DE68906825T2 - Glycosid-Antibiotika BU-3608D und BU-3608E. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Antibiotika BU-3608 D und BU-3608 E, wobei es sich um neue Verbindungen handelt, die aus Actinomadura hibisca isoliert wurden. Diese Verbindungen wirken als fungizide Mittel. Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I
• worin R¹ für H oder Methyl steht; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
• Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eine Antibiotikums der Formel I, wobei man einen Antibiotika produzierenden Stamm von Actinomadura hibisca, vorzugsweise den Stamm P157-2 oder Q278-4, am meisten bevorzugt einen Mutantenstamm, abgeleitet von Stamm P157-2, der hierin als A2660 bezeichnet wird, kultiviert. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Figur 1 zeigt ein 400 MHz Protonenkernresonanzspektrum von BU-3608 D.
• Figur 2 zeigt ein 400 MHz Protonenkernresonanzspektrum von BU-3608 E. Detallierte Beschreibung der Erfindung Antibiotika
• Die Strukturen der Antibiotika BU-3608 D und BU-3608 E entsprechen den folgenden Formeln II bzw. III.
• Die Antibiotika BU-3608 D und BU-3608 E werden durch folgende physikalisch-chemischen Eigenschaften charakterisiert
• Die erfindungsgemäßen Antibiotika können durch Kultivierung eines Antibiotika produzierenden Stamms von Actinomadura hibisca sp. nov. hergestellt werden. Actinomadura hibisca Stamm Nr. P157-2 wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die auf den Fiji Inseln im Südpazifik genommen wurde. Eine biologisch reine Kultur von Actinomadura hibisca sp. nov. Stamm Nr. P157-2 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD in deren permanenter Mikroorganismensammlung unter der Nummer ATCC 53557 hinterlegt. Der Stamm P157-2 produziert BU-3608 als Haupt-Metaboliten. BU-3608 B, BU-3608 C, BU-3608 D und BU-3608 E werden als Nebenkomponenten produziert. Actinomadura hibisca Stamm Nr. Q278-4 wurde aus einer Bodenprobe im Staate Andhra Pradesh, Indien isoliert. Dieser Stamm produziert als aktive Hauptkomponenten die Antibiotika BU-3608 und BU-3608 C, sowie BU-3608 B, BU-3608 D und BU-3608 E als Nebenkomponenten. Eine biologisch reine Probe dieses Mikroorganismus wurde ebenfalls bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53646 hinterlegt. Beide Stämme produzieren jedoch die Komponenten D und E in sehr geringen Mengen. Jede der Komponenten D und E umfaßt weniger als 1% der Antibiotikagesamtproduktion eines jeden Stammes.
• Bei einem Versuch die Produktion von BU-3608 D und BU-3608 E zu erhöhen, wurde eine Mutationsstudie mit dem Stamm P157-2 durchgeführt. Actinomadura hibisca Stamm P157-2 wurde einer chemischen Mutation unter Anwendung von N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin (NTG) unterzogen. Bei diesen Arbeiten wurde ein Mutantenstamm mit der Bezeichnung A2660 aufgrund seiner ständigen Produktion des Antibiotikakomplexes selektiert, bei dem das Verhältnis von D+E zu A+C viel höher war als im Ausgangsstamm. Actinomadura hibisca P157-2 Mutantenstamm A2660 wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53762 hinter legt.
• Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung nicht beschränkt auf die Verwendung der spezifischen Stämme p157-2 oder Q278-4 oder des Mutantenstamms A2660 oder auf Mikroorganismen, die völlig obiger Beschreibung entsprechen. Erfindungsgemäß werden insbesondere auch andere BU-3608- produzierende Stämme oder Mutanten oder Varianten dieser Stämme umfaßt, die aus den beschriebenen Organismen mit Hilfe bekannter Verfahren, wie z.B. Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Stickstoff-Lost oder Phagenbehandlung, hergestellt werden können. Antibiotikaproduktion
• Die erfindungsgemäßen Antibiotika werden dadurch hergestellt, daß man Actinomadura hibisca Stamm Nr. P157-2 oder Stamm Q278-4 oder eine Mutante oder Variante davon, wie den Stamm A2660 in einem herkömmlichen wässrigen Medium kultiviert. Den Organismus züchtet man in einem Nährmedium, das bekannte Nährstoffquellen für Aktinomyzeten enthält, d.h. assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie gegebenen falls anorganische Salze und andere bekannte Wachstumsfaktoren Wässrige, aerobe Bedingungen wendet man vorzugsweise an, um große Antibiotikamengen zu produzieren, obwohl zur Produktion limitierter Mengen Oberflächenkulturen und Flaschen-Kulturen ebenfalls anwendbar sind. Die zur Kultivierung anderer Aktinomyzeten verwendeten allgemeinen Verfahren sind ebenfalls erfindungsgemäß anwendbar.
