DE2166462A1 - 7 beta -(d-5-amino-5-carboxyvaleramido)3-(alpha-methoxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsaeure-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und solche verbindungen enthaltende arzneimittel - Google Patents
7 beta -(d-5-amino-5-carboxyvaleramido)3-(alpha-methoxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsaeure-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und solche verbindungen enthaltende arzneimittelInfo
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Description
Die Erfindung umfasst 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3~eephem-4-carbonsäuren,
die in der 3-Stellung des "Cephem"-Kerns in bestimmter Weise substituiert sind.
Diese Verbindungen werden durch Fermentation erhalten. Sie sind wirksam gegen gram-negative und gram-positive Bakterien.
Die Erfindung betrifft eine neue Klasse antibiotischer Substanzen und ein Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere sind diese neuen Antibiotika Produkte vom
Cephalosporintyp, die einen Methoxy-Substituenten in der
7-Stellung des "Cephem"-Kerns enthalten. Sie sind strukturell
mit der Cephalosporin-Reihe von Verbindungen verwandt, jedoch anders als Cephalosporin C3 das lediglich
eine D-S-Amino-S-carboxyvaleramido-Einheit in der 7-Stellung
enthält, enthalten die vorliegenden Produkte auch
409819/1093
- 1 - ORIGINAL INSPECTED
15 425
einen 7-Methoxy-Substituenten; und während Cephalosporin G
durch Aeetoxymethyl in der 3-Stellung des Eings substituiert
ist, sind die Produkte der Erfindung durch einen substituierten a-Methoxy-cinnamoyloxymethyl-Rest substituiert.
Die erfindungsgemässen Verbindungen entsprechend der folgenden
Strukturf ox*mel:
CH0OC-C=CH
joch
Ia
worin R einen Hydroxy- oder Sulfooxyrest, d. h. -OSOJB bedeutet.
Diese Produkte werden durch Kultivierung eines neuen Stamms von Actinomycete, bezeichnet als MA-2837 in. der Kulturensammlung
von Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, unter geregelten Bedingungen gleichzeitig erzeugt. Eine Probe dieser
Kultur wurde auch zur dauernden Niederlegung in die Kulturen Sammlung der Northern Utilization Research and Development
Branch of the U. S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, gebracht, und erhielt die Kultur-Eumraer NRSL 3851 ·
25 andere Kulturen wurden gleichfalls als Erzeuger dieses Antibiotikumgemischs (Ia) identifiziert, und diese zusaamen
mit der Kultur MA-2837 werden im folgenden in dem mit die
Microorganismen bezeichneten Abschnitt beschrieben. Im folgenden
wird das Antibiotikumgemisch (Ia), das diese beiden
Produkte aufweist, als Antibiotikum 810A oder einfach mit . 810A bezeichnet.
Eine Hauptschwierigkeit bei der antimikrobiellen Therapie ist die Empfindlichkeit der meisten Antibiotika gegenüber
409819/1093 - 2 -
enzymatischem Abbau. Beispielsweise ist Penicillin G wirksam
gegen eine grcsse Vielzahl grampositiver und .gramnegativer Mikroorganismen,
jedoch wird es in Gegenwart von Penicillinase zu einer Form abgebaut, die gegenüber den meisten Pathogenen unv/irksam
ist.
Ein Versuch zur Bewältigung dieses Problems bestand in der Entwicklung
neuer Antibiotika, welche die "Gephemsl-Kemeigenschaft
von Cephalosporin G aufweisen. .Cephalosporin C besitzt eine ihm
eigene Beständigkeit gegenüber Penicillinase und ist wirksam sowohl gegen graisnegative als auch grampositive Bakterien; jedoch
ist es nur massig wirksam, und es gibt andere Enzyme als Penicillinase, welche seine Wirksamkeit zerstören. Diese Enzyme
werden mit Cephalosporinasen bezeichnet. Die erfindungsgemässen
Produkte liefern nicht nur Beständigkeit gegenüber Penicillinase, sondern gleichfalls gegenüber den Cephalosporinasen. Sie liefern
Wirksamkeit sowohl gegen gramnegative als auch grampositive Bakterien, jedoch ist das Ausmsss der Aktivität und der Bereich von
Organismen, gegen die sie wirksam sind, nicht identisch.
Antibiotikum 81OA ist ein Mittel mit breitem Wirkungsspektrum,
das eine etwa ausgeglichene gramnegative und grampositive Wirksamkeit entfaltet. Dazu gehören die Wirksamkeit in vivo gegenüber
den folgenden graranegativen Organismen: Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella pullorum, Escherichia coli und
Elebsialla pneumoniae und in vivo Wirksamkeit gegen die folgenden
grampositiven Organismen: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und Diplococcus pneumoniae.
Von den verschiedenen Produkten, die das Antibiotikum 810A ausmachen,
stellt die 7ß-(D-5~Amino-5-carboxy5raleramido)-3-(amethoxy-p-sulfooxy-cinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-'i}~
carbonsäure-Art entsprechend der obigen Formel Ia, worin E
einen Sulfooxyrest bedeutet und deren Salze, wie beispielsweise das Natriumsalz, eine bevorzugte Aus führung s form der Erfindung
dar. Dieses Produkt besitzt folgende Strukturformel:
EOG-CH-CH0-CH2-Ch2-C-
JOOH Ic
Diese Verbindung besitzt eine grössere Beständigkeit gegenfc
über Cephalosporinasen als Cephaloiftm und ist durch ein
geringeres Ausmass an lloxizität bei Mäusen gekennzeichnet.
Ferner ist es beständiger gegenüber enzymatischem Abbau als Cephalosporin C und es wirkt bakterizid. Bei oraler
Verabreichung schützt es gegen Infektionen auf Grund von Proteus vulgaris und bei subkutaner Verabreichung ist es
wirksam gegenüber einer Vielzahl von gram/negativen und granL/positiven Infektionen.
810A Kult»iren: 33er Mikroorganismus, welcher das Antibiotikum
810A erzeugt, wurde ursprünglich als Einzelkolonie aus Boden isoliert..Diese Kolonie wurde auf eine Strichplatte
der folgenden Zusammensetzung gegeben:
Medium A;
Hefeextrakt 10,0 g
Dextrose 10,0 g
Agar 20,0 g
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
Uach. mehrtägigem Wachstum erzeugte der Mikroorganismus das
Antibiotikum 810A. Dieses Antibiotikum wurde dann in Schüttelkolben reproduziert und von bekannten Antibiotika
~A~ 409819/1093
auf Grund verschiedener biologischer und chemischer Untersuchungen
differenziert. Ein Vergleich dieser Daten mit denjenigen, die über andere bekannte Antibiotika erhalten
wurden, lieferte die Feststellung, das 810A eine neue Einheit ist.
810A ffaxonofflie and Morphologie: Der Mikroorganismus (Kultur
MA-2837), welcher das Antibiotikum 810A produziert,
wurde als Streptcmyces griseus identifiziert. Die zu dieser Bestimmung verwendete Taxonomie ist in "Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe und in "!The Actinomycetes", Band 2, von S. A. Vaksman (1961 ) beschrieben.
Unter Verwendung diese Verfahrens wurde festgestellt, dass die Kultur aus einem Stamm von Streptomyces griseus besteht,
der hinsichtlich der Beschreibung, der Melanin-Erzeugung und des Kohlenstoff -Verbrauchs, dem Streptomyces gri»
seinus sehr stark gleicht, wie in International Journal fo Systemic Bacteriology" 7· Ausgabe (1957) beschrieben,
da die Gruppe von Streptomyces griseus-Kulturen 1959» zwei
Jahre nach Veröffentlichung der Ausgabe, geteilt wurde. Jedoch, sowohl in Vaksman als auch in "International Journal
of Systemic Bacteriology" wird Streptomyces griseinus als ngrisein-erzeugender Stamm von Streptomyces griseus" oder
.als "grisein-erz-eugende oder gri sein-ähnliche Substanz"
definiert. Streptomyces griseus (MA-2837) ist ein Stamm, der sich von der klassischen Beschreibung in Bergey und in
Waksnian insofern unterscheidet, als er ein Luftmycel besitzt,
das vorwiegend braungelb und auf einigen Medien grüngelb mit einem etwas abweichenden Kohlenstoffverbrauchsmuster
ist. Vaksisan beschreibt auf Seite 111 und 153 von
"The Actinomycetes" diese Streptomyces griseus-Reihe als
eine Seihe, welche viele verwandte Species und Stämme umfasst, was sich durch farbloses bis oliv-sandfarbenes Substratwachstum, iuftmycel, das gelblich mit einer grünlichen
Färbung oder grünlich-grau oder gelb-verbrannt oder gras-
409819/1093
grün bis grau ist, Helanin negativ ist, gerade oder biegsame
und in Büscheln erzeugte Sphorophore und ovale Sporen kennzeichnet. Die folgenden Tabellen vergleichen die Eigenschaften
der das Antibiotikum 810A erzeugenden Kultur mit den Streptomyces griseus und Streptomyces griseinus-Eulturen.
Die Charakterisierung des Ausgangsisolats MA-2837
1 2
gleich mit in Bergey und Vaksman beschriebenem Strepto
myces griseus und auch die Charakterisierung von MA-2837
im Vergleich mit dem in Vaksman beschriebenem Streptomy
griseinus sind in den Tabelle I und Ia aufgeführt.
409819/1093
Vergleich der Kultureigenschaften von MA-2837 Kultur
M/U 283?
Sporophoren sind monopcdial verzweigt unter Bildung von Büscheln, mit geraden bis etwas
gebogenen Sporenketten. Sporen: kugelförmig bis oval, Durchmesser 0,9 J*
bis 0,9 χ 1,2 u in Ketten von etwa ίΟ - 15
Sporen. Vegetative
Hyphen yon 0,9 M Breite (Glyc erin-Asparaginagar-97OZ)
Sporen. Vegetative
Hyphen yon 0,9 M Breite (Glyc erin-Asparaginagar-97OZ)
Streptoinyces ,,
griseus (Bergey )
Luftmycel: Reichlich, pulverförmig, wassergrün.
Sporophore erzeugt in Büscheln. Sporen kugelförmig bis
ellipsoid, 0,8 χ bis 1,7/u. Vegetatives
Wachstum: Kolonien glatt oder gefältelt, farblos, später nach oliv bis sandfarben übergehend
Streptomyces ρ
griseus (Waksman )
griseus (Waksman )
Gerade in Büscheln erzeugte Sphorphore.
Sporen kugelförmig
bis oval, 0,8 χ 0,8
bis 1,7/i» Oberfläche
glatt '
Sporen kugelförmig
bis oval, 0,8 χ 0,8
bis 1,7/i» Oberfläche
glatt '
Streptomyces 2 griseinus (Waksman )
Gerade Sporophore erzeugt in Klumpen oder Büscheln ohne Spiralen.
Sporen stabförmig, 1,0 bis 1,8 χ 0,8 bis 1,0 ti
Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe (1957)
2 Waksman, S.A., "The Actinomycetes"", Band 2 (1961) -
Vergleich, der Kultureigenschaften von MA-2837 Kultur
Medium
MA-2837
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
Tomatenpaste Hafermehl-Agar
Glyc erin-Asp araginagar
CD
co Ozapek-Dox.agar
-» CSacharosenitratco agar)
-» CSacharosenitratco agar)
CD
CO
CJ
CO
CJ
Vegetatives Wachstum: Rückseite braun, eben, sich verbreitend,
Luftmycel: Mitte gelbbraun bis graugelb
Kante bräunlich-gelb
Lösliches Pigment: gelbbraun
Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun, eben, sich verbreitend,
Luftmycei: pulverförmig, gelbbraun bis gelb Lösliches Pigment: hell,
gelbbraun-gelblich
Vegetatives Wachstum: Rückseite gelblichorange, eben, sich verbreitend,
Luftmycel: pulverförmig gelbbraun bis gelb (verschiedene
Schattierungen, jedoch vorwiegend Hand
gelbbraun-gelblieh) leichtes
Wachstum im Mittelpunkt und stärkex"es an den Rändern,
Lösliches Pigment: hell, 6 eibDraun-geiblich
S. griseus
(Waksman)
(Waksman)
S. griseinus
(Waksman)
VJl
4 Γ0
\J1
Wachstum spärlich, sich verbreitend, farblos, wird οIivbis
sandfarben,
Luftmycel dick,
pulverförmig,
Wasser grün,
Pigment unlöslich
Luftmycel dick,
pulverförmig,
Wasser grün,
Pigment unlöslich
CD
CD
Sub stratwachstum faltig, Rückseite
creme-farben bisγ bräunlich, Luftmycel:
weiss bis creme-farben mit hellgrün-lichem Stich, Kein lösliches
Pigment
!Tabelle Ia (Fortsetzung)
Medium
M-2837
Fähragar
»Agar
co
co
O
CO
CO
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
Eialbuminagar
S. griseus
(Waksman)
S. griseinus \n (Waksman) · 1^.
■ ' ro
Vegetatives Wachstum: Rückseite gräulich gelbbraun, eben, sich,
ausbreitend
Luftmycel: Gelbbraun bis gelblicii mit grünlicher Schattierung, Hand gelbbraun gelblich, geringes Wachstum im Mittelpunkt, stärkeres Wachstum längs der Bänder
Luftmycel: Gelbbraun bis gelblicii mit grünlicher Schattierung, Hand gelbbraun gelblich, geringes Wachstum im Mittelpunkt, stärkeres Wachstum längs der Bänder
Lösliches Pigment: hell gelbbraun gelblich
Vegetatives Wachstum: Rückseite bräunlichgelb Luftmycel: Samtig, gelbbraungelb.
Hand gelbbraun gelb
Lösliches Pigment: hell braun
reichliches, cremefarbenes fast transparentes Wachstum,
Luftmycel pulverförmig, weiss bis hellgrau, kein lösliches Pigment
Wachstum reichlich, fast transparent, creme-färb en.
Luftmycel pulverförmig, weiss bis hellgrau?. kein lösliches
Pigment
Tabelle Ia (Fortsetzung)
Medium
MA-2337
S.'griseus (Bergey)
S. griseus
(Waksman)
Synthetischer
Agar
Spärliches sich ausbreitendes farbloses Wachstum, das oliv bis
sandfarben wird Luftmycel: dick, pulverförmig, wassergrün
Gelatine-Ansatz
Flockiges creme-farbenes Wachstum setzt sich am Boden des Rohrs ab.
■Vollkommene Verflüssigung
| P Uahrgelatine- | Vegetatives Wachstum: |
| i agar | creme-färben |
| Luftmycel: blass, gelb | |
| braun gelb | |
| Lösliches" Pigment: | |
| keines | |
| O | Verflüssigung der Ge- |
| CD | la.tirfe: gut |
| -*■ Lackmusmilch | Teilweiser Ring, |
| CO ^^ |
Vegetatives Wachstum: . |
| ^^ | bräunlich |
| O | Luftmycel: gering, weiss- |
| CD | Ii ch |
| CO | . Peptonisierung wird al |
| kalisch |
S. griseinus
(Waksman)
Grünlich gelbes oder creme-farbenes Oberflächenwachstum
mit bräunlichem Stich. Hasche Verflüssigung
Wachstum cremefarben mit bräunlichem Stich ■Luftmycel: fehlt
oder spärlich, weiss.
Rasche Verflüssigung
Creme-färb ener Ring, Koagulierung
mit rascher Peptonisierung, wird alkalisch
Wachstum cremefarben.
Ooagulierung und Peptonisierung
CD CD
cn to
Tabelle Ia (Fortsetzung)
■ Medium
MZU2837
S. griseus (Bergey)
Entrahmte Milch.
σ co co
Glucose-agar
Glucoseflüssigkeit
Teilweiser Ring Vegetatives Wachstum:.
