 Stunden bei 24° C in einer mit 220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) inkubiert. Nach diesem Zeitraum werden
die Kolben abgeerntet, und die Aktivität gegen Salmonella
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gallinarum MB1287 und Vibrio percolans ATCC 8461 wird unter
Verwendung von Analysenplatten und 12,7 mm-Analysenschei"ben bestimmt, die in zentrifugierte Fermentationsflüssigkeitsproben
getaucht werden. Die Ergebnisse sind die folgenden:
Analyse beim Abernten
| Kulturalter, h | 101 |
| pH | 7,1 |
| Salmonella gallinarum | |
| Hemmzone, mm | 31 |
| Vibrio percolans |
Hemmzone, mm 43
Die Fermentationsflüssigkeit wird zentrifugiert. Zu den 2,2 1 des klaren Zentrifugats (pH 6,8) setzt man 22 mg (Äthylendini
trilo)-tetraessigsäure zu und stellt den pH-Wert auf 7,2 ein. Das auf den genannten pH-Wert eingestellte Zentrifugat
wird mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min an 150 ml
Dowex 1 χ 2-Harz in der Chloridform adsorbiert, wobei man den Ablauf als eine Fraktion auffängt. Das Adsorbat wird mit
150 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen, die 10 y/ml
(Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthalten, und mit 5-%iger NaCl-Lösung eluiert, die 10 y/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure
enthalten, wobei fünf Fraktionen zu je 75 ml
aufgefangen werden. Alle Fraktionen werden gegen Vibrio percolans ATCC 8461 analysiert. Die Ergebnisse in Prozent der
Anfangsbioaktivität sind die folgenden:
Ausgangsgut 100 %
Ablauf . ■ 0
5 %-NaCl-Eluatfraktionen Nr. 2 bis 4 75 %
Wasserverdrängungs-Waschflüssigkeit 1 %
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50 ml der Fraktion Nr. 3 des 5 %-NaCl-Eluats werden mit verdünnter
Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,2 eingestellt und durch eine 100 ml-Kolonne von XAD-2 geleitet, die zuvor mit
dem Fünffachen ihres Volumens an 60-vol„%iger wässriger
Acetonlösung, dem Fünffachen ihres Volumens an entmineralisiertem
Wasser und dem Fünffachen ihres Volumens an- einer Lösung von 5 Gewichtsteilen NaCl in 100 Raumteilen entmineralisiertem
Wasser, die 25-umolar an neutralem EDTA sind, und sodann
mit dem Fünffachen ihres Volumens an entmineralisiertem
Wasser gewaschen worden ist. Das Harz wird mit entmineralisiertem Wasser, welches 10 y/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure
enthält, entwickelt, wobei man zwei Fraktionen zu je
25 ml und fünf Fraktionen zu je 10 ml auffängt und den Ablauf überwacht, bis er gegen saures Silbernitrat negativ reagiert.
Am Ende der fünften 10 ml-Fraktion wird eine negative Silbernitratreaktion
erhalten. Die Entwicklung mit entmineralisiertem Wasser wird fortgesetzt, bis vier Fraktionen zu je 100 ml
aufgefangen worden sind. Das Harz wird mit 60-%iger wässriger Acetonlösung, die 4 γ/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure
enthält, entwickelt, bis zwei Fraktionen zu je 50 ml aufgefangen worden sind. Alle Fraktionen werden gegen Vibrio
percolans ATCC 8461 analysiert; die Ergebnisse sind die folgenden:
Ausgangsprobe Volumen 50 ml ' Gewinnung 100 %
| Fraktion 1 | 25 | 0 |
| 2 | 25 | 0 |
| 3 | 10 | . 0 |
| 4 | 10 | 0 |
| 5 | 10 | 1 |
| 6 | 10 | 4,5 |
| 7 | 10 | 7 |
| 8 | 100 | 60 |
| 9 | 100 | 6 |
| 10 | 100 | 1 |
| 11 | 100 | 0 |
| 12 | 50 | 1 |
| 13 | 50 | 0 |
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Die Fraktion Nr. 8 wird zu 10 ml eingeengt und zu 34,2 mg
Feststoffen gefriergetrocknet.
33,2 mg der gefriergetrockneten Feststoffe werden in 1,5 ml 1-%iger wässriger n-Butylalkohollösung aufgenommen, und die
Lösung wird in eine 1,4 χ 81,5 cm messende Kolonne von
Bio-Gel P-2 (37-74 u) eingegeben, die zuvor mit 1-%iger wässriger
n-Butylalkohollösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer
Geschwindigkeit von 1 ml/min entwickelt, wobei man Fraktionen zu 2 ml auffängt. Jede der Fraktionen Nr. 29 bis 46 wird gegen
Vibrio percolans ATCC 8461 analysiert. Die höchste Bioaktivität wird in den Fraktionen Nr0 36 bis 44 bei einem Maximum in
der Fraktion Nr. 39 beobachtet. Die Fraktionen Nr. 38 bis 41 werden vereinigt und zu 4,0 mg Antibioticum gefriergetrocknet.
Schüttelkolbenproduktion eines Gemisches, das die Antibiotica 890A1 und 890A^ enthält
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces
flavogriseus MA-4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt
in einem Rohr suspendiert,.das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung
der folgenden Zusammensetzung enthält:
Natriumeitrat . 0,5 g
K2HPO4 . 7,0 g
KH2PO4 3,0 g
(NH4)2S04 · 1,0 g
MgSO4.7H2O ' 0,1 g
destilliertes Wasser . 1000 ml.
Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit
Medium A zu beimpfen, welches die folgende Zusammensetzung hat:
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Medium A
Glycerin Primärhefe Fischmehl destilliertes Wasser Agar
pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt.
Die beimpften Schrägröhreben werden eine Woche bei 27 bis
28° C inkub
aufgehoben.
| 20,0 | g |
| 5,0 | g |
| 15,0 | g |
| 1000 | ml |
| 20,0 | g |
28 C inkubiert und dann bis zur Verwendung bei 4 bis 6 C
Ein Drittel der Oberflächenkultur von zwei Schrägröhreben wird
verwendet, um sechs mit Umlenkorgan versehene 250 ml-Erlenmeyerkolben
zu beimpfen, die je 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium B
HefeautoIysat (Ardamine*) · 10,0 g
Glucose 10,0 g
Phosphatpuffer** 2.0 ml
MgSO4.7H2O 50 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt.
* Ardamine: Yeast Products Corporation
** Phosphatpufferlösung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml.
Der Impfkolben wird einen Tag bei 27 bis 28° C in einer mit.
220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Der Kolben mit Inhalt wird einen Tag in Ruhe bei 4 C aufbewahrt
.
- 51 -
70 9822/1030
22 Erlenmeyer-Produktionskolben zu je 2 1, die je 300 ml
Medium C enthalten, werden je Kolben mit 8 ml der Kultur aus dem Impfkolben beimpft. Das Medium C hat die folgende Zusammensetzung:
Medium C
Tomatenbrei 20,0 g
Primärhefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,0 g
CoCl2.6H2O 5,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.
Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage und 5 Stunden bei 24° C in einer mit 212 U/min laufenden Schüttelmaschine
(Hub 5,1 cm) inkubiert. Die Kolben werden abgeerntet, und die Aktivität wird mit Standardanalysenplatten
gegen Salmonella gallinarum MB1287 und Vibrio percolans
ATCC 8461 unter Verwendung von 1,27 mm-Analysenscheiben analysiert,
die in zentrifugierte Fermentationsflüssigkeitsproben getaucht werden. Falls erforderlich, werden die Proben mit
0,02-molarem Phosphatpuffer (pH 7,0) verdünnt. Die Ergebnisse
sind die folgenden:
KuItüralter, h 101
pH 7,1
Hemmzone,mm 31
Vibrio percolans,
Verdünnung 1/10
Hemmzone, mm 24,5
890-Analyseneinheiten 46
4 1 der vollständigen Fermentationsflüssigkeit, die 23 Einheiten/ml
enthalten, werden auf 3° C gekühlt und in Anteilen von 200 ml je 15 Minuten mit 9000 U/min zentrifugiert. Die vereinigten
überstehenden Flüssigkeiten (3,6 1) werden mit 1 ml
- 52 709822/1030
15 745
0,1-molarer neutraler EDTA-Lösung und 10 ml 1-molarer Tris-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) versetzt. Die 0,10-molare neutrale
EDTA-Lösung wird durch Lösen von 0,1 Mol des Dinatriumsalzes von Athylendiamintetraessigsäure in 1 1 entmineralisiertem
Wasser und Einstellen des pH-Wertes mit Natronlauge auf 7 hergestellt.
Die zentrifugierte Fermentationsflüssigkeit wird in einer Kolonne
an ein 5,1 cm χ 20 cm messendes Bett von Dowex-1 χ 2
(Cl"), Teilchengrösse 150-300 u, adsorbiert, das vor der Aufgabe
der zentrifugierten Flüssigkeit mit 1 1 entmineralisiertem Wasser gewaschen worden war. Die Strömungsgeschwindigkeit
bei der Adsorption beträgt 50-80 ml/min. Nach beendeter Adsorption wird die Kolonne mit 500 ml entmineralisiertem Wasser,
die 25-umolar an neutraler EDTA sind, gewaschen und dann mit 1300 ml 5 % NaCl in entmineralisiertem Wasser, das 25-umolar
an neutraler EDTA ist, eluiert. Von dem ersten Aufguss der Kochsalzlösung an gerechnet, werden neun Fraktionen aufgefangen.