• Das Nährmedium sollte eine geeignete assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Ribose, Glukose, Sucrose oder Cellobiose enthalten. Als Stickstoffquelle können Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat usw. entweder alleine oder in Kombination mit organischen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleichextrakt, Hefeextrakt, Getreideschlempe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl usw. verwendet werden. Gegebenenfalls können anorganische Nährsalze zugefügt werden, um Quellen für Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium, Phospat, Sulfat, Chlorid, Bromid, Carbonat, Zink, Magnesium, Mangan, Cobalt, Eisen und dergleichen bereitzustellen.
• Die Produktion des Antibiotikakomplexes umfassend BU-3608 und die Komponenten B, C, D und E kann bei jeder Temperatur erfolgen, die zu einem zufriedenstellenden Wachstum des produzierenden Stamms führt, wie z.B. 25 - 40ºC, und wird am vorteilhaftesten bei einer Temperatur von etwa 27 - 32ºC durchgeführt. Gewöhnlich erhält man eine optimale Antibiotikaproduktion in Schüttelkolben nach einer Inkubationsdauer von 5 - 8 Tagen. Eine Belüftung der Schüttelkolben erreicht man durch Bewegen, wie z.B. durch Schütteln in einem Schüttelrotor. Wird die Fermentation in Tank-Fermentoren durchgeführt, so ist es wünschenswert, ein vegetatives Inoculum in einer Nährbrühe dadurch herzustellen, daß man die Brühen-Kultur aus einer Schräg-Kultur oder einer lyophilisierten Kultur des Organismus herstellt. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inoculum erhalten hat, wird dieses aseptisch in das Fermentationstank medium überführt. Die Antibiotikaproduktion in Tank-Fermentoren erreicht üblicherweise das Optimum nach einer 3 - 6-tägigen Inkubation. Die Bewegung im Tankfermentor erfolgt durch Rühren und die Belüftung kann durch Einleitung von Luft oder Sauerstoff in das gerührte Gemisch erreicht werden. Die Antibiotikaproduktion kann mit Hilfe chromatographischer oder spektroskopischer Methoden oder mit Hilfe eines herkömmlichen biologischen Tests verfolgt werden. Isolierung und Reinigung der Antibiotika
• Die erfindungsgemäßen Antibiotika können aus der Kulturbrühe mit Hilfe jeder, für eine derartige Isolierung geeigneten Methode isoliert werden. Ein allgemeines Schema für eine derartige Methode zur Isolierung und Reinigung des Antibiotikums BU-3608 aus der Fermentationsbrühe des Stamms P157-2 is im folgenden Schema I gezeigt. Schema I
• Gemäß dem Flußdiagramm von Schema I wird die Fermentationsbrühe in Mycelkuchen und Überstand aufgetrennt, wobei man ein herkömmliches Verfahren, wie Zentrifugation, anwendet. Den Überstand säuert man an und entfernt den dabei gebildeten Niederschlag. Das Filtrat stellt man auf pH 5 ein, um ungereinigtes Antibiotikum abzuscheiden, das man isoliert und zwischen einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungs-mittel und einer wäßrigen Phase verteilt. Ein Beispiel für ein derartiges Lösungsmittelsystem ist n-Butanol-Methanol- 1% NaCl-Gemisch. Die wäßrige Phase trennt man ab, säuert an und extrahiert mit einem organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol. Den Extrakt konzentriert man im Vakuum und lyophilisiert, wobei man das halbgereinigte Hydrochlorid von BU-3608 erhält. Dieses Material weist als Hauptkomponente BU-3608 und als Nebenkomponenten BU-3608 B, C, D und E auf. Diese Nebenkomponenten können vom halbgereinigten BU-3608 HCl beispielsweise durch Reversed Phase Silicagel-Chromatographie abgetrennt werden. Die auf diese Weise isolierten Komponenten D und E können je nach Bedarf durch weitere chromatographische Schritte aufgereinigt werden.