Bräunlich Luftmycel: keines
Lösliches Pigment: hellt»raun
Peptonisierung wird alkalisch
Vegetatives Wachstum: creme-färben, eben,
sich ausbreitend Luftmycel: spärlich, gelblichweiss bis cremefarben
Lösliches Pigment: sehr hellbraun Hydrolyse von Casein
S. griseus
(Waksman)
S. griseinus
(Waksman)
(Waksman)
Im Mittelpunkt verstärktes Wachstum
s trahlenförmi g,
creme-färben bis
orange, Rand gezackt
s trahlenförmi g,
creme-färben bis
orange, Rand gezackt
Reichliche, gelbliche Haut mit grünlichem Stich, stark gefältelt
Tabelle Ia (Fortsetzung)
Medium
HA-2837
Stärke-Agar
Habxstärkeagar
, Kartoffelechnitt
Vegetatives Wachstum: ererne-färben
Luftmycei; blass gelbbraun gelb Lösliches Pigment:
keines Hydrolyse gut
Vegetatives Wachstum:
hellbraun
Luftmycel: massig,
braungelb
leichtes Bräunlichwer-
deyn der Kartoffel
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
Dünnes, sich ausbreitendes transparentes Wachstum, Stärke ist hydrolysiert
Gelbliches, gefaltetes Wachstum,
bedeckt mit weissem, pulferförmigem Luftmycel
bedeckt mit weissem, pulferförmigem Luftmycel
S. griseus (Waksman)
Dünnes Wachstum, sich ausbreitend, transparent, starke Hydrolyse
Eunzliges faltiges Wachstum, gelblich bis bräunlich, bedeckt mit weissem,
pulverförmigem
Luftmycel
S· griseinus ^
(Waksman) *>
Parbloses bis creme-farbenes
Wachstum, Luftmycel: grauolive
Paltiges gelblieh weisses
vJachs-tum
Luftmycel gräulich-weiss
mit olive-farbeneiii Stich
,0
CJ)
Ki
Medium
Calciummalatagar
Tyrosin-Hahragar
ΜΑ.-2837
!Tabelle la (Portsetzung)
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend
durchscheinend und farblos an den Rändern opak und creme-farben
im Mittelpunkt. Luftmycel: Massig, cremefarben bis gelb, Ränder gelbbraun gelb
Lösliches Pigment: keins
Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, creme-färben
Luftmycel: gelblich braungelb mit grünlicher Schattierung, Ränder gelbbraun-gelb
Lösliches Pigment: sehr : ' . hellbraun
Tyrosin-Eristalle zersetzen sich
Pepton-Eisen-Eefe- Vegetatives Wachstum:
Extraktagar creme-efarben
Luftmycel: keins Lösliches Pigment: keines Melanin negativ
S. griseus
(Waksman)
Grünes oder gelbes lösliches
Pigment, das auf
dem Calciummalat
und Succinatmedium erzeugt
wird
Pigment, das auf
dem Calciummalat
und Succinatmedium erzeugt
wird
Häufig erzeugtes
dunkles Pigment
dunkles Pigment
S, griseinus f
(Waksman) v
Keine löslichen Pigmente auf Calciummalat oder Succinatmedium
Kein erzeugtes Pigment
IS3
CD
CD
■fc-
(Tabelle Ia (Portgetaunp;)
Medium
M-2837
S. griseus
(Bergey)
S. griseus
(Waksiaan)
(Waksiaan)
S· griseinus
(Waksman)
Erzeugung von HpS •Loeffler's Bluts
erum-Schrägkulturen
Temp eraturberei cn
(Hefeextrakt-Dextrose-Salzagarschrägkultüren)
Mikroärophiles Wachstum (Hefeextrakt-Dextro
s e-SaIze-Ansatz 40 mm Tiefe)
Eeduktion von Nitraten zu Nitriten
Negativ
Vegetatives Wachstumί gelbbraun
Luftmycel: hellgelb-'
lieh
Lösliches Pigment: bräunlich
Vollkommene Verflüssigung
28° G gutes Wachstum 37O C gutes Wachstum
50 C kein Wachstum
Die Oberfläche bedekkendes und längs der gesamten Ansatzlinie
verlaufendes gutes Wachstum
Negativ
Negativ
Negativ
Optimaitemperatur
570 c
Aerob
Positiv
Positiv
Positiv
CD
CD
K)
15 425 *
2.166Α6Γ2
Diese Beobachtungen erfolgten nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28° C, falls nicht anders vermerkt ist. Der pH-Wert
des bei diesen Untersuchungen verwendeten Mediums war etwa neutral, d. h. 6,8 bis 7?2. Die physiologischen Versuche
wurden nach Ablauf von 7 und 22 Tagen durchgeführt. Die zur
Beschreibung verwendeten Farben entsprechen den Definitionen von "Color Harmony Manual", 4·. Ausgabe, 1958, Container
Corporation of America.
81QA Kohlehydrat-Verwendung;:
Die Streptomyces griseus-Kultur (MA-2837) wurde auch hin-^
sichtlich ihrer Fähigkeit zur Verwendung oder Assimilierung verschiedener Kohlehydrate durch das Wachstum des Mikroorganismus
in synthetischem Ausgangsmedium (T. G. Pridham
and D. Gottlieb, 194-8), das 1 % des Kohlehydrats bei 28° C
während 3 Wochen ,_ . getestet. Die folgende Tabelle II
gibt den Verbrauch oder die Assimilation dieser Kohlehydreinquellen durch die Streptomyces griseus Kultur (MA-2837)
■wieder. Die Erklärung der Zeichen in Tabelle II sind wie folgt: + bedeutet gutes Wachstum, + bedeutet schlechtes
Wachstum und - bedeutet kein Wachstum auf dem speziellen Kohlehydrat.
T a b e 1 1 e II
Kohlehydrat MA-2837 Kohlehydrat MA-2837
Kultur
Glucose Arabinose
Xylose Maltose Mannose Fructose Mannit
| MA-2837 | Kohlehydrat |
| Kultur | |
| ' + | Lactose |
| + | Inosit |
| + | Saccharose |
| + | Khamniose |
| + | Eaffinose |
| Cellulose |
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15 4-25
Die in den Tabellen I, Ia und II beschriebenen Eigenschaften wurden zur Herabsetzung der Streptomycep griseus Kultur
(MA-2837) auf eine Klassifikation einer Species über den in ·
"Bergeys's Manual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe,
Seiten 694- - 829 (1957)-und in "The Actinomycetes", Band 2,
Seiten 61 - 292 (1961) beschriebenen Schlüssel verwendet. Ein Vergleich der Kultur (MA-2837) mit bekannten Species
zeigt, dass sie dem Streptomyces griseus ähnlich ist» Es
bestehen morphologische Unterschiede, wie beispielsweise hinsieht der Farbe des Luftmycels, das bei Streptomyces griseus
vorwiegend gelbbraum-gelb und grünlich-gelb ist, jedoch im
Hinblick auf die erhebliche Anzahl von Ähnlichkeiten und lediglich geringen Unterschieden ergibt sich keine Berechtigung
für eine neue Species-Bezeichnung. Der Mikroorganismus
(MA-2837)ι der das Antibiotikum 810A produziert, wurde somit
■ als ein Stamm von Streptomyces griseus identifiziert.
Zusätzlich zu der vorstehenden Kultur (MA-2837) wurden 25 weitere Kulturen als Erzeuger des Antibiotikums 810A identifiziert.
Dazu gehören: drei Kulturen von Streptomyces griseus, elf Kulturen von Streptomyces viridochromogenes,
fünf Kulturen von Streptomyces fimbriatus, drei Kulturen von Streptomyces halstedii, eine Kultur von Streptomyces
rochei, eine Kultur von Streptomyces cinnamonensis und eine " Kultur von Streptomyces chartreusis. Diese Streptomyces-Stämme
werden als die folgenden Kulturen in der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Eahway, Hew Jersey, identifiziert:
HA-4-160, MA-4-174-, MÄ-4171, MA-4177, MA-4178,
MA-4180, ΜΔ-4164·, MA-4165, MA-4166, MA-4167, MA-2892, MA-3265,
MA-4162, MA-4163, MA-4159, MA-4169, MA-4170, MA-4179, MA-4161,
MA.-4-168, MA-4-175, MA-4-181, MA-2938, MA-4176 und MA-4173·
Diese Kulturen wurden zur dauernden Hinterlegung bei der Eulturensammlung der Uorthefn Utilization Eesearch and
Development Branch of the U.S· Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt.
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INSPECTED
15 425 " - - .
Hie zugeteilten HEEL-KuItur-Bezeichnungen sind wie folgt:
Streptomyces griseus:
| MA.-4160 | HEEL 3951 |
| MÄ.-4174 | HEEL 3953 |
| ■ MA-4171 | HEEL 3952 |
| Streptomxces viridochxomogenes: | |
| MÄ.-4177 | HEEL 397O |
| MÄ.-4178 | HEEL 3971 |
| KÄ.-4180 | HEEL 3972 |
| MA-4164 | HEEL 3966 |
| MA.-4165 | HEEL 3967 |
| MÄ.-4166 | HEEL 3968 |
| Ml-4167 | HEEL 3969 |
| MA.-2892 | HEEL 3962 |
| MA.-3265 | HEEL 3963 |
| MA.-4162 | HEEL 3964 |
| tIÄ.-4163 | HEEL 3965 |
| Streptoinyces fim"briatus: | |
| MA.-4159 | HEEL 3954 |
| MA-4169 | HEEL^ 3956 |
| MA.-4170 | HEEL 3957 |
| Mi-4179 | HEEL 3958 |
| M-4161 | HEEL 3955 |
| Streptomyces halstedii: | |
| MA-4168 | HEEL 3959 |
| Μδ.~4175 | HEEL 3960 |
| MÄ.-4181 | HEEL 3961 |
| Streptoinyces rochei: | |
| MÄ.—2938 | HEEL 3973 |
| Streptomyces cinnamonesis: | |
| MA.-4176 | HEEL 3974 |
409819/10 93
ie
15 425
StreptomTCes chartreusi s; '
MÄ.-4173 - HEEL 3975
Die Charakterisierung der vorstehend erwähnten Isolate im
Vergleich mit Streptomyces griseus, Streptomyces viridochromogenes,
Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii,
Streptomyces rochei, Streptomyces cinnamonensis und Streptomyces chartreusis sind in den folgenden Tabellen Ha bis
He wiedergegeben.
- 18 -
4 098 19/10 93
ο co co
Medium
Q? a b e 11 e Ha
Kultureigenschaf tender das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämme von
Streptomyces griseus
MA-4-160
Morphologie
2)omatenpaste-Hafermenlagar
Glycerin-
asparaginagar
_ Czapek-Dox co Agar
Sporophore bilden Büsche mit geraden bis leicht gewundenen Sporenketten,
Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 ja Durchmesser bis 0,9 £ x 1,2 JuV
in Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen ' ' '
Luftmycel:
pulverförmig, gelbbraun mit grünlicher Schatti erung
Vegetatives Wachstum: gut, eben, sich ausbreit endgelbbraun
Luftmycel: pulver- Luftmycel:
förmig, gelbbraun pulverförmig, gelbbraun mit mit stark grüner stark grüner Übertönung
Übertönung
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachstum: gut, eben, gelbbraun
Luftmycel: pulverförmig, gelbbraun mit grünlicher Schattierung und graugrünen
Vektoren
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, transparent
Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel:
massig, gelbbraun massig, gelbbraun massig, gräulich
Lösliches Pigment:
Lösliches Pigment: Lösliches Pigment
Tabelle Ha (Portβä
Medium
Eefeextrakt sllzaglr *
MA.-4160 MA-4-174-
MA.-4171
egetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, gelbbraun
Luftmycel: gut, pulverförmig, beige
Lösliches Pigment: hellbraun ; u_____——_——
Lösliches
Hefe-Extrakt agar
fcein
keia
keia
O (D CO
CD /SJ
I ab θ 1 1 e Hb
Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyces virido- vn
chromogenes ^,
• ro
Medium MA-2892 ... MA-3265 MA-4-162 MA-A163 ^
Morphologie Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen
auftreten.■
Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 bis 1,2 u. Durchmesser und 0,9 bis 1,2 χ
1,2 bis 1,7 Α, Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen. '
Tomatenpaste- Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum:
Eafermehlagar Rückseite braun turn: Rückseite turn: Bückseite Rückseite braun
τ«. ->
gelbbraun dunkelbraun · · " ■
Jjultmycei: Luftmycel: samtig, Luftmycel: Luftmycel:
samtig, dunkelgrau hellgrau und weiss samtig, bläulich- samtig, mittelgrau
uncL we:LSS ■ grau und weiss und weiss
. Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: Lösliches Pigment:
hellbraun keines hellbraun . hellbraun
.Glycerin-. Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum:
asparagin-. Eückseite dunkelbraun turn: Rückseite turn: Rückseite Rückseite braun
agar Tlifi_,__--, . " " dunkelbraun dunkelbraun
Λ^ίν ?ΞΞ ,, „«λ ^ama Luftmycel: hell- Luftmycel: Luftmycel:
dunkelgrau und creme- J creme-farben und creme-farben und grau
■ farben B hellgrau
. Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: Lösliches Pigment:
' hellbraun keines hellbraun · hellbraun
Tabelle ITb (Fortsetzung)
Medium
Czapek-Dox
Agar
Hefeextrakt Eextroseagar
Lösliches Pigment auf P ep ton-Ei s en-Hefeextraktagar
MA.-2892
Vegetatives Wachstum: dunkelbraun
Luftmyc el:
sehr spärlich
Lösliches Pigment: dunkelbraun
Vegetatives Wachstum : dunkelbraun
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun
MA-3265
MA-4162
Vegetatives Wachstum: dunkelbraun
Luftmycel:
hellgrau und weiss
hellgrau und weiss
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachstum: Ruckseise
braun
Luftmycel: hellgrau
braun
Luftmycel: hellgrau
Lösliches Pigment: keines
Vegetatives
Wachstum:
dunkelbraun'
Luftmycel: ■
sehr spärlich
Lösliches
Pigment:
hellbraun
Vegetatives
Wachstum:
dunkelbraun
Luftmycel:
sehr sparsam
Lösliches Pigment: hellbraun
dunkelbraun'
Luftmycel: ■
sehr spärlich
Lösliches
Pigment:
hellbraun
Vegetatives
Wachstum:
dunkelbraun
Luftmycel:
sehr sparsam
Lösliches Pigment: hellbraun
MA.-4163
Vegetatives Wachstum: gelbbraun
Luf tmycel': sehr spärlich
Lösliches Pigments, hellbraun
Vegetatives Wachstum! dunkelbraun
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun
dunkelbraun
O CO CO
NO
cn cn
cn
Tabelle IlbCPortsetzung;)
Medium
Glycerin-Asparagin- agar
Czapek-Dox
Agar
O (O OO
CD CO Ca>
MA.-2892 MA.-3265
M/U4162
MA-4163
Morphologie
Tomatenpaste Hafeanehlagar
Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen
auftreten. Sporen sind kugelförmig "bis oval - 0,9 "bis 1,2 μ Durchmesser und
0,9 - 1,2 χ 1,2 - 1,7 η , Ketten von etwa 10 "bis 15 Sporen
- Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun
Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel:
samtig, bläulich- samtig, mittel- ' samtig, mittelgrau samtig, dunkelgrau
grau und creme- grau und creme- und creme-farben und creme-farben
farben farben
Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun
Luftmycel: dunkelgrau und cremefarben Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum: Rückseite turn: dunkelgrau
dunkelbraun · ■■
dunkelbraun · ■■
Luftmycel:
mittelgrau und
creme-färben
mittelgrau und
creme-färben
Luftmycel: spärlich gräulich .
Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun
Luftmyc el: hellgrau
und creme-färben
CJ) CJ)
Vegetatives Wachstum: braun
Luftmyc el: s ehr
spärlich
Lösliches Pigment: braun Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum: Rückseite
braun
braun
Luftmycel: hellgrau und cremefarben
Lösliches Pigment:
hellbraun
hellbraun
turn: braun
Luftmyceis a ehr
spärlich.
spärlich.
Lösliches Pigment;
braun
braun
Vegetatives Wachstum : gelbbraun
Luftmyc el: s ehr
spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun
•P-CD
CO OO
O CD CO
Medium
Hefeextrakt-Bextrose-
agar
Lösliches Pigment auf PepV-on- Eisen-"
Hefe extraktagar
lab el le Hb (Portsetzung)
Vegetatives Wachstum: dunkelbraun
Luftmycel: sehr sparsam —·
Luftmycel: sehr sparsam —·
-^I67
Lösliches Pigment: hellbraun
dunkelbraun
rv>
vn
CD CD J>· CD K)
Tabelle Hb (Portsetzung)
Medium
Morphologie
Tomatenpaste-Hafem
ehl agar
Glycerinro Asparagin-
agar
Czapek-Dox
Agar .
Agar .
ΜΑ-Λ177
MA-A-178
MA-4-180
Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzv/eige auf Lufthyphen
auftreten. Die Sporen sind kugelförmig "bis oval - 0,9 "bis 1,2 w.
Durchmesser und 0,9 "bis 1,2 χ 1,2 bis 1,7 Ά in Eetten von etwa 10 bis 15
Sporen
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Bückseite gelbbraun Eückseite braun
Luftmycel: ssjoitig,
dunkelgrau und
dunkelgrau und
Luftmycel: dunkelgrau
samtig,
weiss
Vegetatives Wachstum: Rückseite braun
Luftmycel: samtig, dunkelgrau und cremefarb
en
-Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Rückseite braun Rückseite dunkelbraun
Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun
Luftmycel:
dunkelgrau
dunkelgrau
Luftmyc el:
dunkelgrau Luftmycel:
Gemisch aus
dunkelgrau
Gemisch aus
dunkelgrau
hell und
Lösliches Pigment: hellbraun :
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: gelbbraun dunkelbraun gelbbraun
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun VJI
Medium
I/ösliches Pigment auf Pepton-Eisen-Hefeextraktagar
Tabelle lib (Portsetzung)
ΜΑ-Λ180
Hefeextrakt Dextroseagar ·
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:
dunkelbraun braun "braun
vn
Luftmycel: spärlich-gräulich
Luftmycel:
sehr spärlich
sehr spärlich
Luftmycel:
sehr spärlich
sehr spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun
dunkelbraun
O CO CD
O CO Ca)
!Tabelle lic
Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyces
fimbriatus
Medium
MA-4169 MA-4179
MA-4161
VJl
P ro
VJl
Morphologie Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen und einige Schleifen, die
als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 a Durchmesser und 0,9 χ 1,2 η mit Ketten von
etwa 10 bis 15 Sporen ' '
lomatenpaste Hfh agar
Vegetatives Vegetatives Wachs- Vegetatives
Wachstum: Rück- turn: Eückseite seite gelbbraun gelbbraun Luftmycel: Luftmycel: massig,
massig, hellgrau hellgrau
O CO OO
Vegetatives
Wachstum: Wachstum:
Eückseite gelb-Eückseite gelbbraun braun
Luftmycel: Luftmycel:
massig, hell- spärlichgrau und creme- gräulich
färb en
Eückseite gelb-Eückseite gelbbraun braun
Luftmycel: Luftmycel:
massig, hell- spärlichgrau und creme- gräulich
färb en
Sporophore sind kurze Haken und Schleifen, die als Seitenzweige auf
Luftmycel auftreten. Sporen in Ketten von weniger als 10 Sporen sind kugelförmig bis
oval, 0,9 Α Durchmesser und 0,9 x
Vegetatives Wachstum : gelbbraun Luftmycel: · spärlich, gräulich.