Die Fraktionen Nr. 1 bis 4 enthalten 100 bis 115 ml je Fraktion, die Fraktionen Nr. 5 bis 9 umfassen je 170 bis
ml. Die Fraktionen werden auf ihre Bioaktivität gegen Salmonella gallinarum MB1287 analysiert. Die Bioak.tivität erscheint
in den Fraktionen Nr. 2 bis 9 mit einem Maximum bei den Fraktionen Nr. 4 und 5.
Die Ultraviolettabsorption geeigneter Verdünnungen einer jeden Fraktion wird mit einem Spektrophotometer (Gilford Modell 2000)
gemessen und das Verhältnis von Bioaktivität zu Extinktion (absorbance) bei 220 nm (A2P0) für Jede Fraktion berechnet.
Diejenigen Fraktionen, bei denen das Verhältnis von Bioaktivität zu Appn grosser als die Hälfte des Maximalwertes ist,
werden, für die weitere Verarbeitung vereinigt. So werden die
- 53 -
709822/1030
Fraktionen Nr. 4 bis 7 vereinigt, die 30 % der aufgegebenen
Bioaktivität enthalten.
Das vereinigte NaCl-Eluat wird unter vermindertem Druck auf
100 ml eingeengt, wobei die Temperatur beim Eindampfen unter 35 C gehalten wird.
Der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zusatz von 3 ml 1-molarer
Salzsäure auf 5,2 eingestellt und das Konzentrat in eine 3,5 cm weite und 57 cm lange Kolonne mit XAD-2 aufgegeben,
die zuvor mit 3 1 60-vol.?6iger wässriger Acetonlösung,
3 1 entmineralisiertem Wasser, 3 1 einer Lösung von 5 Gewichtsteilen Kochsalz je 100 Raumteile entmineralisiertes Wasser,
die 25-umolar an.neutraler EDTA ist, und 1 1 gesättigter
Kochsalzlösung gewaschen worden ist. Nach dem Waschen wird die Kolonne in einen kalten Raum überführt, der auf 3 C gehalten
wird, bevor das Konzentrat aufgegeben wird.
Das aufgegebene Konzentrat wird bis zur Höhe des Bettes des
Adsorptionsmittels ablaufen gelassen, und die aktiven Fraktionen werden mit 1,3 1 25-umolarer neutraler EDTA-Lösung in
entmineralisiertem Wasser eluiert. Von der ersten Aufgabe des Konzentrats in die Kolonne an gerechnet, werden Fraktionen zu
je 10 ml aufgefangen.
Jede fünfte Fraktion wird nach der Plattenmethode auf ihre Bioaktivität gegen Salmonella gallinarum MB1287 analysiert,
und die A-pn-Werte werden an geeigneten Verdünnungen bestimmt.
Diejenigen Fraktionen, bei denen das Verhältnis der Bioaktivität zu A22O grosser als die Hälfte des Maximalwertes ist, werden
vereinigt. Auf diese Weise werden die Fraktionen Nr. 48 bis 95 vereinigt, die 50 % der aufgegebenen Aktivität, entsprechend
17 % der Aktivität der filtrierten Fermentationsflüssigkeit,
enthalten.
- 54 909822/1030
Die vereinigten XAD-2-Fraktionen werden auf 50 ml eingeengt
und in eine Kolonne von Dowex-1 χ 4 (Cl ) mit Teilchengrössen
unter 37 u aufgegeben, in der die Abmessungen des Harzbettes 1»3 x 13 cm betragen. Die Kolonne wird mit 15 ml entmineralisiertem
Wasser gewaschen und mit 400 ml einer Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert, die 0,08-molar an NaCl,
0,005-molar an NH^ Cl und 0,0001-molar an NH^ ist. Bei einer
Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 ml/min werden Fraktionen zu je 10 ml aufgefangen. Eine Aktivität, die 100 % der aufgegebenen
Aktivität äquivalent ist, wird in den Fraktionen Nr. bis 30 eluiert; das Maximum der Aktivität tritt in der Fraktion
Nr. 2b auf. Die Fraktionen Nr. 26 und Nr. 27 haben das höchste Verhältnis von Extinktion (absorbance) bei 300 nm zu
Extinktion (absorbance) bei 220 nm (A^^/A-p^.),·, und diese beiden
Fraktionen werden zwecks Entsalzung vereinigt. Die Gesamtaktivität in den Fraktionen Nr. 26 und 27 beträgt 7390 Einheiten
oder 59 % der aufgegebenen Aktivität. Die vereinigten Fraktionen Nr. 26 und 27 werden mit 5 ul 0,01-molarer neutraler
EDTA-Lösung versetzt.
Die vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 1,95 ml eingeengt, und
das Konzentrat wird in eine Kolonne von Bio-Gel P-2 (37-74 u) aufgegeben, in der die Abmessungen des Adsorptionsmittelbettes
2,2 χ 80 cm betragen. Die Probe wird mit Anteilen zu 1 ml und 2 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und'dann mit einer
Geschwindigkeit von 0,7 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Dabei werden Fraktionen zu 2,1 bis 2,2 ml aufgefangen.
Das Hauptmaximum der UV-Extinktion (UV absorbance) findet sich in den Fraktionen Nr. 89 bis 100, die 74 % der aufgegebenen.
Extinktionseinheiten (absorbance units), bestimmt bei 300·nm (A,0Q-Einheiten), enthalten. Die Fraktionen Nr. 92 bis
98 werden vereinigt, zu 2 ml eingeengt und gefriergetrocknet.
- 55 -
η ο 9 8 2 % 11 ο 3 ο
Diese Produktprobe enthält 18,6 A^00-Einheiten, was 5,8 % der
in der Ausgangsfermentationsflüssigkeit enthaltenen Bioaktivität
entspricht. Die Fraktionen Nr. 89 bis 91 und Nr. 99 bis 100 werden weiter gemäss Beispiel 6 gereinigt.
Schüttelkolbenproduktion des Antibioticums ^
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt
in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält:
Natriumeitrat K2HPO4
|
0,5
7,0 |
g g |
| 3,0 | g |
| 1,0 | g |
| 0,1 | g |
| 1000 | ml |
24 (NH4)2S04
MgSO4.7H2O destilliertes Wasser
Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit Medium A zu beimpfen, welches die folgende Zusammensetzung
hat:
Medium A
Glycerin 20,0 g
Primärhefe 5,0 g
Fischmehl 15,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Agar 20,0 g
pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt.
28 C inkubiert und dann bis zur Verwendung bei 4 bis 6° C
Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 27 bis 28° C inkub.
aufgehoben.
- 56 709822/1030
Ein Drittel der Kultur dieser drei Schrägröhrchen wird verwendet, um neun mit Umlenkorgan versehene 250 ml-Erlenmeyerkolben
zu beimpfen, die je 50 ml Medium E der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium B
Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g
Glucose 10,0 g
Phosphatpuffer** 2,0 ml
MgSO4.7H2O - 50 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt.
* Ardamine: Yeast Products Corporation ** Phosphatpufferlösung
| KH2PO4 | Wasser | 91,0 | g |
| Na2HPO4 | 95,0 | g | |
| destilliertes | 1000 | ml. | |
Der Impfkolben wird einen Tag bei 27 bis 28 C in einer mit 220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt.
Der Ko
wahrt.
wahrt.
Der Kolben mit Inhalt wird einen Tag in Ruhe bei 4 C aufbe-
33 Erlenmeyer-Produktionskolben zu je 2 1, die je 250 ml Medium C enthalten, werden je Kolben mit 8 ml der Kultur aus
dem Impfkolben beimpft. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:
Medium C
Tomatenbrei Primärhefe '. Dextrin (Amidex) CoCl2*6H2O
destilliertes Wasser
pH mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.
- 57 -
| 20,0 | g |
| 10,0 | g |
| 20.0 | g |
| 5,0 | mg |
| 1000 | ml |
709822/1 030
Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage bei 24° C in einer mit 212 U/min laufenden Schüttelmaschine
(Hub 5,1 cm) inkubiert. Die Kolben werden abgeerntet, und die Aktivität wird mit Standardanalysenplatten gegen Salmonella
gallinarum MBI287 und Vibrio percolans ATCC 8461 unter Verwendung
von 1,27 mm-Analysenscheiben analysiert, die in zentrifugierte
Fermentationsflüssigkeitsproben getaucht werden. Falls erforderlich, werden die Proben mit 0,02-molarem Phosphatpuffer
(pH 7,0) verdünnt. Die Ergebnisse sind die folgenden:
Kulturalter, h 96
pH . 7,2
Hemmzone, mm 29,5
Vibrio percolans,
Verdünnung 1/10
Hemmzone, mm 31
890-Analyseneinheiten 40
7 1 der vollständigen Fermentationsflüssigkeit werden auf 3 C gekühlt und in Anteilen zu 200 ml Je 15 Minuten bei 9000 U/min
zentrifugiert.
Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden mit 7 ml 0,1-molarer neutraler EDTA-Lösung versetzt, und die ganze Probe
wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit, von 40 ml/min an
einer Kolonne mit Dowex-1 χ 2 (Cl"), Teilchengrössen 150-300 μ,
Bettabmessungen 5,1 χ 25 cm, adsorbiert. Die Kolonne wird mit
500 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen, die 5 ml 1-molaren
Tris-HCl-Puffer (pH 7,0)· enthalten und 25-umolar an neutraler
EDTA sind. Das Antibioticum wird mit 1 1 entmineralisiertem Wasser mit einem Kochsalzgehalt von 50 g eluiert und die Kolonne
dann mit 300 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. Von dem ersten Auftreten von Salz im Kolonnenablauf an gerechnet,
werden Fraktionen zu je 100 ml aufgefangen. Die Bio-
- 58 -
709822/1030
aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 1 bis 10 mit einem Maximum in der Fraktion Nr. 2. Die Fraktionen mit den höchsten
Verhältnissen von Bioaktivität zu Ap20 werden vereinigt. So
werden die Fraktionen Nr. 2 bis 5 vereinigt, die 17 % der aufgegebenen
Aktivität enthalten.
Die vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 110 ml eingeengt, und der
pH-Wert wird durch Zusatz von 4,2 ml 1-molarer Salzsäure auf 5,8 eingestellt. Das so eingestellte Konzentrat wird in eine
XAD-2-Kolonne mit Bettabmessungen von 3,8 χ 50 cm aufgegeben,
die zuvor mit 3 1 60-vol.prozentiger wässriger Acetonlösung, dann mit 3 1 entmineralisiertem Wasser, mit 3 1 Kochsalzlösung
(5 Gewichtsteile je 100 Raumteile) und 1 1 Kochsalzlösung (25 Gewichtsteile je 100 Raumteile) in entmineralisiertem
Wasser gewaschen worden ist. Man lässt das Konzentrat bis zur Höhe des Adsorptionsmittelbettes ablaufen. Das Antibioticum
wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 15 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Von der ersten Aufgabe der
Probe an gerechnet, werden 22 Fraktionen zu je 100 ml aufgefangen. Die Bioaktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 6
bis 22 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 9 und 10. Die Fraktionen, deren Verhältnisse von Bioaktivität zu Appn grosser
als das 0,3fache des Maximalwertes sind, werden miteinander vereinigt. Auf diese Weise werden die Fraktionen Nr. 9 bis
20 zur weiteren Verarbeitung vereinigt. Zu diesen Fraktionen werden die Fraktionen Nr. 89, 90, 91, 99 und 100 aus der Bio-Gel
P-2-Kolonne des Beispiels 5 zugesetzt. Dieses Gemisch wird im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 70 ml
eingeengt.
Das Konzentrat wird an einer Kolonne mit Dowex-1 χ 4 (Cl"),
Teilchengrössen unter 37 U, Bettabmessungen 2,2 χ 27 cm, ad-
- 59 7098 22/1030
sorbiert. Die Kolonne wird mit 50 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und das Antibioticum mit 2 1 einer an Kochsalz
0,070-molaren, an NH^Cl 0,005-molaren und an NH, 0,0001-molaren
Lösung in entmineralisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min eluiert. Dabei werden Fraktionen
zu je 9,5 ml aufgefangen.
Das Hauptmaximum des Antibioticums wird in den Fraktionen Nr. 142 bis 163 eluiert. Die Fraktionen Nr. 146 bis 157 enthalten
das Material mit den höchsten A,Q0/A2cQ-Verhältnissen
und werden zur weiteren Verarbeitung vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen Nr. 146 bis 157 werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 3 ml eingeengt, und
das Konzentrat wird durch Zusatz von 5 Ul 1-molarer NH,-Lösung
auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Das Konzentrat wird in eine Kolonne (2,2 χ 70 cm) mit Bio-Gel P-2 (37-74 p)
aufgegeben, die zuvor mit 20 ml 5-molarer Kochsalzlösung und 500 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen worden ist. Sobald
das Konzentrat bis zur Höhe des Adsorptionsmittelbettes abgelaufen ist, wird die Kolonne zweimal mit je 1 ml entmineralisiertem
Wasser gespült, worauf man wieder bis zur Höhe des Bettes ablaufen lässt. Die Kolonne wird dann mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 0,6 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert, wobei Fraktionen zu je 2,9 ml aufgefangen
werden.
Das Hauptmaximum der antibiotischen Aktivität wird in den Fraktionen Nr. 63 bis 70 eluiert. Die Fraktionen Nr. 64 und
65 haben die höchsten A,00/A2,=Q-Verhältnisse und werden für
die weitere Aufarbeitung vereinigt. Diese .beiden Fraktionen enthalten 44 % der UV-Absorption (UV absorption) bei 300 nm,
die in die Bio-Gel P-2-Kolonne aufgegeben worden war.
- 60 709822/1030
Die vereinigten Fraktionen Nr. 64 und 65 werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 2 ml eingeengt und
dann 8 Stunden in einer 14 ml-Ampulle mit Schraubkapsel gefroren
und zu 2,25 mg praktisch reinen Antibioticums 890A-, gefriergetrocknet
(45,5 A-2QQ-Einheiten).
Schüttelkolbenproduktion des Antibioticums 890A^
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt
in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält:
Natriumeitrat K2HPO4
KH2PO4 (NH4)2S04
MgSO4-7H2O
destilliertes Wasser
Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit Medium A zu beimpfen, welches die folgende Zusammensetzung
hat:
Medium A
Glycerin 20,0 g
Primärhefe 5,0 g
Fischmehl 15,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Agar 20,0 g
pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt.
Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 27 bis 28 C inkubiert und dann bis zur Verwendung bei 4 bis 6 C
aufgehoben (nicht länger als 21 Tage).
- 61 -
| 0,5 | g |
| 7,0 | g |
| 3,0 | g |
| 1,0 | g |
| 0,1 | g |
| 1000 | ml. |
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Ein Drittel der Kultur aus vier Schrägröhrchen wird verwendet,
um 12 mit Umlenkorgan versehene 250 ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen,
die je 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium B
Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g
Glucose 10,0 g
Phosphatpuffer** 2,0 ml
MgSO4.7H2O 50 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt.
* Ardamine: Yeast Products Corporation
** Phosphatpufferlösung
• KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml.
Der Impfkolben wird einen Tag bei 27 bis 28° C in einer mit 220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm), geschüttelt.
Der Ko:
wahrt.
wahrt.
Der Kolben mit Inhalt wird einen Tag in Ruhe bei 4 C aufbe-
44 Erlenmeyer-Produktionskolben zu Je 2 1, die je 200 ml
Medium C enthalten, werden mit je 8 ml der Kultur aus dem Impfkolben beimpft. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:
Medium C
Tomatenbrei Primärhefe Dextrin (Amidex)
CoCl2·6H2O .
destilliertes Wasser
pH mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.
- 62 -
| 20,0 | g |
| 10,0 | g |
| 20,0 | g |
| 5,0 | mg |
| 1000 | ml |
7Ö9822/1030
Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage und 5 Stunden bei 24° C in einer mit 212 U/min laufenden Schüttelmaschine
(Hub 5,1 cm) inkubiert. Die Kolben werden abgeerntet, und die Aktivität wird mit Standardanalysenplatten gegen Salmonella
gallinarum MB1287 und Vibrio percolans ATCC 8461 unter
Verwendung von 1,27 mm-Analysenscheiben analysiert, die in zentrifugierte Fermentationsflüssigkeitsproben getaucht werden.
Falls erforderlich, werden die Proben mit 0,02-molarem Phosphatpuffer
(pH 7,0) verdünnt. Die Ergebnisse sind die folgenden:
Kulturalter, h 101
pH 7,2
Hemmzone, mm 35
Vibrio percolans,
Verdünnung 1/10
Hemmzone, mm 34
890-Analyseneinheiten 121
Die gesamten 7,0 1 der vollständigen Fermentationsflüssigkeit werden auf 3 C gekühlt und in Anteilen zu 200 ml je 15 Minuten
mit 9000 U/min zentrifugiert. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden mit 1,7 ml 0,1-molarer neutraler
EDTA-Lösung versetzt, und der Ansatz wird auf 3° C gehalten.
Die oben beschriebene Fermentation wird unter den gleichen Bedingungen mit dem Unterschied wiederholt, dass die 44
2-Liter-Erlenmeyer-Produktionskolben mit je 7 ml der Kultur
aus dem Impfkolben beimpft werden. pH und Analysenergebnisse sind die folgenden:
- 63 -
709822/1030
Kulturalter, h 101
pH 7,3
Hemmzone, mm 38
Vibrio percolans,
Verdünnung 1/10
Hemmzone, mm 39
890-Analyseneinheiten 92,8
Die gesamten 7,4 1 der bei dieser Fermentation erhaltenen
Flüssigkeit werden auf 3 C gekühlt und in Anteilen von
200 ml je 15 Minuten mit 9000 U/min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden 1,8 ml einer
0,1-molaren EDTA-Lösung zugesetzt.