• Die detaillierte Beschreibung der Actinomadura hibisca Stämme P157-2 und Q278-4, die Isolierungs- und Reinigungsverfahren für BU-3608, BU-3608B, BU-3608 C sind in unseren Patenten US 4,490, 497 und US 4,870,165, eingereicht am 2.November 1987, beschrieben. Biologische Eigenschaften
• Die fungizide Aktivität von BU-3608 D und BU-3608 E wurde sowohl in vitro als auch in vivo bestimmt. Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC-Werte) gegenüber verschiedenen Pilzen wurde mit Hilfe von seriellen Agar- und Brühen-Verdünnungsverfahren unter Verwendung von Sabouraud Dextrose-Agar- und -Brühe bestimmt. Die Inoculumgröße des Testorganismus wurde auf 10&sup6; Zellen/ml bei der Brühen- Verdunnungsmethode eingestellt. Für die Agar-Verdünnungsmethode wurden etwa 0,003 ml Pilzsuspension, enthaltend 10&sup6; Zellen/ml auf die Oberfläche von Agarplatten aufgetragen, die die Testantibiotika enthielten. Die MIC-Werte nach 44-stündiger Inkubation der Kulturen bei 28ºC sind in Tabelle I zusammengefaßt. Tabelle I
• Die in vivo Aktivität von BU-3608 E bestimmt man mit Hilfe einer Candida albicans A9540-Infektion in Mäusen. Die Testorganismen kultiviert man 18 Stunden bei 28ºC in einem YGP- Medium (Hefeextrakt, Glucose, Pepton, K&sub2;HPO&sub4;, MgSO&sub4;) und suspendiert anschließend in Kochsalzlösung. Männliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 24 g infiziert man intravenös mit etwa dem zehnfachen der mittleren lethalen Dosis des Testpilzes. Man verabreicht das Antibiotikum in verschiedenen Dosismengen Gruppen von 5 Mäusen jeweils intravenös unmittelbar nach der Pilzinfektion. Diejenige Dosis, die 50% der Tiere vor einer Infektion schützt (PD&sub5;&sub0;, mg/kg) berechnet man aus dem Anteil überlebender Tiere am 20. Tag nach der Pilzinfektion. Sämtliche Kontrolltiere starben innerhalb von 7 bis 15 Tagen nach Infektion. Die Ergebnisse der in vivo Studien für BU-3608 E sind in Tabelle II zusammengefaßt. Der PD&sub5;&sub0;-Wert für BU-3608 D gegen den gleichen Organismus bei dem gleichen obenbeschriebenen Versuchsprotokoll beträgt 9 mg/kg/inj. Tabelle II
• Die akute Toxizität von BU-3608 D bestimmt man nach einer einzelnen intravenösen Verabreichung. Der LD&sub5;&sub0;-Wert betrug 210 mg/kg.
• Zur Behandlung von Pilzinfektionen bei Tier und Mensch können die erfindungsgemäßen Antibiotika in einer fungizidwirkenden Menge über irgendeinen tauglichen Verabreichungsweg verabreicht werden. Als Beispiele hierfür sind zu nennen intravenöse, intramuskuläre, orale, intranasale, und für oberflächliche Infektionen die topische verarbreichung, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Präparate zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen, oder Emulsionen.
• Sie können in Form von sterilen festen Zusammensetzungen hergestellt werden, die man in sterilem Wasser, physiologischer Salzlösung oder in einem anderen sterilen, injizierbaren Medium unmittelbar vor Anwendung löst. Orale Formulierungen können in Form von Tabletten, Gelatinekapseln, als Pulver, Pastillen, Syrup oder dergleichen vorliegen. Zur topischen Verabreichung kann die Verbindung in Lotionen, Salben, Gelen, Cremes, Balsam, Tinkturen oder dergleichen aufgenommen werden. Einheitsdosisformen können unter Anwendung allgemein bekannter Verfahren aus dem Bereich der pharmazeutischen Formulierungen hergestellt werden.