Glycerin-
Asparaginagar
Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich Ti s grau
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachs- Vegetatives turn: dunkelbräun- Wachstum:
lieh bis grau dunkelbraun-Vegetatives
Wachstum:
dunkelbräunlich bis grau lieh bis 'grau
Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun mit rötlich gelbbraunen Vektoren
—y CD CO
!Tabelle· lic (Fortsetzung)
Medium
MÄ.-4169
-4.17Q
MA-4179
MA-4-161
VJl
Ozapek-Dox
Agar
Hefeextrakt
Dextrose +
Salz-Agar
Dextrose +
Salz-Agar
Vegetatives
Wachstum:
dunkelbräunlich bis
grau
dunkelbräunlich bis
grau
Luftmycelί
sehr spärlich
sehr spärlich
Lösliches
Pigment;
braun
Vegetatives
Wachstumί
dunkelbräunlich bis grau
Wachstumί
dunkelbräunlich bis grau
Vegetatives Wachstum: düjikelbräun-11cn
bis grau
Vegetatives Wachstum : dunkelbräun-Iich
bis grau
Luftmycel:
g
g
massig.
au
Luftmycel: grau
massig
Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: braun "braun
Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum: dunkelbräun- turn: dunkelbräunlich
bis grau lieh bis grau Vegetatives
Wachstum: dunkelbräunlich ·
bis grau
Wachstum: dunkelbräunlich ·
bis grau
Luftmycel:
sehr spärlich
sehr spärlich
Lösliches
Pigment:
braun
Vegetatives
V/achsturn: dunkelbräunlich
bis grau
V/achsturn: dunkelbräunlich
bis grau
Vegetatives
Wachstum:
gelbbraun
Luftmyeel:
spärlich
sehr
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives
Wachstum: braun
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigment: braun
Lösliches
Pigment auf
P ep t on-Ei s en-"
Hefeextrakt-Agar
Pigment auf
P ep t on-Ei s en-"
Hefeextrakt-Agar
dunkelbraun
O CO CD
Tabelle lld
Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyces halstedii
Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyces halstedii
Medium MA-4168 MA-4-175 MA.-4181
Morphologie
Tomatenpaste HaSnmehlagar
Glyc erin-Asparagin-Agar
Sporophore sind lange, lose Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen
auftreten. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 p. Durchmesser und
0,9 χ 1,2 a -in Setten von mehr als 10 Sporen '
■i /
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Rückseite braun Bückssite gelbbraun Rückseite braun
Luftmycel:
pulverförmig, dunkelgrau
Vegetatives Wachstum: Rückseite braun bis dunkelbraun
Luftmycel:
pulverförmig, dunkelgrau und weiss
Luftmycel:
dunkelgrau und weiss, pulverförmig
Luftmycel: dunkelgrau und weiss
Lösliches Pigment: keines ■■■·
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:
Rückseite gräulich
Luftmycel:
pulverförmig, vorwiegend dunkelgrau gemischt mit hellgrau und weiss
Lösliches Pigment: keines
Rückseite gräulich
Luftmycel:
dunkelgrau, pulverförmig
CD CO U3
Medium
Czapek-Dox
Agar
Agar
Hefeextrakt
Dextrose +
SaIz-Agar
Dextrose +
SaIz-Agar
Lösliches
Pigment auf
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar
Pigment auf
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar
ΓΜ.-4-168
ga"beile Hd (Portsetzung)
MA-4181
Vegetatives Wachstum: creme-färb en
Luftmycel: gräulich cremefarben
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:
Eückseite rötlich- creme-farben
braun ' " ''
Luftmycel: Luftmycel:
gräulich creme-farben sehr spärlich
Vegetatives Wachstum: gelbbraun
Luftmycel: gräulich, spärlich Lösliches Pigment: keines
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: gelbbraun braun
Luftmycel: spärlich, gräulich
Luftmycel:
spärlich, gräulich
spärlich, gräulich
Lösliches Pigment: keines
keines
gäbe 1
e ,1Ie
Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Streptomyces Spec.ies
Medium MA-2958 MA-4-176
Medium MA-2958 MA-4-176
Tomatenpaste ι Hafermehl-Agar
GIyc erin-A sp aragin-Agar
Morphologie
Streptomyces rochei
Sporophore bilden kompakte Spiralen,die
als Seitenketten von etwa 10 - 15 Sporen kugelförmig
bis oval, 0,9/U Durchmesser und
0,9 x'1,2 a. auftreten
Vegetatives Wachstum: Rückseite rötlich bis
y mittelgrau
Lösliches Pigment: keines
Vegetatives Wachstum: Rückseite rötlich bis braun
Luftmycel:
mittelgrau
mittelgrau
Lösliches Pigment: keines
Stre-ptomyces^ cinnamonesis
Sporophore sind Haken,
Schleifen und einige lose
Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind
in Ketten von mehr als
10 Sporen, kugelförmig
bis oval, 0,9 ja Durchmesser und 0,9 x'1,2 η
Sporophore sind Haken,
Schleifen und einige lose
Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind
in Ketten von mehr als
10 Sporen, kugelförmig
bis oval, 0,9 ja Durchmesser und 0,9 x'1,2 η
Vegetatives Wachstum:
gelbbraun
gelbbraun
Luftmycel: beige mit
rosa Eärbung, samtig
rosa Eärbung, samtig
Lösliches Pigment:
braun
braun
Vegetatives Wachstum:
Rückseite dunkelrötlich
bis braun
Rückseite dunkelrötlich
bis braun
Luftmycel: beige mit
rosa Färbung
rosa Färbung
Lösliches Pigment:
braun
braun
Streptomyces chartreusis
Sporophoren sind kompakte Spiralen, die als Seitenzveige
auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind in Ketten von mehr als 10 Sporen, kugelförmig bis
oval, 0,9 bis 1»2λι Durchmesser
und 0,9 bis 1,2 χ 1,2 bis 1,7 Ja
Vegetatives Wachstum: hellbraun mit orange bis braunen Vektoren Luftmycel: pulverförmig,
dunkelgrau mit blau-grüner
lärbung Lösliches Pigment: braun
Vegetatives Wachstum: braun
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun
Tabelle He (Fortsetzung)
Medium
MA-2958 MÜ4176
MA-4175
Czapek-Dox Agar
Hefeextrakt
Dextrose + SaIz-Agar
Dextrose + SaIz-Agar
Loslich.es Pigment
auf Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar
auf Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar
Vegetatives Wachstum; rötlichbraun
Luftmycel: sehr sparsam.
Lösliches Pigment: keines
Vegetatives Wachstum* gelbbraun-
Luf tmyc'el: gräulich
Lösliches Pigment: hellbraun
keines Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun
Luftmycel: massig,beige mit rosa Färbung
Lösliches Pigment:
braun
braun
Vegetatives Wachstum: braun
Luftmycel: spärlich, creme-farben bis weiss
Lösliches Pigment:
hellbraun
hellbraun
dunkelbraun
Vegetatives Wachstum: orange- bis braun ·
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachstum: braun
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigment: braun
dunkelbraun
O CD OO
O CO CO
15 425
Die vorstellende Beschreibung der das Antibiotikum 810A erzeugenden
Mikroorganismen dient einfach zur Erläuterung der verwendbaren Arten von Stämmen und nicht zur Begrenzung der
Erfindung auf einen Organismus, der die Merkmale dieser speziellen Beschreibung erfüllt. Die Erfindung umfasst die
Verwendung anderer Mikroorganismen einschliesslich Stämme von Actinomyceten, die aus der Natur isoliert oder durch
Mutation erhalten werden, beispielsweise solche, die durch natürliche Auswahl erhalten werden oder solche, die durch
Mutationsmittel, beispielsweise Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, Ultraviolett-Bestrahlung, Stickstoffsenfgase und
dgl.t die unter geeigneten Bedingungen ein identisches Antibiotikum
ergeben, erhalten werden.
In vitro und- in vivo Untersuchungen
Antibiotikum 810A, in vitro: Die.biologische in vitfro
Charakterisierung des Antibiotikums 810Δ erfolgte durch die Petri--Schalen-Agar-Diffusioiisniethode. Diese Versuche wurden
so durchgeführt, dass mit der Antibiotikumlösung angefeuchtete 7 miQ-Scheiben auf die Oberfläche von Petri--Schäler)- gebracht
wurden, die mit 5 ^l Difeo-Nähragar und 0,2%igem
Hefeextrakt begossen wurdet der mit 5 oder 10 ml Impfstoff
- 33 -
4 0 9819/1093
15 425 JV
Je 150 ml Medium beimpft war, und bei 25° 0 oder 37° C
16 Stunden inkubiert wurde. Die Methode und Abhandlung über diese Versuche sind in der Veröffentlichung: "Cross Re.si- *■
stance Studies and Antibiotic Identification", applied Microbiology, Band 6, Seiten 392 bis 398 (1958) beschrieben.
Die folgenden Tabellen VI, VII und VII geben die Ergebnisse dieser Versuche hinsichtlich der·antibakteriellen und
Kreuzungsresistenz wieder und führen die verwendeten Versuchsorganismen
und die angewendeten Bedingungen auf.
40 9819/1093
. · . » Tabelle VI · ■ '
810A antibakterielles Spektrum, in vitro Wirksamkeit J
tPestorgaiiismus " Testbedingungen · Inhibierungszone, ^
Durchmesser vri
Escherichia coli Bacillus species Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa
Serratia marcescens Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis Sarcina lutea Stphylococcus aureus
(Streptomycin-Streptothricinresistent)
Streptococcus faecalis Alcaligenes faecalis. Bruceila bronchiseptica
Salmonella gallinarum Vibrio percolans to Xanthomonas vesicatoria
| •Impfstoff** | Inkubierung | 810A |
| ml/150 ml | Temp. C | 5 mg/ml |
| 5 | 25 | 15 |
| 5 | 25 | 22 |
| Lf\ | 37 | 29 |
| 5 | 25 | 7 |
| 5 | 25 | 7 |
| 5 | 25 | 26 |
| 5 | 25 | 33 |
| 5 | 25 | 26 |
| 5 | 37 | 19 |
| 15 | 37 | 7 |
| 5 | 37 | 25 |
| 10 | 37 | 21 |
| 10 . | . . 25 | 15 |
| 10 | 27 | 36 ■ |
| . 5 | 25 | 15 |
co * 7 mm = Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet)
**·* ** Übernacht-Kultur", verdünnt auf einen Wert von 60 mu auf dem Lumetron-Colorimeter
CD '
O? a b e 1 1 e VII 810A Ereuzungsbeständigkeit, in vitro Untersuchung
Escherichia coli - Stamm**
Unt ersuchungsb edingungen
Inhibi erungsz one Durchmesser
vn
ro vn
Sensitiver Ausgangs stamm.
Streptomycin-resistent
Streptothricin-resi stent
OXAMYCIN-resistent
Pleoxidin-resistent
Chloramphenicol-resistent
Chlortetracyclin-resistent
Oxytetracyclin-resistent
Neomycin-resistent
Tetracyclin-resistent
Viomycin-resistent
Polymyxin-resistent
Grisein-resistent
Streptomycin-resistent
Streptothricin-resi stent
OXAMYCIN-resistent
Pleoxidin-resistent
Chloramphenicol-resistent
Chlortetracyclin-resistent
Oxytetracyclin-resistent
Neomycin-resistent
Tetracyclin-resistent
Viomycin-resistent
Polymyxin-resistent
Grisein-resistent
Impfstoff*** ml/150 ml
5 10 ■10 10 10 10 10 10 10 10
■10
lnkubierung
Temp. C
25 25 25
37 25 25 25 37 25
37 25 25
810A 5 mg/ml
15
13
17
10
26
20
17 13 15
OS
O
CD
OO
CD
OO
* 7 mm = Scheibengrosse (keine Inhibierungszone beobachtet)
** Versuche gegenüber einer Reihe von Stämmen von E. coli,isoliert aus der gleichen
•Ausgangskultur durchgeführt und anschliessend gegenüber den einzelnen Antibiotika
ausgesetzt
**♦ Übernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 mu
auf dem Lumetron-Colorimeter
O CO OO
O CO Ca>
810A spezielles Wirkungsspektrum, in vitro Untersuchung -*
Escherichia coli W-MB-60 !Eestbedingungen Inhibierungszone 8
(mit speziellen Zusätzen wie .. ·π.,^Λν™Α«
vn
angegeben)
Vergleich, (keine Zusätze) 0,1 m.ol, Phosphat-Puff er -jpH
0,1 raol, Phosphat-Puffer,- pH
0,1 τηbl.Phosphat-Puffer - pH
Menschliches Blutplasma 20 %
Kationen-Austauschharz ■
(Dow ET 91-1%, Agar-Eonzentration
' auf 1 % nur für die Harzplatte herabgesetzt)
| üestbedingungen | Inkubierung Temp. ° C |
Inhibi erungsz one |
| 25 | Durchmesser | |
| 25 | mm* | |
| Impfstoff** ml/150 ml |
25 | 810A 5 mg/ml |
| 5 | 25 | 13. |
| 5 | 25 | 13 |
| 5 | . .25' :,. ' | 16 |
| 5 | 18 | |
| 5 | 15 | |
| 5 | 12 . | |
* 7 ™ Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet)
cd ♦* übernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 mu auf dem Lumetron-Colorimeter
cd ♦* übernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 mu auf dem Lumetron-Colorimeter
425
Antibiotikum 810Α„ in vivo: Die biologische in vivo Charakterisierung
ergibt, dass 810A ein Antibiotikum mit breitem Wirkungsspektrum ist, das gegen Infektionen mit drei Species
von Proteas, zwei von Salmonella, einem Stamm von Escherichia coli, zwei von Klebsialla unddrei gram-positive Organismen:
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und Diplococcus
pneumoniae schützt.
Methode: Die zu dieser Charakterisierung verwendete Methode
ist wie folgt: Veisse, weibliche Schweizer Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 20 bis 33 E wurden intraperitoneal
mit dem 3- bis 20fachen der Anzahl an.Organismen infiziert,
die als lethal für 50 % der infizierten Kontrolltiere berechnet
wurde (LDcrk-Dosis 3 bis 20). Zum Zeitpunkt der
Infektion und wiederum 6 Stunden später, wurde über den be-■ zeichneten Weg Therapie angewendet. Kontrollen der Virulenz
der Kultur und der Toxizität des Antibiotikums für nichtinfizierte Mäuse wurden in die Versuche eingeschlossen.
7 Tage nach der Infektion wurde der Versuch als beendet erachtet, und die Menge des Antibiotikums (I), die zum Schutz
von 50 % ä.er infizierten und behandelten Tiere notwendig
ist, wurde nach der Methode von Knudsen und Curtis, J. Amer. Stat. Assoc, Band 42, Seite 282 (1947) berechnet. ·
Ergebnisse: Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle IV
aufgeführt. Diese Daten zeigen, dass das aus der Kultur MA-2837 erhaltene Antibiotikum 810A ein Mittel mit breitem
Wirkungsspektrum ist, das sowohl gegen gram-positive als auch gram;-negative Organismen schützt.
Obgleich Wirksamkeit bei oraler Verabreichung (p.o.) erzielt wurde, erhielt man die besten Ergebnisse über den subkutanen
(s.c.) oder intraperitoneal en (i.p.) Weg. Das antibiotische Gemisch tötete keine nichtinfizierten Mäuse, wenn
zwei Dosierungen, die jeweils 1 mg des Produktes enthielten t
409819/1093
15 425
«59
intraperitoneal verabreicht wurden, oder wenn zwei Dosierungen von jeweils 18 mg subkutan oder oral -verabreicht wurden.
Tabelle IX
810A in vivo Wirksamkeit
Testorganismus
Therapie- EDcn in Mikrogramm
e^ χ zw.ei Dosierungen
| Proteus vuigaris Proteus mirabilis » Salmonella §chottmuelleri |
i.p. S.C . p.o. • i.p. p.o. i.p. S.C. |
55 500 12100 200 5000 9000 |
| Escherichia coli | i.p. | 3750 |
| Escherichi coli | i.p. | 1530 |
| Klebsiella pneumoniae | i.p. | 2500 |
| Salmonella gallinarum | i.p. | 1670 |
| Salmonella pullorum | i.p. | 625 |
| Diplococcus pneumoniae | i.p. | 258 |
| Staphylococcus aureus | i.p. | 927 |
| Streptococcus pyogenes | i.p. | 625 |
| Die Antibiotika | ||
| 810A Fermentation; Das Antibiotikum 81OA | wird während der |
aeroben Fermentation geeigneter, wässriger Nährmedien unter
geregelten Bedingungen über die Beimpfung mit der Streptomyces
griseus Kultur MA-2837 erzeugt. Wässrige Medien, wie sie beispielsweise zur Herstellung anderer Antibiotika verwendet
werden, sind gleichfalls zur Herstellung des Antibiotikums 810A geeignet. Derartige Medien enthalten durch den
Mikroorganismus assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze.