Flüssigkeit werden auf 3 C gekühlt und in Anteilen von
200 ml je 15 Minuten mit 9000 U/min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden 1,8 ml einer
0,1-molaren EDTA-Lösung zugesetzt.
Die überstehenden Flüssigkeiten der Fermentationsflüssigkeiten, die bei den beiden Fermentationsversuchen dieses Beispiels erhalten
worden sind, werden zu insgesamt 13 1 vereinigt, die
eine Stärke von 80 Einheiten/ml, bestimmt durch Analyse gegen Vibrio Percolans ATCC 8461, aufweisen.
eine Stärke von 80 Einheiten/ml, bestimmt durch Analyse gegen Vibrio Percolans ATCC 8461, aufweisen.
Die vereinigte überstehende Flüssigkeit wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 60 ml/min durch eine Kolonne mit
Dowex-1 χ 2 (Cl") (Teilchengrösse 150-300 fu, Bettabmessungen 4,7 cm χ 50 cm) geleitet. Die Kolonne wird mit 1 1 entmineralisiertem Wasser gewaschen und das Antibioticum mit 5 1 Kochsalzlösung (5 Gewichtsteile Kochsalz je 100 Raumteile), die
0,01-molar an Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) und 25-umolar an neutraler EDTA sind, eluiert. Es werden Fraktionen von je 220 ml mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/min aufgefangen
und gegen Salmonella gallinarum MB1287 nach der Plattenmethode analysiert.
Dowex-1 χ 2 (Cl") (Teilchengrösse 150-300 fu, Bettabmessungen 4,7 cm χ 50 cm) geleitet. Die Kolonne wird mit 1 1 entmineralisiertem Wasser gewaschen und das Antibioticum mit 5 1 Kochsalzlösung (5 Gewichtsteile Kochsalz je 100 Raumteile), die
0,01-molar an Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) und 25-umolar an neutraler EDTA sind, eluiert. Es werden Fraktionen von je 220 ml mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/min aufgefangen
und gegen Salmonella gallinarum MB1287 nach der Plattenmethode analysiert.
Die antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 3 bis 26 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 5 und 6. Die
- 64 709822/1030
Fraktionen Nr. 5 bis 9, die das höchste Verhältnis von Bioaktivität
zu App0 aufweisen, werden für die weitere Verarbeitung
miteinander vereinigt. Der pH-Wert der vereinigten Fraktionen beträgt 7,8, und die vereinigten Fraktionen enthalten
24 % der anfänglichen Bioaktivität, bestimmt nach der Plattenmethode gegen Salmonella gallinarum MB1287.
Die vereinigten Fraktionen Nr. 5 bis 9 werden in einem rotierenden
Verdampfer unter vermindertem Druck zu 150 ml eingeengt und in eine Kolonne (Bettabmessungen 4,9 cm χ 47 cm) von
XAD-2 aufgegeben, die zuvor mit 5 1 60-vol.prozentiger wässriger Acetonlösung, 5 1 entmineralisiertem Wasser und 5 1
einer Lösung von 50 g Kochsalz je Liter entmineralisiertes Wasser gewaschen worden ist. Die Probe wird in Anteilen von
20 ml in die Kolonne eingegeben, wobei die Kolonne jedesmal bis zur Höhe des Bettes ablaufen gelassen wird. Nach beendeter
Aufgabe der Proben werden drei Anteile zu je 20 ml entmineralisiertes Wasser aufgegeben und jedesmal bis zur Höhe des
Bettes ablaufen gelassen. Dann wird die Probe mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 20 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Alle Arbeitsvorgänge mit der XAD-Kolonne werden
bei Raumtemperatur (24 C) durchgeführt, und die aufgefangenen Fraktionen werden jedesmal sofort schnell im Eisbad gekühlt.
Fraktionen werden von 95 bis 230 ml aufgefangen.
Die antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 2 bis 21, bestimmt nach der Plattenmethode gegen
Salmonella Gallinarum MB1287, und das Maximum ist in den
Fraktionen Nr. 5 bis 7 enthalten (die, gezählt von dem ersten Aufgeben von entmineralisiertem Wasser, von 510 bis 895 ml
des eluierten Volumens reichen). Die Fraktionen Nr. 6 bis 21, bei denen die Verhältnisse der Bioaktivität zu Ap20
innerhalb 50 % des beobachteten Maximalwertes liegen, werden
- 65 709822/1030
vereinigt. Die gesamte gewonnene Bioaktivität beträgt 280
Einheiten oder 112 % der scheinbaren aufgegebenen Aktivität.
Die vereinigten Fraktionen Nr. 6 bis 21 werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 68 ml eingeengt und
dann mit entmineralisiertem Wasser auf 112 ml verdünnt. Das Konzentrat wird in eine Kolonne (Bettabmessungen 2,2 cm χ
21 cm) von Dowex-1 χ 4 (Cl") mit Teilchengrössen unter 37 μ
eingegeben. Die Kolonne wird mit 20 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen, und die Antibiotica werden mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 1,6 ml/min mit 2 1 einer an Kochsalz 0,07-molaren, an NH^Cl 0,005-molaren und an NH5 0,0001-molaren
Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert. Dabei werden Fraktionen zu je 8 ml aufgefangen.
Das Hauptmaximum der Extinktion (absorbance) bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 153 bis 182 mit einem Maximum
in der Fraktion Nr. 162. Die Fraktionen Nr. 157 bis 179, die
die höchsten Verhältnisse von Extinktion (absorbance) bei 300 nm zu Extinktion (absorbance) bei 245 nm aufweisen, werden
für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen weisen insgesamt 780 Absorptionseinheiten
(absorption units) bei 300 nm auf.
Die vereinigten Fraktionen werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 7 ml eingeengt, und der pH-Wert
wird durch Zusatz von 20 ul 1-molarer Natronlauge auf 7,5
eingestellt/Die Lösung wird weiter auf 5 ml eingeengt und in eine Kolonne (2,2 χ 75 cm) von Bio-Gel P-2 (37-74 u) eingegeben.
Die Probe wird in die Kolonne mit zwei Anteilen zu je
1 ml entmineralisiertem Wasser hineingewaschen und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 ml/min mit entmineralisiertem
Wasser eluiert. Zunächst werden zehn Fraktionen zu je
- 66 7098 22/1030
3,3 ml, dann sechzig Fraktionen zu je 2,65 ml und schliesslich
zehn Fraktionen zu je 2,0 ml aufgefangen.
Das Hauptmaximum der Extinktion (absorbance) bei 300 nm erscheint
in den Fraktionen Nr. 60 bis 68. Die pH-Werte der Maximumfraktionen werden durch Zusatz von 1,5 bis 2,5 ul
0,1-molarer Natronlauge auf einen Bereich von 7,5 bis 8,0 eingestellt.
Die Fraktionen Nr. 62, 63, 64 und 65 werden einzeln in 14 ml-Glasampullen gefroren und gefriergetrocknet und im
Vakuum, bei -20° C gelagert. Diese vier Fraktionen enthalten
insgesamt 606 Absorptionseinheiten (absorption units) bei 300 nm.
Um das Antibioticum 890A^ frei von dem Antibioticum 890A^ zu
gewinnen, nutzt man die verhältnismässig höhere Widerstandsfähigkeit
des Antibioticums 890A^ gegen den Abbau durch Penicillinase folgendermaßen aus:
Die Bio-Gel-Fraktion Nr.63 wird mit den Fraktionen Nr. 61,
66 und 67 aus der Bio-Gel-Kolonne vereinigt. Diese vier vereinigten
Fraktionen weisen insgesamt 235 Extinktionseinheiten (absorbance units) bei 300 nm auf. Man setzt 0,2 ml einer
1-molaren Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) und 0,2 ml Penicillinase
zu [Difco "Bacto-Penase", enthaltend 500 000 Einheiten
je ml (1000 LU/ml), wobei der Ausdruck LU sich auf Levy-Einheiten bezieht; 1000 LU inaktivieren 500 000 Einheiten
Penicillin G]. Nach 113 Minuten bei 23 C setzt man weitere 0,2 ml Penicillinase zu. Nach weiteren 7 Stunden bei Raumtemperatur
werden nochmals 0,2 ml Penicillinase zugesetzt, und nach 2 weiteren Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch
im Eisbad gekühlt. Das Gemisch wird dann durch Zusatz von 5 ml entmineralisiertem Wasser auf 15 ml verdünnt.
Die Extinktion (absorbance) des verdünnten umgesetzten Präpa-
- 67 -709822/1030
rats beträgt 6,3 bei 300 nm, wovon 2,64 Einheiten durch Umsetzung mit Cystein auslöschbar sind»
Das Reaktionsgemisch wird an eine Kolonne mit Dowex-1 χ 4
(Cl"), Teilchengrösse unter 37 u, Bettabmessungen 2,15 x 40 cm,
adsorbiert. Das Antibioticum 890A^ wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 3 ml/min mit einer an Kochsalz 0,07-molaren, an NH^Cl 0,005-molaren und an NH, 0,0001-molaren Lösung in
entmineralisiertem Wasser eluiert. Dabei werden Fraktionen zu je 13,8 ml aufgefangen.