• Wenn man einen Wirt behandelt, der mit einem Pilz infiziert ist, der auf die erfindungsgemäßen Antibiotika anspricht, so ist die tatsächlich bevorzugte Verabreichungs weise und die verwendete Dosierung abhängig von der Entscheidung des in der Behandlung von Pilz- und Virusinfektion erfahrenen Arztes und variiert in Abhängigkeit vom kausativen Organismus, dessen Sensitivität gegenüber dem Antibiotikum, der Schwere und dem Ort der Infektion und den Eigenschaften des Patienten, wie Alter, Körpergewicht, Exkretionsgeschwindigkeit, gleichzeitigen Medikationen und dem allgemeinen physischen Zustand.
• Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung. Beispiel 1:
• Fermentation von Actinomadura hibisca Stamm P157-2.
• (a) Schrägagar. Actinomadura hibisca Stamm P157-2 züchtet man auf einem Schrägagar bestehend aus
• 0,5% lösliche Stärke (Nichiden Kagaku Co.)
• 0,5% Gulcose
• 0,1% Fischfleischextrakt (Mikuni Kagaku)
• 0,1% Hefeextrakt (Oriental Yeast Co.)
• 0,2% NZ case (Sheffield)
• 0,1% CaCO&sub3;
• 0,2% NaCl
• 1,6% Agar
• Die Kultur inkubiert man 7 Tage bei 28ºC.
• (b) Impfkultur. Einen Teil der gewachsenen Mikroben aus der Schrägkultur überträgt man auf einen 500 ml Erlenmeyerkolben, der 100 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung enthält:
• 1,0% Glucose
• 2,0% lösliche Stärke (Nichiden Kagaku Co.)
• 0,5% NZ Amin A (Sheffield)
• 0,5% Hefeextrakt (Oriental Yeast Co.)
• 0,1% CaCO&sub3;
• Den pH des Mediums stellt man auf 7,2 ein, bevor man sterilisiert. Die Impfkultur inkubiert man 4 Tage bei 28ºC auf einem Schüttelrotor bei 200 U/min.
• (c) Kolbenfermentation. 5 ml der mikrobiellen Kultur überträgt man von der Impfkultur auf einen 500 ml Erlenmeyerkolben, der 100 ml eines sterilen Produktionsmediums folgender Zusammensetzung enthält:
• 3,0% Glucose
• 3,0% Sojabohnenmehl (Nikko Seiyu Co.)
• 0,5% Pharmamedia (Traders Protein)
• 0,1% Hefeextrakt (Oriental Yeast Co.)
• 0,3% CaCO&sub3;
• Die Fermentation führt man bei 28ºC über 5 bis 6 Tage in einem Schüttelrotor durch. Die Antibiotikaproduktion in der Fermentationsbrühe verfolgt man mit Hilfe der Brühenverdünnungsmethode, wobei man Candida albicans A9540 als Indikatororganismus in Sabouraud Dextrose-Brühe verwendet. Ein UV-Test bei 500 nm in einer 0,01 N NaOH-MeOH (1:1)-Lösung wird ebenfalls angewendet. Die Antibiotikaproduktion erreicht am Tag 5 eine Maximum von 650 ug/ml.
• (d) Tankfermentation. 3 l der Impfkultur verwendet man zum Animpfen von 120 l sterilen Produktionsmediums, das in einem 200 l Tankfermentor enthalten ist. Die Zusammensetzung des Produktionsmediums entspricht dem bei der Kolben- Fermentation verwendeten Medium. Den Tank betreibt man bei 28ºC mit einer Rührgeschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 120 l pro Minute. Nach 96-stündiger Fermentation erhält man einen Antibiotikagehalt von 500 ug/ml, wobei der pH der Brühe 7,9 beträgt. Beispiel 2: Isolierung und Reinigung der Antibiotika
• Die detaillierte Beschreibung für die Isolierung und Reinigung der Antibiotika BU-3608, BU-3608 B und BU-3608 C ist in den US-Patenten 4,490,497 und 4,870,165 angegeben. Das Verfahren zur Herstellung einer ungereinigten Probe von BU-3608 HCl, die als Nebenkomponenten BU-3608 B, C, D und E enthält, wird kurz beschrieben.