Im allgemeinen können Kohlehydrate, wie beispielsweise Zukker, z. B. Glucose, Arabinose, Maltose, Xylose, Mannit und
dgl., und Stärken, wie Getreide, z. B. Hafer, Reis, Maisstärke, Maismehl und dgl., entweder allein oder in Kombination als
- 39 -
409819/1093
15 ^25
assimilierbare Kohlenstoffquellen in dem Hährmedium verwendet
werden. Die genaue Menge der verwendeten Kohlehydratquelle oder -quellen in dem Medium hängt teilweise von den anderen
Bestandteilen des Mediums ab, jedoch im allgemeinen variiert die Menge an Kohlehydrat gewöhnlich zwischen etwa 1 und 6
Gew.% des Mediums. Diese Kohlenstoffquellen könen einzeln verwendet werden^oder es können verschiedene derartiger Kohlenstoffquellen
in dem Medium kombiniert werden. Im allgemeinen kann irgendein proteinhaltiges Material als eine
Stickstoff quelle in dem Permentationsprozess eingesetzt werden.
Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise
Hefehydrolysate, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl, Hydrolysate
von Casein, Maisquellflüssigkeit, lösliche Destillationsrückstände oder Tomatenpaste und dgl. Die Stickstoffquellen
werden entweder allein oder in Kombination in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.% des wässrigen Mediums verwendet.
Typische Medien, die zur Herstellung des Antibiotikums 810A geeignet sind, sind die im folgenden aufgeführten.
Diese Medien und andere in den folgenden Beispielen beschriebene: Medien dienen lediglich zur Erläuterung einer grossen
Vielzahl von Medien, die eingesetzt werden können und dienen nicht zur Begrenzung. ■ .
Medium I:
Difco-Hefeextrakt Glucose
* Phosphate uff er MgSo4- 7H2O
Destilliertes V/asser Difco-Agar
*Phosphatpuffer: KH^PO1
Destilliertes Wasser
Medium II?
Kinds extrakt *" HZ Amin
Dextrose NaCl
Destilliertes HpO " ■ '
pH auf 7,2 mit KaOH eingestellt
*ein enzymatisch abgebautes Casein
--4Θ- 409819/1093
| 10,0 | S | ml |
| 10,0 | S | S |
| 2,0 | ml | g |
| 0,05 g | g | |
| 1000,0 | ml | |
| 25,0 | 6 | |
| 91,0 | S | |
| 95,0 | 6 | |
| 1000,0 | g | |
| 3,0 | ml | |
| 10,0 | ||
| 10,0 | ||
| 5,0 | ||
| 1000,0 |
15 425
Medium III:
Dextrose Asparagin KHO
MgSO4 .
Hefe extrakt * Spurenelementgemisch. Nr.
Destilliertes H2O
pH auf 7,2 mit NaOH eingestellt * Spurenelementgemisch Nr. 2:
MnSO CuCl CaCl
2H2O
ZnSO,,
Destilliertes
Medium IV;
V8 Saft Staley's 4S Sojabohnenmehl
Dextrose Agar
Destilliertes H0O pH 7,9 - 8,0 ^
Medium V:
auf
Hefe-Autolysat (Ardamin) Glucose * Phosphatpuffer MgSO4 - 7H2O
Destilliertes H2O
pH - auf 6,5 unter "Verwendung von NaOH eingestellt
*Phosphatpuf f erlö sung:
KHPO
Na2HPO4 Destilliertes
| 10,0 | ε | ml |
| 1,0 | ε | ε |
| 0,1 | ε | ε |
| 0,5 | ε | ml |
| 0,5 | ε | |
| 10,0 | ml | |
| 1000,0 | ml | |
| 1,0 | ε | |
| 1,0 | ε | |
| 25,0 | mg | |
| 100,0 | mg | |
| 56,0 | mg | |
| 19,0 | mg | |
| 200,0 | mg | |
| 1000,0 | ml | |
| 100,ö | ml | |
| 20,0 | ε | |
| 2,0 | ε | |
| 25,0 | ε | |
| 1000,0 | ml | |
| 10,0 | ε | |
| 10,0 | ε | |
| 2,0 | ml | |
| 0,05 ε | ||
| 1000,0 | ||
| 91,0 | ||
| 95,0 | ||
| 1000,0 |
409819/10'9
15 425
Medium VI;
Maisquellflüssigkeit (auf feuchter Basis) Dextrose
NaCl
4 2
Polyglykol 2000
Polyglykol 2000
Destilliertes HgO
pH - auf 7,0 mit NaOH eingestellt
Medium VII:
Impfung
L-Asparagin
L-Histidin
DL-Phenylalanin
Mononatrium-glutamat
NaCl
L-Histidin
DL-Phenylalanin
Mononatrium-glutamat
NaCl
5,0 4,0
5,0 2,0
, · 7Η2°
ZnSO,, . 7Ηο0
ZnSO,, . 7Ηο0
MgSO4 · 7H2O
Glycerin
Saccharose
Destilliertes
0,1 0,1 0,05 g 1,0 g 20,0 g
2,5 g *1000,0
* pH auf 7,0 mit NaOH eingestellt *♦ pH auf 7,1 mit NaOH eingestellt
Flei schextrakt
NaCl
NZ Amin
Dextrose
pH 7,0
NaCl
NZ Amin
Dextrose
pH 7,0
40,0 g 20,0 g
2,5 g 0,5 g
0,25
1000,0 ml
bezogen auf das Volumen (zu jedem Eo It) en einzeln
zugegeben)
Produktion
5,0
4,0 2,0
1,5 5,0
2,0
g g g g g g
0,4 0,1 0,1
0,05 g
1,0 g
g g g
20,0
2,5
**1000,0
g g
ml *■
0,3 %
o,5 %
0Jo
%
%
409819/1093
15 425 '
Me Fermentation erfolgt "bei Temperaturen im Bereich von
etwa 20 bis 37° C, jedoch, wird es zur Erzielung optimaler
Ergebnisse bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von
etwa 22 bis 30° C durchzuführen. Der pH-Vert der für das
Wachstum der Streptomyces griseus Kultur (MA. 2837) -u11^. zur
Erzeugung dea Antibiotikums 810A geeigneten Nährmedien soll
im Bereich von etwa 5>5 bis 8,0 liegen.
Ein kleiner Fermentationsansatz des Antibiotikums 81OA erfolgt
in einfacher Weise durch Beimpfung eines geeigneten Fahrmediums mit der das Antibiotikum erzeugenden Kultur, wobei
man die Fermentation bei einer konstanten Temperatur von etwa 24 bis 28°,C auf einem Schüttler über einen ausgedehnten
Zeitraum, wie beispielsweise mehrere Tage, fortschreiten lässt. Nach Beendigung des InkubierungsZeitraums
wird das Mycel entfernt, und die überstehende Flüssigkeit
wird untersucht. . ■
In Praxis wird diese Fermentation in einem sterilisierten Kolben über eine ein-, zwei-, drei- oder vierstufige Keimentwicklung
durchgeführt. Das Nährmedium für die Impf stufe kann irgendeine geeignete Kombination von Kohlenstoff- und
Stickstoffquellen sein, wie beispielsweise irgendeines der vorstehend unter I bis VIII beschriebenen Medien. Der Impfkolben
wird in einer konstanten Temperaturkammer bei etwa 28° C während eines Zeitraums von 1 bis etwa 3 Tagen geschüttelt,
und die erhaltene Kultur wird zur Beimpfung entweder
eines Zweistufen-Impfmediums oder des Produktionsmediums verwendet. Wenn Zwischenstufen-Impfkolben verwendet werden,
werden diese in praktisch der gleichen Weise entwickelt, d. h., der Inhalt des Kolbens- wird zur Beimpf ung des' Produktionsmediums eingesetzt, die beimpften Kolben werden bei einer
konstanten Temperatur mehrere Tage geschüttelt, und am Ende des Inkubierungszeitraums wird der Inhalt des Kolbens zum
Entfernen des Hycels zentrifugiert. Die überstehende Flüssig--
- 43 -
409819/10 93
keit oder Brühe wird dann konzentriert und unter Herstellung des Antibiotikums 810A gereinigt.
Pur ein Arbeiten im grösseren Masstab wird es bevorzugt, die
Fermentierung in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einem
Rührwerk und· einer Vorrichtung zur Belüftung des Fermentationsmediums
versehen sind. Mach dieser Methode wird das Nährmedium
in den Tank gebracht und durch Erhitzen auf Temperaturen von bis zu etwa 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen
wird das sterilisierte Medium mit der erzeugenden Kultur geimpft, und man lässt die ^Fermentation während eines Zeitraums
von mehreren Tagen, beispielsweise von 2 bis 4· Tagen, fortschreiten,
während das IJährmedium gerührt und/oder belüftet
wird und die Temperatur bei etwa 24 bis 28° C gehalten wird. Durch Veränderungen der Impfstoffentwicklung und Veränderungen
des Produktionsmediums ist es möglich, eine mehrfache Verbesserung
hinsichtlich der Produktion und eine Steigerung der Wirksamkeit des Antibiotikums zu erhalten.
810A Vers uchsver fahr en unter Verwendung von Proteus Vulgaris?
Das Antiobiotikum 810A wurde in einfacher Weise durch ein
Scheiben-Platt en-Verfahr en unter Verwendung von Proteus
vulgaris HB-838 (ATGC 21100 und KRIOj B-336I) unter Beibehaltung
als eine Schrägkultur auf Nähragar (Difco) plus" 0,2 %
Hefeextrakt (Difco) als Testorganismus untersucht. Die beimpften Schrägkulturen wurden bei 37° C während 18 bis 24
Stunden inkubiert und bei Kühlschranktemperaturen gelagert, bis sie verwendet wurden, wobei frische Schrägkulturen jede
Woche hergestellt wurden. - ' .
Der Impfstoff für die Versuchsplatten wird täglich durch Beimpfung
eines 250 ml Erlenmeyer-Kolbens, der 50 ml Fährbrühe
(Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) enthält, mit einem Abstrich der Schrägkultur hergestellt. Der Kolben wird bei
-44-
409819/1093
15 425 ■ K '
57° C auf einer Schüttelmaschine während 18 bis 24 Stunden
inkubiert. Die Flüssigkeitskultur wird dann auf 40%ige
Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 ma unter Verwendung
eines Bausch & Lomb Spectronic-20 Geräts durch Zugabe
einer 0,2%igen Hefeextraktlösung zu der Kultur eingestellt.. Nichtbeimpfte Flüssigkeit wird als Blindversuch für
diese Bestimmung verwendet. Die eingestellte Brühe (30 ml) wird zur Beimpfung von 1 1 Medium verwendet.
Nähragar (Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) werden als
Versuchsmedium eingesetzt. Dieses Medium wird hergestellt, durch Autoklavieren sterilisiert, und man lässt es auf 50° C
abkühlen. Nachdem ,das Medium beimpft ist, wird zu jeder
der verschiedenen sterilen Petri-Schalen 10 ml zugegeben, und das Medium kann sich verfestigen.
Es wurden Versuche an diesen Platten nach dem Scheiben-Platt en-Verfahr en unter Verwendung von 13 mm Filterpapier-'
scheiben durchgeführt. Die Versuchsplatten wurden 20 bis 24 Stunden bei 37° C inkubiert. Die Auswertungen wurden als
mm Durchmesser der Inhibierungszone ausgedrückt. Sie wurden
zur Bestimmung der relativen Wirksamkeiten oder, wenn sie
mit einem gereinigten Bezutgsstandard verglichen wurden,
der Wirksamkeit in ng/ml verwendet. Wenn ein derartiger Versuch
quantitativ durchgeführt wird,'können 2 bis 4 jag/ml
Antibiotikum ermittelt werden.
810A Versuchsverfahren unter Verwendung von Vibrio percolans:
Es wurden auch Versuche bezüglich 810A nach dem Scheiben-Platten-Verfahren
gegen Vibrio percolans (MB-1271) unter
Verwendung von 13 mm Filterpapierscheiben durchgeführt. Die
Versuchsplatten wurden unter Verwendung von Difco Mhragar
plus 2,0 g /1 Difco Hefeextrakt mit 10 ml je Platte hergestellt.
Eine Übernachtkultur des Versuchsorganismus, Vibrio percolans (MB-1272) in Halbflüssigkeit plus 0,2 % Hefeextrakt
-Λ5-;
409819/1093
15 425
wurde in steriler Salzlösung auf eine Suspension mit 40%iger
Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 mu verdünnt. Diese Suspension wurde mit 20 ml/1 Medium vor dem Begiessen
der Platten zugegeben.
Die Versuchsplatten wurden bei 4° C gehalten, bis sie verwendet
wurden (maximal 5 Sage). Nach der Aufbringung der mit
Antibiotikum gesättigten Versuchsscheiben wurden die Platten bei 28° C während eines Zeitraums von 8 bis 24 Stunden inkubiert.
Inhibierungszonen wurden als mm Durchmesser abgelesen.
^ Bakterialle Inaktivierung mit 81QA: Ein in vitro Versuch
™ diente zur Bestimmung der Resistenz des Antibiotikums 810A
gegenüber bakterieller Inhibierung im Vergleich mit Cephalosporin C, Cephaloridin und Cephalothin. Diese Untersuchung
zeigte» dass das Antibiotikum 810A beständiger als letzteres gegenüber bestimmten Mikroorganismen ist.
Das in diesem Versuch verwendete abbauende Bakterium war ein Organismus, von dem bekannt ist, dass er Cephalosporin C
vollständig inaktiviert, nämlich Alcaligenes faecalis (MB-9).
(a) Herstellung von Bakterienzellen: Alcaligenes faecalis
(MB-9)-Zellen wurden wie folgt hergestellt: Der Inhalt
P eines L-Rohrs wurde mit einigen ml Nährflüssigkeit, die 0,2 % Hefeextrakt enthielt, vermischt. Eine schleifevoll
Aufschlämmung wurde über die Oberfläche einer Nähragar-Schrägkultur verteilt und 18 Stunden bei 37° C inkubiert.
Sämtliche Schrägkulturen wurden bei 5° C aufbewahrt und innerhalb 1 Woche nach der Inkubierung verwendet. Eine
schleifevoll des Oberflächenwachstums aus jeder Schrägkultur wurde as^eptisch in 50 1^l Nährbrühe, die 0,2 %
Hefeextrakt enthielt, überführt und 18 Stunden bei 28° C unter Schütteln inkubiert. Die Kultur wurde dann bei
4000 Upm 10 Minuten zentrifugiert. Das überstehende Ma-
4098 19/1093
15 425
terial wurde abdekantiert, und der restliche ZelIkImapen
wurde zweimal mit sterilem 0,1 m-Phosphatpuffer, pH 7)5
(6,8 g Kaliumphosphat und 7/1 S Natriuaihydrogenphosphat
je Liter destilliertes Wasser) gewaschen. Die gewaschenen
Zellen wurden dann in einem Zehntel des Originalvolumens
einer 4- mg/ml Antibiotikumlösung in 0,1 m-Phosphatpuffer
wieder suspendiert. Das Versuchsgemisch wurde dann ohne Schütteln in einem auf 57° c eingestellten Wasserbad "bis
zu 4- Stunden inkubiert. Die "Versuchsgemische wurden dann
bei 2000 Upm 10 Minuten zentrifugiert, wobei sich ein
klares überstehendes Material bildete, das in sterila Eeagensgläser dekantiert wurde und unmittelbar in Trokkeneis
gefroren wurde, bis es zur biologischen Bestimmung bereit war, gewöhnlich innerhalb von 5 Stunden. Vergleichsproben wurden in genau der gleichen Weise jedoch ohne
Zellen inkubiert. ■ .
(b) Ausmass der Inaktivierung des Antibiotikums 810A:s_ Die
überstehenden Flüssigkeiten wurden hinsichtlich ihrer antibakteriellen Wirksamkeit in folgender Weise getestet:
Papier scheiben von 6,4- mm wurden mit den überstehenden
Flüssigkeiten angefeuchtet und auf die Oberfläche von Kähragar-(0,2 %) Hefeextrakt-Platten gebracht, die vorher
mit dem entsprechenden Testorganismus beimpft worden waren. B. subtilis (MB~964)-Versuchsplatten wurden in folgender
Veise beimpft: 5 ml einer Suspension von gewaschenen Sporen
in 0,9 % Salzlösung wurden zu jeweils 150 ml Hähragar-(0,2
°/o) Hefeextrakt zugegeben, wovon 5 ml dann in Petri-
- Schalen von 15 χ 100 m verteilt wurden. Sämtliche Versachsplatten
wurden bei 5° 0 gelagert und innerhalb von 3 Tagen verwendet.. Die Versuchsplatten wurden übernac ht
bei 25° C inkubiert, bevor Inhibierungszonen rund um die Testscheiben gemessen wurden. ':
Zellfreie Eontrollproben jedes Antibiotikums wurden in
■ ■ - Ä7- '
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15 425 · y<p
Verdünnungen von 1 : 1, 1 : 2, 1 ί 4, 1 : 8, 1 : 16 und
1 : 32 untersucht, um eine Standard-Bezugskurve zu erhalten.
Lösungen der Testantibiotika wurden bei voller Stärke nach Inkubierung in Gegenwart der gewaschenen Bakterienzellen
untersucht. Sämtliche Proben wurden dreifach gefahren.