Das Hauptmaximum der Extinktion (absorbance) bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 185 bis 203. Die Fraktionen Nr.
187 bis 200 haben die höchsten Verhältnisse A300^A245 und wer~
den für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen weisen insgesamt 31 A^0Q-Einheiten auf.
Die vereinigten Fraktionen werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 4 ml eingeengt, und das Konzentrat
wird in eine Kolonne (2,2 χ 70 cm) von Bio-Gel P-2
(37-74 p) eingegeben. Das Antibioticum 890A, wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 ml/min mit entmineralisiertem
Wasser eluiert. Es werden 30 Fraktionen zu je 3,3 ml und
sodann 50 Fraktionen zu je 2,65 ml aufgefangen.
Der Hauptgipfel der Extinktion (absorbance) bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 64 bis 74 mit einem Maximum in
der Fraktion Nr. 70. Die Fraktionen Nr. 66 bis 70 werden vereinigt;
sie enthalten 19 A^0Q-Einheiten oder 61 % der aufgegebenen
Einheiten. Die vereinigten Proben werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 1,5 ml eingeengt,
und das Konzentrat wird gefroren und gefriergetrocknet. Man
- 68 709822/1030
erhält 5,4 mg Feststoffe, die Antibioticum 890A, und restliche
Salze enthalten.
Herstellung der Antibiotica 890A1 und
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt
in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Sa].zlösung der folgenden Zusammensetzung enthält:
Natriumeitrat ·' 0,5 g
K2HPO4 7,0 g
KH2PO4 3,0 g
(NH4)2S04 1,0 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml.
Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit Medium A zu beimpfen, welches die folgende Zusammensetzung
hat:
Medium A
Glycerin 20,0 g
Primärhefe 5,0 g
Fischmehl 15,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Agar 20,0 g
pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt.
Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 27 bis 28° C inkubiert und dann bis zur Verwendung bei 4 bis 6° C
aufgehoben (nicht länger als 21 Tage).
ml Medium B der folgenden Zusammensetzung:
- 69 -
709822/1030
Medium B
Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g
Glucose . 10,0g
Phosphatpuffer** 2,0 ml
MgSO4.7H2O 50 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt.
* Ardamine: Yeast Products Corporation ** Phosphatpufferlösung
| KH2PO4 | Wasser | 91 | ,0 | g |
| Na2HPO4 | 95 | ,0 | g | |
| destilliertes | 1000 | ml | ||
werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel werden in Suspension geschabt,
und 3,3 ml dieser Suspension werden verwendet, um einen 2 1
fassenden, mit Umlenkorgan versehenen Erlenmeyerkolben zu beimpfen,
der 500 ml Medium B enthält. Dieser Impfkolben wird
36 Stunden bei 28° C in einer mit I60 U/min arbeitenden
Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf die Kultur
sich zufriedenstellend entwickelt hat.
Die Kultur aus diesem Impfkolben wird verwendet, um einen 189 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen,
der 160 1 Medium B enthält. Dieser Fermenter wird 24 Stunden
bei 28 C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 150 U/min bei einer Luftströmung von 85 l/min betrieben. Ein
Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000 der Dow Chemical Corp.).wird nach Bedarf verwendet, aber nicht in grösserer
Konzentration als 0,1 %. Die pH-Werte sind die folgenden:
Alter, h 0 pH 6,3
- 70 -
709822/1030
43 1 der Kultur dieses" Impf fermenters werden verwendet, um
einen 756 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen, der 467 1 Medium C der folgenden Zusammensetzung enthält:
einen 756 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen, der 467 1 Medium C der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium C
Tomatenbrei 20,0 g
Primärhefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,0 g
CoCl2-6H2O 5,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.
Dieser Fermenter wird 92 Stunden bei 25 C unter Rühren mit
einer Geschwindigkeit von 146 U/min bei einer Luftströmung
von 255 l/min betrieben. Nach Bedarf wird weiteres Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), aber nicht mehr als 0,1 %,
zugesetzt. Es werden antibakterielle Analysen gegen Salmonella gallinarum MB1287 und Vibrio percolans ATCC 8461 mit den folgenden Ergebnissen durchgeführt:
einer Geschwindigkeit von 146 U/min bei einer Luftströmung
von 255 l/min betrieben. Nach Bedarf wird weiteres Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), aber nicht mehr als 0,1 %,
zugesetzt. Es werden antibakterielle Analysen gegen Salmonella gallinarum MB1287 und Vibrio percolans ATCC 8461 mit den folgenden Ergebnissen durchgeführt:
Alter, h 0 12 24 36 48 60 72 84 92
pH 6,6 6,7 6,65 6,3 6,0 6,4 6,15 6,5 6,5 MB-1287, mm S 19 26 28 32
)1'
-ίο)' — s — 21 24 26 30
i NA NA 6>8 1^'5 24,9.24,3
Die 890A-Einheiten/ml werden, wie oben in dem Abschnitt
"II. Analysenmethode zur Bestimmung der 890-Analyseneinheiten"
beschrieben, bestimmt.
473 1 Fermentationsflüssigkeit werden auf 5 C gekühlt und in einer Zentrifuge (Titan P-9) zentrifugiert. 22,7 kg Celite
werden zu 378,5 1 der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt, und
werden zu 378,5 1 der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt, und
- 71 709822/1030
die Suspension wird durch eine 45,7 cm-Filterpresse (Shriver)
filtriert. Die 344,4 1 Filtrat werden an eine Kolonne adsorbiert,
die 26,5 1 Dowex-1 χ 2 (Cl ) mit Teilchengrössen von 150 bis 300 u enthält, und die Kolonne wird mit 37,85 1 entmineralisiertem
Wasser gewaschen. Das Gemisch aus den Antibiotica 890A1 und 890A, wird mit 113,5 1 5-%iger Kochsalzlösung,
die 0,01-molar an Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) und 25-pnolar
an neutraler EDTA ist, in entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden Fraktionen zu je 18,9 1 aufgefangen. Das Gemisch aus
den Antibiotica 890A1 und 890A^ erscheint in den Fraktionen
Nr. 3 bis 6 mit einer maximalen Stärke in den Fraktionen Nr. und 5. Die Fraktionen Nr. 4, 5 und 6, die 8 % der Aktivität
der filtrierten Fermentationsflüssigkeit enthalten, werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zu 7,6 1
eingeengt.
Die 7,6 1 Konzentrat werden in eine Kolonne eingegeben, die 37,85 1 XAD-2 enthält und zuvor mit 189 1 60-%igen wässrigen
Acetons, dann mit 189 1 entmineralisiertem Wasser und schliesslich
mit 189 1 5-%iger Kochsalzlösung gewaschen worden ist. Das Adsorbat dieses Konzentrats wird mit 142 1 entmineralisiertem
Wasser eluiert. Es werden drei Fraktionen zu 9,5 1 und sechs Fraktionen zu 18,9 1 aufgefangen. Die Aktivität erscheint
in den Fraktionen Nr. 1 bis 6 mit einer maximalen Stärke in der Fraktion Nr. 3. Die Fraktionen Nr. 4 und 5, die
64 % der in die XAD-Kolonne aufgegebenen Aktivität oder 370 000 Einheiten enthalten, werden vereinigt.
Die Fraktionen Nr. 4 und 5 werden durch Eindampfen unter vermindertem
Druck zu 120 ml eingeengt» Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat in eine Kolonne (7 x 50 cm)
von XAD-2 aufgegeben, die zuvor mit 8 1 60-%iger wässriger Acetonlösung, dann mit 4 1 entmineralisiertem Wasser und
- 72 70982 2/10 30
schliesslich mit 8 1 5-%iger Kochsalzlösung in entmineralisiertem
Wasser gewaschen worden ist» Die Probe wird bis zur Höhe des Adsorptionsmittelbettes ablaufen gelassen und die
Kolonne dreimal mit je 20 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und jedesmal bis zur Höhe des Bettes ablaufen gelassen.
Dann wird das Antibioticum mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 l/min mit 7 1 entmineralisiertem Wasser eluiert. Es
werden acht Fraktionen zu je 200 ml und dann 14 Fraktionen zu je 400 ml aufgefangen. Die antibiotische Aktivität erscheint
in den Fraktionen Nr. 4 bis 19, die 77 % der in die Kolonne eingegebenen Bioaktivität (bestimmt gegen Salmonella gallinarum
MB1287) enthalten; ein Maximum der Aktivität findet sich in
den Fraktionen Nr. 6 bis 8O
Man bestimmt das Verhältnis der Bioaktivität der Fraktionen gegen Vibrio percolans ATCC 8461 zu dem HAEA,00-Wert dieser
Fraktionen. Diejenigen Fraktionen, bei denen das Verhältnis etwa 250 beträgt, enthalten das Antibioticum 890A^, und diejenigen
Fraktionen, bei denen das Verhältnis etwa 31 beträgt, enthalten das Antibioticum 890A,. Demgemäss werden die Fraktionen
Nr. 7, 8 und 9, die grösstenteils das Antibioticum 890A^ enthalten, für die weitere Verarbeitung vereinigt, die
nachstehend unter der Überschrift "a) Reinigung des Antibioticums
890A1" beschrieben ist. Die Fraktionen Nr. 10, 11,
12 und 13, die hauptsächlich das Antibioticum 890A-, enthalten, werden ihrerseits vereinigt und weiter verarbeitet, wie
es nachstehend unter der Überschrift "b) Reinigung des Antibioticums
890A," beschrieben ist.
a) Reinigung des Antibioticums
Die vereinigten Fraktionen Nr. 7, 8 und 9 aus der zweiten ΧΑΌ-2-Kolonne, die 480 durch Hydroxylamin auslöschbare Extink-
- 73 7 09822/1030
tionseinheiten (absorbance units) bei 300 nm enthalten, werden
unter vermindertem Druck auf 100 ml eingeengt. Die Probe wird in eine Kolonne mit Dowex-1 χ 4 (Cl") (Teilchengrösse des Harzes
weniger als 37 u, Bettabmessungen 2,15 x 40 cm) eingegeben und mit 4 1 einer an NHaCI 0,075-molaren und an NH-^
0,001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert.