• Die geerntete Brühe (pH 7,8) zentrifugiert man und säuert den Überstand auf pH 2,0 mit 6 N HCl an, wobei man einen biologisch inaktiven Feststoff abscheidet. Nach Entfernung des Niederschlages stellt man das Filtrat auf pH 5,0 mit 6 N NaOH ein und rührt die Lösung langsam über einen Zeitraum von 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Den resultierenden dunkelroten Feststoff filtriert man ab und trocknet in Vakuum. Diesen Feststoff löst man in einem 3:1:4 Gemisch von n-Butanol- Methanol-1% NaCl und rührt das Gemisch 30 Minuten. Die untere wäßrige Phase trennt man ab, wäscht erneut mit frischer oberer Phase, säuert auf pH 2,0 mit 6 N HCl an und extrahiert mit n- Butanol. Den n-Butanol-Extrakt wäscht man mit Wasser, konzentriert im Vakuum auf und liophilisiert, wobei man halbgereinigtes BU-3608-Hydrochlorid erhält. Eine Lösung des Feststoffs in n-Butanol schüttelt man mit alkalischem Wasser (pH 9,0). Die wäßrige Schicht säuert man auf pH 2,0 an und wäscht mit Ethylacetat. Nach Extraktion mit n-Butanol und Abdampfen des Lösungsmittels erhält man eine reinere Probe von BU-3608- HCl. Mit diesem Material führt man eine Reversed Phase Silicagel-Chromatographie durch (ODS-60, 350/250 mesh, Yamamura Chemical Lab., Säule 4,5 x 90 cm). Die Probe löst man in Wasser und trägt sie auf die Säule auf, die mit einem Gemisch aus Acetonitril-0,15% KH&sub2;PO&sub4; (pH 3,5) = 17:83 (v/v) equilibriert worden war. Die Säule wäscht man nacheinander mit jeweils 5 l von Acetonitril-0,15% KH&sub2;PO&sub4;-Mischungen folgender Zusammensetzungen: 17:83, 18:82, 19:81, 20:80 und entwickelt dann mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch mit einem Verhältnis von 22:78. Man sammelt das Eluat in Form von 100 ml-Fraktionen, die mit Hilfe eines Mikroplatten-Tests unter Verwendung von C. albicans A9540 und durch Dünnschichtchromatographie (SiO&sub2;, Methylacetat-n-Propanol-28% Ammoniumhydroxid = 45:105:60 v/v) überprüft werden. Diejenigen Fraktionen, welche die homogene Hauptkomponente enthalten, werden vereinigt und weiter gereinigt, wobei man BU-3608 erhält. Diejenigen Fraktionen, die vor und nach der homogenen Hauptkomponente eluieren, werden ebenfalls gesammelt und weiter gereinigt, wobei man BU-3608 C bzw. BU-3608 B erhält.
• Bei dem oben beschriebenen Reversed Phase Silicagel- Chromatographieverfahren werden diejenigen Fraktionen, die vor BU-3608 C eluiert werden, separat gesammelt und vereinigt. Die vereinigten schwach orange gefärbten Fraktionen werden durch Diaion HP-20-Chromatographie entsalzt. Der auf diese Weise erhaltene Feststoff enthält in relativ angereicherter Form die Komponenten D und E, jedoch noch immer eine große Menge der Komponente C. Die vereinigten Feststoffe (128 mg aus insgesamt 60 l Fermentationsbrühe) lädt man auf eine Reversed Phase Silicagel-Säule (ODS-60, Yamamura Chem.Lab., φ 8,0 x 90 cm) auf und eluiert mit einem 21:79-Gemisch von Acetonitril-0,15% KH&sub2;PO&sub4; (pH 3,5). Das Eluat überprüft man durch HPLC, wobei man eine Microsorb Short One C&sub1;&sub8;-Säule (Rainin Instrument Co., 4,6 mm I.D. x 100 mm 3 um) verwendet und wobei ein 7:17-Gemisch von Acetonitril-0,15% KH&sub2;PO&sub4; (pH 3,5) als mobile Phase bei einer Flußgeschwindigkelt von 1,2 ml/min verwendet wird und man die UV Absorpiton bei 254 nm zu Detektion verwendet. BU-3608 E wird zuerst eluiert, gefolgt von BU-3608 D. Die BU-3608 E enthaltenen Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und durch HP-20-Chromatographie entsalzt, wobei man annähernd homogenes BU-3608 E HCl erhält. Eine wäßrige Lösung von BU-3608 E HCl stellt man auf pH 5,0 mit 0,1 N NaOH ein, wobei reines BU-3608 E in Form des Zwitterions (13 mg) abgeschieden wird. In ähnlicher Weise erhält man BU-3608 D in Form des Zwitterions (4 mg).