(c) Ergebnisse: Die prozentuale Inaktivierung wurde berechnet,
indem der Mittelwert der aus jedem Versuch erhaltenen drei Inhibierungszonen genommen wurde und die Menge an verbleibendem
Antibiotikum in der Testlösung bestimmt, wie sich aus der Standardkurve ergibt. Dieser Wert wurde dann
von der Ausgangskonzentration (4 mg/ml) subtaäaiert und
der Eest durch die Ausgangskonzentration geteilt und mit
100 multipliziert, wobei die vorhandene Inaktivierung erhalten wurde. Die folgenden !Tabellen XII und XIII geben
die erhaltene Inaktivierung für Cephalosporin C, Cephalothin und das Antibiotikum 810A unter den oben beschriegenen
Bedingungen wieder.
Prozentuale Inaktivierung nach Inkubierung mit gewaschenen
Bakterienzellen
(bestimmt auf B. subtilis (MB-964) Platten)
Antibiotikum ' $ Stunden Inkubierung mit
Alcaligenes faecalis -
810A 0
Cephalosporin C 99+
Cephalothin . 62,5
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15 425
Prozentuale Inaktivierung nach. Inkubierung mit gewaschenen
Bakt eri enz ell en (bestimmt auf V. percolans (MB-1272) Platten)
Antibiotikum 3 Stunden Inkubierung mit
Älcaligenes faecalis
810A 0
Cephalosporin C 99+
Cephalothin 50
Die Fähigkeit des Antibiotikums 810A und von Cephalosporin C, dem Abbaueffekt der Aerobacter cloacae (MB-2646)-Kultur zu
widerstehen, wurde ebenfalls bestimmt. Diese Kultur ist grauL-negativ und gegenüber Cephalosporin C resistent. Bei
Durchführung des Versuchs wurden Proben der einzelnen Gemische der Organismen und eine Probe des Antibiotikum-Gemischs nach
2stündiger Inkubierung entnommen und auf die verbliebene
antibiotische Wirksamkeit untersucht. Das Verfahren ist die gleiche TJntersuchungsmethode, wie oben für Algaligenes
faecalis beschrieben. Die Quelle der Inaktivierungssubstanz ist-eine 1 : 160-Verdünnung des ITiltrats einer bei 37° C
während 18 Stunden durchgeführten Schüttelkultur von Aerobacter cloacae MB-2646 in Nährbrühe, die 0,2% Hefeextrakt
enthielt. Die folgende Tabelle XIV gibt die prozentuale Inaktivierung von Antibiotikum 810A, Cephalothin, Cephaloridin
und Cephalosporin C auf Vibrio percolans (MB-1272) gemäss dieser Methode wieder:
- Ά9 -.
4 0.9 8 19'/'10 93
15 425 SO
(Tabelle XIV
Prozentuale Inaktivierung nach Inkubierung mit zellfreiem
Extrakt (bestimmt auf V. percolans (MB-1272) Platten)
Antibiotikum 2stündige Inkubierung mit
Aerobacter cloacae
810A 16
Cephalothin 66
Cephaloridin 96
Cephalosporin C 96
Unter Verwendung des gleichen Versuchsablaufs wie oben beschrieben,
gibt die folgende Tabelle XV die relative Beständigkeit
des Antibiotikums 810A gegenüber enzymatischer
Inaktivierung durch Aerobacter cloacae wieder. Die Ausgangskonzentration
beträgt 250 ug/ml. Die Ergebnisse sind in
ug/ml ausgedrückt.
Tabelle XV
Verbleibende, antibiotische Wirksamkeit (ug/ml)
(Ausgangskonzentration = 250 ug/ml)
| Antibiotikum | Versuchsorganismus | 2stündige Inkubie rung mit Aerobacter cloacae * |
| 810A | B. sübtilis 964- | 190 |
| Cephalothin | ti | 140 |
| Cephaloridin | η | -CIO |
| 810A | V. percolans 12. 72 | 210 |
| Cephalothin | It | 85 |
| Cephaloridin | It | <10 |
* Zellfreier Extrakt
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15 425
Im Hinblick auf die vorstehenden Daten ist das Antibiotikum 810A offensichtlich beständiger als Cephalosporin C, Cephalothin
und Cephaloridin gegen Inaktivierung durch Aerobaeter cloacae.
Da das Antibiotikum 810A und dessen Salze das Wachstum verschiedener Species von Salmonella in v/irksamer Weise inhibieren,
können sie als Desinfektionsmittel zu verschiedenen Haushaiszwecken und industriellen Zwecken verwendet werden.
Beispielsweise ist 81QA wirksam gegen Salmonella schottmuelleri und S. gallinarura, und diese Eigenschaft zeigt deren
Brauchbarkeit als sanitäre Mittel für Haushaltszxvecke und ·
industrielle Zwecke an.
I soli erung und Reinigunp;
Antibiotikum 810A: Das Antibiotikum 810A kann durch Adsorption
an ein Ionenaustauschharz, beispielsweise an synthetische Anionaustauschharze, die sich von Dextrose oder Acryl-Copolycieren
ableiten oder nicht-ionische, vernetzte Polymere gereinigt werden« Das adsorbierte Antibiotikum wird aus dem
Harz oder Polymeradsorbat mit Wasser oder mit einer wässrigen, alkoholischen Lösung eines geeigneten Salzes, wie beispielsweise
Ammoniumchlorid, natriumchlorid und dgl., eluiert. Beispiele für verwendbare Ionenaustauschharze und Polymere sind
die DEAE-Sephadex A-25-, Amberlite IEA.-68 und Amberlite XAD-2-Medien,
die im folgenden beschrieben sind. Gegebenenfalls
40981 9/1093
15 425
kann das nach dem vorstehenden Verfahren erhaltene Eluat durch eine zweite und dritte Adsorptions- und Eluierungsstufe
gereinigt werden. Es werden dann Konzentrate sämtlicher Eluate erhalten, um das gereinigte Produkt zu ergeben.
810A-Komponenten: Das Antibiotikum 810A kann in seine Komponenten,
7ß-(I|-5-Aniiiio-5-carboxyvaleramido)-3-(a~methoxyp-sulfooxycrnnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a~methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
durch Chromatographie getrennt werden. Dazu gehören:
(1) Chromatographie auf einem stark-hydrophil en Anionenaustauschharz,
wie beispielsweise *DEAE Sephadex A-25> entwickelt mit einem Ammoniumbromid-Ameisensäure-System.
Es können verschiedene Konzentrationen dieses Systems verwendet werden, jedoch wird in der Pra>d.s eine Lösung
aus 0,5 m-Ammoniumbromid und 0,1 m-Ameisensäure bevorzugt.
(2) Chromatographie auf einem schwach-basisehen Anionenaustauschharz,
wie beispielsweise **Amberlite IRA-68. Dies ist eine Gruppenabtrennung, wobei Material in roher Form
bei einem pH-Wert von etwa 3 "bis 3»5 aufgegeben wird und
zunächst mit-einer Säure bei einem pH-Wert von etwa 2
und dann mit NaCl/HCl bei einem pH-Wert von etwa 1 elu-
iert wird.
(3) Chromatographie nach einem nicht-ionischen, vernetzten Polystyrol-Polymerisat, wie beispielsweise ***Aioberlite
XAD-2. Die Eluierung erfolgt mit einem geeigneten, wässrigen
System, jedoch ist es im allgemeinen am günstigsten, ein Gemisch aus Wasser und einem niederen Alkylketon
zu verwenden. !Typische verwendbare Eluiermittel sind beispielsweise
10 % Methanol in Wasser und anschliessend
- 52 -409819/1093
50 % Methanol in Wasser. Anstelle der 50%igen Methanolin-Wasser-Lösung
kann 20 % Aceton-in-Wasser verwendet werden.
* DEAE Sephadex A-25,ist ein synthetisches Anionen-
austauschharz, das sich von dem Polysaccharid, Dextran in seiner Chloridform ableitet, d. h. mit
Chlorid-Gegenionen; Pharmacia Fine Chemicals, Inc., 800 Centenial Avenue, Piscataway, New Market, New
Jersey 08854.
** Ein synthetisches Anionenaustauschharz^ ein vernetztes
Acrylcopolymerisat, das eine schwach-"basische
tertiäre Aminogruppe enthalt; Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania 19105.
*** Ein nicht-ionischer, vernetzer Polystyrol-Polymersorbent;
Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania 19105·
Die nach den obigen Methoden erhaltenen einzelnen Produkte können durch Rechromatographie gereinigt werden. So kann
"beispielsweise 7ß-(D-5~Amino-5-carboxyvaleraniido)-3~(amethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3~cephem~4-carbonsäure
(Ic) gereinigt werden, indem dieses Produkt der in der obigen Methode 1 beschriebenen Reinigungsmethode unterzogen
wird, mit nachfolgender Entsalzung auf Amberlite XAD-2-Absorbent, und 7ß-(B-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-
4-carbonsäure kann durch Rechromatographie auf einem Sephadex-A-25 Anionenaustauschharz, das mit 0,5 m-Ammoniumbromid
und 0,05 m-Essigsäure entwickelt wird, erneut gereinigt
werden.
Zub e r ei t ungen
Das Antibiotikum 8IOA und seine einzelnen Bestandteile können
allein oder in Kombination als aktiver Bestandteil in irgendeinem einer Vielzahl pharmazeutischer Präprate verwendet werden.
Diese Antibiotika und ihre entsprechenden Salze können in Kapselform oder als Tabletten, Pulver oder flüssige Lösun-
- 53 -409819/1093
gen oder als Suspensionen oder Elixiere verwendet werden. Sie können, oral, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden.
Zu geeigneten in der Zusammensetzung verwendeten Trägern gehören beispielsweise Mannit, Saccharose, Glucose oder sterile
Flüssigkeiten, wie z. B. Wasser, Salzlösung, Glykole und öle aus Erdölherkunft, tierischer, pflanzlischer oder synthetischer
Herkunft, wie beispielsweise Erdnussöl, Mineralöl oder Sesamöl.
Ausser deca Träger können die erfindungsgemässen Zubereitungen
auch andere Bestandteile enthalten, wie beispielsweise Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel,
Gleitmittel, Suspendierungsmittel, Viscositätsmittel,
Geschmacksstoffe und dgl. Ferner können in den Zubereitungen auch andere aktive Bestandteile enthalten sein, um ein breiteres
Spektrum antibiotischer Wirksamkeit zu liefern.
Die zu verabreichende Dosis hängt weitgehend vom Zustand des zu behandelnden Lebewesens und dem Gewicht des Wirts ab. Der .
parenterale Weg wird für allgemeine Infektionen und der orale Weg für Intestinalinfektionen bevorzugt. Im allgemeinen beisteht eine tägliche Dosis aus etwa 15 bis etwa 175 mg aktivem
Bestandteil Je kg Körpergewicht des Lebewesens in einer oder mehreren Anwendungen Je Tag. Eine bevorzugte tägliche Dosis
für das Antibiotikum 810A oder dessen Einzelkomponenten liegt im Bereich von etwa 20 bis 40 mg an aktivem Bestandteil je kg
Körpergewicht.
Die vorliegenden Zubereitungen können in verschiedenen Einheitsdosierungsformen,
beispielsweise in fester oder flüssiger, oral einnehmbarer Dosierungsform, verabreicht werden. Die
Zubereitungen enthalten je Einheitsdosierung, gleich ob flüssig
oder fest, im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 700 mg aktivem
Bestandteil, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitungen; jedoch wird es im allgemeinen bevorzugt, eine Dosierungsmenge
im Bereich von etwa 80 mg bis 320 mg zu verwenden. Bei parenteraler
Verabreichung ist die Einheitsdosierung gewöhnlich die
reine Verbindung in einer sterilen Wasserlösung oder in Form eines löslichen Pulvers, das zur Auflösung bestimmt ist.
— 54 — 409819/1093
SS
Eine typische Einheitsdosierungsform besteht im Vermischen
von 120 mg Antibiotikum 810A oder 120 mg einer seiner Bestandteile
oder eines Salzes mit 20 mg Lactose und 5 mg Magnesiumstearat
und Einbringung des 145 mg Gemische in eine
Gelatine-Kapsel Nr. J. In ähnlicher Weise können unter "Verwendung
von mehr aktivem Bestandteil und weniger Lactose andere Dosierungsformen in Gelatine-Kapseln Nr. 3 eingebracht
werden, und sollte es notwendig sein, mehr als 14-5 mg Bestandteile
zusammen zu vermischen, können grossere Kapseln verwendet werden. In ähnlicher .V/eise können andere Einheitsdosierungen, wie beispielsweise gepresste Tabletten und Pillen
gleichfalls hergestellt werden. Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung:
Trockengefüllte Kapsel, die 120 mg 7ß-(D-5-amino-5-carboxy-
valeramido)-3-(oc-methoxy-p-sulfoo3iycinnamoyloxyniethyl)-7-methoxy~3-(cephem-4--carbonsäure
(Ic) enthält
| je Kapsel | mg |
| 120 | mg |
| 20 | mg |
| „____£- |
7ß-(D-5~Amino~5~carboxyvaleramido)-j-Cc-methoxy-p-sulfoüxycinnamoyl)--oxyme
thyl )~7-metho:xy-3-c ephem-A—
carbonsäure (Ic)
carbonsäure (Ic)
Lactose
Magnesiums tearat Kapselgrösse Nr. 3
Die 7ß-(I)~5-Amino-5~carboxyvaleramido)»3-(a-methoxy-psulfooxycinnamoyloxymethyl)~7-niethoxy-3-cephem-4~carbonsäure
(Ic) wird auf ein Pulver einer Komgrösse entsprechend einem Siebdurchgang durch ein Sieb mit 0,25 mm (Nr. 60)
zerkleinert und dann werden Lactose und Magnesiums tearat durch ein Siebtuch mit 0,25 mm lichter Maschenweite (Nr. 60)
auf das Pulver gegeben, und die vereinigten Bestandteile werden 10 Minuten vermischt und dann in Gelatine-Kapseln
Nr. 3 eingefüllt.
- 55 -
AQ9819/1093
| je Tablette | mg |
| 250 | mg |
| 192 | mg |
| 5 | mg |
| 65 |
15 425
250 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-metho^~psulfooxycinnamoyloxymethyl)-7~methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ic) enthaltende Tablette
7ß_(D_5_Amino-5~carboxyvaleramido)-5-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyiiiethyl)-7~sietlioxy-3-cephem-4—
carbonsäure (Ic) Dicalciumphosphat, U.S.P. Magnesiumstearat
Lactose, U.S.P.
Der aktive Bestandteil värd mit dem Dicalciumphosphat und
der Lactose vermischt. Das Gemisch wird mit I5%iger Maissttärkepaste
(6 mg) granuliert und grobgesiebt. Es wird bei 45° C getrocknet und wieder durch ein Sieb mit 1,2 mm
lichter Maschenweite (Kr. 16) gesiebt. Das Magnesiumstearat wird zugegeben und das Gemisch zu Tabletten von etwa 15 mm
Durchmesser gepresst.
500 mg 7ß-(D-5--^raino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-psulfooxycinnaraoyloxymethylO-V-methoxy-J-cephem-^-carbonsäure
(Ic) enthaltende parenterale Lösung
Ampulle:
7ß~(D-5-Amino-5-c arboxy vale rami do)-3~
(a-methoxy-p~sulfooxycinnamoyloxyme thy l)-7-methoxy-3-cephem-4-- carbonsäure
(Ic) 5OO mg
Ampulle:
Verdünnungsmittel: Steriles Wasser für ;
die Injektion 2 cm-
- 56 -409819/1093
15 425
S?
Die 7ß-(I)-5-Ainino-5-carboxyvaleraraido)-3-(a-niethoxy-psulfooxycirm.amoyloxymetliyl)-7-metlioxy-3-cepliem-4-carbonsäure
(Ic) kann allein oder in Kombination-mit anderen
biologisch aktiven Bestandteilen verabreicht werden, beispielsweise mit anderen antibakteriellen Mitteln, wie
beispielsweise Lincomycin, einem Penicillin, Streptomycin, Novobiocin, Gentamicin, Neomycin, Colistin und Kanamycin.
])ie erfindungsgemäs-sen Produkte (Ia) bilden eine grosse Vielzahl
pharmakologisch verträglicher Salze mit anorganischen
und organischen Basen; dazu gehören beispielsweise Metallsalze, wie z. B. solche, die sich von Alkali- und Erdalkalihydroxiden,
Carbonaten und Bicarbonaten ableiten und Salze, die sich von primären, sekundären und tertiären Aminen ableiten,
wie beispielsweise Monoalkylamine, Dialkylamine, Trialkylamine,
niedere Alkanolamine, Di-niedrig-alkanolamine, niedere
- 57 -
409819/1093
15*25
■ Alkylendiamine, Ν,Ν-Diaralkyl-niedrig-alkylendiamine, Aralkylamine,
aminosubstituierte niedere Alkanole, H,lT-di-niedrigalkylaLainosubstituierte
niedere Alkanole, amino-, polyamino- und guard.dinosubstituierte niedere Alkansäuren und stickstoffhaltige
heterocyclische Amine. Zu typischen Beispielen dieser Salze geboren Salze, die sich von Natriumhydroxid, ITatrium-CErbonat,
Natriumbicarboiiat, Kaliumcarbonat, Kaliuahydroxid,
Calciumcarbonat und dgl. ableiten und Salze, die sich von Aminen, wie beispielsweise Trimethylarain, Triathy larain, Piperidin,
liorpholin, Chinin, Lysin, Protarain, Arginin, Procain,
Äthanoiainin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, 17,11'-
f}. Dibenzyläthylendiainin, liiäthanolamin, Piperazin, Dimethyl-
aminoäthanol, 2-Amino-2-methyl~'1--piOpanoli Theophyllin und
N-Methylglucamin und dgl., ableiten.