Es werden Fraktionen zu 12 ml mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min aufgefangen.
Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Analyse gegen Salmonella gallinarum MB1287, erscheint in den Fraktionen
Nr. 119 bis 146 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 134
bis 140. An jeder dritten Fraktion im Bereich der Bioaktivität
werden die Ultraviolettextinktionen (absorbances) bei 300 nm, 245 nm und 220 nm bestimmt, und an mehreren Fraktionen zu beiden
Seiten des Maximums wird die durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion (absorbance) bei 300 nm. gemessen. Die Fraktionen
Nr. 129 bis 141, die die höchsten Verhältnisse von durch Hydroxylamin auslöschbarer 300 nm-Extinktion (absorbance)
zu UV-Extinktion (UV-absorbance) bei 220 nm aufweisen, werden miteinander vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen Nr0 129 bis 141 werden zu 4 ml eingeengt
und mit 0,1 ml 1-molarer Ammoniaklösung versetzt. Das
Konzentrat wird in eine Kolonne von Bio-Gel P-2 (37-74 u, Bettabmessungen 2,2 χ 70 cm) eingegeben und mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden Fraktionen zu je 3»1 ml aufgefangen.
Das Hauptmaximum der UV-Extinktion (UV absorbance) bei 300 nm
erscheint in den Fraktionen Nr0 40 bis 47. Die Fraktionen
Nr. 42, 43 und 44 haben die höchsten Verhältnisse von durch
- 74 70 9 8 2 2/1030
Hydroxylamin auslöschbarer 300 nm-Extinktion (absorbance) zu
UV-Extinktion (UV absorbance) bei 220 nm und werden vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 207 Extinktionseinheiten
(absorbance units) bei 300 nm, von denen 133,4 durch Hydroxylamin auslöschbar sind, was einer Gewinnung von
44 % der in die Kolonne aufgegebenen, durch Hydroxylamin auslöschbaren Extinktion (absorbance) entspricht.
Die vereinigten Bio-Gel P-2-Fraktionen werden mit dem gleichen Volumen Methanol verdünnt und in eine Kolonne mit Dowex-1 χ 2
(Cl") (Teilchengrössen unter 37 U, Bettabmessungen 2,15 cm χ
40 cm) aufgegeben, die zuvor mit 50-vol.%igem Methanol ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Antibioticum wird mit
einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min mit 2 1 einer an NH,Cl 0,065-molaren und an NH^ 0,001-molaren Lösung in
50-%igem Methanol eluiert. Es werden Fraktionen zu je 12,5 ml aufgefangen.
Das Hauptmaximum der Extinktion (absorbance) bei 300 nm erscheint
in den Fraktionen Nr. 59 bis 72. Die Fraktionen Nr. 62 bis 68, die die höchsten A,00/Ap,^-Verhältnisse aufweisen,
werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen enthalten 93,7 Extinktionseinheiten (absorbance units) bei 300 nm, von denen
76,3 durch Hydroxylamin auslöschbar sind. Dies entspricht einer Gewinnung von 57 % der aufgegebenen, durch Hydroxylamin
auslöschbaren Absorption (absorption) in den Maximumfraktionen.
Diese vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer
unter vermindertem Druck zu 3»4 ml eingeengt und mit
100 ul 1-molarer NH^-Lösung versetzt. Das so eingestellte
Konzentrat wird in eine Kolonne (2,15 cm χ 70 cm) von
Sephadex G-10 eingegeben, die zuvor mit 20 ml gesättigter Kochsalzlösung und 20 ml 12-%iger Ammoniumchloridlösung und
- 75 709822/1030
hierauf mit 500 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen worden
ist. Die Probe wird mit entmineralisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,15 ml/min eluiert. Es werden
vier Fraktionen zu 10,3 ml und dann 56 Fraktionen zu 3,23 ml
aufgefangen. Das erste Maximum der Ultraviolettabsorption (ultraviolet-absorption) bei 300 nm, das das entsalzte Antinioticum
890A^ enthält, erscheint in den Fraktionen Nr. 25
bis 47. Die Fraktionen Nr. 28 bis 41 werden vereinigt und weisen einen pH-Wert von 3,5 auf. Der pH-Wert wird durch Zusatz
von 8 ul 1-molarer NH,-Lösung auf 7,3 eingestellt. Die
vereinigten Fraktionen enthalten 28 Absorptionseinheiten (absorption units) bei 300 nm, von denen 18 durch Hydroxylamin
auslöschbar sind.
2 ml dieser vereinigten Fraktionen werden als Bezugsproben abgenommen, und der Rest wird zu 2,0 ml eingeengt. Der pH-Wert
des Konzentrats wird durch Zusatz von 0,7 pl 1-molarer NH,-Lösung
auf 7,4 eingestellt.
50 ul des Konzentrats werden entfernt, und der Rest wird in einer 14 ml-Glasampulle eingefroren und zu 4,32 mg Feststoffen
gefriergetrocknet, die das Antibioticum 890A-] und restliche
Salze enthalten.
b) Reinigung des Antibioticums 890A,
Die aus der zweiten XAD-2-Kolonne erhaltenen vereinigten Fraktionen
Nr. 10 bis 13 werden zu 40 ml eingeengt und in eine Kolonne (Bettabmessungen 2,15 cm χ 40 cm) von Dowex-1 χ 4
(Cl") mit Teilchengrössen unter 37 ju eingegeben. Das Antibioticum
wird mit 3 1 einer an NH-Cl 0,075-molaren und an
NH, 0,001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser·bei
einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min eluiert. Es wer-
- 76 709822/1030
den Fraktionen zu je 9 ml aufgefangen. Die gegen Vibrio
percolans ATCC 8461 bestimmte antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. I65 bis 234 mit einer maximalen
Aktivität in den Fraktionen Nr. 195 bis 201.
Die Fraktionen Nr. 186 bis 213 werden vereinigt; sie enthalten insgesamt 472 A,00-Einheiten, von denen 312 durch Umsetzung
mit Hydroxylamin auslöschbar sind.
Die vereinigten Fraktionen werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 4,2 ml eingeengt. Das Konzentrat
wird in eine Kolonne mit Bio-Gel P-2 (37-74 u; Bettabmessungen 2,15 x 60 cm) eingegeben. Die Probe wird bis zur Höhe des Bettes
ablaufen gelassen, zweimal mit je 1 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und dabei jedesmal bis zur Betthöhe ablaufen
gelassen. Dann wird die Kolonne mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert, wobei man
Fraktionen zu je 2,6 ml auffängt.
Das Antibioticum 890A7, wird in den Fraktionen Nr. 38 bis 48
eluiert; die maximale Aktivität, bestimmt durch die durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion (absorbance) bei 300 nm,
tritt in der Fraktion 41 auf. Die Fraktionen Nr. 40 bis 43 werden vereinigt; sie enthalten 260 A^00-Einheiten, von denen
173 mit Hydroxylamin auslöschbar sind.
Um die restliche Verunreinigung des Antibioticums 890A7, durch
das Antibioticum 890A^ zu entfernen, werden die vereinigten
entsalzten Fraktionen Nr. 40 bis 43 mit 50 ul Penicillinase
[Difco "Bacto-Penase", enthaltend 500 000 Einheiten je ml
(1000 LU/ml, wobei der Ausdruck LU sich auf Levy-Einheiten
bezieht; 1000 LU inaktivieren 500 000 Einheiten Penicillin G)] und 0,1 ml 1-molarer Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) versetzt.
- 77 -
709822/1030
Man lässt das Reaktionsgemisch 6 Stunden bei 23 C stehen und setzt dann 3 ml entmineralisiertes Wasser und 15 ml Methanol
zu. Dieses Gemisch wird in eine Kolonne (2,15 x 44 cm Bettabmessungen) von Dowex-1 χ 2 (Cl") (Teilchengrösse unter 37 u)
eingegeben, die in 50-%igem Methanol gefüllt und mit 2 1 50-vol.%igem Methanol gewaschen worden ist. Das Antibioticum
890A^5 wird mit 2 1 50-%igem Methanol eluiert, das an Kochsalz
0,05-molar, an NH^Cl 0,005-molar und an NH3 0,0001-molar ist.