• Die oben beschriebene Isolierung und Reinigung kann auch zur Isolierung der Komponenten D und E aus den Kulturbrühen von Mutantenstämmen angewendet werden. Beispiel 3: Mutation von Actinomadura hibisca Stamm P157-2
• Sporen von Actinomadura hibisca Stamm P157-2 (ATCC 53557) die 10 Tage bei 28ºC auf einem modifizierten Bennett-Agarmedium (lösliche Stärke 0,5%, Glucose 0,5%, Fischfleischextrakt 0,1%, Hefeextrakt 0,1%, NZ-case 0,2%, NaCl 0,2%, CaCO&sub3; 0,1% und Agar 1,6%, pH 7,0) gezüchtet wurden, suspendiert man in Kochsalzlösung, beschallt 20 Sekunden bei 0ºC, isoliert durch Zentrifugation bei 5000 Upm, (10 Minuten bei 25ºC) und resuspendiert in 10 mMol Tris-HCl (pH 9,0). Die Sporensuspension mischt man mit einer Lösung von NTG (5000 ug/ml) in 10% (v/v) Diemthylsulfoxid und schüttelt das Gemisch vorsichtig 1 Stunde bei 28ºC. Die NTG-behandelten Sporen erntet man durch Zentrifugation, resuspendiert in Kochsalzlösung, verteilt auf einer neuen Agarplatte und inkubiert anschließend 7 Tage bei 28ºC. Jede Kolonie überträgt man auf ein vegetatives Medium (10 ml), bestehend aus Glucose 3%, Sojabohnenmehl 3%, Pharmamedia 0,5%, Hefeextrakt 0,1% und CaCO&sub3; 0,3% (pH 7,0) und inkubiert die Kultur 6 Tage bei 28ºC auf einen mit 200 Upm betriebenen Schüttler. Die produzierten Antibiotikakomponenten, die sich in der Fermentationsbrühe befinden, identifiziert man unter Anwendung von Silicagel TLC und HPLC. Der Mutantenstamm A2660 wird als Organismus für die Produktion der Antibiotika BU-3608 D und E aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, die Komponenten D und E im Bezug auf die Komponenten A und C in vorteilhaften Mengen zu produzieren, sowie aufgrund seiner Fähigkeit die neuen Antibiotika ständig zu produzieren. Die Verhältnisse der durch den Ausgangsstamm P157-2 und durch den Mutantenstamm A2660 produzierten Antibiotikakomponenten sind in folgender Tabelle gegenübergestellt.
• Einen Teil der mikrobiellen Aufzucht aus der Schrägkultur des Mutantenstamms inokuliert man in 100 ml modifiziertes Bennet-Flüssigmedium (gleiche Zusammensetzung wie Agarmedium, mit Ausnahme davon, daß Agar nicht enthalten ist) in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben und inkubiert 4 Tage bei 28ºC in einem Schüttelrotor, der mit 200 Upm betrieben wird. 5 ml der Kultur überträgt man auf einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml frisches Medium enthält und führt die Fermentation in einem Schüttelrotor über 6 Tage bei 28ºC durch.
• 1. Verbindung der Formel
• worin R¹ für H oder Methyl steht; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
• 2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹ für H steht; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
• 3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹ für Methyl steht; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
• 4. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung von Pilzinfektionen bei einem Säuger.
• 5. Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine fungizid wirkende Dosis einer Verbindung gemäß Anspruch 1.
• 6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei man einen Antibiotikum produzierenden Stamm von Actinomadura hibisca in einem Medium unter aeroben Bedingungen kultiviert, welches assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, und man das Antibiotikum aus der Kulturbrühe isoliert.
• 7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Antibiotikum produzierende Stamm P 157-2, ATCC 53557 oder eine Antibiotikum produzierende Mutante davon ist.
• 8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Mutante der Stamm A2660, ATCC 53762 ist.
• 9. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Antibiotikum produzierende Stamm Q278-4, ATCC 53646 oder eine Antibiotikum produzierende Mutante davon ist.
• 10. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels gemäß Anspruch 5, wobei man eine fungizid wirkende Dosis einer Verbindung gemäß Anspruch 1 in einer zur Verabreichung an einen Säuger geeigneten Form bereitstellt.
• 11. Actinomadura hibisca P 157-2-Mutantenstamm A 2660 (ATCC 53762)