Die vorstehend, erwähnten Salze können Honosalse sein, wie
beispielsweise das Mono.:; atrium salz, das beispielsweise durch
Behandlung eines A'quivalerfe Natriujiüiydro>:id mit einem Äquivalent
des Produktes (Ia) erhalten wird, oder gemischte Disalze,
die durch Behandlung eines A'auivalenfe des Monosalzes
mit einem Äquivalent einer abv«eichenden Base, erhalten wird. Diese Disalze können auch erhalten werden, indem ein Äquivalent
einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie beib,
spiel sw ε is 3 Calciumhydroxid, mit einem Äquivalent des Produktes
(Χφ behandelt viird. Ferner kommen gemischte SaIae
und Ester,·wie ccd-spielsveise solche, die durch Behandlung
des Produktes (ja) mit einem Äquivalent Natriumhydro>d.d und
dann mit einem Äquivalent Milchsäure erhalten werden, in Betracht.
Die erfindungsgesiässen Salze sind pharmakologisch verträgliche,
nicht-toxische Derivate die als wirksamer Bestandteil
in geeigneten pharmazeutischen Einheitsdosierungsformen verwendet
werden können. Sie können auch mit'anderen Arzneimitteln kombiniert werden, um Präparate mit einem breiten
Virkungsspektrum zu ergeben. Ferner sind die erfindungsgemäs-
409819/1093
' - '58 - BAD ORiGmAL
15 425
sen Salze und ebenfalls die entsprechenden Ester und AmId-Derivate
brauchbar als Zwischenprodukte zur Herstellung des
durch die Formel I wiedergegebenen Carbonsäure-Produktes. Die
SaIae können auch zur Herstellung anderer pharmazeutischverträglicher
Salze verwendet werden.
Ausser in Salze können die erfindungcgemässen Produkte
auch in ihre- entsprechenden Mono- und Diester und Mono-
und Diamide überführt werden, wie beispielsweise die PsmLoyloxyin
ethyl- oder Dibenzhydrylester oder Alkyl-, Cycloalkyl-,
Aryl- oder'Aralkylester, wie beispielsweise die Hethyl-,
Äthyl-» Cyclohexyl-, Phenyl- und Benzylester oder Amide, Diamide,
N-niedrig-Alkylamide, ITjH-Di-niedrigalkylaraide, H- ·
Aralky!amide, Ι'ί,ϊΙ-Diaralkylaraide oder heterocyclische.Amide,
wie beispielsweise H-Kethyl- und E-iithylunid.. N, IT-Dime thy I-amid,
Η,Ε-Diäthylarnid, H-Benzylamid, N.K-Dibenzylainid, Pi-peridid,
Pyrrolidid oder Morpholid und dgl.
Zu Methoden zur Hersteilung der vorstehend erwähnten Ester
und Amid.-Derivate gehören die Reaktion des Carbonsäure-Produktes
(3a) oder eines entsprechenden Bäurehalogenids mit
Methanol, Äthanol, Cyclohexanol, Phenol, Benzylalkohol oder Dibenzhydrol. In ähnlicher Veino können die Amid-Derivate
erhalten werden, indem das entsprechende Säurehaiοgenid mit.
Ammoniak oder mit deia entsprechenden Alkylamin, Di alkyl amin,
Aralkylamin oder heterocyclischen Amin behandelt wird* Diese
und andere übliche Methoden zur Herstellung dieser Ester und Amide sind dem Fachmann geläufig.
Die folgenden Beispiele erläutern die Verfahren, über die die erfinö-ungsgeiTiässen Produkte erhalten werden können. Die
Beispiele dienen jedoch lediglich zur Erläuterung, und es ist dem Fachmann klar, dass von der Erfindung andere funktionell-äquivalente
Produkte und Verfahren zu ihrer Herstellung eingeschlossen sind. Daher ist jede Modifikation dieser
- 59" -409819/1093 BAD.Original
15 425
to
Synthesen, die zur Bildung eines identischen Produktes führt,
als analoge Methode anzusehen. Das beanspruchte Verfahren unterliegt weitgehender Variation und Modifikation, und daher
wird Jede geringe Abweichung oder Ausdehnung als im Rahmen ' der Erfindung liegend betracht.
Beispiel 1
Antibiotikum 810A
Ein lyophilisiertes Reagensglas mit Streptomyces griseus Kultur
(MA-2837) wurde aseptisch geöffnet. Der Inhalt wurde zur Beimpfung von vier Schrägkulturen eines Nährmediums der folgenden
Zusammensetzung verwendet:
Medium I:
Difco-Hefeextrakt Glucose .
* Phosphatpuffer .
Destilliertes Wasser Difco-Agar
* Phosphatpuffer
| 'IU, υ | g |
| g | |
| 2,0 | ml |
| 0,05 | g |
| 1000,0 | ml |
| 25,0 | S |
| 91,0 | ε |
| 95,0 | g |
| 1000,0 | ml |
Destilliertes V/asser
Die Schrägkulturen wurden durch Verteilung von 14 ml/
22 χ 75 ram Kulturreagensglas hergestellt. Das Reagensglas
wurde mit Watte verstopft, 15 Minuten auf 120° C zur Steri
lisierung erhitzt, und man Iiess das Medium in schräger Anordnung verfestigen. Die beimpften Schrägkulturen wurden
"bei 28° C 1 Woche inkubiert und dann bei 4° C bis zur Verwendung
gelagert. Die Kultur auf einer dieser Schrägkulturen wurde dann zur Beimpf ung von mit Unterteilungen ver- '
- 60> -. A09819/1093
15 4-25 % 61
sehenen 250 ml Erlenmeyer-Eolben verwendet, die 50 ml Medium II
enthielten, indem 5 ml steriles Medium zugegeben wurden, die
Schrägkultur-Ob erf lache gekratzt wurde, um das Wachstum zu unterbrechen und 1 ml in jeden der drei Eeimkolben aseptisch
pipettiert wurde. Das Medium II besass die folgende Zusammensetzung:
Medium II: .
Rinds extrakt . 3,0 g
* KZ Amin · . . 10,0 g
Dextrose . 10,0 g
UaCl ■ 5,0g
Destilliertes Wasser . 1000,0 ml pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt
* Ein enzymatisch abgebautes Casein
Der Eeimkolben wurde auf einem Rotationsschüttler bei 220 TJpm
mit einem Hub von 5 cm 3 Tage geschüttelt. Die Eeimkolbenkultur
wurde dann zur Beimpfung von 11 mit Unterteilungen versehenen 2-Liter~Erlenmeyer-Eolben verwendet, die 350 ml
Medium III enthielten, wobei 2 bis 3 °/° Inoculum verwendet
wurde. Medium III besass die folgende Zusammensetzung:
| Medium III: | 10,0 | g |
| Dextrose | 1,0 | g |
| Asparagin | 0,1 | g |
| E2HPO4. | 0,5 | g |
| MgSO4 · 7H2O | 0,5 | g |
| Hefeextrakt | 10,0 | ml |
| * Spurenelementgemisch Nr. 2 | 1000,0 | ml |
| Destilliertes Wasser | ||
| pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt | ||
| -■ · - - 61 - ' | ||
40981 9/1Q93
15 425 U
* Spurenelementgemisch Wr. 2:
FeSO2, · 7H2O ' 1,0 g
MhSO4 "H2O 1,0 6
CuCl2 · 2H2O 25,0 mg
CaCl2 100,0 mg
H3BO2 56,0 mg
-MO7O24 . 4H2O · 19,0 mg
ZnSO4 # 7H2O . 200,0 mg
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
Die Kolben wurden dann auf einem Schüttler bei 135 bis 150 Upm mit einem Hub von 5 cm 4 Tage bei 28° C geschüttelt.
Nach Beendigung des Inkubationszeitraums wurde der Inhalt der 11 Kolben vereinigt und untersucht. Die Untersuchung
der kombinierten, zentrifugierten Brühe zeigte eine Inhibierungszone
von 22 mm (I3 inm-Scheiben) gegen Proteus vulgaris
auf einer Standard-Versuchsplatte. Dieses Antibiotikum
wurde als 810A identifiziert, d. h. ein Antibiotikumgemisch, das 7ß-(D-5~Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(amethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-6-metho3q7-3-cephem«4-
carbonsäure und 7ß-(D-5--Ä-mino-5-carbocyvaleramido)-3-(ccmethoxy-p-hydr
oxycinnamoy loxym e thy 1) - 7-methoxy-3-c ephem-4-
carbonsäure (Ia) enthält.
Beispiel 2
Beispiel 2
Ein lyophilisiertes Reagensglas mit Streptoniyces griseus
(KA-2837) wurde aseptisch geöffnet, und der Inhalt wurde
zur Beimpfung der als Medium I in Beispiel 1 beschriebenen Fahrmedium-Schrägkulturen verwendet. Diese Schrägkulturen
wurden bei 28° C 1 Woche .inkubi-ert, wonach sie bei 4° C
gelagert wurden. Ein ieil der Kultur auf einer dieser Schrägkulturen
wurde dann zur Beimpfung eines mit Unterteilungen
409819/1093
15 425 $S ■'.
versehenen 250 ml-Impf-Erlenmeyer-Kolbens, der 50 ml des
als Medium II in Beispiel 1 beschriebenen Mediums enthielt,
verwendet. Dieses beimpfte Medium wurde bei 28° C 2 Tage auf einem Rotationsschüttler mit einem Hub von 5 cm bei
220 Upm inkubiert. Das Inoculum wurde dann aseptisch unter
Eerunterzentrifungieren des Mycels gewaschen, die überstehende
Flüssigkeit abgegossen, in einem gleichen Volumen Salzlösung resuspendiert, rezentrifungiert und wieder in
einer 0,9%igen Natriumchloridlösung resuspendiert. Das gewaschene Mycel wurde dann zur Beimpfung (2 % Inoculum) von
zwei mit Unterteilungen versehenen 250.1111-Erlenmeyer-Kolben,
die jeweils 50 ml eines chemisch bestimmten Produktionsmediums
enthielten, das bei 120° C 15 Minuten sterilisiert worden war, verwendet. Das chemisch definierte Produktionsmedium hatte die folgende Zusammensetzung:
Produktionsmedium;
L-Prοlin GIyc erin
Saccharose Mononatriumglutamat ITaCl
CaCl2
PeCl, · 6Ho0
P
ei
ZnCl2
| 15,0 | 6 |
| 20,0 | S |
| 2,5 | 6 |
| 1,5 | g |
| 5,0 | S |
| 2,0 | B |
| 0,4 | g |
| 0,1 | δ |
| 0,1 | 6 |
| 0,05 | S |
| 1,0 | g |
| 1000,0 | ml |
2 Destilliertes Wasser
pH (nicht eingestellt) 7,1
Die Produktionskolben wurden dann bei 220 Upm auf einem Schüttler mit einem Hub von 5 cm 4. Tage bei 28° C geschüttelt.
Es wurden Versuche bei 3 und 4 Tagen durchgeführt. Proben
• ■ '- 63,- - - ■■ ' ■ .' ■ .\
409819/10 93
15 425
wurden zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten nach
dem Scheiben-Petri-Schalen-Verfahren untersucht. Unter Verwendung
von 13 mm-Scheiben ergaben diese Brühen Inhibierungszonen gegen Proteus vulgaris (MB-8J8) von 21 mm nach 3 Tagen
und 26 mm nach 4 Tagen. Das Produkt wurde als Antibiotikum 810A identifiziert.
Bei s ρ i e 1 3
Ein lyophilisiertes Reagensglas mit Streptomyces' griseus
(MA-4125a) wurde aseptisch geöffnet und der Inhalt in Schrägkulturen
der folgenden Zusammensetzung überführt:
Medium IV: . ■ '
V8-Saft · 100 ml
Staley's 4S-SoJ ab ohnenmehl 20,0 g
Dextrose · 2,0 g
Agar 25jO g
Destilliertes Wasser bis 1000,0 ml
pH 7,9 bis 8,0
Die so erhaltenen Schrägkulturen wurden dann zur Beimpfung verschiedener 250 ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 50 ml
des folgenden Mediums.V enthielten, verwendet.
Medium V:
Hefe-Autolysat (Ardamin) 10,0 g
Glucose . .''"'.* 10,0 g
* Phosphatpuffer ' 2,0 ml
MgSO4 · 7H2O · 0,05 g
Destilliertes Wasser · 1000,0 ml
pH-Wert unter Verwendung von NaOH auf 6,5 eingestellt.
- 64 409819/1093
15 425
Phosphatpuff erlö sung:
Destilliertes Vasser
91,0 ε
1000,0 ml
Die Keimkolben wurden 1 Tag bei 28 0 und 220 TJpm geschüt
telt. . .
Der Inhalt der Kolben wurde dan zum Beimpfen von 39 250-ml-Erlenmeyer-Kolben
ohne Unterteilungen, die 40 ml des Mediums
YI enthielten, mit 3,5 dl Inoculum je Eolben verwendet.
Medium 71:
| Maisquellflüssigkeit (feuchte Basis) | 40,0 | S | S |
| Dextrose | 20,0 | S | e |
| HaCl | •2,5 | (zu jedem Kolben ein zein zuge geben) |
|
| MgSO4 · 7H2O | 0,5 | ml | |
| Polyglykol 2000 | 0,25 | ||
| Destilliertes Vasser | 1000.0 |
pH-Wert mit HaOH auf 7,0 eingestellt.
Die Produktionskolben wurden auf einem Eotationsschüttler mit einem Hub von 5 cm bei 220 Upm und bei 24° C während
40 Stunden geschüttelt, wonach die Kolben zusammengegeben wurden, eine aliquote Menge zur Untersuchung entnommen wurde
und der Rest zu Extraktionsstudien verwendet wurde. Die Probe zur Untersuchung wurde unter Verwendung von Chlorwasserstoff
säure auf pH 4,0 angesäuert, filtriert, auf 1:4 in Phosphatpuffer mit pH 5»0 verdünnt und auf Proteus vulgaris
MB-838-Platten unter Verwendung von 13 mm Scheiben
gebracht. Die Inhibierungszone betrug 26,5 mm. Das Produkt wurde
- - 65 -.
40.9819/1093 '
15 4-25
66
als Antibiotikum 810A identifiziert, "bestand jedoch vorwiegend
aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-metlioxy-psulf
ooxycinnamoyloxymethyl )-7-methoxy- 3-c ephem-4—carbonsäure
mit lediglich Spurenmengen an 7ß-( ^ 5~Amino-5-carboxy valeramido
)-3- (α-methoxy-p-hydroxy cinnamoyloxymethyl )-7-methoxy-3c
ephem-4- carb onsäur e.
Beispiel A-
Eine V8 Medium-Schrägkultur der Streptomyces griseus Kultur
(MA-4-125A) wurde zur Beimpfung von 50 ml Medium V in einem
mit Unterteilungen versehen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet.
mit Unterteilungen versehen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet.
Medium Y; .
Hefe-Autolysat (Ardamin)
Glucose
* Phosphatpuffer MgSO^ - 7H2O
Destilliertes Wasser
pH-Vert mit ITaOH auf 6,5 eingestellt'
* Phosphatpuffer:
Na2HPO4 Destilliertes Wasser
10,0 g 10,0 g 2,0 ml 0,05 g 1000,0 ml
91,0 g 95,0 g 1000,0 ml
Der Kolben wurde dann auf einem Rotationsschüttler bei
220 Upm 1 Tag bei 28° C geschüttelt. 3 ml dieses vegetativen Inocolums wurden zur Beimpfung eines Keimkolbens, der 50 ml des folgenden synthetischen Mediums (Medium VII) in einem
mit Unterteilungen versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben enthielt, verwendet. ■ . - - - -
220 Upm 1 Tag bei 28° C geschüttelt. 3 ml dieses vegetativen Inocolums wurden zur Beimpfung eines Keimkolbens, der 50 ml des folgenden synthetischen Mediums (Medium VII) in einem
mit Unterteilungen versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben enthielt, verwendet. ■ . - - - -
- "66 409819/1093
2166Λ62
15 425 Medium "VTI:
L-Asparagin L-Histidin
DL-Ph enylalanin Mononatrium-gl.utamat NaCl
2H2O
H2O
61
MnSOx FeSO
ZnSO4 MgSO4 Glyc
erin Saccharose Destilliertes Wasser
| Keimung | S | Produktxon | ε |
| 5,0 | g | 5,0 | g |
| 4,0 | 4,0 | ε | |
| -— | 2,0 | ε | |
| — | g | 1,5 | ε |
| 5,0 | δ | 5,0 | ε |
| 2,0 | E | 2,0 | ε |
| 0,4 | g | 0,4 | ε |
| 0,1 | g | 0,1 | ε |
| 0,1 | g | 0,1 | ε |
| 0,05 | g | 0,05 | ε |
| 1,0 | g | 1,0 | ε |
| 20,0 | g | 20,0 | g |
| 2,5 | ml | 2,5 | ml |
| *1000,0 | **1000,0 |
* pH mit NaOH auf 7,0 eingestellt
** pH mit NaOH auf 7,1 eingestellt
** pH mit NaOH auf 7,1 eingestellt
Der Keimkolben wurde wieder 1 Tag bei 28° G und 220 Upm ge- ·
schüttelt. Dieses synthetische Keiramedium wurde dann zur Beimpf ung "verschiedener 250 ml-Erlenmeyer--Kolben ohne Unterteilung,
die 38 ml des Produkti onsmediums VII "bei 1,5 ml
Inoculum je Kolben enthielten, verwendet. Die Produktionskorben wurden "bei 220 Upm und 24° G geschüttelt, und ihre
Inhalte wurden dann zusammengegeben und bei 4- und 5tägiger Alterung untersucht. Bei der Untersuchung wurde die gesamte Brühe· auf pH 4,0 unter Verwendung von Chlorwasserstoff sä ure angesäuert, und die Brühe wurde dann filtriert undajfi: 4 in Phospb-atpuffer von pH 5,0 verdünnt. Die Untersuchung erfolgte auf Proteus vulgaris MB-838 unter Verwendung von 13 mm-Scheiben. Es wurde eine Inhi bier ung sz one von 25,5 mm bei
dieser Fermentationsbrühe nach 4tägiger Inkubierung erhalten, und aas auf diese Weise erhaltene Produkt wurde als 810A identifiziert.