Es werden Fraktionen zu je 9,2 ml aufgefangen. Das Hauptmaximum der UV-Extinktion (UV absorbance), gemessen bei 300 nm, tritt
in den Fraktionen Nr. 74 bis 88 auf. Die Fraktionen Nr. 78 bis 85 werden vereinigt. Nach dem Abtreiben des Methanols unter
vermindertem Druck beträgt der Gesamtwert an Extinktionseinheiten (absorbance units) dieser Fraktionen bei 300 nm
97,6, wovon 87,5 durch Reaktion mit Hydroxylamin auslöschbar sind.
Die vereinigten Fraktionen Nr. 70 bis 85 werden in einem rotierenden
Verdampfer unter vermindertem Druck auf 3,92 ml eingeengt, und das Konzentrat wird in eine Kolonne von Sephadex-G-10
(Bettabmessungen 2,15 x 70 cm) eingegeben, die mit 4 ml 4-molarer Ammoniaklösung gewaschen und dann mit 0,15-mmolarer
Ammoniaklösung in entmineralisiertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach zweimaligem Waschen mit je 1 ml
0,02-mmolarer NH^-Lösung wird das Antibioticum 890A^ mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 ml/min mit 0,02-mmolarer NH^- Lösung eluiert. Es werden zunächst 49 Fraktionen zu je 2,45 ml
und dann 20 Fraktionen zu je 3,33 ml aufgefangen. Das Hauptmaximum der Extinktion (absorbance) bei 300 nm erscheint in
den Fraktionen Nr. 35 bis 53 ο Die Fraktionen Nr. 38 bis 46, die die höchsten A,00/A2Ac-Werte aufweisen, werden für die
weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen weisen insgesamt 65 Extinktionseinheiten (absorbance units)
- 78 709822/1030
bei 300 nm auf. Die vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 2,84 ml
eingeengt, in zwei gleiche Teile geteilt und gesondert in 14 ml-Glasampullen scbnellgefroren und gefriergetrocknet. So
erhält man das Antibioticum 890A^. Eine Probe enthält
32,0 A^0Q-Einheiten in 0,88 mg, die andere Probe enthält
31,9 A^QQ-Einheiten in 0,82 mg. Die erstgenannte Probe, die
32,0 A^0Q-Einheiten enthält, zeigt bei der NMR-Analyse die
folgenden Peaks:
1,29 (d, J = 6,5); 1,98 (s); 3,42 (d von d, J = 5 und J = 2,4); ^4,01-4,28 (m); 3,14 (d von d, J = 5
und J = 9); 3,39 (t, J = 6,5); 3,92 (d von t, J = und J = 6).
In der obigen Tabelle sind die 100 MHz-NMR-Signale für das
Natriumsalz von 890A^ in DpO im Verhältnis zu DSS als innerem
Standard angegeben; die chemischen Verschiebungen sind in ppm und die Kupplungskonstanten in Hz angegeben, ferner sind auch
Mehrfachwerte angegeben.
Schüttelkolbenproduktion des Antibioticums ^
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4600a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt
in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium A
Hefeextrakt Glucose
MgSO4-7 H2O Phosphatpuffer* destilliertes Wasser
MgSO4-7 H2O Phosphatpuffer* destilliertes Wasser
| 10 | ,0 | g | ml | 1000 | ml |
| TO | ,0 | g | |||
| 0 | ,05 | g | |||
| 2 |
- 79 -
709822/1030
| 15 | 745 | Phosphatpufferlösung | 91,0 | g |
| * | KH2PO4 | 95,0 | ■g | |
| Na2HPO4 '- | 1000 | ml. | ||
| destilliertes Wasser | ||||
Diese Suspension wird verwendet, um einen 250 ml fassenden, mit drei üinlenkorganen versehenen Erlenmeyer-Impfkolben zu beimpfen,
der 54 ml Impfmedium B der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium B
Autolysierte Hefe (Ardamine*) 10,0 g Glucose 10,0 g
MgSO4*7H2O 0,05 g
Phosphatpuffer** 2 ml
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt.
* Ardamine: Yeast Products Corporation ** Phosphatpufferlö sung
KH2PO4 ■ 91,0 g
Na2HPO4 . 95,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml.
Der Impfkolben wird mit einem Wattepfropfen verschlossen und 30 Stunden bei 28 - 1° C in einer '.
5,1 cm) bei 220 U/min geschüttelte
30 Stunden bei 28 - 1° C in einer Drehschüttelmaschine (Hub
50 Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Umlenkorgane, die je 250 ml Inhalt haben und je 40 ml Produktionsmedium C enthalten,
werden mit je 1 ml der aus dem Impfkolben gewonnenen Fermentationsflüssigkeit
beimpft. Die Produktionskolben werden mit Wattepfropfen verschlossen.
- 80 -
709822/1030
Medium C
Tomatenbrei 20,0g
Primärhefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,Og CoCl2*6H2O 5,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.
Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolbeη 3 Tage bei
28-1 C unter Schütteln in einer mit 220 U/min arbeitenden Drehschüttelmaschine (Hub 5,1 cm) inkubiert. Die Kolben werden
auf ihre Aktivität gegen Standardanalysenplatten mit Vibrio percolans ATCC 8461 unter Verwendung von 1,27 einScheiben
analysiert, die in zentrifugierte Fermentationsflüssigkeitsproben
getaucht werden. Die Proben werden mit 0,05-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,4) verdünnt. Die Ergebnisse
sind die folgenden:
Kulturalter, h 72
pH 6,4
Vibrio percolans,
Verdünnung 1/100,
Hemmzone, mm 23
Verdünnung 1/100,
Hemmzone, mm 23
890-Analyseneinheiten/ml 103
Die 890 A-Einheiten/ml werden bestimmt, wie es im Abschnitt
"II. Analysenverfahren zur Bestimmung der 890-Analyseneinheiten"
beschrieben ist.
Die gesamte Fermentationsflüssigkeit wird in Anteilen von 200 ml in Polycarbonatflaschen je 15 Minuten mit 9000 U/min
zentrifugiert, wobei man 1600 ml vereinigte überstehende Flüssigkeiten mit einer Stärke von 104 Einheiten/ml erhält. Hierzu
werden 0,5 ml neutrale EDTA-Lösung zugesetzt.
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Die zentrifugierte Fermentationsflüssigkeit wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 bis 20 ml/min an einer Kolonne
mit Dowex-1 χ 2 (Cl") (150-300 μ, Bettabmessungen 3,8 χ 22 cm)
adsorbiert. Die Kolonne wird mit 100 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von
6 ml/min mit 1 1 entmineralisiertem Wasser eluiert, welches 50 g Kochsalz enthält und 0,02-molar an Tris-HCl-Puffer
(pH 7,0) sowie 25-umolar an neutraler EDTA ist. Es werden Fraktionen zu je 10 ml aufgefangen.
Das Antibioticum 890A1 erscheint in den Fraktionen Nr. 13 bis
81 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 25 bis 33, gerechnet von dem ersten Aufguss des Salzeluats. Die Fraktionen
Nr. 24 bis 41, die die höchsten Verhältnisse von Bioaktivität zu Ap2A naberi>
werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 29 000 Einheiten
oder 17 % der"aufgegebenen Bioaktivität.
Das Dowex-Eluat wird zu 10 ml eingeengt, der pH-Wert mit verdünnter
Salzsäure auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat in eine Kolonne mit XAD-2 (Bettabmessungen 3,3 x 36 cm) eingegeben,
die zuvor mit je 2 1 60-%igem wässrigem Aceton, entmineralisiertem
Wasser und einer Lösung von 5 Gewichtsteilen Kochsalz in 100 Raumteilen entmineralisiertem Wasser gewaschen
worden ist. Die Probe wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert,
wobei Fraktionen von 40 bis 260 ml aufgefangen werden.
Die antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 6 bis 14, die von 220 bis 2560 ml des eluierten Volumens reichen.
Das Maximum ist in den Fraktionen Nr. 9 und 10 enthalten, die sich von 370 bis 590 ml des eluierten Volumens erstrecken. Die
- 82 -
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Fraktionen Nr. 9 bis 12, die 370 bis 1060 ml des eluierten Volumens
umfassen, weisen die höchsten Verhältnisse ΗΑΕΑ^00/Αρρ0
auf und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Diese Fraktionen haben 36 600 Einheiten, was 126 % der scheinbaren
aufgegebenen Aktivität entspricht.
Die vereinigten Fraktionen Nr. 9 bis 12 werden zu 100 ml eingeengt,
und das Konzentrat wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min in eine Kolonne mit Dowex-1 χ 4 (Cl )
eingegeben, in der das Adsorptionsmittel Teilchengrössen unter 37 u und Bettabmessungen von 2,2 χ 41 cm aufweist. Die
Kolonne wird mit 50 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min mit 3 1 einer an Kochsalz
0,07-molaren, an NELCl 0,005-molaren und an NEU
0,0001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert. Beginnend mit der ersten Aufgabe des Eluierungsmittels, werden
Fraktionen zu 10,8 ml aufgefangen.