Inoculum je Kolben enthielten, verwendet. Die Produktionskorben wurden "bei 220 Upm und 24° G geschüttelt, und ihre
Inhalte wurden dann zusammengegeben und bei 4- und 5tägiger Alterung untersucht. Bei der Untersuchung wurde die gesamte Brühe· auf pH 4,0 unter Verwendung von Chlorwasserstoff sä ure angesäuert, und die Brühe wurde dann filtriert undajfi: 4 in Phospb-atpuffer von pH 5,0 verdünnt. Die Untersuchung erfolgte auf Proteus vulgaris MB-838 unter Verwendung von 13 mm-Scheiben. Es wurde eine Inhi bier ung sz one von 25,5 mm bei
dieser Fermentationsbrühe nach 4tägiger Inkubierung erhalten, und aas auf diese Weise erhaltene Produkt wurde als 810A identifiziert.
409819/1093
CS
Bei si)! e 1
5
Herstellung des Antibiotikums 810A und Trennung in seine
Bestandteile
Stufe 1: Der Inhalt eines lyophilisierten Köhrchens mit
Streptomyces griseus (MA-2857) wurde in 2 ml Medium I (in Beispiel 1 beschrieben) suspendiert, und das erhaltene
Inoculum wurde zur Beimpfung von Schrägkulturen des gleichen Mediums verwendet. Diese Schrägkulturen wurden bei 28° C
5 Tage oder bis sie gut mit Sporen versehen waren, inkubiert, und dann wurden 10 ml.Medium VIII zu den Schrägkulturen
zugegeben. *
Medium VIII:
Fleischextrakt 0,3 % '·
HaCl 0,5 %
HZ Amin 1 %
Dextrose . 1 % pH 7,0
Der Wuchs auf jeder Schrägkultur wurde in Suspension gekratzt, und die Suspension wurde als Inoculum'inNfolgenden
Stufe 2 verwendet.
Stufe 2s Die in Stufe 1 erhaltene Suspension wurde zur Beimpfung
eines mit Unterteilungen versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Eolbens,
der 50 ml sterilisiertes Medium VIII (beschrieben in Stufe 1) enthielt, verwendet. Der beimpfte
Kolben wurde dan auf einen Botationsschüttler bei 220 Upm
gebracht und 4-8 Stunden bei 28° C inkubiert.
- 68- -409819/1093
15 4-25
63
Stgfe 5i Der Inhalt eines Impfkorbens aus Stufe 2 wurde zur
Beimpfung eines mit Unterteilungen versehenen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolbens
verwendet, der 500 ml des als Medium VIII in Stufe 1 identifizierten Mediums enthielt. Der beimpfte
Kolben, wurde dann-.auf einen Rotationsschüttler bei 220 Upm
gebracht und 48 Stunden bei 28° C inkubiert.
Stufe 4: Ein Inoculum aus 500 ml des aus Stufe 3 erhaltenen
Wuchses wurde zur Beimpfung eines 750 Liter-Fermentationsbehälters
aus rostfreiem Stahl, der 467 Liter eines sterilen
Mediums VIII (in Stufe 1 beschrieben) enthielt, verwendet. Man liess die Fermentation bei einer Temperatur von 28° C
unter- Bewegung ^130 Upm) fortschreiten, während ein Luftstrom,
von 280 lf(iO cfm) während 65 Stunden beibehalten wurde.
Wäkrertd der Fermentation wurde ein Antischaummittel, Polyglycol
2000, in kleinen Mengen zugegeben, um übermässiges Schäumen zu verhindern.
Stufe 5· Ein Inoculum aus 380 Liter (100 gallons) des erhaltenen
Wuchses aus Stufe 4 wurde zur Beimpfung eines 5700 later (15ΟΟ gallon) Fermentationsbehälters aus rostfreiem
Stahl, der 4500 Liter (1200 gallons) des folgenden Medi uras IX enthielt, verwendet.
Medi, um IX:
Maisquellfliissigkeit 4 %
Dextrose 2 %
pH-¥ert mit ITaOH auf 7,2 eingestellt
Man Hess die Fermentation bei einer Temperatur von 28° C
unter; Bewegung (120 Upm) fortschreiten, während ein Luftstrom von 158Ο 1 (55·3 cfm) während 30 bis 36 Stunden beibehalten
wurde. Während der Fermentation wurde Polyglykol 2000 in kleinen Mengen zugegeben, um übermässiges Schäumen
zu verhindern. Der Ansatz wurde gewonnen und die Wirksam-
- 69; -4098 19/1093
10
keit durch den Seheiben-Plattenversuch bestimmt. Unter Verwendung
von 13 mn (0,5 inch) Scheiben ergab diese Brühe
eine Inhibierungszone von 32,5 ™& gegen Proteus vulgaris
MB-838, bei Gewinnung nach 3Istündiger Alterung.
Stufe B: Isolierung des Antibiptikumsemischs 810A
Filtrierte Brühe 4050 1 (1075 gallons) aus Stufe A, Stufe 5,
wurde nach 36 Stunden gewonnen und der pH-Wert in dem Fermentationsb
ehält er durch Zugabe von Phosphorsäure von 7 bis 8 auf 3jO eingestellt. Das Mycel wurde durch Durchleiten
durch eine HIt erpresse vom Platten-Sieb typ entfernt und
verworfen. Die filtrierte Brühe wurde dann durch ein 38O
(100 gallon) Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorptionsharz mit
einer Fliessgeschwindigkeit von 38 1 (10 gallons) je Minute
gegeben. Die verbrauchte Brühe wurde untersucht und verworfen, und das Harzbett mit 2 Volumen Wasser gewaschen. Das
Antibiotikum wurde aus dem Harzbett mit einer 60%igen ,Lösung
von Methanol und Wasser bei einer Fliessgeschwindigkeit von 19 1 (5 gallons) ge Minute eluiert. 40 Fraktionen mit
jeweils 19 1 (5 gallons) x^urden gesammelt und untersucht. Die Fraktionen 2 bis 40 wurden vereinigt und das Methanol
durch Eindampfen im Vakuum entfernt. Das Endkonzentrat
(158 1, 41,5 gallons) wurde durch Zugabe von Ammoniumhydroxid
auf pH 3,5 eingestellt und gefrorengehalten.
Proben wurden nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris biologisch untersucht.
Filtrierte Brühe; An 4000 1 (1060 gallons) filtrierter Brühe
durchgeführte Versuche ergaben die folgenden Zonendurchmesser:
- 70 -409819/1093
15 425
Eluatzusammeiisetzunp; und Eluatkonzentrat: Es wurden ebenfalls
Versuciie an 740 1 (195 gallons) Eluatzusammensetzung und
158 1 (41,5 gallons) Antibiotikum 810A in Form von Eluatkonzentrat
durchgeführt.
Eluatzusammensetzung
Verdünnung Zonengrösse
Verdünnung Zonengrösse
| 1 | : 5 | 28,8 | •mm |
| 1 | ι 10 | 27,0 | mm |
| 1 | : 20 | 23,8 | mm |
| 1 | : 40 | • 21,0 | mm |
Eluatkonzentrat 810A Verdünnung Zonengrösse
16
27,25 mm 24,5 mm
Untersuchung: der Gesamtfeststoff ei
!Filtrierte Brühe
740 1 (195 gallons) Eluatzusammensetzung
158 1 (41,5 gallons) Elu*konzentrat
119
7,23 kg 7,20 kg
Stufe C: Adsorption an einem Anionenaustauschharz
Das Konzentrat auf Stufe B (78,5 1, 20,7 gallons) wurde mit Wasser auf 118 1 (31 gallons) verdünnt und an ein 22,5 1-Bett
eines schwach-basischen Anionenaustauschharzes (Amberlite IEA-68-Harz, Chloridzyklus) bei pH 4,0 und einer Strömung
von 7,6 1 (2 gallons) de Minute adsorbiert. Danach folgte
eine Wäsche mit 4-5 1 Wasser, wonach das Harzbett mit einer
Lösung aus 1 m-Uatriumnitrat und 0,1 m-Natriumacetat bei
pH 7,5 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 l/min. eluiert wurde. Zehn 19 1 (5 gallons) Eluatfraktionen wurden
dann gesammelt und der pH-Wert mit der aufgefangenen Chlorwasserstoff säure auf pH 4· eingestellt.
Sämtliche Fraktionen wurden nach der Scheiben-Plattenmethode
gegen Proteus vulgaris biologisch wie folgt untersucht:
- 71 4.0 9 8 1.9/ 10 9 3
15 425 . - - .
Beschickunprslösune: Eluatfraktionen, Verdünnung; 1 :
| Verdünnung | : 10 | Zonengrösse | • | 28,5 mm | • | Fraktion | Zonen | fraktion | Zonen |
| : 20 | 26,5 mm | grosse | grosse | ||||||
| 1 | : 40 | 24 mm | 1 | 27 mm | 6 | 25 mm | |||
| 1 | 2 | 50 mm | 7 | 23 mm | |||||
| 1 | 3 | 28,5 mm | 8 | 22 mm | |||||
| 4- | 26 mm | 9 | 21 mm | ||||||
| 5 | 26 mm | 10 | 17,5 mm | ||||||
Der verbrauchte Strom ergab nach Untersuchung 25 mm ohne
Verdünnung und. das Waschwasser ergab nach Untersuchung 23 mm
ohne Verdünnung.
Stufe D: Adsorption an Anionenaustauschharz
Die Fraktionen 1 bis 10 aus Stufe C wurden kombiniert und
einem 45 Liter-Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens bei pH.
3,0 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 .l/min, zugeführt.
Das Harzbett wurde mit 90 1 Wasser bei der gleichen Geschwindigkeit gewaschen. Das Antibiotikum wurde dann aus
dem Harz durch eine 25%ige Lösung aus Aceton und Wasser
bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 l/min, eluiert.
Sechzehn 19 1 (5 gallons) Fraktionen wurden gesammelt.
Sämtliche Fraktionen wurden nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris wie folgt untersucht: Die Beschikkung
(190 Liter) ergab die folgenden Zonendurchmesser:
Beschickunprslösung
Verdünnung Zonengrösse
1:5 30 mm
1 : 10 27,5 nun
1 : 20 24,2 mm
- 72 -. 409819/1093
15 425
"Die Zonendurchmesser der Eluatfraktionen wurden in der fol
genden Tabelle zusammengefasst:
| 1 | ! 10 | Zonengrösse | ? mm. | Eluatfraktion | Verdünnung Zonengrösse | ί 10 | 25 | mm | |
| Eluatfrakti on | 1 | : 10 | 20,ί | mm | Fraktion | Λ | ! 10 | 26,5 | mm |
| Fraktion Verdünnung | 1 | ·. 10 | 29 | mm | 9 | *J | 26 | mm | |
| 1 | 1 | : 10 | 29 | TTi τη | 10 | 1 | • 5 | 28 | mm |
| 2 | . .1 | : 10 | 29 | mm | 11 | 1 | - 5 | 27,5 | mm |
| 3 | 1 | ; 10 | 28 | mm | 12 | 1 | ί 5 | 25 | mm |
| 4 | 1 | ! 10 | 27 | mm | 13 | 1 | ! 5 | 25 | mm |
| 5 | 1 | : 10 | 26 | mm | 14 | 1 . | ί 5 | 24,5 | mm |
| 6 | 26 | 15 | 1 | ||||||
| 7 | 16 | ||||||||
| 8 | |||||||||
Die obigen Eluatfraktionen 2 bis 16 wurden kombiniert und das Aceton durch Eindampfen im 'Vakuum auf. ein Endvolumen
von 17j4 Liter entfernt. Das 17 >4 Lit er-Konzentrat wurde
durch Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt
und gefriergetrocknet, wobei 620 g Antibiotikum 810A, d. h.
ein Gemisch, bestehend im wesentlichen aus 7ß-(D-5-AmInO-5-carboxyvaleramido)-3(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cepheni~4~carboiisäure
und ^Q-{T)-^>-^mirLO--5-carboxyvaleramido)~3-(cc-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten wurde. Dieses trockene Produkt hatte eine Wirksamkeit auf Grund der biologischen Untersuchung von 320 mcg/ml für eine
25 mm-Zone.
Stufe E: 7-ß-(D-^-Amino-5-carboxyvaleramido)-3- (a-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem~
4-carbonsäure
Eine Chromatographie-Kolonne von 2,5 cm Durchmesser wurde
auf eine Betthöhe von 100 cm mit DEAE Sephadex A-25
Anionenaustauschharz in einem 0,5 m- Ammoniumbromid und 0,05 m-Essigsäure enthaltenen System gepackt. Das in
- 75' -409819/1093
15 4-25
Stufe D erhaltene Gemisch des Antibiotikums 810A (10,0 g)
wurde in 18 ml einer Lösung aus 0,5 m-Ammoniumbromid und
0,05 m-Essigsäure gelöst und in die Kolonne eingebracht. Die Eluierlösung wurde durch das Bett mit einer Geschwindigkeit
von 81 ml/h gepumpt, und es wurden 10 ml Fraktionen des Eluats maschinell gesammelt. Der Eluatstrom wurde
durch ein Differential-Refraktometer überwacht. Die Refraktometer-Aufzeichnung zeigte Massenpeaks bei den
Röhren 19, 36, 79, 109 und 206. Scheiben-Plattenversuche
gegen Proteus vulgaris (MB-838) wurden bei jeder dritten
Fraktion unter Verwendung von bei pH ?y0 gepufferten
I3 mm-Scheiben durchgeführt. Die Zonendurchmesser sind in
der folgenden Tabelle aufgeführt: (Die Fraktionen 1 bis 66 ergaben auf Grund der Untersuchung Null).
| Fraktion | Zonen- | Fraktion | Zonen | Fraktion | Zonen |
| dureh- | durch | durch | |||
| messer | messer | messer | |||
| 69 | 18 nna | 122 | 29 | 204 | 40 + |
| Λ 72 | 24 | 125 | 28 | 207 | 40 + |
| 75 | 26 | 128 | 27 | 210 | 40 + |
| 78 | 31 | 131 | 26 | 213 | 40 + |
| 81 | 124 . | 24 | 216 | 40 + | |
| 83 | 35 | 137 | 21 | 219 | 40 ■ |
| 86 | 37 | 140 | 20 | 222 | 38 |
| 89 | 38 | 150 | 18 - | 225 | 35 |
| 92 | 38 | 160 | 20 | 228 | 32 |
| 95 | 40 + | 170 | 29 | 231 | 31 |
| 98 | 40 + | 180 | 35 | 234 | 27 |
| 101 | 40 + | 183 | 38 | 237 | 24 |
| 104 | 40 + | 186 | 40 | 240 | 23 |
| 107 | 40 + | 189 | 40 + | 243 | 19 |
| 110 | 40 + | 192 | 40 + | 246 | 17 |
| 113 | 40 | 195 | 40 + | 249 | 0 . |
| 116 | 38 | 198 | 40 + | 252 | 0 |
| 119 | 33 | 201 | 40 + |
Die Fraktionen 80 bis 133 wurden kombiniert und die Fraktionen
170 bis 230 wurden kombiniert.
- 74 -409819/tO 9 3
154-25
Eine Wiederholung des obigen Versuchs erfolgte?und die Fraktionen
82 bis 130 wurden kombiniert und die Fraktionen 180 bis 234- wurden kombiniert.
Die die erste aktive Komponente enthaltenden Fraktionen aus den obigen Versuchen wurden kombiniert und an ein 100 ml-Bett
aus Amberlite XAD-2 Harz adsorbiert. Das Bett wurde mit 1 Volumen Wasser gewaschen und dann mit 3 Volumen einer
90%igen Lösung aus Methanol und Wasser eluiert. Das Methanol wurde durch Verdampfen im Vakuum entfernt, und das wässrige
Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 810 mg eines Produktes erhalten wurden, das als 7-ß-(D-5~Amino-5-carboxy-:
val eramido)—3-(cc-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-mfctiioxy~3-cephem-4-carbonsäure
identifiziert wurde. Die biologische Wirksamkeit dieses Produktes, bestimmt nach der
Scheiben-Plattenuntersuchungsmethode gegen Proteus vulgaris betrug 18 jug/ml und ergab eine 25 mm-Zone.' Analyse auf Grund
von TJltraviolett-Adsorption ergab die folgenden charakteristischen
Daten:
UV-Adsorption in 0,1 n-HCl ^ max 305 E^cm 524-πν-Adsorption
in 0,1 n-IfaOH^max 328 E^cm 564
Stufe F: 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a~methoxy
p-sulfoxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem
4—carbonsäure
Die Fraktionen aus den beiden Versuchen auf Sephadex A-25<,
welche die zweite aktive Komponente enthielten, wurd.en vereinigt
und an ein 100 ml-Bett von Amberlite XA.D-2 Harz ·
adsorbiert. Das Bett wurde mit 1 Volumen Wasser gewaschen und dann mit 3 Voimen einer 90%igen Lösung aus Methanol und
Wasser eliiiert. Die angereicherten Eluate wurden kombiniert;
und das Methanol wurd durch Verdampfen im Vakuum entfernt. Das wässrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet und ergab
72O mg 7-ß-(D-5--^miI1o-5-carboxyvaleramido)-3-(ia-methoxy-p-
— 75 — 4098T9/1093
15 425 ■ .
U-
sulfooxyciruiamoyloxymetliyl)-7-metlioxy-3-ceph.em-'i}--carbonsäure
(Ic). Analyse auf Grund von Ultraviolett-Absorption ergab
die folgenden Kenndaten:
UV-Ädsorption in 0,1 n-HCl /j max 287 mm E^cm 432
UV-Adsorption in 0,1 n-KaOH Λ max 280 mm E^cm 432
Beispiel 6
Abtrennung der 7ß-(D-5--A-niino-5-carboxyvaleramido)-3-(o:-
nietiioxy-p-sulfooxycinna!iioylo>^rmetliyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
aus dein Antibiotikumgemisch 810A
Das 7ß~(D-5
oxycinnamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-c.ephem-4-carbonsäure (Ic)
und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3"(a-methoxy-phydroxycinnaiaoyloxymethyl)-7-iiiethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
enthaltende Antibiotikumgemisch. 810A (20,0 g) aus Beispiel
Stufe D, wurde in 200 ml Wasser gelöst und der pH-Vex^t der Lösung auf 3*5 eingestellt. Diese Lösung wurde durch ein
200 ffll-Bett von Amberlite IKA-68 Anionenaustauschharz
(Chloridzyklus) gegeben und anschliessend durch Zugabe von 3OO ml Wasser gewaschen. Das Bett wurde dann mit 1 Liter
1%iger (V/V) Ameisensäure in Wasser eluiert. Anschliessend wurden zwei Portionen verdünnte Chlorwasserstoffsäure (pH
0,95) zugegeben. Die Beschickungslösung, verbrauchte Lösung und Waschlösung und Eluate 1, 2 und 3 wurden durch Papier-Elektrophorese
bei pH 4,0, durchgeführt während 1 Stunde bei 1000 Volt Gleichstrom, analysiert. Das Papierchromatogramm
wurde getrocknet, gegen Ammoniakdampf ausgesetzt um die Säure zu neutralisieren und auf einer Nähragar-Platte,
die mit Proteus vulgaris (MB-838) beimpft war, inkubiert.
Die Überprüfung nach 17stündiger Inkubierung bei 37° c
zeigte zwei Inhibierungszonen in dem Bes. Jiickungsmaterial
(in der Eichtung der Anode), lediglich eine Einzelkomponente
- 76 ; -409819/1093
15 425
(die langsamere der "beiden) in der verbrauchten Lösung und
den Ameisensäure-Eluaten und eine Einzelkomponente in dem zweiten Chlorwasserstoff^iäureeluat, das der schnelleren
Komponente in der Beschickung entsprach. Die folgende Tabelle zeigt den Gesamtfeststoff und die biologischen Versuchsdaten:
Masse Volumen Gesamte biologische Produkt(e)
Einheiten
Beschickung 20 g 200 ml . 60 000 Einheiten Ia und Ib
Verbrauchte
Lösung und
Waschlösung 11,15 g 5QO ml 7 500 u Ib
Ameisensäur
eeluat 4,52 g 1000 ml 20 000 " Ib
Erstes Chlorwassers to ffsäureeluat 500 ml 1 000 "
Zweites Chlor- ■ · ■
wasserstoff-
ßäureeluat 2,10 g 500 ml 10 000 w Ia
Diese Fraktionen wurden durch Adsorption an Amberlite XA-D-2
Harz gewonnen, um 7ß-~(I)-5"-^iaino-5-carboxyvaleramido)-3~
(a-metho>q7-p-sulfooxycinnanioyloxyniethyl)-7-methoxy-3-cephem-4—carbonsäure
(Ic) abzutrennen, und diese wurde durch eine 50?iige Lösung von Methanol und Wasser eluiert, wobei im
wesentlichen reines Produkt (Ic) erhalten wurde.
Bei spiel?
Ab tr ennung von 7ß ( D- 5-Amino- 5- c arb oxy val er ami do ) - 3- ( α-m ethoxyp-ßUlfooxycinnamoyloxjrmethyl3-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
aus dem Antibiotikum 810A
Das antibiotische 81OA-Gemisch aus 7-ß-(D~5--A-mino-5~carboxyvaleramido)-3-(α-Ia.ethoxy-p-sulfooxycinnamoyl·oxymethyl)-7~
methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (Ic) und 7ß-(D-5--A-mii1ci-5-carboxy
val erami do ) - 3-( a-me thoxy-p-hy droxy cinnamoy loxym e thy 1)-
-•77: -
A09819/1093
15 425 -- . .
-7-iaetlioxy-3-cephem-4-carbonsäure (5>0 g), das nach Beispiel
5» Stufe D, erhalten wurde, wurde in 20 ml einer 20%igeii Lösung aus Aceton und Wasser gelöst und der pH-Wert
auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung wurde auf ein Bett aus Aiaberlite XA.D-2 Adsorbens von 5 cm Durchmesser χ 100 cm
Höhe in 20%iger Aceton- und Wasserlösung gegeben. Eine Lösung aus 20 % Aceton und Wasser wurde durch das Bett mit einer
Geschwindigkeit von 880 ml/h gepumpt, und 20 ml-IPraktionen
wurden automatisch gesammelt.
Scheiben-Plattenuntersuchungen gegen Proteus vulgaris (MB-838) wurden bei jeäer dritten Fraktion unter Verwendung
von 6nna-Scheiben durchgeführt. Die Zonendurchmesser sind in
der folgenden Tabelle aufgeführt:
- 78 — 409819/1093
| 2166482 | - | 93 | 131 | durchmesser | Fraktion | Zonen | |
| 15 425 | Zonen- Fraktion Zonen | 134 | 0 | durchmesser | |||
| dur chmesser | 137 | 0 | 221 | 18 . | |||
| !Fraktion | 0 | 140 | 0 | 224 | 18 | ||
| 12 mm | 143 | 8 | 227 | 18 | |||
| 1-41 | 22 | 146 | 11 | 230 | 17 | ||
| 44 | 25 | 149 | 13 | 233 | 17 | ||
| 47 | 29 | 152 | 13 | 236 | 15 | ||
| 50 | 31 | 155 | 15 | 239 | 15 | ||
| 53 | 35 | 158 | 15 | . 242 | 15 | ||
| 56 | 30 | 161 ' | 16 | 245 | 15 | ||
| . 59 | 28 | 164 | 17 | 248 | 14 | ||
| 62 | 27 | 167 | 18 | 251 | 14 | ||
| 65 | 25 | 170 | 17- | 254 | 14 | ||
| 68 | " 24 | 173 | 18 | 257 | 13 | ||
| 71 | 21 | 176 | 20 | 260 | 13- | ||
| 74 | 20 | 179 | 21 | 263 | 12 | ||
| 77 | 19 | 182 | 21 | 266 | 12 | ||
| 80 | 16 | 185 | 21 | 269 | 12 | ||
| 83 | 14 | 188 | 21 | 272 | 11 | ||
| 86 | 13 | 191 | 22 | 275 | 11 | ||
| 89 | 13 | 194 | 23 - | 278 | 10 | ||
| 92 | 13 | 197 | 23 | 281 | 10 | ||
| 95 | 13 | 200 | 23 | 284 | 9 | ||
| 98 | 14 | 203 | 22 | 287 | 8 | ||
| 101 | 13 | 206 | 24 | 290 | 0 | ||
| 104 | 13 | 209 | 24 | 293 | 0 | ||
| 107 | 11 | 212 | 24 | 296 | 0 | ||
| 110 | 10 | 215 | 24 | 299 | 0 | ||
| 113 | 9 | 218 | 24 | 302 | 0 | ||
| 116 | 8 | 19 | |||||
| 119 | 8 | 330 | 0 | ||||
| 122 | 8 | ||||||
| 125 | |||||||
| 128 |
Die Fraktionen 44 bis 90 wurden vereinigt, Aceton wurde
durch Abdampfen im Vakuum entfernt,und das wässrige Konzentrat
wurde gefriergetrocknet, wobei 3?3 g rohe 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ic) erhalten wurden.
Die Fraktionen 15O bis 225 wurden vereinigt und ergaben bei
ähnlicher Behandlung 700 mg 7ß-(D-5-AmiB.o-5-carboxyvaler~
amido )- 3- ( a-me thoxy-p-hydroxy cinnamoyloxymethy 1) -7-me thoxy-3-cephem-4-carbonsäure-
— 79 — 40981 9/1093
to
Eine Wiederholung des obigen Versuchs ergab 3>1 S rohe
7ß- (D-5-Amino- 5- carb oxy val erami do ) - 3~ (tx-me thoxy-p- s ulf ooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure
(Ic) · und 400 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3~cephem-4~carbonsäure.
"
Die beiden Mengen an 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-Biethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ic), die nach der vorangehenden Methode erhalten wurden, wurden vereinigt, und die 6,4 g Material
wurden in ein Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens von 5 cm
Durchmesser ζ 100 cia Höhe in einer 5%igen Lösung aus Methanol
und Wasser eingebracht. Eine 5%ige Methanol- und Vasserlösung
wurde durch das Bett mit einer Fliessgeschwindigkeit von 880 ml/h gepumpt und 20 ml Fraktionen wurden automatisch
gesammelt« 287 Fraktionen wurden gesammelt, und jede vierte Fraktion wurde nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus
vulgaris (MB-838) unter "Verwendung von 6 mm Scheiben untersucht.
Die Untersuchungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle
aufgeführt. Die Fraktionen 1 bis 50 wurden nicht untersucht.
Fraktion Zonengrb'sse Fraktion Zonengrösse
| 51 | 23 nun | 40981 | 115 | 20 |
| 26' | 119 | 20 | ||
| 59 | 23 | 123 | 19 | |
| 63 | 18 | 127 | 18 | |
| 67 | 12 | 131 | 19 | |
| 71 | 0 | 155 | 16 | |
| 75 | 0 | 139 | 17 | |
| 79 | 0 | 143 | 15 | |
| 83 | 7 | 147 | 16 | |
| 87 | 9 | 151 | 15 | |
| 91 | 13 | 155 | 13 | |
| 95 | 19 | 159 | 11 | |
| 99 | 21 | 163 | 9 | |
| Ί03 | 22 | 167 | 0 | |
| 107 | 22 | 171 | 0 | |
| 111 | 21 | 287 | D | |
| ■ 80 - | ||||
| 9/1093 |
15 4-25
Die Fraktionen 95 "bis 159 wurden vereinigt, Methanol wurde
im Vakuum abgedampft, und das wässrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet,
wobei 700 mg 7ß-(D~5~Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-aethoxy-p~sulfooxycinnaraoyloxymethyl)-7-methoxy~3-cephem-4-carbonsäure
(Ic) erhalten wurden. Das Ultraviolett-Spektrum von 7ß-(D-5-Atain.o-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycirmamoyloxymethyl)~7-iaethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ic) ergab die folgenden Adsorptionsdaten :
ÜV-Adsorption in 0,1 n-HCl ?t max 285 E^ 160
UV-Adsorption in 0,1 n-NaOH p\ max 277 ^Qm 166
Bei Untersuchung mit 13 mm-Scheiben nach der Scheiben-Plattenmethode
gegen Proteus vulgaris ergab die 7ß-(,D~^-Araijio-5-carbo>qyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyßiethyl)-7-inethoxy-3-cephem-/l—carbonsäure
(Ic)-Probe eine 25 mm-Zone bei 88 mcg/ml und 7ß~(D-5--&mino-5--carboxyvaler~
amido)-3-(oc-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxl7ffiethyl)-7--ßiethoxy-3-cephem-/l~carbonsäure
ergab eine 25 mm-Z one bei 167 mc g/ml.
Die neuen Verbindungen der Erfindung wurden als Verbindungen mit dem 5~^-miß-o-5-carboxyvaleramidorest in der ß-Konfigura-.tion
mit Bezug auf den Cephemkern beschrieben. Obgleich dies auf derzeit verfügbaren Informationen beruht und als richtig
angenommen wird, sollen die Verbindungen nicht auf diese spezielle Konfiguration festgelegt sein, falls sie auf Grund
weiterer Erkenntnisse als unkorrekt nachgewiesen würde.
Die in der vorliegenden Beschreibung angeführten Organismen
sind in der Kulturensammlung des American Type Culture Collection hinterlegt, wo sie unter den folgenden ATCC-Bezeichnungen
verfügbar sind:
- 81 409819/1093
15 4-25
Escherichia coli W-MB-60 ATCC 9637
Proteus vulgaaäs MB-838 ATCC 21100
Alcaligenes faecalis MB ATCC 212
AIcaligenes viscosus MB-12 ATCC 337
Vibrio percolans MB-1272 ATCC 8461
Bacillus subtilis MB-964 . ATCC 6633
Auch werden in der Beschreibung mehrere verwendete Materialien mit Handelsbezeichnungen bezeichnet. Diese weisen die' folgende
Zusammensetzung auf und sind von den folgenden Bezugsfirmen erhältlich:
Amber Yeast Nr. 3OO: Eine Fraktion autolysierter Brauereihefe
; Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin.
Möbel par-S: Ein Entschäumungsrnittel auf Ölbasis (Zusammensetzung
unbekannt); Mobil Oil Company, 15O E. 42nd
Street, New York, New York.
Polyglykol 2000: Ein Entschäumungsmittel; Polypropylen--
glykol-Polymeres mit einem mittleren Molekulargewicht
von 2000; Dow Chemical Company, Midland, Michigan.
Biogel P-2: Ein Gelfiltrationsmedium; ein kugelförmiges
Polyacrylamid vernetzt mit Methylen-bis-acrylamid;
Bio-rad Laboratories, Eichmond, California.
Dowex 50: Ein Polystyrol mit im Kern, sulfonierter SuIfonsäure-Kationenaustauschharz;
Dow Chemical Company, Midland, Michigan.
Analtech G-.F. Plates: Silicagel mit Calciumsulfat-Binder
und ein fluoreszierender Indikator, 250 Mikrometer
Stärke; Analtech Inc., 100 South Justison Street, Wilmington, Delaware, 198OI.
-82 -409819/1093
Claims (9)
- Patentansprüche7ß-(D~5-Amino-5~carboxyvaleramido)-3-kC-methoxy-cinnamoyloxymethyl)-7~methoxy-3~cephem-4-carbonsäure-Verbindungen der allgemeinen FormelOCHHOOC-CH-(CH0),-CO-NH-CO -N-CK.t £C - OCH, I!CH12
worin R Hydroxyl oder Sulfooxyl bedeutet, und deren Salze, Ester und Amide. - 2. Die Alkali- und Erdalkalisalze, besonders Natriumsalze der Verbindungen nach Anspruch 1.
- 3. Verfahren zur Herstellung von 7ß-(D-5-Amino~5-carboxyvaleramido) ~3~ (°^-me thoxy-p-sulf ooxy-cinnamoy loxyme thy I) · 7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3~ fcsC-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3~cephem-1l-carbonsäure, dadurch ge-409819/1093 - 83 -15 425kennzeichnet, dass ein zur Erzeugung des gewünschten Produktes befähigtes Actinomycet in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird und das erhaltene Gemisch der beiden Verbindungen gegebenenfalls chromatographisch trennt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 33 dadurch gekennzeichnet, dass als Actinomycet ein neuer Stamm von Streptomyces griseus, Streptorayces viridochromogenes, Streptomyces fimbr-iatus, Streptomyces halstediis Streptomyces rochei, Streptorayces cinnamonensis oder Streptomyces chartreusis verwendet wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Actinomycet ein neuer Stamm von Streptomyces griseus verwendet wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein wässriges Nährmedium verwendet wird, das zwischen etwa 1 und 6 Gew.-? Kohlehydrat und zwischen etwa 0,2 und 6 Gew.-% verfügbaren Stickstoff enthält,
- 7. Verfahren nach Anspruch 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 37° C durchgeführt wird.
- 8. Verfahren nach Anspruch 3 bis 7> dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des wässrigen Nährmediums im Bereich von etwa 5,5 bis 8,0 liegt.
- 9. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einer Verbindung geinäss Anspruch 1.- 8*1 409819/1093
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