Der Hauptgipfel der Aktivität des Antibioticums 890A1 erscheint
in den Fraktionen Nr. 181 bis 217 mit einem Maximum in der Fraktion Nr. 198. Die Fraktionen Nr. 186 bis 210, die
insgesamt 114 Absorptionseinheiten (absorption units) bei 300 nm enthalten, werden vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen werden zu 4,0 ml eingeengt und der pH-Wert durch Zusatz von 16 ul 1-molarer Natronlauge auf 7,3
eingestellt. Das Konzentrat wird in eine Kolonne mit Bio-Gel P-2 (37-74 u; Bettabmessungen 2,15 x 70 cm) eingegeben
und dreimal mit je 1 ml entmineralisiertem Wasser hineingewaschen. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von
0,96 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden Fraktionen zu je 3,85 ml aufgefangen.
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Der Hauptgipfel der Aktivität des Antibioticums 890A1 erscheint
in den Fraktionen Nr. 24 bis 44 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 33 und 34. Die Fraktionen Nr. 27 bis 38, die die
höchsten A^QQ/ApAu-Verhältnisse aufweisen, werden für die Gefriertrocknung
vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 72 A^0Q-Einheiten.
Um die Gefriertrocknung durchzuführen, werden die vereinigten Fraktionen zu 3,0 ml eingeengt, und der pH-Wert des Konzentrats
wird durch Zusatz von 10 ml 0,1-molarer Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile zu Je
1,50 ml geteilt, die dann gesondert aus 14 ml-Glasampullen
mit Schraubkapseln schnellgefroren und gefriergetrocknet werden. Jede Probe enthält 1,73 mg 890A1, entsprechend
35,8 A-2QQ-E inhei ten.
Mittel, die die Antibiotica gemäss der Erfindung enthalten,
können in verschiedenen Dosisformen, z.B. in fester oder flüssiger oraler Dosisform dargereicht werden. Die Antibiotica
890A^ und 890A-z können gesondert oder in Kombination miteinander
verwendet werden. Die nachstehend beschriebenen Mittel können in gleicher Weise entweder mit den Antibiotica 890A^
oder 890A-, für sich allein oder mit beiden Antibiotica gemeinsam hergestellt werden. Die Mittel können, gleich ob sie
flüssig oder fest sind, Je Einheitsdosis 0,1 bis 99 % Wirkstoff enthalten; der bevorzugte Bereich beträgt etwa 10 bis
60 %. Das Mittel enthält im allgemeinen etwa 25 bis 1000 mg
Wirkstoff, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels; im allgemeinen verwendet man Jedoch Dosismengen im Bereich von etwa
250 bis 1000 mg. Für die parenterale Darreichung besteht die Einheitsdosis gewöhnlich aus der reinen Verbindung in steriler
wässriger Lösung oder in Form eines zum Lösen bestimmten PuI-
- 84 -
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vers. Typische Gemische können nach den folgenden Verfahren hergestellt werden:
Antibioticum 890A1 400 mg
Lactose, U.S.P., zum Füllen von Kapseln
Nr. O ausreichende Menge, ungefähr je 475 mg.
In dem obigen Beispiel werden Wirkstoff und Verdünnungsmittel zu einem gleichmässigen Gemisch vermischt, welches dann von
Hand oder maschinell in Hartgelatinekapseln Nr. 0 eingefüllt wird. Das Mischen und Füllen erfolgt vorzugsweise in einem
Raum mit einer relativen Feuchte von weniger als 40 %.
Antibioticum 890A1 330 mg
Calciumphosphat 192 mg
Lactose, U.S.P. 190 mg
Maisstärke 80 mg
Magnesiumstearat 8 mg
800 mg.
In dem obigen Beispiel wird der Wirkstoff mit dem Calciumphosphat,
der Lactose und etwa der Hälfte der Maisstärke gemischt. Das Gemisch wird mit einem 15-%igen Maisstärkebrei
granuliert, grob gesiebt und dann wieder durch ein Sieb mit 1,19 mm Maschenweite gesiebt. Nach Zusatz des Restes der Maisstärke
und des Magnesiumstearats wird das Gemisch zu Tabletten
verpresst, die einen Durchmesser von etwa 1,27 cm haben
und je 800 mg wiegen.
- 85 -
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Nach einem anderen Verfahren mischt man den Wirkstoff mit dem Calciumphosphat, der Lactose und der Hälfte der Maisstärke.
Das Gemisch wird in einer Hochleistungspresse zu verdichteten, tablettenähnlichen Massen verarbeitet. Diese werden zu Körnern
von einem Durchmesser von etwa 1,2 mm zerkleinert. Dann setzt man den Rest der Maisstärke und das Magnesiumstearat zu und
verpresst das Gemisch zu Tabletten von etwa 1,27 cm Durchmesser und 800 mg Gewicht.
Lyo-Form (für die Injektion) je Ampulle
Antibioticum 890A1 250 mg
Mit Wasser für Injektionen, U.S.P.,
aufgefüllt auf 5 ml.
In dem obigen Beispiel wird der Wirkstoff in dem angegebenen Verhältnis in einer genügenden Menge Wasser für Injektionen
aufgelöst. Die Lösung wird durch Selas-Kerzen oder "Millipore"-Membranfilter
filtriert, um sie zu sterilisieren. Die Lösung wird auf sterile Ampullen verteilt. Die Ampullen werden mit
ihrem Inhalt gefroren, und das Wasser wird aseptisch durch Gefriertrocknung entfernt. Die den sterilen trockenen Feststoff
enthaltenden Ampullen werden aseptisch verschlossen..
Um eine Lösung für die parenterale Darreichung zu regenerieren, setzt man 5 ml steriles Wasser für Injektionen zu dem Inhalt
einer Ampulle zu.
Antibioticum 890A1
Saccharose
Glucose
Natriumbenzoat
Konzentriertes Orangenöl
Mit gereinigtem Wasser, U.S.P., aufgefüllt auf
- 86 7098 22/1030
| je 1000 | ml |
| 1,0 | g |
| 600,0 | g |
| 250,0 | g |
| 1,0 | g |
| 0,2 | ml |
| 1000,0 | ml |
Die Saccharose und die Glucose werden in etwa 400 ml Wasser
unter Erwärmen gelöst. Die Lösung wird gekühlt und zunächst mit Natriumbenzoat und dann mit konzentriertem Orangenöl versetzt.
Die Lösung wird mit Wasser auf etwa 900 ml aufgefüllt, worauf man das Antibioticum zusetzt. Die Lösung wird durch
Filtrieren durch ein grobes Filter geklärt.
-87-
Claims (14)
- Merck & Co., Inc.15 745Patentansprüche[1/ Verbindung, gekennzeichnet durch die StrukturformelCH3-CH(OH) --NH-C-(:ooh :sowie pharmazeutisch unbedenkliche Salze derselben.
- 2. Verbindung
- 3. Verbindung ^
- 4. Gemisch, enthaltend die Verbindungen 890A^ und
- 5. Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine antibakteriell wirksame Menge einer Verbindung der StrukturformelCH V-CH(OH)-J I ι ^ -S-CH2-CH2-NH-C-CH3 .und/oder pharmazeutisch unbedenklicher Salze derselben sowie einen nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthält.- 8870982 2/103 0
- 6", Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine antibakteriell wirksame Menge der Verbindung 890A1 und/oder pharmazeutisch unbedenklicher Salze derselben sowie" einen- nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthält.-
- 7. Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine antibakteriell wirksame Menge der Verbindung 89GA7, und/oder pharmazeutisch unbedenklicher Salze derselben sowie einen nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthält.
- 8. Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine antibakteriell wirksame Menge der Verbindung 890A1 in Kombination mit der
Verbindung 890A^ und/oder pharmazeutisch unbedenklicher
Salze derselben sowie einen nicht-toxischent pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthält. - 9. Verfahren, zur Herstellung der Verbindung 8-90A1 , dadurch
gekennzeichnet, dass man unter submersen aeroben Bedingungen einen Stamm von Streptomyces flavogriseus in einem
assimilierbare C- und N-Quellen und anorganische Salze enthaltenden wässrigen Nährmedium züchtet und das Antibioticum gewinnt. - 10. Verfahren nach Anspruch-9, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 und 8140 züchtet.
- 11. Verfahren zur Herstellung der Verbindung 890A-,, dadurch gekennzeichnet, dass man unter submersen aeroben Bedingungen
einen Stamm von Streptomyces flavogriseus.in einem assimi-. lierbare C- und N-Quellen und anorganische Salze enthaltenden wässrigen Nährmedium -züchtet und das Antibioticum gewinnt.70 9 8 2 2/1030 - 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass' man den Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus MRRL 8139 züchtet.
- 13. Verfahren zur Herstellung eines Gemisches, das die Verbindung 890A^ und .die Verbindung 890A, enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man unter submersen aeroben Bedingungen einen Stamm von-Streptomyces flavogriseus in einem, assimilierbare C-, N-Quellen -und anorganische Salze enthaltenden wässrigen Nährmedium züchtet und das Antibioticum gewinnt.
- 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man den-Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 züchtet.- 90 -709822/1030
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